Reakcija imunofluorescencije, direktne i indirektne metode. Aplikacija. Kompleksna dijagnostika metodom grebena Šta je greben u medicini

Otkrivena 1942. godine od strane Koonsa, reakcija imunofluorescencije nije nova istraživačka metoda. Međutim, pojava hibridomskih tehnologija, koja je omogućila dobivanje monoklonskih antitijela, dala je "drugi život" ovoj reakciji, jer je njihova upotreba omogućila višestruko povećanje osjetljivosti ove reakcije i njene specifičnosti.

A danas ćemo vam detaljno reći o reakciji direktne i indirektne imunofluorescencije (RIF) kao Koons dijagnostičkoj metodi za odrasle muškarce i žene tijekom trudnoće.

Šta je reakcija imunofluorescencije?

Kao odlična prilika za brzo postavljanje tačne dijagnoze, imunofluorescentna reakcija omogućava utvrđivanje prisutnosti uzročnika bolesti u patološkom materijalu. U tu svrhu koristi se razmaz materijala koji se posebno obrađuje sa FITC (fluorescein isothiocyanate) označenim i proučava se kao heterogena analiza.

Da bi se dobio rezultat, koristi se fluorescentni mikroskop, čiji optički sistem sadrži set svjetlosnih filtera koji lijeku pružaju plavo-ljubičasto ili ultraljubičasto svjetlo određene valne dužine. Ovo stanje dozvoljava fluorohromu da se reflektuje u datom opsegu. Istraživač procjenjuje svojstva sjaja, njegov karakter, veličinu objekata i njihov relativni položaj.

Kome je propisano?

Reakcija imunofluorescencije može se propisati za dijagnozu mnogih virusnih bolesti. Konkretno, propisano je tokom sveobuhvatnog pregleda da se identifikuju sljedeći faktori:

• prisutnost virusa u tijelu;
• infekcija salmonelom;
• postojanje određenih antigena u tijelu;
• identificirana je vjerojatnost infekcije tijela klamidijom, mikoplazmom i drugim mikroorganizmima koji imaju sposobnost izazivanja virusnih bolesti kod ljudi;
• dijagnostika virusnih bolesti kod životinja.

Navedene indikacije omogućuju korištenje imunofluorescentne reakcije za otkrivanje virusnih bolesti različite prirode u ljudskom i životinjskom tijelu.

Ciljevi

S obzirom na to da ova dijagnostička metoda ima brojne prednosti, koje uključuju visoku efikasnost, brzinu implementacije i dobijanja rezultata, kao i odsustvo velikog broja kontraindikacija, koristi se za utvrđivanje prisutnosti virusnih infekcija u organizmu. Stoga se ova analiza može propisati i za utvrđivanje i za pojašnjavanje dijagnoze, na osnovu koje se propisuje režim liječenja.

Postupak ne uzrokuje nelagodu, zahtijeva pribavljanje materijala za analizu, koji se uzima iz bilo koje tjelesne tekućine: pljuvačke, sputuma, strugotina s površine sluznice. Krv se takođe može uzeti za analizu. Učestalost reakcije imunofluorescencije propisuje liječnik, koji treba dobiti podatke o dinamici procesa koji se odvijaju u tijelu.

Budući da ovaj test ne šteti ni tijelu ni općem blagostanju osobe, može se propisati po potrebi.

Vrste takvog postupka

Danas se koristi nekoliko varijanti ove analize, od kojih svaka ima niz specifičnih karakteristika i omogućava vam da dobijete najdetaljniju sliku procesa koji se odvijaju u tijelu.

Vrste imunofluorescentnih reakcija uključuju:

1. - jedna od najbrže razvijajućih vrsta dijagnostike, ova analiza omogućava dobijanje kvantitativnih podataka bez upotrebe serijskih razblaženja. Korišćenjem dobijenih merenja optičke gustine tečnosti moguće je precizno odrediti nivo koncentracije željene komponente. Široke mogućnosti ove vrste analize koriste se pri korištenju monoklonskih antitijela za njegovu provedbu, što omogućava određivanje faze zaraznog procesa i njegove težine;
2. DNK dijagnostika- ova metoda se zasniva na komplementarnom vezivanju nukleotida, za šta se mogu koristiti tečnosti kao što su pljuvačka, krv, likvor, urin, sputum, uzorci biopsije i krv. Ova metoda najefikasnije otkriva prisutnost papiloma virusa u tijelu, međutim, mnogi moderni sistemi testiranja mogu povremeno dati lažno pozitivne i lažno negativne rezultate. Mogu biti uzrokovane kontaminacijom tečnih uzoraka za analizu specifične DNK, čije prisustvo može biti ugniježđene ili totalne prirode;
3. imunohromatografija— specifičnost ove metode za određivanje prisustva patološkog okruženja i virusa u tijelu je korištenje obilježenih antitijela tokom reakcije. Ova dijagnostička metoda se koristi za identifikaciju i stepen aktivnosti infektivnog procesa streptokoka grupe A, kao i klamidije sljedećih tipova: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia iz Oxoida. Posedujući najveću moguću osetljivost, test sistemi koji se zasnivaju na ovoj metodi istraživanja. obično se koriste kao indikativni test.

