Drugi dolazak genske terapije. Fetalna genska terapija: od teorije do prakse Vrste genske terapije: ex vivo i in vivo terapija

Genska terapija

Baranov V.S. Genska terapija – medicina 21. stoljeća // Soros obrazovni časopis. – 1999. – br. 3. – Str. 63–68. (St. Petersburg State University)

© Baranov V.S., tekst

© Soros Educational Journal, 1999

© A. Afonin, obrada i objavljivanje html verzije, 2006

<http:// afonin-59- bio. ljudi. ru>

<http:// afonin-59- salix. ljudi. ru>

UVOD

Odlučujuća dostignuća molekularne biologije i genetike u proučavanju fine strukture eukariotskih gena, njihovog mapiranja na hromozomima sisara, a posebno ljudi, impresivni uspjesi projekta Human Genome u identifikaciji i kloniranju gena čije mutacije dovode do brojnih nasljednih bolesti i, konačno, brzi rast biotehnologije i genetski inženjering bili su neophodni preduvjeti za prve pokušaje liječenja monogenih bolesti iz eksperimenata na životinjama i teorijskih konstrukcija već 1989. godine.

Šta je genska terapija? Da li to znači liječenje korištenjem gena kao lijeka ili samo liječenje ispravljanjem mutantnog gena? Ova i mnoga druga pitanja neminovno se nameću kada se razmatra tako obećavajući, a možda i potencijalno opasan po čovječanstvo pravac medicine nadolazećeg 21. stoljeća kao što je genska terapija.

KRATKA ISTORIJSKA POZADINA

Genska terapija u sadašnjoj fazi može se definirati kao liječenje nasljednih, multifaktorskih i nenasljednih (zaraznih) bolesti uvođenjem gena u ćelije pacijenata s ciljem ciljanih promjena genskih defekta ili davanja ćelijama novih funkcija. Prva klinička ispitivanja genske terapije poduzeta su 22. maja 1989. godine, s ciljem genetskog obilježavanja tumor-infiltriranih limfocita u uznapredovalom melanomu. Prva monogena nasljedna bolest za koju su primijenjene metode genska terapija, pokazalo se da je nasljedna imunodeficijencija uzrokovana mutacijom gena za adenozin deaminazu (ADA). 14. septembra 1990. godine u Bethesdi (SAD) četverogodišnjoj djevojčici koja boluje od ove prilično rijetke bolesti (1:100.000) transplantirani su njeni limfociti, prethodno transformirani izvan tijela. (ex vivo) genom ADA (gen ADA + gen peo + retrovirusni vektor). Terapeutski efekat je primećen nekoliko meseci, nakon čega je postupak ponavljan u intervalima od 3...5 meseci. Tokom tri godine terapije urađene su ukupno 23 intravenske transfuzije. ADA- transformisani T limfociti bez vidljivih štetnih efekata. Kao rezultat tretmana, stanje pacijentice se toliko poboljšalo da je mogla normalna slikaživot i ne plašite se slučajnih infekcija. Liječenje drugog bolesnika sa ovom bolešću bilo je jednako uspješno. Trenutno se klinička ispitivanja genske terapije za ovu bolest provode u Italiji, Francuskoj, Velikoj Britaniji i Japanu.

Godine 1997. broj protokola odobrenih za klinička ispitivanja bio je već 175, u njihovoj implementaciji je učestvovalo više od 2000 pacijenata. Većina takvih projekata (oko 80%) odnosi se na liječenje raka, kao i HIV infekcije (AIDS). Istovremeno, u savremenim istraživanjima genske terapije potrebno je uzeti u obzir da su posledice manipulisanja genima ili rekombinantnom DNK in vivo nedovoljno proučeno.

U zemljama sa najnaprednijim nivoom istraživanja u ovoj oblasti, posebno u Sjedinjenim Državama, medicinski protokoli koji koriste čulne DNK sekvence podležu obaveznoj reviziji od strane relevantnih komiteta i komisija. U SAD-u su to Savjetodavni komitet za rekombinantnu DNK (RAC) i Uprava za hranu i lijekove (FDA), uz naknadno obavezno odobrenje projekta od strane direktora Nacionalnog instituta za zdravlje. U Evropi se takvi protokoli sastavljaju i odobravaju u skladu sa preporukama Evropske radne grupe za prenos ljudskih gena i terapiju.

METODE GENETIČKE TRANSFEKCIJE U GENSKOJ TERAPIJI

Odlučujući uslov za uspešnu gensku terapiju je da se obezbedi efikasna isporuka, odnosno transfekcija (u širem smislu) ili transdukcija (kada se koriste virusni vektori) stranog gena u ciljne ćelije, obezbeđivanje njegovog dugotrajnog funkcionisanja u tim ćelijama i stvaranje uslovi za puno funkcionisanje gena (njegova ekspresija) . Transfekcija se može provesti korištenjem čiste (gole) DNK dopirane (integrirane) u odgovarajući plazmid, ili kompleksne DNK (plazmidna DNK povezana sa solima, proteinima (transferin), organskim polimerima (DEAE-dekstran, polilizin, liposomi ili čestice zlata), ili DNK sadržan u virusnim česticama koje su prethodno bile lišene sposobnosti replikacije.

Glavne metode isporuke stranih gena u ćelije dijele se na kemijske, fizičke i biološke. Efikasnost transfekcije i sposobnost integracije transducirane strane DNK nisu iste za različite metode transfekcije u ciljne DNK ćelije. Samo virusni vektori ili genetski konstrukti koji sadrže virusne sekvence su sposobni za aktivnu transdukciju, au nekim slučajevima i za dugotrajnu ekspresiju stranih gena. Od više od 175 protokola kliničkih ispitivanja koji su već odobreni za gensku terapiju, više od 120 uključuje korištenje virusne transdukcije, a oko 100 od njih se temelji na upotrebi retrovirusnih vektora.

Pregledom podataka možemo doći do zaključka da je, uprkos naporima mnogih laboratorija širom svijeta, sve već poznato i ispitano in vivo I in vitro vektorski sistemi su daleko od savršenih. Ako postoji problem sa isporukom stranog DNK in vitro praktički riješen, i njegova isporuka do ciljnih stanica različitih tkiva in vivo uspješno riješene (uglavnom stvaranjem konstrukta koji nose receptorske proteine, uključujući antigene specifične za određena tkiva), onda druge karakteristike postojećih vektorskih sistema - stabilnost integracije, regulirana ekspresija, sigurnost - i dalje zahtijevaju ozbiljna poboljšanja.

Prije svega, to se tiče stabilnosti integracije. Do sada je integracija u genom bila postignuta samo korištenjem retrovirusnih ili adeno-asociranih vektora. Efikasnost stabilne integracije može se povećati poboljšanjem genskih konstrukata kao što su sistemi posredovani receptorima, ili stvaranjem dovoljno stabilnih epizomalnih vektora (tj. struktura DNK sposobne za dugotrajnu perzistenciju unutar jezgara).

Transfer gena posredovan receptorima je kako slijedi. DNK sekvenca željenog gena povezana je sa određenom supstancom (na primjer, glikoproteinom), koja ima visok afinitet za određeni membranski receptor transformirane stanice (na primjer, hepatocit). Dobiveni kompleks se kombinira s adenovirusom, koji osigurava prodiranje genske konstrukcije u ćelijsku jezgru. Takav kombinovani vektor osigurava efikasnu ciljanu isporuku gena do specifičnih ćelija.

U posljednje vrijeme posebna pažnja se poklanja stvaranju vektora na bazi umjetnih hromozoma sisara (Mammalian Artificial Chromosomes). Zbog prisutnosti osnovnih strukturnih elemenata običnih hromozoma, takvi se mini kromosomi dugo zadržavaju u stanicama i mogu nositi gene pune veličine (genomske) i njihove prirodne regulatorne elemente, koji su neophodni za pravilno funkcioniranje. gena, u pravom tkivu iu pravo vrijeme.

PRINCIPI GENE TERAPIJE

Ovisno o načinu uvođenja egzogene DNK u genom pacijenta, genska terapija se može provoditi ili u ćelijskoj kulturi (ex vivo) ili direktno u telu (in vivo). Ćelijska genska terapija ili terapija ex vivo uključuje izolaciju i uzgoj tipova ćelija specifičnih za pacijente in vitro, uvođenje stranih gena u njih (na primjer, one koji pojačavaju imunološki odgovor tijela), odabir transficiranih klonova stanica i njihova ponovna infuzija istom pacijentu. Trenutno, većina programa genske terapije odobrenih za klinička ispitivanja koristi ovaj pristup.

Genska terapija in vivo zasniva se na direktnom uvođenju kloniranih i upakovanih DNK sekvenci u specifična tkiva pacijenta. Posebno obećavajuće za liječenje genetskih bolesti invivoČini se da je moguće uvođenje gena pomoću aerosoliziranih ili ubrizganih vakcina. Aerosol genska terapija se u pravilu razvija za liječenje plućnih bolesti (cistična fibroza, rak pluća).

Razvoju programa genske terapije prethodi detaljna analiza tkivno-specifične ekspresije odgovarajućeg gena, identifikacija primarnog biohemijskog defekta, proučavanje njegove strukture, funkcije i unutarćelijske distribucije. proteinski proizvod, kao i biohemijska analiza patološkog procesa. Svi ovi podaci se uzimaju u obzir pri izradi odgovarajućeg medicinskog protokola. Testiranje postupka genske korekcije nasljedne bolesti provodi se na primarnim kulturama ćelija pacijenta, u kojima je ovaj gen normalno funkcionalno aktivan. Pomoću ovih ćelijskih modela procjenjuje se efikasnost odabranog sistema prijenosa egzogene DNK, utvrđuje ekspresija unesenog genetskog konstrukta, analizira njegova interakcija sa genomom ćelije i razvijaju se metode korekcije na biohemijskom nivou.

