Teste serologice de sânge pentru diagnosticul de sifilis. Reacție de legare complimentă sau RSK. Descifrarea rezultatelor pentru sifilis: plusuri, încrucișări și credite

Teste treponemale pentru sifilis. Descriere generala.

Pentru a diagnostica în mod fiabil sifilisul și a identifica anticorpii anti-sifilitici în corpul pacientului (în serul de sânge sau lichidul cefalorahidian), sunt utilizate tehnologii speciale de cercetare de laborator - așa-numitele metode serologice.

La efectuarea testelor de diagnostic pentru sifilis se folosesc diverse reacții serologice: aglutinare, precipitare, imunofluorescență, fixare a complementului, imunotest enzimatic etc. Toate aceste reacții serologice se bazează pe interacțiunea antigenelor și anticorpilor.

Se numesc teste serologice specifice treponemală deoarece aceste teste folosesc treponema pallidum sau antigenele acestuia, adică antigene de origine treponemă. Scopul testelor treponemale este de a identifica anticorpi specifici la structurile antigenice ale agentului cauzal al sifilisului, adică anticorpi direcționați în mod specific împotriva bacteriilor T. Pallidum înseși și nu împotriva țesuturilor corpului afectate de treponem. Anticorpii antitreponemici specifici din clasa IgM pot fi detectați încă de la sfârșitul celei de-a doua săptămâni de boală.

7. Rezultate fals pozitive și fals negative

Un test PB pozitiv pentru sifilis la persoanele care nu au boala se numește fals pozitiv. Frecvența rezultatelor fals pozitive la indivizii sănătoși este de 0,2-0,25%. Dacă procentul de rezultate fals pozitive nespecifice ale RV la persoanele sănătoase este foarte scăzut, atunci în unele boli poate fi ridicat.

Toate rezultatele nespecifice ale reacțiilor serologice pot fi împărțite în următoarele grupuri principale:

1. Boli cauzate de prezența antigenelor obișnuite la agenți patogeni similari (spirochete): febră recidivă, iacă, bejel, pint, treponem oral, leptospira.

2. Reacții pozitive datorate modificărilor metabolismului lipidic și modificărilor globulinelor serice. Acestea includ rezultate pozitive la femeile însărcinate cu gută, tulburări de compoziție lipidică ca urmare a otrăvirii cu plumb, fosfor, după administrarea de salicilat de sodiu, digitalică etc. Aceste reacții ar trebui să includă și reacții pozitive în anumite boli infecțioase (tifus, malarie, pneumonie , lepra, endocardita, colagenoza, infarctul miocardic, comotia cerebrala, cancerul, ciroza hepatica etc.)

3. Erori tehnice de conduită. Alegere incorectă doze de complement, nerespectarea condițiilor și termenilor de păstrare a reactivilor, excluderea din reacția probelor martor de ser sanguin, utilizarea eprubetelor și instrumentelor contaminate.

8. Modificarea reacţiei Wassermann

Există modificări ale reacției Wasserman în versiuni calitative și cantitative, la rece, cu lichidul cefalorahidian.

Modificarea RV la frig părea a fi mai sensibil. O caracteristică a metodei de setare a reacției Wasserman la rece este regimurile de temperatură în trei faze la care se realizează legarea complementului. Această reacție se pune și cu cardiolipină și antigen treponemal.

Pe lângă evaluarea calitativă a RW, există o metodă pentru aceasta stabilirea cantitativă cu diferite diluții de ser sanguin (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titrul de reagină este determinat de diluția maximă, care dă totuși un rezultat puternic pozitiv (4+). Formularea cantitativă a RV este importantă în diagnosticul unor forme de sifilis și în monitorizarea eficacității terapiei.

9. Domeniul de aplicare

În Rusia, RSKt face parte din complexul de teste serologice standard pentru sifilis (SSR).

Reacția Wasserman cu antigen treponemic și cardiolipin (RSKt) este folosită pentru

• diagnosticul tuturor formelor de sifilis,
• controlul asupra eficacității tratamentului,
• examinări ale persoanelor care au avut contact sexual cu un pacient cu sifilis,
• examinări ale persoanelor cu suspiciune clinică și anamnestică de sifilis
• în timpul examinării preventive pentru sifilis a pacienților din spitalele psihiatrice și neurologice, a donatorilor și a femeilor însărcinate, inclusiv a persoanelor îndrumate pentru întreruperea artificială a sarcinii.

În prezent, prin ordin al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, se recomandă înlocuirea RSKT cu metode treponemale mai sensibile (ELISA sau RPHA).

În străinătate, reacția Wasserman cu antigenul treponemal nu a fost folosită în practica clinică de laborator de mult timp și nu este inclusă în lista de teste standard recomandate de Organizația Mondială a Sănătății.

Complex de reacții serologice clasice (CSR)

DAC- Acest complex de reacție folosit pentru serodiagnosticul sifilisului ca metoda standard. Acest complex de reacții include reacția Wassermann cu antigenul cardiolipin (un extract din inima taurului îmbogățit cu lecitină și colesterol) și antigenul treponemal (o suspensie de treponeame palide culturale apatogene tratate cu ultrasunete), precum și o reacție de microprecipitare (RMP). ) cu plasmă sau ser inactivat, care se plasează cu antigen cardiolipin

CSR devine pozitivă la mijlocul perioadei primare (diviziunea sa în seronegativ și seropozitiv este determinată precis de CSR), în perioada secundară CSR este pozitivă la 98-100% dintre pacienți, iar în perioada terțiară - doar la 60-70 %. Adică, pe măsură ce durata bolii crește, pozitivitatea CSR scade treptat.

Avantajele KSR:

1) Ieftin, simplitate și viteza de setare. Acest lucru este caracteristic în special reacției de microprecipitare: RMP este în prezent principala metodă de screening (selecție);

2) Testele non-treponemale sunt convenabile de utilizat pentru a monitoriza vindecarea sifilisului.

Dezavantajele CSR:

1) Subiectivitatea evaluării rezultatelor reacțiilor („prin ochi”);

2) Sensibilitate scăzută în formele tardive de sifilis;

3) Lipsa de specificitate în comparație cu testele mai moderne. Când sunt efectuate, sunt adesea observate reacții fals pozitive (LPR).

LPR se poate datora reactivității încrucișate între spirochete palide și alți microbi, tulburări ale metabolismului lipidelor și proteinelor, instabilității membranei celulare și formării de autoanticorpi. LPR se notează în infecții acute (malarie, mononucleoză infecțioasă etc.) și cronice (tuberculoză, lepră, hepatită, borelioză etc.), infarctul miocardic, ciroza hepatică, colagenoze (în special în LES), oncopatologie, vaccinare, consum de droguri, abuzul de alcool și alimente grase. Fals-pozitiv poate fi CSR în ultimele săptămâni de sarcină, după naștere și la unele femei în timpul menstruației. Rezultatele CSR fals negative pot fi asociate cu infecția cu HIV.

RIT, RIBT - Reacția de imobilizare a treponemului palid

Testul de imobilizare Treponema pallidum (TPI; Testul de imobilizare Treponema pallidum, TPI) este o metodă clasică care servește la depistarea anticorpilor specifici treponemici. Reacția RIBT folosește treponema pallidum patogen T. pallidum (tulpina Nichols) crescută în testiculele de iepure ca antigen. RIBT se bazează pe pierderea mobilității treponeamelor palide vii după expunerea la anticorpi din serul sanguin și complementul pacientului. Rezultatele sunt evaluate prin microscopie în câmp întunecat. În ciuda faptului că testul RIBT a fost introdus în practica clinică ca un test specific pentru sifilis, este laborios, complex din punct de vedere tehnic, consumator de timp și costisitor de utilizat.

1. Istoricul metodei RIBT

Testul de imobilizare Treponema pallidum (TPRT) este de fapt primul test specific pentru diagnosticul de sifilis. Această reacție a fost prezentată în 1949 de cercetătorii americani Nelson și Mayer (R. W. Nelson și M. M. Mayer) și discutată în detaliu în lucrări științifice din deceniile următoare. Au mai fost făcute încercări nereușite de a utiliza treponeme vii în teste. Datorită faptului că Nelson a reușit să creeze un mediu în care treponemele au rămas viabile până la 8 zile, cercetările sale au fost încununate de succes.

2. Principiul metodei RIBT

Metoda se bazează pe fenomenul de pierdere a mobilității prin treponeame palide în prezența anticorpilor antitreponemici imobilizatori ai serului sanguin și al complementului studiat în condiții anaerobe. Antigenul este treponemul pal patogen viu obținut de la iepuri infectați artificial cu sifilis.

3. Configurarea testului RIBT

Serul de testat, complementul și antigenul participă la reacție. Pentru a trăi treponemul obținut din țesuturile testiculului unui iepure după o infecție artificială, adăugați serul de sânge al subiectului de testat. În prezența anticorpilor anti-treponemici-imobilizine în ser, treponeamele palide încetează să se miște (imobilizate). Anticorpii imobilizini sunt anticorpi antitreponemici tardivi.

Reacția se realizează cu seruri inactivate la căldură sau cu probe de ser uscate pe hârtie cerată (picături uscate). Inactivarea serului prin încălzire se efectuează timp de 30 de minute la o temperatură de 56°C. Înainte de a lua sânge, subiectul nu trebuie să primească medicamente, în special preparate cu penicilină. Luarea medicamentelor este anulată pe durata acestora posibila intarziereîn organism.

Ca antigen, se folosesc bacterii din tulpina Nichols, obținute dintr-o orhită sifilitică de iepure de 7-10 zile (inflamație testiculară). Perioada de la momentul inițierii reacției până la înregistrarea rezultatelor acesteia durează 18-20 de ore, prin urmare, este necesar un mediu de supraviețuire pentru a menține viabilitatea și buna mobilitate a microorganismelor.

RIBT folosește complement de cobai. Pentru a obține complement, sângele trebuie luat în condiții sterile de la mai mulți cobai.

În caz de contaminare bacteriană, complementul este aruncat. Nu poate fi utilizat în reacția de imobilizare a treponemului palid al complementului conservat, tk. este toxic pentru microorganisme.

În reacția de imobilizare se folosește un exces de complement. Cantitatea sa depinde în mare măsură de mediul de supraviețuire pentru treponemul palid.

RIBT se pune în cutii sterile, iradiate în prealabil cu o lampă bactericidă de cuarț timp de 45-60 de minute. Fiecare ser de sânge este examinat în două eprubete: cu experientaȘi Control. În ambele eprubete se adaugă serul de testat și antigenul în cantitățile necesare. Complementul activ este turnat în eprubetă și aceeași cantitate de ser de sânge inactivat de cobai este turnată în tubul de control. După umplere, conținutul tuburilor este amestecat prin agitare ușoară.

RIBT se desfășoară în condiții anaerobe. Eprubete cu ingrediente sunt plasate într-un microaerostat, din care aerul atmosferic este aspirat de o pompă de vid și un amestec de gaz este injectat dintr-un cilindru (95 părți azot și 5 părți azot). dioxid de carbon). Microanaerostatul cu eprubete se pune într-un termostat (35°C) timp de 18-20 ore.

Evaluarea rezultatelor RIBT se efectuează după îndepărtarea eprubetelor din termostat și microanaerostat (adică după 18-20 de ore de experiență). Cu o pipetă Pasteur, o picătură din conținutul eprubetei este aplicată pe o lamă de sticlă, care este acoperită cu o lamă și examinată în câmpul întunecat al unui microscop (obiectiv 40, ocular 10X). Mai multe câmpuri vizuale sunt examinate în diferite părți ale preparatului, numărând numărul de treponeme palide mobile și imobile din fiecare. Numărarea începe cu medicamentul de la control și apoi din eprubetă.

La stabilirea reacției se folosesc 5 studii de control: cu seruri sanguine evident pozitive și negative, cu complement activ și inactivat și mediu de supraviețuire pentru treponemul palid. Serul sanguin de control negativ este utilizat pentru a evalua gradul de mobilitate al treponemului palid în acest experiment. Ser sanguin de control pozitiv - pentru a evalua gradul de activitate de imobilizare în condițiile acestui experiment. Studiul complementului activ și inactivat și al mediului este efectuat pentru a determina efectul acestora asupra mobilității treponemului palid.

Cu o lipsă de complement în experiment, anticorpii de imobilizare nu își arată activitatea în mod corespunzător și treponeamele rămân mobile. Prin urmare, după experiment, se efectuează determinarea complementului rezidual pentru a evalua dacă mobilitatea treponemelor palide în eprubete s-a datorat lipsei de complement. Pentru aceasta, se folosește un sistem hemolitic - un amestec dintr-o suspensie de eritrocite de berbec și ser hemolitic diluat păstrat într-un termostat.

Complementul rezidual se determină prin adăugarea sistemului hemolitic în volumul necesar în fiecare tub. Tuburile sunt plasate într-un termostat la 37° timp de 45 de minute. În eprubetele experimentale ar trebui să apară hemoliza eritrocitelor, în eprubetele de control ar trebui să existe o întârziere a hemolizei. Absența hemolizei în eprubete indică o cantitate insuficientă de complement, în aceste cazuri studiul trebuie repetat. Examinarea repetată a serului sanguin nu se efectuează numai dacă se observă imobilizarea 100% a treponemelor palide.

4. Contabilitatea rezultatelor RIBT

Treponeamele imobilizate sunt numărate la microscop folosind microscopie în câmp întunecat. Cercetătorului i se cere să aibă abilitățile de a evalua mișcarea treponemelor. Ar trebui să fie atent la intensitatea mișcărilor făcute de treponemul palid. La această bacterie, nu este întotdeauna posibil să se observe contracții în formă de undă și mișcări de flexie, uneori doar de rotație. De asemenea, ar trebui să puteți distinge mișcările active ale treponemelor de mișcarea cu flux de fluid.

Pentru a evalua rezultatele reacției, se calculează procentul de imobilizare a treponeamelor palide, adică raportul dintre treponeamele mobile și imobile din experiment (cu complement activ) și control (cu complement inactiv) conform formulei:

X \u003d (M - C) × 100 / M

unde M este numărul de treponeme mobile din martor; C - numărul de treponeme mobile din experiment; X - % imobilizare. În munca practică, procentul de imobilizare este determinat conform unui tabel prealcătuit folosind formula de mai sus.

Reacția de imobilizare a treponemului palid este estimată ca

• pozitivîn timpul imobilizării 51 - 100% treponem,
• slab pozitiv: 31 - 50% treponeame imobile,
• îndoielnic: 21 - 30% treponeame imobile,
• negativ: 0 - 20% treponeame imobile.

Reacția de imobilizare a treponemului palid devine pozitivă la sfârșitul primarului - începutul perioadei secundare de sifilis (din săptămâna 7-8 din momentul infecției și nu numai). În același timp, RIBT este de puțin folos pentru diagnosticarea stadiilor incipiente ale sifilisului, deoarece anticorpii care imobilizează treponemul palid și sunt determinați în reacție apar doar la 3-6 săptămâni după infecție. Anticorpii-imobilizinele aparțin clasei de imunoglobuline IgG. Ele apar în sânge mai târziu decât reaginele (anticorpi anticardiolipină), mai târziu decât anticorpii fluoresceină (se detectează RIF și ELISA) și precipitinele (se detectează RMP).

În viitor, RIBT rămâne pozitiv. Există o sensibilitate ridicată a reacției în formele târzii de sifilis. Cu sifilis secundar, tardiv, neurosifilis, sifilis congenital, un rezultat pozitiv RIBT este înregistrat în 95-100% din cazuri. Cu sifilis terțiar, cu leziuni specifice organe interne, sistemul nervos, când RV este adesea negativ, RIBT dă rezultate pozitive în 98 - 100% din cazuri.

RIBT a fost mult timp recunoscut ca cel mai specific test pentru sifilis. Conform literaturii de specialitate, specificitatea RIBT este de 99%, sensibilitatea variază de la 79 la 94%. Potrivit TsNIKVI, sensibilitatea RIBT (în total, pentru toate stadiile de sifilis) este de 87,7%.

7. Domeniul de aplicare al metodei

Domeniul de aplicare al RIBT se restrânge treptat din cauza duratei de stabilire, a costurilor ridicate și a intensității forței de muncă. RIBT este o analiză destul de complexă și costisitoare care necesită personal înalt calificat și prezența unui vivarium. Din acest motiv, cererea aceasta metoda a scăzut semnificativ în ultimii ani. În SUA, acest test este utilizat în prezent doar în laboratoarele de cercetare.

Pe baza complexității și a costului ridicat al RIF și RIBT, este logic să le folosiți pentru diagnosticarea formelor tardive și latente de sifilis. RIBT își păstrează poziția de „arbitru de reacție” în diagnosticul diferențial al formelor latente precoce de sifilis și a rezultatelor fals pozitive. Această reacție poate fi utilă în diagnosticarea neurosifilisului și atunci când alte teste serologice sunt inconsistente.

RIBT devine pozitiv mult mai târziu decât RIF și RV. Prin urmare, nu este utilizat pentru a diagnostica formele infecțioase de sifilis.

RIBT, ca și RIF, este foarte lent negativ în procesul de terapie antisifilitică. Ca urmare, este nepotrivit pentru monitorizarea progresului terapiei antisifilitice.

Rezultatele fals-pozitive (FPR) în RIBT sunt rare și se observă în principal într-un număr de treponematoze (yaw, pinta, bejel), care nu se găsesc în Rusia, precum și în lepră, sarcoidoză, LES, tuberculoză, ciroză. ficat și alții. boli rare natura nesifilitică. Odată cu vârsta pacienților, numărul de rezultate fals pozitive ale RIBT crește.

