Metode calitative și cantitative pentru determinarea aminoacizilor alfa. Determinarea cantitativă a aminoacizilor prin cromatografie pe hârtie. Metode de determinare a aminoacizilor

Și proteine

Se știe că toate cele 20 de varietăți de α-aminoacizi canonici au aceeași structură, cu trei variante de grupări funcționale (Fig. 3.3). Din păcate, reacțiile la grupările amino și carboxi nu sunt foarte specifice, deoarece respectiv, caracteristic tuturor aminelor, un număr de amide și acizi carboxilici. Același lucru este valabil și pentru majoritatea radicalilor lor = R, dintre care 10 sunt nepolari, adică sunt reprezentați de grupări alifatice = hidrocarburi, dintre care majoritatea sunt inerte din punct de vedere chimic. Specificitatea majorității aminoacizilor polari R este, de asemenea, relativ scăzută, în care apar alcool (Ser, Tre, Tyr) amidă (Acn, Gln) și grupări carboxil (Asp, Glu). Gruparea amino (Liz), imidazolul His și grupa guanidino Arg sunt mai active, în timp ce activitatea grupării tio Cys este cea mai mare. Prin urmare, reacția universală a ninhidrinei, specifică prezenței simultane atât a grupurilor amino cât și a carboxi la atomul α-C, a primit cea mai mare semnificație practică în analiza calitativă și cantitativă a α-aminoacizilor, inclusiv în analizoarele de aminoacizi.

Orez. 3.3. Formule generale pentru structura α-aminoacizilor și produsul lor de polimerizare. Explicații în text.

Polimerizarea α-aminoacizilor în structura peptidelor și proteinelor (Fig. 3.3) păstrează toate tipurile de R, dar:

1. Reacția ninhidrinei devine negativă, deoarece cu excepția N- și C-terminal, grupările α-amino și α-carboxi sunt cheltuite pentru formarea legăturilor peptidice. O reacție pozitivă a ninhidrinei cu proteine ​​indică mai degrabă prezența impurităților de aminoacizi în preparat sau vase.

2. Pentru toate peptidele și proteinele, reacția biuretului la grupa peptidică, care este absentă în aminoacizii monomerici, este specifică.

3. Dintre reacţiile mai specifice la R aminoacizi, sunt utile următoarele: reacţia xantoproteică cu acid azotic concentrat, la aromatic R Phe, Tyr, Tri; reacția cu isatina pentru inelul cu cinci membri Pro, precum și reacțiile pentru imidazolul R His, gruparea tio Cys și gruparea guanidino Arg. Este important să se țină cont de faptul că unii dintre acești R sunt ascunși în globulele proteice și, prin urmare, reacțiile calitative la acestea sunt slăbite. Prin urmare, înainte de a fi efectuate, proteinele sunt de obicei denaturate într-un fel sau altul.

4. Spre deosebire de soluțiile adevărate de aminoacizi, soluțiile coloidale de proteine ​​se caracterizează prin reacții sedimentare asociat cu distrugerea învelișurilor lor de hidratare și, ca urmare, o scădere a solubilității lor sub acțiunea agenților de îndepărtare a apei: săruri neutre = sărare, metanol = MeOH, etanol = EtOH, acetonă, uree și alți agenți.

Efectuând reacții calitative, ar trebui:

1. Respectați cu atenție regulile de siguranță la incendiu și lucrați cu acizi și alcali concentrați = EJ.

2. Marcați 2 rânduri de eprubete cu un sticla sau un stilou cu pâslă și nu puneți mai mult de 0,5 ml (2-5 picături) de soluție de aminoacizi 1% într-una dintre ele și aproximativ același volum de soluție de proteine ​​1% in cealalta.

3. Într-o pereche de eprubete cu soluții de aminoacizi și proteine, adăugați în paralel 3-5 picături din reactivii corespunzători și efectuați restul procedurilor indicate pentru reacția corespunzătoare.