Navedene sorte imaju karakteristike implementacije i specifične karakteristike rezultata, ali sve one imaju za cilj dobijanje podataka o prisutnosti patoloških mikroorganizama i virusa u organizmu, kao io stepenu njihove reprodukcije i aktivnosti.

Indikacije za upotrebu

Reakcija imunofluorescencije može se propisati za identifikaciju bilo koje vrste patološkog okruženja u tijelu.

Hlamidija, trihomonas, gonokok i, kao i giardije svih vrsta, utvrđuju se prilikom ove vrste dijagnoze. i druge bolesti takođe zahtevaju RIF. Za njegovu provedbu potrebno je zakazivanje ljekara.

Kontraindikacije za

Budući da je za ovu reakciju potrebna bilo koja vrsta tjelesnih tekućina kao test materijala, njihovo uzimanje obično nije teško i nema kontraindikacija za provođenje imunofluorescentne reakcije. Međutim, tokom trudnoće i kod djece mlađe od 6 mjeseci, prikupljanje materijala za istraživanje vrši se uz maksimalne mjere opreza.

Odsustvo kontraindikacija omogućava da se ova vrsta dijagnoze provede kada je liječnik prepiše svim pacijentima. Njegova sigurnost je zagarantovana upotrebom dezinfikovanih instrumenata i špriceva za jednokratnu upotrebu.

Priprema za proceduru

Nema posebnosti u vezi sa prikupljanjem materijala za ovu analizu. Krv se za to uzima na prazan želudac kako u njoj nema povećanog sadržaja tvari koje mogu promijeniti istinita očitanja i dati lažnu sliku.

Kako se polaže test?

Kako za analizu nije potrebna posebna priprema, isključeno je samo jelo 12 sati prije testa i izostanak upotrebe lijekova, testni materijal se uzima kao normalan proces uzimanja tjelesne tečnosti na analizu.

Subjektivni osjećaji tokom postupka mogu varirati ovisno o osjetljivosti.

Dekodiranje rezultata

Upotreba savremenih sistema za testiranje omogućava vam da dobijete najtačnije rezultate analize. Za dešifriranje rezultata koriste se sljedeći podaci:

• stepen intenziteta fluorescencije;
• fluorescentna nijansa;
• periferna priroda procesa luminescencije objekta;
• karakteristike morfologije, lokacija patogena u razmazu test materijala i njegova veličina.

Prilikom proučavanja velikih objekata (na primjer, Gardenerella, Trichomonas, ćelije koje su već zaražene virusima), gore navedeni kriteriji omogućuju dobivanje najpouzdanijih rezultata. Međutim, elementarna tijela mikoplazme i klamidije imaju veličine koje leže na granici mogućnosti rezolucije fluorescentnog mikroskopa, što otežava

To otežava postizanje tačnog rezultata, jer periferni sjaj gubi dio svog intenziteta. Preostali kriterijumi više nisu dovoljni za tačnu identifikaciju mikroorganizama koji se proučavaju. Iz tog razloga se postavljaju posebni zahtjevi za specijaliste koji sprovode ovu vrstu istraživanja: njihov nivo kvalifikacije mora biti dovoljan za rad sa dostupnim podacima.

Iz tog razloga, samo lekar sa odgovarajućim nivoom kvalifikacije može tumačiti dobijenu analizu. U nastavku pročitajte o cijeni istraživanja metodom RIF.

prosječna cijena

Cijena imunofluorescentne reakcije ovisi o lokaciji i nivou zdravstvene ustanove, kao i o kvalifikacijama specijaliste koji obavlja analizu. Danas se cijena kreće od 1.280 do 2.160 rubalja.

Video u nastavku će vam reći više o imunološkim reakcijama:

Trenutno se široko koriste serološke reakcije koje uključuju obilježene antigene ili antigene. To uključuje imunofluorescentne reakcije, radioimune i enzimske imunološke metode.

Primjenjuju se:

1) za serodijagnostiku zaraznih bolesti, odnosno za otkrivanje AT pomoću seta poznatih konjugovanih (hemijski kombinovanih) antigena sa različitim oznakama (enzimi, fluorohromne boje);

2) određivanje mikroorganizma ili njegovog serovara pomoću standardno označenih dijagnostičkih antitijela (brza dijagnostika).

Serumi se pripremaju imunizacijom životinja odgovarajućim antigenima, zatim se izoluju imunoglobulini i konjugiraju sa svjetlećim bojama (fluorohromima), enzimima i radioizotopima.

Označeni SR nisu inferiorni po specifičnosti u odnosu na druge SR, a po svojoj osjetljivosti su superiorniji od svih SR.

Nema sličnih materijala

Kao naljepnice koriste se svijetleće fluorohromne boje (fluorescein izotiocijanat, itd.).

Postoje različite modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti, Koons RIF se koristi za identifikaciju mikroba ili njihovih antigena u test materijalu.

Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: direktna i indirektna.

Direktne RIF komponente:

1) materijal koji se ispituje (stolica iz nazofarinksa i sl.);

2) označeni specifični imuni serum koji sadrži AT-la na željeni antigen;

3) izotonični rastvor natrijum hlorida.

Razmaz sa test materijala tretira se označenim antiserumom.

Dolazi do AG-AT reakcije. Tokom luminiscentnog mikroskopskog pregleda detektuje se fluorescencija u području gdje su AG-AT kompleksi lokalizirani.

Komponente indirektnog RIF-a:

1) gradivo koje se proučava;

2) specifični antiserum;

3) antiglobulinski serum (AT-la protiv imunoglobulina), obeležen fluorihromom;

4) Izotonični rastvor natrijum hlorida.

Bris iz test materijala prvo se tretira imunim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.

Luminescentni AG-AT kompleksi - označeni AT se detektuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.

Prednost indirektne metode je u tome što nema potrebe za pripremanjem širokog spektra fluorescentnih specifičnih seruma, već se koristi samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.

Postoji i 4-komponentni tip indirektnog RIF-a, kada se dodatno uvodi komplement (serum zamorca). U pozitivnoj reakciji nastaje kompleks AG-AT - označenog - AT-komplementa.

RIF se zasniva na kombinaciji antigena bakterija, rikecija i virusa sa specifičnim antitijelima označenim fluorescentnim bojama (fluorescein izotiocijanat, rodamin, B-izoticijanit, lisatin rodamin B-200, sulfohlorid itd.) koji imaju reaktivne grupe (sulforiocianit, sulfoklorid itd.) itd.). Ove grupe se kombinuju sa slobodnim amino grupama molekula antitijela, koje ne gube svoj specifični afinitet za odgovarajući antigen kada se tretiraju fluorohromom. Rezultirajući AG-AT kompleksi postaju jasno vidljive, blistave strukture pod fluorescentnim mikroskopom (slika 7). RIF može otkriti male količine bakterijskih i virusnih antigena. RIF metoda se koristi u dvije verzije: direktna i indirektna metoda.

Direktna metoda se zasniva na direktnoj kombinaciji antigena sa obilježenim antitijelom. Indirektna metoda temelji se na detekciji AG-AT kompleksa korak po korak korištenjem fluorescentnih boja. Prva faza je formiranje imunoloških kompleksa specifičnog antigena sa specifičnim antitijelima. Druga faza je identifikacija ovog kompleksa tretiranjem obilježenim antigamaglobulinom.

Prednost RIF-a je jednostavnost, visoka osjetljivost i brzina dobijanja rezultata. RIF se koristi kao metoda za ranu ekspresnu dijagnozu gripa, dizenterije, malarije, kuge, tularemije, sifilisa itd. Za sprovođenje takve studije koristi se fluorescentni mikroskop.

Radioimunotest (RIA)

RIA je jedna od najosetljivijih imunodijagnostičkih metoda. Koristi se za otkrivanje antigena virusa hepatitisa B kod pacijenata sa virusnim hepatitisom. Da bi se to postiglo, u test serum se dodaje referentni serum (serum koji sadrži antitijela na virus hepatitisa B). Smjesa se inkubira 1-2 dana na temperaturi od 40°C, zatim se dodaje referentni antigen (antigen označen sa 125 J izotopom) i inkubacija se nastavlja još 24 sata. Precipitirajući antiimunoglobulini protiv referentnih serumskih proteina dodaju se u nastali kompleks antigen-antitijelo, što dovodi do stvaranja precipitata (slika 8). Rezultat se uzima u obzir prisustvom i brojem impulsa u precipitatu koje snima brojač. Ako u test serumu postoji antigen koji se vezao za specifična antitijela, potonja ne stupaju u interakciju s obilježenim antigenom i stoga se ne otkrivaju u precipitatu. Dakle, RIA se zasniva na principu kompetitivne interakcije antigena koji se određuje i poznate količine obeleženog antigena sa aktivnim centrima antitela, a kao oznake se koriste radioaktivni izotopi.

U zavisnosti od tehnike postavljanja, postoje dve RIA metode.

1) Tehnika „tečne faze” (klasična RIA). Nedostatak ove tehnike uprizorenja je potreba

posebno odvajanje slobodnih i vezanih obilježenih antigena (ili antitijela).

2) Tehnika “čvrste faze”.

AG ili AT poznate specifičnosti vezuju se za sorbente (čvrsta faza) - zidove polistirenskog bunara ili plastične cijevi. Preostale IC komponente se sekvencijalno sorbiraju na imobilizirani AG (AT).

Ovisno o prirodi reakcije, razlikuju se sljedeće metode:

1) Takmičarska metoda - metoda zasnovana na AG konkurenciji.

Komponente reakcije:

a) utvrđena hipertenzija (testni materijal - krv, sputum, itd.);

b) antigen identičan ispitivanom Ag, označen radioizotopom;

c) specifične AT poznate koncentracije vezane za sorbent;

d) standardna hipertenzija (kontrola);

e) puferski rastvor.

