A génterápia második eljövetele. Magzati génterápia: elmélettől gyakorlatig A génterápia típusai: ex vivo és in vivo terápia

Génterápia

Baranov V.S. Génterápia – a 21. század orvoslása // Soros oktatási folyóirat. – 1999. – 3. sz. – P. 63–68. (Szentpétervári Állami Egyetem)

© Baranov V.S., szöveg

© Soros Educational Journal, 1999

© A. Afonin, html verzió feldolgozása és kiadása, 2006

<http:// afonin-59- bio. emberek. ru>

<http:// afonin-59- salix. emberek. ru>

BEVEZETÉS

A molekuláris biológia és a genetika döntő eredményei az eukarióta gének finomszerkezetének vizsgálatában, feltérképezésükben az emlősök és különösen az emberek kromoszómáiban, a Human Genome Project lenyűgöző sikerei olyan gének azonosításában és klónozásában, amelyek mutációi számos örökletes betegséghez vezetnek. , és végül a gyors növekedés a biotechnológia és génmanipuláció Ezek voltak a szükséges előfeltételei annak, hogy már 1989-ben megtegyék az állatkísérletekből és elméleti konstrukciókból származó első kísérleteket a monogén betegségek kezelésére.

Mi az a génterápia? Ez a gén gyógyszerként történő kezelését jelenti, vagy csak a mutáns gén korrigálásával történő kezelést? Ezek és még sok más kérdés óhatatlanul felmerül, ha a következő 21. század orvostudományának egy olyan ígéretes és az emberiség számára potenciálisan veszélyes irányát tekintjük, mint a génterápia.

RÖVID TÖRTÉNETI HÁTTÉR

A génterápia a jelen stádiumban úgy definiálható, mint az örökletes, többtényezős és nem örökletes (fertőző) betegségek kezelése a betegek sejtjébe történő gének bejuttatásával, azzal a céllal, hogy a génhibákat célzottan módosítsák, vagy a sejtek új funkciót kapjanak. A génterápia első klinikai vizsgálatait 1989. május 22-én végezték azzal a céllal, hogy genetikailag megjelöljék a tumorba infiltráló limfociták előrehaladott melanómában. Az első monogén örökletes betegség, amelyre módszereket alkalmaztak génterápia kiderült, hogy örökletes immunhiány, amelyet az adenozin-deamináz gén mutációja okoz. (ADA). 1990. szeptember 14-én Bethesdában (USA) egy négyéves kislányt, aki ebben a meglehetősen ritka betegségben (1:100 000) szenvedett, átültették saját limfocitáit, amelyek korábban a testen kívül alakultak át. (volt vivo) genom ADA (gén ADA + gén peo + retrovirális vektor). A terápiás hatás több hónapig volt megfigyelhető, majd az eljárást 3...5 hónapos időközönként megismételték. A három év terápia során összesen 23 intravénás transzfúziót hajtottak végre. ADA- transzformált T-limfociták látható káros hatások nélkül. A kezelés hatására a beteg állapota annyira javult, hogy képes volt rá normál képéletet, és ne féljen a véletlenszerű fertőzésektől. A második ilyen betegségben szenvedő beteg kezelése is hasonlóan sikeres volt. Jelenleg Olaszországban, Franciaországban, az Egyesült Királyságban és Japánban folynak klinikai vizsgálatok ennek a betegségnek a génterápiájával kapcsolatban.

1997-ben a klinikai vizsgálatokra jóváhagyott protokollok száma már 175 volt, megvalósításukban több mint 2000 beteg vett részt. Az ilyen projektek többsége (mintegy 80%) a rák, valamint a HIV-fertőzés (AIDS) kezeléséhez kapcsolódik. Ugyanakkor a génterápia modern kutatásában figyelembe kell venni, hogy a gének vagy a rekombináns DNS manipulálásának következményei ban ben vivo nem kellően tanulmányozott.

Az e területen a legfejlettebb kutatási szinttel rendelkező országokban, különösen az Egyesült Államokban, az érzéki DNS-szekvenciákat használó orvosi protokollokat az illetékes bizottságok és bizottságok kötelezően felülvizsgálják. Az USA-ban ezek a Rekombináns DNS Tanácsadó Bizottság (RAC) és az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA), a projektet ezt követően a Nemzeti Egészségügyi Intézet igazgatójának kötelező jóváhagyása mellett. Európában az ilyen protokollokat a HumanGene Transfer and Therapy Európai Munkacsoport ajánlásaival összhangban állítják össze és hagyják jóvá.

A GENETIKAI TRANSZFEKCIÓ MÓDSZEREI A GÉNTERÁPIÁBAN

A sikeres génterápia döntő feltétele, hogy biztosítsuk a hatékony bejuttatást, vagyis egy idegen gén transzfekcióját (tágabb értelemben) vagy transzdukcióját (vírusvektorok alkalmazásakor) a célsejtekbe, biztosítva annak hosszú távú működését ezekben a sejtekben és létrehozva. a gén teljes körű működésének feltételei (kifejeződése) . A transzfekció történhet tiszta (csupasz) DNS-sel, amelyet a megfelelő plazmidba adalékolnak (integrálva), vagy komplex DNS-t (sókhoz, fehérjékhez (transzferrin), szerves polimerekhez (DEAE-dextrán, polilizin, liposzómák vagy aranyrészecskék) kapcsolódó plazmid DNS-t, vagy olyan vírusrészecskékben lévő DNS, amelyek korábban megfosztották a replikáció képességétől.

Az idegen gének sejtekbe juttatásának fő módszerei kémiai, fizikai és biológiai módszerekre oszthatók. A transzfekció hatékonysága és a transzdukált idegen DNS integrációs képessége nem azonos a cél-DNS-sejtekbe történő transzfekció különböző módszereivel. Csak a vírusvektorok vagy vírusszekvenciákat tartalmazó genetikai konstrukciók képesek aktív transzdukcióra, és bizonyos esetekben hosszú távú kifejeződésre idegen génekben. A génterápiára már jóváhagyott több mint 175 klinikai vizsgálati protokoll közül több mint 120 tartalmaz vírustranszdukciót, és ezek közül körülbelül 100 retrovirális vektorok használatán alapul.

Az adatok áttekintése lehetővé teszi, hogy arra a következtetésre juthassunk, hogy a világ számos laboratóriumának erőfeszítései ellenére minden már ismert és tesztelt ban ben vivoÉs ban ben vitro A vektorrendszerek messze nem tökéletesek. Ha probléma adódik az idegen DNS bejuttatásával ban ben vitro gyakorlatilag megoldott, és eljuttatása különböző szövetek célsejtjébe ban ben vivo sikeresen megoldott (elsősorban receptorfehérjéket, köztük bizonyos szövetekre specifikus antigéneket hordozó konstrukciók létrehozásával), akkor a meglévő vektorrendszerek egyéb jellemzői - az integráció stabilitása, szabályozott expressziója, biztonsága - még komoly fejlesztéseket igényelnek.

Ez mindenekelőtt az integráció stabilitását érinti. Eddig a genomba való integrációt csak retrovirális vagy adeno-asszociált vektorok alkalmazásával sikerült elérni. A stabil integráció hatékonysága növelhető génkonstrukciók, például receptor-mediált rendszerek javításával, vagy kellően stabil episzómális vektorok (vagyis olyan DNS-struktúrák) létrehozásával, amelyek képesek a magokon belüli hosszú távú perzisztenciára.

A receptor által közvetített géntranszfer a következő. A kívánt gén DNS-szekvenciája egy bizonyos anyaghoz (például glikoproteinhez) kapcsolódik, amely nagy affinitással rendelkezik a transzformált sejt egy bizonyos membránreceptorához (például egy hepatocitához). A kapott komplexet adenovírussal kombinálják, amely biztosítja a génkonstrukció behatolását a sejtmagba. Egy ilyen kombinált vektor biztosítja a gén hatékony célzott szállítását specifikus sejtekhez.

Az utóbbi időben különös figyelmet fordítanak az emlős mesterséges kromoszómákon (Mammalian Artificial Chromosomes) alapuló vektorok létrehozására. A közönséges kromoszómák alapvető szerkezeti elemeinek jelenléte miatt az ilyen mini-kromoszómák hosszú ideig megmaradnak a sejtekben, és képesek a megfelelő működéshez szükséges teljes méretű (genomiális) géneket és azok természetes szabályozóelemeit hordozni. a génről, a megfelelő szövetben és a megfelelő időben.

A GÉNTERÁPIA ALAPELVEI

Az exogén DNS-nek a páciens genomjába történő bejuttatásának módjától függően a génterápia akár sejtkultúrában is elvégezhető (ex vivo) vagy közvetlenül a testben (ban ben vivo). Sejtgénterápia vagy -terápia ex vivo magában foglalja a betegspecifikus sejttípusok izolálását és tenyésztését ban ben vitro, idegen gének bejuttatása beléjük (például olyanok, amelyek fokozzák a szervezet immunválaszát), kiválasztva a transzfektált sejtklónokat, és újra bejuttatva ugyanabba a betegbe. Jelenleg a legtöbb klinikai vizsgálatokra jóváhagyott génterápiás program ezt a megközelítést alkalmazza.

Génterápia ban ben vivo klónozott és csomagolt DNS-szekvenciák közvetlen bejuttatásán alapul a páciens meghatározott szöveteibe. Különösen ígéretes a genetikai betegségek kezelésére invivo lehetségesnek tűnik a gének bejuttatása aeroszolizált vagy injektált vakcinákkal. Az aeroszolos génterápiát rendszerint tüdőbetegségek (cisztás fibrózis, tüdőrák) kezelésére fejlesztették ki.

A génterápiás program kidolgozását a megfelelő gén szövetspecifikus expressziójának alapos elemzése, az elsődleges biokémiai hiba azonosítása, szerkezetének, működésének és intracelluláris eloszlásának vizsgálata előzi meg. fehérje termék, valamint a kóros folyamat biokémiai elemzése. Mindezeket az adatokat figyelembe veszik a megfelelő orvosi protokoll összeállításakor. Az örökletes betegség génkorrekciós eljárásának tesztelését a páciens primer sejttenyészetén végzik, amelyben ez a gén normális esetben funkcionálisan aktív. Ezen sejtmodellek segítségével felmérik a kiválasztott exogén DNS transzfer rendszer hatékonyságát, meghatározzák a bevitt genetikai konstrukció expresszióját, elemzik a sejt genommal való kölcsönhatását, valamint biokémiai szinten korrekciós módszereket dolgoznak ki.

Sejtkultúrák felhasználásával lehetőség nyílik a rekombináns DNS célzott bejuttatására szolgáló rendszer kidolgozására, azonban ennek a rendszernek a működésének megbízhatóságának tesztelése csak a szervezet egészének szintjén végezhető el. Ezért fordítanak olyan nagy figyelmet a génterápiás programokban végzett kísérletekre. ban ben vivo állatok megfelelő örökletes betegségeinek természetes vagy mesterségesen előállított modelljein. Az ilyen állatok genetikai hibáinak sikeres korrekciója és a génterápia nem kívánt mellékhatásainak hiánya a legfontosabb előfeltétele a megoldásnak. klinikai vizsgálatok.