4. Dacă este necesară încălzirea eprubetelor, scoateți capacul creuzetului și dați foc la combustibil uscat cu un chibrit. Apoi, prindeți eprubeta în suport, al cărui design primitiv este foarte nesigur. Prin urmare, este mai bine să înfășurați o pereche de eprubete cu o bucată de hârtie pliată într-o bandă și, ținându-le cu degetul mare, treceți uniform jumătățile inferioare ale eprubetelor prin flacără, evitând direcţia gâturilor asupra vecinilor şi fierberea rapidă a soluţiei. După finalizarea operațiunii, stingeți în timp util flacăra cu capacul creuzetului.

5. Se întocmesc rezultatele experimentelor, în conformitate cu modelul asupra răspândirii unui caiet de laborator sub forma unui tabel:

6. După luarea în considerare a rezultatelor și, după finalizarea protocolului, împreună cu un suport de eprubete, prezentați-le profesorului pentru protecție.

1. Reacția ninhidrinei. Pe baza dezaminării și decarboxilării α-aminoacizilor cu o soluție alcoolică de ninhidrin:

Amoniacul rezultat, reacționând cu două molecule de ninhidrin, formează un derivat colorat cu o absorbție maximă la 540 nm (pentru Pro - 440 nm).

Progres: Se adaugă 3-5 picături de soluție de alcool 0,5% de ninhidrin la probele studiate. Se încălzește ușor eprubetele cu amestecuri pe flacără și după 2-3 minute se înregistrează aspectul de culoare.

2. Reacția xantoproteică. După cum sa menționat mai sus, se bazează pe formarea nitroderivaților ai aminoacizilor cu R aromatic: Phen, Tyr, Tri.

Progres: Pornind tirajul hotei, adăugați cu atenție câteva picături de acid azotic concentrat (HNO3) într-o pereche de eprubete cu soluții de testare. Incalzeste usor eprubetele pe flacara, evitand directia gaturilor catre vecini, si inregistreaza dezvoltarea culorii.

3. Reacția nitroprusiatului. Se bazează pe hidroliza alcalină a aminoacidului cisteină care conține sulf, cu eliberare de sulfură de sodiu (Na 2 S), care dă un complex roșu cu o soluție proaspăt preparată de nitroprusid de sodiu.

Progres: Adăugați un volum egal de hidroxid de sodiu 20% în ambele eprubete cu 5-10 picături de soluții de testare și fierbeți timp de cel puțin 3-5 minute. Adăugați 3-5 picături de soluție de nitroprusiat de sodiu în eprubete și înregistrați dezvoltarea culorii.

4. Reacția biuretului. Se bazează pe formarea într-un mediu alcalin a unui complex colorat a unei legături peptidice cu un ion Cu 2+. Servește ca test universal pentru detectarea peptidelor și proteinelor în soluții. Deoarece odată cu creșterea numărului de legături peptidice, intensitatea culorii soluției crește liniar, aceasta este utilizată pe scară largă pentru determinarea fotometrică a concentrațiilor de proteine.

Progres. Adăugați aceeași cantitate de soluție de hidroxid de sodiu 10% în eprubete cu 5-10 picături de soluție de testare. Se amestecă bine și se adaugă 2 picături de soluție de sulfat de cupru 1% (CuSO 4). Se amestecă probele și după câteva minute se înregistrează dezvoltarea culorii.

5. Testați cu fierbere. Pe baza denaturarii termice a proteinelor.

Progres. Acidificați ambele eprubete cu soluții de testare cu cel mult o picătură de soluție de acid acetic (AcOH) 1% și încălziți până la fierbere. După fierberea soluțiilor timp de 2-3 minute, înregistrați rezultatele și explicați mecanismul fenomenului.

6. Precipitaţii cu săruri ale metalelor grele(Pe mine) . Proprietățile lor denaturante se bazează pe capacitatea cationilor Me grei de a reacționa cu grupele funcționale R ale moleculei proteice: tio-, amino-, carboxi-, aromatice. De asemenea, anionii lor puternici provoacă reîncărcarea grupărilor ionogene din moleculele de proteine, distrugând astfel legăturile ionice din ele.

Progres. Adăugați câteva picături dintr-o soluție 5% de sulfat de cupru (CuSO4) în ambele eprubete cu soluții de testare. Înregistrați și explicați rezultatele.

7. Precipitarea cu acizi organici. Se bazează pe denaturarea acidă a proteinelor și formarea de derivați covalenti ai grupărilor tio-, amino- și aromatice ale aminoacizilor R cu organoclorați.