RIBT se poate dovedi a fi fals pozitiv dacă serul de testat conține substanțe treponemicide (de exemplu, peniciline, tetracicline, eritromicină) care provoacă imobilizarea nespecifică a treponemului palid.Acest lucru se poate datora pacientului care ia antibiotice treponemocide, prin urmare, examinarea nu este efectuate la persoanele care au primit antibiotice în ultima lună. Sângele pentru RIBT poate fi examinat nu mai devreme de 2 săptămâni după terminarea antibioticelor și a altor medicamente antisifilitice.

9. Modificări ale reacţiei de imobilizare a treponeamelor palide

Pe lângă tehnica microanaerostatică, există o setare de amestec a RIBT conform N.M. Ovchinnikov. Condițiile anaerobe în timpul formulării reacției sunt create prin plasarea amestecului de reacție într-un melanger (mixer de leucocite), ambele capete sunt închise cu un inel de cauciuc. Tehnica de reacție melange face posibilă renunțarea la o pompă de vid, un cilindru cu un amestec de azot și dioxid de carbon și un microanaerostat. Într-un studiu comparativ pe un material clinic mare, s-au obținut rezultate care nu sunt inferioare tehnicii anaerostatice clasice.

10. Caracteristici, avantaje și dezavantaje ale RIBT

RIBT este o metodă de diagnosticare complexă și costisitoare din punct de vedere tehnic. Tehnologia necesită fonduri semnificative pentru întreținerea iepurilor și testare. Acest test consumator de timp este utilizat în prezent în principal în scopuri științifice. În majoritatea țărilor străine, de aproape 40 de ani, RIBT a fost practic utilizat nu în scopuri de diagnostic, ci doar în activități de cercetare.

Dezavantaje ale reacției:

• RIBT necesită lucru cu treponema pallidum patogen viu din tulpina Nichols, care rămâne infecțioasă pentru oameni, în ciuda adaptării la iepuri
• reacția este complexă, consumatoare de timp și costisitoare
• este necesar un vivarium
• este necesar personal cu înaltă calificare pentru a stabili reacția, a înregistra rezultatele și a menține vivariumul
• subiectivitatea evaluării rezultatelor
• lipsa automatizării
• nu există nicio modalitate de a standardiza această metodă serologică.
• reacția nu este aplicabilă pe fondul terapiei antisifilitice în curs
• incapacitatea de a folosi pentru a controla vindecarea. RIBT la pacienții cu sifilis poate rămâne pozitiv pentru mulți ani (și chiar pentru viață), în ciuda tratamentului complet primit.
• reacția poate da rezultate fals pozitive la pacienții cu tumori maligne, diabet, lepră, boli autoimune, pneumonie, patologie cardiovasculară severă.

Avantajele RIBT sunt:

1) Sensibilitate suficient de mare;

2) Specificitate ridicată.

RIF (reacție de imunofluorescență)

Reacția de imunofluorescență (RIF) este o metodă de diagnosticare expresă pentru detectarea antigenelor microbiene sau detectarea anticorpilor. Testele bazate pe detectarea unui semnal fluorescent sunt considerate una dintre cele cele mai bune teste pentru sifilis.

1. Istoricul metodei

Anticorpul treponemal fluorescent (FTA) a fost dezvoltat pentru prima dată în 1957 de Deacon și colab.(Deacon, Falcone și Harris).

2. Principiul metodei

Metoda RIF se bazează pe faptul că antigenele tisulare sau microbii tratați cu ser imun cu anticorpi marcați cu fluorocromi pot străluci în razele UV ale unui microscop fluorescent. Bacteriile dintr-un frotiu, tratate cu un astfel de ser luminiscent, strălucesc de-a lungul periferiei celulei sub forma unui chenar verde

Ca antigen în RIF, se folosește o suspensie de treponeame palide patogene vii ale tulpinii Nichols din orhită de iepure, care se usucă pe o lamă de sticlă și se fixează cu acetonă. Serul sanguin al pacientului se adaugă la treponeamele palide uscate și fixate cu acetonă pe sticlă.

După spălare, preparatul este tratat cu ser care conține anticorpi împotriva imunoglobulinelor umane marcate cu fluoresceină. Din nou, preparatul este spălat și privit la microscop fluorescent. Dacă serul de testat conține anticorpi anti-fluoresceină treponemică, se va observa o strălucire galben-verde a treponemelor.

3. Metoda de realizare a cercetării prin metoda RIF

Antigenul fixat pe lama de sticlă (treponema pallidum patogen) este procesat de serul de testat. După spălare, preparatul este tratat cu ser fluorescent anti-imunoglobulină umană marcat cu fluorocrom. În acest caz, complexul fluorescent rezultat (globulină anti-umană + tioizocianat de fluoresceină) se leagă de globulina umană de pe suprafața treponemului palid, oferind o strălucire de treponem pal la microscop fluorescent.

Pentru detectarea complexelor antigen-anticorp se folosește ser luminescent, reprezentând imunoglobuline anti-specie (anti-umane) conjugate cu FITC. Prezența anticorpilor la treponem în ser este determinată de strălucirea treponemelor atunci când sunt examinate la microscop fluorescent. Testul se efectuează în versiuni calitative și semi-cantitative.

4. Contabilitatea rezultatelor

Vizualizarea rezultatelor RIF se realizează folosind un microscop fluorescent. Rezultatele sunt evaluate prin gradul de luminescență al treponemelor din preparat. În prezența anticorpilor, strălucirea treponemelor este vizibilă, dar dacă nu au existat anticorpi antitreponemici în ser, atunci treponeamele nu sunt vizibile. Gradul de luminescență al treponemului pal uscat fixat pe sticlă este indicat în „plusuri” (de la „–” la „++++”). Rezultat negativ - fără strălucire sau nivel de fundal - 1+.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să se folosească

Reacția de imunofluorescență (RIF) este destul de sensibilă în toate etapele infecției, de la sfârșitul perioadei de incubație până la sifilisul târziu. Perioada primară de sifilis în cursul clasic începe la 3-4 săptămâni după infecție. RIF devine pozitiv în primele zile ale perioadei primare sau chiar la sfârșitul perioadei de incubație, din a 3-a săptămână după infectare. Rezultatele RIF rămân pozitive în toate perioadele, inclusiv în formele tardive.

RIF devine pozitiv ceva mai devreme decât RW. Potrivit unor rapoarte, RIF pozitiv apare la 80% dintre pacienții cu sifilis seronegativ primar. În perioada secundară, RIF este pozitiv în aproape 100% din cazuri. Este întotdeauna pozitiv sifilis latentși dă 95 - 100% rezultate pozitive în formele tardive ale bolii și sifilisul congenital.

6. Sensibilitate și specificitate

Reacția de imunofluorescență (RIF) este un grup de metode cu sensibilitate și specificitate ridicate. RIF este sensibil în toate etapele infecției, de la perioada de incubație până la sifilisul târziu. Potrivit OMS, sensibilitatea RIF în sifilisul primar este de 70-100%, în sifilisul secundar și tardiv - 96-100%, specificitatea - 94-100%. Potrivit TsNIKVI, sensibilitatea RIF în toate formele de sifilis este de 99,1%.

Specificitatea RIF poate fi crescută prin pretratarea serului de testat cu un sorbent - antigen treponemic ultrasonizat care leagă anticorpii de grup (RIF-abs).

7. Domeniul de aplicare al metodei

RIF se aplică:

• ca reacție de confirmare în sifilisul precoce, latent
• pentru diagnostic retrospectiv
• pentru diferențierea formelor latente de sifilis și rezultatele fals-pozitive ale cercetărilor asupra sifilisului.
• ca test de confirmare pentru neurosifilis.

RIF este utilizat pe scară largă ca test de confirmare, dar nu este destinat utilizării de rutină sau screening-ului, deoarece este dificil de configurat din punct de vedere tehnic. Pentru a efectua RIF, este necesar să aveți un vivarium sau să achiziționați o suspensie de treponeame palide patogene, ceea ce limitează posibilitatea unei reacții. Cu toate acestea, în ultimii ani, pe piața internă au început să apară sisteme de testare, permițând efectuarea reacției în absența unui vivarium și a propriei tulpini de laborator de treponema pallidum patogen.

8. Surse și cauze ale erorilor de punere în scenă, fals pozitive și fals negative

LPR la setarea RIF sunt rare (cu colagenoze, borrelioză).

RIF este încă considerat unul dintre cele mai bune teste pentru sifilis, „standardul de aur” al serodiagnosticului. RIF în comparație cu RIBT este mai ușor de configurat,

În ciuda valorii ridicate de diagnostic, necesitatea utilizării T. pallidum viu, costul ridicat și durata studiului împiedică introducerea pe scară largă a RIF în practica de zi cu zi. Configurarea reacției este laborioasă. În plus, evaluarea rezultatelor RIF este subiectivă.

Avantajele RIFși RIBT sunt:

1) Sensibilitate ridicată (în special pentru RIF);

2) Specificitate ridicată (în special pentru RIBT).

Dezavantajele RIFși RIBT:

1) Complexitate tehnică, cost ridicat al metodelor.

2) Evaluarea subiectivă a rezultatelor, lipsa automatizării;

3) RIF și RIBT la pacienții cu sifilis pot rămâne pozitive mulți ani (și chiar pe viață), în ciuda tratamentului complet primit. Prin urmare, aceste reacții nu pot fi folosite pentru a controla vindecarea.

10. Modificări de metodă

În practică, pentru serodiagnosticul sifilisului, sunt utilizate și au fost utilizate mai multe modificări ale reacției de imunofluorescență:

• RIF-abs- cea mai sensibilă metodă de serodiagnostic a sifilisului, devine pozitivă mai devreme decât alte reacții (din a 3-a săptămână de la infectare);
• RIF-200(serul pacientului este diluat de 200 de ori la prezentare) este o metodă foarte specifică pentru serodiagnosticul sifilisului.
• RIF-10(diluția de 10 ori a serului de testat) - o metodă mai sensibilă decât RIF-200.
• RIF-c efectuat cu lichior.
• RIF-abs-IgM- depistarea precoce a anticorpilor antitreponemici din clasa IgM.

1. Cea mai răspândită modificare RIF-abs- reacție de imunofluorescență cu absorbție. Înainte de a stabili reacția, serul subiectului este epuizat cu un amestec de treponeame nepatogene pentru a exclude reacțiile încrucișate. Anticorpii de grup sunt îndepărtați din serul studiat folosind treponeame culturale distruse de ultrasunete, ceea ce crește semnificativ specificitatea reacției. Deoarece serul de testat este utilizat într-o diluție de 1:5, RIF-abs este foarte sensibil.

Principalele indicații pentru utilizarea RIF-abs în practica clinica sunt:

• diagnosticul formelor latente și tardive de sifilis,
• detectarea rezultatelor fals pozitive ale CSR și RMP, în special la pacientele gravide și somatice cu suspiciune de sifilis;
• pentru a stabili un diagnostic retrospectiv al bolii.

RIF-abs nu este foarte informativ în evaluarea rezultatelor tratamentului: la 85% dintre pacienții care au primit terapie antisifilitică adecvată, rezultatele pozitive ale RIF persistă mulți ani.

Această reacție este numită „standardul de aur” pentru serodiagnosticul sifilisului. Este utilizat pentru cazuri de arbitraj, dar pentru un rezultat fiabil este necesară o suspensie concentrată proaspătă de T. pallidum tulpina Nichols de la orhită de 7 zile la un iepure, care nu trebuie înghețată.

2. În URSS a fost instalat în două versiuni - RIF-10Și RIF-200, adică cu o diluție a serului de testat de 10 și 200 de ori. RIF-200 - serul de testat este diluat de 200 de ori pentru a reduce numărul de rezultate fals pozitive. Acest lucru oferă o specificitate ridicată a reacției, dar sensibilitatea acesteia scade oarecum. RIF-10 este mai sensibil, dar mai des dă rezultate pozitive nespecifice, decât RIF-200, care se caracterizează printr-o specificitate ridicată. RIF-10 este mai sensibil, RIF-200 și RIF-abs sunt mai specifice.

Sensibilitatea RIF-200 și RIF-abs este estimată la 84–99%, iar specificitatea este de 97–99%.

3. RIF-c efectuat cu lichior. Reacția este setată folosind lichidul cefalorahidian întreg pentru a identifica leziuni specifice ale SNC.

4. Reacție RIF-abs-IgM propus pentru detectarea precoce a anticorpilor antitreponemici din clasa IgM. Această reacție poate fi utilizată pentru a diagnostica sifilisul congenital, formele precoce de sifilis și pentru a diferenția între cazurile de reinfecție și serorecădere.

Sunt cunoscute două modificări ale acestei reacții:

– FTA-ABS-IgM, bazat pe utilizarea unui conjugat anti-IgM (anticorpi marcați cu fluoresceină împotriva IgM umană) în a doua fază a reacției în locul globulinei fluorescente anti-umane;

- versiunea rusă a RIF-abs-IgM, caracterizată prin aceea că se adaugă un sorbent în serul sanguin de testat, eliminând anticorpii IgG, iar RIF-abs este plasat cu anticorpii IgM rămași.

Principalele indicații la formularea RIF-abs-IgM sunt:

- serodiagnosticul sifilisului congenital în absența manifestărilor manifeste ale sifilisului congenital pe piele și mucoase la copil;

- diagnostic diferențial de reinfecție și recidivă clinico-serologică sau serologică a sifilisului, în care RIF-abs-IgM va fi negativ, iar RIF-abs - pozitiv;

- evaluarea eficacităţii terapiei pentru sifilisul dobândit precoce sau congenital: după tratament adecvat RIF-abs-IgM devine negativ în următoarele 3-6 luni.

Această reacție poate fi utilizată pentru a detecta sifilisul congenital. Se știe că moleculele mari de IgM nu pot trece printr-o placentă sănătoasă. Prin urmare, anticorpii de clasa M împotriva treponema pallidum pot apărea în corpul copilului fie din cauza unei încălcări a funcției de barieră a placentei, fie sunt produși de corpul unui copil cu sifilis. Anticorpii din clasa IgM apar în sângele unui pacient cu sifilis deja în primele săptămâni de boală, iar anticorpii clasa IgG apar mai tarziu. Determinarea separată a anticorpilor ambelor clase este extrem de utilă în diagnosticul sifilisului congenital la copii, deoarece prezența anticorpilor din clasa IgM la un copil în prima lună de viață va indica faptul că aceștia sunt formați de corpul unui copil cu sifilis, în timp ce detectarea numai a anticorpilor IgG va indica maternă originea acestora din urmă.

Declarația reacției 19S(IgM)-RIF-abs implică separarea preliminară prin filtrare pe gel a moleculelor mai mari de IgM 19S din

fracții de molecule mai mici de IgG 7S. Studii suplimentare în reacția RIF-abs a serului sanguin care conține doar fracțiunea IgM 19S,

elimină totul surse posibile erori. Dar tehnica de stabilire a acestei reacții este complexă și consumatoare de timp, necesită echipamente speciale și pregătire a specialiștilor.

Reacție de adeziune imună (RIP, TPIA - imunoaderența Treponema pallida).

Această reacție se bazează pe utilizarea unui fenomen descris de Rieckenberg în 1912. RIP se bazează pe faptul că treponeamele tisulare virulente, sensibilizate de serul unui pacient cu sifilis, aderă la suprafața eritrocitelor în prezența complementului și a eritrocitelor și, în timpul centrifugării, sunt transportate cu ele în sediment, dispărând din supernatantul.

Următoarele ingrediente sunt utilizate pentru a stabili reacția: ser de testare, antigen, complement, eritrocite donatoare, soluție izotonică de clorură de sodiu. Ca antigen, se folosește o suspensie de treponem pal al tulpinii Nichols.

Cel mai larg în legătură cu serodiagnosticul sifilisului, acest test a fost studiat de autori interni și străini în anii 50-60. Datele despre valoarea RIP ca test de diagnosticare au fost contradictorii. Reacția a necesitat acuratețe maximă, deoarece cu turnarea incorectă a ingredientelor, cu un exces sau o deficiență a materialului de testat în preparat, s-au obținut rezultate nesigure.

În Rusia, cercetări ample au fost efectuate de L.V. Sazonova, care a obținut rezultate similare în RIP și RIT folosind o suspensie proaspăt preparată de treponeme palide patogenice ale tulpinii Nichols. Cu toate acestea, utilizarea unui antigen încălzit sau conservat cu fenol a distorsionat brusc rezultatele reacției și a făcut antigenul instabil. Recomanda testul dat pentru a înlocui RIT L.V. Sazonova a considerat că era imposibil.

G.P. Avdeeva, folosind alte regimuri de temperatură și timp în prepararea antigenului, a obținut rezultate diferite în studiul RIP. Potrivit ei, sensibilitatea acestei reacții este mai mare decât sensibilitatea KCP și RIT, dar oarecum inferioară RIF, iar specificitatea RIP, RIT și RIF este apropiată.

Cu toate acestea, lipsa eliberării de producție a antigenului pentru RIP nu a permis un studiu mai larg al acestui test și introducerea lui în practică.

Reacția RPHA de hemaglutinare pasivă

Reacția de hemaglutinare pasivă (RPHA) este un test serologic comun care este ferm înrădăcinat în practica de laborator. are un nivel destul de ridicat de eficiență în studiu.