És így, szabványos séma Egy örökletes hiba génkorrekciója egy sor egymást követő szakaszból áll. Egy teljesen működő (kifejezett) genetikai konstrukció létrehozásával kezdődik, amely tartalmazza a gén szemantikai (fehérjekódoló) és szabályozó részét. A következő szakaszban a vektor problémáját oldják meg, biztosítva a gén hatékony és lehetőség szerint célzott eljuttatását a célsejtekhez. Ezt követően transzfekciót (a kapott konstrukció átvitelét) a célsejtekbe hajtják végre, felmérik a transzfekció hatékonyságát és az elsődleges biokémiai hiba javíthatósági fokát sejttenyésztési körülmények között. (ban ben vitro) és ami a legfontosabb, ban ben vivoállatbiológiai modelleken. Csak ezt követően kezdődhet meg a klinikai vizsgálati program.

MONOGÉN ÖRÖKLETES BETEGSÉGEK GENTERÁPIÁJA

Az első klinikai vizsgálatok sikere erőteljes ösztönzést jelentett az új génterápiás módszerek kidolgozásának felgyorsítására más területeken. örökletes betegségek. Az alábbiakban felsoroljuk azokat a betegségeket, amelyek esetében alapvetően lehetséges a génterápiás megközelítés, amelyek génkorrekcióját a belátható jövőben valószínűleg elvégezzük, valamint azokat a betegségeket, amelyekre már hivatalosan jóváhagyott protokollok vannak, és amelyek különböző stádiumban vannak. klinikai vizsgálatokból.

Asztal 1– Örökletes betegségek, amelyek génkorrekciója a klinikai vizsgálatok (CT), kísérleti fejlesztés (ED) stádiumában van és alapvetően lehetséges (PV)

Betegség	Hibás gén	Célsejtek	Színpad
Immunhiány	Adenozin-deamináz	Limfociták
Immunhiány	Purin nukleozid foszforiláz	Limfociták
Családi hiperkoleszterinémia	Alacsony sűrűségű lipoprotein receptor	Hepatociták
Hemofília B	IX. faktor	Fibroblasztok
Hemofília A	VIII	Mioblasztok, fibroblasztok
Gaucher-kór (szfingolipidózis)	p-Glükocerebrozidáz	Makrofágok, őssejtek
Hunter betegség	Iduronát-szulfatáz	Makrofágok, őssejtek
Hurler szindróma	L-iduronidáz	Makrofágok, őssejtek
Tüdőtágulás	α-1 -antitripszin	Limfociták
Cisztás fibrózis	SG-transzmembrán szabályozó	Hörgőhám
Fenilketonúria	Fenilalanin-hidroxiláz	Hepatociták
Hyperammonemia	Ornitin transzkarbamiláz	Hepatociták
Citrulinemia	Arginoszukcinát szintetáz	Hepatociták
Duchenne izomsorvadás	Disztrófiák	Mioblasztok, myofibrillumok
Thalassemia	β-globin	Eritroblasztok
Sarlósejtes vérszegénység	β-globin	Eritroblasztok
Légzési distress szindróma	Felületaktív protein B	Hörgőhám
Krónikus granulomatózis	NADPH oxidáz	Granulociták
Alzheimer kór	Amiloid-β prekurzor fehérje (AAP)	Idegsejtek
Parkinson kór	Tirozin-hidroxiláz	Mioblasztok, fibroblasztok, idegsejtek
Metakromatikus lekodystrophia	Arilszulfatáz A	Vér őssejtek, idegsejtek
Lesch-Nyhan szindróma	Hipoxantin-foszforibozil-transzferáz	Idegsejtek

NEM ÖRÖKLETES BETEGSÉGEK GENTERÁPIÁJA

Az örökletes defektusok génkorrekciója terén végzett kutatások fejlődésével egyidejűleg sikeres volt a szensz DNS-szekvenciák terápiás felhasználási módjainak kutatása is a nem örökletes betegségek, elsősorban rosszindulatú daganatok és vírusfertőzések kezelésére. Lényeges, hogy a patológia ezen szakaszaiban különösen intenzíven keresik a génkorrekciós módokat, és a már jóváhagyott klinikai vizsgálati protokollok száma sokszorosa a monogén betegségek kezelésére szolgálókénak.

Az alábbiakban felsoroljuk a különböző daganatok génterápiájának fő módszertani megközelítéseit, amelyeket kifejlesztettek és már széles körben alkalmaznak. Ezen megközelítések közül sok alkalmazható a legsúlyosabb fertőző betegségek, például a HIV-fertőzés (AIDS) elleni küzdelemben is.

E megközelítések korai klinikai vizsgálatainak eredményei rendkívül biztatóak voltak, különösen a neurodegeneratív betegségek és az idegrendszeri rákos megbetegedések kezelésében.

2. táblázat - A rákos betegségek génkorrekciójának alapvető megközelítései

	Bevezetett gének
Fokozott tumor immunreaktivitás	Idegen antigének génjei, citokinek
Az immunsejtek genetikai módosítása	Citokinek génjei, kostimulátorok
„Érzékenység” gének vagy „öngyilkosság” gének beillesztése	HSV timidin kináz, citozin deamináz gének
Onkogén expressziós blokk	Antiszensz Ki-ras mRNS, intracelluláris antitest gének
Tumorszuppresszor gének beillesztése
A normál sejtek védelme a kemoterápiával szemben	1-es típusú gyógyszerrezisztencia gének
Daganatellenes anyagok szintézisének indukciója normál sejtek	Az interleukin-2, interferon génjei
Daganatellenes rekombináns vakcinák előállítása	Vakcinák, mint például a tumorantigént expresszáló BCG
A normál szövetek helyi sugárvédelme antioxidánsokkal	Transzferáz gének, glutation szintetáz

NÉHÁNY ETIKAI ÉS SZOCIÁLIS KÉRDÉS

GÉNTERÁPIA

Az alapvetően új technológiák megjelenése, amelyek lehetővé teszik a gének és fragmentumaik aktív manipulálását, és biztosítják az új genetikai információblokkok célzott eljuttatását a genom meghatározott régióiba, a biológia és az orvostudomány fontos eseményévé vált.

Már most, az emberi genom ismereteinek jelenlegi szintjén, elméletileg teljesen lehetségesek az ilyen módosítások bizonyos fizikai (például magasság), mentális és intellektuális paraméterek javítása érdekében. Így a modern humántudomány a fejlődés új fordulójában visszatért az emberi faj fejlesztésének gondolatához, amelyet egykor a kiváló angol genetikus, F. Galton feltételezett, és amelyet Nagy-Britanniában tanítványai és követői fejlesztettek ki (K. Pearson). , L. Penrose, J. Haldane), Oroszországban (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), az USA-ban (G. Möller). A történelem további menete, mint tudjuk, teljesen hiteltelenné tette az emberi faj fejlesztésének gondolatát. Az ember saját genomja feletti jövőbeli teljhatalma azonban arra késztet bennünket, hogy újra és újra visszatérjünk ehhez a témához, állandó élénk viták tárgyává téve az általános és tudományos sajtóban. Kétségtelen, hogy az emberi géntechnológiával kapcsolatos kezdeti félelmek alaptalanok voltak. A génterápia alkalmazását számos betegség kezelésére javasolták már. Az egyetlen és nélkülözhetetlen korlát, amely a modern körülmények között is érvényben marad, az, hogy minden génterápiás intézkedés csak egy adott páciensre irányuljon, és kizárólag az ő szomatikus sejtjeit érintse.

A jelenlegi tudásszint nem teszi lehetővé a génhibák korrigálását a csírasejt és a korai preimplantáció előtti emberi embriók sejtjei szintjén. valós veszély a génállomány nemkívánatos mesterséges génkonstrukciókkal való szennyeződése vagy olyan mutációk bevezetése, amelyek beláthatatlan következményekkel járnak az emberiség jövője szempontjából. Ugyanakkor a tudományos irodalomban egyre gyakrabban és kitartóan szólal meg az emberi csíra és csírasejtek génkorrekciójának célszerűségéről szóló vita újraindítása.

Ezek azok a kérdések, amelyekkel foglalkozni kell a genetikusok által javasolt szélesebb körű génterápiás vita részeként.

1. A génterápia a jövőben képes lesz-e olyan teljes génkorrekciót biztosítani, hogy az ne jelentsen veszélyt az utódokra?

2. Mennyiben haladja meg egy pár génterápiás eljárásának haszna és szükségessége egy ilyen beavatkozás kockázatát az egész emberiség számára?

3. Mennyire lesznek indokoltak ezek az eljárások a bolygó közelgő túlnépesedésének hátterében?

4. Hogyan viszonyulnak majd az embereken végzett géntechnológiai tevékenységek a társadalom és a bioszféra homeosztázisának problémáihoz?

Így a genetikai forradalom, amelynek apoteózisa a génterápia volt, nemcsak a súlyos örökletes és nem öröklődő betegségek kezelésére kínál valódi utakat, hanem gyors fejlődése során olyan új problémák elé állítja a társadalmat, amelyek megoldása égetően szükséges a közeljövőben.

Ma a génterápia végre kezdi beváltani a hozzá fűzött reményeket. Az elmúlt hat év során a specifikus funkcionális gének a páciens testrészeibe történő bejuttatásának eredményeként 40 örökletes vakságban szenvedő betegnél sikerült helyreállítani a látást. elleni küzdelemben ragyogó eredmények születtek különféle formák leukémia: 120 alany közül több beteg ért el remissziót, amely három évig tartott. A génterápia a hemofília elleni küzdelemben is megmutatta hatékonyságát, egy örökletes betegség, amely néha a beteg halálához vezet. Most a betegnek nem kell nagy dózisú gyógyszereket szednie, amelyek fokozzák a véralvadást és veszélyes mellékhatásokkal járnak.

A pozitív eredményeket azért is nagy lelkesedéssel fogadták, mert 15 évvel ezelőtt a ritka emésztési zavarban szenvedő tinédzser, Jesse Gelsinger korai halála után felhagytak a génterápiával. Az immunrendszer fiatal férfi olyan hevesen reagált egy idegen gén bejuttatására, hogy a szervezet nem bírta. A génterápia 1990-es években elért sikerei közel sem voltak olyan lenyűgözőek, mint várták.

Mindez arra késztetett bennünket, hogy átgondoljuk néhány alkalmazott módszert, és józanabbul felmérjük a génterápia alkalmazásának lehetőségeit a kiküszöbölésre. különféle patológiák. Fel kellett adnom az illúziókat, és vissza kellett térnem alapkutatás. Először is meg kellett állapítani a lehetséges okát mellékhatások(mint azok, amelyek Gelsinger halálához vezettek), és megtanulják elkerülni őket. Nagyobb figyelmet kellett volna fordítani a betegekkel és hozzátartozóikkal való kommunikációra, hogy döntéseik megalapozottak legyenek.

