A doua venire a terapiei genice. Terapia genică fetală: de la teorie la practică Tipuri de terapie genică: terapie ex vivo și in vivo

Terapia genică

Baranov V.S. Terapia genică – medicina secolului XXI // Jurnal educațional Soros. – 1999. – Nr. 3. – P. 63–68. (Universitatea de Stat din Sankt Petersburg)

© Baranov V.S., text

© Soros Educational Journal, 1999

© A. Afonin, prelucrarea și publicarea versiunii html, 2006

<http:// afonin-59- bio. oameni. ru>

<http:// afonin-59- salix. oameni. ru>

INTRODUCERE

Realizări decisive ale biologiei moleculare și geneticii în studiul structurii fine a genelor eucariote, cartografierea lor pe cromozomii mamiferelor, și în special a oamenilor, succesele impresionante ale Proiectului Genomului Uman în identificarea și clonarea genelor ale căror mutații conduc la numeroase boli ereditare , și, în sfârșit, creșterea rapidă a biotehnologiei și Inginerie genetică au fost premisele necesare pentru a face primele încercări de tratare a bolilor monogenice din experimente pe animale și construcții teoretice deja în 1989.

Ce este terapia genică? Înseamnă tratament folosind gena ca medicament sau numai tratament prin corectarea genei mutante? Acestea și multe alte întrebări apar în mod inevitabil atunci când luăm în considerare o astfel de direcție promițătoare, și poate potențial periculoasă pentru umanitate, a medicinei din secolul XXI ca terapie genetică.

SCURT FOND ISTORIC

Terapia genică în stadiul actual poate fi definită ca tratamentul bolilor ereditare, multifactoriale și neereditare (infecțioase) prin introducerea de gene în celulele pacienților cu scopul de a modifica defectele genice sau de a conferi celulelor noi funcții. Primele studii clinice de terapie genică au fost întreprinse pe 22 mai 1989, cu scopul de a marca genetic limfocitele infiltrante tumorale în melanomul avansat. Prima boală ereditară monogenă pentru care s-au aplicat metode terapia genică, s-a dovedit a fi o imunodeficiență ereditară cauzată de o mutație a genei adenozin deaminazei (ADA). Pe 14 septembrie 1990, la Bethesda (SUA), o fetiță de patru ani care suferă de această boală destul de rară (1:100.000) a fost transplantată cu propriile limfocite, transformate anterior în afara corpului. (ex vivo) genomului ADA (gena ADA + gena oameni + vector retroviral). Efectul terapeutic a fost observat timp de câteva luni, după care procedura s-a repetat la intervale de 3...5 luni. Pe parcursul a trei ani de terapie, au fost efectuate un total de 23 de transfuzii intravenoase. ADA- limfocite T transformate fără efecte adverse vizibile. Ca urmare a tratamentului, starea pacientului s-a îmbunătățit atât de mult încât a putut imagine normală viață și să nu vă fie frică de infecții aleatorii. Tratamentul celui de-al doilea pacient cu această boală a avut la fel de succes. În prezent, studiile clinice de terapie genică pentru această boală se desfășoară în Italia, Franța, Marea Britanie și Japonia.

În 1997, numărul de protocoale aprobate pentru studiile clinice era deja de 175, peste 2000 de pacienți au luat parte la implementarea acestora. Majoritatea acestor proiecte (aproximativ 80%) se referă la tratamentul cancerului, precum și al infecției cu HIV (SIDA). În același timp, în cercetările moderne privind terapia genică este necesar să se țină cont de faptul că consecințele manipulării genelor sau ADN-ului recombinant în vivo insuficient studiat.