Progres. Adăugați câteva picături dintr-o soluție 10% de acid tricloroacetic (TCA) în eprubete cu soluții de testare și înregistrați rezultatele în câteva minute

Metode de determinare a aminoacizilor

Aminoacizii sunt substanțe biologic active, joacă un rol important în viața corpului uman, sunt folosiți pe scară largă ca medicamente. Unele dintre ele sunt indispensabile și intră în organism cu alimente. În prezent, există o serie de metode pentru determinarea cantitativă a aminoacizilor din materialele vegetale medicinale, din medicamente și fluide biologice și din produsele alimentare.

Din întreaga varietate de metode de determinare cantitativă a aminoacizilor din diverse obiecte, se pot distinge patru grupe principale: metode de analiză cromatografice, spectrofotometrice, titrimetrice și electrochimice.

Metode cromatografice

În ultimele decenii, s-au făcut progrese semnificative în domeniul cromatografiei gaz-lichid a aminoacizilor. Este propusă o metodă care utilizează coloane microambalate, care face posibilă separarea aproape completă a 17 a-aminoacizi importanți biologic într-un timp relativ scurt.

A fost dezvoltată o metodă pentru determinarea aminoacizilor prin cromatografia gaz-lichid în probe de ser, plasmă, urină și lichid cefalorahidian, bazată pe prepararea eteri 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoil-izobutil, urmată de separare pe o coloană de polidimetilsiloxan în modul de programare a temperaturii de la 140°C.C până la 250°C cu detector de ionizare cu flacără. Timpul de separare cromatografică este de 28 minute. Ca rezultat al cercetărilor, a fost posibilă separarea a 27 de aminoacizi.

În ciuda varietății de metode de cromatografie lichidă de înaltă performanță în analiza aminoacizilor, versiunea în fază inversă cu detecție spectrofotometrică este cea mai expresivă și accesibilă. Pentru separarea și detectarea cu succes, aminoacizii sunt transformați în derivați hidrofobi și absorbanți de lumină, adică se efectuează derivatizarea pre-coloană. Ca reactivi pentru derivatizare se utilizează ortoftalaldehidă, naftalen-2,3-dicarboxialdehidă, 9-fluorenilmetilcloroformiat.

A fost dezvoltată o metodă pentru determinarea cantitativă a L-cistinei, acidului L-glutamic și glicinei în medicamentul Eltacin, care are activitate antioxidantă în combinație cu efect antianginos. Acidul glutamic și glicina au fost determinate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă după derivatizarea pre-coloană cu reactiv ortoftalaldehidă/N-acetil-L-cisteină. Derivatizarea cisteinei, conform autorilor, este dificilă din cauza instabilității aminoacidului însuși și a derivaților rezultați. Prin urmare, analiza cisteinei a fost efectuată prin metoda titrarii bromatometrice. S-a constatat că prezența unor cantități semnificative de cisteină în probă nu interferează cu determinarea produselor de derivatizare a glicinei și acidului glutamic cu reactivul ortoftalaldehidă / N-acetil-L-cisteină. Metoda se caracterizează prin reproductibilitate ridicată și precizie de determinare.

Posibilitatea utilizării 4,7-fenantrolinei-5,6-dionei (fanchinonă) ca reactiv fluorogen-etichetă pentru formarea precoloană a derivaților săi pentru separarea și analiza cantitativă a aminoacizilor prin cromatografie lichidă de înaltă performanță a fost studiat. Neavând propria fluorescență, fanchinona reacționează cu grupările amino ale aminoacizilor (la 68 °C timp de 160 min), formând iminochinoli, a căror fluorescență este măsurată la o lungime de undă de 460 nm. Derivații izolați au fost identificați prin spectre Tm, IR, masă și PMR. Cromatografia lichidă de înaltă performanță a fost efectuată pe un cromatograf cu detector fluorescent și o coloană cu gradient de eluare cu amestecuri: soluție de trietilamină - tampon fosfat (pH 3) - metanol. Chinidina a fost utilizată ca standard intern. Această metodă este destul de promițătoare în condițiile laboratoarelor mari și poate fi propusă pentru analiza aminoacizilor în forme de dozare finite.