A helyzet fordulópontja hat évvel ezelőtt következett be, miután génterápiával meggyógyítottak egy nyolcéves Corey Haas nevű fiút, aki degeneratív szembetegségben szenvedett. Kezdetben a génmanipuláció hatására a bal szem érintett retinájában kezdett termelődni a hiányzó fehérje, majd négy nappal a műtét után a fiú ellátogatott az állatkertbe, és leírhatatlan örömére rájött, hogy kéket lát. égbolt és sokszínű léggömbök. Három évvel később hasonló manipulációkat végeztek a jobb szemmel. Most már Corey olyan jól lát, hogy elmehet vadászni a nagyapjával.

A génterápia még nem került be a gyakorló orvosok arzenáljába, de van remény, hogy a következő tíz évben erre sor kerül. 2012-ben Európában kísérletet tettek vele egy ritka, de rendkívül fájdalmas patológia, az úgynevezett familiáris lipoprotein lipáz hiány megszüntetésére. Az Egyesült Államokban várhatóan 2016-ban kapják meg az engedélyt a génterápia orvosi alkalmazására, és akkor annak kell pótolnia azt, ami a tíz év tétlenség alatt kiesett.

Kegyetlen csalódás

A génterápia gyakorlati alkalmazásának korai szakaszában a kutatókat ért kudarcok egyértelműen megmutatták, milyen nehéz előre látni az idegen gének szervezetbe juttatásának minden következményét. Túl gyakran kiderült, hogy a legbiztonságosabb rendszerek a szállításukhoz nem elég hatékonyak, és a leghatékonyabbak egy része nem biztonságos: túl heves immunreakció lép fel, mint a Gelsinger esetében, vagy leukémia alakul ki.

Hogy megértsék, mi váltja ki a mellékhatásokat, és hogyan csökkenthető ezek kockázata, a genetikusok a leggyakoribb génbejuttató rendszer alapos tanulmányozására összpontosítottak: olyan vírusok tervezésére, amelyek mikroszkopikus injekciós fecskendőként működnek.

Mindenekelőtt a vírus DNS-ének jelentős részét eltávolították, hogy helyet adjanak a páciens szervezetébe bejuttatni kívánt géneknek. (Ez az eljárás egyidejűleg megfosztotta a vírust a szaporodási képességétől.) A transzformált, a célgéneket hordozó vírust a kívánt testrészbe injektálták, ahol azokat típustól függően a sejt DNS megfelelő régióiba illesztette. a vírustól.

Abban az időben, amikor Gelsinger önkéntesként részt vett a génterápiás klinikai vizsgálatokban, az idegen gének legelterjedtebb szállítórendszere emberekben az adenovírusok voltak, amelyek jellemzően enyhe felső légúti fertőzéseket okoznak. A Pennsylvaniai Egyetem kutatói szerint optimális eredmény beadja a vírust a májba; itt találhatók azok a sejtek, amelyek azt az emésztőenzimet termelik, amelyből Gelsinger hiányzott. Az enzim génjének funkcionális másolatát egy inaktivált vírusrészecskébe illesztették, és ezen részecskék trillióját fecskendezték be a páciens májába.

Sajnos egyes részecskék nem csak a májsejtekbe kerültek, ahogy kellett volna, hanem rengeteg makrofágba is. nagy sejtek, "őrzők" immunrendszer, valamint benne dendritikus sejtek, értesítve az utóbbit az idegen ügynökök inváziójáról. Az immunrendszer azonnal elkezdte elpusztítani az összes fertőzött sejtet, és ez az erőszakos folyamat végül megölte a beteget.

Az immunválasz súlyossága lenyűgözte a kutatókat. A másik 17 önkéntes közül senki sem tapasztalt hasonlót. Köztudott, hogy az adenovírus immunreakciót válthat ki, de Gelsinger esete egyedülálló volt, kivéve azt az esetet, amikor egy majmot a fent leírtaktól kissé eltérő adenovírussal fecskendeztek be. „Az emberi populáció sokkal heterogénebb, mint az állatpopuláció” – mondja James Wilson, a Pennsylvaniai Egyetem munkatársa, aki a Gelsinger klinikai vizsgálatai során használt célzott génbejuttató rendszert fejlesztette ki a többitől." Talán nem történt volna meg a tragédia, ha a vírus dózisa kisebb lett volna – nem trillió részecske, hanem több milliárd. További hiba volt, hogy sem a beteget, sem a hozzátartozóit nem tájékoztatták a majom haláláról hasonló vizsgálatok során, és senki sem tudta, milyen döntést hozna, ha tudott volna az esetről.

A Gelsingerrel történt tragédia nem volt az utolsó. Hamarosan kísérletet tettek egy másik patológia megszüntetésére génterápia segítségével - a súlyos kombinált immunhiány XI (SCID-X1). 20 gyermek vett részt a teszteken; Öten közülük leukémia alakult ki, egy gyermek meghalt. És megint a szállítási rendszer volt a hibás, bár ebben az esetben egy másik vektort – egy retrovírust – alkalmaztak, amely a célgéneket közvetlenül a sejt DNS-ébe inszertálja. Pontos elhelyezkedésük a genomban kissé változik, és néha egy onkogén közelében kapcsolódnak be, ami bizonyos körülmények között rákhoz vezet.

A technológia újralátogatása

A retro- és adenovírusok vektorként való alkalmazásának tragikus következményei arra kényszerítettek bennünket, hogy más vektorokhoz forduljunk. Ennek eredményeként két vírust választottak ki.

Ezek közül az első, az adeno-asszociált vírus (AAV), nem okoz fertőzést emberben. Legtöbben életünk során hordozóivá válunk, és ez az oka annak, hogy az immunrendszer valószínűleg nem reagál rá, amikor vektorként működik. Az AAV-nak van egy másik tulajdonsága, amely segít minimalizálni a mellékhatások kockázatát: számos változata (szerotípusa) létezik, amelyek mindegyike előszeretettel fertőzi meg „saját” szervének vagy szövetének sejtjeit. Tehát az AAV2 esetében ezek a szemek, az AAV8 esetében a máj, az AAV9 esetében a szívizom és az agy. Kiválaszthatja azt a vírusfajtát, amely optimális a test célterületéhez, és minimalizálja az immunválaszt és egyéb nem kívánt hatások. Ezenkívül az AAVue beépíti genetikai anyagát a gazdasejt genomjába, ezért nem okozhat rákot az onkogének véletlenszerű aktiválásával.

Az adeno-asszociált vírust először 1996-ban tesztelték arra vonatkozóan, hogy képes-e genetikai anyagot juttatni a kívánt szövetekbe. A teszteket cisztás fibrózisban szenvedő önkénteseken végezték. Azóta ennek a vírusnak 11 szerotípusát azonosították, és több száz biztonságos, szelektív vektort állítottak elő összetevőikből. Az AAV vírus alapú vektorokat jelenleg olyan patológiák génterápiájára tesztelik, mint a Parkinson- és az Alzheimer-kór, valamint a hemofília, az izomdisztrófia, a szívelégtelenség és a vakság.

A második vírus meglepő módon az AIDS kórokozójának, az emberi immunhiányos vírusnak a legyengített változata. Felejtsük el egy pillanatra rossz hírnevét, és összpontosítsunk vektorként nyújtott előnyeire. A HIV az rstrovírusok családjába tartozó Lentivirus nemzetség tagja. Hatással van az immunrendszer sejtjeire, és - ami nagyon fontos - nem aktiválja az onkogéneket.

Ha eltávolítjuk a HIV halálos hatásáért felelős géneket, akkor egy kiváló vektort kapunk, amely sokféle képességgel rendelkezik. Ezt mondja Stuart Naylor, az angol Oxford Biomedica cég korábbi tudományos igazgatója. A kisebb AAV-vel ellentétben a „semlegesített” HIV több gén egyidejű átvitelére is alkalmas. Nem mérgező és nem okoz immunreakciót. A fertőzés okozó képességétől megfosztott lentivírusokat tesztelik, hogy felhasználják-e őket különféle patológiák, különösen az adenoleukodystrophia megszüntetésére. Mára több ilyen diagnózisú fiú térhetett vissza az iskolába a génterápiának köszönhetően.

A HIV AAVn-t használó klinikai vizsgálatokkal párhuzamosan folyamatban van a régebbi vírusvektorok módosítása, hogy bizonyos körülmények között használhatók legyenek. Így a retrovírusok (a HIV kivételével) genetikailag módosítottak, hogy ne okozzanak leukémiát.

Még az adenovírust sem utasították el teljesen, amelynek használata Gelsinger halálához vezetett. Ma már csak olyan testrészekre adják be, ahol nem valószínű, hogy immunreakciót váltana ki. Egyik lehetséges alkalmazása a xerotómiás (szájszárazság) génterápiája olyan betegeknél, akiket sugárkezelésnek tettek ki a fej és a nyak rákja miatt. amelyben megsérülnek nyálmirigyek.

Az Országos Egészségügyi Intézet (National Institutes of Health) klinikai vizsgálatot végez (kevés önkéntes bevonásával) egy olyan megközelítésen, amely olyan géneknek a megfelelő sejtekbe történő bejuttatásán alapul, amelyek közvetítik a víz nyálmirigyekbe való átjutását szolgáló csatornák kialakulását. Mivel az utóbbiak kis méretűek és többé-kevésbé elszigeteltek, és a vírus dózisa 1000-szer kisebb, mint amit Gelsinger egyszer kapott, a túl erős immunreakció valószínűsége minimális. A célsejteket el nem érő vírusrészecskéket a fejlesztők szerint nyálban kell elpusztítani, azzal együtt kiköpni, vagy lenyelni, ami ismét csökkenti az immunreakció kialakulásának kockázatát. 2006 óta ezzel a módszerrel 11 beteg állapota javított jelentősen.

Új célpontok

A sikertől ihletett orvosgenetikusok kibővítették a génterápia hatókörét, és megpróbálták felhasználni a nem örökletes genetikai hibák kiküszöbölésére.

Így a Pennsylvaniai Egyetem már ezt a megközelítést alkalmazza a gyermekek egyik leggyakoribb rákja, az akut limfoblasztos leukémia (ALL) elleni küzdelemben. Az ilyen diagnózisban szenvedő gyermekek körülbelül 20%-ánál a hagyományos kemoterápia nem segít.

A génterápia ilyen esetekben különösen összetett, és kiméra antigénreceptorok (CAR) alkalmazásán alapul. Az ókori görög mitológia kiméráihoz hasonlóan, amelyek különböző állatok testrészeiből állnak, ezek a receptorok az immunrendszer két olyan összetevőjének komplexei, amelyek általában nem találhatók meg a szervezetben. A T-sejtek, amelyekhez kötődik, képesek megkeresni a leukémiás sejtekben található specifikus fehérjéket a normálnál nagyobb mennyiségben, és elpusztítani a rendellenes sejteket. Az első alanyok felnőtt betegek voltak krónikus leukémia: A kapott eredmények biztatóak voltak. A beteg gyerekeken végzett vizsgálatok eredménye minden várakozást felülmúlt.