Koristeći ćelijske kulture, moguće je razviti sistem za ciljanu isporuku rekombinantne DNK, međutim, ispitivanje pouzdanosti rada ovog sistema može se provesti samo na nivou cijelog organizma. Zbog toga se toliko pažnje posvećuje eksperimentima u programima genske terapije. in vivo na prirodnim ili umjetno dobivenim modelima odgovarajućih nasljednih bolesti kod životinja. Uspješna korekcija genetskih defekata kod ovakvih životinja i odsustvo neželjenih nuspojava genske terapije najvažniji su preduvjeti za rješavanje kliničkim ispitivanjima.

dakle, standardna šema Genska korekcija nasljednog defekta uključuje niz uzastopnih faza. Počinje stvaranjem potpuno funkcionalne (izražene) genetske konstrukcije koja sadrži semantičke (kodirajuće proteine) i regulatorne dijelove gena. U sljedećoj fazi rješava se problem vektora, čime se osigurava efikasna i, ako je moguće, ciljana isporuka gena do ciljnih stanica. Zatim se vrši transfekcija (transfer nastalog konstrukta) u ciljne ćelije, procenjuje se efikasnost transfekcije i stepen ispravljivosti primarnog biohemijskog defekta u uslovima ćelijske kulture. (in vitro) i, što je najvažnije, in vivo na životinjskim biološkim modelima. Tek nakon toga može započeti program kliničkog ispitivanja.

GENOTERAPIJA MONOGENIH NASLJEDNIH BOLESTI

Uspjeh prvih kliničkih ispitivanja bio je snažan poticaj da se ubrza razvoj novih metoda genske terapije primijenjenih na druge nasledne bolesti. Ispod je lista bolesti za koje je pristup genskoj terapiji u osnovi moguć, čija će genska korekcija vjerovatno biti provedena u dogledno vrijeme, kao i onih bolesti za koje već postoje službeno odobreni protokoli i koje su u različitim fazama. kliničkih ispitivanja.

Tabela 1– Nasljedne bolesti čija je genska korekcija u fazi kliničkih ispitivanja (CT), eksperimentalnog razvoja (ED) i fundamentalno moguća (PV)

Bolest	Defektan gen	Ciljane ćelije	Stage
Imunodeficiency	Adenozin deaminaza	Limfociti
Imunodeficiency	Purin nukleozid fosforilaza	Limfociti
Porodična hiperholesterolemija	Lipoproteinski receptor niske gustine	Hepatociti
Hemofilija B	Faktor IX	Fibroblasti
Hemofilija A	Faktor VIII	Mioblasti, fibroblasti
Gaucherova bolest (sfingolipidoza)	p-glukocerebrozidaza	Makrofagi, matične ćelije
Hunterova bolest	Iduronat sulfatase	Makrofagi, matične ćelije
Hurlerov sindrom	L-iduronidaza	Makrofagi, matične ćelije
Emfizem	α -1 -Antitripsin	Limfociti
Cistična fibroza	SG-transmembranski regulator	Bronhijalni epitel
Fenilketonurija	Fenilalanin hidroksilaza	Hepatociti
Hiperamonemija	Ornitin transkarbamilaza	Hepatociti
Citrulinemija	Arginosukcinat sintetaza	Hepatociti
Duchenneova mišićna distrofija	Distrofije	Mioblasti, miofibrili
Talasemija	β-Globin	Eritroblasti
Anemija srpastih ćelija	β-Globin	Eritroblasti
Respiratorni distres sindrom	Surfaktant protein B	Bronhijalni epitel
Hronična granulomatoza	NADPH oksidaza	Granulociti
Alchajmerova bolest	Amiloid-β prekursorski protein (AAP)	Nervne celije
Parkinsonova bolest	Tirozin hidroksilaza	Mioblasti, fibroblasti, nervne ćelije
Metakromatska lekodistrofija	Arilsulfataza A	Matične ćelije krvi, nervne ćelije
Lesch-Nyhan sindrom	Hipoksantin fosforiboziltransferaza	Nervne celije

GENOTERAPIJA NENASLJEDNIH BOLESTI

Uporedo s razvojem istraživanja u oblasti genske korekcije nasljednih defekata, uspješno je bilo i traženje metoda za terapijsku primjenu sekvenci čulnih DNK za liječenje nenasljednih bolesti, uglavnom malignih tumora i virusnih infekcija. Značajno je da se upravo u ovim dijelovima patologije posebno intenzivno traga za načinima genske korekcije, a broj već odobrenih protokola kliničkih ispitivanja višestruko je veći od broja onih za liječenje monogenih bolesti.

U nastavku su navedeni glavni metodološki pristupi genskoj terapiji za različite tumore koji su razvijeni i već se široko koriste. Mnogi od ovih pristupa također su primjenjivi u borbi protiv najozbiljnijih zaraznih bolesti, kao što je HIV infekcija (AIDS).

Rezultati ranih kliničkih ispitivanja ovih pristupa bili su izuzetno ohrabrujući, posebno u liječenju neurodegenerativnih bolesti i karcinoma nervnog sistema.

Tabela 2 - Osnovni pristupi genskoj korekciji bolesti raka

	Uvedeni geni
Povećana imunoreaktivnost tumora	Geni stranih antigena, citokini
Genetska modifikacija imunih ćelija	Geni citokina, kostimulatori
Ubacivanje gena “osjetljivosti” ili gena “samoubistva”.	HSV timidin kinaza, geni citozin deaminaze
Blok ekspresije onkogena	Antisense Ki-ras mRNA, intracelularni geni antitijela
Insercija tumor supresorskih gena
Štiti normalne ćelije od kemoterapije	Geni otpornosti na lijekove tipa 1
Indukcija sinteze antitumorskih supstanci normalne ćelije	Geni interleukina-2, interferon
Proizvodnja antitumorskih rekombinantnih vakcina	Vakcine kao što je BCG koje eksprimiraju tumorski antigen
Lokalna radioprotekcija normalnih tkiva antioksidansima	Geni transferaze, glutation sintetaza

NEKA ETIČKA I DRUŠTVENA PITANJA

GENSKA TERAPIJA

Pojava fundamentalno novih tehnologija koje omogućavaju aktivnu manipulaciju genima i njihovim fragmentima i osiguravaju ciljanu isporuku novih blokova genetskih informacija određenim regijama genoma postala je važan događaj u biologiji i medicini.

Već sada, na sadašnjem nivou znanja o ljudskom genomu, takve modifikacije su teoretski sasvim moguće kako bi se poboljšali neki fizički (npr. visina), mentalni i intelektualni parametri. Tako se moderna ljudska nauka, u svom novom krugu razvoja, vratila ideji poboljšanja ljudske rase, koju je nekada pretpostavio istaknuti engleski genetičar F. Galton i koju su razvili njegovi učenici i sljedbenici u Velikoj Britaniji (K. Pearson , L. Penrose, J. Haldane), u Rusiji (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), u SAD (G. Möller). Dalji tok istorije, kao što znamo, potpuno je diskreditovao samu ideju poboljšanja ljudske rase. Međutim, buduća svemoć čovjeka nad vlastitim genomom tjera nas da se iznova vraćamo ovoj temi, čineći je predmetom stalnih žustrih rasprava u opštoj i naučnoj štampi. Nema sumnje da su početni strahovi povezani sa ljudskim genetskim inženjeringom bili neopravdani. Upotreba genske terapije u liječenju mnogih bolesti već je prepoznata kao preporučljiva. Jedino i neizostavno ograničenje, koje i dalje važi u savremenim uslovima, jeste da sve mere genske terapije treba da budu usmerene samo na određenog pacijenta i da se tiču ​​isključivo njegovih somatskih ćelija.

Trenutni nivo znanja ne dozvoljava korekciju genskih defekata na nivou zametnih ćelija i ćelija ranih preimplantacionih ljudskih embriona zbog stvarna opasnost kontaminacija genskog fonda neželjenim vještačkim genskim konstruktima ili uvođenje mutacija sa nepredvidivim posljedicama po budućnost čovječanstva. Istovremeno, u naučnoj literaturi sve su češći i uporniji pozivi da se nastavi rasprava o preporučljivosti genske korekcije ljudskih klica i germinativnih ćelija.

Ovo su neka od pitanja kojima se treba pozabaviti u okviru šire debate o genskoj terapiji koju predlažu genetičari.

1. Hoće li genska terapija u budućnosti moći pružiti tako potpunu korekciju gena da neće predstavljati prijetnju za potomstvo?

2. U kojoj mjeri korist i neophodnost postupka genske terapije za jedan par nadmašuju rizik od takve intervencije za cijelo čovječanstvo?

3. Koliko će ovi postupci biti opravdani s obzirom na nadolazeću prenaseljenost planete?

4. Kako će se aktivnosti genetskog inženjeringa na ljudima odnositi na probleme homeostaze društva i biosfere?

Dakle, genetska revolucija, čija je apoteoza bila genska terapija, ne samo da nudi prave načine liječenja teških nasljednih i nenasljednih bolesti, već i u svom brzom razvoju postavlja nove probleme za društvo čije je rješenje hitno neophodno u bliskoj budućnosti.

Danas, genska terapija konačno počinje da opravdava nade koje su joj nekada polagane. U proteklih šest godina, kao rezultat uvođenja specifičnih funkcionalnih gena u dijelove tijela pacijenta, moguće je vratiti vid kod 40 pacijenata sa nasljednim sljepoćom. Postignuti su sjajni rezultati u borbi protiv razne forme leukemija: od 120 ispitanika, nekoliko pacijenata je postiglo remisiju, koja je trajala tri godine. Genska terapija je pokazala i svoju efikasnost u borbi protiv hemofilije, nasljedne bolesti koja ponekad dovodi do smrti pacijenta. Sada pacijent ne mora uzimati visoke doze lijekova koji povećavaju zgrušavanje krvi i imaju opasne nuspojave.

Pozitivni rezultati su dočekani s velikim entuzijazmom i zato što je genska terapija napuštena prije 15 godina nakon prerane smrti Jessea Gelsingera, tinejdžera s rijetkim probavnim poremećajem. Imuni sistem mladi čovjek reagovao na uvođenje stranog gena tako burno da tijelo to nije moglo podnijeti. Uspjesi genske terapije postignuti 1990-ih nisu bili ni približno tako impresivni kao što se očekivalo.

Sve nas je to natjeralo da preispitamo neke od korištenih metoda i trezvenije procijenimo mogućnosti primjene genske terapije za eliminaciju razne patologije. Morao sam odustati od iluzija i vratiti se osnovna istraživanja. Prije svega, trebalo je utvrditi uzrok mogućeg nuspojave(poput onih koji su doveli do Gelsingerove smrti) i naučite ih izbjegavati. Trebalo je više pažnje posvetiti komunikaciji sa pacijentima i njihovim rođacima kako bi odluke koje donose bile informisane.

Prekretnica u situaciji dogodila se prije šest godina, nakon što je genskom terapijom izliječen osmogodišnji dječak po imenu Corey Haas, koji je bolovao od degenerativne bolesti oka. U početku, kao rezultat manipulacije genom, protein koji nedostaje počeo je da se proizvodi u zahvaćenoj mrežnjači lijevog oka, a četiri dana nakon operacije dječak je posjetio zoološki vrt i, na svoje neopisivo oduševljenje, shvatio da vidi plavu nebo i raznobojni baloni. Tri godine kasnije, slične manipulacije izvedene su i desnim okom. Sada Corey tako dobro vidi da može ići u lov sa svojim djedom.