A fost dezvoltată o tehnică de cromatografie lichidă de înaltă performanță cu biosenzor potențiometric pentru determinarea cantitativă a lizinei. Biosenzorul este construit prin atașarea unei membrane care conține lizinoxidază la un electrod NH4+ ion-selectiv. Ionii de amoniu generați în timpul degradării enzimatice a lizinei sunt detectați potențiometric. A fost dezvoltată o metodă expres cromatodensitometrică pentru analiza triptofanului în lichide de cultură. Cromatografia în strat subțire a fost efectuată pe plăci Sorbfil. S-a efectuat cromatografia în sistem propanol-2 - soluţie de hidroxid de amoniu 25% (7:3) timp de 25 de minute. Cromatogramele au fost uscate la temperatura camerei și ținute la 120°C timp de 15 minute. Pentru depistarea petelor pe cromatograme s-a folosit un reactiv specific - 4-dimetilaminobenzaldehida, selectiv la inelul indolic al triptofanului, sub forma unei solutii de etanol 0,5% cu adaos de acid sulfuric concentrat 5%. După dezvoltarea cromatogramelor prin imersare într-o cuvă de teflon cu o soluție proaspăt preparată de 4-dimetilaminobenzaldehidă, acestea au fost ținute timp de 5-7 minute la o temperatură de 110°C. Petele de triptofan au fost scanate la o lungime de undă de 625 nm folosind un densitometru video de computer. Metoda dezvoltată, în ciuda preciziei ridicate a determinării și a productivității, este specifică pentru triptofan.

Pentru analiza α-aminoacizilor din fluide biologice, medicamente și produse alimentare, sunt utilizate pe scară largă metodele de electroforeză capilară, bazate pe separarea componentelor unui amestec complex într-un capilar de cuarț sub acțiunea unui câmp electric aplicat. Deoarece aminoacizii sunt de natură zwitterionic, ei pot fi separați folosind tampon electroliți cu pH adecvat, cel mai frecvent sunt utilizați tampon de separare neutri și bazici.

Pentru a crește specificitatea și sensibilitatea metodei de electroforeză capilară pentru analiza α-aminoacizilor individuali, se utilizează derivatizarea lor preliminară, urmată de separarea într-un capilar de cuarț și determinarea spectrofotometrică a produselor de reacție. Astfel, formiatul de 9-fluorenilmetil, cloroformiatul de 9-(2-carbazol)-etil și colorantul cu cian sunt utilizați ca agenți de derivatizare. Perspectivele metodei se datorează avantajelor sale, cum ar fi analiza rapidă, ușurința în pregătirea probei, consumul redus de reactivi și ușurința instrumentării.

Acest articol va lua în considerare metodele de determinare a aminoacizilor, care sunt utilizați nu numai în analiza produselor, ci și în biochimie și analiza farmaceutică.

Cantitatea totală de aminoacizi poate fi realizată printr-o metodă fotometrică bazată pe determinarea amoniacului obținut din aminoacizi conform metodei Kjeldahl.

Reacția cu 1-naftol. Pentru determinarea argininei, histidinei, tirozinei s-a propus o reacție cu 1-naftol. În prezența hipocloritului de sodiu (NaOCl), soluția devine roșie. O soluție de probă în etanol 50% care conține aminoacid este răcită cu gheață și se adaugă o soluție de NaOCl 10% și o soluție de naftol. Produsul de reacție este colorat în roșu (l max = 550 nm). Conținutul de aminoacizi este determinat de intensitatea culorii soluției rezultate.

Reacția biuretului. Una dintre cele mai importante reacții utilizate pentru determinarea aminoacizilor este reacția biuretului. Reacția se realizează prin adăugarea unei soluții apoase diluate de sare de cupru (II) la o soluție alcalină de biuret. În acest caz, soluția se transformă într-o culoare violet intens datorită formării unui compus complex.

