Módszerek rekombináns DNS sejtbe juttatására. Új módszer a DNS embrionális őssejtekbe való eljuttatására. Módszerek DNS-vakcinák sejtekbe juttatására

A sejtekbe történő génbejuttató rendszerek egyik legígéretesebb lehetősége a poliplexek – transzferált DNS és különböző természetű kationos polimerek komplexei. Ez a cikk ismerteti a többféle kationos polimeren alapuló poliplexek tulajdonságait, a célsejtek magjaiba való transzportjukat, valamint a kezelés egyik módszerét. rosszindulatú daganatok ezen struktúrák felhasználásával.

Bevezetés

A génterápia az örökletes, onkológiai és egyéb betegségek kezelése a szükséges genetikai anyag bejuttatásával a páciens sejtjeibe annak érdekében, hogy specifikusan megváltoztassák a génhibákat vagy új funkciókat adjanak a sejteknek [Gorbunova et al., 1997]. A DNS vagy RNS célsejtekhez való eljuttatásához hordozókat (vektorokat) hoznak létre, amelyek biztosítják magas szint transzfekciók, azaz exogén (idegen) DNS vagy RNS átvitele bizonyos típusú sejtekbe. Ezenkívül a vektoroknak védelmet kell nyújtaniuk genetikai információ, mert In vivo körülmények között az idegen DNS instabil a szérumnukleázok, a nukleinsavakat lebontó enzimek általi gyors lebomlás miatt.

A genetikai anyag transzporterek típusai

A természetben léteznek speciális struktúrák a genetikai információ sejtekbe - vírusok -ba való eljuttatására. Ezért kezdték géntranszporterként használni őket. Ugyanakkor a vírusvektorok használata igen egész sor korlátozásokat. Először is ez az átvitt genetikai anyag kis kapacitása és a vírusok eredendő sejtspecifitása. Másodszor, ez annak a lehetősége, hogy a vírusok visszatérjenek a vad típusba a rekombináció eredményeként az azonos típusú fertőzés áthaladása során. Harmadszor, a vírusrészecskék fehérjéi erősen immunogének, aminek következtében ismételt beadásuk immunválaszt vált ki. Végül, tömegtermelés A vírusvektorok még mindig meglehetősen problematikusak és költségesek. Jelenleg aktív fejlesztés alatt áll különféle lehetőségeket kationos lipideken és kationos polimereken alapuló, nem vírusos hordozók. Ezek a kationos molekulák elektrosztatikus kölcsönhatások révén képesek spontán önszerveződő nanokomplexeket képezni egy negatív töltésű DNS-molekulával. A kationos lipidekből és DNS-ből álló, önműködően összeálló komplexeket lipoplexeknek, a kationos polimerekből és DNS-ből álló komplexeket poliplexeknek nevezzük.

Kationos polimerek, amelyeket poliplexek létrehozására használnak

A génterápia és a biotechnológia céljaira javasolták nagyszámú kationos polimerek vagy polikationok. A polikationok a DNS-t kompakt nanokomplexekké kondenzálják, biztosítva a DNS stabilitását és védelmet a nukleázokkal szemben. DNS-kötő polimerként kationos fehérjék, aminosavak szintetikus homopolimerei (polilizinek, poliargininek), kitozán poliszacharid, polietilénimin, dendrimerek szolgálhatnak. eltérő összetételűés egyéb módosított polimerek. A DNS tömörítés mértékét a komplex teljes töltése határozza meg, ami viszont a mennyiség arányától függ. pozitív csoportok polimereket a DNS negatív foszfátcsoportjainak számához. Jellemzően a poliplexek összetételében a polikation feleslegben van jelen, ennek eredményeként nanoméretű (több tíz-több száz nm-es) komplexek keletkeznek, amelyek vízben oldódnak és pozitív töltésűek (1., 2. ábra). ). Ellenkező esetben a komplexek instabilok lesznek.

Rizs. 1. Kationos polimerekből és cirkuláris DNS-molekulából (plazmidból) poliplexek képződésének vázlata. Rizs. 2. Transzmissziós elektronmikroszkóppal (200 nm-es skálaosztás) nyert poliplexek képe egy hordozón.

A génszállításra használt első polikationok egyike a poli-L-lizin volt (PL, 3. ábra), amely peptid jellegéből adódóan biológiailag lebontható, ami rendkívül kényelmessé teszi in vivo alkalmazását. Gyakran megszüntetésére nem kívánt hatások kapcsolatos nagy sűrűségű felületi töltet esetén PL és polietilénglikol (PEG) kopolimert használnak. A módosítás eredményeként a komplex felületi töltése csökken, ami megakadályozza a negatív töltésű szérumfehérjék nem specifikus adszorpcióját a poliplexeken, valamint csökkenti a komplexek citotoxicitását.

A polietilén-imint (PEI, 3. ábra) tartják az egyik legígéretesebb lehetőségnek a polikationok számára az ezen alapuló poliplexek létrehozására. A PEI-t két formában szintetizálják: lineáris és elágazó. A PEI rendelkezik nagy mennyiség protonálódásra képes amino- és iminocsoportok, melynek eredményeként pufferelő tulajdonságokat mutat, amikor élettani állapotok. A PEI-n alapuló poliplexeket a többi polikationhoz képest hatékonyabb transzfekció és a nukleázok hatásával szembeni védelem jellemzi, ami a PEI-en lévő nagy töltéssűrűséggel és kompaktabb DNS-foldinggel jár. Az erős pozitív töltés a PEI toxicitásához vezet, ami a PEI biológiai lebomlásának hiányával együtt korlátozó tényezők a PEI in vivo alkalmazásában. A citotoxicitás csökkentése érdekében a PEI-t polietilénglikollal módosítják, amely alacsony toxicitású és magas hidrofilitású.

Rizs. 3. Poliplexek létrehozására használt kationos polimerek, ill.

A genetikai információ továbbításában használt polikationok másik képviselője a poliamidoaminok (PAMAM, 3. ábra). Ezek a vegyületek erősen elágazó dendrimerek. Az elágazásnak köszönhetően a PAMAM-ok nagy rugalmassággal rendelkeznek, jobban tömörítik a DNS-t, a rájuk épülő poliplexek pedig stabilabbak, mint az összes többi. Tulajdonságai sok hasonlóságot mutatnak a PEI-vel.

A kitozánok (3. ábra) D-glükózaminból és N-acetil-D-glükózaminból (1>4) glikozidos kötésekkel összekapcsolt poliszacharidok. A molekulatömegtől és a dezacetilezés mértékétől függően a kitozánok különböző méretű stabil komplexeket képeznek az átvitt DNS-sel. A kicsi, vagy fordítva, a túl nagy kitozán polimerek az átvitt gén expressziójának csökkenéséhez vezetnek. A kitozán alapú poliplexek fő előnye a biológiai lebonthatóság.

A poliplexek szállítási hatékonyságát számos tényező befolyásolja: a molekulatömeg, az elágazás mértéke, a polimerizáció és a polimer típusa, a szemcseméret, az oldat ionerőssége, a komplexek felületi töltése, valamint a kísérleti körülmények. Az optimális megközelítésnek figyelembe kell vennie ezen tényezők mindegyikét, valamint ezek hatását a komplex tulajdonságaira, a komplexek célsejtek általi felvételére és a toxicitásra.

Számos megközelítés létezik a poliplexek célsejtekre gyakorolt ​​hatásának specifitásának biztosítására. Az egyik a nanokomplexek célzott szállítása bizonyos típusú sejtekhez. Ez a megközelítés komponensek (ligandumok) hozzáadásával jár a poliplexekhez, amelyek receptorai nagy mennyiségben vannak jelen a célsejtek felszínén. Különféle fehérjéket, cukrokat, peptideket, antitesteket stb. használnak specifikus ligandumként. Egy másik stratégia az, hogy transzportálható géneket használnak, amelyek csak bizonyos sejtekben lennének aktívak, míg a komplexek szállítása nem specifikusan történik, azaz bármely sejtbe.

A poliplexek behatolása a célsejtekbe

A genetikai anyag bejuttatásának folyamata két szakaszból áll: extracelluláris (út az injekció helyétől a célsejtekig) és intracelluláris (kölcsönhatás a célsejtekkel, endocitózis, kilépés az endoszómákból, szállítás a sejtmagba). Intracelluláris utak A poliplexek transzportját a 4. ábra mutatja be.

Az első akadály, amelyet a polyplexnek le kell győznie a célsejt felé vezető úton, a vér és az extracelluláris mátrix. Éppen ezért szükséges a komplex olyan fizikai-kémiai paramétereinek kiválasztása, hogy növeljük stabilitását, elkerüljük a nem specifikus kölcsönhatásokat és az immunválasz lehetőségét. Először is, a poliplexben lévő DNS-t védeni kell az extracelluláris nukleázok hatásától. Másodszor, a negatív töltésű vérszérum fehérjék (albumin, fibrinogén, immunglobulinok stb.), valamint az extracelluláris mátrix fehérjék (kollagének) képesek adszorbeálódni a töltött nanokomplexek felületén, ami a poliplexek felületi töltésének megváltozásához vezet. , ami a komplexek méretének növekedéséhez és aggregációjukhoz vezet. Amikor a poliplexek bekerülnek a szervezetbe, részben felhalmozódnak a szövetekben, és fagocitózison mennek keresztül. Ezen okok miatt gyakran alkalmazzák a poliplexek lokális beadását (például rákos daganatok esetén) a szöveti sejtekkel való nem specifikus kölcsönhatásuk alapján.

Rizs. 4. A poliplexek transzportjának intracelluláris útvonalai.

A poliplexek először a plazmamembránon adszorbeálódnak, endocitózissal veszik fel, majd el kell hagyniuk az endolizoszómákat, és át kell haladniuk a nukleáris burkon, hogy bejussanak a sejtmagba. Vannak alternatív szállítási utak is, amelyek nem mindig vezetnek komplexek eljuttatásához a sejtmagba. Ezenkívül az átvitt gén kifejeződése megköveteli a poliplex disszociációját kationos polimerré és szabad DNS-sé.

A genetikai anyag célsejtekhez való eljuttatásának következő szakasza a plazmamembránnal való kölcsönhatás és a sejt általi felszívódás. Amint fentebb megjegyeztük, a poliplexek kötődése a sejtekhez ligandum hiányában nem specifikusan a negatív töltésű plazmamembránnal való elektrosztatikus kölcsönhatás eredményeként megy végbe. A legtöbb esetben az ilyen poliplexeket nem specifikus adszorptív endocitózis szívja fel. Egy ligandum komplexbe történő beépítésével a felvétel klatrin-függő receptor által közvetített endocitózison keresztül érhető el. Egyéb felvételi utak a sejttípustól függenek, ide tartozik a fagocitózis és a caveolin-függő endocitózis. A poliplexek sejtbejuttatásának javítására szolgáló egyik stratégia magában foglalja a vírusbejutási peptidek, például a HIV-1 vírusból először izolált TAT peptidek alkalmazását. Ezeknek a szekvenciáknak a használata biztosítja, hogy a konstrukciók belépjenek a sejtbe, és a poliplexeket a sejtmagba szállítsák.

A poliplexek transzportútjának egyik legfontosabb szakasza az endoszómákból való kilépés. Mint ismeretes, az endoszómák csövekből és vezikulákból álló rendszer, amely az abszorbeált makromolekulák szétválogatásához szükséges. A szortírozó endoszómák közelebb helyezkednek el a plazmamembránhoz. Munka miatt protonszivattyúk pH-juk csökken (körülbelül 6,5 a szortírozó endoszómákban). A további transzport történhet akár az újrahasznosítási útvonalon az abszorbeált molekulák extramembrán térbe jutásával, akár a lítikus úton, amikor a késői endoszómákban a környezet további savasodása következik be, és a makromolekulák bejutnak a lizoszómákba. A lizoszómák tartalmát pH 5-re savanyítják, és az elnyelt molekulákat hidrolitikus enzimek lebontják, amelyek alacsony pH-n aktiválódnak. A bomlástermékeket exocitózissal távolítják el a sejtből, vagy a citoplazmába juttatják, ahol építőanyagként használják fel.

Úgy tartják, hogy a PEI-alapú poliplexek tulajdonságaiknál ​​fogva az úgynevezett „protonszivacs-effektus” révén képesek kilépni az endoszómákból. Ez a hipotézis azon alapul, hogy a kationos polimerek a protonálatlan szekunder és tercier aminok jelenléte miatt pufferhatást hoznak létre, melynek eredményeként a protonokat endoszómákba pumpáló H±ATPáz aktívabban kezd működni. Ebben az esetben a klór anionok felhalmozódnak az endoszómák belsejében. Ennek eredményeként, mivel éles növekedés ozmotikus nyomás duzzanat és lízis lép fel, lehetővé téve a poliplexek ép bejutását a citoszolba. Egy másik mechanizmust javasoltak az endoszómákból való kilépésre a poliplexeknél, amely magában foglalja az endoszómális membrán destabilizálódását a nanokomplexek nagy felületi töltéssűrűsége miatt. A PL és kitozán alapú komplexek nem okozzák a „protonszivacs” hatást, és kevésbé képesek destabilizálni az endoszóma membránt, ami sokkal alacsonyabb transzfekciós hatékonyságot eredményez.

A lizoszómák elhagyása után a poliplexek a perinukleáris térben találják magukat, majd a komplex szabad polikationná és DNS-sé disszociál. Úgy gondolják, hogy ez a DNS foszfátcsoportjai és a citoplazma kis molekulatömegű vegyületek és anionjai közötti kationos csoportok közötti versengés miatt következik be. Egyes esetekben a komplex disszociációja nyilvánvalóan a sejtmagban történik. A plazmid DNS sejtmagba jutásának fő akadálya a kettős nukleáris burok. A makromolekulák sejtmagba juttatásához tartalmaznak egy nukleáris lokalizációs szekvenciát (NLS), amelyet α- és β-importinokkal kombinálva a nukleáris póruskomplex (NPC) felismer, és aktívan behatol a sejtmagba. Csak kis molekulák tudnak átjutni az NPC-n passzív diffúzióval (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Terápiás gének hatásmechanizmusai

Miután a plazmid belép a sejtmagba, megkezdődik a terápiás gén expressziója. A poliplexek hatásának specifitása érdekében a plazmidban lévő terápiás gént egy promoter (a gén azon régiója, amelyen az RNS-polimeráz a transzkripció előtt landol) irányítása alá helyezzük, amely csak a tumorszövetekben aktív. A példák közé tartozik a survivin anti-apoptotikus fehérje génjének promótere vagy a telomeráz enzim génje. Terápiás génként alkalmazható a herpes simplex vírus timidin-kináz (HSVtk) génje, amely képes foszforilálni az aciklovir és ganciklovir herpeszellenes vegyületeket. Ezeket a vegyületeket bizonyos idő elteltével a daganatba fecskendezik. Ezután a celluláris kinázok (foszforiláló enzimek) a foszforilált acyclovirt vagy ganciklovirt trifoszfátokká alakítják, amelyek a sejtosztódás során a megkettőződés során beépülhetnek az újonnan szintetizált DNS-be, és leállítják annak szintézisét. Ennek eredményeként azok a sejtek, amelyek magjába a timidin-kináz gén bejutott, ezen anyagok jelenlétében elpusztulnak. Ebben az esetben az osztódó sejtek pusztulnak el, és nem a nyugvó sejtek, amelyek nem szintetizálnak DNS-t, és nem tartalmaznak ganciklovirt vagy aciklovirt. A terápiás génnek ez a hatásmechanizmusa génterápiás célokra használható rákos daganatok, melynek sejtjei gyorsan osztódnak.

