Serološki testovi krvi za dijagnozu sifilisa. Reakcija vezivanja komplimenta ili CBR. Dešifriranje rezultata za sifilis: plusevi, križevi i krediti

Treponemski testovi na sifilis. Opći opis.

Za pouzdanu dijagnozu sifilisa i identifikaciju antisifilitičkih antitijela u tijelu pacijenta (u krvnom serumu ili cerebrospinalnoj tekućini), koriste se posebne laboratorijske tehnologije istraživanja - takozvane serološke metode.

Prilikom provođenja dijagnostičkih testova na sifilis koriste se različite serološke reakcije: aglutinacija, precipitacija, imunofluorescencija, fiksacija komplementa, enzimski imunosorbentni test itd. Sve ove serološke reakcije zasnivaju se na interakciji antigena i antitijela.

Nazivaju se specifični serološki testovi treponem jer se u ovim testovima koristi Treponema pallidum ili njihovi antigeni, odnosno antigeni treponemskog porijekla. Svrha treponemskih testova je da se identifikuju specifična antitijela na antigenske strukture uzročnika sifilisa, odnosno antitijela usmjerena specifično protiv samih T. Pallidum bakterija, a ne protiv tjelesnih tkiva oštećenih treponemom. Specifična anti-treponemska antitijela IgM klase mogu se otkriti već na kraju druge sedmice bolesti.

7. Lažno pozitivni i lažno negativni rezultati

Pozitivni RV rezultati na sifilis kod osoba koje ne boluju od ove bolesti nazivaju se lažno pozitivnim. Stopa lažno pozitivnih rezultata kod zdravih osoba je 0,2-0,25%. Ako je postotak nespecifičnih lažno pozitivnih rezultata RT kod zdravih ljudi vrlo mali, onda kod nekih bolesti može biti visok.

Svi nespecifični rezultati seroloških reakcija mogu se podijeliti u sljedeće glavne grupe:

1. Bolesti uzrokovane prisustvom zajedničkih antigena kod sličnih uzročnika bolesti (spirohete): povratna groznica, freskanje, bežel, pinta, oralna treponema, leptospira.

2. Pozitivne reakcije uzrokovane promjenama u metabolizmu lipida i promjenama u serumskim globulinima. To uključuje pozitivne rezultate kod trudnica, pacijenata sa gihtom, poremećaja lipida kao posljedica trovanja olovom, fosforom, nakon uzimanja natrijum salicilata, digitalisa i dr. Ove reakcije treba uključiti i pozitivne reakcije kod nekih zaraznih bolesti (tifus, malarija, upala pluća). , lepra, endokarditis, kolagenoza, infarkt miokarda, potres mozga, rak, ciroza jetre, itd.)

3. Tehničke greške. Pogrešan izbor doze komplementa, nepoštivanje uslova i perioda skladištenja reagensa, isključenje kontrolnih uzoraka krvnog seruma iz testa, upotreba kontaminiranih epruveta i instrumenata.

8. Modifikacija Wassermanove reakcije

Postoje modifikacije Wassermanove reakcije u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji, na hladnom, sa cerebrospinalnom tekućinom.

Modifikacija RV-a na hladnoći pokazalo se osjetljivijim. Posebnost metode insceniranja Wassermanove reakcije na hladnoću su trofazni temperaturni režimi pri kojima dolazi do fiksacije komplementa. Ova reakcija se izvodi i sa kardiolipinskim i treponemskim antigenima.

Pored kvalitativne procjene RF-a, postoji i metoda za njegovu kvantitativni iskaz sa različitim razblaženjima krvnog seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titar reagina je određen maksimalnim razrjeđenjem koje i dalje daje oštro pozitivan rezultat (4+). Kvantitativno stadijum RV je važan u dijagnostici nekih oblika sifilisa i u praćenju efikasnosti terapije.

9. Područje primjene

U Rusiji, RSKt je dio seta standardnih seroloških testova na sifilis (SSR).

Za to se koristi Wassermanova reakcija sa treponemskim i kardiolipinskim antigenom (RSKt).

• dijagnostika svih oblika sifilisa,
• praćenje efikasnosti lečenja,
• preglede osoba koje su imale seksualni kontakt sa oboljelim od sifilisa,
• pregled osoba sa kliničkom i anamnestičkom sumnjom na sifilis
• prilikom preventivnog pregleda na sifilis pacijenata u psihijatrijskim i neurološkim bolnicama, donora i trudnica, uključujući i osobe upućene na abortus.

Trenutno, prema nalogu Ministarstva zdravlja Ruske Federacije, preporučuje se zamjena RSCT osjetljivijim treponemskim metodama (ELISA ili RPGA).

U inozemstvu se Wassermanova reakcija s antigenom treponema već duže vrijeme ne koristi u kliničkoj laboratorijskoj praksi i nije uključena u listu standardnih testova koje preporučuje Svjetska zdravstvena organizacija.

Kompleks klasičnih seroloških reakcija (CSR)

KSR- Ovo kompleksa reakcija, koristi se za serodijagnostiku sifilisa kao standardna metoda. Ovaj kompleks reakcija uključuje Wassermannovu reakciju s kardiolipinskim antigenom (ekstraktom iz goveđeg srca obogaćenog lecitinom i kolesterolom) i treponemskim antigenom (ultrazvukom tretiranu suspenziju apatogenih kultiviranih treponemes pallidum), kao i reakciju mikroprecipitacije (MPR) sa plazma ili inaktivirani serum, koji se stavlja sa kardiolipinskim antigenom

CSR-ovi postaju pozitivni sredinom primarnog perioda (njegova podjela na seronegativne i seropozitivne je precizno određena CSR-om), u sekundarnom periodu CSR-ovi su pozitivni kod 98-100% pacijenata, au tercijarnom periodu - samo u 60-70%. Odnosno, kako se trajanje bolesti povećava, pozitivnost CSR-a se postepeno smanjuje.

Prednosti DAC-a:

1) Jeftina, jednostavnost i brzina ugradnje. Ovo posebno važi za reakciju mikroprecipitacije: RMP je trenutno glavna metoda skrininga (selekcije);

2) Ne-treponemski testovi su pogodni za praćenje izlječenja sifilisa.

Nedostaci DAC-a:

1) Subjektivnost u proceni rezultata reakcija („na oko”);

2) Niska osetljivost kod kasnih oblika sifilisa;

3) Nedostatak specifičnosti u odnosu na modernije testove. Kada se provode, često se uočavaju lažno pozitivne reakcije (FPR).

LPR može biti uzrokovan unakrsnom reaktivnošću između blijede spirohete i drugih mikroba, poremećajima metabolizma lipida i proteina, nestabilnošću ćelijskih membrana i stvaranjem autoantitijela. LPR se uočavaju kod akutnih (malarija, infektivna mononukleoza itd.) i kroničnih (tuberkuloza, guba, hepatitis, borelioza itd.) infekcija, infarkta miokarda, ciroze jetre, kolagenoze (posebno kod SLE), onkopatologije, vakcinacije, upotrebe lijekova, zloupotreba alkohola i masne hrane. Lažno pozitivni rezultati se mogu javiti u poslednjim nedeljama trudnoće, nakon porođaja, a kod nekih žena i tokom menstruacije. Lažno negativni rezultati DSC mogu biti povezani sa HIV infekcijom.

RIT, RIBT - Treponema pallidum reakcija imobilizacije

Treponema pallidum imobilizacijski test (TPI) je klasična metoda koja se koristi za otkrivanje specifičnih antitijela na treponeme. RIBT reakcija koristi patogeni Treponema pallidum T. pallidum (Nicholsov soj) uzgojen u testisima kunića kao antigen. RIBT se zasniva na gubitku pokretljivosti žive Treponema pallidum nakon izlaganja antitijelima iz pacijentovog krvnog seruma i komplementa. Rezultati se procjenjuju pomoću mikroskopije tamnog polja. Iako je RIBT test uveden u kliničku praksu kao specifičan test za sifilis, on je radno intenzivan, tehnički složen, dugotrajan i skup za korištenje.

1. Istorijat RIBT metode

Treponema pallidum imobilizacijski test (TPI) je zapravo prvi specifični test za dijagnosticiranje sifilisa. Ovu reakciju su 1949. uveli američki istraživači R. W. Nelson i M. M. Mayer i o njoj se detaljno raspravljalo u naučnim radovima u narednim decenijama. Neuspješni pokušaji korištenja živih treponema u testovima već su činjeni. Zahvaljujući činjenici da je Nelson uspio stvoriti okruženje u kojem su treponeme ostale održive do 8 dana, njegovo istraživanje je bilo uspješno.

2. Princip RIBT metode

Metoda se zasniva na fenomenu gubitka pokretljivosti treponema pallidums u prisustvu imobilizirajućih antitreponemskih antitela seruma krvi i komplementa u anaerobnim uslovima. Antigen je živa patogena Treponema pallidum dobijena od zečeva veštački zaraženih sifilisom.

3. Postavljanje RIBT testa

Reakcija uključuje test serum, komplement i antigen. Krvni serum subjekta dodaje se živoj treponemi dobijenoj iz tkiva testisa kunića nakon umjetne infekcije. Ako u serumu postoje anti-treponemska antitijela-imobilizini, treponema pallidums prestaje da se kreće (imobilizira). Antitijela imobilizina su kasna antitreponemska antitijela.

Reakcija se provodi toplinom inaktiviranim serumima ili uzorcima seruma osušenih na voštanom papiru (suhe kapi). Inaktivacija seruma zagrijavanjem se provodi 30 minuta na temperaturi od 56°C. Prije uzimanja krvi, osoba koja se pregleda ne bi trebala primati lijekove, posebno penicilin. Uzimanje lijekova se prekida za vrijeme njihovog trajanja moguće kašnjenje u organizmu.

Kao antigen koriste se bakterije Nichols soja dobijene od sifilitičnog orhitisa kunića (upala testisa) starog 7-10 dana. Period od trenutka postavljanja reakcije do snimanja njenih rezultata traje 18-20 sati, stoga je neophodno okruženje za preživljavanje da bi se održala vitalnost i dobra pokretljivost mikroorganizama.

RIBT koristi dodatak zamorcima. Da bi se dobio komplement, krv se mora uzeti u sterilnim uslovima od nekoliko zamoraca.

U slučaju bakterijske kontaminacije, komplement se odbija. Konzervirani komplement se ne može koristiti u reakciji imobilizacije Treponema pallidum, jer toksičan je za mikroorganizme.

Reakcija imobilizacije koristi višak komplementa. Njegova količina u velikoj mjeri ovisi o okruženju preživljavanja Treponema pallidum.

RIBT se stavlja u sterilne kutije, prethodno ozračene baktericidnom kvarcnom lampom 45-60 minuta. Svaki krvni serum se ispituje u dvije epruvete: iskusan I kontrolu. Test serum i antigen se dodaju u obe epruvete u potrebnim količinama. U epruvetu se sipa aktivni komplement, a u kontrolnu epruvetu ista količina inaktiviranog krvnog seruma zamorca. Nakon punjenja, sadržaj epruveta se lagano protresa.

RIBT se javlja u anaerobnim uslovima. Epruvete sa sastojcima stavljaju se u mikroanaerostat, iz kojeg se vakuum pumpom usisava atmosferski zrak, a iz cilindra pumpa mješavina plinova (95 dijelova dušika i 5 dijelova ugljen-dioksid). Mikroanaerostat sa epruvetama stavlja se u termostat (35°C) na 18-20 sati.

Rezultati RIBT-a se procjenjuju nakon uklanjanja epruveta iz termostata i mikroanaerostata (tj. nakon 18-20 sati eksperimenta). Uz pomoć Pasteurove pipete, kap sadržaja epruvete nanosi se na staklo, koje se prekriva pokrovnim stakalcem i pregleda u mikroskopu tamnog polja (objektiv 40, okular 10X). U različitim dijelovima preparata ispituje se nekoliko vidnih polja, računajući broj pokretnih i nepokretnih treponeme pallidum u svakom. Brojanje počinje s lijekom iz kontrole, a zatim iz epruvete.

Prilikom postavljanja reakcije koristi se 5 kontrolnih studija: sa očigledno pozitivnim i negativnim krvnim serumom, sa aktivnim i inaktiviranim komplementom i medijumom preživljavanja za Treponema pallidum. Kontrolno negativni krvni serum se koristi za procjenu stepena pokretljivosti Treponema pallidum u ovom eksperimentu. Kontrola pozitivnog krvnog seruma - za procjenu stepena imobilizirajuće aktivnosti u uslovima ovog eksperimenta. Provedena je studija aktivnog i inaktiviranog komplementa i okoline kako bi se utvrdio njihov učinak na pokretljivost Treponema pallidum.

Ako postoji nedostatak komplementa u eksperimentu, imobilizirajuća antitijela ne pokazuju svoju aktivnost kako treba i treponeme ostaju pokretne. Stoga se nakon eksperimenta utvrđuje rezidualni komplement kako bi se procijenilo da li je pokretljivost Treponema pallidum u epruvetama uzrokovana nedostatkom komplementa. U tu svrhu koristi se hemolitički sistem - mješavina suspenzije ovčijih eritrocita i razrijeđenog hemolitičkog seruma koji se čuva u termostatu.

Rezidualni komplement se određuje dodavanjem potrebne zapremine hemolitičkog sistema u svaku epruvetu. Epruvete se stavljaju u termostat na 37° na 45 minuta. U epruvetama bi trebalo da dođe do hemolize crvenih krvnih zrnaca, u kontrolnim epruvetama trebalo bi da dođe do odlaganja hemolize. Odsustvo hemolize u epruvetama ukazuje na nedovoljnu količinu komplementa; u tim slučajevima se studija mora ponoviti. Ponovljeno ispitivanje krvnog seruma se ne radi samo ako se konstatuje 100% imobilizacija Treponema pallidum.

4. Računovodstvo rezultata RIBT-a

Brojanje imobiliziranih treponema koji su izgubili pokretljivost provodi se pod mikroskopom metodom mikroskopije tamnog polja. Od istraživača se traži da ima vještinu procjene kretanja treponema. Treba obratiti pažnju na intenzitet pokreta Treponema pallidum. Kod ove bakterije nije uvijek moguće uočiti talasaste kontrakcije i fleksijske pokrete, ponekad samo rotacijske. Takođe biste trebali biti u stanju da razlikujete aktivne pokrete treponema od pokreta sa protokom tečnosti.

Za procjenu rezultata reakcije izračunava se postotak imobilizacije blijede treponeme, odnosno omjer pokretnih i nepokretnih treponema u eksperimentu (s aktivnim komplementom) i kontroli (sa neaktivnim komplementom) prema formuli:

X = (M – C)×100/M

gdje je M broj mobilnih treponema u kontroli; C je broj mobilnih treponema u eksperimentu; X - % imobilizacija. U praktičnom radu, postotak imobilizacije se određuje iz unaprijed sastavljene tabele koristeći gornju formulu.

Reakcija imobilizacije Treponema pallidum ocjenjuje se kao

• pozitivno tokom imobilizacije 51 - 100% treponema,
• slabo pozitivno: 31 - 50% nepokretne treponeme,
• sumnjivo: 21 - 30% nepokretne treponeme,
• negativan: 0 - 20% nepokretne treponeme.

Reakcija imobilizacije Treponema pallidum postaje pozitivna na kraju primarnog - početkom sekundarnog perioda sifilisa (od 7-8. tjedna od trenutka infekcije ili više). Međutim, RIBT je od male koristi za dijagnosticiranje ranih stadijuma sifilisa, jer se antitijela koja imobiliziraju Treponema pallidum i koja se otkriju u reakciji pojavljuju tek 3-6 sedmica nakon infekcije. Imobilizin antitijela pripadaju IgG klasi imunoglobulina. Pojavljuju se u krvi kasnije od reagina (antikardiolipinska antitijela), kasnije od fluoresceinskih antitijela (otkrivenih RIF-om i ELISA-om) i precipitina (otkrivenih rakom mokraćne bešike).

U budućnosti, RIBT ostaje pozitivan. Kod kasnih oblika sifilisa postoji visoka osjetljivost reakcije. U slučaju sekundarnog, kasnog sifilisa, neurosifilisa, kongenitalnog sifilisa, pozitivan rezultat RIBT se bilježi u 95-100% slučajeva. Sa tercijarnim sifilisom, sa specifičnim lezijama unutrašnje organe, nervni sistem, kada je RV često negativan, RIBT daje pozitivne rezultate u 98 - 100% slučajeva.

RIBT je dugo bio prepoznat kao najspecifičniji test za sifilis. Prema literaturi, specifičnost RIBT-a je 99%, osjetljivost se kreće od 79 do 94%. Prema TsNIKVI-ju, osjetljivost RIBT-a (ukupno, za sve faze sifilisa) je 87,7%.

7. Obim primjene metode

Opseg primjene RIBT-a postupno se sužava zbog trajanja ugradnje, visoke cijene i intenziteta rada. RIBT je prilično složena i skupa analiza koja zahtijeva visoko kvalifikovano osoblje i prisustvo vivarijuma. U tom smislu, upotreba ovu metodu značajno se smanjio posljednjih godina. U Sjedinjenim Državama ovaj test se trenutno koristi samo u istraživačkim laboratorijama.

S obzirom na složenost i visoku cijenu RIF-a i RIBT-a, ima smisla koristiti ih za dijagnosticiranje kasnih i latentnih oblika sifilisa. RIBT zadržava svoju poziciju “reakcionog arbitra” u diferencijalnoj dijagnozi ranih latentnih oblika sifilisa i lažno pozitivnih rezultata. Ova reakcija može biti korisna u dijagnosticiranju neurosifilisa i kada se rezultati drugih seroloških testova razlikuju.