Compușii care conțin cel puțin 2 grupări amidice sau o grupare aminohidroxietilenă, precum și amide și imide ale aminoacizilor intră în reacția biuretului. Proteinele și soluțiile concentrate de aminoacizi și amide dau această reacție. Soluțiile diluate de aminoacizi nu dau o reacție de biuret și, prin urmare, reacția poate fi folosită pentru a stabili sfârșitul hidrolizei proteinelor. Reacția este folosită și pentru determinarea calitativă și cantitativă a proteinei. Metodele utilizate în laboratoarele de diagnostic clinic pentru determinarea proteinelor din sânge și din alte fluide biologice se bazează pe reacția biuretului.

reacția ninhidrinei. A doua cea mai importantă reacție folosită pentru determinarea aminoacizilor este reacția ninhidrinei - o reacție de culoare pentru a-aminoacizi, care se realizează prin încălzirea acestora din urmă într-o soluție alcalină de ninhidrine în exces.

Ninhidrina efectuează decarboxilarea oxidativă a a-aminoacizilor cu formarea de amoniac, dioxid de carbon și o aldehidă care conține un atom de carbon mai puțin decât aminoacidul original. Ninhidrina redusă reacţionează apoi cu amoniacul eliberat şi cu a doua moleculă de ninhidrina, formând un produs de condensare colorat cu amoniacul.

Compusul rezultat (pigmentul) are o culoare violet-albastru (l max = 570 nm). Formarea acestui compus colorat este utilizată într-un test cantitativ pentru a-aminoacizi, cu care aminoacizii pot fi detectați, chiar și cantitatea lor nu depășește 1 μg.

Prolina și hidroxiprolina, care nu au o grupare a-amino, reacționează cu ninhidrina pentru a forma derivați galbeni (l max = 440 nm). Reacția nu este specifică, pentru că un produs colorat cu ninhidrina dă, de asemenea, amoniac și compuși care conțin o grupare amino (amine, proteine, peptide). Cu toate acestea, nu se eliberează CO2 cu acești compuși. Eliberarea de dioxid de carbon este caracteristică numai pentru a-aminoacizi. Reacția este utilizată pentru determinarea cantitativă colorimetrică a a-aminoacizilor, inclusiv în analizoare automate de aminoacizi (măsurarea volumului de CO 2 ).

Reacția ninhidrinei este utilizată pentru a determina glicina, izoleucina, leucina; culoarea mai putin intensa este data de serina, fenilalanina, cisteina, tirozina, triptofanul etc.

Produsele rezultate se caracterizează printr-o culoare destul de intensă (e = 1,8–3,3 10 4), dar produsele colorate sunt instabile. Intensitatea culorii scade rapid. Se adaugă CdCl2 pentru stabilizare. Formează complecși stabili cu compușii rezultați. Clorura de cadmiu accelerează, de asemenea, reacția.

Aminoacizii și alți compuși care conțin o grupare amino se condensează într-un mediu alcalin cu 1,2-naftochinonă - 4-sulfoxilat pentru a forma derivați roșii, galbeni, de culoare portocalie ai 1,2-naftochinonei monoiminei.

Reacția este utilizată pentru determinarea a-aminoacizilor (valină, izoleucină, leucină etc.).

Reacția cu 4-dimetilaminobenzaldehida poate fi utilizată pentru determinarea triptofanului. Produsul de reacție este colorat în violet iar intensitatea culorii determină conținutul de triptofan din soluția analizată.

Trebuie remarcat, totuși, că această reacție este rar utilizată în analiza alimentelor.

Pentru determinarea cantitativă a aminoacizilor care conțin sulf se utilizează o metodă bromatometrică, bazată pe următoarea reacție:

O soluție de cisteină în soluție de NaOH 1% se toarnă într-un balon cu dop măcinat, 0,1 N. soluție de bromat de potasiu, bromură de potasiu uscată și acidulată cu HCI 10%.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Bromul format ca urmare a reacției, a cărui cantitate este echivalentă cu cantitatea de bromat de potasiu, reacționează cu aminoacidul. După 10 minute, se adaugă iodură de potasiu, care reacţionează cu bromul nereacţionat, iar iodul eliberat este titrat cu 0,1 N. soluție de tiosulfat de sodiu cu amidon ca indicator.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Cantitatea de tiosulfat folosită pentru titrare este echivalentă cu cantitatea de brom care nu a reacționat cu aminoacidul. Prin diferența dintre cantitatea de bromat de potasiu adăugat și tiosulfat, se găsește cantitatea de brom care a reacționat cu aminoacidul și, prin urmare, cantitatea de aminoacid.