Prvo, test AG se uvodi u reakciju. Na površini sorbenta dolazi do stvaranja AG-AT kompleksa. Sorbent se ispere, zatim se unosi označeni AG. Što je veći sadržaj ispitivanog AG, to se manje označeni AG vezuje za AT-m na površini sorbenta. Koncentracija označenog AG se određuje mjerenjem radioaktivnosti reakcije pomoću brojača. Količina radioaktivnosti u reakciji će biti obrnuto proporcionalna količini AG u uzorku za ispitivanje.

2) Nekonkurentna metoda.

Komponente reakcije:

a) hipertenzija koja se može detektovati;

b) specifični AT-a poznate koncentracije, povezan

na sorbentu;

c) antitela identična vezanom antitelu, obeležena

radioizotop;

d) standard AG;

e) puferski rastvor.

Testirani AG se dodaje vezanim antitijelima. Tokom procesa inkubacije, na sorbentu se formiraju AG-AT kompleksi. Sorbent se ispere od slobodnih komponenti i dodaju se označeni AT, koji se vezuju za slobodne valence AG u kompleksu. Količina radioaktivnosti je proporcionalna koncentraciji antigena koji se proučava.

3) “Sendvič metoda” (indirektna metoda) - najčešća metoda.

Komponente:

a) test serum (ili test antigen);

b) AG-s vezan na sorbent (ili AT-la vezan na sorbent pri određivanju AG-a);

c) dijagnostička antitela protiv imunoglobulina, obeležena radioizotopima;

d) kontrolni serum (ili AG);

e) puferske otopine.

Ispitivani AT (ili AG) reaguju sa AG u čvrstoj fazi (AT), nakon čega se inkubacija uklanja i u reakciju se uvode obeleženi antiglobulinski Abs, koji se vezuju za specifične AG-AT komplekse na površini sorbenta. Količina radioaktivnosti reakcije je direktno proporcionalna količini testiranog antitijela (ili AG).

Prednosti RIA:

1) visoka specifičnost i osetljivost;

2) jednostavnost tehnike uprizorenja;

3) tačnost kvantitativne procene rezultata;

4) lako se automatizuje.

Nedostatak: upotreba radioaktivnih izotopa.

Nema sličnih materijala (

Enzimski vezana imunosorbentna metoda (ELISA)

Metoda se koristi za otkrivanje antigena korištenjem njihovih odgovarajućih antitijela konjugiranih s označnim enzimom (peroksidaza rena, b-galaktoza ili alkalna fosfataza). Nakon kombinovanja antigena sa enzimom obeleženim imunološkim serumom, u smešu se dodaju supstrat i hromogen. Enzim cijepa supstrat, a proizvodi njegove razgradnje uzrokuju kemijsku modifikaciju hromogena. U isto vrijeme, hromogen mijenja svoju boju – intenzitet boje je direktno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela (slika 9).

Najčešća je čvrsta faza ELISA, u kojoj se jedna od komponenti imunološke reakcije (antigen ili antitijelo) adsorbira na čvrstom nosaču. Polistirenski mikropaneli se koriste kao čvrsti nosač. Prilikom određivanja antitijela, u jažice sa sorbiranim antigenom uzastopno se dodaju krvni serum pacijenta, enzimom obilježen antiglobulinski serum i mješavina otopina enzima i hromogenog supstrata. Svaki put nakon dodavanja druge komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljnim pranjem. Ako je rezultat pozitivan, boja otopine hromogena se mijenja. Čvrstofazni nosač može biti senzibiliziran ne samo antigenom, već i antitijelom. Zatim se u jažice sa sorbovanim antitelima dodaje željeni antigen, dodaje se imuni serum protiv antigena obeleženog enzimom, a zatim se dodaje mešavina rastvora supstrata za enzim i hromogen.

ELISA se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih virusnim i bakterijskim patogenima.Kao oznake koriste se enzimi: peroksidaza, alkalna fosfataza itd.

Pokazatelj reakcije je sposobnost enzima da izazovu reakciju boje kada djeluju na odgovarajući supstrat. Na primjer, supstrat za peroksidazu je otopina ortofenildiamina.

Najviše se koristi ELISA u čvrstoj fazi. Suština ELISA-e je slična RIA.

Rezultati ELISA-e mogu se procijeniti vizualno i mjerenjem optičke gustine na spektrofotometru.

Prednosti ELISA-e uključuju:

Nema kontakta sa radioaktivnim supstancama;

Jednostavnost metoda procjene reakcija;

Stabilnost konjugata;

Lako podložan automatizaciji.

Međutim, u poređenju sa RIA, primećuje se niža osetljivost metode, ali je u nekim slučajevima osetljivost superiornija u odnosu na RIF i RIM.

Sljedeći tipovi ELISA-e su dati kao primjeri:

Takmičarski tip.

Svrha.

Dizajniran za otkrivanje površinskog antigena virusa hepatitisa B (HB3Ad) u serumu i krvnoj plazmi u dijagnozi virusnog hepatitisa B i određivanje prijenosa HB5Ad.