În țările cu cel mai avansat nivel de cercetare în acest domeniu, în special în Statele Unite, protocoalele medicale care utilizează secvențe ADN sens sunt supuse revizuirii obligatorii de către comitetele și comisiile relevante. În SUA, acestea sunt Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) și Food and Drug Administration (FDA), cu aprobarea ulterioară obligatorie a proiectului de către directorul National Institutes of Health. În Europa, astfel de protocoale sunt întocmite și aprobate în conformitate cu recomandările Grupului de lucru european privind transferul și terapia genelor umane.

METODE DE TRANSFECȚIE GENETICĂ ÎN TERAPIA GENICA

Condiția decisivă pentru succesul terapiei genice este asigurarea unei livrări eficiente, adică transfecția (în sens larg) sau transducția (când se utilizează vectori virali) a unei gene străine în celule țintă, asigurând funcționarea acesteia pe termen lung în aceste celule și creând condiții pentru funcționarea deplină a genei (expresia acesteia) . Transfecția poate fi efectuată utilizând ADN pur (gol) dopat (integrat) în plasmida corespunzătoare sau ADN complexat (ADN plasmidic conectat la săruri, proteine ​​(transferină), polimeri organici (DEAE-dextran, polilizină, lipozomi sau particule de aur), sau ADN conținut în particule virale lipsite anterior de capacitatea de a se replica.

Principalele metode de livrare a genelor străine în celule sunt împărțite în chimice, fizice și biologice. Eficiența transfecției și capacitatea de integrare a ADN-ului străin transdus nu sunt aceleași pentru diferite metode de transfecție în celulele ADN țintă. Numai vectorii virali sau constructele genetice care conțin secvențe virale sunt capabili de transducție activă și, în unele cazuri, de expresie pe termen lung a genelor străine. Din cele peste 175 de protocoale de studii clinice deja aprobate pentru terapia genică, peste 120 implică utilizarea transducției virale și aproximativ 100 dintre acestea se bazează pe utilizarea vectorilor retrovirali.

O trecere în revistă a datelor ne permite să ajungem la concluzia că, în ciuda eforturilor multor laboratoare din întreaga lume, totul este deja cunoscut și testat. în vivoȘi în vitro sistemele vectoriale sunt departe de a fi perfecte. Dacă există o problemă cu livrarea ADN-ului străin în vitro practic rezolvată și livrarea acestuia către celulele țintă din diferite țesuturi în vivo rezolvate cu succes (în principal prin crearea de constructe care poartă proteine ​​receptorului, inclusiv antigene specifice anumitor țesuturi), apoi alte caracteristici ale sistemelor vectoriale existente - stabilitatea integrării, expresia reglată, siguranță - necesită încă îmbunătățiri serioase.

În primul rând, aceasta se referă la stabilitatea integrării. Până acum, integrarea în genom a fost realizată doar folosind vectori retrovirali sau adeno-asociați. Eficiența integrării stabile poate fi crescută prin îmbunătățirea construcțiilor genelor, cum ar fi sistemele mediate de receptor, sau prin crearea de vectori epizomali suficient de stabili (adică structuri ADN capabile de persistență pe termen lung în interiorul nucleelor).

Transferul de gene mediat de receptor este după cum urmează. Secvența de ADN a genei dorite este conectată la o anumită substanță (de exemplu, o glicoproteină), care are o afinitate mare pentru un anumit receptor de membrană al celulei transformate (de exemplu, un hepatocit). Complexul rezultat este combinat cu un adenovirus, care asigură pătrunderea construcției genice în nucleul celulei. Un astfel de vector combinat asigură livrarea țintită eficientă a genei către celule specifice.

Recent, s-a acordat o atenție deosebită creării de vectori pe baza cromozomilor artificiali de mamifere (Mammalian Artificial Chromosomes). Datorită prezenței elementelor structurale de bază ale cromozomilor obișnuiți, astfel de mini-cromozomi sunt reținuți în celule pentru o lungă perioadă de timp și sunt capabili să transporte gene (genomice) de dimensiune completă și elementele lor de reglare naturale, care sunt necesare pentru funcționarea corectă. a genei, în țesutul potrivit și la momentul potrivit.