Metionina este determinată în mod similar. Metionina este oxidată la sulfonă:

Această reacție, în anumite condiții, vă permite să determinați foarte precis conținutul de metionină.



Aminoacizii pot fi detectați cu ajutorul reacțiilor de culoare: ninhidrina, xantoproteină, Fol, Milon, teste biuret etc. Aceste reacții sunt nespecifice, deoarece se bazează pe detectarea fragmentelor individuale în structura aminoacizilor, care pot apărea și în alți compuși.

Reacția ninhidrinei, o reacție de culoare utilizată pentru determinarea calitativă și cantitativă a aminoacizilor, iminoacizilor și aminelor. Când este încălzit într-un mediu alcalin de ninhidrin (triketohidrindenhidrat, C 9 H b O 4) cu substanțe având grupări amino primare (-NH 2), se formează un produs care are o culoare albastru-violet intensă stabilă, cu o absorbție maximă de aproximativ 570 nm. Deoarece absorbția la această lungime de undă depinde liniar de numărul de grupări amino libere, reacția ninhidrinei a servit ca bază pentru determinarea lor cantitativă prin colorimetrie sau spectrofotometrie. Această reacție este folosită și pentru determinarea grupărilor amino secundare (> NH) în iminoacizi - prolină și hidroxiprolină; în acest caz, se formează un produs galben strălucitor. Sensibilitate - până la 0,01%. Analiza automată modernă a aminoacizilor este realizată prin combinarea separării aminoacizilor prin schimb de ioni și determinarea lor cantitativă folosind reacția ninhidrinei. La separarea amestecurilor de aminoacizi prin cromatografie pe hârtie, fiecare aminoacid poate fi determinat într-o cantitate de cel puţin 2-5 pg.

Cantitatea de aminoacizi poate fi judecată după intensitatea culorii.

Această reacție este pozitivă nu numai cu aminoacizii liberi, ci și cu peptide, proteine ​​etc.

reacție xantoproteică permite detectarea aminoacizilor aromatici (fenilalanina, tirozina, histidina, triptofanul), pe baza reactiei de substitutie electrofila in nucleul aromatic (nitrare).

Sub acțiunea acidului azotic concentrat, de exemplu, asupra tirozinei, se formează un produs galben.

Reacția lui Fohl. Aceasta este o reacție la cisteină și cistina. În timpul hidrolizei alcaline, „sulful slab legat” din cisteină și cistină se desprinde destul de ușor, rezultând formarea hidrogenului sulfurat, care, reacționând cu alcalii, dă sulfuri de sodiu sau de potasiu. Când se adaugă acetat de plumb(II), se formează un precipitat gri-negru de sulfură de plumb(II).

Descrierea experienței. Se toarnă 1 ml de soluție de cistină într-o eprubetă, se adaugă 0,5 ml de soluție de hidroxid de sodiu 20%. Amestecul este încălzit până la fierbere și apoi se adaugă 0,5 ml de soluție de acetat de plumb(II). Se observă un precipitat gri-negru de sulfură de plumb(II):

Reacția Zimmermann. Aceasta este o reacție la aminoacidul glicină.

Descrierea experienței. La 2 ml de soluție de glicină 0,1%, ajustată prin adăugarea unei soluții de alcali 10% la pH = 8, se toarnă 0,5 ml de soluție apoasă de dialdehidă o-ftalică. Amestecul de reacție începe să devină încet verde strălucitor. După câteva minute, apare un precipitat verde.

răspuns la triptofan. Triptofanul, reacționând într-un mediu acid cu aldehide, formează produse de condensare colorate. De exemplu, cu acidul glioxilic (care este o impuritate a acidului acetic concentrat), reacția se desfășoară conform ecuației:

Reacția triptofanului cu formaldehida se desfășoară conform unei scheme similare.