Amikor Emily Whiteheadnél 2010 májusában leukémiát diagnosztizáltak, kilenc éves volt. Két kemoterápia nem hozott eredményt. 2012 tavaszán elvégezték a harmadik kúrát, ami akár egy felnőtt halálát is okozhatta volna, de a lány túlélte, bár vese-, máj- és lépproblémák jelentkeztek. Bruce Levine kezelőorvos szerint. – Emily a halál küszöbén állt.

Ezután vért vettek tőle, T-sejteket izoláltak és lentivírust fecskendeztek beléjük. amelynek genomjába korábban a célgének bekerültek. Miután a kiméra T-sejteket visszafecskendezték a páciens testébe, állapota gyorsan javulni kezdett. Három hét elteltével csontvelői T-sejtjeinek 25%-át genetikailag módosították, és elkezdték vadászni a rákos sejteket. „Áprilisban a lány teljesen megkopaszodott. – emlékszik vissza Levin, és augusztusra már elnyerte korábbi kinézetét, és készen állt az iskolára.

A módosított T-sejtek valószínűleg nem működnek élete végéig, de az eljárást mindig meg lehet ismételni. Addig is ez a csinos, sűrű barna hajú lány mentes a rákos sejtektől. 2013 őszén orvosgenetikusok több csoportja arról számolt be, hogy a CAR-technikát alkalmazták 120 olyan beteg kezelésére, akiknél a leukémia ugyanaz, mint Emily Whitehead, valamint más formái. Öt felnőtt és 22 gyermek közül 19 ment remisszióba.

Kilátások

A génterápiás kutatók most egy újabb kihívással néznek szembe: engedélyt kell kapniuk az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóságtól (FDA), hogy minden korábbinál biztonságosabb vektorrendszerüket használják a klinikán. Fázis III. klinikai vizsgálatokat kell szervezni önkéntesek nagy csoportjával. Ez általában egy-öt évig tart. 2013 végén a 2000 vizsgálat körülbelül 5%-a érte el ezt a fázist. A Leber-kórban (a mitokondriális DNS mutációja által okozott kétoldali látásvesztés: a nyolcéves Haasnál volt ez a patológia) szenvedő betegek génterápiáját alkalmazó kezelési módszer megalkotói másoknál tovább fejlődtek. Több tucat betegnek sikerült már visszanyernie látását génterápia segítségével.

Cikk a „bio/mol/text” versenyhez: « Misha február 12-én született egészséges gyermek. De 1,5 hónaposan kezdtem észrevenni, hogy az összes fényképen a baba ugyanazt a pozíciót veszi fel, mintha a lába mozdulatlan lenne. Néhány héten belül diagnosztizáltak minket, együtt éreztek velünk, és azt tanácsolták, hogy kezdjünk el egy pillanatra tervezni. egészséges gyermek " A gének végzetes kombinációja miatt Misha, akárcsak a többi ilyen betegségben szenvedő gyermek, rövid élete során minden mozdulatért meg kellett küzdenie. Küzdj kétségbeesetten, minden erőddel, de a végén veszíts. Gerinc izomsorvadás (SMA) egyike azon genetikai rendellenességeknek, amelyekkel szemben az emberiség még mindig tehetetlen. A génterápia sikerei azonban, amelyeket az orvosi világ ma is megfigyel, az SMA-t és más súlyos örökletes patológiákat is a gyógyíthatóak kategóriájába helyezhetik. Ráadásul a méhen belül gyógyíthatóak.

A verseny főszponzora a Diaem cég: a legnagyobb biológiai kutatási és termelési berendezések, reagensek és fogyóeszközök szállítója.

A közönségdíjat az Orvosi Genetikai Központ támogatta.

A verseny "Könyv" szponzora - "Alpina Non-Fiction"

A természet hibázik, az ember javít

A génterápia koncepciója elegáns és szép, mint minden zseniális dolog. Ez abból áll, hogy egészséges genetikai anyagot juttatnak a sejtbe vektorrendszerek segítségével, hogy helyettesítsék a „hibás” géneket, amelyekhez különféle betegségek társulnak (1. ábra).

A „Biomolecule” már részletesen írt arról, hogy a génterápia milyen lehetőségeket nyit meg a rák és az örökletes rendellenességek, különösen a retinitis pigmentosa kezelésében.

És ha a múlt század 80-as éveiben, amikor elég hangosan elkezdtek beszélni a génterápiáról, elmélete sokak számára a „Vissza a jövőbe” című film forgatókönyvének folytatásának tűnt, mára azonban valósággá vált, új, valóban határtalan távlatokat nyit meg.

Nyilvánvaló azonban, hogy a génterápiának számos korlátja van, különösen akkor, ha arról beszélünk az örökletes betegségekről. Először is, a kóros folyamat ilyen esetekben a méhben kezdődhet. Mire a betegséget végül diagnosztizálják – esetenként évekkel a baba születése után – a sejtek és szervek visszafordíthatatlan károsodása alakulhat ki, ami jelentősen korlátozza vagy kiküszöböli a terápiás lehetőségeket.

A probléma megoldásának lehetősége a modern prenatális diagnosztikának köszönhető, amely lehetővé teszi a kromoszóma-rendellenességek kimutatását már a terhesség korai szakaszában. Bármilyen magzati anyag invazív technikákkal történő kinyerésével a genetikai betegségek gyorsan és megbízhatóan diagnosztizálhatók. Hemoglobinopátiák esetén pedig teljesen megszűnik az invazív manipulációk szükségessége: azonosításukhoz elegendő az anya vérsejtjéből nyert magzati DNS-t megvizsgálni.

A modern prenatális diagnosztikai technikák a génterápia fejlődésével kombinálva egyedülálló lehetőséget biztosítanak a természet „hibájának” kijavítására és a kóros folyamatba való beavatkozásra a visszafordíthatatlan sejtkárosodás előtt. A gyermek különböző betegségeinek kezelését az anyaméhben vagy a szerint legalább, minden valószínűség szerint megfékezi a betegség progresszióját magzati génterápia, vagy magzati génterápia.

A magzati génterápia ötlete korántsem újkeletű: alig néhány évvel az első felnőttkori génterápiás kísérlet után, 1994-ben a kutatók komolyan megvitatták az innovatív technika méhen belüli alkalmazását. Mára, amikor a genetikai betegségek méhen belüli kezelése már-már fantasztikus kilátásból valósággá vált, rengeteg olyan munka jelent meg, ahol a magzati génterápia és annak előnyei a felnőttek génterápiájához képest.

Születés előtti vs szülés utáni

Megelőlegezve a genetikai rendellenesség méhen belüli korrekciójának célszerűségével kapcsolatos kérdéseket, azonnal összpontosítsuk a magzati génterápia előnyeit a posztnatális génterápiához képest.

Szervekre és rendszerekre gyakorolt ​​hatások széles skálája

Ismeretes, hogy sok genetikai betegségben (például epidermolysis bullosa vagy cisztás fibrózis) meglehetősen nehéz lehet befolyásolni a fő láncszemeket. kóros folyamat szinte közvetlenül a születés után. A mutáns gének korrekciója a fejlődő magzatban lehetővé teszi az őssejtek populációjának gyors növelését, nagy mennyiségű transzfektált sejtet és ennek következtében kifejezett terápiás hatást biztosítva.

Genetikai anyagot hordozó klinikai vektor egyszerűsített előállítása

A genetikai anyag átvitelére használt vírusvektor adagolása a testtömegtől függ. A magzat kis mérete miatt a vektor sokkal nagyobb biológiai eloszlása ​​érhető el ugyanazzal a dózissal, mint egy felnőtt génterápia során. Ez időt és pénzt takarít meg. Az egyszerű összehasonlító adatok segítenek elképzelni, hogy mekkora megtakarítást jelent: például egy magzat a terhesség 14-16 hetében ( optimális idő vektorindukció) körülbelül 100 g, míg az átlagos felnőtt testsúly körülbelül 60 kg.

A terápia hatékonyságának növelése hiányos immunválasz miatt

Számos tanulmány kimutatta, hogy bizonyos, vektorként általánosan használt szerotípusok adenovírusokkal és adeno-asszociált vírusokkal (AAV-k) szembeni humorális immunitása a transzgén expressziójának kudarcát eredményezheti (2. ábra). Ez lehet a sikeres transzplantáció egyik kritikus akadálya.

Az ezen vírusvektorokkal szemben szerzett immunválaszt mutató felnőttek körülbelül 50%-a veszélyeztetett. De még érzékenység hiányában is, a vektor beadása felnőtteknél gyakran olyan immunválasz kialakulásához vezet, amely csökkenti a transzgén expressziójának időtartamát és szintjét. Szóval utána intramuszkuláris injekció adenovírus vektor fehérje génnel disztrofin A Duchenne-izomdisztrófiában szenvedő felnőtt egerekben disztrofin elleni antitestek fejlődnek ki, ami az expresszió hatékonyságának jelentős csökkenésével jár. Ugyanakkor az anyaméhben lévő magzat immunológiailag éretlen, ami lehetővé teszi a vírusvektor és a transzgéntermék szállítását az immunválasz által támasztott korlátozások nélkül.

A magzati terápia nyilvánvaló előnyei a posztnatális korrekcióhoz képest nagyobb hatékonyságot és megvalósíthatóságot biztosítanak, különösen súlyos, életveszélyes betegségek esetén. A magzati génterápia olyan esetekben is befolyásolhatja a betegség kóros részeit, amelyekben a teljes gyógyulás nem érhető el, megkönnyítve a lefolyást és javítva a prognózist. Ezért családok ezrei számára ez lehet az egyetlen terápiás alternatíva a terhesség megszakítására. Ezenkívül valóban óriási azoknak a betegségeknek a száma, amelyek potenciálisan kontrollálhatók, ha a magzati génterápiát bevezetik a klinikai gyakorlatba.

Kilátások és lehetőségek

Úgy gondolják, hogy a magzati génterápia számos veszélyes patológiát képes kordában tartani. Ezeknek csak kis töredékét mutatjuk be az 1. táblázatban.

1. táblázat Magzati génterápiával kontrollálható betegségek .