Komponente:

1) materijal za ispitivanje je serum ili krvna plazma;

2) antitela na HB3 Ad, adsorbovana na površini otvora polistirenske mikroploče;

3) konjugat - mišja monoklonska antitela na HB3 Ad, obeležena peroksidazom,

4) ortofenilendiamin (OPD) - supstrat;

5) fiziološki rastvor fosfatnog pufera;

6) kontrolni serumi:

Pozitivan (serum sa HBeAd);

Negativno (serum bez HB3 Ad). Napredak

1) Dodavanje kontrolnih i test seruma.

2) Inkubacija 1 sat na 37°C.

3) Pranje rupa.

4) Dodatak konjugata.

5) Inkubacija 1 sat na 37°C.

6) Pranje rupa.

7) Ulazak u OFD. U prisustvu HB3, rastvor u jamicama postaje žut.

ELISA obračun se vrši pomoću optičke gustoće pomoću fotometra. Stepen optičke gustine će biti obrnuto proporcionalan koncentraciji proučavanih NV Ad.

Mehanizam

Reakcija se odvija u tri faze:

1) HB3 Ad test seruma (plazma) se vezuje za homologne Abs adsorbovane na površini jažice. Formira se IR AG-AT. (NVz Ad - agl\NVz AT).

2) HB3Ad antitela obeležena peroksidazom vezuju se za preostale slobodne determinante HB3Ad kompleksa AG-AT. Formira se kompleks AT-AG-obeležen AT (ap!1 HB3 AT-HB3 Ad-ap(1 HB3 AT, obeležen peroksidazom).

3) OPD interakcija (sa peroksidazom) kompleksa AT-AG-AT i dolazi do žute boje.

Indirektni tip

To je glavna test reakcija za dijagnosticiranje HIV infekcije.

Svrha: serološka dijagnoza HIV infekcije - otkrivanje antitela na HIV antigene, Komponente:

1) materijal za ispitivanje - krvni serum;

2) sintetički

Trenutno se široko koriste serološke reakcije (SR) u kojima su uključeni obilježeni antigeni ili antitijela. To uključuje imunofluorescentnu reakciju, radioimune i enzimske imunološke metode, imunobloting reakciju, protočnu citometriju i elektronsku mikroskopiju.

Primjenjuju se:

1) za serodijagnostiku zaraznih bolesti, odnosno za otkrivanje antitela korišćenjem seta poznatih konjugovanih (hemijski kombinovanih) antigena sa različitim oznakama (enzimi, fluorohromne boje);

2) određivanje mikroorganizma ili njegovog serovara pomoću standardno označenih dijagnostičkih antitijela (brza dijagnostika).

Dijagnostički serumi se pripremaju imunizacijom životinja odgovarajućim antigenom, zatim se izoluju imunoglobulini i konjugiraju sa svjetlećim bojama (fluorohromima), enzimima i radioizotopima.

Dijagnostička monoklonska antitijela se proizvode pomoću hibridnih stanica formiranih spajanjem imunog B limfocita sa ćelijom mijeloma. Hibridomi su sposobni da se brzo razmnožavaju in vitro u ćelijskoj kulturi i proizvode imunoglobulin karakterističan za uzete B-limfocite.

Označeni SR nisu inferiorni po specifičnosti u odnosu na druge SR, a po svojoj osjetljivosti su superiorniji od svih SR.

Reakcija imunofluorescencije (RIF)

Kao naljepnice koriste se svijetleće fluorohromne boje (fluorescein izotiocijanat, itd.).

Postoje različite modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti, Koons RIF se koristi za identifikaciju mikroba ili njihovih antigena u materijalu koji se proučava.

Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: direktna i indirektna.

Direktne RIF komponente:

1) materijal za ispitivanje (stolica, nazofaringealni iscjedak i sl.);

2) označeni specifični imuni serum koji sadrži antitela na željeni antigen;

3) izotonični rastvor natrijum hlorida.

Razmaz sa test materijala tretira se označenim antiserumom.

Dolazi do AG-AT reakcije. Tokom luminiscentnog mikroskopskog pregleda detektuje se fluorescencija oznake u oblasti gde su AG-AT kompleksi lokalizovani (slika 34).

Komponente indirektni RIF namijenjen brzoj dijagnostici gripe A:

1) ispitani materijal se ispere iz nazofarinksa pacijenta sa sumnjom na influencu;

2) specifični antiserum sa antitelima protiv virusa influence A;

3) antiglobulinski serum (AT protiv imunoglobulina), obeležen fluorohromom;

4) izotonični rastvor natrijum hlorida.

Bris iz test materijala prvo se tretira imunim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.

Imuni kompleksi AG-AT - označeni AT se otkrivaju pomoću fluorescentnog mikroskopa.

Prednost indirektne metode je u tome što nema potrebe za pripremanjem širokog spektra fluorescentnih specifičnih seruma, već se koristi samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.