Reacția lui Sakaguchi. Această reacție la aminoacidul arginină se bazează pe interacțiunea argininei cu α-naftol în prezența unui agent oxidant. Mecanismul său nu a fost încă pe deplin elucidat. Aparent, reacția se desfășoară conform următoarei ecuații:

Deoarece derivații chinoneiminelor (în acest caz, naftochinona), în care hidrogenul grupei imino –NH– este înlocuit cu un radical alchil sau arii, sunt întotdeauna colorați în tonuri galben-roșu, atunci, aparent, portocaliul-roșu culoarea soluției în timpul reacției Sakaguchi se datorează apariției tocmai derivatului de naftochinonimină. Cu toate acestea, nu este exclusă posibilitatea formării unui compus și mai complex datorită oxidării ulterioare a grupărilor NH rămase ale reziduului de arginină și a inelului benzenic al α-naftolului:

Descrierea experienței. Se toarnă 2 ml dintr-o soluție 0,01% de arginină într-o eprubetă, apoi se adaugă 2 ml dintr-o soluție 10% de hidroxid de sodiu și câteva picături dintr-o soluție alcoolică 0,2% de α-naftol. Conținutul tubului se amestecă bine, se adaugă 0,5 ml de soluție de hipobromit și se amestecă din nou. Se adaugă imediat 1 ml de soluție de uree 40% pentru a stabiliza culoarea portocalie-roșu care se dezvoltă rapid.

Reacția biuretului- folosit ca reactie de culoare pentru proteine. Într-un mediu alcalin în prezența sărurilor de cupru(II), ele dau o culoare violetă. Culoarea se datorează formării unui compus complex de cupru(II), datorită grupării peptidice -CO-NH- care este caracteristic proteinelor. Această reacție și-a primit numele de la derivatul ureei - biuret, care se formează prin încălzirea ureei cu eliminarea amoniacului:

Pe lângă proteine ​​și biuret, și alți compuși care conțin această grupă dau aceeași colorare: amide, imide ale acizilor carboxilici, precum și compuși care conțin grupe -CS-NH- sau \u003d CH-NH- în moleculă. Proteinele, unii aminoacizi, peptidele, biuretul și peptonele medii dau, de asemenea, reacția.

Culoarea complexului obținut prin reacția biuretului cu diferite peptide este oarecum diferită și depinde de lungimea lanțului peptidic. Peptidele cu o lungime a lanțului de patru resturi de aminoacizi și mai sus formează un complex roșu, tripeptide - violet și dipeptide - albastru.

forma cetonică a unei polipeptide

forma enol a unei polipeptide

Când polipeptida interacționează cu Cu (OH) 2, se formează un complex, a cărui structură poate fi prezentată după cum urmează.

Echipament și reactiv: hârtie cromatografică; camera cromatografica; colorimetru fotoelectric; foarfece; plăci de sticlă (3x32 cm) - 3 buc.; suport pentru cromatograme; dulap de uscare; micropipete; eprubete cu dopuri de pământ; biuretă 25 ml; amestec standard de aminoacizi; test amestec de aminoacizi; butanol, acid acetic, apă în raport 15:3:7; 1% soluție de ninhidrin în 95% acetonă; alcool etilic (75%), saturat cu sulfat de cupru.

Finalizarea lucrării

Luați o foaie de hârtie cromatografică de 18x28 cm și trasați o linie orizontală cu un creion simplu la o distanță de 3 cm de marginea ei scurtă. Apoi este împărțit în segmente inegale în conformitate cu schema atașată și limitele de aplicare ale amestecurilor standard și de testare sunt marcate cu săgeți, iar inscripțiile corespunzătoare sunt făcute cu un creion simplu.

Hârtia se fixează deasupra suprafeței mesei și pe linia de start, limitată de săgeți, amestecul standard se aplică mai întâi cu o micropipetă specială într-o linie subțire până când întreaga soluție de la micropipetă este transferată pe linia de start (micropipeta este umplută). 2-3 cm). Masa soluției aplicate se măsoară cântărind pipeta umplută cu amestecul standard (înainte de aplicarea soluției) și goală (după aplicarea soluției). Pe hârtie se aplică de obicei 0,02-0,03 g de soluție standard. Apoi umpleți o pipetă curată cu amestecul de aminoacizi de testat (dat de profesor pentru studiu), cântăriți-o și aplicați amestecul pe linia de plecare cu marca corespunzătoare.