Betegség	Génterápiás gyógyszer	Célsejtek és/vagy szerv	A betegség megnyilvánulásának kora	Prevalencia	Élettartam
Cisztás fibrózis	CFTR (transzmembrán szabályozó)	A légutak és a belek hámsejtjei	A terhesség harmadik trimesztere	1:4000	Körülbelül 35 éves
Duchenne izomsorvadás	Dystrophin	Miociták	2 év	1:4500	25 év
Spinalis izomsorvadás	SMN fehérje	Motoros neuronok	6 hónap (I. típus)	1:10 000	2 év
Vérzékenység	VIII-as vagy IX-es véralvadási faktor	Hepatociták	1 év	1:6000
Béta-talaszémia	Globin	Vörösvérsejtek prekurzorai	Akár egy évig	1:2700	Akár 20 évig
Gaucher-kór	Glükocerebrozidáz	Hepatociták	9,5 év	1:59 000	Kevesebb, mint 2 év
A karbamid ciklus hibái	Ornitin transzkarbamiláz	Hepatociták	2 nap	1:30 000	2 nap
Epidermolysis bullosa	VII típusú kollagén	Keratinociták	Születés	1:40 000	Megfelelő terápia mellett normális várható élettartam
Hipoxiás ischaemiás encephalopathia	Neurotróf tényezők	Kortikális neuronok	Születés	1:1000	Megfelelő terápia mellett normális várható élettartam
Súlyos intrauterin növekedési korlátozás	A placenta növekedési faktorai	Trofoblaszt	Magzat	1:500	Néhány nap

Ezen túlmenően a magzati terápiával kontrollált patológiák közé tartoznak a következők:

• Immunhiányos rendellenességek- csupasz limfocita szindróma, porc hypoplasia, Chediak-Higashi szindróma, krónikus granulomatosus betegség, Kostman szindróma, leukocita adhéziós hiány, Omenn szindróma, Wiskott-Aldrich szindróma.
• Hemoglobinopátiák- Rh betegség, veleszületett eritropoetikus porfiria.
• Az enzimaktivitás hiányával kapcsolatos betegségek- Gaucher-kór, Krabbe-kór, metakromatikus leukodystrophia, mukopoliszacharidózisok, Wolman-kór, Niemann-Pick-kór.
• Egyéb- veleszületett dyskeratosis, familiáris hemaphagocytás lymphohistiocystosis, infantilis osteopetrosis, Shwachman-Diamond szindróma stb.

Elképesztő azoknak a betegségeknek a listája, amelyek a magzati génterápia hatókörébe kerülhetnek: feltehetően ezzel a technikával lehet beavatkozni a korábban emberi kontrollon kívül álló, monogén eredetű betegségek által kiváltott kóros folyamatokba. Számuk az Egészségügyi Világszervezet szerint eléri a tízezret. Mindazonáltal fontos figyelembe venni számos korlátozás meglétét, és elsősorban az anya és a magzat számára az intrauterin génterápiával kapcsolatos kockázatokat.

Félelmek és kockázatok

A prenatális géntranszfer specifikus kockázatai alapvetően különböznek a posztnatális génterápia kockázataitól. Ide tartoznak a rövid távú mellékhatások és a hosszú távú szülés utáni hatások. Relevanciájukat súlyosbítja az a tény, hogy hipotetikusan a magzati gének expressziója előre nem látható hatással lehet mind a prenatális, mind a posztnatális fejlődésre.

Először is, maga az áthelyezési eljárás közvetlenül összefügg a vetélés, a chorioamnionitis és a megnövekedett valószínűséggel. koraszülés. A vizsgálatok dokumentálták a vektorral szembeni gyulladásos reakciókat, különösen a májinfiltrációt és a májelhalást juhmagzati génterápiában.

A magzati génterápia sikerét a magzati immunválasz ellensúlyozhatja, és ez bizonyos kockázatokat hordoz a végeredmény szempontjából. A vektor vagy transzgenikus fehérje sejttranszdukciós rendszereken keresztül történő bejuttatására adott humorális és sejtes válaszok megszüntethetik a transzfertermékeket vagy semlegesíthetik a transzgén expresszióját. Ugyanakkor a vizsgálatok kimutatták, hogy az immunválasz erőssége függ a terhességi kortól. A terhesség korai és középső stádiumában a lentivírus-vektor bejuttatására adott szignifikáns immunreakciókat nem jegyeztek fel, míg a kapszid-antigénnel szembeni erőteljes humorális választ figyeltek meg adenovirális vektor késői stádiumában történő bevezetésével.

A magzati génterápia egyik rendkívül fontos problémája a donor DNS-szekvenciák magzatba történő átvitele során felmerülő potenciális kockázat. Mivel a csírasejtekbe való vektoros integráció valószínűleg véletlenszerű, elméletileg katasztrofális következményekkel járhat a magzatra nézve. Valójában az a gyermek, aki méhen belül kap donor genetikai anyagot, mutánsként születik. A génterápia etikai összetevője aggasztja a tudósok és a teológusok elméjét. Ez utóbbiak a tudománytörténet leghíresebb bárányának születése óta figyelmeztetnek azokra a veszélyekre, amelyeket Isten tervébe való beavatkozás jelent az emberiség számára.

Egy másik fontos szempont a magzati sejtekben bekövetkező mutagenezis valószínűsége okozza, amely bármely funkcionális gén hibájához vezet, ami végső soron egy most új, szerzett genetikai betegség, ill. rosszindulatú daganat. Ez a lehetőség még valószínűbbnek tűnik egy egérvizsgálatból származó bizonyítékok alapján, amelyekben az egérembriók génexpressziója májdaganatok kialakulását váltotta ki.

Ebben az összefüggésben két tanulmány eredménye, amelyek az X-hez kötött kombinált immunhiány sikeres génterápiája után súlyos mellékhatások kialakulását mutatják, korántsem lehet véletlen: az első esetben egy monoklonális limfoproliferatív betegség manifesztációját rögzítették, és a másodszor, az alfa/béta T-sejt proliferáció. Mind az első, mind a második esetben a retrovirális vektor a gén közvetlen közelében integrálódott LMO2 szaporodó T-sejtekben.

Elméletileg génterápia ex vivo biztonságosabb lehet, mint in vivo a vektor magzati injekciója. Bár ez nem zárja ki a mutagenezis lehetőségét a retrovírussal transzdukált sejtekben in vitro, a mutagén bejutása könnyebben kimutatható és ellenőrizhető. Ennek ellenére sajnos ezek a szövődmények nem zárhatók ki teljesen.

Végül a magzati génterápia növeli a magzati sejtek transzdukciós érzékenységét. Alacsony szintű retrovírus-transzdukciót figyeltek meg csírasejt progenitorokba hím és női ivarmirigyekben, miután a vektort intraperitoneálisan birka-, illetve majomembriókba juttatták. A nem szándékos transzdukcióhoz vezető tényezők elemzése kimutatta, hogy a magzati szövet érzékenysége a terhesség korától függ, a terhesség korai szakaszában pedig magasabb a transzdukció aránya.

A lehetséges kockázatok szempontjából nyilvánvaló, hogy a magzati génterápia csak súlyos genetikai betegségek kezelésében lehet ésszerű módszer, amelyre nincs más korrekciós lehetőség. És természetesen köztük van a Gaucher-kór is, amelynek méhen belüli génterápiájának lehetőségét egy nemrég megjelent tanulmány bizonyította.

Először: Gaucher-kór

2018 júliusában a magazin Természetgyógyászat közzétette a Simon Waddington által vezetett egérvizsgálat eredményeit ( Simon Waddington) a London Institute-tól nők egészsége. A munka eredményei igazolták a magzati génterápia hatékonyságát a neurodegeneratív betegségek és különösen a Gaucher-kór kezelésében. Ez a leggyakoribb forma a ritka örökletes enzimpátiák között, amely a lizoszómális enzimaktivitás hiányán alapul. glükózcerebrozidáz(3. ábra), amelyet a gén mutációi okoznak glükozilceramidáz. A mutációk jellegétől függően kialakulhat a betegség súlyos, csecsemőkortól manifesztálódó neuropátiás formája, vagy fokozatosabban kezdődő, kevésbé súlyos tünetekkel járó forma. Míg a Gaucher-kór enyhébb formái jól reagálnak a helyettesítő terápiára, a súlyos formája végzetes marad. A Gaucher-kór gyógyíthatatlan formájának jelei az élet első hónapjaiban jelentkeznek, és magukban foglalják a progresszív izom hipotóniát, a pszichomotoros fejlődés késleltetését és regresszióját, valamint egyéb neurológiai tüneteket.

Egy tanulmányban Waddington és munkatársai kimutatták, hogy az adeno-asszociált vírusvektor 9 (AAV9) intrakraniális injekciója embrionális egerekbe a vemhesség 16. napján a glükóz-cerebrozidáz fokozott expresszióját eredményezte, ami megfordította a neurodegenerációt. Ugyanakkor az agy enzimaktivitása hasonló volt az egészséges egerekéhez. Annak ellenére, hogy beteg rágcsálókat még mindig diagnosztizáltak gyulladásos folyamat az agyban szignifikánsan jobban fejlődtek, mint a kontrollcsoport egerei, amelyeket a betegség súlyossága miatt két héttel a kezelés után el kellett végezni.

A magzati génterápiával kezelt egerek legalább 18 hétig éltek, termékenyek és mozgékonyak voltak. Érdekes módon a vektor postnatális beadása szintén enyhítette a betegséget, de kevésbé volt hatékony, mint a prenatális expresszió.

Mivel az AAV9 a véráramból be tudott jutni az agyba, Waddington csapata újabb kísérletet végzett, melynek során nem az agyba, hanem közvetlenül az egérmagzatok vérébe fecskendeztek lényegesen nagyobb dózisú vektort. Az egereket az expresszió után nagyrészt nem lehetett megkülönböztetni az egészséges egerektől, de mivel csak 55 napig éltek, a tudósok nem tudtak következtetéseket levonni az intravénás génterápia hosszú távú hatékonyságáról.

Waddington kísérlete volt az eddigi legösszetettebb munka, amelyben a magzati génterápiát állatokon végezték. Ma a csapat a vállalattal dolgozik együtt Apollo Therapeutics, amely három brit egyetem és három nagy gyógyszergyár erőfeszítéseit fogta össze. Waddington és munkatársai új célt követnek: ezúttal preklinikai adatok beszerzése és a kezelés lehetséges tesztelése embereken. És miközben a szkeptikusok azon töprengenek a magzati génterápia emberben történő alkalmazásának lehetőségeiről, amelyeket jelentősen szűkíthet az a tény, hogy a Gaucher-kór nem szerepel a prenatális tesztekben, Waddington csapata magabiztosan halad a jövő felé. Egy jövő, ahol a Gaucher-kórban, Duchenne-izomdystrophiában, SMA-ban és sok más ritka, de ma már gyógyíthatatlan betegségben szenvedő gyerekek felépülhetnek.

Irodalom

1. 12 módszer képekben: génsebészet. II. rész: Eszközök és technikák;
Immunválaszok génterápiás vektorokra: hatása a vektor működésére és az effektor mechanizmusokra. Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Immunválasz a teljes hosszúságú disztrofinra, amelyet egy nagy kapacitású adenovírus vektor szállít a Dmd izomba. Molekuláris terápia. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). Az Utero génterápiában és a genomszerkesztésben. Curr Stem Cell Rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Legjobb gyakorlat és kutatás klinikai szülészet és nőgyógyászat. 22 , 203-218;
5. Összegzés a génterápia frontjáról. Új stratégia a hemofília semlegesítésére;
6. Charles Coutell. (2008). Miért baj?: Megéri az In Utero génterápia az erőfeszítést? . Molekuláris terápia. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang stb. al.. (2005). Onkogenezis egy nem főemlős lentivirális génterápiás vektor magzati és újszülött egerekbe való bejuttatását követően. Molekuláris terápia. 12 , 763-771;
8. Az Európai Génterápiás Társaság (ESGT) sajtóközleménye, Bernd Gansbacher. (2003). Jelentés egy második súlyos nemkívánatos eseményről az X-hez kötött súlyos kombinált immunhiány (X-SCID) génterápiájának klinikai vizsgálatában. J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley stb. al.. (2018). Magzati génterápia csecsemők neurodegeneratív betegségeiben. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Bevezetés

Évről évre egyre több cikk jelenik meg az orvostudományról klinikai vizsgálatok, amelyben így vagy úgy, különböző gének bevezetésén alapuló kezelést alkalmaztak - génterápia. Ez az irány a biológia olyan jól fejlődő ágaiból nőtt ki, mint a molekuláris genetika és a biotechnológia.