1. Istoricul metodei RPHA

Pentru prima dată, G.Blumental și W.Bachman (1932) au raportat despre utilizarea RPHA pentru diagnosticul sifilisului. În 1965, a fost propus un test de hemaglutinare indirectă sau pasivă pentru diagnosticul de sifilis. Modificarea reacției folosind diferite antigene a fost raportată de T. Ratlev în 1965 - 1967. Micromodificarea RPGA a fost propusă de Sokh R.M. și co-autori în 1969. Primul sistem de testare comercial a fost dezvoltat de oamenii de știință japonezi Tomisava et. al. în 1969

2. Principiul metodei RPHA

Dintr-o suspensie omogenă preparată de eritrocite „încărcate” cu antigene, când se adaugă serul de testare care conține anticorpi, precipită un precipitat sub formă de fulgi. Precipitatul rezultat este format din eritrocite „lipite” de anticorpi, și se numește "hemaglutinat". O suspensie de eritrocite este pregătită în prealabil și furnizată ca parte a sistemelor de testare de diagnosticare.

Procesul de lipire a globulelor roșii, pe suprafața cărora sunt prezenți antigeni, se numește „hemaglutinare”. Legătura are loc sub acțiunea unor anticorpi specifici (aglutininele). Reacția se numește "pasiv", deoarece antigenele proprii ale eritrocitelor nu reacţionează, iar eritrocitele însele îndeplinesc o funcţie indicator exclusiv auxiliar.

Reacția de hemaglutinare pasivă (indirectă) este un tip de reacție de aglutinare în care eritrocitele (din greacă háima - sânge) sunt folosite ca purtători de antigene, și nu alte particule. ÎN caz general, în reacția de aglutinare sub acțiunea anticorpilor, microbii sau alte celule se lipesc și precipită - nu neapărat eritrocite, ci, de exemplu, particule de latex, bacterii sau alte particule corpusculare purtătoare de antigen.

În reacția de hemaglutinare pasivă pentru diagnosticul sifilisului, eritrocitele de berbec sau de pasăre acoperite cu antigene palide de treponemă sunt utilizate ca antigen. Când se adaugă ser care conține anticorpi specifici, eritrocitele se lipesc împreună (aglutinare).

Reacția RPHA este denumită metode imunologice, deoarece. se bazează pe interacțiunea specifică a antigenului treponemului pallidum patogen cu un anticorp. În conformitate cu „teoria rețelei”, aglutinarea este rezultatul „reticulare” moleculelor de antigen de suprafață cu moleculele de anticorpi (imunoglobuline).

3. Enunțul reacției de hemaglutinare pasivă

RPHA este plasat în tablete de plastic sau în eprubete cu diluții din serul sanguin al pacientului, la care se adaugă un diagnostic eritrocitar.

Procesul de combinare a unui antigen cu eritrocite se numește sensibilizare, iar antigenul corpuscular artificial obținut în acest fel se numește eritrocite sensibilizate. Diagnosticul eritrocitar eritrocitele sensibilizate cu un antigen se numesc.

Pentru pregătirea diagnosticului se folosesc eritrocite de berbec sau de pasăre (de obicei pui) tratate mai întâi cu formol, apoi cu tanin, care sunt sensibilizate cu antigen ultrasunete al treponema pallidum patogen (tulpina Nichols) sau proteine ​​recombinate treponema pallidum (TpN15, TpN17, TpN47). Se pot folosi și eritrocitele de oaie sensibilizate cu antigen ultrasunet al treponemului pallidum de cultură.

Numai ser (nu utilizați plasmă). Probele hemolizate și tulburi nu sunt potrivite. Eritrocitele nesensibilizate servesc drept control negativ (pentru a exclude prezența anticorpilor anti-eritrocitari). În fiecare serie de producții utilizați controale pozitive și negative.

Probele de ser sanguin studiat și eritrocite de testare sunt introduse în godeurile (celulele) tabletei imunologice. Dacă serul sanguin al pacientului conține anticorpi anti-treponemici specifici, atunci când serul de testat este adăugat în godeul cu antigenul, se formează complexe antigen-anticorp care sunt asociate cu suprafața purtătorilor (eritrocite). Vizual, acest lucru se manifestă prin lipirea globulelor roșii, adică hemaglutinarea, care este vizibilă cu ochiul liber. Complexele imune „anticorp-antigen-eritrocit”, care coboară treptat sub influența gravitației, sunt distribuite pe întreaga suprafață a fundului puțului și formează o imagine caracteristică a unei „umbrele inversate”.

În funcție de cantitatea de anticorpi conținută în proba de testat, imaginea „umbrelă inversată” variază de la maxim, ocupând întreaga suprafață a fundului puțului, până la o zonă mică în partea centrală, cea mai de jos a acesteia (cu iluminare în centrul şi formarea unui inel mai intens de eritrocite decantate de-a lungul periferiei).

Complexele imune nu se formează dacă nu există anticorpi specifici în probă sau când la reacție se adaugă eritrocite de control (intacte). În același timp, eritrocitele se adună treptat în punctul cel mai de jos al fundului puțului, formând o figură sub forma unui punct compact sau „buton”, uneori cu o ușoară iluminare în centru.

Dacă serul de sânge uman conține anticorpi anti-eritrocitari, atunci se va forma „umbrela” în orice caz - atât în ​​reacție cu eritrocitele de testare, cât și cu eritrocitele de control. În acest caz, se recomandă alte tehnologii medicale pentru detectarea anticorpilor antitreponemici specifici.

Este posibil fenomenul prozonei (imposibilitatea reacției din cauza excesului de anticorpi), care se elimină prin diluarea serului.

4. Contabilizarea rezultatelor reacției de hemaglutinare pasivă

Rezultatele RPGA sunt luate în considerare vizual după 60-120 de minute la configurarea micrometodei și după 2-4 ore sau a doua zi la configurarea macrovariantei. Când se utilizează eritrocite de păsări mai mari (nucleate), se obține o imagine mai clară, iar rezultatele sunt înregistrate la o dată mai devreme.

Este posibil să se determine titrul (titru ridicat TPHA ≥ 1:2 560).

Rezultatele studiului sunt evaluate conform sistemului 4+ (de la „-” la „++++”) în funcție de dimensiunea filmului format. Când are loc aglutinarea, eritrocitele sunt situate pe suprafața sondei sub forma unei „umbrele”, iar cu un rezultat negativ, eritrocitele alunecă liber în jos și se acumulează pe fundul în centrul sondei sub forma unui „buton”. ".

Evaluarea general acceptată a rezultatelor RPGA:

4+ - RPHA pozitiv. Eritrocitele aglutinate sub forma unei „umbrele” aliniază uniform întreaga suprafață a găurii;

3+ - RPHA pozitiv. Eritrocitele căptușesc întreaga suprafață a găurii, dar unele dintre ele „alunecă” spre centru. În același timp, se formează un inel vizibil de-a lungul periferiei depozitului;

2+ - RPHA slab pozitiv. Eritrocitele formează un film pe o zonă mică a părții inferioare a puțului, formând un inel dens de sediment eritrocitar cu o iluminare vizibilă în centru;

1+ - RPHA nedeterminat, eritrocitele formează un sediment liber la fundul puțului cu margini neclare și un lumen ușor în centru;

(–) - RPHA negativ, toate eritrocitele se află în fundul puțului sub formă de sediment compact („butoane” sau inele) pe un fundal înconjurător curat (fără sedimentare granulară înconjurătoare).

În practica străină, rezultatele RPGA sunt evaluate și ca reactive (în cazul formării de aglutinați), slab reactive (dacă formațiunile sunt nesemnificative) și nereactive (dacă nu se observă aglutinarea).

Contabilitatea rezultatelor reacției se poate face automat folosind analizoare speciale. Pe lângă cercetarea calitativă, toate sistemele de testare oferă analiza cantitativa cu determinarea titrului.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să utilizați RPHA

RPHA devine pozitiv la mijlocul perioadei primare (7-8 săptămâni din momentul infecției, 3-4 săptămâni după apariția unui șancru dur) și rămâne pozitiv ani de zile după tratament.

Cu un nivel foarte ridicat de anticorpi la treponem în serul studiat (care este cel mai caracteristic sifilisului secundar), este posibil un rezultat fals negativ al TPHA (așa-numitul fenomen „prozonă”).

Anticorpii specifici de aglutinină sunt detectați în sângele persoanelor care au sifilis de mult timp, astfel încât RPGA nu poate fi recomandată pentru diagnosticul diferențial de reinfecție sau pentru determinarea severității procesului infecțios.

RPGA nu este folosit pentru a controla vindecarea, deoarece. poate rămâne pozitiv la mulți ani după recuperare. În același timp, poate fi utilizat ca metodă suplimentară (la RMP sau RPR) în monitorizarea eficacității tratamentului, investigând dinamica scăderii titrurilor de anticorpi. O condiție prealabilă pentru aceasta este utilizarea aceluiași sistem de testare RPGA ca la prima examinare (înainte de tratament) a pacientului, precum și studiul în același laborator.

6. Sensibilitatea și specificitatea RPHA

RPHA este considerat un test foarte sensibil și specific. Această reacție este un test de diagnostic valoros în toate formele de sifilis, dar este deosebit de sensibilă în formele avansate ale bolii. Sensibilitatea RPHA variază în funcție de stadiul bolii. Cu sifilisul primar, sensibilitatea RPHA este de 76% (și mai mare), cu sifilisul secundar - până la 100%. Cu latentă precoce - 97%, cu sifilis tardiv - 94%, cu o specificitate de 98-100%. Sensibilitatea mai scăzută în formele proaspete ale bolii se datorează formării ulterioare a aglutininelor.

Potrivit instituției de stat „TsNIKVI Roszdrav”, sensibilitatea RPHA în diagnosticul diferitelor forme de sifilis a fost de 99,4%. Majoritatea cercetătorilor notează o specificitate de 98-99% a RPHA.

Din punct de vedere al sensibilității și specificității, RPHA nu este inferior, iar în formele tardive și sifilisul congenital, depășește chiar și RIF și RIBT.

7. Domeniul de aplicare al metodei RPGA

TPHA poate fi folosit atât ca test de screening, cât și de confirmare; poate fi utilizat într-o variantă semi-cantitativă cu calculul titrului de anticorpi. S-a dezvoltat o metodă cantitativă pentru stabilirea RPHA, o micrometodă, precum și o reacție automată de microhemaglutinare.

8. Caracteristici, avantaje și dezavantaje ale RPGA

Conform literaturii de specialitate, RPGA a ocupat în mod constant o poziție de lider în practica clinică în majoritatea țărilor lumii. TPHA este cel mai utilizat test în clinicile ITS din străinătate.

Tehnica RPGA este usor de realizat, nu necesita echipament special: este nevoie doar de o placa de hemaglutinare pentru a o monta. Studiul nu durează mult; reacția este foarte sensibilă și specifică. Aprobarea metodei în practica clinică a arătat că este extrem de simplă, ieftină și sensibilă. La fel ca ELISA, RPHA este simplu de realizat, nu necesită personal înalt calificat și echipamente speciale, iar automatizarea lui este posibilă.

Avantajele testului RPGA:

• ușor de configurat și interpretat,
• nu necesită echipament special,
• timp pentru a obține rezultatul - 45 de minute,
• adecvat pentru screening-ul în masă (este necesar doar 25 µl de ser la o diluție de 1:20),
• grad ridicat de standardizare,
• prezența controalelor interne,
• termen lung de valabilitate
• pret acceptabil
• posibilitatea automatizării contabilităţii.

De asemenea, trebuie remarcate dezavantajele RPGA:

• posibilitatea unor reacții nespecifice în prezența anticorpilor anti-eritrocitari,
• lipsa corelației dintre titrul și stadiul sifilisului,
• reacție pozitivă ulterioară în stadiile incipiente ale sifilisului,
• posibilitatea unor reacții fals pozitive la persoanele care au consumat alcool, dependenți de droguri,
• sensibilitate la vibrații și temperatură în laborator.

Avantajele RPGA în comparație cu RIBT și RIF sunt:

• utilizarea sistemelor de testare industriale,
• posibilitatea de automatizare a reacției,
• nu este nevoie să lucrați cu treponemul palid viu,
• elimină necesitatea unui vivarium.

9. Surse și cauze ale erorilor în setarea RPHA, rezultate fals pozitive și fals negative

Reacția de hemaglutinare pasivă este un studiu relativ simplu; atunci când se efectuează, este necesar să se respecte toate recomandările producătorilor de diagnostic și regulile de lucru în laboratorul de diagnostic clinic. Greșelile făcute pot duce la apariția și înregistrarea rezultatelor reacției atât fals-negative, cât și fals-pozitive. Rezultatele fals pozitive ale RPGA se pot datora influenței factorului uman și factorilor biologici.

Se pot obține rezultate fals pozitive

• în studiul serurilor de sânge ale pacienților cu treponematoze non-venerice,
• din cauza factorului reumatoid
• datorită anticorpilor care reacţionează încrucişat cu antigenul treponemal, care se formează în timpul diferitelor tulburări metabolice sistemice sau induse de medicamente sau induse de medicamente,
• din cauza nivelurilor anormale de imunoglobuline;
• la nou-născuți - datorită formării în organism a fătului sau a copilului de anticorpi IgM la IgG mamei, ceea ce complică interpretarea rezultatelor și diagnosticul de sifilis congenital.

Erori cauzate de influența factorului de participare umană asupra studiului:

• microplăci contaminate
• pipetare incorectă
• vibratii in laborator
• temperatura aerului din laborator este în afara intervalului de temperatură: 18–25 grade

Cele mai tipice erori tehnice în setarea RPGA, care conduc la rezultate nesigure, includ:

• diluarea incorectă a ingredientelor,
• încălcare regim de temperatură,
• încălcarea timpului de incubare a reactivilor,
• încălcarea condițiilor de aplicare a reactivilor pe tabletă,
• inconsecvența pH-ului soluțiilor cu cele necesare,
• contaminarea sticlei de laborator.

Următoarele puncte tehnice pot fi, de asemenea, o sursă de erori la configurarea RPGA:

• excluderea din formularea reacției serurilor de sânge de control;
• concentrația neuniformă a eritrocitelor în diagnosticul din cauza amestecării insuficiente înainte de utilizare;
• încălcarea termenilor și condițiilor de depozitare a eritrocitelor de diagnostic și control; utilizarea truselor expirate;
• utilizarea de eprubete contaminate, vârfuri de pipetă, pipete, plăci imunologice, soluții la stabilirea reacțiilor;
• inexactități în diluția inițială a unei probe de ser de sânge;
• minuțiozitate insuficientă în efectuarea dublelor diluții consecutive;
• nerespectarea regimului de temperatură și a timpului de incubație;
• prezența vibrațiilor străine și scuturarea plăcii imunologice în timpul incubației;
• încălcarea metodei de stabilire a RPGA, exprimată în refuzul de a efectua studiul cu eritrocite de control.

Utilizarea plasmei sanguine care conține anticoagulante capabile să provoace aglutinarea eritrocitară nespecifică (RPHA) poate duce la rezultate care nu pot fi interpretate.

Numărul de rezultate fals pozitive și fals negative este mai mic decât în ​​cazul altor teste serologice. LPR în cadrul RPHA sunt rare și posibile cu treponematoze (vici, bejel, halbă). De asemenea, s-au înregistrat rezultate fals pozitive (sub 1% în total) la dependenți de droguri, la pacienți mononucleoza infectioasa, borrelioza, lepra, cu colagenoze, ciroza hepatica, limfosarcom, precum si la femeile insarcinate.

Rezultatele fals-negative ale reacției se pot datora competiției dintre anticorpii IgM și IgG. Rezultate fals negative sunt posibile și la pacienții infectați cu HIV.

10. Modificări ale metodei RPHA

Există modificări micro și macro ale setării RPGA, prima este mai des folosită din cauza economiei, vitezei de setare și luării în considerare a rezultatelor.

În plus, un automat complex de diagnostic analiza imaginilor, care a făcut posibilă efectuarea unei evaluări automate cantitative a rezultatelor și eliminarea subiectivității în interpretarea datelor obținute. Complexul hardware-software recunoaște imaginea, prelucrează datele și dă răspunsul în unități relative.

Cititoarele și analizoarele automate sunt, de asemenea, folosite pentru a automatiza înregistrarea rezultatelor RPGA.

TPPA (aglutinarea particulelor de Treponema pallidum) - un test de aglutinare a particulelor artificiale pentru a detecta anticorpi la Treponema pallidum

Scurtă descriere a testului TPPA

În prezent, o modificare a metodei de hemaglutinare pasivă - TPRA (Treponema pallidum particle agglutination) este, de asemenea, utilizată pentru a diagnostica sifilisul, în care antigenul treponem pal este fixat pe particulele de gelatină. Deoarece particulele de polimer artificial nu au propriile antigene care determină activitatea biologică, atunci kiturile pentru serodiagnosticul sifilisului bazate pe acestea au motive să fie considerate mai avansate. Utilizarea particulelor artificiale biologic inerte minimizează aglutinarea nespecifică întâlnită în mod obișnuit cu alți purtători.

TPPA este folosit pentru diagnostic serologic anticorpi la diferite tipuri și subspecii de treponeame patogene. Acest test poate fi folosit pentru a detecta anticorpi la agenții cauzali ai sifilisului, halbă, bejel și iacă.