PRINCIPII ALE TERAPIEI GENICE

În funcție de metoda de introducere a ADN-ului exogen în genomul pacientului, terapia genică poate fi efectuată fie în cultură celulară. (ex vivo) sau direct în organism (în vivo). Terapie sau terapie genetică celulară ex vivo implică izolarea și cultivarea tipurilor de celule specifice pacientului în vitro, introducând gene străine în ele (de exemplu, cele care îmbunătățesc răspunsul imun al organismului), selectând clonele de celule transfectate și reinfuzându-le în același pacient. În prezent, majoritatea programelor de terapie genetică aprobate pentru studiile clinice utilizează această abordare.

Terapia genică în vivo se bazează pe introducerea directă a secvențelor de ADN clonate și împachetate în țesuturile specifice ale pacientului. Deosebit de promițător pentru tratamentul bolilor genetice in vivo introducerea de gene folosind vaccinuri aerosolizate sau injectate pare a fi posibilă. Terapia genică cu aerosoli este dezvoltată, de regulă, pentru tratamentul bolilor pulmonare (fibroză chistică, cancer pulmonar).

Dezvoltarea unui program de terapie genetică este precedată de o analiză amănunțită a expresiei specifice țesuturilor a genei corespunzătoare, identificarea defectului biochimic primar, studiul structurii, funcției și distribuției intracelulare a acestuia. produs proteic, precum și analiza biochimică a procesului patologic. Toate aceste date sunt luate în considerare la întocmirea protocolului medical corespunzător. Testarea procedurii de corectare a genelor a unei boli ereditare se efectuează pe culturi de celule primare ale pacientului, în care această genă este în mod normal activă din punct de vedere funcțional. Folosind aceste modele celulare, se evaluează eficacitatea sistemului de transfer de ADN exogen selectat, se determină expresia constructului genetic introdus, se analizează interacțiunea acestuia cu genomul celular și se dezvoltă metode de corecție la nivel biochimic.

Folosind culturi de celule, este posibil să se dezvolte un sistem pentru livrarea țintită a ADN-ului recombinant, cu toate acestea, testarea fiabilității funcționării acestui sistem poate fi efectuată numai la nivelul întregului organism. Acesta este motivul pentru care se acordă atât de multă atenție experimentării în programele de terapie genetică. în vivo pe modele naturale sau obținute artificial de boli ereditare corespunzătoare la animale. Corectarea cu succes a defectelor genetice la astfel de animale și absența efectelor secundare nedorite ale terapiei genice sunt cele mai importante premise pentru rezolvare. studii clinice.

Prin urmare, schema standard Corectarea genică a unui defect ereditar include o serie de etape succesive. Începe cu crearea unui construct genetic (exprimat) pe deplin funcțional, care conține părțile semantice (codând proteine) și reglatoare ale genei. În etapa următoare, problema unui vector este rezolvată, asigurând livrarea eficientă și, dacă este posibil, țintită a genei către celulele țintă. Apoi se efectuează transfecția (transferul constructului rezultat) în celulele țintă, se evaluează eficiența transfecției și gradul de corectare a defectului biochimic primar în condițiile culturii celulare. (în vitro) si cel mai important, în vivo pe modele biologice animale. Abia după aceasta poate începe programul de studii clinice.