RIBT postaje pozitivan mnogo kasnije od RIF-a i RV-a. Stoga se ne koristi za dijagnosticiranje infektivnih oblika sifilisa.

RIBT se, kao i RIF, vrlo sporo negativizira tokom antisifilitičke terapije. Kao rezultat toga, nije pogodan za praćenje napretka antisifilitičke terapije.

Lažno pozitivni rezultati (FPR) sa RIBT su rijetki i zabilježeni su uglavnom kod brojnih treponematoza (jaws, pinta, bejel), koje se ne nalaze u Rusiji, kao i kod lepre, sarkoidoze, SLE, tuberkuloze, ciroze jetra i neke druge rijetke bolesti nesifilitičke prirode. Kako pacijenti stare, broj lažno pozitivnih RIBT rezultata se povećava.

RIBT može biti lažno pozitivan ako test serum sadrži treponemocidne supstance (npr. peniciline, tetracikline, eritromicin) koje izazivaju nespecifičnu imobilizaciju Treponema pallidum.Ovo može biti posljedica uzimanja treponemocidnih antibiotika kod pacijenta, pa se pregled ne radi za osobe koje su primile antibiotike u poslednjih mesec dana. Krv na RIBT se može testirati najkasnije 2 sedmice nakon završetka uzimanja antibiotika i drugih antisifilitičkih lijekova.

9. Modifikacije reakcije imobilizacije Treponema pallidum

Pored tehnike mikroanaerostata, postoji i melange metoda RIBT prema N.M. Ovchinnikov. Anaerobni uslovi pri postavljanju reakcije stvaraju se stavljanjem reakcione smeše u melanžer (mešalica za leukocite), čija su oba kraja zatvorena gumenim prstenom. Tehnika reakcije melanža omogućava vam da bez vakuum pumpe, cilindra sa mješavinom dušika i ugljičnog dioksida ili mikroanaerostata. Komparativna studija na velikom kliničkom materijalu dala je rezultate koji nisu inferiorni u odnosu na klasičnu anaerostatsku tehniku.

10. Osobine, prednosti i mane RIBT-a

RIBT je tehnički složena i skupa dijagnostička metoda. Tehnologija zahtijeva značajna sredstva za držanje kunića i provođenje testiranja. Ovaj radno intenzivan test trenutno se koristi uglavnom u naučne svrhe. U većini stranih zemalja, skoro 40 godina, RIBT se praktično koristi ne u dijagnostičke svrhe, već samo u istraživačkom radu.

Nedostaci reakcije:

• RIBT zahtijeva rad sa živom patogenom Treponema pallidum soja Nichols, koja ostaje zarazna za ljude uprkos adaptaciji na zečeve
• postavljanje reakcije je složeno, dugotrajno i skupo
• potreban je vivarijum
• potrebno je visoko kvalifikovano osoblje za postavljanje reakcije, snimanje rezultata i održavanje vivarijuma
• subjektivnost procjene rezultata
• nedostatak automatizacije
• nije moguće standardizirati ovu serološku metodu.
• reakcija nije primjenjiva u pozadini tekuće antisifilitičke terapije
• nemogućnost upotrebe za kontrolu izlječenja. RIBT kod pacijenata sa sifilisom može ostati pozitivan dugi niz godina (pa čak i doživotno), uprkos potpunom liječenju.
• reakcija može dati lažno pozitivne rezultate kod pacijenata sa malignim tumorima, dijabetesom, gubom, autoimunim bolestima, upalom pluća i teškom kardiovaskularnom patologijom.

Prednosti RIBT-a su:

1) Dovoljno visoka osetljivost;

2) Visoka specifičnost.

RIF (reakcija imunofluorescencije)

Reakcija imunofluorescencije (RIF) je brza dijagnostička metoda za identifikaciju mikrobnih antigena ili određivanje antitijela. Testovi zasnovani na detekciji fluorescentnog signala smatraju se jednim od njih najbolji testovi za sifilis.

1. Istorija metode

Test fluorescentnih treponemalnih antitijela (FTA) prvi su razvili 1957. godine od strane Deacona i koautora (Deacon, Falcone i Harris).

2. Princip metode

RIF metoda se zasniva na činjenici da su tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunim serumima sa antitelima obeleženim fluorohromima u stanju da svetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom sijaju duž periferije ćelije u obliku zelene ivice

Kao antigen u RIF-u koristi se suspenzija živog patogenog blijedih Treponema soja Nichols iz orhitisa kunića, koja se suši na stakalcu i fiksira acetonom. Krvni serum pacijenta dodaje se Treponema pallidum, osuši i fiksira u staklo acetonom.

Nakon ispiranja, lijek se tretira serumom koji sadrži antitijela protiv humanih imunoglobulina označenih fluoresceinom. Preparat se ponovo ispere i pregleda pod fluorescentnim mikroskopom. Ako test serum sadrži anti-treponemska fluoresceinska antitijela, primijetit će se žuto-zeleni sjaj treponema.

3. Metoda izvođenja istraživanja metodom RIF

Antigen fiksiran na stakalcu (patogena Treponema pallidum) tretira se test serumom. Nakon ispiranja, lijek se tretira fluorescentnim serumom protiv humanih imunoglobulina, označenih fluorohromom. U ovom slučaju, nastali fluorescentni kompleks (anti-humani globulin + fluorescein tioizocijanat) se veže za ljudski globulin na površini treponema pallidum, osiguravajući sjaj treponema pallidum pod fluorescentnim mikroskopom.

Za otkrivanje kompleksa antigen-antitijelo, koristi se luminiscentni serum koji predstavlja anti-species (anti-humane) imunoglobuline konjugirane na FITC. Prisustvo antitijela na treponeme u serumu određuje se sjajem treponema kada se pregleda pod fluorescentnim mikroskopom. Test se provodi u kvalitativnoj i polukvantitativnoj verziji.

4. Računovodstvo rezultata

Vizualizacija rezultata RIF-a se vrši pomoću fluorescentnog mikroskopa. Rezultati se procjenjuju stepenom luminiscencije treponema u preparatu. U prisustvu antitijela vidljiv je sjaj treponema, ali ako u serumu nije bilo anti-treponemskih antitijela, onda se treponemi ne vide. Stepen luminescencije osušene blijede treponeme fiksirane na staklu označen je "plusima" (od "-" do "++++"). Negativan rezultat - bez sjaja ili nivoa pozadine - 1+.

5. U kojim periodima bolesti je bolje koristiti

Reakcija imunofluorescencije (RIF) je prilično osjetljiva u svim fazama infekcije, od kraja perioda inkubacije do kasnog sifilisa. Primarni period sifilisa u klasičnom toku počinje 3-4 sedmice nakon infekcije. RIF postaje pozitivan u prvim danima primarnog perioda ili čak na kraju perioda inkubacije, od 3. sedmice nakon infekcije. Rezultati RIF-a ostaju pozitivni u svim periodima, uključujući i kasne forme.

RIF postaje pozitivan nešto ranije od RV. Prema nekim podacima, pozitivan RIF se javlja kod 80% pacijenata sa primarnim seronegativnim sifilisom. U sekundarnom periodu RIF je pozitivan u skoro 100% slučajeva. To je uvijek pozitivno latentni sifilis i daje 95 - 100% pozitivnih rezultata kod kasnih oblika bolesti i kongenitalnog sifilisa.

6. Osjetljivost i specifičnost

Imunofluorescentna reakcija (RIF) je grupa metoda visoke osjetljivosti i specifičnosti. RIF je osjetljiv u svim fazama infekcije, od perioda inkubacije do kasnog sifilisa. Prema WHO, osjetljivost RIF-a za primarni sifilis je 70-100%, za sekundarni i kasni sifilis - 96-100%, specifičnost - 94-100%. Prema TsNIKVI-ju, osjetljivost RIF-a za sve oblike sifilisa je 99,1%.

Specifičnost RIF-a može se povećati prethodnom obradom test seruma sorbentom - ultrazvučnim treponemskim antigenom koji vezuje grupna antitijela (RIF-abs).

7. Obim primjene metode

RIF se primjenjuje:

• kao potvrdna reakcija kod ranog, latentnog sifilisa
• prilikom postavljanja retrospektivne dijagnoze
• za razlikovanje latentnih oblika sifilisa i lažno pozitivnih rezultata testova na sifilis.
• kao potvrdni test za neurosifilis.

RIF se široko koristi kao potvrdni test, ali nije namijenjen za rutinsku upotrebu ili skrining jer ga je tehnički teško izvesti. Za izvođenje RIF-a potrebno je imati vivarijum ili nabaviti suspenziju patogene Treponema pallidum, što ograničava mogućnosti reakcije. Međutim, posljednjih godina na domaćem tržištu počeli su se pojavljivati ​​testni sistemi koji omogućavaju da se reakcija provede u nedostatku vivarijuma i vlastitog laboratorijskog soja patogene Treponema pallidum.

8. Izvori i uzroci grešaka u proizvodnji, lažno pozitivni i lažno negativni rezultati

LPR su rijetki kada se dijagnosticira RIF (kod kolagenoze, borelioze).

RIF se i dalje smatra jednim od najboljih testova za sifilis, „zlatni standard“ serodijagnostike. RIF je lakše postaviti nego RIBT,

Uprkos visokoj dijagnostičkoj vrijednosti, široko uvođenje RIF-a u svakodnevnu praksu otežava potreba za korištenjem živog T. pallidum, visoka cijena i trajanje studije. Postavljanje reakcije je naporno. Osim toga, ocjena rezultata RIF-a je subjektivna.

Prednosti RIF-a i RIBT su:

1) Visoka osetljivost (posebno za RIF);

2) Visoka specifičnost (posebno za RIBT).

Nedostaci RIF-a i RIBT:

1) Tehnička složenost, visoka cijena metoda.

2) subjektivnost evaluacije rezultata, nedostatak automatizacije;

3) RIF i RIBT kod pacijenata sa sifilisom mogu ostati pozitivni dugi niz godina (pa čak i doživotno), uprkos potpunom liječenju. Stoga se ove reakcije ne mogu koristiti za praćenje izlječenja.

10. Modifikacije metode

U praksi se za serodijagnostiku sifilisa koristi i koristi se nekoliko modifikacija imunofluorescentne reakcije:

• RIF-abs– najosetljivija metoda serodijagnostike sifilisa, postaje pozitivna ranije od ostalih reakcija (od 3. nedelje od infekcije);
• RIF-200(serum pacijenta se razrijedi 200 puta nakon dijagnoze) – vrlo specifična metoda za serodijagnostiku sifilisa.
• RIF-10(10-struko razrjeđivanje test seruma) je osjetljivija metoda od RIF-200.
• RIF-ts obavljen uz piće.
• RIF-abs-IgM- otkrivanje ranih antitreponemskih antitijela IgM klase.

1. Najraširenija modifikacija je RIF-abs- reakcija imunofluorescencije sa apsorpcijom. Prije izvođenja reakcije, pacijentov serum se iscrpljuje mješavinom nepatogenih treponema kako bi se eliminisale unakrsne reakcije. Grupna antitijela se uklanjaju iz test seruma pomoću kulturnih treponema uništenih ultrazvukom, što značajno povećava specifičnost reakcije. Pošto se test serum koristi u razblaženju 1:5, RIF-abs je veoma osetljiv.

Glavne indikacije za upotrebu RIF-abs su: kliničku praksu su:

• dijagnoza latentnih i kasnih oblika sifilisa,
• identifikacija lažno pozitivnih rezultata CSR-a i raka mokraćne bešike, posebno kod trudnica i somatskih pacijenata sa sumnjom na sifilis,
• da se uspostavi retrospektivna dijagnoza bolesti.

RIF-abs nije previše informativan pri procjeni rezultata liječenja: kod 85% pacijenata koji su primili adekvatnu antisifilitičku terapiju, pozitivni rezultati RIF-a traju dugi niz godina.

Ova reakcija se naziva “zlatnim standardom” za serodijagnostiku sifilisa. Koristi se za arbitražne slučajeve, ali za pouzdan rezultat potrebna je svježa koncentrirana suspenzija T. pallidum soja Nichols iz sedmodnevnog orhitisa kod kunića, koja se ne može zamrznuti.

2. U SSSR-u je instaliran u dvije modifikacije - RIF-10 I RIF-200, odnosno razblaženjem test seruma za 10 i 200 puta. RIF-200 - test serum se razrijedi 200 puta kako bi se smanjio broj lažno pozitivnih rezultata. Time se postiže visoka specifičnost reakcije, ali se njena osjetljivost donekle smanjuje. RIF-10 je osjetljiviji, ali češće daje nespecifične pozitivne rezultate od RIF-200, koji je visoko specifičan. RIF-10 je osjetljiviji, RIF-200 i RIF-abs su specifičniji.

Osetljivost RIF-200 i RIF-abs je procenjena na 84–99%, a specifičnost je 97–99%.

3. RIF-ts obavljen uz piće. Reakcija se izvodi upotrebom cijele cerebrospinalne tekućine kako bi se identificirale specifične lezije centralnog nervnog sistema.

4. Reakcija RIF-abs-IgM predložen za detekciju ranih anti-treponemskih antitijela IgM klase. Ova reakcija se može koristiti za dijagnosticiranje kongenitalnog sifilisa, ranih oblika sifilisa i diferencijalne dijagnoze slučajeva reinfekcije i serorelapsa.

Postoje 2 poznate modifikacije ove reakcije:

– FTA-ABS-IgM, zasnovan na upotrebi u drugoj fazi reakcije anti-IgM konjugata (fluoresceinom obeležena antitela na humani IgM) umesto anti-humanog fluorescentnog globulina;

– Ruska verzija RIF-abs-IgM, karakterizirana time što se u krvni serum koji se ispituje dodaje sorbent koji uklanja IgG antitijela, a RIF-abs se primjenjuje sa preostalim IgM antitijelima.

Glavne indikacije za RIF-abs-IgM testiranje su:

– serodijagnostika kongenitalnog sifilisa u odsustvu manifestacija kongenitalnog sifilisa na koži i sluzokožama kod djeteta;

– diferencijalna dijagnoza reinfekcije i kliničko-serološki ili serološki relaps sifilisa, kod kojih će RIF-abs-IgM biti negativan, a RIF-abs pozitivan;

– procjena efikasnosti terapije za rano stečeni ili kongenitalni sifilis: poslije adekvatan tretman RIF-abs-IgM postaje negativan u narednih 3-6 mjeseci.

Ova reakcija se može koristiti za otkrivanje kongenitalnog sifilisa. Poznato je da veliki IgM molekuli ne mogu proći kroz zdravu placentu. Slijedom toga, antitijela klase M protiv treponema pallidum mogu se pojaviti u tijelu djeteta ili zbog kršenja barijerne funkcije placente, ili ih proizvodi tijelo djeteta sa sifilisom. Antitela IgM klase pojavljuju se u krvi bolesnika sa sifilisom već u prvim nedeljama bolesti, a antitela IgG klasa pojaviti kasnije. Odvojeno određivanje antitela obe klase pokazalo se izuzetno korisnim u dijagnostici kongenitalnog sifilisa kod dece, jer će prisustvo antitela IgM klase kod deteta u prvom mesecu života ukazivati ​​na to da ih formira telo deteta sa sifilisom. , dok će detekcija samo IgG antitijela ukazati na majčino porijeklo potonjih.

Postavljanje reakcije 19S(IgM)-RIF-abs uključuje preliminarno odvajanje korištenjem gel filtracije većih 19S IgM molekula iz

frakcije manjih 7S IgG molekula. Dalje istraživanje RIF-abs reakcije krvnog seruma koji sadrži samo 19S IgM frakciju,

eliminiše sve mogući izvori greške. Ali tehnika za insceniranje ove reakcije je složena i radno intenzivna, zahtijeva posebnu opremu i stručnu obuku.

Reakcija imunološke adhezije (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Ova reakcija se zasniva na upotrebi fenomena koji je opisao Rieckenberg 1912. RIP se bazira na činjenici da se virulentna tkivna treponema, senzibilizirana serumom bolesnika sa sifilisom, u prisustvu komplementa i eritrocita, prianja na površinu eritrocita i, tokom centrifugiranja, odnosi se sa njima u sediment, nestaju iz supernatanta.

Za uspostavljanje reakcije koriste se sljedeći sastojci: test serum, antigen, komplement, crvena krvna zrnca donora, izotonični rastvor natrijum hlorida. Kao antigen koristi se suspenzija blede treponema soja Nichols.

Ovaj test je u odnosu na serodijagnostiku sifilisa najviše proučavan od strane domaćih i stranih autora 50-60-ih godina. Dokazi o vrijednosti RIP-a kao dijagnostičkog testa su nedosljedni. Reakcija je zahtijevala maksimalnu preciznost, jer je neprecizno doziranje sastojaka ili višak ili nedostatak ispitivanog materijala u preparatu rezultirao nepouzdanim rezultatima.

U Rusiji je opsežna istraživanja proveo L.V. Sazonov, koji je dobio slične rezultate u RIP i RIT koristeći svježe pripremljenu suspenziju patogenog pallidum treponema soja Nichols. Međutim, upotreba zagrijanog antigena ili antigena konzerviranog u fenolu oštro je iskrivila rezultate reakcije i učinila antigen nestabilnim. Preporučeno ovaj test za zamjenu RIT L.V. Sazonova je to smatrala nemogućim.

G.P. Avdeeva je, koristeći druge temperaturne i vremenske režime u proizvodnji antigena, dobila različite rezultate prilikom proučavanja RIP-a. Prema njenim podacima, osetljivost ove reakcije je veća od osetljivosti KCP i RIT, ali nešto inferiorna u odnosu na RIF, a specifičnost RIP, RIT i RIF je bliska.