Genska terapija još nije ušla u arsenal praktičara, ali postoji nada da će se to dogoditi u narednih deset godina. U Evropi je 2012. godine pokušano da se njime eliminiše retka, ali izuzetno bolna patologija, takozvani familijarni nedostatak lipoprotein lipaze. Očekuje se da će u Sjedinjenim Državama odobrenje za primjenu genske terapije u medicini dobiti 2016. godine, a potom će morati nadoknaditi izgubljeno tokom deset godina nedjelovanja.

Okrutno razočarenje

Neuspjesi koji su zadesili istraživače u ranim fazama korištenja genske terapije u praksi jasno su pokazali koliko je teško predvidjeti sve posljedice unošenja stranih gena u organizam. Prečesto se pokazalo da su najsigurniji sistemi za njihovu isporuku nedovoljno efikasni, a neki od najefikasnijih su nesigurni: dolazi do prenasilne imunološke reakcije, kao što je bio slučaj sa Gelsingerom, ili se razvija leukemija.

Kako bi razumjeli šta izaziva nuspojave i otkrili kako smanjiti rizik od njih, genetičari su se fokusirali na pomno proučavanje najčešćeg sistema za isporuku gena: dizajniranje virusa koji djeluju poput mikroskopskih špriceva za injekciju.

Prije svega, značajan dio virusne DNK je uklonjen kako bi se napravio prostor za gene koji su trebali biti uneti u tijelo pacijenta. (Ova procedura je virusu istovremeno lišila sposobnost reprodukcije.) Transformirani virus, koji nosi ciljne gene, ubrizgavan je u željeni dio tijela, gdje ih je ubacivao u odgovarajuće regije ćelijske DNK, ovisno o vrsti virusa.

U vrijeme kada je Gelsinger volontirao u kliničkim ispitivanjima genske terapije, najčešći sistem isporuke stranih gena kod ljudi bili su adenovirusi, koji obično uzrokuju blage infekcije gornjih disajnih puteva. Prema istraživačima sa Univerziteta u Pensilvaniji, optimalan rezultat daje injekciju virusa u jetru; tu se nalaze ćelije koje proizvode probavni enzim koji je nedostajao Gelsingeru. Funkcionalna kopija gena za ovaj enzim umetnuta je u inaktiviranu virusnu česticu i trilion ovih čestica je ubrizgano u pacijentovu jetru.

Nažalost, neke čestice su ušle ne samo u ćelije jetre, kako je trebalo, već i u ogroman broj makrofaga - velike ćelije, "čuvari" imunološki sistem, kao i u dendritske ćelije, obavještavajući potonjeg o invaziji stranih agenata. Imuni sistem je odmah počeo da uništava sve zaražene ćelije, a ovaj nasilni proces je na kraju ubio pacijenta.

Ozbiljnost imunološkog odgovora zadivila je istraživače. Nijedan od 17 drugih volontera nije doživio ništa slično. Bilo je poznato da adenovirus može izazvati imunološku reakciju, ali osim incidenta koji je uključivao jednog majmuna kojem je ubrizgan adenovirus malo drugačiji od gore opisanog, Gelsingerov slučaj je bio jedinstven. "Ljudska populacija je mnogo heterogena od životinjske", kaže James Wilson sa Univerziteta u Pensilvaniji, koji je razvio ciljani sistem za isporuku gena koji se koristio u Gelsingerovim kliničkim ispitivanjima "A u našem slučaju, jedan pacijent je na neki način bio značajno drugačiji od ostatka." Možda do tragedije ne bi došlo da je doza virusa bila manja - ne trilion čestica, već nekoliko milijardi. Druga mana je bila što ni pacijent ni njegova rodbina nisu bili obaviješteni o smrti majmuna u sličnim testovima, a niko nije znao kakvu bi odluku donijeli da je znao za incident.

Tragedija koja se dogodila Gelsingeru nije posljednja. Ubrzo je učinjen pokušaj da se genskom terapijom eliminira još jedna patologija - teška kombinirana imunodeficijencija XI (SCID-X1). U testovima je učestvovalo 20 djece; Njih petoro je dobilo leukemiju, jedno dijete je umrlo. I opet je sistem dostave bio kriv, doduše u ovom slučaju korišten je još jedan vektor - retrovirus, koji ubacuje ciljne gene direktno u ćelijsku DNK. Njihova tačna lokacija u genomu neznatno varira, a ponekad se uključuju u blizini onkogena, što pod određenim uvjetima dovodi do raka.

Ponovno razmatranje tehnologije

Tragične posljedice korištenja retro- i adenovirusa kao vektora natjerale su nas da se okrenemo drugim vektorima. Kao rezultat, odabrana su dva virusa.

Prvi od njih, adeno-associated virus (AAV), ne uzrokuje nikakve infekcije kod ljudi. Većina nas u jednom ili drugom trenutku u životu postane njegov nosilac, i zbog toga je malo vjerovatno da će imunološki sistem reagirati na njega kada djeluje kao vektor. AAV ima još jednu osobinu koja pomaže da se minimizira rizik od nuspojava: dolazi u mnogo varijanti (serotipova), od kojih svaki preferira da inficira ćelije "svog" organa ili tkiva. Dakle, za AAV2 su to oči, za AAV8 - jetra, za AAV9 - srčani mišić i mozak. Možete odabrati vrstu virusa koja je optimalna za ciljni dio tijela i minimizirati imunološki odgovor i drugo neželjeni efekti. Osim toga, AAVue ugrađuje svoj genetski materijal u genom ćelije domaćina i stoga ne može uzrokovati rak nasumično aktivirajući onkogene.

Adeno-asociran virus je prvi put testiran na sposobnost da isporuči genetski materijal u željena tkiva 1996. godine. Testovi su sprovedeni na dobrovoljcima koji boluju od cistične fibroze. Od tada je identificirano 11 serotipova ovog virusa, a stotine sigurnih, selektivnih vektora su konstruirane od njihovih komponenti. Vektori bazirani na AAV virusu trenutno se testiraju za gensku terapiju kod patologija kao što su Parkinsonova i Alchajmerova bolest, kao i hemofilija, mišićna distrofija, zatajenje srca i sljepoća.

Drugi virus je, iznenađujuće, oslabljena verzija virusa ljudske imunodeficijencije, uzročnika AIDS-a. Zaboravimo na trenutak na njenu lošu reputaciju i fokusirajmo se na njene prednosti kao vektora. HIV je član roda Lentivirusa iz porodice rstrovirusa. Deluje na ćelije imunog sistema i – što je veoma važno – ne aktivira onkogene.

Ako uklonimo gene odgovorne za smrtonosno dejstvo HIV-a, dobićemo odličan vektor sa širokim spektrom mogućnosti. Tako kaže Stuart Naylor, bivši naučni direktor engleske kompanije Oxford Biomedica. Za razliku od manjih AAV, “neutralizovani” HIV je pogodan za prijenos nekoliko gena odjednom. Netoksičan je i ne izaziva imunološke reakcije. Lentivirusi, lišeni sposobnosti izazivanja infekcije, testiraju se na mogućnost njihove upotrebe za uklanjanje različitih patologija, posebno adenoleukodistrofije. Danas je nekoliko dječaka s ovom dijagnozom uspjelo da se vrati u školu zahvaljujući genskoj terapiji.

Paralelno sa kliničkim ispitivanjima koristeći HIV AAVn, radi se na modifikaciji starijih virusnih vektora kako bi se mogli koristiti u određenim okolnostima. Dakle, retrovirusi (osim HIV-a) su genetski modificirani tako da ne uzrokuju leukemiju.

Čak ni adenovirus, čija je upotreba dovela do Gelsingerove smrti, nije u potpunosti odbačen. Sada se ubrizgava samo u dijelove tijela gdje je malo vjerovatno da će izazvati imunološku reakciju. Jedna od njegovih mogućih primjena je genska terapija za kserotomiju (suha usta) kod pacijenata koji su bili izloženi zračenju za rak područja glave i vrata. u kojoj su oštećeni pljuvačne žlijezde.

Nacionalni institut za zdravlje provodi kliničko ispitivanje (koji uključuje mali broj dobrovoljaca) pristupa koji se zasniva na uvođenju gena u odgovarajuće ćelije koji posreduju u formiranju kanala za prolaz vode u pljuvačne žlijezde. Budući da su potonji male veličine i manje-više izolirani, a doza virusa je 1000 puta manja od one koju je Gelsinger jednom primio, vjerojatnost prejake imunološke reakcije je svedena na minimum. Virusne čestice koje ne stignu do ciljnih stanica, prema riječima programera, trebale bi se uništiti u pljuvački, ispljunuti zajedno s njom ili progutati, što opet smanjuje rizik od razvoja imunološke reakcije. Od 2006. godine ova metoda je značajno poboljšala stanje 11 pacijenata.

Nove mete

Inspirirani uspjehom, medicinski genetičari proširili su obim genske terapije i pokušali je koristiti za uklanjanje nenasljednih genetskih defekata.

Tako Univerzitet Pensilvanije već koristi ovaj pristup u borbi protiv jednog od najčešćih karcinoma kod djece – akutne limfoblastne leukemije (ALL). Za otprilike 20% djece s ovom dijagnozom tradicionalna kemoterapija ne pomaže.

Genska terapija je u takvim slučajevima posebno složena i oslanja se na upotrebu himernih antigenskih receptora (CAR). Poput himera starogrčke mitologije, koje se sastoje od dijelova tijela različitih životinja, ovi receptori su kompleks dvije komponente imunološkog sistema koje se inače ne nalaze u tijelu. T ćelije za koje je vezan stiču sposobnost da traže specifične proteine ​​sadržane u ćelijama leukemije u većim količinama od normalnih i uništavaju abnormalne ćelije. Prvi ispitanici bili su odrasli pacijenti sa hronična leukemija: Dobijeni rezultati su bili ohrabrujući. Ishod ispitivanja na bolesnoj djeci premašio je sva očekivanja.

Kada je Emily Whitehead u maju 2010. dijagnosticirana leukemija, imala je devet godina. Dva kursa kemoterapije nisu dala rezultate. U proleće 2012. godine sproveli su treći kurs, koji je mogao da ubije odraslu osobu, ali je devojčica preživela, iako su joj se javili problemi sa bubrezima, jetrom i slezinom. Prema ljekaru Bruceu Levineu. "Emili je bila na ivici smrti."