GENOTERAPIA BOLILOR EREDITARE MONOGENICE

Succesul primelor studii clinice a fost un stimulent puternic pentru a accelera dezvoltarea de noi metode de terapie genetică aplicate altor boli ereditare. Mai jos este o listă a bolilor pentru care o abordare a terapiei genice este în mod fundamental posibilă, corectarea genică a cărora este probabil să fie efectuată în viitorul apropiat, precum și acele boli pentru care există deja protocoale aprobate oficial și care se află în stadii diferite. a studiilor clinice.

tabelul 1– Boli ereditare, a căror corecție genică se află în stadiul de studii clinice (CT), dezvoltare experimentală (ED) și este în mod fundamental posibilă (PV)

Boala	Gena defectuoasa	Celulele țintă	Etapă
Imunodeficiență	Adenozin deaminaza	Limfocite
Imunodeficiență	Purin nucleozid fosforilază	Limfocite
Hipercolesterolemie familială	Receptor pentru lipoproteine ​​cu densitate joasă	Hepatocite
Hemofilia B	Factorul IX	Fibroblastele
Hemofilia A	Factorul VIII	Mioblaste, fibroblaste
boala Gaucher (sfingolipidoză)	p-Glucocerebrozidaza	Macrofage, celule stem
boala Hunter	Iduronat sulfatază	Macrofage, celule stem
sindromul Hurler	L-iduronidază	Macrofage, celule stem
Emfizem	α -1 -Antitripsină	Limfocite
Fibroză chistică	SG-regulator transmembranar	Epiteliul bronșic
fenilcetonurie	Fenilalanin hidroxilaza	Hepatocite
Hiperamoniemia	Ornitin transcarbamilaza	Hepatocite
Citrulinemia	Arginosuccinat sintetaza	Hepatocite
Distrofia musculară Duchenne	Distrofii	Mioblaste, miofibrile
Talasemia	β-globină	Eritroblaste
Anemia celulelor secera	β-globină	Eritroblaste
Sindromul de detresă respiratorie	Surfactant proteina B	Epiteliul bronșic
Granulomatoza cronică	NADPH oxidaza	Granulocite
Boala Alzheimer	Proteina precursor de amiloid-β (AAP)	Celule nervoase
boala Parkinson	Tirozin hidroxilază	Mioblaste, fibroblaste, celule nervoase
Lecodistrofie metacromatică	Arilsulfataza A	Celule stem din sânge, celule nervoase
sindromul Lesch-Nyhan	Hipoxantin fosforiboziltransferaza	Celule nervoase

GENOTERAPIA BOLILOR NEERITABILE

Concomitent cu dezvoltarea cercetării în domeniul corecției genetice a defectelor ereditare, a avut succes și căutarea metodelor de utilizare terapeutică a secvențelor de ADN simț pentru tratamentul bolilor neereditare și, în principal, a tumorilor maligne și a infecțiilor virale. Este semnificativ faptul că tocmai în aceste secțiuni de patologie se desfășoară în mod deosebit de intens căutarea modalităților de corecție a genelor, iar numărul de protocoale de studii clinice deja aprobate este de multe ori mai mare decât numărul celor pentru tratamentul bolilor monogenice.

Mai jos sunt enumerate principalele abordări metodologice ale terapiei genice pentru diferite tumori care au fost dezvoltate și sunt deja utilizate pe scară largă. Multe dintre aceste abordări sunt aplicabile și pentru combaterea celor mai grave boli infecțioase, cum ar fi infecția cu HIV (SIDA).

Rezultatele studiilor clinice timpurii ale acestor abordări au fost extrem de încurajatoare, în special în tratamentul bolilor neurodegenerative și al cancerelor sistemului nervos.

Masa 2 - Abordări de bază pentru corectarea genetică a bolilor canceroase

	Genele introduse
Imunoreactivitate tumorală crescută	Gene de antigene străine, citokine
Modificarea genetică a celulelor imune	Gene de citokine, costimulatori
Inserarea genelor de „sensibilitate” sau a genelor de „sinucidere”.	HSV timidin kinaza, genele citozin deaminazei
Blocul expresiei oncogene	ARNm Ki-ras antisens, gene de anticorpi intracelulari
Inserarea genelor supresoare tumorale
Protejarea celulelor normale de chimioterapie	Gene de rezistență la medicamente de tip 1
Inducerea sintezei de substanțe antitumorale celule normale	Genele interleukinei-2, interferon
Producerea de vaccinuri recombinate antitumorale	Vaccinuri cum ar fi BCG care exprimă antigenul tumoral
Radioprotecția locală a țesuturilor normale folosind antioxidanți	Gene transferaze, glutation sintetaza