Za serološka dijagnoza gripe A, odnosno određivanje antitijela protiv virusa influence A u krvnom serumu korištenjem indirektni RIF koristiti influenza diagnosticum (antigen virusa influence A). Serodijagnostika virusnih infekcija uglavnom je retrospektivne prirode i koristi se za potvrdu dijagnoze i epidemiološke analize.

Enzimski imunosorbentni test (ELISA): kompetitivna metoda (određivanje HBs-AG virusa hepatitisa B) i indirektna metoda (serološka dijagnoza HIV infekcije)

Enzimski imunosorbentni test (ELISA)

Enzimi se koriste kao oznake: peroksidaza, alkalna fosfataza itd.

Pokazatelj reakcije je sposobnost enzima da izazovu reakciju boje kada djeluju na odgovarajući supstrat. Na primjer, supstrat za peroksidazu je otopina ortofenildiamina (OPD) ili tetrametilbenzidina (TMB).

Najviše se koriste ELISA u čvrstoj fazi (slika 35), indirektne i kompetitivne metode (slika 36).

Rezultati ELISA-e mogu se procijeniti vizualno i mjerenjem optičke gustine na spektrofotometru (ELISA analizator).

Prednosti ELISA-e uključuju:

Jednostavnost metoda procjene reakcija;

Stabilnost konjugata;

Lako podložan automatizaciji.

Sljedeći tipovi ELISA-e su dati kao primjeri:

A) takmičarski tip

Dizajniran za detekciju površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBs Ag) u serumu i krvnoj plazmi za dijagnozu virusnog hepatitisa B i određivanje nosivosti HBs Ag.

Komponente:

1) materijal za ispitivanje – serum ili krvna plazma;

2) antitela na HBs Ag, adsorbovana na površini otvora polistirenske mikroploče;

3) konjugat – mišja monoklonska antitela na HBs Ag, obeležena peroksidazom;

4) ortofenilendiamin (OPD) – supstrat;

5) fosfatno-fiziološki pufer;

6) kontrolni serumi:

Pozitivan (serum sa HBs Ag);

Negativno (serum bez HBs Ag).

napredak:

2. Inkubacija 1 sat na 37°C.

3. Pranje rupa.

4. Dodatak konjugata.

5. Inkubacija 1 sat na 37°C.

6. Pranje rupa.

7. Ulazak u OFD. U prisustvu HBs Ag, rastvor u jamicama postaje žut.

8. ELISA brojanje se vrši pomoću optičke gustine pomoću fotometra. Stepen optičke gustine će biti obrnuto proporcionalan koncentraciji Ag HBs koji se proučava.

Reakcija se odvija u tri faze:

1. HBs Ag test seruma (plazma) se vezuje za homologna antitela adsorbovana na površini jažice. Formira se IR AG-AT. (HBs Ag – anti HBs AT).

2. Antitela na HBs Ag, obeležena peroksidazom, vezuju se za preostale slobodne determinante HBs Ag u AG-AT kompleksu. Formira se kompleks AT-AG obeleženog AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT obeležen peroksidazom).

3. OPD stupa u interakciju s peroksidazom AT-AG-AT kompleksa i javlja se žuta boja.

B) indirektni tip

To je glavna test reakcija za dijagnosticiranje HIV infekcije.

Svrha: Serološka dijagnostika HIV infekcije - detekcija antitela na antigene HIV-a.

Komponente:

1) materijal za ispitivanje – krvni serum (AT do HIV Ags);

2) sintetički peptidi koji imitiraju 2 HIV antigena: gp 120 i gp 41, adsorbovani na površini polistirenske bušotine;

3) antiglobulinski serum obeležen peroksidazom, dobijen imunizacijom zečeva humanim globulinima (AT do AT);

5) fiziološki rastvor fosfatnog pufera;

6) kontrolni serumi:

Pozitivno;

Negativno.

napredak:

1. Dodavanje kontrolnih i test seruma.

2. Inkubacija 30 minuta na 37°C.

3. Pranje.

4. Dodatak antiglobulinskog seruma označenog enzimom.

5. Inkubacija 30 minuta na 37°C.

6. Pranje.

7. Ulazak u OFD.

Reakcija se odvija u 3 faze:

1. Antitela na HIV test seruma vezuju se za homologne antigene (gp 120 i gp 41), a na površini sorbenta se formira IR AG-AT (HIV Ag - AT na HIV).

2. Formiranje IR AG-AT-AT, obeleženog peroksidazom, jer Antitela test seruma su antigeni za antiglobulinski serum.

3. OPD stupa u interakciju sa peroksidazom kompleksa AG-AT-AT i dolazi do žutog obojenja rastvora bunara. Stepen enzimske aktivnosti je direktno proporcionalan koncentraciji testiranih antitijela.

Reakcija se zasniva na činjenici da se imuni serumi tretiraju fluorohromima (FITC), koji se kombinuju sa antitelima. Serumi ne gube svoju imunološku specifičnost. Kada nastali luminescentni serum stupi u interakciju sa odgovarajućim antigenom, formira se specifičan luminiscentni kompleks koji je lako vidljiv u luminiscentnom mikroskopu.