Međutim, nedostatak industrijske proizvodnje antigena za RIP nije omogućio da se ovaj test šire proučava i uvede u praksu.

RPHA reakcija pasivne hemaglutinacije

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA) je uobičajen serološki test koji je čvrsto uspostavljen u laboratorijskoj praksi. ima prilično visok nivo efikasnosti u istraživanju.

1. Istorija RPGA metode

G. Blumental i W. Bachman (1932.) prvi put su objavili upotrebu RPHA za dijagnozu sifilisa. Godine 1965. predložen je indirektni ili pasivni hemaglutinacijski test za dijagnosticiranje sifilisa. O modifikaciji reakcije upotrebom različitih antigena izvijestio je Ratlev T. 1965. - 1967. godine. Mikromodifikaciju RPGA predložio je Sokh R.M. i koautori 1969. Prvi komercijalni test sistem razvili su japanski naučnici Tomisava i dr. al. 1969. godine

2. Princip RPGA metode

Iz pripremljene homogene suspenzije eritrocita „nabijenih“ antigenima, nakon dodavanja test seruma koji sadrži antitela, taloži se talog u obliku pahuljica. Nastali precipitat se sastoji od crvenih krvnih zrnaca "zalijepljenih zajedno" antitijelima i naziva se "hemaglutinirati". Suspenzija crvenih krvnih zrnaca se priprema unaprijed i isporučuje kao dio dijagnostičkih test sistema.

Proces lijepljenja crvenih krvnih stanica koje imaju antigene na svojoj površini naziva se "hemaglutinacija". Vezivanje nastaje pod dejstvom specifičnih antitela (aglutinina). Reakcija se zove "pasivan", jer vlastiti antigeni eritrocita ne reagiraju, a sami eritrociti vrše isključivo pomoćnu indikatorsku funkciju.

Reakcija pasivne (indirektne) hemaglutinacije je vrsta reakcije aglutinacije u kojoj se kao nosioci antigena koriste eritrociti (od grčkog háima - krv), a ne druge čestice. IN opšti slučaj, u reakciji aglutinacije pod utjecajem antitijela, mikrobi ili druge stanice se spajaju i talože - ne nužno crvena krvna zrnca, već, na primjer, čestice lateksa, bakterije ili druge korpuskularne čestice koje nose antigen.

U reakciji pasivne hemaglutinacije za dijagnosticiranje sifilisa, kao antigen se koriste eritrociti ovaca ili ptica obloženi antigenima Treponema pallidum. Kada se doda serum koji sadrži specifična antitijela, crvena krvna zrnca se spajaju (aglutinacija).

RPGA reakcija je klasifikovana kao imunološka metoda, jer zasniva se na specifičnoj interakciji patogenog antigena Treponema pallidum sa antitijelom. Prema „teoriji rešetke“, aglutinacija je rezultat „unakrsnog povezivanja“ površinskih molekula antigena s molekulima antitijela (imunoglobulinima).

3. Postavljanje reakcije pasivne hemaglutinacije

RPGA se stavlja u plastične tablete ili u epruvete sa razrijeđenjima krvnog seruma pacijenta, kojima se dodaje eritrocitni dijagnostikum.

Proces spajanja antigena s eritrocitima naziva se senzibilizacija, a tako dobiveni umjetni korpuskularni antigen naziva se senzibilizirani eritrociti. Erythrocyte diagnosticums zvani eritrociti senzibilizirani antigenom.

Za pripremu dijagnostikuma koriste se eritrociti ovaca ili ptica (obično piletina), prvo tretirani formaldehidom, a zatim taninom, koji se senzibiliziraju ultrazvučnim antigenom patogene treponema pallidum (Nicholsov soj) ili rekombinantnim proteinima treponema pallidum (T). TpN17, TpN47). Mogu se koristiti i ovčji eritrociti senzibilizirani ultrazvučnim antigenom kultivirane Treponema pallidum.

Ispituje se samo serum (ne koristiti krvnu plazmu). Hemolizirani i zamućeni uzorci nisu prikladni. Nesenzibilizirani eritrociti služe kao negativna kontrola (da se isključi prisustvo anti-eritrocitnih antitijela). U svakoj seriji proizvodnje koriste se pozitivne i negativne kontrole.

Uzorci seruma krvi za ispitivanje i testiranih crvenih krvnih zrnaca dodaju se u jažice (jažice) imunološke tablete. Ako pacijentov krvni serum sadrži specifična anti-treponemska antitijela, onda kada se test serum doda u jažicu s antigenom, dolazi do stvaranja kompleksa antigen-antitijelo povezanih s površinom nosača (eritrocita). Vizuelno se to manifestuje lepljenjem crvenih krvnih zrnaca, odnosno hemaglutinacijom koja je vidljiva golim okom. Imuni kompleksi “antitijelo-antigen-eritrocit”, koji pod utjecajem gravitacije postepeno padaju, raspoređeni su po cijeloj površini dna rupe i formiraju karakterističnu sliku “obrnutog kišobrana”.

U zavisnosti od količine antitela sadržanih u uzorku za testiranje, slika „obrnutog kišobrana” varira od maksimalne, koja zauzima celu površinu dna bunara, do male površine u centralnom, najnižem delu (sa čišćenjem u centar i formiranje intenzivnijeg prstena staloženih crvenih krvnih zrnaca na periferiji).

Imuni kompleksi se ne formiraju ako u uzorku nema specifičnih antitijela ili kada se reakciji dodaju kontrolna (neoštećena) crvena krvna zrnca. Istovremeno, crvena krvna zrnca se postupno skupljaju na najnižoj tački dna rupe, tvoreći lik u obliku kompaktne točke ili "dugma", ponekad s blagim razmakom u sredini.

Ako krvni serum osobe sadrži anti-eritrocitna antitijela, tada će se u svakom slučaju formirati "kišobran" - kako u reakciji s test eritrocitima, tako i s kontrolnim eritrocitima. U ovom slučaju, preporučuje se korištenje drugih medicinskih tehnologija za identifikaciju specifičnih antitreponemskih antitijela.

Moguć je fenomen prozona (nemogućnost reakcije zbog viška antitijela) koji se može eliminirati razrjeđivanjem seruma.

4. Obračunavanje rezultata reakcije pasivne hemaglutinacije

Rezultati RPGA se vizuelno uzimaju u obzir nakon 60-120 minuta pri postavljanju mikro-metode i nakon 2-4 sata ili narednog dana pri postavljanju makro-metode. Pri korištenju većih (nukleiranih) ptičjih eritrocita dobija se jasnija slika, a rezultati se bilježe ranije.

Moguće je odrediti titar (visoki titar RPHA ≥ 1:2 560).

Rezultati studije se procjenjuju po sistemu 4+ (od “–” do “++++”) na osnovu veličine formiranog filma. Kada dođe do aglutinacije, crvena krvna zrnca se nalaze na površini rupe u obliku "kišobrana", a ako je rezultat negativan, crvena krvna zrnca slobodno klize prema dolje i nakupljaju se na dnu u središtu rupe u obliku “dugma”.

Općenito prihvaćena procjena rezultata RPGA:

4+ - pozitivan RPGA. Aglutinirana crvena krvna zrnca u obliku "kišobrana" ravnomjerno oblažu cijelu površinu rupe;

3+ - pozitivan RPGA. Crvena krvna zrnca oblažu cijelu površinu rupe, ali neka od njih "klize" do centra. U tom slučaju se formira uočljiv prsten duž periferije sedimenta;

2+ - slabo pozitivan RPGA. Crvena krvna zrnca formiraju film na maloj površini donjeg dijela rupe, tvoreći gusti prsten sedimenta crvenih krvnih zrnaca s primjetnim čišćenjem u sredini;

1+ - neodređeni RPHA, crvena krvna zrnca formiraju labav sediment na dnu bunara s nejasnim rubovima i blagim lumenom u sredini;

(–) - negativan RPGA, sva crvena krvna zrnca leže na dnu bunara u obliku kompaktnog sedimenta („dugmići“ ili prstenovi) na čistoj okolnoj pozadini (bez okolnog granularnog sedimenta).

U stranoj praksi, rezultati RPGA se također ocjenjuju kao reaktivni (u slučaju stvaranja aglutinata), slabo reaktivni (ako su formacije beznačajne) i nereaktivne (ako se aglutinacija ne opaža).

Rezultati reakcije mogu se automatski zabilježiti pomoću posebnih analizatora. Pored kvalitativnog istraživanja, svi testni sistemi pružaju kvantitativna analiza sa određivanjem titra.

5. U kojim periodima bolesti je bolje koristiti RPHA?

RPHA postaje pozitivan sredinom primarne menstruacije (7-8 sedmica od trenutka infekcije, 3-4 sedmice nakon pojave šankra) i ostaje pozitivan godinama nakon tretmana.

Uz vrlo visok nivo antitijela na treponemu u test serumu (što je najtipičnije za sekundarni sifilis), moguć je lažno negativan RPGA rezultat (tzv. „prozonski” fenomen).

Specifična aglutininska antitijela se otkrivaju u krvi osoba koje su duže vrijeme bolovale od sifilisa, pa se RPGA ne može preporučiti za diferencijalnu dijagnozu reinfekcije ili određivanje težine infektivnog procesa.

RPGA se ne koristi za kontrolu ozdravljenja, jer može ostati pozitivan mnogo godina nakon oporavka. Istovremeno, može se koristiti kao dodatna (kacinom mokraćne bešike ili RPR) metoda u praćenju efikasnosti lečenja proučavanjem dinamike smanjenja titra antitela. Preduslov za to je korišćenje istog RPGA test sistema kao i prilikom prvog (pre lečenja) pregleda pacijenta, kao i testiranje u istoj laboratoriji.

6. Osjetljivost i specifičnost RPGA

RPGA se smatra vrlo osjetljivim i specifičnim testom. Ova reakcija je vrijedan dijagnostički test za sve oblike sifilisa, ali je posebno osjetljiva kod kasnih oblika bolesti. U zavisnosti od stadijuma bolesti, osetljivost RPGA varira. S primarnim sifilisom, osjetljivost RPGA je 76% (i više), sa sekundarnim sifilisom - do 100%. Za latentni rani sifilis - 97%, za kasni sifilis - 94%, sa specifičnošću od 98-100%. Niža osjetljivost kod svježih oblika bolesti objašnjava se kasnijim stvaranjem aglutinina.

Prema podacima Državne ustanove „TsNIKVI Roszdrav“, osjetljivost RPGA u dijagnosticiranju različitih oblika sifilisa bila je 99,4%. Većina istraživača primjećuje 98-99% specifičnosti za RPHA.

Po senzitivnosti i specifičnosti RPGA nije inferioran, a kod kasnih oblika i kongenitalnog sifilisa čak je superiorniji od RIF-a i RIBT-a.

7. Obim primjene RPGA metode

RPGA se može koristiti i kao skrining i kao potvrdni test; može se koristiti u polukvantitativnoj verziji sa izračunom titra antitijela. Razvijena je kvantitativna metoda za postavljanje RPHA, mikrometoda, kao i automatizirana reakcija mikrohemaglutinacije.

8. Karakteristike, prednosti i nedostaci RPGA

Prema literaturi, RPGA je dosljedno zauzimala vodeće mjesto u kliničkoj praksi u većini zemalja svijeta. RPGA je test koji se najčešće koristi u klinikama za spolno prenosive bolesti u inostranstvu.

RPGA tehnika je jednostavna za izvođenje i ne zahtijeva posebnu opremu: sve što vam treba je hemaglutinacijska ploča. Istraživanje ne traje dugo; reakcija je vrlo osjetljiva i specifična. Testiranje metode u kliničkoj praksi pokazalo je da je izuzetno jednostavna, jeftina i osjetljiva. Kao i ELISA, RPGA je jednostavna za izvođenje, ne zahtijeva visoko kvalifikovano osoblje i posebnu opremu, a moguća je i automatizacija.

Prednosti RPGA testa:

• jednostavan za postavljanje i tumačenje,
• ne zahtijeva posebnu opremu,
• vrijeme za postizanje rezultata – 45 minuta,
• pogodan za masovni skrining (potrebno je samo 25 µl seruma razrijeđenog 1:20),
• visok stepen standardizacije,
• prisustvo internih kontrola,
• dugi rok trajanja,
• prihvatljiva cijena
• mogućnost automatizacije računovodstva.

Treba napomenuti i nedostatke RPGA:

• mogućnost nespecifičnih reakcija u prisustvu antieritrocitnih antitijela,
• nedostatak korelacije između titra i stadijuma sifilisa,
• kasnija pozitivna reakcija u ranim fazama sifilisa,
• mogućnost lažno pozitivnih reakcija kod osoba koje su uzimale alkohol, ovisnika o drogama,
• osjetljivost na vibracije i temperaturu u laboratoriju.

Prednosti RPGA u odnosu na RIBT i RIF su:

• upotreba industrijskih test sistema,
• mogućnost automatizacije reakcije,
• nema potrebe raditi sa živom Treponema pallidum,
• nema potrebe za vivarijumom.

9. Izvori i uzroci grešaka pri izvođenju RPGA, lažno pozitivni i lažno negativni rezultati

Test pasivne hemaglutinacije je relativno jednostavan test; pri izvođenju potrebno je pridržavati se svih preporuka proizvođača dijagnostikuma i pravila rada u kliničko-dijagnostičkom laboratoriju. Učinjene greške mogu dovesti do pojave i registracije lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata reakcije. Lažno pozitivni rezultati RPGA mogu biti posljedica utjecaja ljudskih i bioloških faktora.

Mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati

• prilikom proučavanja krvnih seruma pacijenata sa nevenerijskim treponematozama,
• zbog reumatoidnog faktora
• zbog unakrsne reakcije antitela sa antigenom treponeme, nastalih tokom različitih sistemskih ili metaboličkih poremećaja izazvanih lekovima,
• zbog abnormalnih nivoa imunoglobulina;
• kod novorođenčadi - zbog stvaranja u tijelu fetusa ili djeteta IgM antitijela na IgG majke, što otežava tumačenje rezultata i dijagnozu kongenitalnog sifilisa.

Greške uzrokovane utjecajem ljudskog učešća na studiju:

• kontaminirane mikroploče
• pogrešno pipetiranje
• prisustvo vibracija u laboratoriji
• Temperatura vazduha u laboratoriji je van temperaturnog opsega: 18–25 stepeni

Najtipičnije tehničke greške pri izvođenju RPGA, koje dovode do nepouzdanih rezultata, uključuju:

• netačno razrjeđivanje sastojaka,
• kršenje temperaturni režim,
• kršenje vremena inkubacije reagensa,
• kršenje rokova za primjenu reagensa na tabletu,
• nesklad između pH vrijednosti otopina i potrebnih,
• kontaminacija laboratorijskog staklenog posuđa.

Sljedeći tehnički problemi također mogu biti izvor grešaka prilikom postavljanja RPGA:

• isključivanje kontrolnih krvnih seruma iz reakcije;
• neujednačena koncentracija crvenih krvnih zrnaca u dijagnostikumu zbog nedovoljnog miješanja prije upotrebe;
• kršenje rokova i uslova skladištenja dijagnostikuma i kontrole crvenih krvnih zrnaca; korištenje kompleta kojima je istekao rok trajanja;
• korištenje kontaminiranih epruveta, vrhova pipeta, pipeta, imunoloških ploča, otopina pri izvođenju reakcija;
• nepreciznosti u početnom razrjeđivanju uzorka seruma;
• nedovoljna pažnja u izvođenju serijskih dvostrukih razrjeđivanja;
• nepoštivanje temperaturnih uslova i vremena inkubacije;
• prisutnost vanjskih vibracija i tresenje imunološke tablete tijekom inkubacije;
• kršenje procedure za postavljanje RPGA, izraženo u odbijanju da se uradi studija sa kontrolnim eritrocitima.

Upotreba krvne plazme koja sadrži antikoagulanse koji mogu uzrokovati nespecifičnu aglutinaciju eritrocita (RPGA) može dovesti do rezultata koji se ne mogu protumačiti.

Broj lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata je manji nego kod drugih seroloških testova. LPR kod stadija RPHA su rijetki i mogući su kod treponematoza (jaws, bejel, pinta). Takođe, zabilježeni su lažno pozitivni rezultati (ukupno manje od 1%) kod ovisnika o drogama, kod pacijenata infektivna mononukleoza, borelioze, lepre, kolagenoze, ciroze jetre, limfosarkoma, kao i kod trudnica.

Lažno negativni rezultati testa mogu biti posljedica konkurencije između IgM i IgG antitijela. Lažno negativni rezultati mogući su i kod pacijenata zaraženih HIV-om.

10. Modifikacije RPGA metode

Postoje mikro- i makro-modifikacije RPHA podešavanja, prva se češće koristi zbog svoje efikasnosti, brzine podešavanja i snimanja rezultata.

Osim toga, automatik dijagnostički kompleks analiza slike, koja je omogućila da se izvrši kvantitativna automatska procena rezultata i eliminiše subjektivnost u interpretaciji dobijenih podataka. Kompleks hardvera i softvera prepoznaje sliku, obrađuje podatke i daje odgovor u relativnim jedinicama.

Za automatizaciju snimanja RPGA rezultata koriste se i čitači i automatski analizatori.

TPPA (Treponema pallidum particle aglutination) - reakcija aglutinacije umjetnih čestica za otkrivanje antitijela na Treponema pallidum

Kratak opis TPPA testa

Trenutno se za dijagnostiku sifilisa koristi i modifikacija metode pasivne hemaglutinacije - TPPA (Treponema pallidum particle aglutination), u kojoj se antigen Treponema pallidum fiksira na čestice želatine. Budući da čestice umjetnog polimera nemaju vlastite antigene koji određuju biološku aktivnost, setovi za serodijagnostiku sifilisa na temelju njih imaju razloga da se smatraju naprednijim. Upotreba biološki inertnih umjetnih čestica minimizira nespecifičnu aglutinaciju koja se uobičajeno opaža kod drugih nosača.