Bibliográfia:

1. Gorbunova V.N., Baranov V.S. Bevezetés az örökletes betegségek molekuláris diagnosztikájába és génterápiájába. S.-Pb., „Speciális irodalom”, 1997, 287. o.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. A génszállításhoz kondenzált DNS nanoszkopikus szerkezete. //Nucl. Savak. Res., 1997, vol. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. A polimer génszállító rendszerek jelenlegi állapota. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, vol. 58, 467–486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. és Stayton P. S. Polimerek tervezése és fejlesztése génszállításhoz. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4,581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. A plazmid DNS intracelluláris útválasztása nem vírusos géntranszfer során. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, vol. 57, 755–767.
6. Maxfield F.R. és McGraw T.E. Endocita újrahasznosítás. // Nature Rev. Mol. Sejt. Biol., 2004, vol. 5, 121–132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. és Topal M.D. Aciklikus, didezoxi- és ara nukleotidok beépítése és kiterjesztése herpesviridae, humán alfa és humán béta polimerázok által. J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 3898–3904.

Durimanov Mihail, a Moszkvai Állami Egyetem Biológiai Karának hallgatója

A cikk a Lomonoszov 2009 konferencia népszerű tudományos versenyének díjazottja (Biológiai Kar, „Nanobiotechnológia”, „Biomérnöki”, „Biofizika”).

Bevezetés

1 A genetikailag módosított enzimek fő csoportjai

1.1 Restrikciós enzimek

1.1.1 A restrikciós enzimek hatásmechanizmusa

1.1.2 Korlátozási térképek készítése

1.3 Ligázok

2 Új gén bevitele a sejtbe

2.1 A génexpresszió szabályozása prokariótákban

2.2 Módszerek egy gén közvetlen sejtbe történő bejuttatására

2.3 Gének bejuttatása emlőssejtekbe

2.4 Emlős szomatikus sejtek genetikai transzformációja

2.5 Génterápia

2.6 Transzgénikus állatok előállítása

Következtetés

Bibliográfia

Bevezetés

A génsebészet funkcionálisan aktív genetikai struktúrák (rekombináns DNS) in vitro felépítése, vagy más szóval mesterséges genetikai programok létrehozása (Baev A. A.). E. S. Piruzyan szerint a génsebészet olyan kísérleti technikák rendszere, amely lehetővé teszi mesterséges genetikai struktúrák laboratóriumi (in vitro) felépítését úgynevezett rekombináns vagy hibrid DNS-molekulák formájában.

Molekuláris genetikai rendszerek szervezeten kívüli irányított, előre meghatározott program szerinti felépítéséről beszélünk, majd azok élő szervezetbe történő bejuttatásáról. Ebben az esetben a rekombináns DNS a befogadó szervezet genetikai apparátusának szerves részévé válik, és új egyedi genetikai, biokémiai, majd fiziológiai tulajdonságokat kölcsönöz neki.

Az alkalmazott géntechnológia célja olyan rekombináns DNS-molekulák tervezése, amelyek a genetikai apparátusba bekerülve az ember számára hasznos tulajdonságokat adnának a testnek.

A rekombináns DNS technológia a következő módszereket használja:

A DNS specifikus hasítása restrikciós nukleázokkal, felgyorsítva az egyes gének izolálását és manipulálását;

Az összes nukleotid gyors szekvenálása egy tisztított DNS-fragmensben, amely lehetővé teszi a gén és az általa kódolt aminosav-szekvencia határainak meghatározását;

Rekombináns DNS felépítése;

Nukleinsav-hibridizáció, amely lehetővé teszi specifikus RNS- vagy DNS-szekvenciák nagyobb pontossággal és érzékenységgel történő kimutatását, komplementer nukleinsav-szekvenciák megkötésére való képességük alapján;

DNS klónozás: in vitro amplifikáció polimeráz láncreakcióval vagy DNS-fragmens bejuttatása egy baktériumsejtbe, amely az ilyen transzformációt követően ezt a fragmentumot milliós másolatban reprodukálja;

Rekombináns DNS bejuttatása sejtekbe vagy organizmusokba.

A géntechnológia története

A génsebészet a biokémia és a molekuláris genetika különböző ágaiban számos kutató munkájának köszönhetően jelent meg. Sok éven át a fehérjéket a makromolekulák fő osztályának tekintették. Még azt is feltételezték, hogy a gének fehérje jellegűek. Avery, McLeod és McCarthy csak 1944-ben mutatta be, hogy a DNS az örökletes információ hordozója. Ettől kezdve megkezdődött a nukleinsavak intenzív kutatása. Egy évtizeddel később, 1953-ban J. Watson és F. Crick megalkotott egy kétszálú DNS-modellt. Ezt az évet tekintik a molekuláris biológia születésének évének.

Az 50-es, 60-as évek fordulóján a genetikai kód tulajdonságait tisztázták, majd a 60-as évek végére kísérletileg igazolták egyetemességét. Intenzíven fejlődött a molekuláris genetika, amelynek tárgyai az E. coli, annak vírusai és plazmidjai voltak. Módszereket dolgoztak ki ép DNS-molekulák, plazmidok és vírusok nagy tisztaságú preparátumainak izolálására. A vírusok és plazmidok DNS-ét biológiailag aktív formában juttatták be a sejtekbe, biztosítva annak replikációját és a megfelelő gének expresszióját. A 70-es években számos enzimet fedeztek fel, amelyek katalizálják a DNS-konverziós reakciókat. A géntechnológiai módszerek kidolgozásában kiemelt szerepet töltenek be a restrikciós enzimek és a DNS ligázok.

A géntechnológia fejlődésének története három szakaszra osztható. Az első szakasz a rekombináns DNS-molekulák in vitro kinyerésének alapvető lehetőségének bizonyításához kapcsolódik. Ezek a munkák különböző plazmidok közötti hibridek előállítására vonatkoznak. A különböző baktériumfajokból és baktériumtörzsekből származó kezdeti DNS-molekulák felhasználásával rekombináns molekulák létrehozásának lehetősége, életképességük, stabilitásuk és működésük bizonyítást nyert.

A második szakasz a prokarióták kromoszómális génjei és a különböző plazmidok közötti rekombináns DNS-molekulák megszerzésére irányuló munka kezdetéhez kapcsolódik, bizonyítva stabilitásukat és életképességüket.

A harmadik szakasz az eukarióta gének, főként állatok, vektor-DNS-molekulákba való beépítésével kapcsolatos munka kezdete (a génátvitelre használt DNS, amely képes integrálódni a befogadó sejt genetikai apparátusába).

Formálisan a géntechnológia születési dátumának 1972-et kell tekinteni, amikor a Stanford Egyetemen P. Berg, S. Cohen, H. Boyer és munkatársai létrehozták az első rekombináns DNS-t, amely az SV40 vírus, a bakteriofág és az E. coli DNS-fragmenseit tartalmazza. .

1 A genetikailag módosított enzimek fő csoportjai

A génsebészet a molekuláris genetika leszármazottja, de születését a genetikai enzimológia és a nukleinsavkémia sikereinek köszönheti, hiszen az enzimek a molekuláris manipuláció eszközei. Míg néha mikromanipulátorokkal dolgozhatunk sejtekkel és sejtszervszervekkel, a DNS- és RNS-makromolekulákkal való munka során még a legkisebb mikrosebészeti eszközök sem segítenek. Mit kell tenni? Az enzimek „szikeként”, „ollóként” és „fűzőszálként” működnek.

Csak ők találhatnak bizonyos nukleotidszekvenciákat, „vághatnak” oda egy molekulát, vagy fordítva, „befoltozhatnak” egy lyukat a DNS-láncon. Ezek az enzimek már régóta működnek a sejtekben, a sejtosztódás során DNS-replikációt (duplázódást) végeznek, a károsodások helyreállítását (a molekula integritásának helyreállítását), a genetikai információ olvasási és átviteli folyamataiban sejtről sejtre vagy belül. egy cella. A génmérnök feladata, hogy olyan enzimet válasszon ki, amely teljesíti a rábízott feladatokat, azaz képes lenne dolgozni a nukleinsav egy bizonyos szakaszával.

Megjegyzendő, hogy a génsebészetben használt enzimek nem rendelkeznek fajspecifikussággal, így a kísérletező tetszőleges eredetű DNS-fragmenseket egyetlen egésszé kombinálhat a választott szekvenciában. Ez lehetővé teszi a géntechnológia számára, hogy legyőzze a természet által felállított faji akadályokat, és fajok közötti keresztezést hajtson végre.

A rekombináns DNS felépítésében használt enzimek több csoportra oszthatók:

DNS-fragmenseket termelő enzimek (restrikciós enzimek);

Olyan enzimek, amelyek DNS-t szintetizálnak DNS-templáton (polimerázok) vagy RNS-t (reverz transzkriptázok);

DNS-fragmenseket összekötő enzimek (ligázok);

Enzimek, amelyek lehetővé teszik a DNS-fragmensek végeinek szerkezetének megváltoztatását.

1.1 Restrikciós enzimek

Általánosan elfogadott, hogy a „restrikciós enzim”, „restrikciós endonukleáz” és „helyspecifikus endodezoxiribonukleáz” kifejezések szinonimák.

Minden bakteriális restrikciós endonukleáz felismer specifikus, meglehetősen rövid DNS-szekvenciákat, és kötődik hozzájuk. Ezt a folyamatot a DNS-molekula levágása kíséri magán a felismerési helyen vagy más helyen, amelyet az enzim típusa határoz meg. A restrikciós aktivitás mellett a baktériumtörzs képes metilálni a DNS-t; Ezt a folyamatot ugyanaz a DNS-szekvencia-specifitás jellemzi, mint a restrikciót. A metiláz metilcsoportokat ad az adenin- vagy citozinmaradékokhoz ugyanazon a helyen, ahol a restrikciós enzim kötődik. A metiláció következtében a hely ellenállóvá válik a restrikcióval szemben. Ezért a metiláció megvédi a DNS-t a vágástól.

A restrikciós enzimeknek 3 fő osztálya van: 1, 2 és 3.

Minden restrikciós enzim felismeri a szigorúan meghatározott szekvenciákat a kettős szálú DNS-en, de az 1. osztályú restrikciós enzimek a DNS-molekula tetszőleges pontjain törést okoznak, a 2. és 3. osztályú restrikciós enzimek pedig felismerik és hasítják a DNS-t a felismerési helyeken belül vagy egy bizonyos ponton. tőlük távolságra rögzített hely.

Az 1-es és 3-as típusú enzimek összetett alegység-szerkezettel rendelkeznek, és kétféle aktivitással rendelkeznek - módosító (metilező) és ATP-függő endonukleáz.

A 2. osztályba tartozó enzimek 2 különálló fehérjéből állnak: egy restrikciós endonukleázból és egy módosító metilázból, ezért csak a 2. osztályba tartozó enzimeket használják a géntechnológiában. Kofaktorként magnéziumionokat igényelnek.

Jelenleg több mint 500 2. osztályú restrikciós enzimet izoláltak, de a különféle mikroorganizmusokból izolált enzimek között vannak olyanok is, amelyek ugyanazokat a szekvenciákat ismerik fel a DNS-en. Az ilyen párokat vagy csoportokat izoschizomereknek nevezzük. Megkülönböztetik a valódi izoszkizomerizmust, amikor az enzimek ugyanazt a nukleotidszekvenciát ismerik fel, és ugyanazon a ponton törik meg a DNS-t, és hamis, amikor az enzimek a DNS ugyanazon helyét felismerve ugyanazon a helyen belül különböző pontokon töréseket okoznak.

A legtöbb 2. osztályba tartozó restrikciós enzim 4-6 nukleotidpárt tartalmazó szekvenciákat ismer fel, ezért a restrikciós enzimeket kis- és nagyvágásúra osztják. A kis vágású restrikciós enzimek felismerik a tetranukleotidokat, és sokkal több törést visznek be a molekulákba, mint a nagy vágású restrikciós enzimek, amelyek hat nukleotidpárból álló szekvenciát ismernek fel. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy egy bizonyos négy nukleotidból álló szekvencia előfordulási valószínűsége sokkal nagyobb, mint egy hat nukleotidból álló szekvencia előfordulásának valószínűsége. Például a T7 bakteriofág 40 000 bázispárból álló DNS-éből hiányzik az E. coliból származó R1 restrikciós enzim által felismert szekvencia.

A Hpa II és az Alu (Arthrobacter luteusból) restrikciós enzimek kismértékben hasadóak, az Eco R I (Escherichia coliból) és Hind III pedig nagy hasító enzimek. Ha feltételezzük, hogy a restrikciós enzim felismerő helyek véletlenszerűen oszlanak el a DNS-lánc mentén, akkor a négy nukleotidból álló szekvenciát (helyet) felismerő enzimek célpontjának átlagosan 256 bázispáronként, a hat nukleotidot felismerő enzimek esetében pedig minden 4096 bázisban kell előfordulnia. párok. Ha a restrikciós hely a gén belsejében van, akkor a DNS restrikciós enzimmel végzett kezelés a gén inaktiválásához vezet. Egy ilyen esemény valószínűsége nagyon nagy, ha kis vágású restrikciós enzimekkel kezelik, és jelentéktelen nagy vágású endonukleázok alkalmazásakor. Ezért egy ép gén kinyerése érdekében a hasítást felváltva több nagy vágású restrikciós enzimmel végezzük, vagy az „alulrestrikciós” technikát alkalmazzuk, pl. A restrikciót olyan körülmények között hajtják végre, amikor a hasítás csak egy helyen történik.

8860 0

Jelenleg mintegy 40 különböző módszer ismert a rekombináns DNS sejtekbe juttatására, amelyek különböző módon oldják meg a probléma leküzdésének problémáját. plazma membrán. Még nincs egységes osztályozás a rekombináns DNS sejtekbe juttatására szolgáló módszerekre vonatkozóan. Mindegyik áttekintés szerzője a maga módján osztályoz, talán azért, mert sok empirikusan talált módszer esetében még mindig nem világos a membrán leküzdésének mechanizmusa, például az átalakulás esetében. A terminológiát illetően is van bizonytalanság, ami nem meglepő a tudomány és gyakorlat gyorsan fejlődő új területén.