Procedura de studiu este foarte simplă și nu necesită echipament special - se folosesc microplăci standard în formă de „U”. Testul se bazează pe aglutinarea particulelor de gelatină sensibilizate cu antigeni T. pallidum, anticorpi găsiți în serul sanguin al pacientului.

TPPA este un test treponemic de confirmare care este util atât pentru un număr mic de probe, cât și pentru screening-ul în masă. TPPA este folosit în străinătate ca test de confirmare și pentru a înlocui testul de microhemaglutinare MHA-TP (testul de microhemaglutinare pentru anticorpi la T. pallidum).

Sensibilitatea testului TPPA este între 85% și 100%, în timp ce specificitatea este între 98% și 100%. Sensibilitatea TPPA pentru sifilisul primar este de 88%, pentru sifilisul secundar și latent tardiv 98%-100%.

Dacă TPPA este utilizat pentru a diagnostica sifilisul, anticorpii împotriva altor tipuri de treponem (cum ar fi T. pallidum endemicum, pertenue sau carateum) pot provoca rezultate fals pozitive. Există o serie de metode pentru a elimina acești anticorpi din probele de ser înainte de a începe testul.

Principiul testului TPPA

TPPA este o metodă de aglutinare pasivă a particulelor de gelatină din ser sau plasmă umană. Serul care conține anticorpi la treponemul patogen reacționează cu particulele de gelatină sensibilizate cu antigenul treponemului pal al tulpinii Nichols, supuse ultrasunetelor. Ca rezultat al reacției, în godeul plăcii de microtitrare se formează o peliculă netedă de particule de gelatină aglutinată.

Dacă nu sunt prezenți anticorpi, particulele se depun în fundul godeului plăcii, formând un „buton” compact de particule neaglutinate. Godeurile de control cu ​​particule de gelatină nesensibilizate ar trebui să prezinte, de asemenea, un astfel de „buton” compact pentru fiecare ser, adică fără aglutinare.

Aplicarea testului TPPA

TPRA este un test universal care poate fi utilizat cu egal succes atât în ​​examinarea preventivă obligatorie a grupurilor de populație pentru sifilis (screening), cât și în instituțiile dermatovenerologice specializate. Avantajul testului TPPA este sensibilitatea sa ridicată, care nu este inferioară teste clasice, care până de curând reprezentau „standardul de aur” pentru serodiagnosticul sifilisului. Alte avantaje ale testului includ reproductibilitatea ridicată, precum și simplitatea și viteza de stabilire a reacției.

Testul TPPA este utilizat pentru a confirma rezultatele pozitive ale testelor de screening non-treponemic pentru sifilis, cum ar fi testul VDRL, și pentru a evalua pacienții care au teste non-treponemice negative, dar au semne sau simptome care sugerează sifilis tardiv. Utilizarea TPPA ca unic test de screening pentru sifilis nu este recomandată.

În plus, testul de aglutinare TPPA poate fi utilizat pentru a examina probe de lichid cefalorahidian în diagnosticul de neurosifilis. În acest caz, ca și în cazul altor teste serologice, interpretarea rezultatelor trebuie efectuată cu combinația obligatorie cu alți indicatori și simptome ale bolii.

Rezultatele testului TPPA

Rezultatul este evaluat conform sistemului de „plusuri” - de la (-) la (2+). Rezultatele testului sunt vizibile cu ochiul liber și sunt interpretate după cum urmează:

Gradul de aglutinare	Scorul testului	Interpretare
Particulele aglutinate căptușesc uniform fundul plăcii bine	2+	Pozitiv
Inel mare semnificativ, cu margini exterioare neuniforme și aglutinare periferică	1+	Pozitiv
Particulele formează un inel compact cu un gol în centru și neted frontiere externe	±	slab pozitiv
Particulele formează un inel compact în centrul puțului, cu un spațiu ușor în centru și o limită exterioară netedă.	–	Negativ
Particulele formează un „buton” în centrul găurii cu o limită exterioară netedă	–	Negativ

Rezultatele sunt înregistrate pentru a determina conformitatea cu descrierea de mai sus. Probele care prezintă un rezultat nedeterminat (±) trebuie retestate. În cazul în care un eșantion arată un rezultat nedeterminat la mai multe teste TPPA, se recomandă efectuarea unui studiu folosind alte metode.

Rezultatele analizei nu trebuie luate în considerare izolat. De exemplu, într-un stadiu incipient al infecției, numărul de anticorpi este încă prea mic, drept urmare TPPA și multe alte metode nu sunt sensibile. Prin urmare, dacă se suspectează sifilis, chiar dacă rezultatele testelor sunt negative, probele trebuie reexaminate. Pentru a pune un diagnostic, este necesar să se țină cont de simptomele clinice pe care le are pacientul, istoricul clinic și alte date.

Ca și în testul TPHA, fenomenul prozonă și un rezultat fals negativ pot fi observate pentru TPPA dacă proba de ser conține un titru de anticorpi prea mare.

ELISA - ELISA

Testul imunoenzimatic (ELISA; Testul imunosorbent legat de enzime, ELISA) este una dintre numeroasele metode de diagnostic serologic al bolilor infecțioase. Imunotestul enzimatic (ELISA) în serodiagnosticul sifilisului este un test pentru anticorpi din clasele M, G și A (IgM, IgG, IgA) împotriva antigenelor treponemului palid. Este posibil să se efectueze ELISA cu lichid cefalorahidian.

Introducerea testului imunosorbent legat de enzime (ELISA) în practică în locul reacției Wasserman și a altor teste cardiolipină a îmbunătățit semnificativ calitatea diagnosticului de laborator al sifilisului. Un avantaj semnificativ al acestei metode este posibilitatea de automatizare a procesului de cercetare, ceea ce reduce influența factorului uman.

1. Istoricul metodei ELISA

Principiile de bază ale imunotestării enzimatice pe suprafața unui purtător în fază solidă au fost dezvoltate de E. Engvar și colab. (1971), B.Van Weeman și A.Schuurs (1971). Imunotestul enzimatic pe care l-au dezvoltat a fost propus pentru prima dată pentru diagnosticul de sifilis în 1975 de către J. Veldkamp și A. Visser, care au apreciat potențialul acestui test automat. ELISA a început să fie utilizat pe scară largă în diagnosticul sifilisului în anii 1980, când au fost dezvoltate și certificate teste de diagnostic, iar metodele de testare au fost standardizate. În URSS, tehnica ELISA pentru diagnosticarea sifilisului a fost dezvoltată de V.N. Bednova, A.V. Babiy și A.V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. Principiul metodei ELISA

Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) conform mecanismului de reacție este aproape de RIF (sunt detectați aceiași anticorpi). Reacția imunologică enzimatică este clasificată ca o reacție imunologică bazată pe interacțiunea foarte specifică a antigenelor treponema pallidum cu anticorpii unui pacient cu sifilis.

În practica sifilidologică, se utilizează în principal o variantă indirectă a ELISA. Principiul celei mai frecvent utilizate variante de reacție indirectă este următorul. Pe suprafața godeurilor unei plăci de polistiren sunt fixate complexe imune, care se formează în timpul interacțiunii anticorpilor unui pacient cu sifilis cu antigenele treponemului palid. După aceea, ele sunt detectate într-o reacție de culoare utilizând conjugați specifici și aditivi substrat-cromogeni corespunzători.

Procedura de efectuare a testului este următoarea: serul pacientului este plasat pe un purtător în fază solidă cu un antigen atașat. În prezența anticorpilor în el, pe suprafața purtătorului se formează un complex antigen-anticorp. Pentru a „manifesta” rezultatele reacției, se folosesc anticorpi anti-specie la Ig umană conjugați cu markeri enzimatici. În cazul unei reacții pozitive, enzima atașată la complexul antigen-anticorp descompune substratul adăugat în sistem, rezultând în dezvoltarea colorației de culoare de intensitate diferită.

În reacție, determinarea complexului de AG și AT adsorbit pe faza solidă se realizează folosind anticorpi antiglobulină marcați cu enzima, în funcție de reacția de culoare a enzimei cu substratul.

În reacție, determinarea complexului de antigene și anticorpi adsorbiți pe faza solidă se realizează folosind anticorpi antiglobulină marcați cu enzime.

ELISA prezintă posibilitatea de a detecta Ig serice de diferite clase. Există sisteme pe piață care vă permit să determinați separat IgM și IgG și anticorpii totali.

Antigenii specifici utilizați pentru ELISA pot avea o origine diferită:

ultra-voce- se obtin ca urmare a distrugerii celulei bacteriene T.pallidum prin ultrasunete sau alta metoda;

recombinant- sunt obținute prin tehnologii de inginerie genetică prin introducerea în genomul unei celule bacteriene (de exemplu, coli E.Coli) gena responsabilă de sinteza unui anumit antigen T.pallidum, urmată de creșterea masei bacteriene a microorganismului producator, distrugerea acestor celule, izolarea și purificarea antigenului;

peptidă- obţinută ca urmare a sintezei chimice secvenţiale a epitopilor antigenici ai proteinelor T.pallidum.

Organismul este capabil să formeze anticorpi pentru aproape orice parte a moleculei de antigen. Într-un răspuns imun normal, acest lucru nu se întâmplă de obicei. Una sau mai multe peptide imunogene izolate dintr-un antigen proteic au o antigenitate specială, iar majoritatea anticorpilor sunt formați în mod specific pentru acestea. Ei dezvoltă cel mai intens răspuns imunitar. Cele mai informative din ELISA au arătat regiuni imunodominante ale proteinelor treponemului pal, cu o greutate moleculară de 15 kD, 17 kD și 47 kD. Un extract de detergent sau un sonicat de treponeme patogene ale tulpinii Nichols a fost utilizat ca antigen.

3. Metoda de realizare a cercetării prin metoda

Principiul metodei este de a identifica un complex antigen-anticorp specific adsorbit pe faza solidă (suprafața godeurilor unei plăci de plastic) cu anticorpi antiglobulină marcați cu o enzimă (peroxidază) folosind o reacție de culoare cu un substrat, care este cuantificat spectrofotometric.

Antigenii utilizați pentru a sensibiliza godeurile plăcii de polistiren pot fi:

• lizat- obtinut ca urmare a distrugerii treponemului palid prin ultrasunete;
• peptidă- obținut ca urmare a sintezei chimice a fragmentelor de proteine ​​de treponem pal și având reactivitate antigenică similară cu proteinele originale ale agentului patogen;
• recombinant- obținut prin metode de inginerie genetică, purtând determinanți antigenici identici cu treponemul palid.

În practica sifilidologică, se utilizează de obicei o variantă indirectă a ELISA.

4. Contabilitatea rezultatelor

În ELISA, pentru a vizualiza reacția antigen-anticorp, se folosește o reacție enzimatică (fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean) cu un substrat, care își schimbă culoarea. Intensitatea culorii determină pozitivitatea reacției (de la „-” la „++++”). Rezultatele ELISA pot fi evaluate vizual pe un sistem cu 4 puncte sau instrumental sub forma unor indicatori digitali de densitate optică obținuți pe cititoare speciale (cum ar fi Multiscan) la o lungime de undă de 492 nm. Deoarece evaluarea rezultatelor se efectuează spectrofotometric, aceasta excluzând interpretarea subiectivă.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să se folosească

Termenii de pozitivitate ELISA - din a 4-a săptămână de la infectare. Rezultatele ELISA (precum și RIF) devin pozitive în primele zile ale perioadei primare sau la sfârșitul incubației și rămân pozitive în toate perioadele. ELISA este deosebit de valoroasă în diagnosticul precoce al sifilisului - rezultate pozitive la anticorpi pot fi obținute deja la sfârșitul perioadei de incubație a bolii (adică, 4-6 săptămâni după infecție).

6. Sensibilitate și specificitate

ELISA este un test foarte sensibil și specific, ceea ce este avantajul său. ELISA în ceea ce privește mecanismul de reacție, sensibilitatea și specificitatea este apropiată de RIF, tk. aceiași anticorpi iau parte la ambele reacții. Majoritatea cercetătorilor notează o specificitate și sensibilitate ridicate în toate etapele bolii. Sensibilitatea diferitelor variante ELISA, conform lui G. A. Dmitriev, ajunge la 98–100%, iar specificitatea este de 96–100%. Potrivit TsNIKVI, sensibilitatea ELISA pentru sifilis este de 99,1% (Ordinul nr. 87 M3 al Federației Ruse).

Varianta ELISA în fază solidă (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) este unul dintre cele mai sensibile teste serologice, permițând detectarea a 0,0005 µg/ml de anticorpi și 0,000005 µg/ml de antigene.

7. Domeniul de aplicare al metodei

Se recomandă utilizarea metodei la examinarea femeilor însărcinate, a persoanelor de contact, a donatorilor și a reprezentanților grupurilor de risc. ELISA poate fi folosit atât ca test de screening, cât și de confirmare. Într-un timp relativ scurt al istoriei sale, ELISA a evoluat de la un test indicativ la unul de confirmare. În diagnosticul de sifilis, testul este folosit și ca test de confirmare pentru probele care prezintă rezultate pozitive folosind diverse teste non-treponemale și TPHA.

Metoda ELISA poate fi utilizată cantitativ cu calculul indicelui de pozitivitate sau reactivitate, ceea ce vă permite să evaluați nivelul de anticorpi din probă.

În prezent, în Rusia, utilizarea imunotestului enzimatic pentru diagnosticarea sifilisului este reglementată de Ordinul Ministerului Sănătății al Federației Ruse nr. 87 din 26 martie 2001 „Cu privire la îmbunătățirea diagnosticului serologic al sifilisului” (Anexa nr. 1 „Setarea testelor de screening și diagnostic pentru sifilis”). În comandă, este planificată înlocuirea RSK în complexul de seroreacții (SSR) cu ELISA și RPHA.

8. Surse și cauze ale erorilor de punere în scenă, fals pozitive și fals negative

Imunotestul enzimatic este un studiu complex în mai multe etape, în care este necesar să se respecte cu strictețe toate recomandările producătorilor de truse de diagnosticare, regulile de ajustare și configurare a echipamentului utilizat în studiu.

Următoarele puncte pot fi sursa erorilor la configurarea unui ELISA:

Un studiu în reacția hiperlipidemiei, a serului sanguin hemolizat sau a probelor cu semne de creștere bacteriană;

Nu practicați dubla sau mai mult congelarea unei probe de material biologic; dacă este necesar, reexaminare, utilizați ser dintr-un tub duplicat;

Încălcarea termenilor și condițiilor de păstrare a imunosorbantului și a soluției de spălare; utilizarea truselor de testare expirate;

Aplicarea componentelor de reacție din alte truse de diagnosticare;

Încălcarea timpului etapelor de reacție;

uscarea godeurilor plăcii imunologice în timpul etapelor de reacție;

Reutilizarea vaselor de plastic (tavi de plastic) pentru prepararea unui amestec de cromogen si substrat;

Nerespectarea frecvenței de control metrologic a parametrilor de funcționare a aparatelor utilizate (săibă și spectrofotometru);

Utilizarea sticlei de laborator contaminate la stabilirea reacțiilor: baloane, cilindri de măsurare, eprubete, pipete, vârfuri de pipetă;

Amănunțime insuficientă în efectuarea diluțiilor probelor de material biologic;

Erori la introducerea unei probe de material biologic în godeul corespunzător al tabletei;

Erori la transferul rezultatelor studiului în jurnalul de înregistrare, protocolul de studiu sau formularul de răspuns.

Implementarea atentă a recomandărilor din instrucțiunile de utilizare a truselor de testare de diagnosticare, verificarea regulată a acurateței dozatoarelor de pipete și a dispozitivelor automate, utilizarea controalelor interne pozitive și negative permit obținerea rezultatelor ELISA foarte reproductibile.

9. Caracteristici, avantaje și dezavantaje

ELISA se referă la metode moderne și promițătoare de serodiagnostic a sifilisului datorită simplității, reproductibilității și disponibilității sale. Detectarea anticorpilor prin ELISA este o metodă de diagnostic ideală potrivită pentru examinarea simultană a unui număr mare de probe. Datorită avantajelor sale, a câștigat popularitate în toate țările.

Tehnologia cercetării ELISA asigură conformitatea cu toate recomandările producătorilor de truse comerciale de testare de diagnosticare și minuțiozitatea procedurii de cercetare. Pentru a efectua cercetări în ELISA, este necesar să achiziționați echipamente speciale suplimentare. Tehnica de setare durează mai mult în comparație cu RMP, RPR și RPGA.

Prezența automatizării unui număr de etape sau a întregului proces în ansamblu vă permite să examinați simultan un număr mare de mostre de material biologic cu un grad ridicat de standardizare a studiului, minimizând elementul subiectiv în evaluarea rezultatelor, posibilitatea de stocare a protocoalelor fixe de studiu, ceea ce face posibilă arhivarea datelor de studiu și trimiterea din nou la acestea pentru analiză retrospectivă.

Avantaje:

• Permite determinarea diferențiată și totală a IgM și anticorpi IgG la agentul cauzal al sifilisului.
• sensibilitate ridicată și specificitate care se apropie de 100%,
• reproductibilitatea
• posibilități de automatizare

Avantajele ELISA includ specificitatea ridicată (96-100%) și sensibilitatea (98-100%) observate de majoritatea cercetătorilor.

Prezența automatizării unui număr de etape sau a întregului proces vă permite să examinați simultan un flux cu un număr mare de probe de material biologic cu un grad ridicat de standardizare a studiului, minimizând elementul subiectiv în evaluarea rezultate, posibilitatea de stocare a protocoalelor fixe de studiu care vă permit să arhivați datele studiului și să faceți referire la ele din nou pentru o analiză retrospectivă.