Cromatograma pregătită este plasată într-o cameră cromatografică cu un sistem de solvenți turnați în prealabil în ea pentru a separa un amestec de aminoacizi, de exemplu, un amestec de butanol, acid acetic și apă într-un raport de 15:3:7. Separarea se realizează prin cromatografie ascendentă până când linia frontală ajunge la 2-3 cm până la marginea superioară a hârtiei cromatografice (linia de sosire). După aceea, cromatograma este scoasă din cameră și capătul superior al hârtiei este imediat introdus într-un suport format din trei baghete de sticlă fixate cu un inel de cauciuc și plasate într-o hotă de fum timp de 20 de minute pentru a îndepărta solvenții din hârtie.

Orez. 8. Schema dispunerii aminoacizilor pe cromatogramă:

A - punct de aplicare a unui amestec de aminoacizi; I - cistina si cisteina;

2 - lizină; 3 - histidină; 4 - arginină; 5 - acid aspartic,

serie și glicină; 6 - acid glutamic și treonină; 7 - alanină;

8 - prolină; 9 - tirozină; 10 - valină și metionină; II - triptofan;

12 - fenilalanină; 13 - leucină și izoleucină

Cromatograma uscată este scufundată într-o soluție 1% de ninhidrin în acetonă pentru a detecta pozițiile petelor de aminoacizi de pe ea. Apoi cromatograma este plasată timp de 10 minute într-o hotă pentru a îndepărta acetona și transferată într-un cuptor, unde se lasă 15 minute la 70°C. Aminoacizii din amestecurile standard și de testare sunt detectați ca pete albastru-violet dispuse într-un lanț în direcția sistemului de solvenți de la linia de început până la marginea superioară a cromatogramei.

Identificarea aminoacizilor conținuti în amestecul de testat se realizează prin coincidență pe cromatograma pozițiilor ocupate de aminoacizii amestecurilor standard și de testare (Fig. 8).

Pentru a determina conținutul cantitativ de aminoacizi din amestecurile de testat, cromatograma este desenată cu un creion simplu, astfel încât zonele colorate situate la același nivel, corespunzătoare aceluiași aminoacid, să fie închise în dreptunghiuri aproximativ identice (Fig. 9). .

I II III IV

Orez. 9. Schema dispunerii aminoacizilor pe cromatogramă:

I - amestec nr. I; II - amestec nr 2; 1U - amestec nr 3; Ш - standard

amestec de aminoacizi

Secțiunile de hârtie conturate sunt decupate și plasate în eprubete, ale căror numere ar trebui să corespundă numărului de pete de pe cromatograme. Se toarnă 10 ml dintr-o soluție de etanol 75% saturată cu sulfat de miere în fiecare eprubetă dintr-o biuretă (se adaugă 0,2 ml dintr-o soluție saturată de sulfat de cupru la 500 ml de alcool etilic). Eprubeta se închide cu un dop și, amestecând periodic, se realizează o tranziție completă a culorii roșu cărămiziu (sare de cupru a albastru-violet al lui Rueman) din hârtie în soluție. Acest lucru durează 15-20 de minute. Absorbanța (densitatea optică) a soluțiilor standard și de testat este măsurată pe un fotoelectrocalorimetru cu filtru de lumină verde (540 nm). În fluxul de referință este instalată o cuvă cu o soluție de alcool etilic 75% cu sulfat de cupru.

Conținutul cantitativ de aminoacizi din soluția de testat se calculează din raportul dintre stingerea probelor test și standard.

Exemplu de calcul. Să presupunem că amestecul standard conține 1,8 mg de glicină în 1 ml, 0,02 g din această soluție standard se aplică pe banda de pornire. Prin urmare, cromatograma primită (1,8×0,02) = 0,036 mg de glicină. Să fim de acord în continuare că absorbanța soluțiilor colorate a fost 0,288 pentru standard și 0,336 pentru amestecul necunoscut. Apoi, conținutul de glicină din amestecul de testat aplicat pe cromatogramă va fi (36´0,336): 0,288=42 µg. Dacă mai presupunem că amestecul de testat este aplicat pe cromatogramă într-o cantitate de, de exemplu, 0,0250 g, atunci conținutul de glicină în 1 ml de soluție de testat va fi (42: 0,0250) = 1680 μg sau 1,68 mg / ml.

Întocmește rezultatele propriului experiment, trageți concluzii din ele.

Laboratorul #15

Separarea ionilorFe 3+ , co 2+ , Ni 2+