Az idegen DNS sejtekbe juttatásának minden egyes módszerének megvannak a maga sajátosságai, előnyei és hátrányai a sejt túlélése, a beadás hatékonysága, a sokoldalúság és a technikai megvalósítási lehetőségek tekintetében. A módszer megválasztása a gazdasejt típusától és a használt vektor típusától, valamint a kísérletvezető személyes preferenciáitól és képességeitől függ. Az alábbiakban részletesen tárgyaljuk a DNS célsejtekbe való eljuttatásának néhány legismertebb módszerét.

A transzformáció a legáltalánosabb értelmében a szabad DNS sejtbe való bejuttatásának folyamata. Szűkebb értelemben a kifejezést főként a baktériumokra alkalmazzák, és a rekombináns DNS kompetens sejtek általi felvételének folyamatát jelöli, amelyet a sejtmembrán hőmérsékleti fázisátalakulása indukál. Az E. coli a legelterjedtebb élőlény a rekombináns DNS-sel végzett munka során, és a plazmid DNS sejtekbe való bejuttatása érdekében a sejteket CaCl2 és DNS jéghideg oldatával inkubálják, majd 42 °C-on ~1 percig hősokkolják. .

Nyilvánvalóan az ilyen kezelés eredményeként a sejtfal helyi pusztulása következik be. Transzformációs hatékonyság, amely a transzformánsok száma 1 μg hozzáadott DNS-re vonatkoztatva,
ebben az esetben körülbelül 10 000 - 10 000 000. Ennek a módszernek a hatékonysága alacsony, a sejtek hozzávetőleg kevesebb, mint 0,1%-a transzformálódik, de ezt a hátrányt kompenzálja olyan szelekciós sémák alkalmazása, amelyek lehetővé teszik a kívánt klónok gyors azonosítását.

Az idegen DNS-t felszívni képes sejteket kompetensnek nevezzük. Ezeknek a sejteknek az aránya a populációban általában nagyon kicsi, de speciális tápközeggel, tenyésztési körülményekkel és (általában empirikusan kiválasztott) kémiai induktorokkal növelhető. A kompetens sejtek előállításának gyakran használt szakasza a szferoplasztok - részben vagy teljesen külső merev sejtfal nélküli sejtek (protoplasztok) - termelése.

Például ez az egyetlen módja a Bacillus, Listeria, Streptommyces stb. nemzetségekhez tartozó Gram-pozitív baktériumok hatékony transzformálásának. Egyes élesztő transzformációs módszerek az élesztősejtfal enzimes eltávolítását is magukban foglalják glükozidázok segítségével. Azon organizmusok esetében, amelyek ellenállóak a megfelelő kémiai induktorokkal, vagy nem rendelkeznek természetes képességgel, más DNS-bejuttató rendszereket használnak.

Konjugáció. Vannak olyan bakteriális plazmidok (konjugatív plazmidok), amelyek képesek sejtközi kapcsolatok létrehozására, amelyeken keresztül egyik sejtből a másikba jutnak. A donor és a recipiens sejtek közötti kontaktusok kialakulását a plazmidok konjugációs tulajdonságai, magát a DNS-transzfert pedig a mobilizációs tulajdonságok biztosítják. Ebben az esetben a konjugatív plazmid hordozhat egy szabályos plazmidvektort, amely ugyanabban a sejtben található.

Ily módon lehetséges a más módon nehezen transzformálható recipiens sejteket transzformálni. Például kimutatták a pAT187 ingavektor mobilizációs átvitelét gazdaszervezetek széles skálájával E. coli-ból különböző gram-pozitív baktériumokba (Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus nemzetség stb.), bár sokkal kisebb hatékonysággal, mint a gazdaszervezetek közötti átvitelnél. különböző E. coli törzsek.

Ezenkívül a közelmúltban kimutatták a DNS konjugatív átvitelének lehetőségét a bakteriális sejtekből tenyésztett állati sejtekbe. A konjugációs folyamat során a donor plazmidnak csak az egyik szála kerül átadásra, amelyen azután a második szál szintetizálódik. Ez azt eredményezi, hogy a konjugatívan átvitt plazmidot nem támadják meg a gazdaszervezet restrikciós enzimei. Ennek a módszernek a hatékonysága a baktériumok esetében összemérhető a transzformációval.

Vírusos fertőzés. A vírusalapú vektorok bejuttatására széles körben alkalmazzák a gazdasejt természetes fertőzési útvonalát, amely a vírus típusától függ.

Perforációs módszerek. A nukleinsavak célsejtekbe történő bejuttatásának egyik népszerű módszere az elektroporáció - egy kétrétegű lipidmembránban átmenetileg pórusokat hoznak létre elektromos tér rövid távú hatása alatt. Ez egy univerzális fizikai transzformációs módszer, melynek technikáját szinte minden sejttípusra kifejlesztették.

Az E. coli-val végzett munka során az elkészített sejtszuszpenziót (~50 μl) és a DNS-t az elektródák közé helyezzük, és egyetlen ~4,5 ms-os áramimpulzust alkalmazunk 1,8 kV feszültségen, az elektródák közötti távolság 1 mm. Az ilyen kezelés után a transzformáció hatékonysága 109-1011-re nő a kis plazmidok (~3-6 kb) és 106-ra a nagy plazmidok (~135 kb) esetén. Hasonló körülményeket alkalmazunk a BAC vektor E. coliba való bejuttatására.

A kétrétegű lipidmembránon a nagyfeszültségű kisülés elektroporációs hatása a görbületi sugarától függ. Ezért a kis bakteriális sejtek sokkal nagyobb térerővel (12-18 kV/cm) abszorbeálják a DNS-t, mint a nagy állati és növényi sejtek, amelyek 1-2 kV/cm térerősség mellett hatékonyan abszorbeálják a DNS-t. Az elektroporáció a legegyszerűbb, leghatékonyabb és reprodukálható módszer a DNS-molekulák sejtekbe történő bejuttatására, amely azonban speciális elektroporátort igényel.

Egyéb perforációs módszerek a DNS sejtekbe juttatására: sejtek ultrahangos kezelése, sejtek lekaparása a szubsztrátról exogén anyag jelenlétében, sejtek centrifugálása tápközegben DNS-sel elektroporációval kombinálva, plazmamembrán ozmotikus perforálása, sejtlebontás lézerrel mikrosugár, a pórusképző toxin streptolysin-O alkalmazása.

Transzfekció. Kezdetben ez a kifejezés a vírus-DNS sejtekbe való bejuttatását jelentette, mára a jelentése kibővült bármely idegen DNS eukarióta sejtekbe történő bejuttatására. A „transzformáció” kifejezés, amely a DNS-nek a prokarióták és élesztők sejtjébe történő bejuttatásának folyamatára utal, kényelmetlennek bizonyult, mivel az állati sejtekkel kapcsolatban a transzformáció a normál sejtek rákos sejtekké történő átalakulását jelenti. Szűkebb értelemben a transzfekció főként a DNS eukarióta sejtekbe történő bejuttatását jelenti különféle kémiai reagensek segítségével.

A hatékony transzfekció egyik első kidolgozott módszere a DNS DEAE-dextránnal való inkubálása volt. A kapott hatékonyság a bakteriális transzformációhoz hasonlítható volt, és 106 transzfektánst ért el μg DNS-enként.

A DEAE-dextrán hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott, de ismert, hogy a DNS-hez és a sejtmembránhoz kötődik, serkenti a pinocitózist (2.8. ábra), bár a sejtek nem veszik fel. Az eljárás hátrányai közé tartozik a DEAE-dextrán toxicitása bizonyos típusú sejtekre, a hatékonyság függése a gyógyszer minőségétől, valamint a stabil transzfektánsok nagyon alacsony gyakorisága.

Rizs. 2.8. A DNS különböző komplexek részeként a sejtbe endocitózissal történő bejuttatásának sémája: fagocitózis és pinocitózis (a). Nem lipid polikation részecskéjének sematikus ábrázolása egy dendroformában kötött DNS-sel, amelynek negatív töltését egy kationos polimer kompenzálja (b)

A transzfekció hatékonyságát 10-100-szorosára növeltük a sejteknek kalcium-foszfáttal kicsapott DNS-sel történő inkubálásával. A kalcium-DNS-csapadék sűrű részecskéit a sejt fagocitózissal felszívja (2.8. ábra), de a behatolt molekuláknak csak kis része jut el a sejtmagba, és integrálódik a kromoszómális DNS-be. A kalcium-foszfát módszer hatékonyabb és olcsóbb, de a DNS-molekulák törését okozza, ami a cirkuláris molekulákat lineáris formává alakítja, amely vírustranszfekció esetén néha nem fertőző. Ezenkívül a kalcium-foszfátos transzfekció feltételeit minden egyes célsejt esetében egyedileg kell kiválasztani.

Más transzfekciós reagensek keresése során felfedezték, hogy a felesleges kationos töltést hordozó polimer molekulák jelentősen növelhetik a transzfekció hatékonyságát. A polimer kationok a nukleinsavakkal semlegesített töltéssel stabil komplexeket képeznek, amelyek nagy hatékonysággal képesek DNS-t és RNS-t a sejtbe szállítani, megvédve azokat az endonukleázok hatásától a sejtmag felé vezető úton (2.9. ábra).

Rizs. 2. 9. A sejtmagba történő DNS transzport sémája egy polikation-DNS komplex részeként ligandum által közvetített endocitózissal specifikus ligandumhoz kötve

A szintetikus nem lipid polimer kationok lineáris vagy elágazó konformációban (dendrites formában) képesek a DNS-t és az RNS-t viszonylag kis részecskékké kondenzálni, amelyek aztán a sejtmembránhoz kötődnek, és nem specifikus endocitózissal bejutnak a sejtbe. Jelenleg a nem lipid polikationok, polietilénimin, poliamidoaminok és az ezeken alapuló dendrimerek csoportjából történő transzfekcióhoz elsősorban kationos fehérjéket, például polilizint, protamint és hisztonokat, valamint különféle kereskedelmi termékeket, például PAMAM-ot használnak.

A forradalom az első alacsony toxikus kationos lipid, a DOTMA (1,2-dioleil-3-N,N,N-trimetil-amino-propán) bevezetése volt, amelyet Feigner (1987) és munkatársai szintetizáltak. A transzfekció hatékonysága a kationos lipid használatával (2.10. ábra) megközelítőleg 100-szor nagyobb volt, mint bármely más kémiai reagens, nagy arányban stabil transzgenikus sejtekkel.

Rizs. 2. 10. A DNS-komplex szerkezete (a) és a kationos lipid polimer általános szerkezete (b). A kationos lipidpolimerek (lineáris és elágazó láncú), amelyek szerkezetükben és tulajdonságaiban hasonlóak a sejtmembrán-foszfolipidekhez, a reagensek egyszerű összekeverésével komplexeket képeznek a DNS-sel többrétegű kationos liposzómák formájában (a). Az ilyen komplexek endocitózissal vagy a sejtmembránnal való fúzióval jutnak be a sejtbe a lipidrészen keresztül

Ezzel egy időben egy új „lipofection” kifejezést vezettek be a gyakorlatba, hangsúlyozva magas hatásfok a sejtek genetikai transzformációja, a lipid-kation komplexek közelebb hozása a fertőző vírusrészecskékhez.

Erre a sikerre építve ezeknek a vegyületeknek számos változatát fejlesztették ki (lipofektin, lipofektamin, cellfektin stb.).

Ezzel párhuzamosan DNS-sel vagy RNS-sel töltött foszfolipid liposzómákon alapuló szállító vivőanyagokat fejlesztettek ki.

A mesterséges membránok kis gömbjei összeolvadhatnak a sejtek plazmamembránjaival, vagy endocitózissal felveszik, és a tartalmat a sejtbe engedik. A liposzóma transzfekció alacsony hatékonyságát növelte foszfolipidek, például kardiolipin és foszfatidil-etanolamin bejuttatása a liposzómák szerkezetébe, amelyek a kétrétegű membránokkal együtt fordított micelláris struktúrákat, kocka- és hexagonális fázisokat is képeznek, amelyek képesek a membrán iniciálására. fúzió.

A liposzóma módszer meglehetősen szeszélyes, és megköveteli az összes körülmény gondos kiválasztását a specifikus sejtek hatékony transzfekciójához. Ezenkívül a kapszulázási eljárás, általában az ultrahangos kezelés, gyakran károsítja a nagy DNS-molekulákat.

A transzfekciós reagensek fejlesztésének új állomása volt a nukleinsavak hatékonyabb és célzottabb eljuttatása a specifikus célsejtekhez azáltal, hogy a szintetikus transzfekciós reagensek és liposzómák szerkezetébe különböző ligandumok kerültek be a membránreceptor fehérjékhez való kötődés érdekében. A sejtreceptorok által felismert ilyen célcsoportok (ligandumok) jelenléte lehetővé teszi a ligandum által közvetített endocitózis mechanizmusok alkalmazását (lásd 2.9. ábra).

Ilyen ligandumként a receptorok által felismert fehérjéket és peptideket használjuk; oligoszacharidok, mivel számos állati sejt felszínén lektinek vannak - receptorfehérjék, amelyek specifikusan megkötik őket; poliszacharidok. Az ilyen célzott DNS (RNS) transzfekciós reagens komplexek sejtjeivel való kölcsönhatási folyamatai hasonlóak a vírusrészecskék sejtbe való behatolásához.

Jelenleg a biotechnológiai cégek a különféle transzfekciós reagensek széles skáláját kínálják – a legegyszerűbbtől és a legolcsóbbtól a legújabb fejlesztésekig, különféle sejttípusokra és feladatokra specializálódva. Új, még hatékonyabb transzfekciós reagensek létrehozása is intenzíven folyik.

Mikroinjekció - a sejtmembránt mikrotűvel átszúrják, és DNS-t tartalmazó oldatot injektálnak a sejt citoplazmájába, vagy közvetlenül a sejtmagba, ha a sejtmag elég nagy (például egy tojás magja). A DNS mikroinjektálása emlőssejtekbe a 0,1-0,5 μm átmérőjű mikropipetták előállítására alkalmas eszköz és a mikromanipulátor megjelenésével vált lehetővé. A módszer nagyon hatékony, az injektált gének stabil integrációjával és expressziójával rendelkező sejtek aránya elérheti az 50%-ot. A leírt módszer előnye az is, hogy lehetővé teszi bármilyen DNS bejuttatását bármely sejtbe, és nincs szükség szelektív nyomásra a bejuttatott gén sejtekben való megtartásához.

A ballisztikus transzfekció, a bioballisztika vagy biolisztika (mikrorészecskés bombázás) azon alapul, hogy a sejteket körülbelül 1-2 mikron méretű, DNS-sel bevont mikrogömbökkel bombázzák. Arany, wolfram (néha fitotoxikus), szilikon és különféle szintetikus nanogömbök mikrorészecskéit használják. A DNS-sel bevont mikrorészecskék áthaladnak a sejtrétegeken, és a genetikai konstrukciót közvetlenül az organellumokba és sejtmagokba továbbítják. Az erre a célra létrehozott „génpisztoly” vagy „génpisztoly”, amelyet J. Sanford 1987-ben fejlesztett ki a DNS gabonaszemekbe való bejuttatására, felépítésében hasonló a légfegyverekhez (2.11. ábra).