TPPA se koristi za serološka dijagnostika antitijela na različite vrste i podvrste patogene Treponema. Ovaj test se može koristiti za otkrivanje antitijela na patogene sifilis, pint, bejel i yaws.

Postupak istraživanja je vrlo jednostavan i ne zahtijeva posebnu opremu - koriste se standardne mikroploče u obliku slova U. Test se zasniva na aglutinaciji želatinskih čestica senzibiliziranih antigenima T. pallidum, antitijelima sadržanim u krvnom serumu pacijenta.

TPPA je potvrdni treponemski test koji je koristan i za testiranje malih uzoraka i za masovni skrining. TPPA se koristi u inostranstvu kao potvrdni test i kao zamena za mikrohemaglutinacioni test MHA-TP (test mikrohemaglutinacije za antitela na T. pallidum).

Osetljivost TPPA testa je između 85% i 100%, a specifičnost između 98% i 100%. Osetljivost TPPA za primarni sifilis je 88%, za sekundarni i kasni latentni sifilis 98%-100%.

Ako se TPPA koristi za dijagnosticiranje sifilisa, antitijela na druge treponeme (kao što su T. pallidum endemicum, pertenu ili carateum) mogu uzrokovati lažno pozitivne rezultate. Postoji niz dostupnih metoda za uklanjanje ovih antitijela iz uzoraka seruma prije testiranja.

Princip TPPA testa

TPPA je metoda pasivne aglutinacije želatinskih čestica u ljudskom serumu ili plazmi. Serum koji sadrži antitela na patogenu treponemu reaguje sa česticama želatine senzibilizovanim sa antigenom blede treponema soja Nichols, podvrgnutim ultrazvuku. Kao rezultat reakcije formira se glatki film aglutiniranih želatinskih čestica u jažici mikrotitarske ploče.

Ako su antitijela odsutna, tada se čestice talože na dno jažice ploče, formirajući kompaktno „dugme“ neaglutiniranih čestica. Kontrolne jažice sa nesenzibiliziranim česticama želatina također trebaju pokazati ovo kompaktno „dugme“ za svaki serum, tj. bez aglutinacije.

Primjena TPPA testa

TRPA je test univerzalne namjene koji se podjednako uspješno može koristiti kako prilikom obaveznog preventivnog pregleda populacionih grupa na sifilis (skrining), tako i u specijalizovanim dermatovenerološkim ustanovama. Prednost TPPA testa je njegova visoka osjetljivost, koja nije inferiorna klasični testovi, koji su donedavno bili “zlatni standard” za serodijagnostiku sifilisa. Ostale prednosti testa su visoka ponovljivost, kao i jednostavnost i brzina postavljanja reakcije.

TPPA test se koristi za potvrdu pozitivnih rezultata skrining testova na netreponemski sifilis, kao što je VDRL test, i za procjenu pacijenata s negativnim rezultatima netreponemskog testa, ali koji imaju znakove ili simptome koji upućuju na sifilis. kasni sifilis. Ne preporučuje se upotreba TPPA kao jedinog skrining testa za sifilis.

Osim toga, TPPA aglutinacijski test se može koristiti za ispitivanje uzoraka cerebrospinalne tekućine u dijagnozi neurosifilisa. U ovom slučaju, kao i kod drugih seroloških testova, tumačenje rezultata mora se provesti u obaveznoj kombinaciji s drugim pokazateljima i simptomima bolesti.

Rezultati TPPA testa

Rezultat se ocjenjuje po sistemu “plus” - od (–) do (2+). Rezultati testa su vidljivi golim okom i tumače se na sljedeći način:

Stepen aglutinacije	Test indikator	Interpretacija
Aglutinirane čestice ravnomjerno oblažu dno ploče	2+	Pozitivno
Značajno veliki prsten sa neujednačenim vanjskim rubovima i perifernom aglutinacijom	1+	Pozitivno
Čestice formiraju kompaktan prsten sa razmakom u sredini i glatkom vanjske granice	±	Slabo pozitivno
Čestice formiraju kompaktan prsten u sredini rupe s blagim razmakom u sredini i glatkom vanjskom granicom	–	Negativno
Čestice formiraju „dugme“ u sredini rupe sa glatkom spoljnom granicom	–	Negativno

Rezultati se uzimaju u obzir kako bi se utvrdila usklađenost sa gornjim opisom. Uzorci koji pokazuju neodređeni rezultat (±) moraju se ponovo testirati. Ako uzorak pokazuje neodređeni rezultat u nekoliko TPPA testova, preporučuje se testiranje korištenjem drugih metoda.

Rezultate analize ne treba posmatrati izolovano. Na primjer, u ranoj fazi infekcije, broj antitijela je još uvijek premali, zbog čega TPPA i mnoge druge metode nemaju osjetljivost. Stoga, ako se sumnja na sifilis, čak i ako su rezultati testa negativni, uzorci se moraju ponovo testirati. Za postavljanje dijagnoze potrebno je uzeti u obzir kliničke simptome pacijenta, anamnezu i druge podatke.

Kao i kod RPHA reakcije, TPPA može pokazati fenomen prozona i lažno negativan rezultat ako uzorak seruma sadrži previsok titar antitijela.

ELISA - Enzimski imunotest

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) je jedna od mnogih metoda za serološku dijagnostiku zaraznih bolesti. Enzimski imunosorbentni test (ELISA) u serodijagnostici sifilisa je test za antitela klasa M, G i A (IgM, IgG, IgA) protiv antigena Treponema pallidum. Moguće je uraditi ELISA sa cerebrospinalnom tečnošću.

Uvođenje u praksu enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) umjesto Wassermanove reakcije i drugih kardiolipinskih testova značajno je poboljšalo kvalitetu laboratorijske dijagnostike sifilisa. Značajna prednost ove metode je mogućnost automatizacije procesa istraživanja, čime se smanjuje uticaj ljudskog faktora.

1. Istorijat ELISA metode

Osnovne principe enzimskog imunotestiranja na površini čvrstog nosača razvili su E. Engvar i koautor. (1971), B. Van Weeman i A. Schuurs (1971). Enzimski imunotest koji su razvili prvi su predložili za dijagnozu sifilisa 1975. godine J. Veldkamp i A. Visser, koji su procijenili potencijal ovog automatiziranog testa. ELISA je počela da se široko koristi u dijagnostici sifilisa 1980-ih, kada su razvijeni i sertifikovani dijagnostički testovi i standardizovane metode testiranja. U SSSR-u, metodu ELISA za dijagnosticiranje sifilisa razvili su V.N. Bednova, A.V. Babiy i A.V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. Princip ELISA metode

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) je po mehanizmu reakcije sličan RIF-u (otkrivaju se ista antitijela). Reakcija enzimskog imunoeseja klasificira se kao imunološka reakcija zasnovana na visoko specifičnoj interakciji antigena treponema pallidum sa antitijelima pacijenta sa sifilisom.

U sifilidološkoj praksi uglavnom se koristi indirektna verzija ELISA. Princip najčešće korištene indirektne reakcije je sljedeći. Na površini jažica polistirenske tablete fiksiraju se imuni kompleksi koji nastaju kada antitijela bolesnika sa sifilisom stupe u interakciju s antigenima Treponema pallidum. Nakon toga se detektuju u reakciji boje upotrebom specifičnih konjugata i odgovarajućih supstrat-hromogenih aditiva.

Procedura za izvođenje testa je sljedeća: pacijentov serum se stavlja na čvrstofazni nosač na koji je pričvršćen antigen. Ako u njemu postoje antitijela, na površini nosača se formira kompleks antigen-antitijelo. Da bi se “manifestirali” rezultati reakcije, koriste se anti-humana Ig antitijela konjugirana sa markerima enzima. U slučaju pozitivne reakcije, enzim vezan za kompleks antigen-antitijelo razgrađuje supstrat koji je dodat sistemu, što rezultira razvojem bojenja različitog intenziteta.

U reakciji se određivanje kompleksa AG i AT sorbiranog na čvrstoj fazi provodi korištenjem antiglobulinskih antitijela označenih enzimom, na osnovu reakcije boje enzima sa supstratom.

U reakciji se određivanje kompleksa antigena i antitijela sorbiranih na čvrstoj fazi provodi korištenjem antiglobulinskih antitijela obilježenih enzimom.

ELISA pruža mogućnost detekcije serumskih Ig različitih klasa. Na tržištu postoje sistemi koji vam omogućavaju da zasebno odredite IgM i IgG i ukupna antitijela.

Specifični antigeni koji se koriste za ELISA mogu imati različito porijeklo:

ultra-glas- dobijaju se uništavanjem bakterijske ćelije T. pallidum ultrazvukom ili drugom metodom;

rekombinantna- dobijaju se tehnologijom genetskog inženjeringa uvođenjem u genom bakterijske ćelije (npr. coli E.Coli) gen odgovoran za sintezu specifičnog antigena T.pallidum, praćeno povećanjem bakterijske mase mikroorganizma koji proizvodi, uništavanjem ovih ćelija, izolacijom i pročišćavanjem antigena;

peptid- dobijeni kao rezultat sekvencijalne hemijske sinteze antigenskih epitopa proteina T. pallidum.

Tijelo je u stanju da formira antitijela na gotovo svaki dio molekule antigena. Uz normalan imunološki odgovor, to se obično ne dešava. Jedan ili više imunogenih peptida izoliranih iz proteinskog antigena imaju posebnu antigenost, a većina antitijela se formira specifično za njih. Na njih se razvija najintenzivniji imuni odgovor. Najinformativnija ELISA je pokazala imunodominantne regije proteina Treponema pallidum sa molekularnom težinom od 15 kDa, 17 kDa i 47 kDa. Kao antigen korišten je ekstrakt deterdženta ili sonikat patogenih treponema Nichols soja.

3. Metoda provođenja istraživanja korištenjem metode

Princip metode je da detektuje specifični kompleks antigen-antitijelo sorbiran na čvrstoj fazi (površina jažica plastične ploče) s antiglobulinskim antitijelima obilježenim enzimom (peroksidazom) pomoću reakcije u boji sa supstratom, uzetim u kvantitativno spektrofotometrijski.

Antigeni koji se koriste za senzibilizaciju jažica polistirenske ploče mogu biti:

• lizat- dobiveno kao rezultat uništavanja Treponema pallidum ultrazvukom;
• peptid- dobiveni kao rezultat kemijske sinteze proteinskih fragmenata Treponema pallidum i imaju antigensku reaktivnost sličnu originalnim proteinima patogena;
• rekombinantna- dobiveni metodama genetskog inženjeringa, noseći antigenske determinante identične Treponema pallidum.

U sifilidološkoj praksi obično se koristi indirektna verzija ELISA.

4. Računovodstvo rezultata

U ELISA testu, da bi se vizualizirala reakcija antigen-antitijelo, enzim (alkalna fosfataza ili peroksidaza hrena) reagira sa supstratom, koji mijenja boju. Intenzitet boje određuje pozitivnost reakcije (od “–” do “++++”). ELISA rezultati se mogu procijeniti vizuelno korištenjem sistema od 4 tačke ili instrumentalno u obliku digitalnih indikatora optičke gustine dobijenih na posebnim čitačima (kao što je Multiscan) na talasnoj dužini od 492 nm. Jer Rezultati se procjenjuju spektrofotometrijski, što eliminira subjektivnu interpretaciju.

5. U kojim periodima bolesti je bolje koristiti

Vrijeme ELISA pozitivnosti je od 4. sedmice od infekcije. Rezultati ELISA (kao i RIF) postaju pozitivni u prvim danima primarnog perioda ili na kraju inkubacije i ostaju pozitivni u svim periodima. ELISA je posebno vrijedna u ranoj dijagnostici sifilisa - pozitivni rezultati za otkrivanje antitijela mogu se dobiti već na kraju inkubacionog perioda bolesti (tj. 4-6 sedmica nakon infekcije).

6. Osjetljivost i specifičnost

ELISA je vrlo osjetljiv i specifičan test, što je njegova prednost. ELISA je bliska RIF-u po mehanizmu reakcije, senzitivnosti i specifičnosti, jer U obje reakcije učestvuju ista antitijela. Većina istraživača primjećuje visoku specifičnost i osjetljivost u svim fazama bolesti. Osjetljivost različitih varijanti ELISA, prema G. A. Dmitrievu, dostiže 98-100%, a specifičnost - 96-100%. Prema TsNIKVI-ju, osjetljivost ELISA testa za sifilis je 99,1% (Naredba br. 87 M3 Ruske Federacije).

Varijanta čvrste faze ELISA (enzimski imunosorbentni test, ELISA) je jedna od najosetljivijih seroloških reakcija, koja omogućava detekciju 0,0005 μg/ml antitela i 0,000005 μg/ml antigena.

7. Obim primjene metode

Metoda se preporučuje za pregled trudnica, kontakt osoba, donatora i predstavnika rizičnih grupa. ELISA se može koristiti i kao skrining i kao potvrdni test. U relativno kratkom vremenu svoje istorije, ELISA je evoluirala od indikativnog testa do potvrdnog testa. U dijagnozi sifilisa, test se također koristi kao potvrdni test za uzorke koji pokazuju pozitivne rezultate koristeći različite netreponemske testove i RPGA.

ELISA metoda se može koristiti u kvantitativnoj verziji sa izračunom indeksa pozitivnosti, odnosno reaktivnosti, što vam omogućava da procijenite nivo antitijela u uzorku.

Trenutno u Rusiji, upotreba enzimskog imunotesta za dijagnozu sifilisa regulisana je Naredbom Ministarstva zdravlja Ruske Federacije br. 87 od 26. marta 2001. godine „O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa“ (Dodatak br. 1 „ Postavljanje skrininga i dijagnostičkih testova za sifilis”). Naredbom se planira zamjena RSC u kompleksu seroreakcija (SRC) sa ELISA i RPGA.

8. Izvori i uzroci grešaka u proizvodnji, lažno pozitivni i lažno negativni rezultati

Enzimski imunotest je složena višestepena studija, u kojoj je potrebno striktno slijediti sve preporuke proizvođača dijagnostičkih kompleta, pravila za podešavanje i konfiguraciju opreme koja se koristi u studiji.

Izvor grešaka pri izvođenju ELISA-e mogu biti sljedeće točke:

Ispitivanje reakcije hiperlipidemijskog, hemoliziranog krvnog seruma ili uzoraka sa znakovima rasta bakterija;

Nemojte prakticirati zamrzavanje uzorka biološkog materijala dva ili više puta; ako je potrebno, ponovite studiju, koristite serum iz duple epruvete;

Kršenje rokova i uslova skladištenja imunosorbenta i rastvora za pranje; korištenje testnih kompleta kojima je istekao rok trajanja;

Upotreba komponenti reakcije iz drugih dijagnostičkih kompleta;

Kršenje vremena faza reakcije;

Sušenje jažica imunološke ploče u fazama reakcije;

Ponovno korištenje plastičnih posuda (plastičnih posuda) za pripremu mješavine kromogena i supstrata;

Nepoštivanje učestalosti metrološke kontrole radnih parametara upotrebljenih uređaja (mašina za pranje i spektrofotometar);

Upotreba kontaminiranog laboratorijskog staklenog posuđa pri postavljanju reakcija: tikvice, gradirani cilindri, epruvete, pipete, vrhovi pipeta;

Nedovoljna temeljitost u obavljanju razblaženja uzoraka biološkog materijala;

Greške prilikom unošenja uzorka biološkog materijala u odgovarajuću jažicu ploče;

Greške prilikom prijenosa rezultata studije u dnevnik registracije, protokol studije ili obrazac za odgovore.

Pažljivo sprovođenje preporuka uputstava za upotrebu dijagnostičkih test kompleta, redovna provera tačnosti dozatora za pipete i automatskih uređaja, kao i upotreba internih pozitivnih i negativnih kontrola omogućavaju dobijanje rezultata ELISA testa sa visokom ponovljivošću.

9. Karakteristike, prednosti i nedostaci

ELISA je moderna, obećavajuća metoda za serodijagnostiku sifilisa zbog svoje jednostavnosti, ponovljivosti i pristupačnosti. Određivanje antitijela ELISA-om je idealna dijagnostička metoda, pogodna za istovremeno ispitivanje velikog broja uzoraka. Zbog svojih prednosti stekao je popularnost u svim zemljama.

Tehnologija ELISA istraživanja zahtijeva usklađenost sa svim preporukama proizvođača komercijalnih dijagnostičkih test-kitova i temeljitost postupka istraživanja. Za provođenje istraživanja u ELISA-i potrebno je kupiti dodatnu specijalnu opremu. Tehnika postavljanja traje duže u odnosu na RMP, RPR i RPGA.

Prisutnost automatizacije niza faza ili cijelog procesa u cjelini omogućava vam da istovremeno proučavate veliki broj uzoraka biološkog materijala uz visok stepen standardizacije studije, minimizirajući subjektivni element u evaluaciji rezultata i mogućnost pohranjivanja fiksnih protokola studija, što vam omogućava da arhivirate podatke studije i ponovo im pristupite za retrospektivnu analizu.

Prednosti:

• Omogućava diferencirano i ukupno određivanje IgM i IgG antitela uzročnika sifilisa.
• visoka osjetljivost i specifičnost koja se približava 100%,
• reproduktivnost
• mogućnosti automatizacije

Prednosti ELISA-e uključuju visoku specifičnost (96-100%) i osjetljivost (98-100%), napominje većina istraživača.