Za metode direktne i indirektne imunofluorescencije mogu se koristiti različiti imunofluorescentni serumi. U direktnoj metodi, specifični fluorescentni imuni serumi se pripremaju za svaki mikrob imunizacijom zeca ubijenom kulturom patogena, zatim se imunološki serum zeca kombinuje sa fluorohromom (fluorescein izocijanat ili izotiocijanat). Metoda se koristi za brzu dijagnostiku za otkrivanje bakterijskih ili virusnih antigena.

Indirektna metoda uključuje upotrebu dijagnostičkog imunološkog nefluorescentnog seruma (od imuniziranog zeca ili bolesne osobe) i fluorescentnog seruma koji ima antitijela protiv specifičnih globulina dijagnostičkog seruma.

Posao br. 3

Enzimski imunotest (ELISA)

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) se široko koristi. Temelji se na činjenici da su proteini čvrsto adsorbirani na pločama, na primjer, napravljenim od polivinil klorida. Jedna od najčešćih varijanti ELISA u praksi zasniva se na upotrebi specifičnih antitela obeleženih enzimima iste specifičnosti. Rastvor koji sadrži antigen koji se analizira dodaje se u nosač sa imobilisanim antitelima. Tokom inkubacije na čvrstoj fazi formiraju se specifični kompleksi antigen-antitelo. Zatim se nosač ispere od nevezanih komponenti i dodaju se homologna antitela obeležena enzimom, koja se vezuju za slobodne valence antigena u kompleksima. Nakon sekundarne inkubacije i uklanjanja viška ovih enzimom obeleženih antitela, utvrđuje se enzimska aktivnost na nosaču, čija će vrednost biti proporcionalna početnoj koncentraciji antigena koji se proučava.

U drugoj verziji ELISA test serum se dodaje imobiliziranom antigenu. Nakon inkubacije i uklanjanja nevezanih komponenti, specifični imunokompleksi se detektuju korištenjem enzimom obilježenih antiglobulinskih antitijela. Ova shema je jedna od najčešćih pri izvođenju ELISA.

Specifični testni materijal - Specifična antitijela Supstrat

antitijela patogen s peroksidazom za peroksidazu

Studija AGS, označena

Serum peroksidaza Supstrat za

Specifična peroksidaza

Kontrola:

pozitivan - imunološki serum označen peroksidazom + supstrat - 2 jažice;

negativan - normalan serum + supstrat - 2 jažice.

Treponema pallidum reakcija imobilizacije(RIBT). Preduslov je da pacijent prije pregleda ne uzima antibiotike koji toksično djeluju na Treponema pallidum, što uzrokuje njihovu nespecifičnu imobilizaciju.

Pozitivni rezultati RIBT-a se otkrivaju otprilike od sredine sekundarnog svježeg perioda sifilisa i mogu potrajati još dugo nakon liječenja. Ako je potrebno, metoda se koristi za otkrivanje AT u likvoru, ovu studiju karakterizira visoka specifičnost, ali niska osjetljivost (oko 40%).

RIBT je od male koristi za dijagnosticiranje ranih oblika sifilisa zbog kasne (ne ranije od 8-9 sedmica od trenutka infekcije) pojave AT-imobilizina; metoda može dati lažno pozitivne rezultate, posebno kod pacijenata sa autoimunom patologijom, malignim oboljenjima i dijabetesom. Osim toga, RIBT je prilično složena, radno intenzivna i skupa analiza koja zahtijeva visoko kvalifikovano osoblje i prisustvo vivarijuma, te se stoga posljednjih godina koristi samo u određenim laboratorijima. U dijagnostici, RIBT se koristi kao reakcijski arbitar kada postoje odstupanja u rezultatima drugih seroloških studija, za razlikovanje lažno pozitivnih rezultata i prilikom postavljanja dijagnoze kasnih oblika sifilisa.

Reakcija fiksacije komplementa sa antigenom treponeme (RSC sa TA) Osetljivost metode je oko 80%, specifičnost je 98%. Metoda je bila dio skupa standardnih seroloških reakcija na sifilis, regulisanih Naredbom Ministarstva zdravlja SSSR-a br. 1161 od 2. septembra 1985. „O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa“. Trenutno je upotreba ove reakcije, poput CSC sa kardiolipin antigenom, ograničena na pojedinačne laboratorije.

Reakcija imunofluorescencije (RIF). Za dijagnosticiranje sifilisa koristi se nekoliko modifikacija RIF-a: RIF-c - za otkrivanje AT u likvoru, RIF-200 (test serum se razrijedi 200 puta prije reakcije); RIF-abs (RIF sa apsorpcijom), IgM-RIF-abs (za određivanje IgM AT). U smislu osjetljivosti i specifičnosti, RIF-abs nije inferioran u odnosu na RIBT, ali je implementacija ove metode mnogo jednostavnija. Rezultati RIF-abs postaju pozitivni od 3. sedmice nakon infekcije (prije pojave šankroida ili istovremeno s njim), ovo je metoda za ranu dijagnostiku sifilisa. Pozitivni rezultati istraživanja često se nalaze mnogo godina nakon potpunog liječenja ranog sifilisa, a kod pacijenata sa kasnim sifilisom – decenijama.