Rizs. 2.11. Rekombináns DNS bejuttatása növényi levelekbe a Bio-Rad újrafelhasználható „génpisztolyával” (a) és általános sémájával (b). A héliumimpulzus DNS-sel vagy RNS-sel bevont mikrorészecskéket lövell ki a mintakapszulából. A DNS-t hordozó mikrorészecskék felgyorsulnak és fókuszálnak a sejtekbe való maximális behatolás érdekében, a gyorsító csatorna mentén és a fegyver csöve mentén mozognak, míg a széles kimeneti nyílásnál a hélium áramlás diffúz módon oldalra terelődik. A távtartó szűrő megtartja az optimális érintkezési távolságot a célponttal, miközben maximalizálja a hélium eltávolítását, hogy minimálisra csökkentse a sejtfelszíneket károsító hatásokat

A mikrorészecskék behatolási mélysége általában kicsi - 1 mm-ig, de speciális égetési körülmények között a mikrorészecskék 4-5 mm mélységig behatolhatnak a szövetekbe, és géneket juttathatnak át például a harántcsíkolt izmok rostjaiba. . A ballisztikus transzfekció akkor is nagyon hatékony, ha a vastag sejtfalak (élesztőgombák, növények) sok más szállítási módot akadályoznak, és alkalmazzák, beleértve a szöveteket, szerveket és akár egész organizmusokat is. Jelenleg széles körben használják a génterápiában transzgenikus állatok és növények előállítására.

A transzfekciós eszközök és módszerek e sokfélesége a különböző feladatoknak, a felhasznált célsejtek széles körének és a sejtekbe szállított nukleinsavtípusoknak, valamint a társadalom azon igényeinek köszönhető, hogy egyre hatékonyabb eszközöket szerezzenek a genetikai információ sejtekbe, szövetekbe és egész organizmusok. Különös figyelmet fordítanak a transzfekciós reagensek és módszerek fejlesztésére a humán génterápia elképesztő kilátásai kapcsán, amely célzott, rendkívül hatékony és biztonságos génszállítást igényel.

Idegen DNS stabil és átmeneti bejutása a sejtbe. A rekombináns DNS eukarióta sejtbe történő bejuttatása után csak egy kis része kerül a sejtmagba, mivel a magmembrán nehéz gátat jelent az idegen DNS-nek. A sejtmagban a rekombináns DNS beépülhet a kromoszómába, vagy egy ideig létezhet extrakromoszómális állapotban.

Ennek megfelelően különbséget kell tenni a stabil transzfekció között, amikor a rekombináns DNS beépül a recipiens sejtek kromoszómáiba, és azok szerves részévé válik, valamint az ideiglenes vagy átmeneti transzfekciót, amelyben rekombináns DNS-molekulák léteznek és átíródnak a sejtmagokban. extrakromoszómális állapot rövid ideig. A bejuttatott idegen DNS stabil öröklődése a fő feltétele a transzgenikus szervezetek gazdasági célú megszerzésének.

Ezért különös figyelmet fordítanak a DNS sejtekbe történő bejuttatására szolgáló módszerek kidolgozására, amelyek a stabil transzformánsok nagyobb arányú termeléséhez vezetnek. Ezenkívül a stabil transzformánsok nagy százaléka lehetővé teszi a szelektív és marker gének elhagyását, amelyek a transzgenikus szervezetek létrehozásában ballasztként szolgálnak.

ON A. Voinov, T.G. Volova

A találmány a biotechnológia területére vonatkozik, különösen eljárásra DNS célzott bejuttatására a CXCR4 receptort expresszáló tumor- és őssejtekbe. A jelen találmány alkalmazható genetikai konstrukciók célzott bejuttatására ős- és rosszindulatú daganatsejtekbe génhibák kijavítása és betegségek megelőzése céljából. Az eljárás során genetikai konstrukciók hordozóit állítják elő úgy, hogy a hordozómolekulák összetételébe beépítik a hordozómolekulákat, amelyek nyolc lizin aminosavból álló DNS-kötő szekvencia - KKKKKKKK - szignálszekvenciák. A szignálszekvencia összekapcsolása a DNS-kötő szekvenciával két ε-aminohexánsav molekulából álló linker régió segítségével történik. Ezután DNS/hordozó komplexek képződnek. A transzfekciót ezután in vitro végezzük. A javasolt találmány lehetővé teszi a kérdéses gén tumor- és őssejtekbe történő bejuttatásának hatékonyságának növelését. 2 fizetés f-ly, 4 ill.

A találmány géngyógyászatra, génterápiára, biotechnológiára és gyógyszerekre vonatkozik, és felhasználható genetikai konstrukciók célzott bejuttatására ős- és rosszindulatú daganatsejtekbe génhibák korrekciója és betegségek megelőzésére. A génkonstrukciók szállításának szöveti specifitását az ilyen típusú sejtekben expresszálódó CXCR4 receptor szignálszekvenciáinak alkalmazása biztosítja.

A génterápiát az különbözteti meg a hagyományos orvoslás megközelítéseitől, hogy a betegség okaira összpontosít, nem pedig a tünetekre és következményekre. Jelenleg folyik a kezelés vagy a megelőzés génterápiás megközelítéseinek kidolgozása széleskörű emberi betegségek. Ezek a megközelítések alkalmazhatók in vivo és ex vivo terápiában is. Az in vivo terápia a genetikai konstrukciók közvetlen bejuttatásán alapul, közvetlenül a testszövetekbe. A beadás történhet intravénásan aeroszolos porlasztóval vagy adott szövetekbe adott injekcióval. Az ex vivo génterápia egy meghatározott típusú sejtek izolálásán alapul a szervezetből, egy „terápiás” génkonstrukció bejuttatásán, a transzfektált sejtek kiválasztásán, majd a betegbe történő visszaültetésen.

A jelenleg fejlesztés alatt álló genetikai konstrukciók szállításának három fő iránya van:

1) klónozás vírusvektorok részeként;

2) fizikai transzfekciós módszerek alkalmazása;

3) plazmid expressziós vektorok és nem virális hordozómolekulák komplexeinek alkalmazása.

A vírus által közvetített transzfer rendkívül hatékony módszer a DNS célsejtekbe történő eljuttatására, mivel a módosított vírusvektor behatolása hasonló ahhoz a folyamathoz, amely a vírusgenom gazdasejtekbe történő átvitele során természetes módon megy végbe. A legtöbbet tanulmányozott vektorok retro-, adeno- és adenoasszociált vírusok alapján készültek. A vírusok előnyei közé tartozik mindenekelőtt az expressziós vektor és a hordozó tulajdonságainak kombinációja, a specifikus bejuttatás lehetősége, az osztódó és nem osztódó sejtek transzfektálhatósága, valamint a DNS-nek a kromoszómába történő integrálása. biztosítják a hosszú távú kifejezést. Ezen előnyök miatt ezt a megközelítést még mindig széles körben alkalmazzák a génszállítási kutatásokban, bár vannak hátrányai. A retro- és adenoasszociált vírusok klónozott DNS-fragmensének mérete korlátozott, és az inszerciós mutagenezis kockázata, ha a vírus beépül a gazda genomjába. Az adenovirális vektorok komoly hátránya a kifejezett immunválasz nagy dózisok mellett és az adenovírus konstrukciók ismételt beadása (Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease // Drugs. - 2000. - v.60. - P.249-271, RF szabadalom No. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, közzététel: 2005.05.20).

A csupasz plazmid DNS-konstrukciók injektálása volt az egyik első megközelítés a génterápiás kezelési stratégiák kidolgozásában. A csupasz DNS-sel történő transzfekció alacsony hatékonysága új módszerek kidolgozását késztette a genetikai konstrukciók szállítására. Különféle fizikai módszereket tanulmányoztak a DNS bejuttatására a testsejtekbe. Közülük a legnépszerűbb a ballisztikus transzfekciós módszer és az elektroporáció, amelyeket széles körben alkalmaznak bőr- és izomsejtek transzfektálására. A ballisztikus transzfekciós módszer alapja az arany vagy volfrám mikrorészecskékre rakódott DNS sejtbe való behatolása. A transzfekció sűrített gáz- vagy folyadékáram nyomása alatt történik. Az elektroporációs módszer a sejtmembrán elektromos potenciáljának lokális változásán alapul az elektromos áram hatására. Az elektromos impulzusok pórusok kialakulásához vezetnek a sejtmembránban, ezáltal átjárhatóvá teszik a biomolekulákat. A csupasz DNS in vivo transzfekció alacsony hatékonyságának leküzdésére a hidrodinamikus sokk módszert is alkalmazzák - plazmidvektor intravénás vagy intraartériás beadása nagy térfogatú oldatban. A meglévő fizikai transzfekciós eljárások fő hátránya a DNS-szállítás hatásának alacsony hatékonysága és lokálissága. Lehetővé teszik a plazmid számára, hogy legyőzze a sejtmembránt, és elkerülje az endoszómákba való beépülést, megakadályozva ezzel az enzimes lebontást, de általában nem biztosítják a bevitt genetikai konstrukciók hosszú távú fennmaradását (Wells D.J. A génterápia előrehaladása és kilátásai: elektroporáció és egyéb fizikai módszerek // Gene Ther. - 2004. - v.11, No. 18. - P.1363-1369 Wang S., Joshi S, Lu S. Delivery of DNA to skin by particle bombardment // Methods Mol Biol. - 2004. - 245. v. - P.185-196. Herweijer H., Wolff J. A. Haladás és kilátások: csupasz DNS géntranszfer és terápia // Génterápia - 2003. - 10. v., 6. szám - P .453-458).

A nem vírushordozók alternatívát jelentenek a genetikai konstrukciók emlőssejtekbe történő vírus által közvetített átviteléhez. A nem vírusos hordozók könnyen szintetizálhatók, és egyszerű módosításuk lehetővé teszi a molekulák szerkezetének és összetételének megváltoztatását, ezáltal javítva a szállító vivőanyagokat. Nem vírushordozók használata esetén nincs korlátozás a szállított expressziós vektor méretére vonatkozóan. Ezenkívül kevésbé toxikusak, a legtöbb esetben nem okoznak specifikus immunválaszt, és biztonságosabbak az in vivo alkalmazásban, mint a vírusvektorok. Ezért a nem vírushordozókba csomagolt genetikai konstrukció bevezetése megismételhető. A nem vírushordozók tanulmányozása a plazmid DNS transzfektáló tulajdonságainak javítása irányába fejlődik azáltal, hogy DNS-komplexeket képeznek különböző szintetikus vegyületekkel (lipidek, oligo- és polipeptidek, polimerek stb.) (például RF szabadalom No. 2336090). , A61K 39/00, A61K 47/00, közzététel: 2008.10.20). A nem vírusos bejuttató hordozók fejlesztése nagymértékben függ a DNS-nek a szervezet sejtjeibe való behatolása akadályainak részletes megértésétől (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Nem vírusos és hibrid vektorok a humán génterápiában: an frissítés // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vektorok és szállítási rendszerek a génterápiában // Med Sci Monit. - 2005. - v. .11, No. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. A nem vírusos génszállítás akadályai // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, No 2. - P.203-217).

Úgy gondolják, hogy a nem vírushordozónak a következő jellemzőkkel kell rendelkeznie:

1) nem toxikus, tömör és védi a plazmid DNS-t az enzimes lebomlástól, és felhasználás után kiürül a szervezetből;

2) biztosítja a plazmid behatolását a sejtbe a sejt plazmamembránjához való specifikus kötéssel:

3) képesek DNS-t felszabadítani az endoszómális kompartmentből;

biztosítják a DNS disszociációját a komplexből a plazmid későbbi transzportja érdekében a sejtmagba.

A génterápia szempontjából a genetikai konstrukciók szállításának legelőnyösebb módja a szövetspecifikus átvitel a test sejtjeibe és szöveteibe.

A komplexek intracelluláris behatolásának első akadálya a plazmamembrán. A legtöbb komplex elektrosztatikus erők segítségével lép kölcsönhatásba a sejtfelülettel. A komplexek sejthez való kötésének egy lehetséges mechanizmusa a sejtfelszíni fehérjékkel - glükózaminoglikánokkal - való kölcsönhatás. Ezzel a komplexek behatolási mechanizmusával azonban nincs génkonstrukciók szövetspecifikus átvitele. Ugyanakkor a genetikai konstrukciók szövetspecifikus szállításának problémája számos betegség génterápiája szempontjából releváns. A sejtfelszínnel való specifikus kölcsönhatás érdekében a komplexek ligandumokat tartalmaznak a sejtfelszínen lévő receptorokhoz. Számos integrin peptid ligandumot jellemeztek. Ide tartozik különösen az RGD tripeptid fragmens (az integrinek számos sejt felszínén vannak jelen), a transzferrin (receptorának fokozott expressziója van a szaporodó sejtekben), az asialorosomucoid (az asialoglikoprotein receptor specifikus expressziót mutat a máj hepatocitáiban).

A genetikai anyag idegsejtekbe való specifikus eljuttatására Zeng és munkatársai a TrkA receptor szignálrégiójából (80-108 aminosav az idegnövekedési faktorból) és 10 lizin aminosavból álló DNS-kötő szekvenciából álló hordozó használatát javasolták. Ez a hordozó a klorokin endoszomolitikus szer jelenlétében, amely elősegíti a komplexek felszabadulását a sejt endoszomális kompartmentjéből, csak a TrkA receptor expressziójával rendelkező sejtekbe tudta szövetspecifikusan eljuttatni a markergént. Ez a hordozó különféle neurológiai betegségek, például epilepszia, Parkinson- és Alzheimer-kór génterápiás kezelésére használható. Azonban nem alkalmas genetikai anyag más típusú sejtekhez való eljuttatására (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S Az idegnövekedési faktor 4. hurkát tartalmazó szintetikus peptid a célzott génszállításhoz // J Gene Med 2004; 6: 1247-1256).

Az emberi őssejteket ígéretes szereknek tekintik különféle emberi betegségek sejt- és génterápiájában. Ugyanakkor ezek az egyik legnehezebben transzfektálható sejttípusok. A rák génterápiás kezelésében biztosítani kell a gének közvetlenül a tumorsejtekbe való eljuttatását.

A CXCR4 az őssejt-migrációs faktor, az SDF-1α kemokin receptora. A CXCR4 hematopoietikus sejtekben, vaszkuláris endotéliumban és izomszatellitsejtekben expresszálódik. Ennek a génnek a magas szintű expresszióját több mint 20 típusú rákos daganatban (emlőrák, prosztatarák stb.), valamint a vándorló őssejtekben figyelték meg. A CXCR4 receptor a vMIP-II vírus kemokinhez (Kaposi-szarkóma vírus) is képes kötődni. Így a szignálszekvenciák felvétele a hordozómolekulákba a CXCR4 receptorhoz való kötődés érdekében ígéretes módja annak, hogy rendszereket hozzanak létre a tumor- és őssejtekbe történő célzott génszállításhoz.