Prisutnost automatizacije niza faza ili cijelog procesa u cjelini omogućava vam da istovremeno proučavate protok s velikim brojem uzoraka biološkog materijala uz visok stepen standardizacije studije, minimizirajući subjektivni element u procjeni rezultata , mogućnost pohranjivanja fiksnih istraživačkih protokola, što vam omogućava da arhivirate istraživačke podatke i ponovo im pristupite za retrospektivnu analizu.

Značajni nedostaci ručnih metoda, uključujući određivanje antitela na antigene T. pallidum ELISA-om, su:

~ moguće greške osoblja tokom istraživanja (previd, nemar, kršenje tehnologije);

~ nemogućnost potpune standardizacije procesa istraživanja sa ručnom verzijom ELISA-e;

~ povećan rizik od infekcije osoblja.

10. Modifikacije metode

Uz klasičnu indirektnu ELISA metodu trap ELISA. Predložili su ga 1989. O. E. Ijsselmudien et al. za otkrivanje IgM antitela na Tr antigene. pallidum. Metoda ima visoku specifičnost i osjetljivost.

Pročišćena antitijela na humane imunoglobuline klase M se sorbiraju na površini jažica ploče, a nakon inkubacije test seruma, svi IgM se vezuju za nosač. Prisustvo antigen-specifičnog Tr. među udruženim IgM. pallidum se detektuje pomoću Tr. pallidum konjugiran sa enzimom.

Ova metoda vam omogućava da otkrijete antitijela ne samo klase IgM, već i klase IgG i IgA. Da bi se to postiglo, jažice ploča se senzibiliziraju afinitetnim pročišćenim antitijelima određene klase protiv humanih imunoglobulina. U ovom slučaju, antitijela ove klase se hvataju iz seruma, a otkrivanje antitijela specifičnih za treponeme vrši se njihovim kombinovanjem sa konjugatom koji predstavlja vezu treponemskog antigena sa enzimom.

Upotreba trap verzije enzimskog imunosorbentnog testa smanjuje rizik od lažno pozitivnih reakcija posredovanih reumatoidnim faktorom krvi, unakrsne reakcije između imunoglobulina klasa M i G. Prilikom pregleda novorođenčadi, u ovom slučaju, lažno pozitivan test Rezultati povezani sa detekcijom IgM usmjerenih protiv majčinog anti-treponemskog IgG su također isključeni.

ELISA je našla široku upotrebu u inostranstvu kao opcije. enzimski imunološki test (EIA) i sistem ICE sifilis. U potonjem, mješavina antitijela na IgM i IgG, kao i tri rekombinantna proteina T. pallidum, se sorbuje u ćelijama ploče. Pozitivni rezultati se testiraju u istom sistemu testiranja u duplikatu kako bi se dobio konačni rezultat.

U Rusiji je razvijen niz test sistema za serodijagnostiku sifilisa pomoću ELISA metode sa domaćim reagensima. Ovi sistemi imaju visoku specifičnost i osjetljivost.

Pored navedenih, postoje i druge ELISA opcije, uključujući one koje omogućavaju direktnu detekciju patogena u krvi (direktna ELISA), dot-ELISA sa reakcijom na nitrocelulozne trake, ELISA sa kapilarnom krvlju, kao i imunoblotiranje, ili Western blot, uz istovremenu detekciju AT na različite komponente patogena.

Moderna poboljšana modifikacija ELISA-e je imunoblotiranje.

ICA (imunohemiluminiscencijski test), ICL (imunohemiluminiscencija)

Sa razvojem laboratorijske dijagnostike u kontekstu modernizacije zdravstva u Ruskoj Federaciji, automatizacija laboratorijskih istraživanja je ušla u praksu laboratorija, što omogućava standardizaciju analitičkih faza istraživanja. To pomaže poboljšanju kvalitete dijagnoze. Uvođenjem automatizacije počele su se koristiti nove visokotehnološke metode visoke osjetljivosti i specifičnosti, kao što je hemiluminiscentni imunotest (CLIA)

Hemiluminiscencija je proces emisije fotona tokom tranzicije elektronski pobuđenih oksidativnih produkata hemijske reakcije u prvobitno energetsko stanje. Tokom reakcije hemiluminiscencije oslobađa se značajna količina energije, a kvantni prinos emitovane svjetlosti je prilično visok. Od svih ne-izotopskih metoda, hemiluminiscencija daje najveću osjetljivost. Za imunometrijske metode, osjetljivost hemiluminiscencije je za redove veličine veća od osjetljivosti radioimunog testa.

Metoda imunohemiluminiscencije (ICL) trenutno je našla svoju primjenu u dijagnostici tumorskih markera, autoimune bolesti, dijabetes, srčani markeri, hormoni ( štitne žlijezde, nadbubrežne žlijezde, ženski i muški polni hormoni), torch infekcije, virusni hepatitis, virusi iz grupe herpesa.

Na osnovu imunohemiluminiscentne metode, razvijen je niz visoko osjetljivih i specifičnih (98-100%) test sistema za dijagnostiku sifilisa, koji se koriste uglavnom u inostranstvu.

Metoda kao antigene koristi rekombinantne lipoproteine ​​dobijene metodama genetskog inženjeringa, koji su potpuni analozi antigena T. pallidum.

Na osnovu rezultata kliničke studije, ICA metoda je priznata i preporučuje se za upotrebu u laboratorijskoj dijagnostici sifilisa u Ruskoj Federaciji kao skrining i potvrdni test ako je odgovarajuća oprema dostupna u laboratorijama. ICA je 2012. godine uključena kao skrining i potvrdni test za dijagnozu sifilisa u Kliničke smjernice za liječenje pacijenata sa spolno prenosivim infekcijama i urogenitalnim infekcijama

Dakle, upotreba visokotehnološke ICA, koja je uvođenjem automatizacije postala dio prakse svjetske i domaće laboratorijske dijagnostike, pruža sljedeće prednosti:

• eliminisanje uticaja subjektivnih faktora u analitičkoj fazi studije
• sigurnost osoblja prilikom izvođenja istraživanja na potencijalno zaraženom biološkom materijalu
• povećavajući brzinu kojom pacijent prima rezultate
• standardizacija studija i kontrola kvaliteta studija
• pružanje pouzdanih i pouzdanih rezultata pacijentima
• visok kvalitet kliničkih laboratorijskih istraživanja.

Po osjetljivosti, ICA metoda je uporediva sa radioimunoesej metodom, a po jednostavnosti izvođenja, sigurnosti za osoblje i mnogim drugim parametrima je nadmašuje.

ICA metoda, koja ima visoku osjetljivost i specifičnost (98-100%), omogućava kvantitativno određivanje razine antitijela na uzročnika sifilisa i može se koristiti za potvrdu sifilitičke infekcije i skrining. Ograničenja upotrebe: ne može se koristiti za praćenje efikasnosti terapije, može dati lažno pozitivan rezultat.

Imunohromatografija (ICH).

Metode za otkrivanje antitijela specifičnih za treponeme zasnovane na imunohromatografskim (ICH) metodama su relativno nove za upotrebu u Ruskoj Federaciji. Kao i u ICA metodi, kao antigeni se koriste rekombinantni lipoproteini dobijeni metodama genetskog inženjeringa (na primjer: antigeni Tp15, Tp17, Tp47) i biosintetski peptid TmpA. Navedeni antigeni se također koriste u različitim kombinacijama kao dio imunosorbenata u ELISA-i i imunoblotingu.

ICG metoda vam omogućava da brzo odredite sadržaj antitijela specifičnih za treponeme na uzročnika sifilisa u uzorcima seruma i pune krvi bez upotrebe posebne laboratorijske opreme i koristi se u pružanju primarne zdravstvene zaštite, uključujući epidemiološke indikacije.

Ograničenja upotrebe: ne može se koristiti za praćenje efikasnosti terapije, može dati lažno pozitivan rezultat.

PBT (jednostavni brzi testovi uz krevet)

Relativno nedavno, u serodijagnostici sifilisa, počeo se razvijati takozvani jednostavni brzi testovi (SRT), odnosno testovi uz krevet (Point-of-care - POC). Jednostavni brzi testovi uz krevet, odnosno imunohromatografski testovi, omogućavaju brzo određivanje sadržaja antitijela specifičnih za treponeme na uzročnika sifilisa u uzorcima seruma i pune krvi bez upotrebe posebne laboratorijske opreme i mogu se koristiti u primarnoj zdravstvenoj zaštiti, uključujući i za epidemiološke indikacije. Ograničenja upotrebe: ne može se koristiti za praćenje efikasnosti terapije, može dati lažno pozitivan rezultat.

Ovi testovi se zasnivaju na imunohromatografskom određivanju antitela na treponemske antigene Treponema pallidum i izvode se na trakama; može se koristiti kao puna krv i serum (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Format testa omogućava izvođenje istraživanja u nedostatku posebne opreme i bez upotrebe električne energije. Međutim, zbog relativno niske osjetljivosti i specifičnosti, ovi testovi još uvijek nisu široko korišteni u praksi.

Imunoblotiranje (Western Blot)

Posljednjih godina pojavile su se metode istraživanja usmjerene na otkrivanje i analizu sadržaja antitijela na svaki antigen Treponema pallidum odvojeno. Jedna od ovih metoda je imunobloting metoda (ili blotting, imunoblot, Western blot), koja se koristi za određivanje IgG ili IgM antitijela na Treponema pallidum. Metoda imunoblotinga je modifikacija enzimskog imunoeseja - varijante ELISA-e.

Imunobloting je jedan od najčešćih savremenim metodama serodijagnostika sifilisa i aktivno se koristi u inostranstvu. Ime je dobio (“Western blotting”) kao duhovit odgovor na nazive tehnika za određivanje DNK (“Southern blotting”) i RNA (“Northern blotting”).

1. Istorija metode

Imunobloting (Western blot) se koristi za određivanje IgG ili IgM antitela na antigene treponema pallidum (Herremans M. et al., 2007).

2. Klasični imunoblot

Klasični imunoblot(Western Blot analiza) kombinuje enzimski imunotest i upotrebu elektroforetske metode. Proteini antigena uzročnika sifilisa prethodno se odvajaju elektroforezom i prenose na nosač - nitroceluloznu membranu (traku). Ovaj prijenos se zove blotting. Zatim se ovaj nosač sa odvojenim tačkama (blotovima) tretira test serumom i antitelima na IgG ili IgM, obeleženim enzimima ili radioaktivnim supstancama. Metoda uključuje korištenje prirodnih ili rekombinantnih proteina treponema.

Elektroforeza je razdvajanje nabijenih spojeva na osnovu njihove mobilnosti u elektroforetskom polju. Kada se razlika potencijala primjenjuje u mediju, pozitivno nabijeni molekuli se kreću prema negativno nabijenoj elektrodi, a negativno nabijeni molekuli kreću se prema pozitivnoj elektrodi.

Većina globularnih proteina je sastavljena na način da se većina nabijenih grupa, odnosno hidrofilnih, nalazi na površini proteina, dok su nenabijeni, hidrofobni ostaci ugrađeni u unutrašnjost globule. U električnom polju, proteini migriraju prema svom naboju prema suprotno nabijenoj elektrodi.

Elektroforetsko odvajanje proteina vrši se u sintetičkom gel mediju na bazi poliakrilamida. Za razdvajanje proteina prema njihovoj molekularnoj težini, mješavina proteina se prethodno inkubira u prisustvu natrijum dodecil sulfata (SDS) prije elektroforeze.

Detaljna istraživanja stranih naučnika Webera i Osborna (1969) pokazala su da je nakon takvog tretmana jedini faktor koji može utjecati na pokretljivost proteina u poliakrilamidnom gelu (PAGE) veličina proteina, odnosno njegova molekularna težina. To je omogućilo korištenje metode PAGE elektroforeze u prisustvu SDS-a za prilično precizno određivanje molekulske težine proteina i peptida. U stranoj literaturi ova metoda je nazvana SDS-PAGE (elektroforeza natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela).

Profil reaktivnosti u klasičnom WB testu sa prirodnim antigenima (metoda elektroforeze natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gel). (1) - kontrolni pozitivan rezultat, (2) - kontrolni negativan rezultat, (3-6) - klinički uzorci.

U testovima na sifilis ovom metodom, prethodno pročišćeni i uništeni do sastavne komponente Treponema pallidum se podvrgava elektroforezi u poliakrilamidnom ili agaroznom gelu. U ovom slučaju, antigeni uključeni u njegov sastav su razdvojeni po molekularnoj težini.

Zatim se pomoću vertikalne elektroforeze antigeni prenose na traku nitroceluloze, koja sada sadrži spektar antigenskih traka nevidljivih oku, karakterističnih za Treponema pallidum.

Prilikom izvođenja analize, testni materijal (serum, krvna plazma pacijenta, itd.) se nanosi na nitroceluloznu traku (traku). Ako u uzorku postoje specifična antitijela, onda se tokom procesa inkubacije snažno vezuju za striktno odgovarajuće (komplementarne) antigene trake i formiraju kompleks “antigen-antitijelo”.

Nakon uklanjanja nevezanih imunoglobulina tokom pranja trake, slijedi inkubacija s konjugatom - enzimom označenim antitijelima na humane imunoglobuline (antitijela na humani IgG ili IgM), pri čemu se enzimom označena antitijela vezuju za postojeće komplekse antigen-antitijelo na površini membranu.

Nakon uklanjanja nevezanog konjugata tokom inkubacije sa rastvorom supstrata, enzim stupa u interakciju sa supstratom, što dovodi do razvoja reakcije u boji – bojenja područja membrane (u obliku pruga) na kojima se nalaze pojedinačni antigeni treponema pallidum, antitela na koje se bili u test serumu. Intenzitet bojenja zavisi od količine vezanih antitela iz seruma. Rezultat reakcije se procjenjuje vizualno.

Prisustvo traka u određenim područjima nitrocelulozne ploče potvrđuje prisustvo u ispitivanom serumu antitela na strogo definisane antigene Treponema pallidum.

Imunodeterminante 15, 5, 17, 44,5, 47 kD određene ovom metodom imaju dijagnostički značaj za sifilis. Ig G imunobloting je sličan po senzitivnosti i specifičnosti RIF sa apsorpcijom (RIF abs). Ig M imunobloting može poslužiti kao dijagnostički test za kongenitalni sifilis.

3. Imunoblot u formatu linearnog imunoeseja

Linearno imunološka analiza(linijski imunoesej, LIA) omogućava istovremeno određivanje antitela na antigene Treponema pallidum u ljudskom serumu ili plazmi. Antigeni se prethodno nanose na test trake, koje se isporučuju kao dio komercijalnih dijagnostičkih kompleta.

Trake se izrađuju od nitrocelulozne membrane, poliamida sa plastičnom podlogom ili najlonske membrane sa plastičnom podlogom. Tokom proizvodnje, nekoliko diskretnih antigena se stavlja na test traku u obliku zasebnih antigenskih linija. Pored ovih antigena sifilisa, na svaku traku se nanose još četiri kontrolne linije: streptavidin i kontrolni uzorci (3 +, 1 + i ± linija preseka).

Trake koriste umjetne antigene dobivene metodama genetskog inženjeringa - rekombinantne proteine ​​ili sintetičke polipeptidne konstrukte. Radi se o analozima površinskih antigena Treponema pallidum - TpN15, TpN17, TpN47 i TmpA sa molekularnom težinom od 15, 17, 47 kDa i 44,5 (TmpA), gdje je kDa = kiloDaltona. Uz njihovu pomoć određuju se serumska antitijela na različite imunodominantne komponente patogena.

Inkubacija test uzorak prelazi u kivetu, gde se takođe postavlja indikatorska traka. Antitijela na T. pallidum se određuju vezivanjem za antigene nanesene na test trake. Ako su u uzorku prisutna antitijela specifična za T. pallidum, ona formiraju veze s različitim antigenskim linijama. Kada antitela sadržana u test serumu stupe u interakciju sa diskretnim antigenima T. pallidum postavljenim na test traku, formira se kompleks antigen-antitelo u obliku vizuelno uočljivih traka u boji.

Kada se uzmu u obzir rezultati imunoblotinga, reaktivnost seruma na svaki od antigena procjenjuje se posebno. Ukupan pozitivan odgovor se dobija kada se rezultat dobije istovremeno sa dva ili tri prikazana antigena.

Postupci istraživanja se sprovode ručno ili na posebnom analizatoru, uz interpretaciju rezultata pomoću specijalizovanih kompjuterski program za zarazne bolesti.

Zbog visokog stepena prečišćavanja rekombinantnih antigena i istovremenog otkrivanja antitela na najimunogenije determinante uzročnika sifilisa, metoda ima visoku osetljivost i specifičnost.

4. Računovodstvo rezultata

Za očitavanje intenziteta bojenja antigenskih traka na trakama razvijeni su fotometri čiji se rad zasniva na refleksiji signala, što eliminiše subjektivnu procjenu i pruža potencijal za automatizaciju.

5. U kojim periodima bolesti je bolje koristiti

Testovi koji koriste imunobloting mogu otkriti specifična antitijela na antigene Treponema pallidum u vrlo ranoj fazi bolesti. Najznačajnija antitela u dijagnozi sifilisa su antitela na antigene Treponema pallidum TpN15, TpN17, TmpA i TpN47. Ovi antigeni su membranski proteini sa molekularnom težinom od 15, 17, 44,5 i 47 kDa, respektivno.