Zatim su joj uzeli krv, izolovali T-ćelije i ubrizgali im lentivirus. u čiji genom su prethodno bili uključeni ciljni geni. Nakon ubrizgavanja himernih T ćelija natrag u tijelo pacijentice, njeno stanje je počelo naglo da se poboljšava. Nakon tri nedelje, 25% T ćelija njene koštane srži je genetski modifikovano i počelo je lov na ćelije raka. “U aprilu je djevojka potpuno ćelala. “prisjeća se Levin, “a do avgusta je poprimila svoj prethodni izgled i bila spremna za školu.”

Modifikovane T ćelije verovatno neće raditi do kraja njenog života, ali se postupak uvek može ponoviti. U međuvremenu, ova zgodna djevojka guste smeđe kose nema ćelije raka. U jesen 2013. godine, nekoliko grupa medicinskih genetičara prijavilo je korištenje CAR tehnike za liječenje 120 pacijenata sa istim oblikom leukemije kao i Emily Whitehead, kao i drugim oblicima. Pet odraslih i 19 od 22 djece otišlo je u remisiju.

Izgledi

Sada se istraživači genske terapije suočavaju sa još jednim izazovom: moraju dobiti odobrenje od Uprave za hranu i lijekove (FDA) da koriste svoj sigurniji nego ikad prethodni vektorski sistem u klinici. Neophodno je organizovati III fazu kliničkih ispitivanja koja uključuju veliku grupu volontera. To obično traje od jedne do pet godina. Do kraja 2013. godine, otprilike 5% od 2.000 ispitivanja doseglo je ovu fazu. Kreatori metode liječenja pomoću genske terapije za pacijente koji pate od Leberove bolesti (bilateralni gubitak vida uzrokovan mutacijom mitohondrijalne DNK: osmogodišnji Haas je imao ovu patologiju) napredovali su dalje od drugih. Nekoliko desetina pacijenata je već uspjelo povratiti vid pomoću genske terapije.

Članak za konkurs "bio/mol/tekst": « Miša je rođen 12. februara zdravo dete. Ali sa 1,5 mjeseca počela sam primjećivati ​​da na svim fotografijama beba zauzima isti položaj, kao da su mu noge nepomične. U roku od nekoliko sedmica postavili su nam dijagnozu, saosjećali s nama i savjetovali nas da počnemo planirati na trenutak, zdravo dete " Zbog fatalne kombinacije gena, Misha je, kao i druga djeca sa ovom bolešću, bio primoran da se bori za svaki pokret tokom svog kratkog života. Borite se očajnički, svom snagom, ali na kraju izgubite. Kičma atrofija mišića (SMA) jedna je od genetskih abnormalnosti protiv kojih je čovječanstvo još uvijek nemoćno. Međutim, uspjesi genske terapije, koje svijet medicine danas promatra, mogu prebaciti i SMA i druge teške nasljedne patologije u kategoriju izlječivih. Štaviše, izlječive su u maternici.

Generalni pokrovitelj takmičenja je kompanija Diaem: najveći dobavljač opreme, reagensa i potrošnog materijala za biološka istraživanja i proizvodnju.

Pokrovitelj nagrade publike je Medicinsko genetički centar.

"Knjiga" pokrovitelj takmičenja - "Alpina Non-fiction"

Priroda griješi, čovjek ispravlja

Koncept genske terapije je elegantan i lijep, kao i sve genijalne stvari. Sastoji se od dostavljanja zdravog genetskog materijala u ćeliju pomoću vektorskih sistema kako bi se zamijenili “pogrešni” geni sa kojima su povezane različite bolesti (slika 1).

“Biomolekul” je već detaljno pisao o mogućnostima koje genetska terapija otvara u liječenju karcinoma i nasljednih abnormalnosti, posebno retinitis pigmentosa.

I ako je 80-ih godina prošlog vijeka, kada su počeli prilično glasno pričati o genskoj terapiji, njena teorija se mnogima činila kao nastavak scenarija filma „Povratak u budućnost“, a danas je postala stvarnost, otvara nove, zaista bezgranične perspektive.

Međutim, jasno je da genska terapija ima niz ograničenja, posebno kada mi pričamo o tome o nasljednim bolestima. Prije svega, patološki proces u takvim slučajevima može započeti u maternici. Do trenutka kada je bolest konačno dijagnosticirana – ponekad godinama nakon rođenja bebe – mogla bi se razviti nepovratna oštećenja ćelija i organa, značajno ograničavajući ili eliminirajući terapijske mogućnosti.

Šansa za rješavanje ovog problema ukazala se zahvaljujući savremenoj prenatalnoj dijagnostici, koja omogućava otkrivanje hromozomskih defekata već u ranim fazama trudnoće. Dobivanjem bilo kojeg fetalnog materijala invazivnim tehnikama, genetske bolesti se mogu brzo i pouzdano dijagnosticirati. A u slučajevima s hemoglobinopatijama, potreba za invazivnim manipulacijama potpuno nestaje: za njihovu identifikaciju dovoljno je ispitati fetalnu DNK dobivenu iz majčinih krvnih stanica.

Moderne prenatalne dijagnostičke tehnike u kombinaciji s napretkom u genskoj terapiji pružaju jedinstvenu priliku da se ispravi "greška" prirode i intervenira u patološkom procesu prije nepovratnog oštećenja stanica. Omogućiti liječenje raznih bolesti djeteta u maternici ili, prema najmanje, može, po svoj prilici, obuzdati napredovanje bolesti fetalna genska terapija, ili fetalna genska terapija.

Ideja fetalne genske terapije daleko je od nove: samo nekoliko godina nakon prvog pokušaja genske terapije kod odraslih, 1994. godine, istraživači su počeli ozbiljno raspravljati o korištenju inovativne tehnike u maternici. Danas, kada se liječenje genetskih bolesti u maternici gotovo pretvorilo iz fantastične perspektive u stvarnost, objavljeno je mnogo radova u kojima je objavljena fetalna genska terapija i njene prednosti u odnosu na gensku terapiju kod odraslih.

Prenatalno vs postnatalno

Predviđajući pitanja o preporučljivosti intrauterine korekcije genetske abnormalnosti, hajde da se odmah fokusiramo na prednosti fetalne genske terapije u odnosu na postnatalnu gensku terapiju.

Širok spektar efekata na organe i sisteme

Poznato je da kod mnogih genetskih bolesti (na primjer, buloza epidermolize ili cistične fibroze) može biti prilično teško utjecati na glavne karike. patološki proces skoro odmah nakon rođenja. Korekcija mutantnih gena u fetusu u razvoju omogućava vam da brzo povećate populaciju matičnih stanica, pružajući veliki skup transficiranih stanica i, kao posljedicu, izražen terapeutski učinak.

Pojednostavljena proizvodnja kliničkog vektora koji nosi genetski materijal

Doziranje virusnog vektora koji se koristi za prijenos genetskog materijala ovisi o tjelesnoj težini. Zbog male veličine fetusa moguće je postići mnogo veću biodistribuciju vektora u istoj dozi kao i tokom genske terapije za odraslu osobu. Ovo štedi vrijeme i novac. Jednostavni uporedni podaci pomažu da se zamisli koliko su značajne uštede: na primjer, fetus u 14-16 sedmici trudnoće ( optimalno vreme vektorske indukcije) teži oko 100 g, dok je prosječna tjelesna težina odrasle osobe oko 60 kg.

Povećanje efikasnosti terapije zbog nepotpunog imunološkog odgovora

Brojne studije su pokazale da humoralni imunitet na adenoviruse i adeno-asociirane viruse (AAV) (Slika 2) određenih serotipova koji se obično koriste kao vektori može rezultirati neuspjehom ekspresije transgena. Ovo može biti jedna od kritičnih prepreka uspješnoj transplantaciji.

Oko 50% odraslih osoba koje imaju stečeni imuni odgovor na ove virusne vektore su u opasnosti. Ali čak i u odsustvu osjetljivosti, primjena vektora kod odraslih često dovodi do razvoja imunološkog odgovora koji smanjuje trajanje i nivo ekspresije transgena. Dakle, posle intramuskularna injekcija adenovirusni vektor sa proteinskim genom distrofin Odrasli miševi s Duchenneovom mišićnom distrofijom razvijaju antitijela na distrofin, što je povezano sa značajnim smanjenjem efikasnosti ekspresije. Istovremeno, fetus u maternici je imunološki nezreo, što omogućava isporuku virusnog vektora i transgenskog proizvoda bez ograničenja koje nameće imuni odgovor.

Očigledne prednosti fetalne terapije u odnosu na postnatalnu korekciju osiguravaju njenu veću efikasnost i izvodljivost, posebno kod teških bolesti opasnih po život. Čak iu slučajevima kada se ne može postići potpuno izlječenje, fetalna genska terapija može utjecati na patološke dijelove bolesti, olakšati njen tok i poboljšati prognozu. I, stoga, može postati jedina terapeutska alternativa prekidu trudnoće za hiljade porodica. Štaviše, broj bolesti koje bi se potencijalno mogle kontrolisati kada se fetalna genska terapija uvede u kliničku praksu je zaista ogroman.

Izgledi i prilike

Vjeruje se da je fetalna genska terapija sposobna staviti pod kontrolu mnoge opasne patologije. Samo mali dio njih prikazan je u tabeli 1.

Tabela 1. Bolesti koje se mogu kontrolisati fetalnom genskom terapijom .