Gyakran, amikor a hagyományos (konzervatív) módszereket már kipróbálták, a génterápia segíthet a betegek túlélésében, sőt teljes gyógyulásában. Ez vonatkozik például az örökletes monogén betegségekre, vagyis azokra, amelyeket egyetlen gén hibája okoz, valamint sok másra is. Vagy például a génterápia segíthet és mentheti meg a végtagot azoknak a betegeknek, akiknél szűkült az erek lumenje. alsó végtagokés ennek eredményeként a környező szövetek tartós ischaemiája alakult ki, vagyis ezek a szövetek súlyos tápanyag- és oxigénhiányt szenvednek, amelyeket normális esetben a vér szállít a szervezetben. Sebészeti manipulációkés gyakran lehetetlen gyógyszerekkel kezelni az ilyen betegeket, de ha a sejteket lokálisan több fehérjefaktor kibocsátására kényszerítik, ami befolyásolná az új erek kialakulásának és csírázásának folyamatát, akkor az ischaemia sokkal kifejezettebbé válna, és az élet sokkal könnyebbé válik. betegek számára.

Génterápia ma úgy definiálható, mint a betegségek kezelése a betegek sejtjébe géneket juttatva a génhibák specifikus megváltoztatása vagy a sejtek új funkcióinak biztosítása érdekében. A génterápiás módszerek első klinikai próbáira a közelmúltban – 1989. május 22-én – került sor a rák diagnosztizálása céljából. Az első olyan örökletes betegség, amelyre génterápiás módszereket alkalmaztak, az örökletes immunhiány volt.

Évről évre nő a sikeresen elvégzett klinikai vizsgálatok száma a különböző betegségek génterápiával történő kezelésére, és 2014 januárjára elérte a 2 ezret.

Ugyanakkor a génterápia modern kutatásában figyelembe kell venni, hogy a gének manipulálásának vagy a „kevert” (rekombináns) DNS következményei in vivo(latin szó szerint „az élőkben”) nem tanulmányozták kellőképpen. Az e területen a legfejlettebb kutatási szinttel rendelkező országokban, különösen az Egyesült Államokban, az érzéki DNS-szekvenciákat használó orvosi protokollokat az illetékes bizottságok és bizottságok kötelezően felülvizsgálják. Az USA-ban ezek a Rekombináns DNS Tanácsadó Bizottság (RAC) és az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA), a projektet ezt követően az igazgatónak kötelező jóváhagynia. Nemzeti Intézetek egészségügy (Nemzeti Egészségügyi Intézetek).

Szóval, úgy döntöttünk ezt a kezelést azon alapul, hogy ha a szervezet egyes szöveteiben hiányoznak bizonyos egyedi fehérjefaktorok, akkor ez korrigálható a megfelelő fehérjéket kódoló gének bejuttatásával ezekbe a szövetekbe, és minden többé-kevésbé csodálatos lesz. Magukat a fehérjéket nem lehet majd bevinni, mert szervezetünk azonnal erős immunreakcióval reagál, és a hatástartam nem lenne elegendő. Most el kell döntenie a gén sejtekbe juttatásának módját.

Transzfekció sejteket

Először is érdemes bevezetni néhány kifejezés definícióját.

A génszállítást köszönhetően vektor egy DNS-molekula, amelyet mint " jármű"a genetikai információ sejtbe történő mesterséges átviteléhez. Sokféle vektor létezik: plazmid, vírus, valamint kozmidok, phasmidok, mesterséges kromoszómák stb. Alapvetően fontos, hogy a vektorok (különösen a plazmidok) rendelkezzenek rájuk jellemző tulajdonságokkal:

1. A replikáció eredete (ori)- az a nukleotidszekvencia, amelyből a DNS duplikációja kezdődik. Ha a vektor DNS nem tud megduplázódni (replikálódni), akkor a szükséges terápiás hatás nem érhető el, mert egyszerűen az intracelluláris nukleáz enzimek gyorsan lebontják, és a templátok hiánya miatt végül sokkal kevesebb fehérjemolekula képződik. Megjegyzendő, hogy ezek a pontok minden biológiai fajra specifikusak, vagyis ha feltételezzük, hogy a vektor-DNS-t bakteriális tenyészetben történő szaporítással kapják (és nem csak kémiai szintézissel, ami általában sokkal drágább), akkor két külön replikációs origóra lesz szükség - az emberek és a baktériumok számára;

2. Korlátozási oldalak- specifikus rövid (általában palindrom) szekvenciák, amelyeket speciális enzimek (restrikciós endonukleázok) ismernek fel és bizonyos módon levágnak - „ragadós végek” kialakulásával (1. ábra).

1. ábra „ragadós végek” kialakulása restrikciós enzimek részvételével

Ezek a helyek szükségesek ahhoz, hogy a vektor-DNS-t (amely lényegében egy „üres”) a kívánt terápiás génekkel egyetlen molekulává varrjuk. Az ilyen, két vagy több részből térhálósított molekulát „rekombinánsnak” nevezik;

3. Világos, hogy több millió másolatot szeretnénk szerezni egy rekombináns DNS-molekulából. Ismétlem, ha bakteriális sejttenyészetről van szó, akkor ezt a DNS-t el kell izolálni. A probléma az, hogy nem minden baktérium nyeli le azt a molekulát, amelyre szükségünk van. E két csoport megkülönböztetésére beillesztik szelektív markerek- bizonyos ellenállási területek vegyszerek; Ha ezeket az anyagokat hozzáadja a környezethez, akkor csak azok maradnak életben, amelyek ellenállnak nekik, a többiek pedig meghalnak.

Ez a három komponens mind a legelső mesterségesen szintetizált plazmidban megfigyelhető (2. ábra).

2. ábra

A plazmidvektor bizonyos sejtekbe való bejuttatásának folyamatát ún transzfekció. A plazmid egy meglehetősen rövid és általában kör alakú DNS-molekula, amely egy baktériumsejt citoplazmájában található. A plazmidok nem kapcsolódnak a bakteriális kromoszómához, ettől függetlenül képesek replikálódni, és a baktérium felszabadíthatja környezet vagy fordítva, felszívódni (az abszorpció folyamata az átalakítás). A plazmidok segítségével a baktériumok genetikai információt cserélhetnek, például bizonyos antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát továbbíthatnak.

A plazmidok baktériumokban léteznek természeti viszonyok. De senki sem akadályozhatja meg a kutatót abban, hogy mesterségesen szintetizáljon egy plazmidot, amely rendelkezik majd a számára szükséges tulajdonságokkal, beillesztve egy géninszertet, és bejuttassa egy sejtbe. Ugyanabba a plazmidba különböző inszertek illeszthetők be .

Génterápiás módszerek

Két fő megközelítés létezik, amelyek a célsejtek természetében különböznek egymástól:

1. Magzat, amelyben a zigótába (megtermékenyített petesejtbe) vagy az embrióba a fejlődés korai szakaszában idegen DNS kerül be; ebben az esetben várható, hogy a bevitt anyag a recipiens minden sejtjébe (sőt a csírasejtekbe is) bejut, ezzel biztosítva a következő generációba való átvitelt. Nálunk valójában tilos;

2. Szomatikus, amelyben a genetikai anyag a már megszületett ember nem szaporodó sejtjébe kerül, és nem kerül át a csírasejtekbe.

Génterápia in vivo klónozott (sokszorozott) és csomagolt DNS-szekvenciák meghatározott módon történő közvetlen bejuttatásán alapul a páciens bizonyos szöveteibe. A génbetegségek in vivo kezelésében különösen ígéretes a gének aeroszolos vagy injektált vakcinák alkalmazásával történő bevitele. Az aeroszolos génterápiát rendszerint tüdőbetegségek (cisztás fibrózis, tüdőrák) kezelésére fejlesztették ki.

A génterápiás program kidolgozásának számos lépése van. Ez magában foglalja a megfelelő gén szövetspecifikus expressziójának alapos elemzését (azaz egy bizonyos szövetben bizonyos fehérje génjének mátrixán történő szintézisét), az elsődleges biokémiai hiba azonosítását, valamint a szerkezet, funkció tanulmányozását. fehérjetermékének intracelluláris eloszlását, valamint a kóros folyamat biokémiai elemzését. Mindezeket az adatokat figyelembe veszik a megfelelő orvosi protokoll összeállításakor.

Fontos, hogy a génkorrekciós sémák összeállításakor felmérjék a transzfekció hatékonyságát és az elsődleges biokémiai hiba korrekciójának mértékét sejttenyésztési körülmények között ( in vitro,"in vitro"), és ami a legfontosabb, in vivoállatbiológiai modelleken. Csak ezt követően kezdődhet meg a klinikai vizsgálati program .

Terápiás gének közvetlen szállítása és sejthordozói

Számos módszer létezik idegen DNS eukarióta sejtbe történő bejuttatására: egyesek a fizikai feldolgozástól (elektroporáció, magnetofekció stb.), mások az alkalmazástól függenek. vegyi anyagok vagy biológiai részecskék (például vírusok), amelyeket vektorként használnak. Azonnal érdemes megemlíteni, hogy a kémiai és fizikai módszerek(pl. elektroporáció + DNS beburkolása liposzómákkal)

Közvetlen módszerek

1. A kémiai alapú transzfekció több típusba sorolható: ciklodextrin anyag, polimerek, liposzómák vagy nanorészecskék felhasználásával (kémiai vagy vírusos funkcionalizálással, azaz felületmódosítással vagy anélkül).
a) Az egyik legolcsóbb módszer a kalcium-foszfát használata. 10-100-szorosára növeli a DNS sejtekbe történő beépülésének hatékonyságát. A DNS erős komplexet képez a kalciummal, amely biztosítja annak hatékony felszívódását. Hátránya: a DNS-nek csak körülbelül 1-10%-a jut el a sejtmagba. Alkalmazott módszer in vitro DNS humán sejtekbe történő átvitelére (3. ábra);

3. ábra

b) Erősen elágazó szerves molekulák – dendrimer – alkalmazása a DNS megkötésére és a sejtbe történő átvitelére (4. ábra);

4. ábra

c) Nagyon hatékony módszer A DNS transzfektálásához liposzómákon keresztül vezetik be – kis, membránnal körülvett testeken, amelyek egyesülhetnek a sejt citoplazmatikus membránjával (CPM), amely egy kettős lipidréteg. Az eukarióta sejtek esetében a transzfekció hatékonyabb kationos liposzómák használatával, mivel a sejtek érzékenyebbek rájuk. Az eljárásnak saját neve van - lipofection. Ezt a módszert ma az egyik legbiztonságosabbnak tartják. A liposzómák nem toxikusak és nem immunogének. A liposzómák használatával végzett génátvitel hatékonysága azonban korlátozott, mivel az általuk a sejtekbe bevitt DNS-t a lizoszómák általában azonnal elkapják és megsemmisítik. A DNS humán sejtekbe liposzómák segítségével történő bejuttatása a mai terápia alappillére. in vivo(5. ábra);

5. ábra

d) Egy másik módszer kationos polimerek, például dietil-amino-etil-dextrán vagy polietilén-imin alkalmazása. A negatív töltésű DNS-molekulák pozitív töltésű polikationokhoz kötődnek, és ez a komplex endocitózissal bejut a sejtbe. DEAE-dextrán változások fizikai tulajdonságok plazma membránés serkenti ennek a komplexnek a sejt általi felvételét. A módszer fő hátránya, hogy a DEAE-dextrán be magas koncentrációk mérgező. A módszer nem terjedt el széles körben a génterápiában;

e) Hisztonok és más sejtmagfehérjék segítségével. Ezek a fehérjék, amelyek sok pozitív töltésű aminosavat (Lys, Arg) tartalmaznak, természetes körülmények között segítenek tömören tömöríteni egy hosszú DNS-láncot egy viszonylag kis sejtmagba.