Dezavantajele semnificative ale metodelor manuale, inclusiv determinarea anticorpilor la antigenele T. pallidum prin ELISA, sunt:

~ posibile erori ale personalului în timpul studiului (supraveghere, neglijență, încălcare a tehnologiei);

~ imposibilitatea standardizării complete a procesului de cercetare cu o versiune manuală a ELISA;

~ risc crescut de infectare a personalului.

10. Modificări de metodă

Alături de ELISA indirectă clasică, metoda este de asemenea cunoscută. ELISA prin capcane. A fost propusă în 1989 de O. E. Ijsselmudien și colab. pentru a detecta anticorpii din clasa IgM la antigenele Tr. pallidum. Metoda are specificitate și sensibilitate ridicate.

Anticorpii purificați la imunoglobulinele umane din clasa M sunt absorbiți pe suprafața godeurilor tabletei și, după incubarea serului de testat, toate IgM se leagă de purtător. Prezența printre IgM asociate specifice pentru antigenele Tr. pallidum este detectat folosind antigenele Tr. pallidum conjugat cu o enzimă.

Această metodă vă permite să detectați anticorpi nu numai din clasa IgM, ci și din clasele IgG, IgA. Pentru a face acest lucru, godeurile plăcilor sunt sensibilizate cu anticorpi purificați cu afinitate dintr-o anumită clasă împotriva imunoglobulinelor umane. În acest caz, anticorpii din această clasă sunt capturați din ser, iar detectarea anticorpilor specifici treponemic este realizată prin combinarea acestora cu un conjugat, care este o combinație de antigen treponemal cu o enzimă.

Utilizarea unui ELISA prins reduce riscul de reacții fals pozitive mediate de factorul sanguin reumatoid, reacții încrucișate între imunoglobulinele din clasele M și G. La examinarea nou-născuților, în acest caz, rezultatele testelor fals pozitive asociate cu detectarea IgM îndreptate împotriva IgG antitreponemice materne sunt de asemenea excluse.

Ca variante ELISA în străinătate sunt utilizate pe scară largă test imun enzimatic (EIA) si sistem ICE Sifilis. În cel din urmă, un amestec de anticorpi la IgM și IgG, precum și trei proteine ​​recombinate T. pallidum, a fost adsorbit în godeurile plăcii. Rezultatele pozitive sunt testate în același sistem de testare în două repetări pentru a da rezultatul final.

În Rusia, au fost dezvoltate o serie de sisteme de testare pentru serodiagnosticarea sifilisului prin ELISA cu reactivi domestici. Aceste sisteme au specificitate și sensibilitate ridicate.

Pe lângă cele de mai sus, există și alte opțiuni ELISA, inclusiv cele care permit detectarea directă a agentului patogen în sânge (ELISA directă), dot-ELISA cu reacția pe benzi de nitroceluloză, ELISA cu sânge capilar, precum și imunoblot, sau Western Blot, cu detectarea simultană a anticorpilor la diferite componente ale agentului patogen.

O modificare modernă îmbunătățită a ELISA este imunoblotting.

ICA (analiza imunochimiluminiscentă), ICL (imunochemiluminiscență)

Odată cu dezvoltarea diagnosticului de laborator în contextul modernizării asistenței medicale în Federația Rusă, automatizarea cercetării de laborator a intrat în practica laboratoarelor, ceea ce face posibilă standardizarea etapelor analitice ale cercetării. Acest lucru îmbunătățește calitatea diagnosticului. Odată cu introducerea automatizării, au început să fie aplicate noi metode de înaltă tehnologie cu sensibilitate și specificitate ridicate, cum ar fi imunotestul cu chemiluminiscență (CLIA)

Chemiluminescență - procesul de emisie de fotoni în timpul tranziției produselor oxidative excitate electronic reacții chimiceînapoi la starea sa energetică inițială. În timpul reacției de chimioluminiscență, se eliberează o cantitate semnificativă de energie, iar randamentul cuantic al luminii emise este destul de mare. Dintre toate metodele non-izotopice, chemiluminiscența oferă cea mai mare sensibilitate. Pentru metodele imunometrice, sensibilitatea chemiluminiscenței este cu ordine de mărime mai mare decât cea a radioimunotestului.

Metoda imunochimiluminiscenței (ICL) și-a găsit acum aplicația în diagnosticul markerilor tumorali, boală autoimună, diabet, markeri cardiaci, hormoni ( glanda tiroida, glandele suprarenale, hormoni sexuali feminini și masculini), infecții cu torță, hepatita virala, virusuri din grupa herpesului.

Pe baza metodei imunochimiluminiscenței, au fost dezvoltate o serie de sisteme de testare foarte sensibile și specifice (98-100%) pentru diagnosticarea sifilisului, care sunt utilizate în principal în străinătate.

În metodă, lipoproteinele recombinante obţinute prin metode de inginerie genetică sunt utilizate ca antigene, care sunt analogi completi ai antigenelor T.pallidum.

Pe baza rezultatelor unui studiu clinic, metoda ICA a fost recunoscută și recomandată pentru utilizare în diagnosticul de laborator al sifilisului în Federația Rusă ca test de screening și de confirmare, dacă laboratoarele au echipamentul adecvat. În 2012, ICA a fost inclusă ca test de screening și confirmare pentru diagnosticul de sifilis în Ghiduri clinice privind managementul pacienților cu infecții cu transmitere sexuală și infecții urogenitale

Astfel, utilizarea ICA de înaltă tehnologie, care a intrat în practica diagnosticului de laborator atât mondial, cât și intern odată cu introducerea automatizării, oferă următoarele avantaje:

• excluderea influenței factorilor subiectivi la etapa analitică a studiului
• siguranța personalului atunci când se efectuează studii asupra materialului biologic potențial infectat
• creşterea vitezei de obţinere a rezultatelor de către pacient
• standardizarea cercetării și controlul calității cercetării
• furnizarea de rezultate fiabile și fiabile pacienților
• cercetare clinică de laborator de înaltă calitate.

Din punct de vedere al sensibilității, metoda ICA este comparabilă cu metoda radioimunotestului, iar în ceea ce privește ușurința de execuție, siguranța personalului și mulți alți parametri, o depășește.

Metoda ICA, care are sensibilitate și specificitate ridicate (98-100%), face posibilă cuantificarea nivelului de anticorpi la agentul cauzal al sifilisului și poate fi utilizată pentru confirmarea infecției sifilitice și screening-ul. Limitări de utilizare: nu poate fi utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei, poate da un rezultat fals pozitiv.

Imunocromatografie (ICH).

Relativ noi pentru utilizare în Federația Rusă sunt metodele de detectare a anticorpilor specifici treponemului bazate pe metode de imunocromatografie (ICH). Ca și în metoda ICA, lipoproteinele recombinante obținute prin metode de inginerie genetică (de exemplu: antigenele Tp15, Tp17, Tp47) și peptida biosintetică TmpA sunt utilizate ca antigene. Antigenele enumerate sunt, de asemenea, utilizați în diferite combinații ca parte a imunosorbanților în ELISA și imunoblot.

Metoda ICG vă permite să determinați rapid conținutul de anticorpi specifici treponemului la agentul cauzal al sifilisului în probele de ser și sânge integral fără utilizarea echipamentelor speciale de laborator și este utilizată în furnizarea de asistență medicală primară, inclusiv în indicații epidemiologice.

Limitări de utilizare: nu poate fi utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei, poate da un rezultat fals pozitiv.

PBT (teste rapide simple la pat)

Relativ recent, în serodiagnosticul sifilisului, a început să se dezvolte o direcție pentru dezvoltarea așa-numitelor teste simple rapide (PBT) sau teste la patul pacientului (Point-of-care - ROC). Testele rapide simple la pat, sau testele imunocromatografice, fac posibilă determinarea rapidă a conținutului de anticorpi specifici treponemului la agentul cauzal al sifilisului în probele de ser și sânge integral, fără a utiliza echipamente speciale de laborator și să fie utilizate în asistența medicală primară, inclusiv indicatii epidemiologice. Limitări de utilizare: nu poate fi utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei, poate da un rezultat fals pozitiv.

Aceste teste se bazează pe detectarea imunocromatografică a anticorpilor la antigenele treponemale ale treponemului palid și sunt efectuate pe benzi; poate fi folosit ca tot sângeleși ser (Herring A., Ballard R. și colab., 2006). Formatul testelor vă permite să efectuați cercetări în absența echipamentelor speciale și fără utilizarea energiei electrice. Cu toate acestea, din cauza sensibilității și specificității relativ scăzute, aceste teste nu și-au găsit încă aplicarea largă în practică.

Imunoblotting (Western Blot)

În ultimii ani au apărut metode de cercetare care vizează detectarea și analiza conținutului de anticorpi. pentru fiecare antigen treponem palid separat. O astfel de metodă este metoda de blotting imun (sau blotting, imunoblot, Western blot), care este utilizată pentru determinarea anticorpilor IgG sau IgM la treponemul palid. Metoda de imunoblotare este o modificare a imunotestului enzimatic - o variantă a ELISA.

Imunoblotting este una dintre cele mai multe metode moderne serodiagnosticul sifilisului și este utilizat activ în străinătate. Și-a primit numele ("Western blotting") ca un răspuns plin de umor la numele tehnicilor de detectare a ADN-ului ("Southern Blotting") și ARN ("Northern Blotting").

1. Istoricul metodei

Imunoblotting (Western blot) este utilizat pentru a determina anticorpii IgG sau IgM la antigenele treponemului palid (Herremans M. et al., 2007).

2. Imunoblot clasic

Imunoblot clasic(Analiza Western Blot) combină imunotestul enzimatic și utilizarea unei metode electroforetice. Antigenii proteici ai agentului cauzal al sifilisului sunt separați preliminar prin electroforeză și transferați într-un purtător - o membrană (bandă) de nitroceluloză. Acest transfer se numește blotting. Apoi acest purtător cu puncte separate (bloturi) este tratat cu serul de testat și anticorpi la IgG sau IgM marcați cu enzime sau substanțe radioactive. Metoda implică utilizarea proteinelor treponem naturale sau recombinate.

electroforeză este separarea compușilor încărcați pe baza mobilității lor într-un câmp electroforetic. Când se aplică o diferență de potențial într-un mediu, moleculele încărcate pozitiv se deplasează către un electrod încărcat negativ, iar moleculele încărcate negativ se deplasează către un electrod pozitiv.

Majoritatea proteinelor globulare sunt asamblate în așa fel încât majoritatea grupărilor încărcate, și anume cele hidrofile, sunt situate pe suprafața proteinei, în timp ce reziduurile neîncărcate, hidrofobe, sunt scufundate în interiorul globului. Într-un câmp electric, în conformitate cu sarcina lor, proteinele migrează către un electrod încărcat opus.

Separarea electroforetică a proteinelor se realizează într-un mediu de gel sintetic pe bază de poliacrilamidă. Pentru a separa proteinele în funcție de greutatea lor moleculară, înainte de electroforeză, amestecul de proteine ​​este preincubat în prezența dodecil sulfatului de sodiu (SDS).

Studii detaliate ale oamenilor de știință străini Weber și Osborn (1969) au arătat că, după un astfel de tratament, singurul factor care poate afecta mobilitatea proteinelor într-un gel de poliacrilamidă (PAAG) este dimensiunea proteinei, sau mai degrabă greutatea moleculară a acesteia. Acest lucru a făcut posibilă aplicarea metodei de electroforeză în SDS-PAGE în prezența SDS pentru o determinare destul de precisă a greutății moleculare a proteinelor și peptidelor. În literatura străină, această metodă a fost numită SDS-PAGE (electroforeză în gel de poliacrilamidă-dodecil sulfat de sodiu).

Profil de reactivitate în testul WB clasic cu antigeni naturali (metoda de electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu). (1) - rezultat martor pozitiv, (2) - rezultat martor negativ, (3-6) - probe clinice.

În testele pentru sifilis folosind această metodă, în prealabil curățat și distrus la componentele constitutive treponemul palid este supus electroforezei în gel de poliacrilamidă sau agaroză. În același timp, antigenele incluse în compoziția sa sunt separate prin greutate moleculară.

Apoi, prin electroforeză verticală, antigenele sunt transferate pe o bandă de nitroceluloză, care conține acum un spectru invizibil de benzi antigenice caracteristice treponemului palid.

În timpul analizei, materialul de testat (ser, plasma sanguină a pacientului etc.) este aplicat pe o bandă (bandă) de nitroceluloză. Dacă există anticorpi specifici în probă, atunci în procesul de incubare se leagă puternic de benzile antigenice care le corespund strict (complementare) și formează un complex „antigen-anticorp”.

După îndepărtarea imunoglobulinelor nelegate în timpul spălării benzii, urmează incubarea cu un conjugat - anticorpi marcați cu enzime la imunoglobulinele umane (anticorpi la IgG sau IgM umane), timp în care anticorpii marcați cu enzima sunt atașați la anticorpul antigen existent. complexe de pe suprafața membranei.

După îndepărtarea conjugatului nelegat în timpul incubării cu soluția de substrat, enzima interacționează cu substratul, rezultând o reacție de culoare - colorarea secțiunilor membranei (sub formă de benzi) în care se află antigenele individuale ale treponemului palid, anticorpii împotriva care se aflau în serul de testare. Intensitatea colorării depinde de cantitatea de anticorpi legați din ser. Rezultatul reacției este evaluat vizual.

Prezența benzilor în anumite zone ale plăcii de nitroceluloză confirmă prezența în serul studiat a anticorpilor la antigeni strict definiți ai treponemului palid.

Imunodeterminanții 15, 5, 17, 44,5, 47 kD determinați folosind această metodă au semnificație diagnostică în sifilis. Imunoblotarea Ig G este similară ca sensibilitate și specificitate cu RIF cu absorbție (RIF abs). Imunoblotarea Ig M poate servi ca test de diagnostic pentru sifilisul congenital.

3. Imunoblot în format imunotest liniar

Liniar analiza imunologica(imunotest de linie, LIA) vă permite să determinați simultan anticorpi la antigenele treponeme palide în ser sau plasmă umană. Antigenele sunt pre-aplicate pe benzile de testare (benzi), care sunt furnizate ca parte a truselor de diagnosticare comerciale.

Benzile sunt realizate din membrană de nitroceluloză, membrană de poliamidă cu suport de plastic sau membrană de nailon cu suport de plastic. În timpul fabricării, mai multe antigene discrete sunt plasate pe banda de testare ca linii antigenice separate. Pe lângă aceste antigene de sifilis, pe fiecare bandă sunt aplicate încă patru linii de control: streptavidină și martori (3+, 1+ și ± linia de tăiere).

Pentru benzi se folosesc antigene artificiale obținute prin inginerie genetică - proteine ​​recombinate sau construcții polipeptidice sintetice. Aceștia sunt analogi ai antigenilor de suprafață ai treponemului palid - TpN15, TpN17, TpN47 și TmpA cu o greutate moleculară de 15, 17, 47 kDa și 44,5 (TmpA), unde kDa = kiloDaltoni. Cu ajutorul lor, se determină anticorpii serici la diferite componente imunodominante ale agentului patogen.

Incubarea proba de testare trece într-o cuvă, unde este plasată și banda indicatoare. Anticorpii la T. pallidum sunt determinați prin legarea la antigenii imprimați pe benzile de testare. Dacă există anticorpi specifici pentru T. pallidum în probă, aceștia formează legături cu liniile individuale de antigen. Atunci când anticorpii conținuți în serul de testare interacționează cu antigeni discreti de T. pallidum plasați pe banda de testare, se formează un complex antigen-anticorp sub formă de benzi colorate detectabile vizual.

Luând în considerare rezultatele imunoblotării, reactivitatea serului la fiecare dintre antigene este evaluată separat. Un răspuns total pozitiv este emis atunci când se obține un rezultat simultan cu doi sau trei dintre antigenele prezentate.

Procedurile de cercetare se desfășoară manual sau pe un analizor special, cu interpretarea rezultatelor cu ajutorul unui instrument specializat program de calculator pentru boli infectioase.

Datorită gradului ridicat de purificare a antigenelor recombinante și a detectării simultane a anticorpilor la cei mai imunogeni determinanți ai agentului cauzal al sifilisului, metoda are sensibilitate și specificitate ridicate.

4. Contabilitatea rezultatelor

Pentru a citi intensitatea colorării benzilor antigenice pe benzi, au fost dezvoltate fotometre, a căror funcționare se bazează pe reflectarea semnalului, care elimină evaluarea subiectivă și oferă o posibilă oportunitate de automatizare.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să se folosească

Testele care utilizează metoda Western blot pot detecta anticorpi specifici la antigenele Treponema pallidum într-un stadiu foarte incipient al bolii. Cei mai semnificativi în diagnosticul sifilisului sunt anticorpii la antigenele treponemului palid TpN15, TpN17, TmpA și TpN47. Acești antigeni sunt proteine ​​​​de membrană având greutăți moleculare de 15, 17, 44,5 și, respectiv, 47 kDa.