Bolest	Lijek za gensku terapiju	Ciljane ćelije i/ili organ	Starost manifestacije bolesti	Prevalencija	Životni vijek
Cistična fibroza	CFTR (transmembranski regulator)	Epitelne ćelije respiratornog trakta i creva	Treći trimestar trudnoće	1:4000	Star oko 35 godina
Duchenneova mišićna distrofija	Distrofin	Miociti	2 godine	1:4500	25 godina
Spinalna mišićna atrofija	SMN protein	Motorni neuroni	6 mjeseci (tip I)	1:10 000	2 godine
Hemofilija	Faktor zgrušavanja VIII ili IX	Hepatociti	1 godina	1:6000
Beta talasemija	Globin	Prekursor crvenih krvnih zrnaca	Do godinu dana	1:2700	Do 20 godina
Gaucherova bolest	Glucocerebrosidase	Hepatociti	9,5 godina	1:59 000	Manje od 2 godine
Defekti ciklusa uree	Ornitin transkarbamilaza	Hepatociti	2 dana	1:30 000	2 dana
Epidermolysis bullosa	Kolagen tip VII	Keratinociti	Rođenje	1:40 000	Uz pravilnu terapiju, normalan životni vijek
Hipoksična ishemijska encefalopatija	Neurotrofni faktori	Kortikalni neuroni	Rođenje	1:1000	Uz pravilnu terapiju, normalan životni vijek
Teška intrauterina restrikcija rasta	Faktori rasta placente	Trophoblast	Fetus	1:500	Nekoliko dana

Osim toga, patologije za koje se smatra da se kontroliraju fetalnom terapijom uključuju:

• Poremećaji imunodeficijencije- sindrom golih limfocita, hipoplazija hrskavice, Chediak-Higashi sindrom, hronična granulomatozna bolest, Kostmanov sindrom, nedostatak adhezije leukocita, Omennov sindrom, Wiskott-Aldrich sindrom.
• Hemoglobinopatije- Rh bolest, kongenitalna eritropoetska porfirija.
• Bolesti povezane s nedostatkom aktivnosti enzima- Gaucherova bolest, Krabbeova bolest, metahromatska leukodistrofija, mukopolisaharidoze, Wolmanova bolest, Niemann-Pickova bolest.
• Ostalo- kongenitalna diskeratoza, porodična hemafagocitna limfohistiocistoza, infantilna osteopetroza, Shwachman-Diamond sindrom itd.

Lista bolesti koje mogu biti u dosegu fetalne genske terapije je nevjerojatna: vjerovatno će ova tehnika omogućiti intervenciju u patološkim procesima koji su prethodno bili van kontrole čovjeka, a uzrokovani su monogenim bolestima. Njihov broj, prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji, dostiže deset hiljada. Ipak, važno je uzeti u obzir postojanje brojnih ograničenja, a prije svega rizike za majku i fetus povezane s intrauterinom genskom terapijom.

Strahovi i rizici

Specifični rizici prenatalnog transfera gena su fundamentalno različiti od rizika postnatalne genske terapije. To uključuje kratkoročne nuspojave i dugoročne postnatalne učinke. Njihova važnost je pogoršana činjenicom da hipotetički, ekspresija fetalnih gena može imati nepredvidive efekte na prenatalni i postnatalni razvoj.

Prije svega, sam postupak prijenosa je direktno povezan s povećanom vjerovatnoćom pobačaja, horioamnionitisa i prevremeni porod. Studije su dokumentirale upalne reakcije na vektor, posebno infiltraciju jetre i nekrozu jetre u genskoj terapiji fetusa ovaca.

Na uspjeh fetalne genske terapije može se suprotstaviti imuni odgovor fetusa, a to nosi određene rizike za konačni rezultat. Humoralni i stanični odgovori na uvođenje vektora ili transgenog proteina kroz sisteme ćelijske transdukcije mogu eliminirati produkte prijenosa ili neutralizirati ekspresiju transgena. Istovremeno, studije su pokazale zavisnost snage imunog odgovora o gestacijskoj dobi. Značajne imunološke reakcije na uvođenje lentivirusnog vektora u ranim i srednjim fazama trudnoće nisu zabilježene, dok je snažan humoralni odgovor na kapsidni antigen uočen uvođenjem adenovirusnog vektora u kasnim fazama.

Jedan od izuzetno važnih problema sa fetalnom genskom terapijom je potencijalni rizik koji nastaje pri prenošenju sekvenci donora DNK na fetus. Budući da je vektorska integracija u zametne ćelije vjerovatno nasumična, teoretski bi mogla imati katastrofalne posljedice za fetus. U stvari, dijete koje primi genetski materijal donora u maternici je rođeno kao mutant. Etička komponenta genske terapije zabrinjava umove naučnika i teologa. Potonji, od rođenja najpoznatije ovce u istoriji nauke, upozoravaju na opasnosti koje mešanje u Božji plan donosi čovečanstvu.

Drugi važan aspekt je uzrokovan vjerovatnoćom mutageneze u stanicama fetusa, što dovodi do defekta bilo kojeg funkcionalnog gena, što u konačnici može postati uzrok nove, stečene genetske bolesti ili maligni tumor. Ova mogućnost se čini još vjerovatnijom s obzirom na dokaze iz studije na miševima u kojoj je ekspresija gena u mišjim embrionima pokrenula razvoj tumora jetre.

U tom kontekstu, rezultati dvije studije koje pokazuju razvoj ozbiljnih nuspojava nakon uspješne genske terapije za X-vezanu kombinovanu imunodeficijenciju mogu biti daleko od slučajnosti: u prvom slučaju zabilježena je manifestacija monoklonske limfoproliferativne bolesti, a u drugo, proliferacija alfa/beta T-ćelija. I u prvom i u drugom slučaju, retrovirusni vektor je integriran u neposrednoj blizini gena LMO2 u proliferirajućim T ćelijama.

Teoretski genska terapija ex vivo može biti sigurnije od in vivo fetalna injekcija vektora. Iako to ne isključuje mogućnost mutageneze u stanicama koje su retrovirusno transducirane in vitro, uvođenje mutagena može se lakše otkriti i kontrolisati. Ipak, nažalost, ove komplikacije se ne mogu u potpunosti isključiti.

Konačno, fetalna genska terapija povećava osjetljivost fetalnih stanica na transdukciju. Retrovirusna transdukcija niskog nivoa u progenitore zametnih stanica uočena je u muškim i ženskim gonadama nakon intraperitonealne injekcije vektora u embrije ovaca i majmuna. Analiza faktora koji dovode do nenamjerne transdukcije pokazala je da osjetljivost fetalnog tkiva na nju zavisi od gestacijske dobi, s većom stopom transdukcije u ranoj trudnoći.

Sa stanovišta potencijalnih rizika, očigledno je da fetalna genska terapija može biti razumna metoda liječenja samo teških genetskih bolesti za koje ne postoje druge mogućnosti korekcije. A među njima je, naravno, i Gaucherova bolest, za koju je mogućnost intrauterine genske terapije dokazana u nedavno objavljenoj studiji.

Prvi koji ide: Gaucherova bolest

U julu 2018. magazin Prirodna medicina objavio je rezultate studije na mišu koju je vodio Simon Waddington ( Simon Waddington) sa Londonskog instituta zdravlje žena. Rezultati rada pokazali su efikasnost fetalne genske terapije u liječenju neurodegenerativnih bolesti, a posebno Gaucherove bolesti. Ovo je najčešći oblik među rijetkim nasljednim enzimopatijama, koji se temelji na nedostatku aktivnosti lizosomskih enzima glukozecerebrozidaza(slika 3), uzrokovane mutacijama u genu glukozilceramidaza. Ovisno o prirodi mutacija, može se razviti teški neuropatski oblik bolesti, koji se manifestira od djetinjstva, ili oblik s postupnijim početkom i manje izraženim simptomima. Dok blaži oblici Gaucherove bolesti dobro reaguju na zamjensku terapiju, teški oblik ostaje fatalan. Znakovi neizlječivog oblika Gaucherove bolesti javljaju se u prvim mjesecima života i uključuju progresivnu hipotoniju mišića, kašnjenje i regresiju psihomotornog razvoja i druge neurološke znakove.

U studiji, Waddington i suradnici su pokazali da je intrakranijalna injekcija vektora virusa 9 (AAV9) povezanog s adeno u embrionalne miševe 16. dana gestacije rezultirala povećanom ekspresijom glukozecerebrozidaze, što je preokrenulo neurodegeneraciju. Istovremeno, aktivnost enzima u mozgu bila je uporediva sa onom kod zdravih miševa. Unatoč činjenici da su bolesni glodari još uvijek dijagnosticirani upalni proces u mozgu su se znatno bolje razvijali od miševa iz kontrolne grupe, koji su zbog težine bolesti morali biti eutanazirani dvije sedmice nakon tretmana.

Miševi liječeni fetalnom genskom terapijom živjeli su najmanje 18 sedmica, bili su plodni i pokretni. Zanimljivo je da je postnatalna primjena vektora također ublažila bolest, ali je bila manje efikasna od prenatalne ekspresije.

Budući da je AAV9 mogao ući u mozak iz krvotoka, Waddingtonov tim je izveo još jedan eksperiment u kojem su ubrizgali značajno veću dozu vektora ne u mozak, već direktno u krv fetusa miša. Miševi se uglavnom nisu razlikovali od zdravih miševa nakon ekspresije, ali pošto su živjeli samo 55 dana, naučnici nisu bili u mogućnosti da izvuku zaključke o dugoročnoj efikasnosti intravenske genske terapije.

Waddingtonov eksperiment bio je najsloženiji rad do sada u kojem se provodila fetalna genska terapija na životinjama. Danas tim radi sa korporacijom Apollo Therapeutics, koji je ujedinio napore tri britanska univerziteta i tri velike farmaceutske kompanije. Waddington i njegove kolege slijede novi cilj: ovog puta imaju zadatak da dobiju pretkliničke podatke i potencijalno testiraju tretman na ljudima. I dok skeptici razmišljaju o rasponu mogućnosti za korištenje fetalne genske terapije kod ljudi, što može biti značajno suženo činjenicom da Gaucherova bolest nije uključena u prenatalne testove, Waddingtonov tim samouvjereno korača u budućnost. Budućnost u kojoj se djeca s Gošeovom bolešću, Duchenneovom mišićnom distrofijom, SMA i mnogim drugim rijetkim, ali danas, nažalost, neizlječivim bolestima mogu oporaviti.

Književnost

1. 12 metoda u slikama: genetski inženjering. Dio II: Alati i tehnike;
Imuni odgovori na vektore genske terapije: utjecaj na funkciju vektora i efektorske mehanizme. Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Imuni odgovor na distrofin pune dužine koji se isporučuje u Dmd mišić preko adenovirusnog vektora visokog kapaciteta. Molekularna terapija. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). In utero genska terapija i uređivanje genoma. Curr matične ćelije rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Najbolja praksa i istraživanje kliničkog porodništva i ginekologije. 22 , 203-218;
5. Sažetak sa fronta genske terapije. Nova strategija za neutralizaciju hemofilije;
6. Charles Coutell. (2008). Zašto se mučiti?: Da li je genska terapija inutero vrijedna truda? . Molekularna terapija. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al.. (2005). Onkogeneza nakon isporuke vektora nonprimarne lentivirusne genske terapije fetalnim i neonatalnim miševima. Molekularna terapija. 12 , 763-771;
8. Evropsko društvo za gensku terapiju (ESGT) Saopštenje za javnost, Bernd Gansbacher. (2003). Izvještaj o drugom ozbiljnom neželjenom događaju u kliničkom ispitivanju genske terapije za X-vezani teški kombinovani imunološki nedostatak (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al.. (2018). Fetalna genska terapija za neurodegenerativne bolesti dojenčadi. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Uvod

Svake godine sve više članaka o medicini kliničke studije, u kojem se, na ovaj ili onaj način, koristilo liječenje zasnovano na uvođenju različitih gena – genska terapija. Ovaj pravac je izrastao iz tako dobro razvijenih grana biologije kao što su molekularna genetika i biotehnologija.