UNELE PROBLEME ETICE ŞI SOCIALE

TERAPIA GENICA

Apariția unor tehnologii fundamental noi care fac posibilă manipularea activă a genelor și a fragmentelor acestora și asigurarea livrării țintite a unor noi blocuri de informații genetice către regiunile specificate ale genomului a devenit un eveniment important în biologie și medicină.

Deja acum, la nivelul actual de cunoștințe despre genomul uman, astfel de modificări sunt teoretic destul de posibile pentru a îmbunătăți unii parametri fizici (de exemplu, înălțimea), mentali și intelectuali. Astfel, știința umană modernă, în noua sa rundă de dezvoltare, a revenit la ideea de îmbunătățire a rasei umane, postulată cândva de remarcabilul genetician englez F. Galton și dezvoltată de studenții și adepții săi din Marea Britanie (K. Pearson). , L. Penrose, J. Haldane) , în Rusia (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), în SUA (G. Möller). Cursul ulterior al istoriei, după cum știm, a discreditat complet însăși ideea de îmbunătățire a rasei umane. Cu toate acestea, atotputernicia viitoare a omului asupra propriului genom ne obligă să revenim la această temă din nou și din nou, făcându-l subiectul unor discuții vie constante în presa generală și științifică. Nu există nicio îndoială că temerile inițiale asociate cu ingineria genetică umană au fost nejustificate. Utilizarea terapiei genice pentru tratamentul multor boli a fost deja recunoscută ca fiind recomandabilă. Singura și indispensabilă limitare, care rămâne valabilă în condițiile moderne, este aceea că toate măsurile de terapie genică ar trebui să vizeze doar un anumit pacient și să privească exclusiv celulele lui somatice.

Nivelul actual de cunoștințe nu permite corectarea defectelor genelor la nivelul celulelor germinale și celulelor embrionilor umani preimplantați precoce din cauza pericol real contaminarea fondului de gene cu constructe de gene artificiale nedorite sau introducerea de mutații cu consecințe imprevizibile pentru viitorul umanității. În același timp, în literatura științifică apar tot mai dese și mai persistente apeluri pentru reluarea discuției despre oportunitatea corectării genetice a germenilor și celulelor germinale umane.

Acestea sunt câteva dintre întrebările care trebuie abordate ca parte a dezbaterii mai ample de terapie genetică propusă de geneticieni.

1. Terapia genică va putea în viitor să ofere o corecție genetică atât de completă încât să nu reprezinte o amenințare pentru urmași?

2. În ce măsură beneficiile și necesitatea unei proceduri de terapie genetică pentru un cuplu depășesc riscul unei astfel de intervenții pentru întreaga umanitate?

3. Cât de justificate vor fi aceste proceduri pe fundalul viitoarei suprapopulări a planetei?

4. Cum se vor lega activitățile de inginerie genetică asupra oamenilor cu problemele de homeostazie ale societății și ale biosferei?

Astfel, revoluția genetică, a cărei apoteoză a fost terapia genică, oferă nu numai căi reale de tratare a afecțiunilor grave ereditare și neereditare, dar și în dezvoltarea sa rapidă pune noi probleme societății, a căror rezolvare este urgentă necesară în viitorul apropiat.

Astăzi, terapia genică începe în sfârșit să fie la înălțimea speranțelor puse odată în ea. În ultimii șase ani, ca urmare a introducerii unor gene funcționale specifice în părți ale corpului pacientului, a fost posibilă restabilirea vederii la 40 de pacienți cu orbire ereditară. S-au obținut rezultate strălucitoare în lupta împotriva diferite forme leucemie: din 120 de subiecți, mai mulți pacienți au obținut remisie, cu o durată de trei ani. Terapia genică și-a demonstrat eficiența și în lupta împotriva hemofiliei, o boală ereditară care duce uneori la moartea pacientului. Acum pacientul nu trebuie să ia doze mari de medicamente care cresc coagularea sângelui și au efecte secundare periculoase.