A genetikai anyag CXCR4 receptort expresszáló sejtekbe juttatásához Le Bon és munkatársai egy szintetikus ligandumot használtak ehhez a receptorhoz, az AMD3100-at, amelyet polietiléniminnel vagy kationos lipidekkel kombináltak. A genetikai anyag ezen vegyületekkel alkotott komplexei nem vezettek szignifikánsan a markergén CXCR4+ sejtekbe történő bejuttatásának hatékonyságának növekedéséhez a szignál nélküli vegyületekhez képest. A Le Bon által használt hordozók nem voltak hatékonyak, mert specifikus bejuttatásukkal csak a CXCR4 receptor internalizációját elősegítő anyag (forbol-észter) transzfekciós tápközeghez való hozzáadásával lehetséges. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 konjugátumok a célzott nem vírusos génbejuttató rendszerek összetevőjeként: CXCR4-expresszáló sejtek szintézise és in vitro transzfekciós hatékonysága. // Chem Biocon2004 , 15, 413-423).

Ezért szükség van olyan genetikai konstrukciók hordozójának létrehozására, amely képes specifikus szállítást biztosítani a CXCR4(+) sejtekhez, és nem befolyásolja a közeli szöveteket. A jelen találmány egy ilyen eljárást biztosít.

A találmány azon a feladaton alapul, hogy olyan módszert dolgozzanak ki genetikai konstrukciók CXCR4 receptort expresszáló sejtekbe történő specifikus bejuttatására, amely során a CXCR4 receptor szignálszekvenciáját tartalmazó genetikai konstrukciók hordozóinak felhasználásával a sejtek hatékonyságának növelése. elérjük a kérdéses gén szállítását. Fontos megjegyezni, hogy az igényelt hordozók szintézise a szilárd fázisú peptidszintézis bármely ismert módszerével végrehajtható.

A megfogalmazott technikai probléma megoldását az biztosítja, hogy a DNS célzott bejuttatásának módszerében a CXCR4 receptort expresszáló tumor- és őssejtekbe, ideértve a genetikai konstrukciók hordozóinak előállítását a hordozómolekulák összetételébe történő beépítésével egy nyolc lizin aminosavból álló DNS-kötő szekvencia - KKKKKKKK, szignálszekvenciák, DNS/hordozó komplexek képződése, in vitro transzfekció, a szignálszekvencia a következő csoportból van kiválasztva: az N-terminális 1-8 aminosavából álló fragmentum az SDF-1α fehérje szekvenciája - KPVSLSYR; az SDF-1α fehérje - KPVSLSYRCPCRFFESH - N-terminális szekvenciájának 1-17 aminosav közötti fragmentuma, ahol a 9. és 11. aminosav szerinnel van helyettesítve; vagy a virális kemokin vMIP-II - LGASWHRPDK N-terminális szekvenciájának 1-10 aminosavból álló fragmentuma; A szignálszekvencia összekapcsolása a DNS-kötő szekvenciával két ε-aminohexánsav molekulából álló linker régió segítségével történik.

Ebben az esetben a szignálszekvencia lehet az SDF-1α-KPVSLSYR fehérje N-terminális szekvenciájának 1-8. aminosavaiból származó fragmentum.

Vagy a szignálszekvencia lehet az SDF-1α fehérje – KPVLSSYRCPCRFFESH – N-terminális szekvenciájának 1–17. aminosavaiból származó fragmentum, ahol a 9. és 11. aminosav szerinnel van helyettesítve.

A virális kemokin vMIP-II - LGASWHRPDK N-terminális szekvenciájának 1-10. aminosavaiból származó, D-aminosavakból szintetizált fragmentum szintén használható szignálrégióként.

A glicerin vagy a klorokin olyan komponensként használható, amely biztosítja a hordozókból és genetikai anyagokból álló komplexek endoszómákból való kijutását.

A plazmid DNS felhasználható hordozók genetikai anyagaként.

A jelen találmányban meghatározott technikai eredményt az oligolizin molekulák - KKKKKKKK (K8) - hordozóként való felhasználásával érik el, amely az SDF-1 vagy vMIP-II fehérjék CXCR4 receptorához fűződő szignálszekvenciákkal konjugált, nevezetesen az N-terminális szekvenciával. az SDF-1 kemokin (c 1-8 aminosav) vagy az SDF-1 kemokin N-terminális szekvenciája (1-17 aminosav, a 9 és 11 aminosavak szerinnel történő helyettesítésével), vagy az SDF-1 kemokin N-terminális szekvenciája virális kemokin vMIP-II (1-10 aminosav a D-konformációban). A KKKKKKKK oligolizin jelenléte a hordozókészítményben lehetővé teszi, hogy a konjugátumok elektrosztatikus kölcsönhatás következtében komplexeket képezzenek nukleinsavakkal, különösen a plazmid DNS-sel.

A megadott műszaki eredményt az igényelt hordozó három változata éri el.

Az első megvalósítási módban meghatározott technikai eredményt az a tény éri el, hogy a rövid CDP hordozóban az SDF-1 kemokin szintetikus analógjain alapul, beleértve egy kationos komponenst, amely egy oligolizin K8, amelyet a plazmid DNS kondenzálására használnak, és egy ligandum komponens a CXCR4 receptorral való kölcsönhatáshoz, összhangban az igénypontokkal. Az igényelt találmány az SDF-1 fehérje N-terminális szekvenciájának egy fragmensét (1-8 aminosav) használja, amelynek szerkezete KPVSLSYR, és az agonista aktivitással rendelkezik. A CXCR4 receptor, mint ligandum komponens, és a konjugátum kationos komponense KKKKKKKK szerkezetű, és egy távtartón keresztül kapcsolódik a ligandum komponenshez - két molekula ε-aminohexánsav (Ahx).

A meghatározott technikai eredményt a második változatban az a tény éri el, hogy az SDF-1 kemokin szintetikus analógjain alapuló hordozóban (hosszú CDP), amely egy kationos komponenst is tartalmaz, amely az oligolizin K8, amelyet a plazmid DNS kondenzálására használnak, és ligandum komponens a CXCR4 receptorral való kölcsönhatáshoz, az igényelt találmány szerint, az SDF-1 fehérje N-terminális szekvenciájának fragmense (1-17 aminosav; az aa9 és aa11 szerinnel van helyettesítve), amely szerkezete KPVSLSYRSPSRFFESH, és a CXCR4 receptor agonistáinak aktivitásával rendelkezik, ligandum komponensként használják, és a konjugátum kationos komponensének szerkezete KKKKKKKK, és egy távtartón keresztül kapcsolódik a ligandum komponenshez - két ε-aminohexánsav molekula.

A harmadik megvalósítási módban meghatározott technikai eredményt az a tény éri el, hogy a Kaposi-szarkóma vírus vMIP-II fehérje szintetikus analógjain alapuló hordozóban (vírus CDP), amely egy kationos komponenst is tartalmaz, amely egy oligolizin K8, amelyet a sejtek kondenzálására használnak. plazmid DNS-t, valamint a CXCR4 receptorral való kölcsönhatásra szolgáló ligandum komponenst, az igényelt találmánynak megfelelően, a vMIP-II fehérje N-terminális szekvenciájának fragmensét (1-10 Daa - D-aminosavakból szintetizálva). az LGASWHRPDK szerkezetű és a CXCR4 receptor antagonista aktivitásával rendelkező ligandum komponensként használatos, a konjugátum kationos komponense pedig KKKKKKKK szerkezetű, és egy távtartón keresztül kapcsolódik a ligandum komponenshez - két ε-aminohexánsav molekula. .

Az igényelt hordozó mindhárom változata szintetizálható ismert peptidszintézis módszerekkel, például a szilárd fázisú Boc-módszerrel (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society 1963. V.85 (14), 2149-2154.

Példák konkrét megvalósításra

A találmányt az 1. ábra segítségével szemléltetjük, amely az etidium-bromid fluoreszcencia intenzitásának változását mutatja a hordozó/DNS töltésarányok növekedésével rövid CDP/DNS, hosszú CDP/DNS és virális CDP/DNS komplexekben. A fluoreszcencia intenzitás csökkenése a képződött komplexek sűrűségének növekedését jelzi. A fennsíkot elérő fluoreszcencia görbék azt jelzik, hogy a komplexek olyan sűrűséget értek el, amely elegendő az etidium-bromid fluoreszcenciájának kioltásához.

A 2. ábra a luciferáz aktivitás függését mutatja HeLa sejtekben (CXCR4+) rövid CDP/DNS, hosszú CDP/DNS és virális CDP/DNS komplexekkel való transzfekció után, glicerin endoszomolitikus szer jelenlétében. Ebben az esetben a következő hordozó/DNS töltésarányok mellett képződött komplexeket használtuk: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. A kísérleti kontrollok egy ép molekula, DNS, PEI/DNS 1/8 komplexek (pozitív kísérleti kontroll a kereskedelmi forgalomban kapható hordozó elágazó polietilén-imin 25 kDa - PEI) és DNS-t és egy kontroll peptidet (CP) tartalmazó komplexek voltak. A CP abban különbözik a jelen találmány szerinti hordozóktól, hogy nincs kötõdése a CXCR4 receptorhoz, és szerkezetileg egy oligolizin KKKKKKKK. A markergén bejuttatásának hatékonysága a rövid CDP, a hosszú CDP és a virális CDP hordozói által 10-100-szor nagyobb volt, mint a CP kontrollé.

A 3. ábra a luciferáz aktivitás függését mutatja A172 sejtekben (CXCR4+) rövid CDP/DNS-sel, hosszú CDP/DNS-sel és virális CDP/DNS komplexekkel, endoszomolitikus ágens glicerin jelenlétében végzett transzfekció után. Itt a következő hordozó/DNS töltési arányokkal képzett komplexeket használtuk: 9/1, 12/1. Kísérleti kontrollként egy ép DNS-molekula, PEI/DNS 1/8 komplexek, valamint DNS-t és CP-peptidet tartalmazó komplexek szolgáltak. A markergén bejuttatásának hatékonysága a rövid CDP, a hosszú CDP és a virális CDP hordozói által 10-szer magasabb volt, mint a CP kontrollé.

A 2. és 3. ábrán látható eredmények alátámasztják a jelen találmány szerinti hordozók specifitását a CXCR4 receptorra.

A 4. ábra a luciferáz-aktivitás függését mutatja CHO-sejtekben (CXCR4-) rövid CDP/DNS-sel, hosszú CDP/DNS-sel és virális CDP/DNS-komplexekkel glicerin endoszomolitikus szer jelenlétében történő transzfekció után. A következő hordozó/DNS töltési arányokkal képzett komplexeket használtuk: 9/1, 12/1. Kísérleti kontrollként egy ép DNS-molekula, PEI/DNS 1/8 komplexek, valamint DNS-t és CP-peptidet tartalmazó komplexek szolgáltak. A markergén bejuttatásának hatékonysága rövid CDP, hosszú CDP és virális CDP hordozókkal közel azonos volt a CP kontrolléval.

A jellel rendelkező hordozók nem képesek lényegesen magasabb szintű genetikai anyag szállítást biztosítani a receptor expresszió nélküli sejtekben, mint a kontroll.

A találmány megvalósítása az alábbiak szerint magyarázható. A jelen találmány célja genetikai konstrukciók célzott bejuttatása a CXCR4 receptort expresszáló sejtekbe, a receptor szignálszekvenciáját tartalmazó genetikai anyag hordozóinak felhasználásával.

Az első szakaszban a hordozó egyik kiviteli alakjának komplexek kialakítását hajtják végre az „érdeklődni” gént tartalmazó genetikai konstrukcióval. A kialakult komplexek segítségével genetikai anyagot juttatnak el a megfelelő célsejtekhez. A sejtpenetráció hatékonyságának elemzése enzimatikus vagy immunhisztokémiai módszerekkel történik.

A komplexek képzése izotóniás oldatban történik. Előnyös a Hepes-pufferolt mannit (Hepes-puffered mannit). A kapott komplexek mérete 170-230 nm.

Az egyik megvalósítási mód szerint a plazmid DNS-t genetikai konstrukcióként alkalmazzuk.

A plazmid DNS markert (luc, lacZ) vagy terápiás gént (a betegségtől függően) tartalmaz, megfelelő promóterek és enhanszerek (CMV, SV40 stb.) és egyéb, például a gazdasejtben történő replikációhoz szükséges elemek ellenőrzése alatt. vagy a genomba való integráció. A rák génterápiás kezelésében a HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, timidin-kináz stb. gének használhatók.

Egy másik megvalósítási mód szerint az mRNS vagy prekurzora egy specifikus szekvenciájával komplementer kis DNS-ből vagy RNS-ből álló oligonukleotidokat genetikai konstrukcióként alkalmazunk egy fehérjetermék szintézisének elnyomására vagy egy mutációt hordozó exon eltávolítására az mRNS-ből. A képződött komplexek genetikai anyagot juttatnak be a CXCR4 receptort expresszáló sejtekbe. A jelen találmány szerinti hordozókomplexek bejutása túlnyomórészt receptor által közvetített transzporton keresztül történik, a CXCR4 receptor extracelluláris doménjéhez való kötődés és a receptor ezt követő internalizálása révén.

A hordozók és a genetikai anyag dózisát egyénileg határozzák meg, és függ a sejtek típusától, a felületükön lévő CXCR4 receptor mennyiségétől és a sejtek transzfektálásának összetettségétől.

Ezen hordozók hatékonyságának növelése érdekében a sejttranszfekciót előnyösen endoszomolitikus szer alkalmazásával végezzük. Ezek közé tartozik a glicerin, klorokin stb. Ezeket az anyagokat közvetlenül a komplexek sejtekhez való hozzáadása előtt adják a transzfekciós táptalajhoz. Nem kapcsolódnak a komplexekhez, ezért nem befolyásolják szerkezetüket.

A hordozó DNS-kötő részeként olyan peptidek, más polimer vegyületek és liposzómák használhatók, amelyek képesek nukleinsavak tömörítésére. Emellett endoszomolitikus tulajdonságokkal is rendelkezhetnek (nincs szükség további endoszomolitikus szer alkalmazására), és szükség esetén (például terápiás vagy markergének szállításához) genetikai anyagot juttatnak a sejtmagba.

A transzfekciós körülmények kiválasztásakor a lehető legnagyobb szállítási hatékonyságot biztosítják. Előnyös, ha a komplexeket a sejtekkel 4 órán keresztül inkubáljuk. Ez az idő azonban 3 és 6 óra között változtatható. Az inkubációs idő letelte után a táptalajt kicseréljük, és a sejteket 24-48 órán át (sejttípustól és genetikai anyagtól függően) hagyjuk a kérdéses génnel bevitt konstrukciók expressziójára vagy az oligonukleotidok terápiás hatásának megnyilvánulására.

A bejuttatás hatékonyságának elemzése a bejuttatott génkonstrukció típusától függően enzimatikus vagy immunhisztokémiai módszerekkel történik.