Često, kada su konvencionalne (konzervativne) metode već isprobane, genska terapija može pomoći pacijentima da prežive, pa čak i da se potpuno oporave. Na primjer, ovo se odnosi na nasljedne monogene bolesti, odnosno one koje su uzrokovane defektom jednog gena, kao i mnoge druge. Ili, na primjer, genska terapija može pomoći i spasiti ud onim pacijentima koji su suzili lumen krvnih žila u donjih udova i kao rezultat toga, razvila se trajna ishemija okolnih tkiva, odnosno ta tkiva doživljavaju ozbiljan nedostatak nutrijenata i kiseonika, koji se normalno prenose krvlju kroz tijelo. Hirurške manipulacije a takve pacijente je često nemoguće liječiti lijekovima, ali ako bi stanice bile lokalno prisiljene da oslobađaju više proteinskih faktora koji bi utjecali na proces formiranja i klijanja novih žila, tada bi ishemija postala mnogo manje izražena i život bi postao mnogo lakši. za pacijente.

Genska terapija danas se može definirati kao liječenje bolesti uvođenjem gena u ćelije pacijenata kako bi se specifično promijenili genski defekti ili dali ćelijama nove funkcije. Prva klinička ispitivanja metoda genske terapije poduzeta su sasvim nedavno - 22. maja 1989. godine, u svrhu dijagnosticiranja raka. Prva nasljedna bolest kod koje su primijenjene metode genske terapije bila je nasljedna imunodeficijencija.

Svake godine raste broj uspješno provedenih kliničkih ispitivanja za liječenje različitih bolesti genskom terapijom, te je do januara 2014. dostigao 2 hiljade.

Istovremeno, u savremenim istraživanjima genske terapije potrebno je uzeti u obzir da su posledice manipulisanja genima ili „promešane“ (rekombinantne) DNK in vivo(latinski doslovno “u živom”) nisu dovoljno proučavani. U zemljama sa najnaprednijim nivoom istraživanja u ovoj oblasti, posebno u Sjedinjenim Državama, medicinski protokoli koji koriste čulne DNK sekvence podležu obaveznoj reviziji od strane relevantnih komiteta i komisija. U SAD-u su to Savjetodavni odbor za rekombinantnu DNK (RAC) i Uprava za hranu i lijekove (FDA), uz naknadno obavezno odobrenje projekta od strane direktora Nacionalni instituti zdravlje (Nacionalni instituti za zdravlje).

Tako smo odlučili ovaj tretman zasniva se na činjenici da ako nekim tkivima tijela nedostaju određeni pojedinačni proteinski faktori, onda se to može ispraviti uvođenjem odgovarajućih gena koji kodiraju proteine ​​u ta tkiva, i sve će postati manje-više divno. Same bjelančevine neće biti moguće uvesti, jer će naše tijelo odmah reagirati snažnom imunološkom reakcijom, a trajanje djelovanja bi bilo nedovoljno. Sada morate odlučiti o načinu isporuke gena u ćelije.

Transfekcija ćelije

Prvo, vrijedi uvesti definicije nekih pojmova.

Transport gena se vrši zahvaljujući vektor je DNK molekul koji se koristi kao " vozilo"za vještački prijenos genetskih informacija u ćeliju. Postoji mnogo tipova vektora: plazmidni, virusni, kao i kozmidi, fazmidi, veštački hromozomi, itd. Osnovno je važno da vektori (posebno plazmidni) imaju svojstva karakteristična za njih:

1. Porijeklo replikacije (ori)- sekvenca nukleotida od koje počinje umnožavanje DNK. Ako se vektorska DNK ne može udvostručiti (replicirati), tada se neće postići potreban terapeutski učinak, jer će se jednostavno brzo razgraditi intracelularnim nukleaznim enzimima, a zbog nedostatka šablona u konačnici će se formirati mnogo manje proteinskih molekula. Treba napomenuti da su ove tačke specifične za svaku biološku vrstu, odnosno ako se vektorska DNK treba dobiti razmnožavanjem u bakterijskoj kulturi (a ne samo hemijskom sintezom, koja je obično mnogo skuplja), onda dva biće potrebno odvojeno porijeklo replikacije - za ljude i za bakterije;

2. Mjesta ograničenja- specifične kratke sekvence (obično palindromne), koje prepoznaju posebni enzimi (restrikcione endonukleaze) i od njih seku na određeni način - sa formiranjem „lepljivih krajeva“ (slika 1).

Slika 1. Formiranje “ljepljivih krajeva” uz učešće restrikcijskih enzima

Ova mjesta su neophodna kako bi se vektorska DNK (koja je, u suštini, "prazna") spojila sa željenim terapeutskim genima u jedan molekul. Takav molekul umrežen iz dva ili više dijelova naziva se “rekombinantnim”;

3. Jasno je da bismo željeli dobiti milione kopija rekombinantnog molekula DNK. Opet, ako imamo posla sa kulturom bakterijskih ćelija, onda ovu DNK treba izolovati. Problem je u tome što sve bakterije neće progutati molekule koje su nam potrebne; Da bi se razlikovale ove dvije grupe, umeću se selektivni markeri- područja otpornosti na određene hemikalije; Sada, ako dodate baš te supstance u okolinu, tada će preživjeti samo one koje su otporne na njih, a ostale će umrijeti.

Sve ove tri komponente se mogu uočiti u prvom veštački sintetizovanom plazmidu (slika 2).

Fig.2

Proces uvođenja plazmidnog vektora u određene ćelije naziva se transfekcija. Plazmid je prilično kratka i obično kružna molekula DNK koja se nalazi u citoplazmi bakterijske ćelije. Plazmidi nisu povezani s bakterijskim hromozomom, mogu se replicirati neovisno o njemu, a bakterija ih može otpustiti u okruženje ili, obrnuto, biti apsorbovan (proces apsorpcije je transformacija). Uz pomoć plazmida, bakterije mogu razmjenjivati ​​genetske informacije, na primjer, prenoseći otpornost na određene antibiotike.

Plazmidi postoje u bakterijama prirodni uslovi. Ali niko ne može spriječiti istraživača da umjetno sintetizira plazmid koji će imati svojstva koja su mu potrebna, da u njega ubaci genski umetak i unese ga u ćeliju. U isti plazmid mogu se umetnuti različiti umetci .

Metode genske terapije

Postoje dva glavna pristupa, koja se razlikuju po prirodi ciljnih ćelija:

1. Fetalni, kod kojeg se strana DNK unosi u zigotu (oplođeno jaje) ili embrion u ranoj fazi razvoja; u ovom slučaju se očekuje da će uneseni materijal ući u sve ćelije primaoca (pa čak i u zametne ćelije, čime će se osigurati prijenos na sljedeću generaciju). Kod nas je to zapravo zabranjeno;

2. Somatski, u kojem se genetski materijal unosi u nereproduktivne ćelije već rođene osobe i ne prenosi se na zametne ćelije.

Genska terapija in vivo zasniva se na direktnom uvođenju kloniranih (umnoženih) i upakovanih DNK sekvenci na određeni način u određena tkiva pacijenta. Posebno obećavajuće za liječenje genskih bolesti in vivo je uvođenje gena pomoću aerosola ili ubrizganih vakcina. Aerosol genska terapija se u pravilu razvija za liječenje plućnih bolesti (cistična fibroza, rak pluća).

Mnogo je koraka uključenih u razvoj programa genske terapije. Ovo uključuje detaljnu analizu tkivno specifične ekspresije odgovarajućeg gena (tj. sintezu na matrici gena nekog proteina u određenom tkivu), i identifikaciju primarnog biohemijskog defekta, te proučavanje strukture, funkcije i intracelularnu distribuciju njegovog proteinskog proizvoda, kao i biohemijsku analizu patološkog procesa. Svi ovi podaci se uzimaju u obzir pri izradi odgovarajućeg medicinskog protokola.

Važno je da se prilikom izrade šema korekcije gena procijeni efikasnost transfekcije i stepen korekcije primarnog biohemijskog defekta u uslovima kulture ćelija ( in vitro,"in vitro") i, što je najvažnije, in vivo na životinjskim biološkim modelima. Tek nakon toga može započeti program kliničkog ispitivanja .

Direktna isporuka i ćelijski nosioci terapijskih gena

Postoji mnogo metoda za uvođenje strane DNK u eukariotsku ćeliju: neke ovise o fizičkoj obradi (elektroporacija, magnetofekcija, itd.), druge ovise o primjeni hemijski materijali ili biološke čestice (na primjer, virusi) koje se koriste kao vektori. Vrijedi odmah spomenuti da hemikalija i fizičke metode(npr. elektroporacija + omotavanje DNK liposomima)

Direktne metode

1. Transfekcija zasnovana na hemikalijama može se klasifikovati u nekoliko tipova: korišćenjem ciklodekstrinske supstance, polimera, liposoma ili nanočestica (sa ili bez hemijske ili virusne funkcionalizacije, tj. modifikacije površine).
a) Jedna od najjeftinijih metoda je korištenje kalcijum fosfata. Povećava efikasnost ugradnje DNK u ćelije za 10-100 puta. DNK formira jak kompleks sa kalcijumom, koji obezbeđuje njegovu efektivnu apsorpciju. Nedostatak - samo oko 1 - 10% DNK dospijeva u jezgro. Korištena metoda in vitro za transfer DNK u ljudske ćelije (slika 3);

Fig.3

b) Upotreba visoko razgranatih organskih molekula - dendrimera, za vezivanje DNK i njeno prenošenje u ćeliju (slika 4);

Fig.4

c) Veoma efikasan metod Za transfekciju DNK, ona se uvodi kroz liposome - mala tijela okružena membranom koja se mogu spojiti sa ćelijskom citoplazmatskom membranom (CPM), koja je dvostruki sloj lipida. Za eukariotske stanice, transfekcija je efikasnija korištenjem kationskih liposoma jer su stanice osjetljivije na njih. Proces ima svoje ime - lipofekcija. Ova metoda se danas smatra jednom od najsigurnijih. Liposomi su netoksični i neimunogeni. Međutim, efikasnost prijenosa gena korištenjem liposoma je ograničena, budući da se DNK koju unose u stanice obično odmah hvataju lizozomi i uništavaju. Uvođenje DNK u ljudske ćelije pomoću liposoma je danas glavni oslonac terapije. in vivo(Sl. 5);

Fig.5

d) Druga metoda je upotreba katjonskih polimera kao što su dietilaminoetil dekstran ili polietilenimin. Negativno nabijeni molekuli DNK vezuju se za pozitivno nabijene polikatione, a ovaj kompleks endocitozom dalje ulazi u ćeliju. DEAE-dekstran promjene fizička svojstva plazma membrana i stimuliše uzimanje ovog kompleksa od strane ćelije. Glavni nedostatak metode je što DEAE-dekstran ulazi visoke koncentracije toksično. Metoda nije postala široko rasprostranjena u genskoj terapiji;

e) Uz pomoć histona i drugih nuklearnih proteina. Ovi proteini, koji sadrže mnogo pozitivno nabijenih aminokiselina (Lys, Arg), u prirodnim uvjetima pomažu kompaktnom pakovanju dugog lanca DNK u relativno malo jezgro ćelije.