Kada se Treponema pallidum unese u ljudski organizam, antisifilitička antitijela se pojavljuju ovim redom: prvo se razvija imuni odgovor na antigene TpN17, zatim na TpN47, nakon TpN15 i kasnije na sve TmpA. Uzimajući u obzir rezultate testa, serumska reaktivnost na svaki od njih se procjenjuje posebno. Na primjer, kada linearna mrlja pokazuje reaktivnost samo na antigenske linije TpN17 i TpN47, to znači da je bolest u ranoj fazi. Što više antigenskih linija postaje reaktivno, infekcija dalje napreduje. Kod liječenja sifilisa, obrazac reaktivnosti u ovom testu se mijenja.

Određivanje IgM na proteine ​​molekulske težine 15,17, 41, 47 kDa omogućava identifikaciju 29,2% pacijenata sa sekundarnim sifilisom, 12,5% sa ranim latentnim sifilisom i 8,0% sa serorezistentnošću. Potragu za IgG na iste molekule karakteriše senzitivnost od 61,6% za serorezistencija i 100% za sekundarni i rani latentni sifilis.

6. Osjetljivost i specifičnost

Prema literaturi, osjetljivost i specifičnost testa su vrlo visoke - 99,6-100 i 99,3-99,5%, respektivno. U klasičnoj metodi to se postiže elektroforetskim odvajanjem proteina, gliko- i lipoproteina i maksimalnom specifičnošću detekcije imunoloških seruma odn. monoklonska antitela. U optimalnim uslovima, imunoblotiranje može otkriti antigen u količinama manjim od 1 ng u zapremini testa.

Osetljivost linearnog mrlja je takođe 99,6%, a specifičnost se kreće između 99,3% i 99,5%.

Prema mišljenju stručnjaka, imunobloting sa rekombinantnim visoko specifičnim antigenima sličan je po osjetljivosti i specifičnosti RIF-abs.

Prema podacima iz inostrane literature i rezultatima studije na TsNIKVI, metoda imunoblotinga ima visoku osjetljivost (98,8-100%) i specifičnost (97,1-100%) za dijagnosticiranje sifilisa.

7. Obim primjene metode

Imunoblot (imunoblot) je vrlo specifična i visoko osjetljiva referentna metoda. Visoka osjetljivost i specifičnost omogućavaju da se ova metoda smatra potvrdnim testom za sifilis. Metoda se može koristiti za potvrdu dijagnoze, kao i u slučajevima kada drugi treponemski testovi daju upitne i kontradiktorne rezultate. Koristeći imunobloting, možete potvrditi dijagnozu kod pacijenata s pozitivnim ili neodredenim rezultatima testova, uključujući one dobivene pomoću RPGA ili ELISA.

8. Izvori i uzroci grešaka u proizvodnji, lažno pozitivni i lažno negativni rezultati

Lažno pozitivni rezultati su vrlo rijetki. Lažno negativni rezultati su također prilično rijetki i primjećuju se kod pacijenata sa imunodeficijencijama - češće kod osoba zaraženih HIV-om i s efektom dijagnostičkog "prozora" zbog kašnjenja u sintezi antitijela, kao i u slučaju grešaka. u fazi dijagnoze.

Upotreba savremenih test sistema nalaže striktno poštovanje svih zahteva kako za materijal tako i za izvođenje reakcije. U osnovi, izvor grešaka je kršenje redoslijeda i tehnologije studije (posebno za klasični Western blot), te nepoštivanje preporuka proizvođača test kitova. . Greške se takođe mogu pojaviti tokom prikupljanja, isporuke, skladištenja uzoraka seruma i tokom testiranja. Osim pokvarenih uzoraka, drugi mogući razlozi uključuju korištenje testnih kompleta s isteklim rokom trajanja, kao i greške u analizi rezultata studije.

9. Karakteristike, prednosti i nedostaci

Jedinstvenost imunoblota leži u visokom sadržaju informacija i pouzdanosti rezultata.

Test ne zahtijeva visoko pročišćene antigene, referentne ili kontrolne serume. Identifikacija cilja antitijela zasniva se na molekularnoj težini proteina s kojim reaguju antitijela iz seruma pacijenta. U jednoj reakciji može se otkriti vezanje antitijela za više antigena, od kojih se svaki može precizno okarakterizirati. Zbog toga imunoblotiranje ima niz prednosti u odnosu na druge metode detekcije antitela, čiji rezultati zavise od standardizacije, osetljivosti, kvaliteta supstrata, nestabilnosti ili netopivosti određenih antigena.

Metoda je lako ponovljiva, relativno jednostavna za izvođenje i interpretaciju rezultata, omogućava određivanje spektra antitela na nekoliko antigena T. pallidum odjednom i procenu doprinosa antitela različitih specifičnosti ukupnom odgovoru.

Upotreba visoko pročišćenih rekombinantnih i peptidnih antigena minimizira nespecifičnu reaktivnost seruma. Korištenjem metode moguće je izbjeći radno intenzivne i subjektivne metode koje predstavljaju opasnost za istraživača (inokulacija sojeva G. pallidum, rad sa patogenom T. pallidum pri postavljanju reakcije). Ovo određuje prednost metode imunoblotinga u odnosu na druge treponemske testove (RIF i posebno RIBT) za dijagnosticiranje sifilisa.

10. Modifikacije metode

Postoji nekoliko komercijalnih test sistema zasnovanih na ovoj metodi. Neki od njih su napravljeni u formatu Western blot, sastoje se od traka na koje se prenose proteinske komponente T. pallidum, prethodno razdvojene elektroforezom u poliakrilamidnom gelu.

Drugi su u formatu linear blot, sastoje se od traka na kojima se sorbiraju rekombinantni i sintetički polipeptidi u obliku diskretnih linija - analoga površinskih antigena T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 i TmpA.

Rezultate Western blota je teže protumačiti jer trake otkrivaju širok spektar antitijela, od kojih su mnoga specifična za grupu. Nasuprot tome, interpretacija rezultata mrljanja linija je jednostavna; Dodatno, dodatne kontrolne linije nanesene na traku omogućavaju semi-kvantitativnu procjenu nivoa antitela na četiri antigena T. pallidum.

xMAP tehnologija

xMAP - moderna tehnologija, omogućavajući multiparametarske studije simultanom detekcijom više analita u jednom biološkom uzorku. Kao čvrsta faza koriste se obojene mikrosfere obložene reagensima za hvatanje (oligonukleotidi, antitela, antigeni).

Ispitni uzorak se dodaje u rastvor koji sadrži mikrosfere. Analiti detektovani u uzorku se vezuju za odgovarajuću mikrosferu, nakon čega se u rastvor dodaje detekciono sredstvo (antitela za detekciju, fluorescentna oznaka). Za detekciju analita koji se određuje koristi se sistem od dva lasera koji omogućava i kvalitativnu procenu prisustva analita u uzorku (za to se koristi crveni laser, klasifikujući mikrosfere po boji), i kvantitativnu procjena sadržaja analita u uzorku (za to se koristi zeleni laser).

Serološki testovi krvi su izuzetno važni. Trenutno se koristi kompleks seroloških reakcija - obično se koriste klasična Wassermanova reakcija i dvije sedimentne reakcije. Od reakcija sedimenta najčešće se koriste Kahn, Sachs-Vitebsky i citoholne reakcije.

Rezultati seroloških studija su označeni plusevima kako slijedi: + + + + jako pozitivni, + + + pozitivni, + + i + slabo pozitivni; negativna reakcija je označena minusom (-).

Pored indiciranog kompleksa seroloških reakcija, posljednjih godina je široko priznat imobilizacijski test Treponema pallidum (Nelson-Mayerov test), koji se provodi sa specifičnim antigenom (suspenzija Treponema pallidum). Ova reakcija je specifičnija od pomenutog kompleksa reakcija koje se provode sa nespecifičnim antigenima. Nelson-Mayerov test je od posebne vrijednosti u određivanju specifičnosti pozitivne Wassermanove reakcije i reakcija sedimenta kod osoba koje nemaju simptome sifilisa.

Serološke reakcije u različitim periodima sifilisa. Dijagnostička vrijednost seroloških reakcija u različitim periodima sifilisa nije ista. U primarnom periodu - u roku od 2-3 sedmice nakon pojave primarnog sifiloma - serološke reakcije su obično negativne; počevši od 3-4 sedmice postaju pozitivni kod nekih pacijenata. Kako se bolest približava sekundarnom periodu, postotak pozitivnih seroloških reakcija raste, a do pojave sekundarnih simptoma sifilisa oni postaju pozitivni kod gotovo 100% pacijenata.

U svježim sekundarnim i rekurentnim periodima bolesti, serološke reakcije u krvi ostaju pozitivne u gotovo 100% bolesnika.

U tercijarnom periodu sifilisa sa aktivnim manifestacijama bolesti, serološke reakcije često mogu biti negativne, kod približno 15% pacijenata, a u nedostatku aktivnih manifestacija bolesti, broj negativne reakcije može dostići 30-40%.

Serološke reakcije kao kriterij uspješnog liječenja sifilisa. Specifično liječenje sifilisa mora se provoditi pod kontrolom seroloških reakcija. Obično kod pacijenata sa primarnom seropozitivnom i sekundarnom svježom menstruacijom, serološke reakcije postaju negativne nakon 1-2 mjeseca racionalnog liječenja sifilisa; u sekundarnom periodu recidiva mogu postati negativni istovremeno ili nešto kasnije. Ako serološke reakcije ne postanu negativne u navedenom vremenskom okviru, to ukazuje na nedovoljnu efikasnost liječenja. U takvim slučajevima potrebno je povećati efikasnost terapije, ali ne povećanjem doze lijekova, već promjenom metode liječenja i dodavanjem metoda nespecifične terapije.

Jako pozitivne serološke reakcije u odsustvu kliničkih simptoma mogu se smatrati simptomom sifilisa, pod uslovom da ostanu jako pozitivne nakon ponovljenog testiranja i da je studija provedena u kvalificiranom serološkom laboratoriju.

Slabo pozitivne serološke reakcije u odsustvu kliničkih simptoma i drugih podataka ne mogu poslužiti kao potpora za dijagnozu sifilisa; takve rezultate treba uzeti u obzir samo u slučajevima kada je pacijent u prošlosti imao sifilis i tretiran na odgovarajući način. Slabo pozitivne serološke reakcije također mogu biti važne ako pacijent ima bolest nepoznate etiologije. U tim slučajevima, rezultati seroloških reakcija moraju se procijeniti uzimajući u obzir druge anamnestičke, kliničke i laboratorijske podatke.

Nespecifične serološke reakcije može se uočiti kod mnogih bolesti. Stoga se kod gube i povratne groznice često javlja oštro pozitivan rezultat. Kod malarije, tuberkuloze, bruceloze i mnogih drugih zaraznih bolesti, kao i kod pacijenata sa malignim tumorima, rezultati su obično slabo pozitivni ili pozitivni (+ + +), a rijetko jako pozitivni (+ + + +).

Konzumiranje alkoholnih pića ili masne hrane prije testa može uzrokovati nespecifičnu, slabo pozitivnu reakciju. Krv za serološke studije treba uzeti na prazan želudac.

U nedostatku serološke laboratorije, preporučuje se slanje krvi na testiranje poštom u koverti u obliku „suhe kapi“.

Da bi se dobila suha kap, 5 ml krvi iz kubitalne vene se uvuče u epruvetu. Epruveta sa krvlju ostavi se 2 sata na sobnoj temperaturi. Nastali krvni ugrušak odvaja se od zidova epruvete kalciniranom i ohlađenom žicom, a zatim se krv stavlja na hladno mjesto do sljedećeg jutra. Sljedećeg dana graduiranom pipetom izvucite 0,75 ml seruma koji se nanosi na voštani papir ili traku celofana. Serum na papiru ili celofanu ostavlja se do sljedećeg dana na sobnoj temperaturi, štiteći ga od prašine i muva. Nakon toga, voštani papir ili celofan sa osušenim serumom smotaju u obliku farmaceutskog praha, stavljaju u kovertu i uz prateću napomenu šalju poštom u najbliži serološki laboratorij.

Treba napomenuti da je metoda seroloških reakcija korištenjem "osušene kapi" krvi manje pouzdana od uobičajene.

Serološka dijagnoza sifilisa

Dijagnoza sifilisa se zasniva na kliničkim i laboratorijskim podacima. Dijagnoza sifilisa se postavlja tek nakon laboratorijske potvrde, odnosno otkrivanja blijede treponeme u iscjetku šankroida, erozivnih papula kod primarnog i sekundarnog sifilisa i podataka serološkog pregleda. Serološke reakcije su izuzetno vrijedna metoda ne samo za potvrđivanje dijagnoze sifilisa, već i za praćenje dinamike njegovog toka pod utjecajem liječenja i utvrđivanje da li je bolest izliječena.

Standardne komponente kompleksa seroloških reakcija (CSR) za utvrđivanje sifilitičke infekcije trenutno su dopunjene treponemskim reakcijama: RIBT (reakcija imobilizacije treponema pallidum), RIF (reakcija imunofluorescencije). Wassermanova reakcija (RW, PB) zasniva se na fenomenu fiksacije komplementa. Za njegovu proizvodnju koristi se kardiolipin antigen, koji je kolesterolizirani alkoholni ekstrakt iz srčanih mišića goveda i ima slična antigena svojstva kao Treponema pallidum.

Wassermanova reakcija. Komplement je vezan kompleksom (lipoidni antigen i reagin test seruma). Za ukazivanje na formirani kompleks koristi se hemolitički sistem (crvena krvna zrnca ovaca i hemolitički serum).

Osim reakcije fiksacije komplementa s kardiolipinom i treponemskim antigenima, KSR grupa uključuje i reakciju na staklu (ekspres metoda). Ozbiljnost hemolize tokom RV označena je plusevima:

oštro pozitivno - 4 +; pozitivno - 3+; slabo pozitivan - 2 + ili 1 +; negativan - -.

Formulacija reakcije je takođe važna kvantitativna metoda, tj. sa različitim razblaženjima seruma (1:10; 1:20, itd. do 1:320). Veliki broj standardnih seroloških reakcija objašnjava se antigenskom mozaičnom prirodom Treponema pallidum, zbog čega se u krvi pojavljuje odgovarajuća množina antitijela (fiksirajući komplement, aglutinini, precipitini, imobilini, antitijela koja izazivaju imunološku fluorescenciju itd.) serum pacijenata. U svakom stadiju sifilisa mogu prevladavati određena antitijela i stoga reakcije s nekim antigenima mogu već biti pozitivne, dok kod drugih mogu biti i dalje negativne. Osim toga, relativna specifičnost standardnih seroloških testova čini neophodnim izbjegavanje dijagnostičke greške koristite ne jednu od njih, već kompleks reakcija. CSR postaju pozitivni krajem 3. ili tokom 4. sedmice nakon pojave šankra. Ove reakcije su oštro pozitivne iu značajnom razblaženju seruma kod skoro svih pacijenata sa sekundarno svježim (98-99%), sekundarno rekurentnim (100%), tercijarno aktivnim (70-80%) i tercijarno latentnim (50-60%). sifilis. Međutim, CSR nije striktno specifičan skup reakcija na sifilis. Mogu biti pozitivni kod pacijenata sa leprom, tuberkulozom, brucelozom, malarijom, eritematoznim lupusom, kao i u slučajevima upale pluća, bolesti jetre, raka, nakon konzumiranja alkohola, masne hrane, tokom trudnoće, posebno u drugoj polovini, kao i tokom prve 2 sedmice nakon porođaja. S godinama se povećava broj nespecifičnih lažno pozitivnih DCS rezultata.

Za potkrijepljenu dijagnozu sifilisa, uz podatke o CSR-u, uzimaju se u obzir klinički podaci, rezultati studije za Treponema pallidum u manifestnim manifestacijama primarnog i sekundarnog sifilisa, podaci iz drugih seroloških reakcija - RIBT i RIF.

RIBT zasniva se na fenomenu imobilizacije Treponema pallidum antitijelima kao što su imobilizini prisutni u krvnom serumu pacijenata sa sifilisom. Kao antigen za RIBT koristi se suspenzija blijede treponema dobivena iz tkiva sifilitičnog orhitisa zeca. Treponema pallidums, nakon što im se doda pacijentov krvni serum, prestaje da se kreće, odnosno postaje imobiliziran. Rezultati reakcije se ocjenjuju u procentima: pozitivan RIBT se navodi kada je imobilizacija od 51 do 100% Treponema pallidum, slabo pozitivan - od 31 do 50%, sumnjiv - od 21 do 30% i negativan - od 0 do 20% . Reakcija se odvija u uslovima anaerobioze. Imobilizini se pojavljuju u krvnom serumu pacijenata kasnije od drugih antitijela, tako da RIBT postaje pozitivan kasnije od CSR i RIF. RIBT je najspecifičnija od postojećih reakcija na sifilis. Njegova glavna svrha je prepoznavanje lažno pozitivnih rezultata prilikom obavljanja CSR-a. Ovo je posebno važno za pacijente kod kojih se sifilis javlja latentno bez vanjskih manifestacija, ali sa oštećenjem unutrašnjih organa ili nervnog sistema. RIBT je od posebnog značaja u prepoznavanju lažno pozitivnih rezultata CSR-a kod trudnica. Treba imati na umu da su nespecifični pozitivni rezultati RIBT mogući i kod pacijenata sa sarkoidozom, eritematoznim lupusom, tuberkulozom, cirozom jetre itd. Međutim, kod ovih bolesti RIBT je slabo pozitivan (od 30 do 50%) i nikada ne dostiže 100%). Kada se liječi antibioticima, rezultati RIBT-a postaju negativni. Stoga se studije primjenom RIBT-a provode tek nakon 7 dana, ako su davani antibiotici rastvorljivi u vodi, i 25 dana nakon završetka liječenja trajnim antibioticima.