1. példa: DNS/hordozó komplexek kialakulása és a komplexképződés folyamatának vizsgálata.

A szentjánosbogár luciferáz gént a citomegalovírus promoter szabályozása alatt tartalmazó pCLUC4 plazmidot genetikai anyagként használták a gének célzott sejtekbe juttatásához. A hordozó egyik kiviteli alakját használták.

Egyenlő térfogatú pufferben 1 μg DNS-ből 40 μl 1X HBM pufferben (5% w/v mannit, 5 mM Hepes, pH 7,5) készült oldatok és a DNS/hordozó különböző töltésarányának megfelelő hordozóoldatok készültek. A hordozóoldatot fokozatosan hozzáadtuk a DNS-oldatot tartalmazó Eppendorf-csőhöz, és 20 másodpercig erőteljesen kevertük. A kapott elegyet 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, hogy a komplexképzési folyamat befejeződjön.

A komplexképzés eredményeit etidium-bromid kiszorításos módszerrel elemezzük. Az etidium-bromid fluoreszcenciát Varioscan Flash spektrális pásztázó multimódusú olvasóval (Thermo, Finnország) mérjük. Az etidium-bromid kiszorítását 590 nm-es emissziónál figyelték meg (gerjesztés 544 nm-en), miután az etidium-bromiddal (400 ng/ml) előinkubált DNS-hez hordozót adtunk (20 μg/ml). Az elmozdulást az (F-Ff)/(Fb-Ff) képlet segítségével számítottuk ki, ahol Ff és Fb az etidium-bromid fluoreszcencia intenzitása DNS hiányában, illetve jelenlétében, az eredményeket az 1. ábra mutatja be.

2. példa Transzfekció végrehajtása in vitro.

A HeLa, A172 és CHO sejteket 48 lyukú tenyésztőlemezekre (Nunc) oltottuk be 24 órával a transzfekció előtt 50 000 sejt/lyuk arányban, amely 500 μl DMEM táptalajból (GIBCO) és 10% borjúmagzatból álló standard tenyészet keveréket tartalmazott. szérum (GIBCO), 2 mM glutamin, penicillin (50 U/ml), sztreptomicin (50 μg/ml) és 1 mM nátrium-piruvát hozzáadásával. A komplexek szuszpenzióját az 1. példában leírt módszer szerint állítottuk elő tenyésztőlemez lyukájánként 2 μg DNS-sel. 10 perccel a DNS/hordozó komplexek szuszpenziójának hozzáadása előtt a sejteket többször mostuk DMEM-mel, és 500 μl 15% glicerint és 1,5% etanolt tartalmazó tápközeget adtunk mindegyik lyukba. A transzfekciót DNS/hordozó komplexek szuszpenziójának a tápközeghez való hozzáadásával végeztük. A komplexek hozzáadása után a sejteket tartalmazó lemezeket 37 °C hőmérsékletű és 5% CO 2 tartalmú termosztátba helyeztük 4 órára. Az inkubációs idő letelte után a sejteket DMEM-mel mostuk, és 500 μl standard tenyészet keveréket adtunk mindegyik lyukba. A tenyésztőlemezt termosztátban 37 °C-on és 5% CO 2-on 48 órán át inkubáltuk, majd a markergén expresszióját detektáltuk.

3. példa: Luciferáz génexpresszió kimutatása transzfekció után in vitro.

A tápközeget eltávolítottuk a tenyésztőlemezekről, és a sejteket 1x PBS-ben (pH 7,2) mostuk. 80 μl lízispuffert (25 MM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8) adtunk minden egyes lyukhoz. 50 μl lizátumot vittünk át átlátszatlan falú polisztirol lemezekre a luciferáz aktivitás mérésére. A mérést Varioscan Flash spektrális pásztázó multimódusú olvasóval (Thermo, Finnország) végeztük. A mérést luciferáz gyorskeverék (20 mM tricin, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2,67 mM MgSO 4, 0 1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530) oldatával végeztük. μM ATP, 270 µM acetil-koenzim A, 470 µM luciferin). Minden mérést 10 másodpercig végeztünk. A műszer leolvasásait relatív fényegységben (RLU) kaptuk. A kísérleti eredményeket a sejtkivonatokból származó 1 mg összfehérjére vonatkoztatott relatív fényegységben értékeltük egy tenyésztőlemez lyukájában. Az egyes üregekben lévő fehérje teljes mennyiségét egy protein assay kit (Bio-Rad) segítségével mértük, a szarvasmarha-szérum albumin kalibrációs görbéhez viszonyítva. Az eredményeket a 2., 3., 4. ábra mutatja be.

DNS vakcina(Is gén vakcina, nukleinsav vakcina)- génmanipulált konstrukció, amely a sejtbe juttatva biztosítja a kórokozó fehérjék vagy tumorantigének termelődését és immunválaszt vált ki. A DNS-vakcinák szervezetbe juttatását genetikai immunizálásnak nevezik. A DNS-oltásnak számos előnye van a hagyományos vakcinákkal szemben. Konkrétan kimutatták, hogy az ilyen vakcinák nemcsak antitestek termelését (humorális immunitás), hanem specifikus citotoxikus választ (celluláris immunitás) is biztosítanak, amely korábban csak élő vakcinák segítségével volt elérhető. Manapság a DNS-vakcinákat nem használják emberek kezelésére, de az előrejelzések szerint a genetikai immunizálás számos betegség leküzdésében segít.

A teremtés története

A DNS-fragmensek vakcinázásra való felhasználásának ötlete az 50-es és 60-as években jelent meg. Kísérletsorozat után kiderült, hogy a DNS genetikai információja megőrzi átírási és lefordítási képességét egy másik sejtbe való átvitel után. Ugyanebben az évben felfedezték, hogy a gyermekbénulás vírus genomjának állatokba való befecskendezése serkenti az antitestek termelését. Későbbi aktiválás humorális immunitás nem fertőző ágensekből származó DNS-molekulák esetében mutatják be. A 90-es évek óta a tudományos laboratóriumok egyre inkább elkezdték feltárni a DNS immunstimuláló tulajdonságait. 1992-ben Tang és munkatársai kimutatták, hogy a plazmidba ágyazott emberi növekedési hormon gén stabilan expresszálódik az egér testében, és a szintetizált hormont az immunrendszer antigénként ismeri fel, és serkenti az antitestek termelését. A plazmid DNS bejuttatásának folyamatát a humorális immunitás stimulálására Tango "genetikai immunizálásnak" nevezték. A következő évben azonban a tudósok egy másik csoportja bejelentette, hogy az influenzavírus-fehérjéket kódoló plazmid bevezetése humorális és sejtes választ is okozott. Az immunitás mindkét ágának indukcióját ugyanabban az évben találták HIV-géneket tartalmazó plazmid esetében is. 1995 óta kezdenek bizonyítani, hogy a DNS-oltás aktiválhatja az immunrendszert a rák ellen. Körülbelül 20 éve zajlottak a DNS-vakcinák első klinikai próbái, amelyek elsősorban az új módszer biztonságosságát hivatottak bizonyítani. A betegeket HIV, influenza vírus, herpesz, hepatitis B és a malária kórokozójának génjeibe fecskendezték be. Az összes teszt eredménye biztatónak bizonyult: a DNS-vakcinák stabilan expresszálódnak, immunválaszt váltottak ki, és nem okoztak súlyos mellékhatások, amely további kutatásaik ösztönzésére szolgált.

DNS-vakcina tervezése

Szerkezetileg a DNS-vakcina egy vektorba ágyazott nukleotidszekvencia, amely specifikus antigént vagy antigéneket kódol. A génsebészetben a vektor egy nukleinsavmolekula, amely genetikai anyag sejtekbe juttatására és replikációjának vagy expressziójának biztosítására szolgál. Korábban vírusokon alapuló vektorokat használtak a gének sejtekbe történő szállítására: módosított (gyengített) variola vírus, adenovírusok és retrovírusok. A vírusvektorok meglehetősen hatékonyak, de jelentős a valószínűsége a mellékhatások kialakulásának magának a vektornak a viszonylag magas immunogenitása miatt. Ezért manapság egy bakteriális plazmidot, egy autonóm replikációra képes kis stabil, cirkuláris DNS-molekulát gyakrabban használnak vektorként. A plazmid önmagában nem váltja ki a kívánt specifikus immunválaszt, ezért immunogén fehérjék génjeit inszertálják bele. Ezenkívül a DNS-vakcinának tartalmaznia kell az eukarióta sejtekben történő génexpresszióhoz szükséges szabályozó szekvenciákat. A kész DNS-konstrukciót egy baktériumsejtbe juttatják, ahol megnövelik a másolatok számát. Ezt követően a kívánt inszertet hordozó plazmidokat izoláljuk és tisztítjuk.

Plazmid vektor tervezés

A DNS-vakcinák létrehozásának fontos szakasza a vektor tervezése (konstrukciója). A plazmidvektor kötelező szerkezete a restrikciós helyek, egy szelektálható marker és a DNS-vakcina replikációjának kezdőpontja a bakteriális sejtben. Ahhoz, hogy az antigén szintézis megtörténjen, a DNS-vakcinának tartalmaznia kell egy promotert és egy poliadenilációs szignált. A promóter fontos tényező a vakcina hatékonyságában, hiszen ez határozza meg az immunválasz erősségét: minél nagyobb a vírus- vagy tumorantigént kódoló gén expressziója, annál erősebb az immunválasz. A leggyakrabban használt promoter az SV40 vagy a citomegalovírus (CMV). Az mRNS-transzkriptumok stabilizálása érdekében poliadenilációs szignált, amelyet leggyakrabban a szarvasmarha növekedési hormon génjéből nyernek, inszertálnak a plazmidba. (BGH) vagy SV40 vírus. A bakteriális antibiotikum rezisztencia géneket választják szelektív markerként, gyakran a kanamicin rezisztencia gént. A DNS-vakcinák tervezésekor a replikáció legnépszerűbb origója az Escherichia coli.

Gén kiválasztása immunizáláshoz

A vektor a DNS-vakcina fontos összetevője, de immunogenitását az inszert – az antigént kódoló DNS-szekvencia – határozza meg. A vírusantigének közül a fúziós fehérjék a legalkalmasabbak az immunizálásra - ezek viszonylag konzervatív fehérjék, amelyek biztosítják a vírus behatolását a sejtbe. A Gram-pozitív baktériumok elleni vakcinázáshoz célszerű a plazmid vektorba beépíteni azon bakteriális fehérjék génjeit, amelyek meghatározzák a betegség patogenezisét. A Gram-negatív baktériumok fehérjéi közül magas immunogenitásúak. Terápiás daganatellenes DNS-vakcinákhoz rákos sejt markerfehérjéket használnak.

Módszerek DNS-vakcinák sejtekbe juttatására

A kész vakcinát az emberi vagy állati szervezetbe kell eljuttatni, ahol az antigénprezentáló sejtek (APC) - makrofágok, dendritikus sejtek, B-limfociták - a rendeltetési helye. Itt megtörténik az antigén szintézise és poszttranszlációs módosulása, majd beágyazódik a sejtmembránba, hogy magára vonja a figyelmet. immunrendszer. A fő probléma az, hogy elegendő mennyiségű plazmid kerüljön az APC-be. A genetikai anyag sejtekbe juttatásának módszereit általában 2 csoportra osztják: vírusos és nem vírusos. Mivel a vírusvektoroknak számos jelentős hátránya van, ez a rész csak a DNS-vakcinák bejuttatásának nem vírusos módszereit mutatja be.

Mikroinjekció

Az 1990-es évek elején az intramuszkuláris mikroinjekció volt a leggyakoribb módszer a DNS sejtekbe történő bejuttatására a módszer egyszerűsége miatt. Ehhez a DNS-t vízben vagy izotóniás oldatban oldják, és szükség esetén adjuvánst (az immunválaszt fokozó anyagot) adnak hozzá. Ezután egy vékony üvegcső segítségével az oldatot az izomszövetbe fecskendezik, ahol az APC-k szerepét a dendritikus sejtek látják el. A dendritesejt magjába kerülve a vakcina elkezd expresszálódni, és megtörténik az antigénfehérjék szintézise. Mikroinjekciókkal a DNS szubkután a csecsemőmirigybe, a májba és a daganatszövetbe injektálható, de az izomszövetben figyelhető meg a DNS vakcina leghosszabb ideig tartó (akár egy évig tartó) expressziója. A Langerhans sejtek magas koncentrációja miatt (altípus dendritikus sejtek), a DNS-oltás vonzó célpontja a bőr. Az intradermális (szubkután) beadáshoz egy sor mikrotűt használnak, amelyek hossza több száz mikron. Az intradermális vakcinázásnak számos lehetősége van. Könnyebb, ha a stratum corneumot (a bőr külső rétegét, általában 10-20 mikron) fellazítja egy sor mikrotűvel, hogy növelje a permeabilitását a DNS-oldat további helyi injektálásához. Hatékonyabb a száraz vakcinával bevont mikrotűk használata, amelyek a bőr alatt feloldódnak. Ennek a módszernek a hatékonysága általában alacsony, mivel a DNS először az intercelluláris térbe kerül, és csak ezután épül be a sejtekbe.

Elektroporáció

Az elektroporáció hagyományos módszer a DNS baktériumsejtekbe és sejttenyészetekbe juttatására, elektromos impulzus alkalmazásával. Ez az impulzus pórusokat hoz létre a sejtmembránban, ami megkönnyíti a negatív töltésű DNS bejutását. Ezt a módszert DNS-vakcinák állatoknak és embereknek történő bejuttatására kölcsönözték, és jelentősen növelheti a hagyományos injekció hatékonyságát. Az elektroporációs készülék egy elektromos áramforrást és egy eldobható hálót tartalmaz, amely fecskendőből és elektródátűkből áll. Egy fecskendő befecskendezi a vakcinát az izomszövetbe, és az elektródák elektromos mezőt hoznak létre, amely megkönnyíti a DNS bejutását a miocitákba és a dendritikus sejtekbe. Mára olyan eszközöket fejlesztettek ki, amelyek a hagyományos injekcióhoz képest 1000-szeresére növelhetik az oltás hatékonyságát. Az elektroporáció a DNS-vakcinák intramuszkuláris és szubkután beadására egyaránt alkalmazható. A hátrányok közé tartozik az enyhe fájdalom az injekció beadásának helyén és a speciális eszközök szükségessége. Elektromos tér helyett mágneses mező is használható. Az ilyen eszközök ugyanazon az elven működnek, de ebben az esetben az eljárás teljesen fájdalommentes és kevésbé károsítja a sejteket.

Az elektromos tér hatása nemcsak a DNS-vakcina sejtek általi felszívódását fokozza, hanem az immunválasz kialakulását is serkenti. Az elektroporáció alkalmazása kisebb szövetkárosodáshoz vezet - helyi gyulladásos folyamat alakul ki. A károsodott sejtek kemokinek szabadulnak fel, így makrofágok, limfociták és dendritikus sejtek jutnak el hozzájuk. Az immunsejtek koncentrációjának növelése a vakcina beadási helyén növeli annak hatékonyságát.