2. Fizičke metode:

a) Elektroporacija je veoma popularna metoda; Trenutačno povećanje propusnosti membrane postiže se izlaganjem ćelija kratkotrajnom izlaganju intenzivnom električnom polju. Pokazalo se da pod optimalnim uslovima broj transformanata može dostići 80% preživelih ćelija. Trenutno se ne koristi kod ljudi (slika 6).

Fig.6

b) “Cell squeezing” je metoda izumljena 2013. godine. Omogućava vam da molekule isporučite u ćelije “nježnim stiskanjem” ćelijske membrane. Metoda eliminira mogućnost toksičnosti ili pogrešnog ciljanja jer se ne oslanja na vanjske materijale ili električna polja;

c) Sonoporacija je metoda vještačkog prenošenja strane DNK u ćelije izlaganjem ultrazvuku, uzrokujući otvaranje pora na ćelijskoj membrani;
d) Optička transfekcija – metoda u kojoj se u membrani napravi sićušna rupa (oko 1 μm u prečniku) korišćenjem visoko fokusiranog lasera;
e) Hidrodinamička transfekcija - metoda isporuke genetskih konstrukata, proteina itd. kontroliranim povećanjem tlaka u kapilarama i međućelijskoj tekućini, što uzrokuje kratkotrajno povećanje permeabilnosti ćelijske membrane i stvaranje privremenih pora u njima. Izvodi se brzom injekcijom u tkivo, a isporuka je nespecifična. Efikasnost isporuke za skeletne mišiće - od 22 do 60% ;

f) Mikroinjekcija DNK - uvođenje u jezgro životinjske ćelije pomoću tankih staklenih mikrotubula (d=0,1-0,5 µm). Nedostatak je složenost metode, postoji velika vjerovatnoća uništenja jezgra ili DNK; ograničen broj ćelija se može transformisati. Nije za ljudsku upotrebu.

3. Metode zasnovane na česticama.

a) Direktan pristup transfekciji je genski pištolj, u kojem se DNK spaja u nanočesticu s inertnim čvrstim tvarima (obično zlato, volfram), koja se zatim "puca" usmjerava u jezgra ciljnih stanica. Ova metoda se primjenjuje in vitro I in vivo za uvođenje gena, posebno u ćelije mišićnog tkiva, na primjer, kod bolesti kao što je Duchenneova mišićna distrofija. Veličina čestica zlata je 1-3 mikrona (slika 7).

Fig.7

b) Magnetofekcija je metoda koja koristi sile magnetizma za isporuku DNK do ciljnih stanica. Prvo se nukleinske kiseline (NA) povezuju sa magnetnim nanočesticama, a zatim se pod uticajem magnetnog polja čestice ubacuju u ćeliju. Učinkovitost je gotovo 100%, zabilježena je očigledna netoksičnost. U roku od 10-15 minuta, čestice se registruju u ćeliji - to je mnogo brže od drugih metoda.
c) "nabijanje na kolac", lit. "nabijanje" + "infekcija") - metoda isporuke koja koristi nanomaterijale kao što su ugljične nanocijevi i nanovlakna. U ovom slučaju ćelije su doslovno probijene slojem nanofibrila. Prefiks „nano“ koristi se za označavanje njihovih vrlo malih veličina (unutar milijarditih delova metra) (slika 8).

Fig.8

Odvojeno, vrijedi istaknuti metodu kao što je transfekcija RNK: u ćeliju se ne isporučuje DNK, već molekule RNK - njihovi „nasljednici“ u lancu biosinteze proteina; u ovom slučaju se aktiviraju posebni proteini koji režu RNK na kratke fragmente - tzv. mala interferirajuća RNK (siRNA). Ovi fragmenti se vezuju za druge proteine ​​i, na kraju, to dovodi do inhibicije ćelijske ekspresije odgovarajućih gena. Na ovaj način moguće je blokirati djelovanje onih gena u ćeliji koji u ovom trenutku potencijalno više štete nego koriste. RNA transfekcija je našla široku primjenu, posebno u onkologiji.

Prikazani su osnovni principi isporuke gena pomoću plazmidnih vektora. Sada možemo preći na razmatranje virusnih metoda. Virusi su nećelijski oblici života, koji se najčešće sastoje od molekula nukleinske kiseline (DNK ili RNK) umotane u proteinsku ljusku. Ako iz genetskog materijala virusa izrežemo sve one sekvence koje uzrokuju bolesti, onda se cijeli virus također može uspješno pretvoriti u „vozilo“ za naš gen.

Proces uvođenja DNK u ćeliju, posredovan virusom, naziva se transdukcija.
U praksi se najčešće koriste retrovirusi, adenovirusi i adeno-asociirani virusi (AAV). Prvo, vrijedno je shvatiti koji bi trebao biti idealan kandidat za transdukciju među virusima. Kriterijumi su da mora biti:

Stabilan;
. kapacitet, odnosno da primi dovoljnu količinu DNK;
. inertan u odnosu na metaboličke puteve ćelije;
. precizno - idealno bi trebalo da integriše svoj genom u određeni lokus genoma jezgra domaćina, itd.

U stvarnom životu, vrlo je teško kombinovati barem nekoliko tačaka, pa se obično bira kada se razmatra svaki pojedinačni slučaj posebno (slika 9).

Fig.9

Od sva tri navedena najčešće korišćena virusa, najsigurniji i ujedno najprecizniji su AAV. Gotovo jedini nedostatak im je relativno mali kapacitet (oko 4800 bp), što se, međutim, pokazalo dovoljnim za mnoge gene .

Pored navedenih metoda, genska terapija se često koristi u kombinaciji sa staničnom terapijom: prvo se u hranljivi medij posadi kultura određenih ljudskih ćelija, nakon čega se potrebni geni na ovaj ili onaj način unose u ćelije, uzgajaju. neko vrijeme iznova transplantirana u tijelo domaćina. Kao rezultat, ćelije se mogu vratiti u svoja normalna svojstva. Tako su, na primjer, ljudska bijela krvna zrnca (leukociti) modificirana za leukemiju (slika 10).

Fig.10

Sudbina gena nakon što uđe u ćeliju

Pošto je sa virusnim vektorima sve manje-više jasno zbog njihove sposobnosti da efikasnije isporuče gene do konačnog cilja - jezgre, zadržaćemo se na sudbini plazmidnog vektora.

U ovoj fazi smo postigli da je DNK prošla prvu veliku barijeru – citoplazmatsku membranu ćelije.

Zatim, u kombinaciji s drugim supstancama, u omotaču ili ne, treba doći do jezgra ćelije kako bi poseban enzim - RNA polimeraza - sintetizirao molekulu glasničke RNK (mRNA) na DNK matriksu (ovaj proces se naziva transkripcija). Tek nakon toga mRNA će se osloboditi u citoplazmu, formirati kompleks sa ribosomima i, prema genetski kod sintetizira se polipeptid - na primjer, vaskularni faktor rasta (VEGF), koji će početi obavljati određenu terapijsku funkciju (u ovom slučaju će započeti proces formiranja grananja krvnih žila u tkivu podložnom ishemiji).

Što se tiče ekspresije uvedenih gena u traženi tip ćelije, ovaj problem se rešava uz pomoć regulatornih elemenata transkripcije. Tkivo u kojem dolazi do ekspresije često je određeno kombinacijom tkivno specifičnog pojačivača (sekvenca za poboljšanje) sa specifičnim promotorom (sekvenca nukleotida iz koje počinje sinteza RNA polimeraze), koji može biti inducibilan. . Poznato je da se aktivnost gena može modulirati in vivo vanjskim signalima, a budući da pojačivači mogu raditi sa bilo kojim genom, u vektore se mogu uvesti izolatori, koji pomažu pojačivaču da radi bez obzira na njegovu poziciju i može djelovati kao funkcionalna barijera između gena. Svaki pojačivač sadrži skup vezivnih mjesta za aktivaciju ili supresiju proteinskih faktora. Promotori se takođe mogu koristiti za regulaciju nivoa ekspresije gena. Na primjer, postoje metalotionein ili temperaturno osjetljivi promoteri; promotori koje kontrolišu hormoni.

Ekspresija gena zavisi od njegove pozicije u genomu. U većini slučajeva, postojeće virusne metode rezultiraju samo slučajnim umetanjem gena u genom. Da bi se eliminisala ovakva zavisnost, prilikom konstruisanja vektora, gen se snabdeva poznatim nukleotidnim sekvencama, koje omogućavaju ekspresiju gena bez obzira na to gde je umetnut u genom.

Najjednostavniji način da se reguliše ekspresija transgena je da mu se obezbedi indikatorski promotor koji je osetljiv na fiziološki signal, kao što je oslobađanje glukoze ili hipoksija. Takvi "endogeni" kontrolni sistemi mogu biti korisni u nekim situacijama, kao što je kontrola proizvodnje insulina zavisna od glukoze. “Egzogeni” kontrolni sistemi su pouzdaniji i univerzalniji, kada se ekspresija gena kontrolira farmakološki uvođenjem male molekule lijeka. Trenutno su poznata 4 glavna kontrolna sistema - regulisana tetraciklinom (Tet), steroidom za insekte, ekdizonom ili njegovim analozima, antiprogestinskim lijekom mayfpristone (RU486) i hemijskim dimerizatorima poput rapamicina i njegovih analoga. Svi oni uključuju privlačenje domene aktivacije transkripcije zavisnu od lijeka na glavni promotor koji vodi željeni gen, ali se razlikuju po mehanizmima te privlačnosti. .