Indikacije za izvođenje RIF-abs:

• pozitivni rezultati NTT kod trudnica u nedostatku kliničkih i anamnestičkih podataka koji ukazuju na sifilis;
• pregled osoba sa različitim somatskim i infektivnim bolestima, kod kojih se konstatuju pozitivni rezultati NTT;
• pregled osoba sa kliničkim manifestacijama karakterističnim za sifilis, ali sa negativnim rezultatima NTT;
• rana dijagnoza sifilisa;
• u nekim slučajevima - kao kriterij uspješnosti antisifilitičkog liječenja: prijelaz pozitivnog RIF-absa u negativan nakon liječenja je 100% kriterij za izlječenje sifilisa.

IgM-RIF-abs se koristi za odvojeno otkrivanje Ig klase AT, što je od posebnog interesa u dijagnozi kongenitalnog sifilisa, kada su Treponema AT sintetizirani u tijelu djeteta predstavljeni IgM, a IgG AT su majčinog porijekla. Indikacije za ovu studiju su: dijagnoza kongenitalnog sifilisa; procjena rezultata liječenja ranog sifilisa.

RIF ima visoku osjetljivost (98,5%) i specifičnost (99,6%) za gotovo sve oblike sifilisa. Nedostaci RIF-a su: nemogućnost automatizacije istraživanja i evidentiranja rezultata; poteškoće u pripremi visokokvalitetnog antigena iz suspenzije Treponema pallidum dobivene iz testisa zaraženog zeca; subjektivnost u ocjenjivanju rezultata.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Poređenje rezultata dobijenih primenom RPGA i RIBT, RIF-abs, CSR, MRP pokazalo je visoku osetljivost i specifičnost RPGA u dijagnostici sifilisa, što se poklapa sa rezultatima RIF-abs.

RPGA se može izvoditi u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji, postoje njihove makro- i mikro-modifikacije. Kvantitativna RPGA metoda omogućava procjenu koncentracije specifičnih antitijela na treponeme u krvi. Titri od 1:640 i ispod tipični su za pacijente koji su u prošlosti liječeni od sifilisa. Viši titri su uobičajeni za aktivnu, neliječenu infekciju.

Pozitivni rezultati RPGA obično se primjećuju 3 sedmice nakon pojave šankra, a zatim kod pacijenata koji su imali sifilis dugi niz godina, često doživotno.

Osetljivost RPGA je 76% za primarni sifilis; 100% za sekundarni sifilis; 97% za latentni sifilis; 94% za kasni sifilis. Specifičnost RPGA je veća od specifičnosti RIF–abs i iznosi 99%.

Zbog omjera visoke specifičnosti, osjetljivosti, lakoće izvođenja i standardizacije reagensa među treponemskim testovima za serodijagnostiku sifilisa, RPGA dosljedno zauzima vodeće mjesto u kliničkoj praksi u svijetu.

Posebne prednosti ELISA su: visoka osjetljivost i specifičnost metode; automatizacija podešavanja reakcije; visok stepen standardizacije; sposobnost proučavanja velikog broja uzoraka seruma; u kvantitativnom računovodstvu i objektivnom dokumentovanju dobijenih rezultata; mogućnost istovremenog određivanja titra antitreponemskih antitijela različitih klasa (IgG i IgM) u jednom uzorku; pogodnost za ranu dijagnostiku sifilisa i dijagnozu kongenitalnog sifilisa; u jednostavnosti upotrebe za testiranje krvi u službi za transfuziju krvi; primjenjivost kao potvrdni specifični treponemski test. ELISA osjetljivost je 98-100%, specifičnost 96-100%.

Nedostaci ELISA-e uključuju: neprikladnost za proučavanje pojedinačnih uzoraka; duži period prije dobijanja rezultata i kraći rok trajanja ELISA kompleta, na primjer, u poređenju sa RPGA.

Imunološki blot (IB). Jedna od modernih metoda za dijagnosticiranje sifilisa je IB za određivanje IgG ili IgM antitijela na određena Treponema pallidum antitijela.

Metoda ima visoku osjetljivost (do 100%), specifičnost (98%) i reproduktivnost (100%). Studija omogućava proučavanje spektra antitijela na nekoliko antigena T. pallidum odjednom, koristeći visoko pročišćene rekombinantne i peptidne antigene koji smanjuju nespecifičnu reaktivnost seruma na minimum.

Sve ovo određuje mogućnost da se preferira upotreba IB metode u odnosu na druge treponemske testove za provjeru dijagnoze sifilisa u teškim slučajevima, posebno za dijagnosticiranje sifilisa u drugoj polovini perioda inkubacije, latentnog kongenitalnog sifilisa u prvim danima života djeteta, za identifikaciju latentnog sifilisa kod osoba sa slabim humoralnim odgovorom, kao i za razlikovanje lažno pozitivnih rezultata od drugih testova.