Sonoporation

A sonoporáció az idegen DNS sejtekbe történő átvitelének módja ultrahang segítségével. Az ultrahang növeli a sejtmembrán permeabilitását, aminek következtében az exogén DNS könnyebben behatol a sejtbe. A sonoporációt először 1986-ban alkalmazták gének sejtekbe történő átvitelére. Ezzel a módszerrel DNS-molekulákat juttatnak be a szaruhártya, az agy, a csontszövet, a vese, a hasnyálmirigy, az embrionális szövet, a váz- és a szívizmok sejtjébe. A sonoporációt más módszerekkel összehasonlítva kevesen vizsgálták, még mindig sok erőfeszítésre van szükség annak hatékonyságának növelésére, különösen az egész szervezet szintjén.

Ballisztikus transzfekció

A ballisztikus transzfekció a szervek és szövetek DNS-molekulákkal bevont, 1-3 mikron átmérőjű nehézfém-mikrorészecskéivel (arany, volfrám) történő héjazásán (bombázásán) alapul. Ily módon bejutva a DNS-vakcina a célsejtekben expresszálódik, és termékeik bejutnak a vérbe. A részecskék gyorsítására a kézi lőfegyverekhez hasonló eszközt használnak - génpisztolyt vagy génágyút. A mikrorészecskék áthaladnak a sejtmembránokon, és a genetikai konstrukciót közvetlenül a sejtmagba juttatják. A mikrorészecskék behatolási mélysége általában kicsi - legfeljebb 1 mm, ezért a módszert elsősorban a bőr vagy a szomszédos porcszövet transzfekciójára használják. A speciális tüzelési feltételek lehetővé teszik, hogy a mikrorészecskék 4-5 mm mélységig hatoljanak be, és génkonstrukciókat vigyenek át a harántcsíkolt izmok rostjaiba. Jellemzően a közvetlenül a lövés közepén elhelyezkedő sejtek elhalnak, míg a központtól 0,6-1 cm-re lévő zónában találhatók a legsikeresebben transzformált sejtek. Ezt a technológiát biobalisztikának vagy biolisztikának is nevezik.

Az első génpisztolyt tudósok egy csoportja alkotta meg 1983 és 1986 között növényi sejtek átalakítása céljából. Ez egy pisztoly volt, amelyet egy szögek automatikus beverésére szolgáló eszköz köré terveztek. A riporter (marker) génből származó DNS-t volfrámgolyóra vitték, és egy Petri-csészébe lőtték. A riportergén expressziója az immunizálás hatékonyságát jelezte. Manapság aranyból vagy ezüstből készült részecskéket használnak a DNS szállítására, mivel ezek a wolframmal ellentétben nem mérgezőek a sejtekre.

Magas nyomás alatt

1999-ben olyan injekciós eszközöket fejlesztettek ki, amelyek tű használata nélkül képesek DNS-vakcina beadására. Az ilyen eszközök a Lorentz-erőnek köszönhetően működnek: egy kicsi, erős mágnes jelentős nyomást hoz létre, és aktiválja a dugattyút, amely hangsebességgel löki ki a gyógyszert. Az aktuális erősség megváltoztatásával kiválaszthatja az injekció mélységét és adagolhatja a gyógyszereket. Az eljárás teljesen fájdalommentes, korábban cukorbetegek inzulin beadására és nagyszabású védőoltások során alkalmazták. Ennek a módszernek jelentős hátránya, hogy a nagy nyomás elméletileg megváltoztathatja a beinjektált molekulák szerkezetét. Ezt az injekciós technológiát azonban folyamatosan fejlesztik, és mára olyan eszközöket fejlesztettek ki, amelyek akár 16 mm-es mélységig is képesek eljuttatni a DNS-t.

Élő bakteriális vektort tartalmaz

Az élő bakteriális vektorok törzsek Salmonela, Shigella vagy Listeria, amelyek olyan mutációt hordoznak a bioszintézis- vagy inváziós génekben, amelyek megszüntetik a patogenitást és képesek fenntartani életképességüket a gazdaszervezetben vagy a környezetben. De az immunogén fehérjékhez szükséges géneket beépítik a bakteriális genomba. A legyengült baktérium szájon át (szájon át, lenyelve) vagy intranazálisan (orrba permetezve) kerül a szervezetbe, így ez az oltási mód nem igényel felszerelést. Ezenkívül az ilyen beadás serkenti a nyálkahártya immunválaszát, ami azért fontos, mert a legtöbb kórokozó a száj- és orrnyílásokon keresztül jut be a szervezetbe. A gyomrot megkerülve a legyengült baktériumok bejutnak a vékonybélbe. Ezután a baktérium behatol a Peer plakkokba - a bél nyirokcsomóiba. A Peyer-foltok közepén a baktériumok a makrofágok célpontjává válnak, és fagocitózison mennek keresztül. A makrofág citoplazmájában a baktérium felszabadítja a DNS-vakcinát, amely után a DNS bejut a sejtmagba, és a baktériumot az immunrendszer semlegesíti.

Csomagolás liposzómákba

A liposzómák gömb alakú (körülbelül 100 nm átmérőjű) képződmények, amelyek lipid kettős rétegből állnak. A liposzómák belül üregesek, amelyeket általában oldószerrel töltenek meg, de különféle anyagok, köztük DNS-vakcinák szállítására is használhatók. Hidrofób héjuk lehetővé teszi számukra, hogy egyesüljenek a sejtmembránokkal, és tartalmukat a sejtbe szállítsák. A liposzómák használata 1965-ben kezdődött, és ez a bionanotechnológia fejlődésének erőteljes motorja lett.

A DNS-konstrukciók célsejtekbe történő közvetlen bejuttatásának ígéretes módszere a genetikai konstrukció bejuttatása a pozitív töltésű lipidekből épített kationos liposzómák részeként. A negatív töltésű DNS-molekulával rendelkező kationos liposzómák DNS-lipid komplexet - lipoplexet - alkotnak. Az ilyen komplexek használatának előnyei a nagy mennyiségű információ szállításának képessége, a nem fertőzőképesség, emellett egyszerűek és olcsók a gyártásuk. 2003-ban rendkívül kicsi, millimikron polietilénglikollal bevont liposzómákat hoztak létre, amelyek képesek a terápiás DNS-t a vér-agy gáton keresztül átvinni és az agy neuronjaihoz eljuttatni, ami korábban lehetetlen volt.

Polyplexből áll

A nagy DNS-konstrukciók (>10 kb) sejtbe történő bejuttatására poliplexeket használnak - pozitív töltésű polimerekből (polikationokból) és negatív töltésű DNS-molekulákból álló rendszereket. Az ilyen komplexek mérete 100 nm-nél kisebb, ami egyrészt a makrofágok emésztésének teszi ki őket (így reagálnak a 200 nm-nél nagyobb részecskékre), másrészt elég nagyok ahhoz, hogy ne szűrjük a vesékben.

A polikációk komplexekké kondenzálják a DNS-molekulát, így biztosítják annak stabilitását és védelmét a nukleázok hatásával szemben. Kationos fehérjék, aminosavak szintetikus homopolimerei (polilizinek, poliargininek), kitozán-poliszacharid és polietilén-amin szolgálhatnak DNS-kötő polimerként. Jellemzően a poliplexben a polikation feleslegben van jelen, aminek következtében a komplex oldható és pozitív töltésű. Ha egy ligandum poliplexhez kapcsolódik egy bizonyos sejt receptor, akkor a DNS-vakcina egy adott sejttípusra irányulhat. A genetikai anyag poliplex részeként történő szállításának folyamata két szakaszból áll: extracelluláris (út az injekció helyétől a célsejtekig) és intracelluláris (kölcsönhatás a célsejtekkel, endocitózis, kilépés az endoszómákból, szállítás a sejtmagba). Az első akadály, amelyet a komplexnek le kell győznie, a vér és az extracelluláris mátrix. Ezért a poliplex ilyen fiziko-kémiai paramétereit úgy választják meg, hogy növeljék stabilitását, elkerüljék a vérfehérjékkel való nem kívánt kölcsönhatásokat és a kiváltott immunreakciót. kémiai természet polikáció. A célsejtekbe jutva a poliplex a plazmamembránon felszívódik, endocitózissal felveszi, majd el kell hagynia az endoszómát, és kationos polimerré és DNS-molekulává disszociál. A szabad DNS a sejtmagba kerül, a polimer kationok pedig elhagyják a sejtet, és kiürülnek a szervezetből.

A DNS-vakcinák bejuttatásának leggyakoribb módszereinek jellemzői
Módszer	Előnyök	Hibák
Intramuszkuláris vagy szubkután injekciók	Nincs szükség speciális felszerelésre Állandó vagy hosszú távú kifejezés A DNS a szomszédos szövetekbe kerül	Alacsony hatékonyság Viszonylag nagy mennyiségű DNS-t igényel
Elektroporáció	Magas hatásfok	Szövetkárosodás
Gén fegyver	Nagy pontosság Kívánt kis mennyiségben DNS	Inert mikrorészecskék jelenléte szükséges Sejtkárosodás a lövés helyén
Nagynyomású befecskendezés	Viszonylag egyszerű módszer Nincs szükség mikrorészecskékre A DNS néhány mm-től 1,5 cm-ig terjedő mélységig képes behatolni	Befolyásolja a DNS szerkezetét Az immunizálás alacsony hatékonysága Nagy mennyiségű DNS-t igényel (akár 300 μg)
Csomagolás liposzómákba	Magas hatásfok in vitro Könnyű gyártás Nagy kapacitású Más módszerekkel kombinálható Nál nél intravénás beadás a vakcina potenciálisan minden szövetet elérhet Az intranazális beadás biztosítja a vakcina kifejeződését az orrnyálkahártyában és az A osztályú immunglobulinok (IgA) termelődését.	Lehetséges toxicitás Alacsony hatékonyság in vivo

Az immunválasz kialakulásának mechanizmusa

A sejtben szintetizált antigén feldolgozáson megy keresztül, majd bemutatásra kerül az immunkompetens sejteknek. A feldolgozás egy antigén fehérje hasítása immunogén peptid fragmentumokra. A prezentáció egy antigén-fragmens bemutatását jelenti immunkompetens sejtek fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekuláival kombinálva. Ezeknek a molekuláknak két legjelentősebb osztálya van: az I. osztályú MHC (MHC-I) és az MHC II. osztály (MHC-II). Az egyes osztályok molekuláihoz való kötődéshez az antigént a sejt speciális részeiben állítják elő. Az endogén antigén fehérjéket a proteaszómába küldik lebontásra, majd MHC-I-vel komplexben jelennek meg a sejtfelszínen. Itt, amikor találkoznak, felismerik őket a CD8 + T-sejtek (killer T-sejtek), amelyek citotoxikus immunválaszt valósítanak meg. Az exogén fehérjéket a lizomnim proteázok hasítják, amelyek az MHC-II-ben vannak, és a CD4 + T-sejt (T-helper) receptorok felismerik. Ez utóbbiak sejtes és humorális válaszokat is okoznak.

Az antigén bemutatása az MHC-I útvonalon keresztül

A DNS-oltás endogén antigénszintézist foglal magában, ezért ez az út az uralkodó. Az antigénfeldolgozás az MHC-I útvonalon keresztül több szakaszban megy végbe. A sejtmagban szintetizált fehérje a citoplazmába kerül, és a Proteaszóma rövid peptidekre - epitópokra hasítja, amelyeket speciális antigén transzporter fehérjék (TAP, antigénfeldolgozáshoz kapcsolódó transzporter) juttatnak az endoplazmatikus retikulumba (ER). Az ER-ben minden epitóp egy MHC-I molekulával kombinálódik, majd a képződött komplexet a Golgi-készülékbe (AG) küldik glikozilezésre. Innen a vezikulumban lévő komplex a plazmamembrán felé hajlik. Miután a vezikula egyesül a plazmalemmával, a komplex megjelenik a sejtfelszínen, ahol a T-killer receptorok felismerik, amelyek citotoxikus aktivitással rendelkeznek.

Az antigén bemutatása az MHC-II útvonalon keresztül

A MES-II-hez kötődő peptidek fő forrása az exogén fehérjék, amelyek endocitózison keresztül jutnak be a sejtbe. Kimutatták azonban, hogy egyes intracelluláris fehérjék az MChS-II-vel komplexben is jelen lehetnek. Ebben az esetben az újonnan szintetizált fehérjék, miután bejutottak a citoplazmába, lizoszómákba kerülnek, ahol az antigén savas proteázok hatására hasad. Ezt követően az epitópokat tartalmazó lizoszóma összeolvad a MES-II molekulát hordozó vezikulával. Az egyesített vezikulában epitóp-MCS-II komplex képződik, amely a vezikula plazmalemmával való egyesülése után a sejtfelszínre kerül. Itt ezt a komplexet felismerik a T-helper receptorok, ami aktiválja őket. Ez mind a celluláris (a gyilkos T-sejtek aktiválása), mind a humorális immunitás (a B-limfociták aktiválása) stimulálásához vezet.

Az oldható fehérje antigénekkel végzett hagyományos vakcinázás célja a T helper sejtek mobilizálása. A T-helper sejtek viszonylag alacsony válaszreakciója a DNS-vakcinák egyik hátránya. Ezenkívül a DNS-vakcinák jelenlegi generációja nem képes magas titerű antitestek termelését indukálni. A T helper sejtek aktiválásának fokozása érdekében az antigént a MES-II útvonalra kell irányítani. Ennek érdekében egy lizoszómális lokalizációs jelet építenek be a DNS-vakcinába, a szintetizált antigén a lizoszómákba kerül, ami azt jelenti, hogy a MES-II útján halad.

Stratégiák a DNS-oltás hatékonyságának javítására

A DNS-vakcinák jövőjével kapcsolatos egyik fő kérdés hatékonyságuk növelése. Jelenleg számos tanulmány folyik a kifejlesztett DNS-vakcinák optimalizálására. A megoldás keresése két irányban történik: a vakcina expressziójának növelése és a kódolt antigén immunogenitásának növelése.

Az átírási elemek optimalizálása

A DNS-vakcina fontos összetevője a promoter. A bakteriális promoterek nem alkalmasak emlőssejtekben az antigénexpresszióra, ezért inkább onkogén vírusok promotereit alkalmaztuk. A vakcinák biztonságának javítása érdekében ezeket nem karcinogén tárgyakból, például humán citomegalovírusból (CMV) származó promoterekre cserélték. A legtöbb DNS-vakcina esetében ez a promoter az optimális választás: Magas expresszió jellemzi a sejtek széles körében. Specifikus szövetekben történő génexpresszióhoz ígéretes az erre a szövettípusra specifikus promóterek alkalmazása. Például egy izom CPK-promoter alkalmazása, ha beadják, tízszeresére növeli az antitest-szintézist és a T-sejt-válasz indukcióját, mint egy hasonló DNS-vakcina alkalmazása CMV-promoterrel. A citoszkeletális fehérjék egyikét kódoló desmin gén promótere is nagy hatékonyságot mutatott a myocytákban. A DNS-vakcina expressziójának fokozása keratinocitákban (sejtek hámszövet) a metalotionein gén promótereit használják (egy fehérje, amely kötődik nehéz fémek) vagy D-vitamin hidroxiláz gén 3.