Zaključak

Pregledom podataka možemo doći do zaključka da je, uprkos naporima mnogih laboratorija širom svijeta, sve već poznato i ispitano in vivo I in vitro vektorski sistemi su daleko od savršenih . Ako postoji problem sa isporukom stranog DNK in vitro praktički riješen, i njegova isporuka do ciljnih stanica različitih tkiva in vivo uspješno riješene (uglavnom stvaranjem konstrukta koji nose receptorske proteine, uključujući antigene specifične za određena tkiva), onda druge karakteristike postojećih vektorskih sistema - stabilnost integracije, regulirana ekspresija, sigurnost - i dalje zahtijevaju ozbiljna poboljšanja.

Prije svega, to se tiče stabilnosti integracije. Do sada je integracija u genom bila postignuta samo korištenjem retrovirusnih ili adeno-asociranih vektora. Efikasnost stabilne integracije može se povećati poboljšanjem genskih konstrukcija kao što su sistemi posredovani receptorima ili stvaranjem dovoljno stabilnih epizomalnih vektora (tj. struktura DNK sposobne za dugotrajan boravak unutar jezgara). U posljednje vrijeme posebna pažnja se posvećuje stvaranju vektora na bazi umjetnih hromozoma sisara. Zbog prisutnosti osnovnih strukturnih elemenata običnih hromozoma, takvi se mini kromosomi dugo zadržavaju u stanicama i mogu nositi gene pune veličine (genomske) i njihove prirodne regulatorne elemente, koji su neophodni za pravilno funkcioniranje. gena, u pravom tkivu iu pravo vrijeme.

Genska i ćelijska terapija otvara blistave izglede za obnavljanje izgubljenih stanica i tkiva i genetski inženjering dizajn organa, što će nesumnjivo značajno proširiti arsenal metoda za biomedicinska istraživanja i stvoriti nove mogućnosti za očuvanje i produženje ljudskog života.

Zdravlje

Koncept zamjene defektnih gena zdravim, koja je počela aktivno da dobija naučnu ljusku još početkom devedesetih godina prošlog veka, činilo se, dao bi nadu i najbeznadnijim pacijentima. Međutim, od prvog eksperimenta genske terapije, sprovedenog 1990. godine, optimizam među naučnicima je donekle smanjen – a sve zbog određenih neuspjeha i poteškoća u primjeni metoda genske terapije. Međutim, mogućnosti koje nudi genska terapija za liječenje Parkinsonove bolesti cistična fibroza, razne vrste rak i mnoge druge bolesti su zaista neograničene. Zbog toga naučnici neumorno rade, pokušavajući prevladati sve poteškoće povezane s genskom terapijom koje se javljaju na tom putu.

Šta je genska terapija?

Dakle, šta je zapravo genska terapija? Da bih odgovorio ovo pitanje, potrebno je to podsjetiti Glavna funkcija gena u našem tijelu je regulacija proizvodnje proteina, neophodan za normalno funkcionisanje i zdravlje svih ćelija. Ali neki genetski defekti (mane u genima) sprečavaju njihovo izvođenje glavna funkcija, u jednom ili drugom stepenu sprečavaju proizvodnju proteina. Cilj genske terapije (genske terapije) je zamjena defektnih gena zdravim. To će pomoći da se uspostavi reprodukcija odgovarajućeg proteina, što znači da će osoba biti izliječena od određene bolesti.

Ako uzmemo u obzir idealan scenarij razvoja, ćelije sa korigirani molekuli deoksiribonukleinske kiseline (DNK).će se početi dijeliti, proizvodeći, zauzvrat, višestruke kopije korigiranog gena, što će omogućiti tijelu da se riješi genetske abnormalnosti i potpuno izliječi. Međutim, uvođenje zdravih gena u bolesne ćelije (kao i pokušaj ispravljanja odgovarajućih abnormalnosti) je izuzetno složen proces, što je do sada rijetko dovodilo do uspjeha. Zato većina savremena istraživanja ima za cilj razvoj sigurnih i pouzdanih mehanizama za uvođenje gena u oštećene stanice.

Vrste genske terapije: ex vivo i in vivo terapija

Genska terapija, ovisno o načinu uvođenja DNK u genom pacijenta, može se provoditi bilo u ćelijskoj kulturi (ex vivo) ili direktno u tijelu (in vivo). Uz ex vivo gensku terapiju, ćelije se uklanjaju iz tijela pacijenta, genetski modificiraju, a zatim se ponovo unose u tijelo pojedinca. Ova metoda je posebno korisna u liječenju bolesti krvi, jer se krvna zrnca vrlo lako mogu ukloniti i ponovo ubaciti. Međutim, u slučaju većine drugih bolesti, uklanjanje ćelija iz organizma i njihovo vraćanje nije tako jednostavno. npr. u slučaju srčanih bolesti uzrokovanih genetskim uzrocima efikasna mjera je takozvana in vivo genska terapija, kada se promjene gena provode direktno u tijelu pacijenta. Da biste uradili ovu proceduru, genetske informacije se dostavljaju direktno u ćeliju putem vektora - molekula nukleinske kiseline, koristi se u genetskom inženjeringu za prijenos genetskog materijala. U većini slučajeva, da bi izvršili ovaj prijenos, istraživači koriste viruse koji nisu opasni po zdravlje i život.

Metode za dostavljanje genetskih informacija u ćeliju

Kako pokazuju brojna istraživanja, upotreba raznih virusa je vrlo efikasno rješenje, što vam omogućava da prođete kroz imunološku odbranu tijela, a zatim inficiraju ćelije, koristeći ih za širenje virusa. Za izvođenje ove procedure, genetski inženjeri su odabrali najprikladnije viruse iz grupe retrovirusa i adenovirusa. Retrovirusi unose genetske informacije u obliku ribonukleinske kiseline (RNA), molekule slične DNK koja pomaže u procesuiranju genetskih informacija pohranjenih u DNK. Čim je moguće prodrijeti duboko u takozvanu ciljnu ćeliju, iz molekule RNK dobija se kopija molekule DNK. Ovaj proces se naziva reverzna transkripcija. Kada se nova molekula DNK pričvrsti za ćeliju, sve nove kopije ćelija će sadržavati ovaj modificirani gen.

Adenovirusi prenose genetske informacije direktno u obliku DNK, koja se isporučuje u ćeliju koja se ne dijeli. Iako ovi virusi isporučuju DNK direktno u jezgro ciljne ćelije, DNK ne odgovara genomu ćelije. Stoga se modificirani gen i genetske informacije ne prenose na ćelije kćeri. Prednost genske terapije koja se sprovodi adenovirusima je u tome što je moguće uvesti gene u ćelije nervnog sistema i u sluzokožu respiratornog trakta, opet, putem vektora. Osim toga, postoji i treća metoda genske terapije, koja se provodi putem takozvanih adeno-asociranih virusa. Ovi virusi sadrže relativno mala količina genetskih informacija, i mnogo ih je teže eliminirati od retrovirusa i adenovirusa. Međutim, prednost adeno-asociranih virusa je u tome što ne izazivaju reakciju ljudskog imunološkog sistema.

Poteškoće pri korištenju virusa u genskoj terapiji

Glavni problem povezan s metodom dostavljanja genetskih informacija u ćeliju putem virusa je to izuzetno je teško u potpunosti kontrolisati vezu gena sa ciljnom ćelijom. To može biti izuzetno opasno, jer dolazi do takozvane ekspresije gena, koja se može transformirati zdrave ćelije do raka. U ovom trenutku, ovaj problem je posebno izražen kada se radi s retrovirusima. Drugi problem čije rješenje još nije moguće organizirati, je da jedna procedura primjene genske terapije najčešće nije dovoljna. Većinu genetskih terapija potrebno je ponavljati s vremena na vrijeme. I treće, upotreba virusa za isporuku genetskih informacija u ćeliju je komplikovana rizikom od reakcije imunološkog sistema tijela. Ovo je takođe izuzetno ozbiljan problem, posebno u slučajevima kada kada je potrebno višestruko ponavljanje postupka genske terapije, budući da se tijelo pacijenta postepeno prilagođava i počinje da se sve efikasnije bori protiv ubrizganih virusa.

Genska terapija: istraživanja se nastavljaju

Ako govorimo o uspjesima, onda je u ovom trenutku genetska terapija izuzetno efikasna mjera u liječenju takozvane kombinovane imunodeficijencije, vezan za gen za X hromozom. S druge strane, vrlo je malo slučajeva uspješnog korištenja genske terapije za liječenje ove bolesti. Osim toga, sam tretman je rizičan jer može uzrokovati da pacijenti dožive niz simptoma koji su uobičajeni kod ljudi koji pate od leukemije. Osim ove bolesti, postoji vrlo, vrlo malo slučajeva genske terapije koja bi bila jednako efikasna, iako nedavne studije daju nadu za ranu upotrebu genske terapije za liječenje pacijenata koji boluju od artritisa, raka mozga, bolesti srpastih stanica, rascjepa mrežnjače i nekih drugih stanja.

Ispostavilo se da je oko praktična primjena Još je rano govoriti o genskoj terapiji u medicini. ipak, Istraživači nastavljaju da traže načine da bezbedno i efikasno koriste gensku terapiju, potrošivši većina eksperimenti u živom tkivu prebačenom iz tijela u vještačko vanjsko okruženje. Među ovim eksperimentima izuzetno su zanimljive studije u kojima naučnici pokušavaju da unesu veštački, 47. hromozom u ciljnu ćeliju. Nedavna naučna istraživanja omogućila su naučnicima da bolje razumiju procese koji se dešavaju tokom uvođenja RNK molekula. Ovo je omogućilo razvoj mehanizma za suzbijanje transkripcije gena (koji se naziva isključenje gena), što može biti korisno u liječenju Hamiltonove bolesti. Naučnici također navode da su uspjeli razviti način za isporuku genetskih informacija u moždane ćelije, što se ranije nije moglo učiniti pomoću vektora. pošto je ovaj molekul bio prevelik za ovu svrhu. Drugim riječima, istraživanja se nastavljaju, što znači da čovječanstvo ima sve šanse da nauči kako se boriti protiv bolesti korištenjem metoda genske terapije.