Când treponema pallidum este introdus în corpul uman, anticorpii antisifilitici apar în această ordine: mai întâi se dezvoltă un răspuns imun la antigenele TpN17, apoi la TpN47, după TpN15 și mai târziu decât toate TmpA. Luând în considerare rezultatele testelor, se evaluează separat reactivitatea serului față de fiecare dintre ele. De exemplu, atunci când într-o pată liniară există reactivitate numai la linia antigenică TpN17 și TpN47, aceasta înseamnă că boala este într-un stadiu incipient. Cu cât liniile antigenice devin mai reactive, cu atât mai mult progresează infecția. În tratamentul sifilisului, modelul de reactivitate în acest test se modifică.

Determinarea IgM la proteine ​​cu o greutate moleculară de 15,17, 41, 47 kDa face posibilă identificarea a 29,2% dintre pacienții cu sifilis secundar, 12,5% cu sifilis latent precoce și 8,0% cu serorerezistent. Căutarea IgG la aceleași molecule se caracterizează printr-o sensibilitate de 61,6% pentru sifilisul serorerezistent și de 100% pentru sifilisul latent secundar și precoce.

6. Sensibilitate și specificitate

Conform literaturii de specialitate, sensibilitatea si specificitatea testului sunt foarte mari - 99,6-100%, respectiv 99,3-99,5%. În metoda clasică, aceasta se realizează prin separarea electroforetică a proteinelor, glico- și lipoproteinelor și specificitatea maximă a detectării serurilor imune sau Anticorpi monoclonali. În condiții optime, imunoblotarea poate detecta antigenul în cantități mai mici de 1 ng în volumul de testat.

Sensibilitatea blotului linear este, de asemenea, de 99,6%, iar specificitatea este între 99,3% și 99,5%.

Potrivit experților, imunoblotarea cu antigeni recombinanți foarte specifici este similară ca sensibilitate și specificitate cu RIF abs.

Conform datelor din literatură străină și rezultatelor unui studiu la TsNIKVI, metoda imunoblotării are sensibilitate ridicată (98,8-100%) și specificitate (97,1-100%) în diagnosticul de sifilis.

7. Domeniul de aplicare al metodei

Imunoblot (immunoblot) este o metodă de referință foarte specifică și foarte sensibilă. Sensibilitatea și specificitatea ridicate permit ca această metodă să fie considerată un test de confirmare pentru sifilis. Metoda poate fi folosită pentru a confirma diagnosticul, precum și dacă alte teste treponemale dau rezultate îndoielnice și contradictorii. Western blot poate confirma diagnosticul la pacienții cu rezultate pozitive sau nedeterminate ale testelor, inclusiv cele obținute prin TPHA sau ELISA.

8. Surse și cauze ale erorilor de punere în scenă, fals pozitive și fals negative

Rezultatele fals pozitive sunt foarte rare. Rezultatele fals-negative sunt, de asemenea, destul de rare și se observă la pacienții cu imunodeficiențe - mai des la persoanele infectate cu HIV și cu efectul unei „ferestre” diagnostice din cauza întârzierii sintezei anticorpilor, precum și a erorilor în stadiul de stadializare.

Utilizarea sistemelor moderne de testare dictează respectarea exactă a tuturor cerințelor atât pentru material, cât și pentru performanța reacției. Practic, sursa erorilor este o încălcare a ordinii și tehnologiei studiului (în special pentru Western blot clasic), nerespectarea recomandărilor producătorilor de truse de testare. . De asemenea, se pot face erori la recoltarea, livrarea, păstrarea probelor de ser sanguin, precum și la efectuarea testelor. Pe lângă probele contaminate, alte cauze posibile includ utilizarea truselor de testare expirate și erorile în analiza rezultatelor testelor.

9. Caracteristici, avantaje și dezavantaje

Unicitatea imunoblot constă în conținutul său ridicat de informații și fiabilitatea rezultatelor.

Testul nu necesită antigene foarte purificate, seruri de referință și de control. Identificarea unei ținte de anticorpi se bazează pe greutatea moleculară a proteinei cu care reacționează anticorpii din serul pacientului. Într-o reacție, poate fi detectată legarea anticorpilor la mai mulți antigeni, fiecare dintre acestea putând fi caracterizat cu precizie. Datorită acestui fapt, imunoblotarea are o serie de avantaje față de alte metode de detectare a anticorpilor, ale căror rezultate depind de standardizare, sensibilitate, calitatea substratului, instabilitatea sau insolubilitatea anumitor antigene.

Metoda este ușor reproductibilă, relativ ușor de realizat și interpretat rezultatele, face posibilă determinarea spectrului de anticorpi la mai mulți antigeni T. pallidum simultan și evaluarea contribuției anticorpilor cu specificitate diferită la reacția globală.

Utilizarea de antigene recombinante și peptidice înalt purificate minimizează reactivitatea nespecifică a serurilor. Utilizarea metodei face posibilă evitarea metodelor subiective și intensive în muncă, care sunt periculoase pentru cercetător (transplant de tulpini de G. pallidum, lucru cu T. pallidum patogen la stabilirea unei reacții). Aceasta determină preferința pentru metoda imunoblotării față de alte teste treponemale (RIF și în special RIBT) pentru diagnosticul de sifilis.

10. Modificări de metodă

Există mai multe sisteme comerciale de testare bazate pe această metodă. Unele dintre ele sunt în format western blot, constau din benzi pe care sunt transferate componentele proteice ale T. pallidum, separate in prealabil prin electroforeza pe gel de poliacrilamida.

Altele sunt în format blot liniar, constau din benzi pe care polipeptidele recombinante și sintetice sunt adsorbite sub formă de linii discrete - analogi ai antigenelor de suprafață ai T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 și TmpA.

Rezultatele Western blot sunt mai dificil de interpretat deoarece benzile prezintă o mare varietate de anticorpi, dintre care mulți sunt specifici grupului. În schimb, interpretarea rezultatelor blot linear este simplă; în plus, liniile de control suplimentare imprimate pe bandă permit evaluarea semicantitativă a nivelului de anticorpi la cei patru antigeni de T. pallidum.

Tehnologia xMAP

hMAR - tehnologie moderna, care permite efectuarea de studii multiparametrice prin detectarea simultană a mai multor analiți într-o singură probă biologică. Ca fază solidă se folosesc microsfere colorate acoperite cu reactivi de captare (oligonucleotide, anticorpi, antigeni).

Proba de testat este adăugată la soluția care conține microsfere. Analiții detectați în probă sunt legați de microsfera corespunzătoare, după care se adaugă în soluție un agent de detectare (anticorpi de detectare, etichetă fluorescentă). Pentru detectarea analitului de determinat se folosește un sistem de două lasere, care permite atât o evaluare calitativă a prezenței unui analit într-o probă (pentru aceasta se folosește un laser roșu care clasifică microsferele după culoare), cât și o evaluare cantitativă. a conținutului de analit dintr-o probă (pentru aceasta se folosește un laser verde).

Testele serologice de sânge sunt extrem de importante. În prezent, se folosește un complex de reacții serologice - de obicei se pun reacția Wassermann clasică și două reacții sedimentare. Dintre reacțiile sedimentare, sunt mai des utilizate reacțiile Kahn, Zaks-Vitebsky și citocolice.

Rezultatele studiilor serologice sunt indicate prin plusuri, după cum urmează: + + + + puternic pozitiv, + + + pozitiv, + + și + slab pozitiv; o reacție negativă este indicată de semnul minus (-).

Pe lângă complexul specificat de reacții serologice, în ultimii ani, reacția de imobilizare a treponeamelor palide (testul Nelson-Meyer), care se efectuează cu un antigen specific (suspendarea treponeamelor palide), a devenit larg recunoscută. Această reacție este mai specifică decât complexul menționat de reacții care sunt efectuate cu antigeni nespecifici. Testul Nelson-Meyer este de o valoare deosebită atunci când se decide asupra specificității unei reacții Wassermann pozitive și a reacțiilor sedimentare la indivizii care nu prezintă simptome de sifilis.

Reacții serologice în diferite perioade de sifilis. Valoarea diagnostică a reacțiilor serologice în diferite perioade de sifilis nu este aceeași. În perioada primară - în decurs de 2-3 săptămâni de la debutul sifilomului primar - reacțiile serologice sunt de obicei negative; incepand din saptamana 3-4 devin pozitive la unii pacienti. Pe măsură ce boala se apropie de perioada secundară, procentul reacțiilor serologice pozitive crește, iar în momentul în care apar simptomele secundare ale sifilisului, acestea devin pozitive la aproape 100% dintre pacienți.

În perioadele proaspete secundare și recurente ale bolii, reacțiile serologice din sânge rămân pozitive la aproape 100% dintre pacienți.

În perioada terțiară a sifilisului cu manifestări active ale bolii, reacțiile serologice adesea, la aproximativ 15% dintre pacienți, pot fi negative, iar în absența manifestărilor active ale bolii, numărul reacții negative poate ajunge la 30-40%.

Reacțiile serologice ca criteriu pentru tratamentul cu succes al sifilisului. Tratamentul specific al sifilisului trebuie efectuat sub controlul reacțiilor serologice. De obicei, la pacienții cu perioada seropozitivă primară și proaspătă secundară, reacțiile serologice devin negative după 1-2 luni de tratament rațional al sifilisului; în perioada recurentă secundară pot deveni negative în același timp sau ceva mai târziu. Dacă, în termenii indicați, reacțiile serologice nu devin negative, atunci aceasta indică o lipsă de eficacitate a tratamentului. În astfel de cazuri, este necesar să se sporească eficacitatea terapiei, dar nu prin creșterea dozei de medicamente, ci prin schimbarea metodei de tratament și adăugarea de metode de terapie nespecifice.

Reacțiile serologice puternic pozitive în absența simptomelor clinice pot fi considerate un simptom al sifilisului, cu condiția ca acestea să rămână puternic pozitive la repetarea testelor și ca testul să fi fost efectuat într-un laborator serologic calificat.

Reacțiile serologice slab pozitive în absența simptomelor clinice și a altor constatări nu pot susține diagnosticul de sifilis; astfel de rezultate trebuie luate în considerare numai în acele cazuri în care pacientul a avut sifilis în trecut și a fost supus unui tratament adecvat. Reacțiile serologice slab pozitive pot fi, de asemenea, importante dacă pacientul are o boală de etiologie necunoscută. În aceste cazuri, rezultatele reacțiilor serologice trebuie evaluate luând în considerare alte date anamnestice, clinice și de laborator.

Reacții serologice nespecifice poate fi observată în multe boli. Deci, un rezultat puternic pozitiv apare adesea cu lepră și febră recurentă. În malarie, tuberculoză, bruceloză și multe alte boli infecțioase, precum și la pacienții cu tumori maligne, rezultatele sunt de obicei slab pozitive sau pozitive (+ + +) și rareori puternic pozitive (+ + + +).

Utilizarea băuturilor alcoolice sau a alimentelor grase înainte de studiu poate provoca o reacție nespecifică slab pozitivă. Sângele pentru testarea serologică trebuie luat pe stomacul gol.

În absența unui laborator serologic, sângele pentru cercetare este recomandat să fie trimis prin poștă într-un plic sub forma unei „picături uscate”.

Pentru a obține o picătură uscată, 5 ml de sânge din vena cubitală sunt colectate într-o eprubetă. Tubul cu sânge se lasă 2 ore la temperatura camerei. Cheagul de sânge rezultat este separat de pereții tubului cu un fir calcinat și răcit, apoi sângele este pus într-un loc răcoros până a doua zi dimineața. A doua zi, se colectează 0,75 ml de ser cu o pipetă gradată, care se aplică pe hârtie ceară sau pe o bandă de celofan. Serul pe hârtie sau celofan se lasă până a doua zi la temperatura camerei, ferindu-l de praf și muște. După aceea, hârtie ceară sau celofan cu ser uscat se rulează sub formă de pulbere farmaceutică, se pune într-un plic și, împreună cu un bilet de copertă, se trimite prin poștă la cel mai apropiat laborator serologic.

Trebuie remarcat faptul că metoda reacțiilor serologice folosind o „picătură uscată” de sânge este mai puțin fiabilă decât cea obișnuită.

Diagnosticul serologic al sifilisului

Diagnosticul de sifilis se bazează pe date clinice și de laborator. Diagnosticul de sifilis se face numai după confirmarea de laborator, adică detectarea treponemului palid în descărcarea unui șancru dur, papule erozive în sifilisul primar și secundar și datele de examinare serologică. Reacțiile serologice sunt o metodă extrem de valoroasă nu numai pentru confirmarea diagnosticului de sifilis, ci și pentru monitorizarea dinamicii cursului acestuia sub influența tratamentului și determinarea vindecării bolii.

Componentele standard ale complexului de reacții serologice (CSR) pentru constatarea unei infecții sifilitice sunt completate în prezent de reacții treponemale: RIBT (reacție de imobilizare a treponemului palid), RIF (reacție de imunofluorescență). Reacția Wasserman (RW, PB) se bazează pe fenomenul de fixare a complementului. Pentru formularea sa se folosește un antigen cardiolipin, care este un extract de alcool colesterol din mușchii unei inimi de bovine și are proprietăți antigenice similare cu treponemul palid.

Reacția lui Wasserman. Complementul este legat de un complex (antigen lipoid și reagină a serului de testat). Pentru a indica complexul format se folosește un sistem hemolitic (eritrocite de oaie și ser hemolitic).

Pe lângă reacția de fixare a complementului cu cardiolipină și antigene treponemale, grupul CSR a inclus o reacție pe sticlă (metoda expresă). Severitatea hemolizei în VD este indicată de plusuri:

puternic pozitiv - 4 +; pozitiv - 3 +; slab pozitiv - 2 + sau 1 +; negativ - -.

Setarea reacţiei conform metoda cantitativă, adică cu diferite diluții de ser (1:10; 1:20 etc. până la 1:320). Multiplicitatea reacțiilor serologice standard se explică prin mozaicitatea antigenică a treponeamelor palide și, prin urmare, în serul sanguin al pacienților apare o multiplicitate corespunzătoare de anticorpi (legare de complement, aglutinine, precipitine, imobilizine, anticorpi care provoacă fluorescența imună etc.) . În fiecare stadiu al sifilisului pot predomina anumiți anticorpi și, prin urmare, reacțiile cu unii antigeni pot fi deja pozitive, iar cu altele încă negative. În plus, specificitatea relativă a testelor serologice standard face necesară evitarea erori de diagnostic folosiți nu una dintre ele, ci un complex de reacții. CSR devine pozitivă la sfârșitul celei de-a 3-a săptămâni sau în a 4-a săptămână după apariția unui șancru dur. Aceste reacții sunt puternic pozitive și într-o diluție semnificativă a serurilor la aproape toți pacienții cu proaspăt secundar (98-99%), recurent secundar (100%), activ terțiar (70-80%) și latent terțiar (50-60%). sifilis. Cu toate acestea, CSR nu este un complex de reacție strict specific pentru sifilis. Ele pot fi pozitive la pacientele cu lepră, tuberculoză, bruceloză, malarie, lupus eritematos, precum și pneumonie, boli hepatice, cancer, după consumul de alcool, alimente grase, în timpul sarcinii, în special în a doua jumătate a acesteia, precum și în timpul primele 2 saptamani dupa nastere. Odată cu vârsta, numărul de rezultate fals-pozitive nespecifice ale CSR crește.

Pentru un diagnostic rezonabil al sifilisului, împreună cu datele CSR, sunt luate în considerare datele clinice, rezultatele unui studiu privind treponemul palid în manifestările manifeste ale sifilisului primar și secundar, datele din alte reacții serologice - RIBT și RIF.

RIBT se bazează pe fenomenul de imobilizare a treponemului palid de către anticorpi precum imobilizinele prezente în serul sanguin al pacienţilor cu sifilis. Ca antigen pentru RIBT, se folosește o suspensie de treponem palid obținut din țesuturile orhitei sifilitice de iepure. Treponemele palide, după ce le-a adăugat serul sanguin al pacientului, se opresc din mișcare, adică sunt imobilizate. Rezultatele reacției sunt evaluate ca procent: RIBT pozitiv este detectat în timpul imobilizării de la 51 la 100% din treponemul palid, slab pozitiv - de la 31 la 50%, îndoielnic - de la 21 la 30% și negativ - de la 0 la 20% . Reacția este pusă în condiții de anaerobioză. Imobilizinele apar în serul sanguin al pacienților mai târziu decât alți anticorpi, astfel încât RIBT devine pozitiv mai târziu decât CSR și RIF. RIBT este cea mai specifică dintre reacțiile existente la sifilis. Scopul său principal este de a recunoaște rezultatele fals pozitive la stabilirea unui CSR. Acest lucru este deosebit de important în relația cu pacienții la care sifilisul este latent fără manifestări externe, dar cu afectare a organelor interne sau a sistemului nervos. RIBT este de o importanță deosebită în recunoașterea rezultatelor fals pozitive ale CSR la femeile însărcinate. Trebuie amintit că rezultatele pozitive nespecifice ale RIBT sunt posibile și la pacienții cu sarcoidoză, lupus eritematos, tuberculoză, ciroză hepatică etc. Cu toate acestea, în aceste boli, RIBT este slab pozitiv (de la 30 la 50%) și nu atinge niciodată 100% ). Când sunt tratate cu antibiotice, rezultatele RIBT devin negative. Prin urmare, studiile care utilizează RIBT se efectuează numai după 7 zile, dacă s-au administrat antibiotice solubile în apă, și la 25 de zile după terminarea tratamentului cu antibiotice.