A transzkripció iniciációs szintje általában növekszik mögött használati fiók erős promóter és fokozó,és a lezárási jellemzők korlátozó tényezővé válhatnak. A poliadeniláció és az elsődleges RNS-transzkriptum feldolgozásának hatékonysága a poliA jel szekvenciájától függően változik. Vagyis a poliadenilezési szekvencia befolyásolja az antigénszintézist. Például az SV40 vírus széles körben használt poliA szignálja alacsonyabb hatékonysággal rendelkezik, mint a nyúl β-globin gén vagy a szarvasmarha növekedési hormon gén poliadenilációs szignálja.

A hatékony transzláció érdekében az emlős mRNS-nek át kell esnie az ún Kozák sorozat. Ennek a szekvenciának a DNS-konstrukcióba történő beillesztése jelentősen megnövelheti az antigénszintézis szintjét. Annak megakadályozására, hogy az RNS-polimeráz kihagyja a gén stopkodonját, és egy megnyúlt fehérje szintézise megtörténjen, amely ezután nem tudja megszerezni a megfelelő hajtást, a gén leállítható. dupla stop vonal.

A DNS-vakcina tervezésekor is próbálkoznak optimalizálja a kodonjait. Az optimalizálási eljárás azt jelenti, hogy a génszekvenciában kodonokat cserélünk ki oly módon, hogy a fehérje aminosav-szekvenciája változatlan marad, de mRNS-e transzlációjának hatékonysága nő. Ennek az az oka, hogy a legtöbb aminosavat egynél több határ kódolja. Minden kodonnak megvan a saját tRNS-e, és a különböző tRNS-ek reprezentációja egy sejtben nem azonos, és az organizmus típusától függően is változik. A kodonokat úgy választják ki, hogy a kívánt tRNS jelenléte ne váljon korlátozó tényezővé az antigénszintézis során.

Antigén optimalizálás

Bár az immunválasz erőssége korrelál a DNS-vakcina expressziós szintjével, minden antigén esetében van egy bizonyos plató, amely után az antigén fehérje mennyiségének növelése növeli az antitest-termelést. Ugyanakkor az antigén optimalizálásával erősebb immunválasz érhető el. Például által antigén és ligandum kombinálása egy antigénprezentáló sejt specifikus receptorához. Ilyen ligandum lehet a CD40 markerfehérje, az Fms-szerű tirozin-kináz-3 extracelluláris doménje vagy a T-ölő antigén-4. A ligandum-receptor kölcsönhatás következtében megnő az antigén fehérje APC általi felvételének hatékonysága.

Az antigén proteaszómává vagy lizoszómává történő lebontásának elősegítése az immunválaszt is serkentik. Az antigén proteliotikus hasításának fokozása érdekében ubiquitinációs jelet inszertálnak a szekvenciájába Idézethiba: Hibás hívás: A cím nélküli ref tagnak rendelkeznie kell bemenettel. A teljes antigén helyett kódoló DNS-vakcinák alkalmazása több különböző eredetű epitóp, lehetővé teszi az immunválasz spektrumának jelentős bővítését.

A kombináció hatásos a tumorellenes DNS-vakcinák esetében „tumor antigén + vírus vagy bakteriális antigén.” Például egy tumorantigén és egy tetanusztoxin epitóp kombinálása jelentősen növeli a gyilkos T-sejtek rákos sejtekkel szembeni aktiválódását.

Adjuvánsok felvétele

Ha hagyományos vakcinákat alkalmaznak, adjuvánsokat adnak hozzá az immunválasz fokozására. A DNS-oltásnak van bakteriális eredetű, tehát maga is immunstimuláns. Az immunválasz fokozása érdekében adjuváns géneket inszertálnak a DNS-vakcinába, vagy egy további plazmidot alkalmaznak, amely immunstimuláló fehérjéket kódol.

A bakteriális CpG-dinukleotidok immunstimuláló hatása

A plazmidok funkciója nem korlátozódik a gének sejtekbe juttatására. Még 1893-ban fedezték fel, hogy a bakteriális lizátumok keveréke csökkenti a rákos daganatok progresszióját, de csak 1983-ban állapították meg, hogy a lizátum immunstimuláló tulajdonságai a bakteriális DNS-molekuláknak köszönhetők. 1995-ben kimutatták, hogy az immunstimulációt a bakteriális DNS-ben lévő CpG motívumok okozzák. A baktériumokban, valamint a DNS-vírusokban ezek a motívumok metilálatlanok. Ezzel szemben az emberi szervezetben és a magasabb rendű főemlősökben a CpG-dinukleotidok többségében a citozin metilcsoportot tartalmaz. Ezért észlelhető a CpG-motívumok metilálatlansága emberi test mint kórokozó-asszociált molekuláris minták (PAMP, patogén-asszociált molekuláris minták). A rumry vegyületeket a Toll-szerű receptorok ismerik fel, amelyek a ligandum típusától függően több típusra oszthatók. A nem metilált CpG motívumokat a B-limfociták, dendritikus sejtek és természetes gyilkos sejtek endoplazmatikus retikulumának membránján található TLR-9 receptor ismeri fel. A receptor kötődése a nem metilált CpG motívumokhoz reakciókaszkádot indít el, melynek eredményeként a proinflammatorikus citokinek – interferon-1 és IL-12 – szintézise indukálódik.

Citokinek és egyéb immunmodulátorok expressziója

A DNS-oltáshoz leggyakrabban citokin géneket használnak adjuvánsként. A citokinek a fehérjemolekulák egy osztálya, amelyek szabályozzák az intercelluláris és rendszerközi kölcsönhatásokat a szervezetben, különösen az immunrendszer működését. Az összes citokin, és közülük több mint 30 ismert, képes módosítani az immunválaszt. Az IL2, IL-12, interferon γ, IL-15, IL-18 és IL-23 citokinek stimuláló hatást fejtenek ki az 1. osztályú T helper sejtekre. A második osztályba tartozó T-helper sejtek hatását módosító citokinek közé tartoznak a következők: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. A citokin típusát aszerint választják ki, hogy milyen típusú immunválaszt kívánnak fokozni.

Az immunválasz fokozása kemokinek használatával érhető el. A kemokinek olyan citokinek családját jelentik, amelyek képesek kemotaxist indukálni a rájuk érzékeny sejtekben, beleértve az immunsejteket is. A kemokinek receptorai különösen a kemokinek antigénreceptív sejtjein találhatók. Egy kemokin kötődése a receptorához az antigén-kemokin komplex endocitózisához vezet az APC-be. Ezt a stratégiát hatékonyan alkalmazzák mind az antivirális DNS-vakcinák, mind a daganatellenes vakcinák kifejlesztésében.

Az adjuváns funkciót a HSP70 fehérje (heat-shock proteins) is elláthatja. A HSP70 immunstimuláló hatása azon a képességén alapul, hogy képes bejutni az extracelluláris térbe és kötődni az APC receptorokhoz. A HSP70 kifelé irányuló transzportjának mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, de valószínűleg több út is létezik: exocitózis, kifelé szekréció vagy kilépés a csatornán keresztül. A HSP70 kötődése a receptorhoz a dendritikus sejtek aktiválásához vezet, közvetíti az antigénprezentációt és serkenti a kemokinek termelését. Mivel az antigén a HSP70-hez van fuzionálva, az extracelluláris térbe is bejut, ezért a MES-II útvonalon keresztül bemutatható, és aktiválhatja a B-sejteket. Elkerülni autoimmun reakciók A DNS-vakcinák a HSP70 bakteriális gént használják.

A DNS-vakcinák előnyei és hátrányai

A DNS-oltás módszerének számos előnye van, amelyek közül a legfontosabb a humorális és celluláris immunválasz kiváltása. A DNS-alapú vakcinák hosszan tartó antigénexpressziót és ezáltal tartós immunválaszt biztosítanak. NAK NEK további tényezők A DNS-immunizálás kialakulásához hozzájáruló tényezők közé tartozik az oltóanyag-előállítás egyszerűsége és alacsony költsége.

Előnyök

Hibák

Az antigén elnyeri natív konformációját Az immunitás mindkét ágának aktiválása: humorális és sejtes A szintetizált antigén szelektíven a MES-I vagy MES-II útvonalra irányítható Szelektíven hat a T-helper sejtek különböző populációira Hosszú távú antigénexpressziót biztosít Egyszerű és gyors gyártás Alacsony gyártási költség Nem szükséges különleges körülmények tárolás Betegségek megelőzésére és kezelésére egyaránt használható Potenciálisan hatékony számos betegség ellen: bakteriális, vírusos, autoimmun és rák

Gyenge immunogenitás Vírusvektorok esetében fennáll annak a veszélye, hogy idegen DNS beépül a sejtgenomba Autoimmun reakciók lehetséges kialakulása A plazmid- és vírusvektorok nem specifikus immunválaszt indukálhatnak

DNS-vakcinák alkalmazása

A DNS-vakcinák első klinikai vizsgálatai az új módszer biztonságosságával együtt bebizonyították annak alacsony hatékonyságát. A DNS-immunizálás ígéretét megvalósítva a tudományos laboratóriumok a biotechnológiai cégekkel közösen az új módszer optimalizálására összpontosították erőfeszítéseiket, és néhány éven belül jelentős előrelépés történt. 2005-ben az első DNS-vakcina megkapta az FDA jóváhagyását. Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság)állatokon való használatra. 2013-ig több mint száz DNS-vakcina van klinikai vizsgálat alatt, és négy DNS-vakcina kapott engedélyt állattenyésztésre.

DNS-vakcinák az állatgyógyászatban

Mind a négy FDA által jóváhagyott vakcina plazmid alapú. Közülük három esetében a gyártó által javasolt beadási mód intramuszkuláris, a LifeTide® vakcina esetében elektroporációval kombinált injekció. Ha más vakcinák az immunrendszer aktiválását célozzák, akkor a LifeTide® vakcina esetében az immunstimuláló hatás további. A vakcina terméke a szomatoliberin, egy hormon, amely az agyalapi mirigyet növekedési hormon és prolaktin felszabadulására serkenti. Az utolsó két hormon sertéseknél az állatok súlyának növekedéséhez és az almok számának növekedéséhez vezet. Ugyanakkor a szomatoliberint kódoló plazmid állatokba juttatása serkenti a T-limfociták, a természetes ölősejtek termelődését, és ezáltal növeli a szervezet immunrezisztenciáját.

A vakcina kereskedelmi neve	Az engedélyezés éve	Cél	Állat	Vakcina termék	A vakcina létrehozásának célja
West Nile-Innovator® (USA)	2005	Nyugat-nílusi vírus	Lovak	A PreM-E vírus strukturális fehérje	Védelem a vírus ellen
Apex-IHN® (Kanada)	2005	A hematopoietikus szövet fertőző nekrózisának kórokozója	A lazacok családjába tartozó halak	Vírusos glikoprotein	A haleledel mennyiségének és minőségének növelése
LifeTide® SW 5 (Ausztrália)	2008	Egy növekedési hormon	Sertés és egyéb állatállomány	Sertés szomatoliberin	Megnövekedett alomméret kocáknál; jelentősen csökkenti a csökkenést perinatális mortalitásés a morbiditás
ONCEPT® (USA)	2010	Melanóma	Kutyák	Humán tirozinázok	Alternatívaként sugárkezelésés sebészeti beavatkozás a melanoma kezelésében

A DNS-oltás kilátásai

Daganatellenes DNS vakcinák

Míg a sejtes és humorális immunválaszok kiváltása meggyőzően bizonyított idegen antigének társult, összekapcsolt, társított valamivel fertőző betegségek, a DNS-vakcinák alkalmazása a rák kezelésére eddig kevésbé volt sikeres. A hatékony daganatellenes immunitás kiváltása az kihívást jelentő feladat. Klinikai kutatások megerősített általános biztonság A tumorellenes DNS-vakcinák alacsony toxicitásúak, azonban az általuk kiváltott immunválasz hatékonysága gyenge volt, és a daganatellenes aktivitás bizonyos esetekben általában megkérdőjelezhető.

DNS-vakcinák vírusos és bakteriális kórokozók ellen

DNS-vakcina fogszuvasodás ellen

A fogszuvasodás oka a szénhidrátok baktériumok által végzett fermentációja (glikolízise) következtében fellépő helyi pH-változás. A Wuhani Virológiai Intézet (Kína) tudósai kifejlesztettek egy DNS-oltást, amely a fogszuvasodás egyik kórokozója ellen irányul. Streptococcus mutans. A vakcina plazmidon alapul, és két fehérjét kódol: a felszíni fehérjét Utca. mutans PAcés a baktériumokból származó flagelin szalmonella, amely adjuvánsként működik. A preklinikai vizsgálatok szakaszában a vakcinát az orron keresztül adták be a laboratóriumi rágcsálóknak, majd a vérszérum immunglobulin G szintjét, ill. szekréciós immunglobulinokÉs nyálban. A vizsgálatok után a tudósok azt találták, hogy mind a vérben, mind a nyálban megnőtt az immunfehérjék szintje, de ami még fontosabb, a telepek növekedése gátolt. Streptococcus mutans a fogzománcon. Vagyis a beoltott állatok fogai jobban védettek voltak a fogszuvasodás ellen.

DNS-vakcinák és autoimmun betegségek kezelése

DNS-vakcina az 1-es típusú cukorbetegség ellen

Az 1-es típusú cukorbetegséget a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteiben található inzulintermelő béta-sejtek elvesztése jellemzi. fő ok A béta-sejtek elvesztése a gyilkos T-sejtek autoimmun támadása. Annak érdekében, hogy megvédjék a béta sejteket a túlműködő immunrendszertől, a Stanfordi (USA) és a Leideni (Hollandia) egyetem tudósai kifejlesztették a BHT-3021 DNS vakcinát. A vakcina plazmidon alapul, és egy inzulin prekurzort, a proinzulint kódolja. Ez egy visszamenőleges vakcina: ha a hagyományos vakcinák aktiválódnak immunreakciók, akkor a BHT-3021 éppen ellenkezőleg, semlegesíti a gyilkos T-sejtek Langerhans-szigetei ellen irányuló citotoxikus hatását.

Az első fázisban klinikai vizsgálatok A BHT-3021 egy 80 fős csoportban mutatta meg hatékonyságát. Felük hét naponta kapott 12 héten keresztül intramuszkuláris injekciók BHT-3021 és a másik fele placebo. Ezen időszak után a vakcinát kapott csoportban a C-peptid szintje emelkedett a vérben, ami a béta-sejtek működésének helyreállítását jelezte. Egyik résztvevőnél sem jelentettek súlyos mellékhatásokat. A vakcina hatása 2 hónapig tartott.