REEF- osjetljivija reakcija, pa je pozitivna već u primarnom seronegativnom periodu sifilisa kod 80% pacijenata. Što se tiče specifičnosti, RIF je inferiorniji od RIBT-a, što mu ne dozvoljava da zamijeni RIBT, iako je njegova tehnika mnogo jednostavnija. Reakcija se izvodi u nekoliko modifikacija: RIF-10, RIF-200 i RIF-abs. (apsorbovano). RIF-10 je osjetljiviji, dok RIF-200 i RIF-abs. konkretnije. Princip reakcije je da se specifični antigen (treponema pallidum) kombinuje sa krvnim serumom pacijenta (antitijela) i anti-species fluorescentnim serumom (zečji serum protiv ljudskih globulina u kombinaciji s fluoresceinom, tvari koja svijetli pod ultraljubičastim svjetlom). Uz pozitivnu reakciju, žuto-zeleni sjaj blijede treponeme može se vidjeti u fluorescentnom mikroskopu, jer su okruženi fluorescentnim antitijelima koja se drže za njih. Stepen luminiscencije se ocjenjuje plusevima, kao kod CSR-a. Pozitivna reakcija Navedene su 4 +, 3 + i 2. +. Ako je stepen luminescencije 1 + i nema luminescencije, reakcija se smatra negativnom. Kod sekundarnog sifilisa, RIF je pozitivan u skoro 100% slučajeva. Uvijek je pozitivan kod latentnog sifilisa (99-100%), a kod tercijarnih oblika i kongenitalnog sifilisa pozitivan je u 95-100%.

Ekspresna metoda (mikroreakcija na staklu). U ovoj reakciji, kao iu CSR-u, koristi se kardiolipin antigen, čija se jedna kap pomiješa sa 2-3 kapi krvnog seruma osobe koja se ispituje u jažice posebne staklene ploče. Reakcija se odvija po mehanizmu precipitacije. Ukupno trajanje reakcije je 10-40 minuta. Rezultat se procjenjuje količinom padavina i veličinom pahuljica; ozbiljnost reakcije je naznačena plusovima: 4 +, 3 +, itd., poput DAC-a. Mikroreakcija na staklu je manje specifična za pacijente sa sifilisom od RV, ali je nešto bolja po osjetljivosti. Lažno pozitivni rezultati se češće dobijaju ekspresnom metodom nego RT metodom. Stoga je ova metoda odobrena za upotrebu samo kao selekcijska reakcija prilikom masovnih pregleda stanovništva, kliničkog pregleda i pregleda pacijenata u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama somatskih bolnica. Konačna dijagnoza sifilisa na osnovu ove metode je zabranjena. Samo ekspresna metoda se ne može koristiti pri pregledu donora, trudnica, niti za praćenje nakon liječenja bolesnika sa sifilisom.

Za dijagnosticiranje sifilisa možete koristiti druge metode: enzimski imunosorbentni test (ELISA) s reakcijom mikroprecipitacije (RPM) ili reakcijom pasivne hemaglutinacije (RPHA) s RMP (uključujući strane analoge RMP - RPR ili VDRL).

Prilikom provođenja kliničke i serološke kontrole nakon specifičan tretman(da bi se utvrdila efikasnost terapije), dozvoljena je kvantitativna studija raka mokraćne bešike (proučavanje titra odgovora tokom vremena).

enzimski imunosorbentni test (ELISA,Elisa). Princip reakcije je da se kombinuje sifilitički antigen, sorbiran na površini nosača čvrste faze, sa antigenom seruma krvi u testu i identifikuje specifični kompleks antigen-antitelo korišćenjem anti-specijskog imuno seruma obeleženog enzimom. Osetljivost i specifičnost ELISA testa su slične RIF-u.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Makromodifikacija ove reakcije naziva se TRHA, mikromodifikacija se zove MNA-TR, a automatizirana verzija se zove AMNA-TR.

IgM serologija. Poslednjih decenija, dinamika stvaranja antitela u telu pacijenata sa sifilisom pre, za vreme i posle lečenja je široko proučavana. To je zbog činjenice da kod pacijenata koji su u potpunosti liječeni od sifilisa, pozitivni rezultati specifičnih seroloških reakcija na sifilis ostaju dugo vremena, što otežava odluku o izlječenju pacijenata, kao i dijagnozu ranog kongenitalnog sifilisa. . Diferencijalna dijagnoza relapsa bolesti i reinfekcije je također teška. Prilikom proučavanja stvaranja antitijela u tijelu pacijenata sa sifilisom, ustanovljeno je da se prvi nakon infekcije stvaraju specifični IgM, koji se otkrivaju već u drugoj nedjelji nakon infekcije i dostižu maksimalnu koncentraciju u krvi u 6-9 sedmici. . Nakon 6 mjeseci nakon završetka terapije kod većine pacijenata se ne otkrivaju u krvi. U četvrtoj sedmici nakon infekcije tijelo počinje proizvoditi specifične IgG. Ova vrsta imunoglobulina se u najvećoj količini otkriva 1-2 godine nakon infekcije. Treba napomenuti da specifični IgM prestaje da se proizvodi kada antigen nestane iz organizma, a lučenje IgG nastavljaju klonovi memorijskih ćelija. Osim toga, veliki IgM molekuli ne prolaze kroz placentu od majke do fetusa, pa se njihovo prisustvo kod djeteta koristi za utvrđivanje da li je dijete zaraženo Treponema pallidum. Zbog činjenice da se koncentracija specifičnih IgM u krvi prirodno smanjuje s vremenom, povećanje titra ovih antitijela može poslužiti kao pomoćni znak prisustva relapsa bolesti ili reinfekcije.

Serološka dijagnoza sifilisa

Dijagnoza sifilisa se zasniva na kliničkim i laboratorijskim podacima. Dijagnoza sifilisa se postavlja tek nakon laboratorijske potvrde, odnosno otkrivanja blijede treponeme u iscjetku šankroida, erozivnih papula kod primarnog i sekundarnog sifilisa i podataka serološkog pregleda. Serološke reakcije su izuzetno vrijedna metoda ne samo za potvrđivanje dijagnoze sifilisa, već i za praćenje dinamike njegovog toka pod utjecajem liječenja i utvrđivanje da li je bolest izliječena.

Standardne komponente kompleksa seroloških reakcija (CSR) za utvrđivanje sifilitičke infekcije trenutno su dopunjene treponemskim reakcijama: RIBT (reakcija imobilizacije treponema pallidum), RIF (reakcija imunofluorescencije). Wassermanova reakcija (RW, PB) zasniva se na fenomenu fiksacije komplementa. Za njegovu proizvodnju koristi se kardiolipin antigen, koji je kolesterolizirani alkoholni ekstrakt iz srčanih mišića goveda i ima slična antigena svojstva kao Treponema pallidum.

Wassermanova reakcija. Komplement je vezan kompleksom (lipoidni antigen i reagin test seruma). Za ukazivanje na formirani kompleks koristi se hemolitički sistem (crvena krvna zrnca ovaca i hemolitički serum).

Osim reakcije fiksacije komplementa s kardiolipinom i treponemskim antigenima, KSR grupa uključuje i reakciju na staklu (ekspres metoda). Ozbiljnost hemolize tokom RV označena je plusevima:

oštro pozitivno - 4 +; pozitivno - 3+; slabo pozitivan - 2 + ili 1 +; negativan - -.

Takođe je važno inscenirati reakciju kvantitativnom metodom, odnosno različitim razblaženjima seruma (1:10; 1:20 itd. do 1:320). Veliki broj standardnih seroloških reakcija objašnjava se antigenskom mozaičnom prirodom Treponema pallidum, zbog čega se u krvi pojavljuje odgovarajuća množina antitijela (fiksirajući komplement, aglutinini, precipitini, imobilini, antitijela koja izazivaju imunološku fluorescenciju itd.) serum pacijenata. U svakom stadiju sifilisa mogu prevladavati određena antitijela i stoga reakcije s nekim antigenima mogu već biti pozitivne, dok kod drugih mogu biti i dalje negativne. Osim toga, relativna specifičnost standardnih seroloških reakcija zahtijeva korištenje ne jedne od njih, već kompleksa reakcija, kako bi se izbjegle dijagnostičke pogreške. CSR postaju pozitivni krajem 3. ili tokom 4. sedmice nakon pojave šankra. Ove reakcije su oštro pozitivne iu značajnom razblaženju seruma kod skoro svih pacijenata sa sekundarno svježim (98-99%), sekundarno rekurentnim (100%), tercijarno aktivnim (70-80%) i tercijarno latentnim (50-60%). sifilis. Međutim, CSR nije striktno specifičan skup reakcija na sifilis. Mogu biti pozitivni kod pacijenata sa leprom, tuberkulozom, brucelozom, malarijom, eritematoznim lupusom, kao i u slučajevima upale pluća, bolesti jetre, raka, nakon konzumiranja alkohola, masne hrane, tokom trudnoće, posebno u drugoj polovini, kao i tokom prve 2 sedmice nakon porođaja. S godinama se povećava broj nespecifičnih lažno pozitivnih DCS rezultata.

Za potkrijepljenu dijagnozu sifilisa, uz podatke o CSR-u, uzimaju se u obzir klinički podaci, rezultati studije za Treponema pallidum u manifestnim manifestacijama primarnog i sekundarnog sifilisa, podaci iz drugih seroloških reakcija - RIBT i RIF.

RIBT zasniva se na fenomenu imobilizacije Treponema pallidum antitijelima kao što su imobilizini prisutni u krvnom serumu pacijenata sa sifilisom. Kao antigen za RIBT koristi se suspenzija blijede treponema dobivena iz tkiva sifilitičnog orhitisa zeca. Treponema pallidums, nakon što im se doda pacijentov krvni serum, prestaje da se kreće, odnosno postaje imobiliziran. Rezultati reakcije se ocjenjuju u procentima: pozitivan RIBT se navodi kada je imobilizacija od 51 do 100% Treponema pallidum, slabo pozitivan - od 31 do 50%, sumnjiv - od 21 do 30% i negativan - od 0 do 20% . Reakcija se odvija u uslovima anaerobioze. Imobilizini se pojavljuju u krvnom serumu pacijenata kasnije od drugih antitijela, tako da RIBT postaje pozitivan kasnije od CSR i RIF. RIBT je najspecifičnija od postojećih reakcija na sifilis. Njegova glavna svrha je prepoznavanje lažno pozitivnih rezultata prilikom obavljanja CSR-a. Ovo je posebno važno za pacijente kod kojih se sifilis javlja latentno bez vanjskih manifestacija, ali sa oštećenjem unutrašnjih organa ili nervnog sistema. RIBT je od posebnog značaja u prepoznavanju lažno pozitivnih rezultata CSR-a kod trudnica. Treba imati na umu da su nespecifični pozitivni rezultati RIBT mogući i kod pacijenata sa sarkoidozom, eritematoznim lupusom, tuberkulozom, cirozom jetre itd. Međutim, kod ovih bolesti RIBT je slabo pozitivan (od 30 do 50%) i nikada ne dostiže 100%). Kada se liječi antibioticima, rezultati RIBT-a postaju negativni. Stoga se studije primjenom RIBT-a provode tek nakon 7 dana, ako su davani antibiotici rastvorljivi u vodi, i 25 dana nakon završetka liječenja trajnim antibioticima.

REEF- osjetljivija reakcija, pa je pozitivna već u primarnom seronegativnom periodu sifilisa kod 80% pacijenata. Što se tiče specifičnosti, RIF je inferiorniji od RIBT-a, što mu ne dozvoljava da zamijeni RIBT, iako je njegova tehnika mnogo jednostavnija. Reakcija se izvodi u nekoliko modifikacija: RIF-10, RIF-200 i RIF-abs. (apsorbovano). RIF-10 je osjetljiviji, dok RIF-200 i RIF-abs. konkretnije. Princip reakcije je da se specifični antigen (treponema pallidum) kombinuje sa krvnim serumom pacijenta (antitijela) i anti-species fluorescentnim serumom (zečji serum protiv ljudskih globulina u kombinaciji s fluoresceinom, tvari koja svijetli pod ultraljubičastim svjetlom). Uz pozitivnu reakciju, žuto-zeleni sjaj blijede treponeme može se vidjeti u fluorescentnom mikroskopu, jer su okruženi fluorescentnim antitijelima koja se drže za njih. Stepen luminiscencije se ocjenjuje plusevima, kao kod CSR-a. Pozitivna reakcija se navodi kao 4 +, 3 + i 2. +. Ako je stepen luminescencije 1 + i nema luminescencije, reakcija se smatra negativnom. Kod sekundarnog sifilisa, RIF je pozitivan u skoro 100% slučajeva. Uvijek je pozitivan kod latentnog sifilisa (99-100%), a kod tercijarnih oblika i kongenitalnog sifilisa pozitivan je u 95-100%.

Ekspresna metoda (mikroreakcija na staklu). U ovoj reakciji, kao iu CSR-u, koristi se kardiolipin antigen, čija se jedna kap pomiješa sa 2-3 kapi krvnog seruma osobe koja se ispituje u jažice posebne staklene ploče. Reakcija se odvija po mehanizmu precipitacije. Ukupno trajanje reakcije je 10-40 minuta. Rezultat se procjenjuje količinom padavina i veličinom pahuljica; ozbiljnost reakcije je naznačena plusovima: 4 +, 3 +, itd., poput DAC-a. Mikroreakcija na staklu je manje specifična za pacijente sa sifilisom od RV, ali je nešto bolja po osjetljivosti. Lažno pozitivni rezultati se češće dobijaju ekspresnom metodom nego RT metodom. Stoga je ova metoda odobrena za upotrebu samo kao selekcijska reakcija prilikom masovnih pregleda stanovništva, kliničkog pregleda i pregleda pacijenata u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama somatskih bolnica. Konačna dijagnoza sifilisa na osnovu ove metode je zabranjena. Samo ekspresna metoda se ne može koristiti pri pregledu donora, trudnica, niti za praćenje nakon liječenja bolesnika sa sifilisom.

Za dijagnosticiranje sifilisa možete koristiti druge metode: enzimski imunosorbentni test (ELISA) s reakcijom mikroprecipitacije (RPM) ili reakcijom pasivne hemaglutinacije (RPHA) s RMP (uključujući strane analoge RMP - RPR ili VDRL).

Prilikom provođenja kliničko-serološkog praćenja nakon specifičnog liječenja (da bi se utvrdila učinkovitost terapije), dopuštena je kvantitativna studija raka mokraćne bešike (proučavanje titra reakcije tokom vremena).

enzimski imunosorbentni test (ELISA,Elisa). Princip reakcije je da se kombinuje sifilitički antigen, sorbiran na površini nosača čvrste faze, sa antigenom seruma krvi u testu i identifikuje specifični kompleks antigen-antitelo korišćenjem anti-specijskog imuno seruma obeleženog enzimom. Osetljivost i specifičnost ELISA testa su slične RIF-u.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Makromodifikacija ove reakcije naziva se TRHA, mikromodifikacija se zove MNA-TR, a automatizirana verzija se zove AMNA-TR.

IgM serologija. Poslednjih decenija, dinamika stvaranja antitela u telu pacijenata sa sifilisom pre, za vreme i posle lečenja je široko proučavana. To je zbog činjenice da kod pacijenata koji su u potpunosti liječeni od sifilisa, pozitivni rezultati specifičnih seroloških reakcija na sifilis ostaju dugo vremena, što otežava odluku o izlječenju pacijenata, kao i dijagnozu ranog kongenitalnog sifilisa. . Diferencijalna dijagnoza relapsa bolesti i reinfekcije je također teška. Prilikom proučavanja stvaranja antitijela u tijelu pacijenata sa sifilisom, ustanovljeno je da se prvi nakon infekcije stvaraju specifični IgM, koji se otkrivaju već u drugoj nedjelji nakon infekcije i dostižu maksimalnu koncentraciju u krvi u 6-9 sedmici. . Nakon 6 mjeseci nakon završetka terapije kod većine pacijenata se ne otkrivaju u krvi. U četvrtoj sedmici nakon infekcije tijelo počinje proizvoditi specifične IgG. Ova vrsta imunoglobulina se u najvećoj količini otkriva 1-2 godine nakon infekcije. Treba napomenuti da specifični IgM prestaje da se proizvodi kada antigen nestane iz organizma, a lučenje IgG nastavljaju klonovi memorijskih ćelija. Osim toga, veliki IgM molekuli ne prolaze kroz placentu od majke do fetusa, pa se njihovo prisustvo kod djeteta koristi za utvrđivanje da li je dijete zaraženo Treponema pallidum. Zbog činjenice da se koncentracija specifičnih IgM u krvi prirodno smanjuje s vremenom, povećanje titra ovih antitijela može poslužiti kao pomoćni znak prisustva relapsa bolesti ili reinfekcije.

Što se ranije i preciznije otkrije sifilis, to više lakši tretman i postoji veća šansa da će za pacijenta proći glatko.

Cilj svih laboratorijskih pretraga je isti: nedvosmisleno i brzo postaviti dijagnozu. Ali nijedan od modernih visokotehnoloških testova na sifilis ne daje rezultat nedvosmisleno i sa 100% preciznošću. Stare metode se usavršavaju, smišljaju se nove, ali i dalje u kliničkoj praksi liječnici uvijek moraju koristiti kombinaciju nekoliko različitih testova na sifilis. Doktori se ne mogu osloniti na rezultat bilo koje stvari.

Postoji toliko mnogo vrsta testova za sifilis da je nemoguće odmah razumjeti sve kratice:

Bolest je prvi put identificirana laboratorijskom reakcijom 1906. godine. To je zasluga njemačkog naučnika Augusta Wassermana, po kojem je reakcija i dobila ime. Od tada je prošlo mnogo vremena, metoda je zastarjela i ne koristi se u praksi, ali dijagnoza sifilisa je još uvijek čvrsto povezana s analizom RV.