2. Fizikai módszerek:

a) Az elektroporáció nagyon népszerű módszer; A membrán permeabilitásának azonnali növelése érhető el, ha a sejteket rövid ideig tartó intenzív elektromos tér hatásának teszik ki. Kimutatták, hogy optimális körülmények között a transzformánsok száma elérheti a túlélő sejtek 80%-át. Embereknél jelenleg nem alkalmazzák (6. ábra).

6. ábra

b) A „sejtpréselés” egy 2013-ban feltalált módszer, amely lehetővé teszi, hogy a sejtmembrán „finom összenyomásával” molekulákat juttathassunk a sejtekbe. A módszer kiküszöböli a toxicitás vagy a rossz célzás lehetőségét, mivel nem támaszkodik külső anyagokra vagy elektromos mezőkre;

c) A sonoporáció olyan módszer, amellyel az idegen DNS-t mesterségesen juttatják a sejtekbe, ultrahanggal, pórusok nyílását okozva a sejtmembránban;
d) Optikai transzfekció - olyan módszer, amelyben egy kis lyukat készítenek a membránon (körülbelül 1 μm átmérőjű) erősen fókuszált lézerrel;
e) Hidrodinamikai transzfekció - módszer genetikai konstrukciók, fehérjék stb. a kapillárisok és az intercelluláris folyadék szabályozott nyomásnövekedésével, ami rövid távú permeabilitásnövekedést okoz sejtmembránokés átmeneti pórusok kialakulása bennük. A szövetbe történő gyors injekcióval történik, és a bejuttatás nem specifikus. Szállítási hatékonyság a vázizomzatban - 22-60% ;

f) DNS mikroinjektálása - vékony üveg mikrotubulusok segítségével (d=0,1-0,5 µm) bejuttatjuk egy állati sejt magjába. Hátránya a módszer bonyolultsága, nagy a valószínűsége a sejtmag vagy a DNS megsemmisülésének; korlátozott számú sejt transzformálható. Nem emberi használatra.

3. Részecske alapú módszerek.

a) A transzfekció közvetlen megközelítése egy génpisztoly, amelyben a DNS-t inert szilárd anyagokkal (általában arany, wolfram) nanorészecskévé kötik össze, amelyet aztán a célsejtek magjaiba irányítanak. Ezt a módszert alkalmazzák in vitroÉs in vivo gének bejuttatására, különösen izomszövetsejtekbe, például olyan betegségben, mint a Duchenne-izomdystrophia. Az aranyrészecskék mérete 1-3 mikron (7. ábra).

7. ábra

b) A magnetofekció egy olyan módszer, amely a mágnesesség erőit használja a DNS célsejtekhez való eljuttatására. Először a nukleinsavakat (NA) kötik össze a mágneses nanorészecskékkel, majd mágneses tér hatására a részecskék bejutnak a sejtbe. A hatékonyság majdnem 100%, nyilvánvaló, hogy nem mérgező. 10-15 percen belül a részecskék regisztrálódnak a sejtben - ez sokkal gyorsabb, mint más módszerek.
c) Impalement, lit. "impalement" + "infection") - nanoanyagokat, például szén nanocsöveket és nanoszálakat használó szállítási módszer. Ebben az esetben a sejteket szó szerint átszúrja egy nanofibrillák rétege. A „nano” előtagot a nagyon kis méretek (a méter milliárdod részén belül) jelölésére használják (8. ábra).

8. ábra

Külön érdemes kiemelni egy olyan módszert, mint az RNS-transzfekció: nem a DNS-t szállítják a sejtbe, hanem az RNS-molekulák - ezek „utódjai” a fehérje bioszintézis láncában; ilyenkor speciális fehérjék aktiválódnak, amelyek az RNS-t rövid darabokra vágják - az ún. kis interferáló RNS (siRNS). Ezek a fragmentumok más fehérjékhez kötődnek, és végső soron ez a megfelelő gének sejt expressziójának gátlásához vezet. Ily módon blokkolható azon gének működése a sejtben, amelyek jelenleg több kárt okoznak, mint használnak. Az RNS-transzfekciót széles körben alkalmazzák, különösen az onkológiában.

Áttekintjük a plazmidvektorok használatával történő génszállítás alapelveit. Most áttérhetünk a vírusos módszerek mérlegelésére. A vírusok nem sejtes életformák, leggyakrabban fehérjehéjba csomagolt nukleinsavmolekulából (DNS vagy RNS) állnak. Ha a vírus genetikai anyagából kivágjuk mindazokat a szekvenciákat, amelyek betegségeket okoznak, akkor az egész vírust is sikeresen génünk „hordozójává” alakíthatjuk.

A DNS sejtbe vírus által közvetített bejuttatásának folyamatát ún transzdukció.
A gyakorlatban a leggyakrabban használt retrovírusok, adenovírusok és adeno-asszociált vírusok (AAV). Először is érdemes kitalálni, hogy mi legyen az ideális jelölt a vírusok közötti transzdukcióhoz. A kritériumok a következők:

Stabil;
. nagy kapacitású, azaz elegendő mennyiségű DNS befogadására;
. közömbös a sejt metabolikus útjaihoz képest;
. pontos - ideális esetben a genomját a gazdamag genomjának egy specifikus lokuszába kell integrálnia stb.

A való életben nagyon nehéz legalább több pontot összevonni, ezért általában az egyes esetek külön-külön mérlegelésekor történik a választás (9. ábra).

9. ábra

A felsorolt ​​három leggyakrabban használt vírus közül a legbiztonságosabb és egyben legpontosabb az AAV. Szinte egyetlen hátrányuk a viszonylag kis kapacitásuk (kb. 4800 bp), amely azonban sok gén számára elegendőnek bizonyul. .

A felsorolt ​​módszerek mellett gyakran alkalmazzák a génterápiát sejtterápiával kombinálva: először bizonyos emberi sejtek tenyészetét tápközegbe ültetik, majd a szükséges géneket így vagy úgy bejuttatják a sejtekbe, tenyésztik. egy ideig és újra átültetik a gazdaszervezetbe. Ennek eredményeként a sejtek visszaállíthatók normál tulajdonságaikba. Így például az emberi fehérvérsejteket (leukocitákat) módosították leukémiára (10. ábra).

10. ábra

A gén sorsa a sejtbe jutás után

Mivel a vírusvektorokkal többé-kevésbé minden világos, mivel képesek hatékonyabban eljuttatni a géneket a végső célhoz - a sejtmaghoz, ezért a plazmidvektor sorsán fogunk elidőzni.

Ebben a szakaszban elértük, hogy a DNS átjutott az első nagy gáton - a sejt citoplazmatikus membránján.

Ezután más anyagokkal kombinálva, burkolt vagy nem, el kell jutnia a sejtmaghoz, hogy egy speciális enzim - az RNS-polimeráz - hírvivő RNS (mRNS) molekulát szintetizáljon egy DNS-mátrixon (ezt a folyamatot ún. átírása). Csak ezután kerül az mRNS a citoplazmába, komplexet képez a riboszómákkal és a genetikai kód polipeptidet szintetizálnak - például vaszkuláris növekedési faktort (VEGF), amely bizonyos terápiás funkciót kezd betölteni (ebben az esetben elindítja az érelágazás kialakulását az ischaemiára érzékeny szövetekben).

Ami a bevitt gének expresszióját illeti a kívánt sejttípusban, ezt a problémát a transzkripciót szabályozó elemek segítségével oldjuk meg. Azt a szövetet, amelyben az expresszió megtörténik, gyakran egy szövetspecifikus enhanszer („fokozó” szekvencia) és egy specifikus promoter (olyan nukleotidszekvencia, amelyből az RNS-polimeráz szintézisét kezdi) kombinációja határozza meg, amely indukálható lehet. . Ismeretes, hogy a génaktivitás módosítható in vivo külső jelek, és mivel az enhanszerek bármilyen génnel működhetnek, a vektorokba szigetelőket lehet bevinni, amelyek elősegítik az enhanszer működését helyzetétől függetlenül, és funkcionális gátként működhetnek a gének között. Mindegyik enhanszer tartalmaz egy sor kötőhelyet a fehérjefaktorok aktiválásához vagy elnyomásához. A promóterek a génexpresszió szintjének szabályozására is használhatók. Például vannak metallotionein vagy hőmérséklet-érzékeny promoterek; hormonok által szabályozott promóterek.

Egy gén expressziója a genomban elfoglalt helyétől függ. A legtöbb esetben a létező vírusos módszerek csak egy gén véletlenszerű beépülését eredményezik a genomba. Az ilyen függőség kiküszöbölésére a vektorok konstruálásakor a gént ismert nukleotidszekvenciákkal látják el, amelyek lehetővé teszik a gén expresszióját, függetlenül attól, hogy a genomba hol van beépítve.

A transzgén expressziójának szabályozásának legegyszerűbb módja, ha olyan indikátor promoterrel látjuk el, amely érzékeny egy fiziológiai jelre, például glükózfelszabadulásra vagy hipoxiára. Az ilyen „endogén” szabályozási rendszerek bizonyos helyzetekben hasznosak lehetnek, például az inzulintermelés glükózfüggő szabályozásában. Az „exogén” kontrollrendszerek megbízhatóbbak és univerzálisabbak, ha a génexpressziót farmakológiailag szabályozzák egy kis gyógyszermolekula bejuttatásával. Jelenleg 4 fő szabályozási rendszer ismeretes - a tetraciklin (Tet), a rovarszteroid, az ekdizon vagy analógjai, a progesztin elleni gyógyszer, a mayfpristone (RU486) és a kémiai dimerizálók, például a rapamicin és analógjai szabályozzák. Mindegyik magában foglalja a transzkripciós aktivációs domén gyógyszerfüggő vonzását a kívánt gént vezető fő promoterhez, de különböznek a vonzás mechanizmusaiban .