RECIF- o reacție mai sensibilă, deci este pozitivă deja în perioada seronegativă primară a sifilisului la 80% dintre pacienți. Din punct de vedere al specificității, RIF este inferior RIBT, ceea ce nu permite înlocuirea RIBT cu acesta, deși tehnica sa este mult mai simplă. Reacția este pusă în mai multe modificări: RIF-10, RIF-200 și RIF-abs. (absorbit). RIF-10 este mai sensibil, în timp ce RIF-200 și RIF-abs. mai specific. Principiul reacției este că un antigen specific (treponema pallidum) este combinat cu serul sanguin (anticorpii) al pacientului și cu serul fluorescent anti-specie (serul anti-globulină umană de iepure, combinat cu fluoresceină, o substanță care strălucește sub lumina ultravioletă) . Cu o reacție pozitivă, o strălucire galben-verzuie de treponeme palide poate fi văzută într-un microscop fluorescent, deoarece acestea sunt înconjurate de anticorpi fluorescenți care aderă la ele. Gradul de luminescență este estimat prin plusuri, ca și în cazul CSR. reacție pozitivă Se menționează 4+, 3+ și 2.+. Când gradul de luminescență este 1 + și nu există luminiscență, reacția este considerată negativă. Cu sifilisul secundar, RIF este pozitiv în aproape 100% din cazuri. Este întotdeauna pozitiv în sifilisul latent (99-100%), iar în formele terțiare și sifilisul congenital este pozitiv în 95-100%.

Metoda expres (microreacție pe sticlă).În această reacție, ca și în CSR, se folosește un antigen cardiolipin, din care o picătură este amestecată cu 2-3 picături din serul sanguin al persoanei examinate în godeurile unei plăci speciale de sticlă. Reacția se desfășoară prin mecanismul de precipitare. Durata totală a reacției este de 10-40 de minute. Rezultatul este evaluat prin cantitatea de precipitații și mărimea fulgilor; severitatea reacției este indicată prin plusuri: 4 +, 3 + etc., precum și CSR. Microreacția pe sticlă este mai puțin specifică pentru pacienții cu sifilis decât RV, dar oarecum superioară ca sensibilitate. Rezultatele fals-pozitive cu metoda expres sunt mai frecvente decât cu RV. Prin urmare, această metodă este permisă pentru utilizare numai ca reacție de selecție pentru examinările în masă ale populației, examinarea clinică și examinarea pacienților în laboratoarele de diagnostic clinic ale spitalelor somatice. Diagnosticul final al sifilisului pe baza acestei metode este interzis. Numai metoda expresă nu poate fi utilizată atunci când se examinează donatorii, femeile însărcinate și, de asemenea, pentru monitorizarea după tratamentul pacienților cu sifilis.

Pentru diagnosticarea sifilisului pot fi utilizate și alte metode: testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) cu reacție de microprecipitare (RPM) sau reacție de hemaglutinare pasivă (RPHA) cu RMP (inclusiv analogi străini ai RMP - RPR sau VDRL).

La efectuarea controlului clinic şi serologic după tratament specific(pentru a determina eficacitatea terapiei) este permis un studiu cantitativ al RMP (studiu al titrului de reacție în dinamică).

imunotestul enzimatic (ELISA,Eliza). Principiul reacției este de a combina antigenul sifilitic adsorbit pe suprafața unui purtător în fază solidă cu antigenul serului sanguin de testat și de a detecta un complex antigen-anticorp specific folosind un ser imun anti-specie marcat cu enzime. Sensibilitatea și specificitatea ELISA sunt similare cu RIF.

Reacția de hemaglutinare pasivă (RPHA). Macromodificarea acestei reacții se numește TRHA, micromodificarea este MHA-TR, iar versiunea automată este AMHA-TR.

serologie IgM.În ultimele decenii, dinamica formării de anticorpi în organismul pacienților cu sifilis a fost studiată pe scară largă înainte, în timpul și după încheierea tratamentului. Acest lucru se datorează faptului că la pacienții care sunt tratați pe deplin pentru sifilis, rezultatele pozitive ale reacțiilor serologice specifice la sifilis rămân pentru o lungă perioadă de timp, ceea ce complică decizia cu privire la problema vindecării pacienților, precum și diagnosticarea precoce a congenitale. sifilis. De asemenea, este dificil să se facă diferența între recidivă și reinfecție. La studierea formării de anticorpi în organismul pacienților cu sifilis, s-a constatat că IgM specifice sunt primele care sunt produse după infecție, care sunt detectate încă din a doua săptămână după infecție și ating o concentrație maximă în sânge la 6-9. săptămâni. Dupa 6 luni după terminarea terapiei la majoritatea pacienților în sânge nu sunt determinate. În a patra săptămână după infectare, organismul începe să producă IgG specifice. Acest tip de imunoglobulină în cea mai mare cantitate se determină la 1-2 ani de la infectare. Trebuie remarcat faptul că IgM specifice încetează să se producă atunci când antigenul dispare din organism, iar secreția de IgG continuă de către clonele de celule de memorie. În plus, moleculele mari de IgM nu trec prin placentă de la mamă la făt și, prin urmare, prin prezența lor la un copil, îi judecă infecția cu treponem palid. Având în vedere faptul că concentrația de IgM specifice în sânge scade în mod natural în timp, o creștere a titrului acestor anticorpi poate servi ca un semn auxiliar al prezenței unei recidive a bolii sau reinfectării.

Diagnosticul serologic al sifilisului

Diagnosticul de sifilis se bazează pe date clinice și de laborator. Diagnosticul de sifilis se face numai după confirmarea de laborator, adică detectarea treponemului palid în descărcarea unui șancru dur, papule erozive în sifilisul primar și secundar și datele de examinare serologică. Reacțiile serologice sunt o metodă extrem de valoroasă nu numai pentru confirmarea diagnosticului de sifilis, ci și pentru monitorizarea dinamicii cursului acestuia sub influența tratamentului și determinarea vindecării bolii.

Componentele standard ale complexului de reacții serologice (CSR) pentru constatarea unei infecții sifilitice sunt completate în prezent de reacții treponemale: RIBT (reacție de imobilizare a treponemului palid), RIF (reacție de imunofluorescență). Reacția Wasserman (RW, PB) se bazează pe fenomenul de fixare a complementului. Pentru formularea sa se folosește un antigen cardiolipin, care este un extract de alcool colesterol din mușchii unei inimi de bovine și are proprietăți antigenice similare cu treponemul palid.

Reacția lui Wasserman. Complementul este legat de un complex (antigen lipoid și reagină a serului de testat). Pentru a indica complexul format se folosește un sistem hemolitic (eritrocite de oaie și ser hemolitic).

Pe lângă reacția de fixare a complementului cu cardiolipină și antigene treponemale, grupul CSR a inclus o reacție pe sticlă (metoda expresă). Severitatea hemolizei în VD este indicată de plusuri:

puternic pozitiv - 4 +; pozitiv - 3 +; slab pozitiv - 2 + sau 1 +; negativ - -.

Formularea reacției printr-o metodă cantitativă este de asemenea importantă, adică cu diferite diluții de ser (1:10; 1:20 etc. până la 1:320). Multiplicitatea reacțiilor serologice standard se explică prin mozaicitatea antigenică a treponeamelor palide și, prin urmare, în serul sanguin al pacienților apare o multiplicitate corespunzătoare de anticorpi (legare de complement, aglutinine, precipitine, imobilizine, anticorpi care provoacă fluorescența imună etc.) . În fiecare stadiu al sifilisului pot predomina anumiți anticorpi și, prin urmare, reacțiile cu unii antigeni pot fi deja pozitive, iar cu altele încă negative. În plus, specificitatea relativă a reacțiilor serologice standard face necesară utilizarea nu a uneia dintre ele, ci a unui complex de reacții, pentru a evita erorile de diagnostic. CSR devine pozitivă la sfârșitul celei de-a 3-a săptămâni sau în a 4-a săptămână după apariția unui șancru dur. Aceste reacții sunt puternic pozitive și într-o diluție semnificativă a serurilor la aproape toți pacienții cu proaspăt secundar (98-99%), recurent secundar (100%), activ terțiar (70-80%) și latent terțiar (50-60%). sifilis. Cu toate acestea, CSR nu este un complex de reacție strict specific pentru sifilis. Ele pot fi pozitive la pacientele cu lepră, tuberculoză, bruceloză, malarie, lupus eritematos, precum și pneumonie, boli hepatice, cancer, după consumul de alcool, alimente grase, în timpul sarcinii, în special în a doua jumătate a acesteia, precum și în timpul primele 2 saptamani dupa nastere. Odată cu vârsta, numărul de rezultate fals-pozitive nespecifice ale CSR crește.

Pentru un diagnostic rezonabil al sifilisului, împreună cu datele CSR, sunt luate în considerare datele clinice, rezultatele unui studiu privind treponemul palid în manifestările manifeste ale sifilisului primar și secundar, datele din alte reacții serologice - RIBT și RIF.

RIBT se bazează pe fenomenul de imobilizare a treponemului palid de către anticorpi precum imobilizinele prezente în serul sanguin al pacienţilor cu sifilis. Ca antigen pentru RIBT, se folosește o suspensie de treponem palid obținut din țesuturile orhitei sifilitice de iepure. Treponemele palide, după ce le-a adăugat serul sanguin al pacientului, se opresc din mișcare, adică sunt imobilizate. Rezultatele reacției sunt evaluate ca procent: RIBT pozitiv este detectat în timpul imobilizării de la 51 la 100% din treponemul palid, slab pozitiv - de la 31 la 50%, îndoielnic - de la 21 la 30% și negativ - de la 0 la 20% . Reacția este pusă în condiții de anaerobioză. Imobilizinele apar în serul sanguin al pacienților mai târziu decât alți anticorpi, astfel încât RIBT devine pozitiv mai târziu decât CSR și RIF. RIBT este cea mai specifică dintre reacțiile existente la sifilis. Scopul său principal este de a recunoaște rezultatele fals pozitive la stabilirea unui CSR. Acest lucru este deosebit de important în relația cu pacienții la care sifilisul este latent fără manifestări externe, dar cu afectare a organelor interne sau a sistemului nervos. RIBT este de o importanță deosebită în recunoașterea rezultatelor fals pozitive ale CSR la femeile însărcinate. Trebuie amintit că rezultatele pozitive nespecifice ale RIBT sunt posibile și la pacienții cu sarcoidoză, lupus eritematos, tuberculoză, ciroză hepatică etc. Cu toate acestea, în aceste boli, RIBT este slab pozitiv (de la 30 la 50%) și nu atinge niciodată 100% ). Când sunt tratate cu antibiotice, rezultatele RIBT devin negative. Prin urmare, studiile care utilizează RIBT se efectuează numai după 7 zile, dacă s-au administrat antibiotice solubile în apă, și la 25 de zile după terminarea tratamentului cu antibiotice.

RECIF- o reacție mai sensibilă, deci este pozitivă deja în perioada seronegativă primară a sifilisului la 80% dintre pacienți. Din punct de vedere al specificității, RIF este inferior RIBT, ceea ce nu permite înlocuirea RIBT cu acesta, deși tehnica sa este mult mai simplă. Reacția este pusă în mai multe modificări: RIF-10, RIF-200 și RIF-abs. (absorbit). RIF-10 este mai sensibil, în timp ce RIF-200 și RIF-abs. mai specific. Principiul reacției este că un antigen specific (treponema pallidum) este combinat cu serul sanguin (anticorpii) al pacientului și cu serul fluorescent anti-specie (serul anti-globulină umană de iepure, combinat cu fluoresceină, o substanță care strălucește sub lumina ultravioletă) . Cu o reacție pozitivă, o strălucire galben-verzuie de treponeme palide poate fi văzută într-un microscop fluorescent, deoarece acestea sunt înconjurate de anticorpi fluorescenți care aderă la ele. Gradul de luminescență este estimat prin plusuri, ca și în cazul CSR. O reacție pozitivă este menționată 4 +, 3 + și 2. +. Când gradul de luminescență este 1 + și nu există luminiscență, reacția este considerată negativă. Cu sifilisul secundar, RIF este pozitiv în aproape 100% din cazuri. Este întotdeauna pozitiv în sifilisul latent (99-100%), iar în formele terțiare și sifilisul congenital este pozitiv în 95-100%.

Metoda expres (microreacție pe sticlă).În această reacție, ca și în CSR, se folosește un antigen cardiolipin, din care o picătură este amestecată cu 2-3 picături din serul sanguin al persoanei examinate în godeurile unei plăci speciale de sticlă. Reacția se desfășoară prin mecanismul de precipitare. Durata totală a reacției este de 10-40 de minute. Rezultatul este evaluat prin cantitatea de precipitații și mărimea fulgilor; severitatea reacției este indicată prin plusuri: 4 +, 3 + etc., precum și CSR. Microreacția pe sticlă este mai puțin specifică pentru pacienții cu sifilis decât RV, dar oarecum superioară ca sensibilitate. Rezultatele fals-pozitive cu metoda expres sunt mai frecvente decât cu RV. Prin urmare, această metodă este permisă pentru utilizare numai ca reacție de selecție pentru examinările în masă ale populației, examinarea clinică și examinarea pacienților în laboratoarele de diagnostic clinic ale spitalelor somatice. Diagnosticul final al sifilisului pe baza acestei metode este interzis. Numai metoda expresă nu poate fi utilizată atunci când se examinează donatorii, femeile însărcinate și, de asemenea, pentru monitorizarea după tratamentul pacienților cu sifilis.

Pentru diagnosticarea sifilisului pot fi utilizate și alte metode: testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) cu reacție de microprecipitare (RPM) sau reacție de hemaglutinare pasivă (RPHA) cu RMP (inclusiv analogi străini ai RMP - RPR sau VDRL).

La efectuarea controlului clinic și serologic după un tratament specific (pentru a determina eficacitatea terapiei), este permis un studiu cantitativ al RMP (studiul titrului reacției în dinamică).

imunotestul enzimatic (ELISA,Eliza). Principiul reacției este de a combina antigenul sifilitic adsorbit pe suprafața unui purtător în fază solidă cu antigenul serului sanguin de testat și de a detecta un complex antigen-anticorp specific folosind un ser imun anti-specie marcat cu enzime. Sensibilitatea și specificitatea ELISA sunt similare cu RIF.

Reacția de hemaglutinare pasivă (RPHA). Macromodificarea acestei reacții se numește TRHA, micromodificarea este MHA-TR, iar versiunea automată este AMHA-TR.

serologie IgM.În ultimele decenii, dinamica formării de anticorpi în organismul pacienților cu sifilis a fost studiată pe scară largă înainte, în timpul și după încheierea tratamentului. Acest lucru se datorează faptului că la pacienții care sunt tratați pe deplin pentru sifilis, rezultatele pozitive ale reacțiilor serologice specifice la sifilis rămân pentru o lungă perioadă de timp, ceea ce complică decizia cu privire la problema vindecării pacienților, precum și diagnosticarea precoce a congenitale. sifilis. De asemenea, este dificil să se facă diferența între recidivă și reinfecție. La studierea formării de anticorpi în organismul pacienților cu sifilis, s-a constatat că IgM specifice sunt primele care sunt produse după infecție, care sunt detectate încă din a doua săptămână după infecție și ating o concentrație maximă în sânge la 6-9. săptămâni. Dupa 6 luni după terminarea terapiei la majoritatea pacienților în sânge nu sunt determinate. În a patra săptămână după infectare, organismul începe să producă IgG specifice. Acest tip de imunoglobulină în cea mai mare cantitate se determină la 1-2 ani de la infectare. Trebuie remarcat faptul că IgM specifice încetează să se producă atunci când antigenul dispare din organism, iar secreția de IgG continuă de către clonele de celule de memorie. În plus, moleculele mari de IgM nu trec prin placentă de la mamă la făt și, prin urmare, prin prezența lor la un copil, îi judecă infecția cu treponem palid. Având în vedere faptul că concentrația de IgM specifice în sânge scade în mod natural în timp, o creștere a titrului acestor anticorpi poate servi ca un semn auxiliar al prezenței unei recidive a bolii sau reinfectării.

Cu cât sifilisul este detectat mai devreme și mai precis, cu atât tratament mai ușorși există o șansă mai mare ca acesta să meargă fără probleme pentru pacient.

Scopul pentru toate testele de laborator este același: a face un diagnostic fără ambiguitate și rapid. Dar niciunul dintre testele moderne de înaltă tehnologie pentru sifilis nu oferă rezultatul fără ambiguitate și cu o acuratețe de 100%. Metodele vechi sunt îmbunătățite, sunt inventate altele noi, dar până acum, în practica clinică, medicii trebuie să folosească întotdeauna o combinație de mai multe teste diferite pentru sifilis. Medicii nu se pot baza pe rezultatul nimănui.

Există atât de multe varietăți de analize pentru sifilis, încât este imposibil să înțelegeți toate abrevierile din mers:

Pentru prima dată, a fost posibilă identificarea bolii folosind o reacție de laborator în 1906. Acesta este meritul savantului german August Wassermann, după care poartă numele reacției. A trecut mult timp de atunci, metoda este depășită și nu este folosită în practică, dar diagnosticul de sifilis este încă puternic asociat cu analiza RV.

O persoană poate avea nevoie să fie testată pentru sifilis din mai multe motive.
Primul motiv care îmi vine în minte este atunci când se suspectează o infecție, iar în practică nu este cel mai frecvent. În acest caz, este important să înțelegem că infecția are o perioadă de incubație (din momentul infecției până la formarea unui șancru dur) și o perioadă seronegativă primară (șancru dur în primele trei săptămâni) - în acest moment, testele vor fi negative. Prin urmare, dacă temerile sunt grave, testele se repetă după câteva săptămâni.