Osoba će možda morati da se podvrgne testiranju na sifilis iz raznih razloga.
Prvi razlog koji vam pada na pamet je kada sumnjate na infekciju, a u praksi to nije najčešći. U ovom slučaju, važno je shvatiti da infekcija ima period inkubacije (od trenutka infekcije do formiranja šankroida) i primarni seronegativni period (šankroid u prve tri sedmice) - za to vrijeme testovi će biti negativni . Stoga, ako je zabrinutost ozbiljna, testovi se ponavljaju nakon nekoliko sedmica.

Ljudi koji ne sumnjaju na infekciju češće se moraju testirati na sifilis. To se obično dešava prilikom konkurisanja za posao (analiza je uvrštena u zdravstveni karton) i tokom periodičnih lekarskih pregleda (liječnički pregledi). Takođe je obavezno davanje krvi za sifilis:

• donatori,
• žene u prvim nedeljama trudnoće - dva puta, kada su registrovane u antenatalnoj ambulanti i u porodilištu nekoliko nedelja pre porođaja,
• pacijenti prije operacije ili bilo koje druge medicinske invazivne procedure ( FGDS, bronhoskopija itd.).

Na kraju članka odgovorili smo na najčešća pitanja ljudi koji su suočeni s dijagnozom sifilisa. Nema vremena za čitanje detalja o metodama istraživanja -.

Sve vrste testova na sifilis

Postoje 2 glavne grupe istraživačkih metoda za sifilis: direktne i indirektne.

• Direktna metoda- ovo je studija u kojoj se sama infekcija traži u biomaterijalu - pojedinačni predstavnici patogena u cjelini, ili njihovi dijelovi - DNK.
• Indirektne metode (serološke reakcije) je test kojim pokušavaju otkriti antitijela na uzročnika sifilisa u krvi. Logika je sledeća: ako se pronađe imuni odgovor koji je karakterističan za neku vrstu infekcije, to znači da postoji sama infekcija koja je izazvala ovaj imunološki odgovor.

Direktne metode- najpouzdaniji: ako je bakterija "uhvaćena na licu mjesta", tada se prisustvo bolesti smatra dokazanim. Ali Treponema pallidum je teško uhvatiti, a negativni rezultati testa ne isključuju prisustvo infekcije. Ove studije ima smisla provoditi samo u prisustvu osipa i samo u ranom obliku sifilisa - do dvije godine bolesti. One. Ovim metodama nemoguće je odrediti latentni sifilis ili njegove kasne oblike, stoga se u kliničkoj praksi rijetko koriste i samo za potvrđivanje drugih testova.

Direktne metode uključuju: Mikroskopija tamnog polja, Infekcija laboratorijskih životinja, PCR .

1. mikroskopija tamnog polja ( TPM) - pregled Treponema pallidum pod mikroskopom. Materijal se uzima od šankra ili osipa. Metoda je jeftina i brza, a otkriva sifilis na samom početku primarne menstruacije, kada su nalaz krvi na sifilis još uvijek negativan. Ali bakterije, koje su prisutne u malim količinama u osipu, lako se ne mogu uhvatiti struganjem. Osim toga, Treponema pallidums se lako može pomiješati s drugim stanovnicima usnoj šupljini, analni kanal itd.
2. Inficiranje laboratorijskih životinja je vrlo skupa i mukotrpna metoda, koja se koristi samo u istraživačkoj praksi.
3. PCR- relativno nova metoda koju traže DNK infekcije. Bilo koje tkivo ili tekućina koja može sadržavati treponema pallidum je pogodna za istraživanje: krv, urin, sekret prostate, ejakulat, strugotine s kožnih osipa, iz genitourinarnog trakta, orofarinksa ili konjuktive. Analiza je vrlo osjetljiva i specifična. Ali komplikovano i skupo. Propisuje se u slučaju sumnjivih rezultata drugih testova.

Indirektne metode, poznate i kao serološke reakcije, su osnova za laboratorijsko ispitivanje sifilisa. Upravo se ove metode koriste za masovni skrining populacije, za potvrđivanje dijagnoze i praćenje liječenja. Indirektne metode istraživanja dijele se na netreponemske i treponemske testove.

Netreponemski testovi su znatno jeftiniji. Za njihovo izvođenje ne koriste sam protein antigena, koji je specifičan za sifilitički treponemu, već njegovu zamjenu, kardiolipin antigen. Ovi testovi su visoko osjetljivi, ali slabo specifični. To znači da će takvi testovi identificirati sve koji imaju sifilis, pa čak i više: zdravi ljudi također mogu imati lažno pozitivne rezultate. Koriste se za masovni skrining populacije, ali u slučaju pozitivnog rezultata nužno zahtijevaju potvrdu specifičnijim testovima - treponemskim testovima. Netreponemski testovi su takođe veoma korisni u proceni efikasnosti lečenja: kada efikasan tretman volumen antitijela u krvi se smanjuje, a njihov titar se smanjuje u skladu s tim (o ovim titrima ćemo govoriti detaljnije malo dalje). Najpouzdaniji rezultat ovih netreponemskih testova biće tokom ranog sifilisa, posebno u sekundarnom periodu.

Netreponemski testovi uključuju:

• Wassermanova reakcija( , ona je RV, ili RSK) - već je zastario i nije u upotrebi, ali zbog jake povezanosti s bolešću, ovo je često naziv za svaki test za skrining populacije na sifilis. Ako vidite napomenu „analiza“ u uputu ljekara RV" - nemoj da se stidiš, u laboratoriji će verovatno sve razumeti ispravno i uradiće to RPR.
• Reakcija mikroprecipitacije (GOSPODIN, ona je ista RMP) je jednostavan i jeftin test za otkrivanje sifilisa. Ranije se koristio kao glavni ne-treponemski test, ali je sada ustupio mjesto pogodnijem i objektivnijem RPR-test.
• Brzi plazmareagin test (RPR-test) je brz, jednostavan i zgodan test za masovni skrining populacije i praćenje tretmana. To je glavni netreponemski test koji se koristi u Rusiji i inostranstvu.
• TRUST - ovo je modernija modifikacija RPR-test. Inače se označava kao RPR-test sa toludin crvenim. U Rusiji se koristi samo u malom broju laboratorija.
• VDRL - ova analiza je slična po pouzdanosti rezultata RMP, a takođe je inferioran RPR. Nije našla široku upotrebu u Rusiji.
• USR-test(ili njegova modifikacija - RST-test) - napredniji VDRL test, međutim u Rusiji se također koristi izuzetno rijetko.

Treponemski testovi izvedeno sa antigenima treponeme. Oni su specifičniji i stoga pažljivije izdvajaju zdrave od bolesnih. Ali njihova osjetljivost je niža i takvi testovi mogu promašiti bolesnu osobu, posebno u ranoj fazi bolesti. Još jedna karakteristika je da se treponemski testovi pojavljuju kasnije od netreponemskih testova, samo tri do četiri sedmice nakon pojave šankra. Stoga se ne mogu koristiti kao skrining testovi. Glavna svrha treponemskih testova je potvrditi ili opovrgnuti rezultate netreponemskih testova.

Također, rezultati testova na treponeme ostat će pozitivni nekoliko godina nakon uspješnog liječenja. Zbog toga se ne koriste za praćenje efikasnosti liječenja, a također se ne oslanjaju na rezultate ovih testova osim ako nisu potvrđeni netreponemskim testovima.

Treponemski testovi uključuju:

• RPGA (ili njegova modernija modifikacija - TRPA,TRNA) - reakcija pasivne hemaglutinacije. Glavna treponemska reakcija se sada koristi u inostranstvu i Rusiji. Jednostavan i praktičan test za određivanje antitijela na sifilis u tijelu.
• ELISA (anti-Tr. pallidum IgG/IgM) - enzimski imunotest, poznat i kao ELISA od engleske skraćenice. Ovaj test se može izvesti i sa kardiolipinskim antigenom i antigenom treponeme. Može se koristiti i kao skrining i kao potvrda. Što se tiče pouzdanosti, nije inferioran RPGA i također je preporučeni treponemski test za potvrdu dijagnoze sifilisa.
• Imunobloting- ovo je skuplji napredni ELISA-test. Koristi se samo u sumnjivim slučajevima.
• REEF — reakcija imunofluorescencije. Tehnički teška i skupa analiza. Ona je sekundarna i koristi se za potvrdu dijagnoze u sumnjivim slučajevima.
• RIBT (RIT) - reakcija imobilizacije (imobilizacije) Treponema pallidum. Ova reakcija je složena, dugotrajna i teško interpretirati rezultat. Ponegdje se još uvijek koristi, ali postepeno blijedi u pozadini, ustupajući mjesto RPGA I ELISA.

Tumačenje seroloških testova na sifilis:

Algoritam za dijagnosticiranje sifilisa

Svaka dijagnoza se sastoji od tri glavna stuba medicine: anamneze (istorija bolesti), kliničkih manifestacija (simptoma) i laboratorijskog pregleda. Ako liječnik, na osnovu priče pacijenta i vanjskog pregleda njegovog tijela, posumnja na sifilis, propisuje set testova (ili skup seroloških reakcija - KSR). Mora uključivati ​​1 ne-treponemski test ( RMP ili RPR) i 1 treponemski test ( RPGA ili ELISA). Ako se rezultati ovih testova razlikuju, radi se dodatni alternativni treponemski test ( ELISA ili RPGA). Ovo je najviše jednostavno kolo. U slučaju sumnjivih pokazatelja, ovisno o situaciji, liječnik propisuje druge dijagnostičke metode.

Ekspresni test na sifilis, ili kako odrediti sifilis kod kuće

Postoji test na sifilis koji možete uraditi sami. Može se slobodno kupiti u apoteci, prosječna cijena— 200-300 rub. Princip određivanja bolesti sličan je netreponemskom RPR. Proizvođači tvrde da je tačnost visoka, ali u stvarnosti je niska, ne više od 70%.

Algoritam za provjeru sličan je testu na trudnoću, samo se koristi krv umjesto urina. Na indikator se nanosi kap krvi, a rezultat se pojavljuje u roku od 10-15 minuta. 1 traka - negativan test, 2 trake - pozitivan test.
Ne preporučujemo ovu dijagnostičku metodu. Ako sumnjate u sifilis, bolje je odmah se obratiti liječniku ili barem neovisnoj laboratoriji. Biće malo skuplje i duže, ali mnogo preciznije.

Dešifriranje rezultata za sifilis: plusevi, križevi i krediti.

Dalja taktika doktora zavisi od rezultata određenih testova. Rezultati skrining testova izraženi su ili u križevima (plusima) ili u posebnom unosu:

4 ili 3 križa - pozitivan rezultat; potrebno je dodatno ispitivanje na sifilis drugim dijagnostičkim metodama.
2 ili 1 krstić - sumnjiv rezultat, preporučljivo je ponoviti rezultat nakon 10 dana.
0 križeva - negativan rezultat, sifilis nije otkriven.

U slučaju pozitivne i upitne reakcije, dodatna istraživanja uzeta krv: razrjeđivanjem od 1:2 do 1:1024 i dodavanjem kapi kardiolipin antigena u svaki titar krvi. Rezultat bilježi maksimalni titar pri kojem se reakcija dogodila: što je veće razrjeđenje, to je veće više vrijednosti titar, to je veća količina Treponema pallidum u krvi. Ali glavni zadatak određivanja titra nije izračunavanje stupnja kontaminacije krvi, već praćenje uspjeha liječenja: liječenje se smatra učinkovitim ako titar padne 4 puta u 4 mjeseca. Do kraja liječenja netreponemski testovi bi trebali biti negativni.

Najveća osjetljivost skrining testova uočena je u sekundarnom periodu sifilisa (100%), nešto manja u primarnom (86%) i još manja u tercijarnom (73%).

Važne nijanse u dijagnosticiranju sifilisa:

1. Prilikom provođenja testova mogući su lažno pozitivni rezultati. Posebno su česti tokom projekcija. Ako nikada niste imali sifilis, a testovi su pozitivni, ne biste trebali odmah paničariti, morate napraviti još barem jedan alternativni test.
2. Javljaju se i lažno negativni rezultati. Ako se sumnja na sifilis, bolje je ponoviti test nakon nekoliko sedmica.
3. Izliječeni sifilis ostaje pozitivan na treponemskim testovima nekoliko godina ili života.

Najčešća pitanja o testovima na sifilis

Kako se besplatno testirati na sifilis?

Da biste to učinili, potrebno je otići u ambulantu u mjestu stanovanja i posjetiti svog lokalnog ljekara koji će vam dati uputnicu za testiranje. Testiranje na sifilis je besplatno za sve štićenike RF prema politici Obavezno zdravstveno osiguranje.

Gdje se mogu anonimno testirati na sifilis?

Testovi se mogu obaviti anonimno u bilo kojoj plaćenoj laboratoriji, a kožne i venske ambulante često same nude ovu uslugu. Također je moguće testirati na sifilis kod kuće pomoću brzih testova koji se prodaju u ljekarnama. Međutim, treba imati na umu da takav test ne daje tačan rezultat, a ako sumnjate na sifilis, trebate se posavjetovati s liječnikom.

Koliko dana nakon spolnog odnosa možete dati krv za sifilis?

Za 1-1,5 mjeseci. Ako dođe do infekcije, test na sifilis će biti pozitivan najkasnije sedam do deset dana nakon pojave šankra, odnosno 4-5 sedmica nakon infekcije. Ovaj period može biti duži, pa ako negativni rezultati analizu treba ponoviti nakon 2 sedmice.

Gdje se vadi krv na sifilis?

Krv za sifilis se najčešće uzima iz vene, ali se može uzeti i iz prsta. Zavisi od vrste analize.

Priprema. Kako se testirati na sifilis?

Prije davanja krvi za sifilis, ne biste trebali jesti četiri sata – krv se mora dati na prazan želudac. Osim toga, ne smijete piti alkohol 12 sati prije testa. Ovo je važno jer oštećenje jetre od alkohola može uzrokovati lažno pozitivne testove.

Koliko u prosjeku traje testiranje na sifilis?

Rezultati su obično poznati sljedeći dan. Provođenje brzih testova traje ne više od 30 minuta.

Koji test se radi na sifilis i kako se zove?

I za skrining, kada nema sumnje na bolest RMP(reakcija mikroprecipitacije), ili RPR(brzi plazmareagin test). Ponekad se takvi skrining testovi nazivaju Wassermanova reakcija.

Ako postoje stvarne sumnje ili sumnje, one nikada nisu ograničene na jednu analizu. Istovremeno izvršite jednu od bilo koje grupe skrininga ( RMP ili RPR) i jedna od specifičnijih testnih grupa ( RPGA ili ELISA), zatim postupajte u zavisnosti od rezultata i anamneze pacijenta.

Može li test na sifilis biti pogrešan?

Možda! Verovatnoća greške u različitim metodama zavisi prvenstveno od perioda bolesti i opšteg stanja organizma.

Netreponemski testovi su najosjetljiviji na vrhuncu bolesti – u sekundarnom periodu. Zbog svoje niske specifičnosti često daju lažno pozitivne rezultate. To se može dogoditi zbog groznice, gripe ili druge zarazne bolesti, nedavne vakcinacije, hroničnih bolesti i niza drugih razloga.

Treponemski testovi su osetljiviji u kasnijem periodu. Mogu dati i lažno pozitivne rezultate, ali samo ako u tijelu postoje patogene bakterije slične Treponema pallidum koje uzrokuju druge bolesti: nevenerične treponematoze pinta (rijetka u Rusiji) ili lajmsku bolest (prenose se ubodom krpelja).

Lažno negativni rezultati testova mogući su kod svih dijagnostičkih metoda. Zavise od imunološkog odgovora tijela: nema odgovora - nema reakcije na sifilis. To je moguće kod osoba zaraženih HIV-om, kao i onih koji su imunokompromitovani iz drugih razloga. Osim toga, postoji i obrnuta reakcija: hiperprodukcija antitijela, "prozonski" efekat, u kojem postoji toliko mnogo antitijela da sprječavaju jedno drugo u reakciji s antigenom. Rezultat je lažno negativan rezultat.

Mogu li opći testovi pokazati sifilis?

Sifilis se ne može utvrditi ni općim testom krvi ni biohemijskim testom. Neće to pokazati ni opći test urina ili redovni vaginalni bris. Svi testovi na sifilis su visoko specijalizovani i svaki ima svoje ime. Koristeći bilo koje druge testove, nemoguće je izračunati da li osoba ima sifilis ili ne. Ali šta će drugi testovi pokazati ako osoba ima sifilis? Pogledajmo svaki od njih:

Kompletna krvna slika: pokazuje glavna krvna zrnca - crvena krvna zrnca, bela krvna zrnca, trombociti. Na kraju primarnog i na početku sekundarnog perioda, leukociti kod osobe mogu porasti i također se povećati ESR- indikator upale. Ovo su vrlo nespecifični pokazatelji, koji jednostavno ukazuju na to da se tijelo bori protiv bakterijske infekcije. Inače će krvni test odgovarati općem stanju tijela.

Biohemijski test krvi: pokazuje rad jetre, bubrega, srca, pankreasa i drugih organa. Ako sifilis još nije zahvatio ove organe, a oni rade kako treba, nalaz krvi će biti normalan.

Opšti test urina: pokazuje funkcionisanje bubrega i endokrinog sistema, kao i opšte stanje tijelo. Ako nema akutnih ili hroničnih bolesti ovih sistema, analiza će biti normalna.

Vaginalni bris: utvrđuje da li postoji upalni ili onkološki proces, kao i disbioza. Nemoguće je dijagnosticirati sifilis pomoću takvog razmaza.