Következtetés

Az adatok áttekintése lehetővé teszi, hogy arra a következtetésre juthassunk, hogy a világ számos laboratóriumának erőfeszítései ellenére minden már ismert és tesztelt in vivoÉs in vitro A vektorrendszerek messze nem tökéletesek . Ha probléma adódik az idegen DNS bejuttatásával in vitro gyakorlatilag megoldott, és eljuttatása különböző szövetek célsejtjébe in vivo sikeresen megoldott (elsősorban receptorfehérjéket, köztük bizonyos szövetekre specifikus antigéneket hordozó konstrukciók létrehozásával), akkor a meglévő vektorrendszerek egyéb jellemzői - az integráció stabilitása, szabályozott expressziója, biztonsága - még komoly fejlesztéseket igényelnek.

Ez mindenekelőtt az integráció stabilitását érinti. Eddig a genomba való integrációt csak retrovirális vagy adeno-asszociált vektorok alkalmazásával sikerült elérni. A stabil integráció hatékonysága növelhető génkonstrukciók, például receptor-mediált rendszerek fejlesztésével, vagy kellően stabil episzómális vektorok (vagyis olyan DNS-struktúrák) létrehozásával, amelyek hosszú ideig képesek a sejtmag belsejében tartózkodni. Az utóbbi időben különös figyelmet fordítanak az emlős mesterséges kromoszómákon alapuló vektorok létrehozására. A közönséges kromoszómák alapvető szerkezeti elemeinek jelenléte miatt az ilyen mini-kromoszómák hosszú ideig megmaradnak a sejtekben, és képesek a megfelelő működéshez szükséges teljes méretű (genomiális) géneket és azok természetes szabályozóelemeit hordozni. a génről, a megfelelő szövetben és a megfelelő időben.

A gén- és sejtterápia ragyogó távlatokat nyit az elveszett sejtek és szövetek helyreállítására, valamint a szervek géntechnológiai tervezésére, ami kétségtelenül jelentősen kibővíti az orvosbiológiai kutatások módszereinek arzenálját, és új lehetőségeket teremt az emberi élet megőrzésére és meghosszabbítására.

Egészség

A hibás gének egészségesekkel való helyettesítésének koncepciója, amely a múlt század kilencvenes éveiben kezdett aktívan megszerezni a tudományos burkot, úgy tűnt, reményt adna a legreménytelenebb betegeknek. Az első, 1990-ben elvégzett génterápiás kísérlet óta azonban a tudósok optimizmusa némileg alábbhagyott – és mindez a génterápiás módszerek végrehajtásának bizonyos kudarcai és nehézségei miatt. Azonban a génterápia kínálta lehetőségek a Parkinson-kór kezelésében cisztás fibrózis, különféle típusok a rák és sok más betegség valóban határtalan. A tudósok ezért fáradhatatlanul dolgoznak, igyekszik leküzdeni a génterápiával kapcsolatos összes nehézséget, amely az út során felmerül.

Mi az a génterápia?

Tehát mi is valójában a génterápia? A válasz érdekében ez a kérdés, emlékeztetni kell arra Testünkben a gének fő funkciója a fehérjetermelés szabályozása, minden sejt normális működéséhez és egészségéhez szükséges. De bizonyos genetikai hibák (a gének hibái) megakadályozzák ezek végrehajtását fő funkció, ilyen vagy olyan mértékben megakadályozza a fehérjék termelődését. A génterápia (génterápia) célja az a hibás géneket egészségesekre cserélni. Ez segít létrehozni a megfelelő fehérje szaporodását, ami azt jelenti, hogy a személy meggyógyul egy bizonyos betegségből.

Ha figyelembe vesszük az ideális fejlesztési forgatókönyvet, a sejtek a korrigált dezoxiribonukleinsav (DNS) molekulák osztódni kezd, és a korrigált gén több másolatát állítja elő, ami lehetővé teszi a szervezet számára, hogy megszabaduljon a genetikai rendellenességtől, és teljesen meggyógyuljon. Az egészséges gének bejuttatása a beteg sejtekbe (valamint a megfelelő rendellenességek korrigálása) azonban rendkívül összetett folyamat, ami eddig ritkán vezetett sikerre. Ezért a legtöbb modern kutatás célja, hogy biztonságos és megbízható mechanizmusokat fejlesszen ki gének bejuttatására a sérült sejtekbe.

A génterápia típusai: ex vivo és in vivo terápia

A DNS-nek a páciens genomjába történő bejuttatásának módjától függően génterápia is végezhető akár sejttenyészetben (ex vivo), akár közvetlenül a szervezetben (in vivo). Az ex vivo génterápiával a sejteket eltávolítják a páciens szervezetéből, genetikailag módosítják, majd visszajuttatják az egyén szervezetébe. Ez a módszer különösen hasznos a vérbetegségek kezelésében, mivel a vérsejtek könnyen eltávolíthatók és visszahelyezhetők. A legtöbb egyéb betegség esetében azonban a sejtek eltávolítása a szervezetből és visszajuttatása nem ilyen egyszerű. Például, genetikai okok által okozott szívbetegségek esetén, hatékony intézkedés az úgynevezett in vivo génterápia, amikor a génváltozásokat közvetlenül a páciens szervezetében hajtják végre. Annak érdekében, hogy megtegye ezt az eljárást, a genetikai információ közvetlenül a sejtbe kerül egy vektoron keresztül - egy nukleinsav molekulán, géntechnológiában genetikai anyag átvitelére használják. A legtöbb esetben az átvitel érdekében a kutatók olyan vírusokat használnak, amelyek nem veszélyesek az egészségre és az életre.

Genetikai információ sejtbe juttatásának módszerei

Amint azt számos tanulmány mutatja, a különféle vírusok alkalmazása nagyon hatékony megoldás, amely lehetővé teszi a szervezet immunvédelmének átjutását, majd megfertőzi a sejteket, felhasználva a vírus terjesztésére. Ennek az eljárásnak a végrehajtásához a génmérnökök a retrovírusok és adenovírusok csoportjából választották ki a legmegfelelőbb vírusokat. A retrovírusok ribonukleinsav (RNS) formájában juttatják be a genetikai információt, amely a DNS-hez hasonló molekula, amely segít feldolgozni a DNS-ben tárolt genetikai információkat. Amint lehetséges mélyen behatolni az úgynevezett célsejtbe, a DNS-molekula másolatát nyerik ki az RNS-molekulából. Ezt a folyamatot fordított transzkripciónak nevezik. Amint egy új DNS-molekula kapcsolódik egy sejthez, a sejt minden új másolata tartalmazza ezt a módosított gént.

Az adenovírusok genetikai információt közvetlenül hordoznak DNS formájában, amelyet egy nem osztódó sejtbe juttatnak. Habár ezek a vírusok közvetlenül a célsejt magjába juttatják a DNS-t, a DNS nem egyezik a sejt genomjával. Így a módosított gén és genetikai információ nem kerül át a leánysejtekbe. Az adenovírusok felhasználásával végzett génterápia előnye, hogy vektoron keresztül lehet géneket juttatni az idegrendszer sejtjeibe és a légutak nyálkahártyájába. Ezen kívül létezik egy harmadik génterápia módszere is, amelyet az úgynevezett adeno-asszociált vírusokon keresztül hajtanak végre. Ezek a vírusok tartalmaznak viszonylag kis mennyiségű genetikai információ, és sokkal nehezebb eltávolítani őket, mint a retrovírusokat és az adenovírusokat. Az adeno-asszociált vírusok előnye azonban, hogy nem váltanak ki reakciót az emberi immunrendszerből.

Nehézségek a vírusok génterápiában történő alkalmazásakor

A genetikai információ vírusokon keresztüli sejtbe juttatásának módszerével kapcsolatos fő probléma az rendkívül nehéz a gének célsejttel való kapcsolatát teljesen ellenőrizni. Ez rendkívül veszélyes lehet, mivel az úgynevezett génexpresszió, amely átalakulhat egészséges sejteket rákosakba. Jelenleg ez a probléma különösen sürgős a retrovírusokkal való munka során. Második probléma melynek megoldását még nem lehet megszervezni, hogy a génterápia alkalmazásának egy eljárása legtöbbször nem elegendő. A legtöbb genetikai terápiát időről időre meg kell ismételni. Harmadszor pedig a vírusok genetikai információ sejtbe juttatására történő felhasználását bonyolítja a szervezet immunrendszerének reakcióinak kockázata. Ez is rendkívül súlyos probléma, különösen olyan esetekben, amikor amikor a génterápiás eljárás többszöri megismétlésére van szükség, ahogy a páciens szervezete fokozatosan alkalmazkodik, és egyre hatékonyabban kezd felvenni a harcot a befecskendezett vírusokkal.

Génterápia: a kutatás folytatódik

Ha sikerekről beszélünk, akkor jelenleg a genetikai terápia rendkívül hatékony intézkedés az úgynevezett kombinált immunhiány kezelésében, amely az X kromoszóma génhez kapcsolódik. Másrészt nagyon kevés olyan eset van, amikor a génterápiát sikeresen alkalmazzák e betegség kezelésére. Ezenkívül maga a kezelés kockázatos, mert számos olyan tünetet okozhat a betegeknek, amelyek a leukémiában szenvedőknél gyakoriak. Ettől a betegségtől eltekintve nagyon-nagyon kevés olyan génterápia van, amely ilyen hatékony lenne, bár a legújabb tanulmányok reményt adnak a génterápia korai alkalmazásáraízületi gyulladásban, agyrákban, sarlósejtes betegségben, retinahasadékban és néhány egyéb betegségben szenvedő betegek kezelésére.

Kiderül, hogy kb praktikus alkalmazás A génterápiáról az orvostudományban még nagyon korai beszélni. Mindazonáltal, A kutatók továbbra is keresik a génterápia biztonságos és hatékony alkalmazásának módjait, miután költött a legtöbb a testből mesterséges külső környezetbe átvitt élő szövetekkel végzett kísérletek. E kísérletek között rendkívül érdekesek azok a vizsgálatok, amelyekben a tudósok egy mesterséges 47. kromoszómát próbálnak bevinni egy célsejtbe. A legújabb tudományos kutatások lehetővé tették a tudósok számára a folyamatok jobb megértését RNS-molekula bevezetése során fellépő. Ez lehetővé tette egy olyan mechanizmus kifejlesztését, amely elnyomja a géntranszkripciót (úgynevezett génleállás), ami előnyös lehet a Hamilton-kór kezelésében. A tudósok arról is beszámoltak, hogy sikerült kifejleszteniük egy olyan módszert, amellyel genetikai információkat juttathatnak el az agysejtekbe, amit korábban vektorral nem lehetett megtenni. mivel ez a molekula túl nagy volt erre a célra. Vagyis a kutatás folytatódik, ami azt jelenti, hogy az emberiségnek minden esélye megvan arra, hogy a génterápiás módszerek segítségével megtanulja a betegségek elleni küzdelmet.