Mai des, persoanele care nu suspectează nicio infecție trebuie testate pentru sifilis. Acest lucru se întâmplă de obicei la aplicarea pentru un loc de muncă (analiza este inclusă în cartea medicală) și în timpul examinărilor medicale periodice (examenele medicale). De asemenea, este obligatoriu să dați sânge pentru sifilis:

• donatori
• femeile din primele săptămâni de sarcină - de două ori, la înregistrarea la clinica prenatală și la maternitate cu câteva săptămâni înainte de naștere,
• pacienții înainte de operație sau orice alte intervenții medical invazive ( FGDS, bronhoscopie etc.).

La sfârșitul articolului, am răspuns la cele mai frecvente întrebări ale persoanelor care se confruntă cu diagnosticul de sifilis. Nu este timp pentru a citi detalii despre metodele de cercetare -.

Toate tipurile de cercetări asupra sifilisului

Există 2 grupe principale de metode de cercetare pentru sifilis: directe și indirecte.

• metoda directa- acesta este un studiu în care infecția în sine este căutată în biomaterial - reprezentanți individuali ai agentului patogen în ansamblu sau piesele lor - ADN.
• Metode indirecte (testele serologice) este un test în care se încearcă depistarea anticorpilor la agentul cauzal al sifilisului în sânge. Logica este aceasta: dacă se găsește un răspuns imun caracteristic unui fel de infecție, atunci există o infecție în sine care a provocat acest răspuns imun.

metode directe,- cel mai de încredere: dacă bacteria este „prinsă în flagrant”, atunci prezența bolii este considerată dovedită. Dar treponema pallidum este dificil de prins, iar rezultatele negative ale testelor nu exclud prezența infecției. Este logic să efectuați aceste studii numai în prezența erupțiilor cutanate și numai în forma precoce de sifilis - până la doi ani de boală. Acestea. este imposibil să se determine sifilisul latent sau formele sale tardive prin aceste metode, prin urmare, în practica clinică, acestea sunt rareori utilizate și doar pentru a confirma alte teste.

Metodele directe includ: Microscopie în câmp întunecat, infecția animalelor de laborator, PCR .

1. Microscopie în câmp întunecat ( TPM) - examinarea treponemului palid la microscop. Materialul este luat dintr-un șancru dur sau erupție cutanată. Metoda este ieftină și rapidă și detectează sifilisul chiar la începutul perioadei primare, când testele de sânge pentru sifilis sunt încă negative. Dar bacteriile, care se află în cantități mici în erupții cutanate, nu pot intra cu ușurință în răzuire. În plus, treponemele palide pot fi ușor confundate cu alți locuitori. cavitatea bucală, canal anal etc.
2. Infectarea animalelor de laborator este o metodă foarte costisitoare și minuțioasă, folosită doar în practica cercetării.
3. PCR- o metodă relativ nouă, o caută ADN infectii. Orice țesut sau lichid care poate conține treponeame palide este potrivit pentru cercetare: sânge, urină, secreții de prostată, ejaculat, zgârieturi de la erupții cutanate, din tractul genito-urinar, orofaringe sau conjunctivă. Analiza este foarte sensibilă și specifică. Dar complicat și scump. Atribuiți-l în cazul rezultatelor discutabile ale altor teste.

Metodele indirecte, sunt și reacții serologice, stau la baza studiului de laborator al sifilisului. Aceste metode sunt utilizate pentru screening-ul în masă al populației, pentru a confirma diagnosticul și tratamentul de control. Metodele de cercetare indirectă sunt împărțite în teste non-treponemice și treponemale.

Testele non-treponemale sunt considerabil mai ieftine. Pentru implementarea lor se folosește nu proteina antigenă în sine, specifică treponemului sifilitic, ci înlocuitorul acesteia, antigenul cardiolipin. Aceste teste sunt foarte sensibile, dar slab specifice. Aceasta înseamnă că astfel de teste vor identifica pe oricine are sifilis și nu numai: oamenii sănătoși pot avea și rezultate fals pozitive. Sunt utilizate pentru screening-ul în masă al populației, dar în cazul unui rezultat pozitiv, ele trebuie confirmate prin teste mai specifice - treponemale. Testele totuși non-treponemice sunt foarte utile în evaluarea eficacității tratamentului: când tratament eficient volumul anticorpilor din sânge scade, iar titrul acestora scade în consecință (vom vorbi despre aceste titruri puțin mai detaliat). Cel mai sigur rezultat al acestor teste non-treponemice va fi în timpul sifilisului timpuriu, în special în perioada secundară.

Testele non-treponemale includ:

• Reacția lui Wasserman(, ea RV, sau RSK) este acum învechită și nu mai este utilizată, dar din cauza asocierii sale puternice cu boala, orice test utilizat pentru screening-ul populației pentru sifilis este adesea menționat ca atare. Dacă vedeți în direcția de la medic intrarea „analiza RV”- nu vă jenați, în laborator toată lumea cu siguranță va înțelege corect și va face RPR.
• Reacția de microprecipitare (DOMNUL, ea este RMP) este un test simplu și ieftin pentru sifilis. Utilizat anterior ca principal test non-treponemic, dar acum a făcut loc unui test mai convenabil și mai obiectiv RPR-Test.
• Test rapid PlasmaRegine (RPR-test) este un test rapid, simplu și convenabil pentru examinarea în masă a populației și controlul tratamentului. Este principalul test non-treponemic utilizat în Rusia și în străinătate.
• ÎNCREDERE este o versiune mai modernă RPR-Test. Într-un alt mod, se numește RPR-test cu roșu toludină. În Rusia, este utilizat doar într-un număr mic de laboratoare.
• VDRL - această analiză este similară în ceea ce privește fiabilitatea rezultatelor RMP, și este, de asemenea, inferior RPR. În Rusia, nu a găsit o aplicație largă.
• USR-Test(sau modificarea acesteia - RST-test) - mai avansat VDRL test, cu toate acestea, în Rusia este, de asemenea, folosit extrem de rar.

Teste treponemale efectuată cu antigene treponemale. Ele sunt mai specifice și, prin urmare, îndepărtează cu mai multă grijă pe cei sănătoși de cei bolnavi. Dar sensibilitatea lor este mai mică, iar astfel de teste pot lipsi o persoană bolnavă, mai ales într-un stadiu incipient al bolii. O altă caracteristică este că testele treponemale apar mai târziu decât cele netreponemale, la doar trei până la patru săptămâni după apariția unui șancru dur. Prin urmare, nu pot fi folosite ca screening. Scopul principal al testelor treponemale este de a confirma sau infirma rezultatele testelor non-treponemale.

Cu toate acestea, rezultatele testelor treponemale vor rămâne pozitive câțiva ani după un tratament cu succes. Din acest motiv, ele nu sunt utilizate pentru a monitoriza eficacitatea tratamentului și, de asemenea, nu se bazează pe rezultatele acestor teste, cu excepția cazului în care acestea sunt confirmate de teste non-treponemice.

Testele treponemale includ:

• RPGA (sau modificarea sa mai modernă - TRRA, TRNA) este o reacție pasivă de hemaglutinare. Principala reacție treponemică utilizată în prezent în străinătate și în Rusia. Un test simplu și convenabil pentru detectarea anticorpilor de sifilis în organism.
• ELISA (anti-Tr. pallidum IgG/IgM) - test imunosorbent legat de enzime, alias ELISA din prescurtarea engleză. Acest test poate fi efectuat atât cu antigenul cardiolipin, cât și cu treponemal. Poate fi folosit atât pentru screening, cât și ca confirmare. În ceea ce privește fiabilitatea, nu este inferior RPGAși este, de asemenea, testul treponemic recomandat pentru confirmarea diagnosticului de sifilis.
• Imunoblotting- aceasta este o îmbunătățire mai scumpă ELISA-Test. Folosit numai în cazuri de îndoială.
• RECIF - reacție de imunofluorescență. Analiză dificilă și costisitoare din punct de vedere tehnic. Este secundar, folosit pentru a confirma diagnosticul în cazurile îndoielnice.
• RIBT (RIT) - reacție de imobilizare (imobilizare) a treponeamelor palide. Această reacție este complexă, îndelungată în execuție și dificil de interpretat rezultatul. În unele locuri este încă folosit, dar trece treptat în fundal, cedând locul RPGAȘi ELISA.

Descifrarea testelor serologice pentru sifilis:

Algoritm pentru diagnosticarea „sifilisului”

Orice diagnostic constă din trei piloni principali ai medicinei: anamneza (antecedentele medicale), manifestările clinice (simptomele) și examenul de laborator. Dacă medicul suspectează sifilis pe baza poveștii pacientului și a examinării externe a corpului său, el prescrie un set de teste (sau un set de reacții serologice - DAC). Include neapărat 1 test non-treponemic ( RMP sau RPR) și 1 test treponemic ( RPGA sau ELISA). Dacă rezultatele acestor teste diferă, se efectuează un test treponemic alternativ suplimentar ( ELISA sau RPGA). Acesta este cel mai mult circuit simplu. În cazul unor indicatori îndoielnici, în funcție de situație, medicul prescrie alte metode de diagnostic.

Test rapid pentru sifilis sau cum se determină sifilisul acasă

Există un test pentru sifilis pe care îl puteți face singur. Poate fi cumpărat gratuit de la farmacie, cost mediu- 200-300 de ruble. Principiul determinării bolii este similar cu cel non-treponemic RPR. Producătorii susțin o precizie ridicată, dar în realitate este scăzută, nu mai mult de 70%.

Algoritmul acțiunilor în timpul testului seamănă cu un test de sarcină, în loc de urină se folosește doar sânge. Pe indicator se aplică o picătură de sânge, iar rezultatul apare în 10-15 minute. 1 bandă - testul este negativ, 2 benzi - testul este pozitiv.
Nu recomandăm această metodă de diagnosticare. Dacă aveți îndoieli cu privire la sifilis, este mai bine să consultați imediat un medic sau cel puțin un laborator independent. Va fi puțin mai scump și mai lung, dar mult mai precis.

Descifrarea rezultatelor pentru sifilis: plusuri, încrucișări și credite.

Tacticile suplimentare ale medicului depind de rezultatele anumitor teste. Rezultatele analizelor de screening sunt exprimate fie prin încrucișări (plus) fie într-o intrare separată:

4 sau 3 încrucișări - un rezultat pozitiv, este necesară o examinare suplimentară pentru sifilis folosind alte metode de diagnostic.
2 sau 1 cruce - rezultat îndoielnic, se recomanda repetarea rezultatului dupa 10 zile.
0 încrucișări - rezultat negativ, sifilisul nu a fost detectat.

În cazul unei reacții pozitive și îndoielnice, cercetări suplimentare sânge prelevat: diluarea acestuia de la 1:2 la 1:1024 și adăugarea unei picături de antigen cardiolipin la fiecare titru de sânge. Rezultatul înregistrează titrul maxim la care a avut loc reacția: cu cât diluția este mai mare, cu atât mai multă valoare titrul, cu atât este mai mare numărul de treponeme palide din sânge. Dar sarcina principală de determinare a titrului nu este de a calcula gradul de contaminare a sângelui, ci de a controla succesul tratamentului: tratamentul este considerat eficient dacă titrul scade de 4 ori în 4 luni. Până la sfârșitul tratamentului, rezultatele testelor non-treponemice ar trebui să devină negative.

Cea mai mare sensibilitate a testelor de screening se observă în perioada secundară a sifilisului (100%), ceva mai mică în primară (86%) și chiar mai puțin în cea terțiară (73%).

Nuanțe importante în diagnosticul sifilisului:

1. La efectuarea testelor, sunt posibile rezultate fals pozitive. Sunt frecvente în special în timpul proiecțiilor. Dacă nu ați avut niciodată sifilis, iar testele sunt pozitive, nu trebuie să vă panicați imediat, trebuie să faceți cel puțin o altă analiză alternativă.
2. Există, de asemenea, rezultate fals negative. Dacă există o suspiciune de sifilis, atunci este mai bine să repetați analiza după câteva săptămâni.
3. Sifilisul vindecat rămâne pozitiv la testele treponemice timp de câțiva ani sau toată viața.

Cele mai frecvente întrebări despre testele pentru sifilis

Cum să fii testat gratuit pentru sifilis?

Pentru a face acest lucru, trebuie să contactați clinica de la locul de reședință și să vizitați medicul local, care vă va trimite o trimitere pentru analiză. Testarea sifilisului este gratuită pentru toți rezidenții RF conform politicii CHI.

Unde pot fi testat pentru sifilis anonim?

Testele anonime pot fi făcute la orice laborator plătit, clinicile de îngrijire a pielii oferă deseori acest serviciu. De asemenea, este posibil să testați sifilisul acasă folosind teste rapide care sunt vândute în farmacii. Cu toate acestea, trebuie amintit că un astfel de test nu dă un rezultat precis și, dacă suspectați sifilis, trebuie să consultați un medic.

La câte zile după actul sexual pot dona sânge pentru sifilis?

După 1-1,5 luni. Dacă a apărut o infecție, atunci testul pentru sifilis va fi pozitiv nu mai devreme de șapte până la zece zile după apariția unui șancru dur sau la 4-5 săptămâni după infecție. Această perioadă poate fi mai lungă, deci rezultate negative analiza trebuie repetată după 2 săptămâni.

Unde iau sânge pentru sifilis?

Sângele pentru sifilis este luat mai des dintr-o venă, dar poate fi luat și de la un deget. Depinde de tipul de analiză.

Pregătirea. Cum să fii testat pentru sifilis?

Înainte de a dona sânge pentru sifilis, nu puteți mânca timp de patru ore - sângele trebuie donat pe stomacul gol. În plus, cu 12 ore înainte de analiză, nu puteți bea alcool. Acest lucru este important deoarece leziunile hepatice cauzate de alcool pot provoca teste fals pozitive.

Cât durează în medie un test pentru sifilis?

Rezultatele sunt de obicei disponibile a doua zi. Testele rapide nu durează mai mult de 30 de minute.

Ce analiză se face pentru sifilis și cum se numește?

Nici pentru screening, atunci când boala nu este suspectată RMP(reacție de microprecipitare), sau RPR(test rapid cu plasmă). Uneori, astfel de teste de screening sunt numite reacția Wasserman.

Dacă există suspiciuni sau îndoieli reale, acestea nu se limitează niciodată la o singură analiză. În același timp, se efectuează unul din oricare dintre grupurile de screening ( RMP sau RPR) și unul din oricare dintre grupurile de testare mai specifice ( RPGA sau ELISA), acționează în continuare în funcție de rezultate și de istoricul pacientului.

Poate un test pentru sifilis să fie greșit?

Pot fi! Probabilitatea de eroare a diferitelor metode depinde în primul rând de perioada de boală și de starea generală a corpului.

Testele non-treponemale sunt cele mai sensibile la apogeul bolii - în perioada secundară. Datorită specificității lor scăzute, de multe ori dau rezultate fals pozitive. Acest lucru se poate întâmpla din cauza febrei, a gripei sau a unei alte boli infecțioase, a unei vaccinări recente, a unei boli cronice și a o serie de alte motive.

Testele treponemale sunt mai sensibile în perioada târzie. Ele pot da, de asemenea, rezultate fals pozitive, dar numai dacă există bacterii patogene asemănătoare treponemului palid în organism care provoacă alte boli: treponematoze non-venerice (rar în Rusia) sau boala Lyme (transmisă prin mușcături de căpușă).

Rezultatele testelor fals negative sunt posibile cu toate metodele de diagnosticare. Ele depind de răspunsul imun al organismului: fără răspuns - fără reacție la sifilis. Acest lucru este posibil la persoanele infectate cu HIV, precum și la persoanele imunodeprimate din alte motive. În plus, există o reacție inversă: supraproducție de anticorpi, efectul „prozonă”, în care există atât de mulți anticorpi încât nu permit reciproc să reacționeze cu antigenul. Rezultatul este un rezultat fals negativ.

Testele generale pot arăta sifilis?

Sifilisul nu poate fi determinat nici printr-un test de sânge general, nici printr-unul biochimic. Nici un test general de urină sau un frotiu vaginal obișnuit nu o vor arăta. Toate studiile despre sifilis sunt foarte specializate și fiecare are propriul nume. Pentru orice altă analiză, este imposibil de calculat dacă o persoană are sau nu sifilis. Dar ce vor arăta alte teste dacă o persoană are sifilis? Să analizăm fiecare dintre ele:

Hemoleucograma completă: arată principalele celule sanguine - eritrocite, leucocite, trombocite. La sfârșitul perioadei primare și la începutul perioadei secundare, leucocitele pot crește la o persoană, precum și să crească ESR este un indicator al inflamației. Aceștia sunt indicatori foarte nespecifici care indică pur și simplu că organismul se luptă cu o infecție bacteriană. Restul testului de sânge va corespunde stării generale a corpului.

Test biochimic de sânge: arată funcționarea ficatului, rinichilor, inimii, pancreasului și a altor organe. Dacă sifilisul nu a lovit încă aceste organe și funcționează corect, testul de sânge va fi normal.

Analiza completă a urinei: arată funcționarea rinichilor și a sistemului endocrin, precum și stare generală organism. Dacă nu există boli acute sau cronice ale acestor sisteme, analiza va fi normală.

Tampon vaginal: determină dacă există un proces inflamator sau oncologic, precum și disbacterioză. Este imposibil să pui sifilis pe un astfel de frotiu.