Rezultatele pozitive au fost primite cu mare entuziasm și pentru că terapia genică a fost abandonată în urmă cu 15 ani, după moartea prematură a lui Jesse Gelsinger, un adolescent cu o tulburare digestivă rară. Sistemul imunitar tânăr a reacționat la introducerea unei gene străine atât de violent, încât organismul nu a putut suporta. Succesele terapiei genice obținute în anii 1990 nu au fost chiar atât de impresionante pe cât se aștepta.

Toate acestea ne-au forțat să reconsiderăm unele dintre metodele folosite și să evaluăm mai sobru posibilitățile de utilizare a terapiei genice pentru a elimina diverse patologii. A trebuit să renunț la iluzii și să mă întorc la cercetare de baza. În primul rând, a fost necesar să se stabilească cauza posibilului efecte secundare(ca cele care au dus la moartea lui Gelsinger) și învață să le eviți. Ar fi trebuit să se acorde mai multă atenție comunicării cu pacienții și rudele acestora, astfel încât deciziile pe care le iau să fie informate.

Un moment de cotitură în situație a avut loc în urmă cu șase ani, după ce terapia genică a fost folosită pentru a vindeca un băiețel de opt ani pe nume Corey Haas, care suferea de o boală degenerativă a ochiului. Inițial, ca urmare a manipulării genelor, proteina lipsă a început să fie produsă în retina afectată a ochiului stâng, iar la patru zile după operație, băiatul a vizitat grădina zoologică și, spre încântarea lui de nedescris, și-a dat seama că vede un albastru. cer și baloane multicolore. Trei ani mai târziu, au fost efectuate manipulări similare cu ochiul drept. Acum Corey poate vedea atât de bine încât poate merge la vânătoare cu bunicul său.

Terapia genică nu a intrat încă în arsenalul medicilor practicanți, dar există speranță că acest lucru se va întâmpla în următorii zece ani. În 2012, s-a încercat în Europa să-l folosească pentru a elimina o patologie rară, dar extrem de dureroasă, așa-numita deficiență familială de lipoprotein lipază. Este de așteptat ca în Statele Unite, aprobarea pentru utilizarea terapiei genice în medicină să fie primită în 2016, iar apoi va trebui să compenseze ceea ce s-a pierdut în zece ani de inacțiune.

Dezamăgire crudă

Eșecurile care s-au întâmplat cercetătorilor în primele etape ale utilizării terapiei genice în practică au arătat clar cât de dificil este să prevăd toate consecințele introducerii genelor străine în organism. Prea des, cele mai sigure sisteme pentru livrarea lor s-au dovedit a fi insuficient de eficiente, iar unele dintre cele mai eficiente sunt nesigure: apare o reacție imună excesiv de violentă, cum a fost cazul Gelsinger, sau se dezvoltă leucemie.

Pentru a înțelege ce declanșează efectele secundare și pentru a afla cum să reducă riscul de apariție a acestora, geneticienii s-au concentrat pe studierea îndeaproape a celui mai comun sistem de livrare a genelor: proiectarea virușilor care acționează ca seringi de injecție microscopice.

În primul rând, o parte semnificativă a ADN-ului viral a fost îndepărtată pentru a face loc genelor destinate a fi introduse în corpul pacientului. (Această procedură a lipsit simultan virusul de capacitatea sa de a se reproduce.) Virusul transformat, purtând genele țintă, a fost injectat în partea dorită a corpului, unde le-a introdus în regiunile adecvate ale ADN-ului celular, în funcție de tip. de virus.

La momentul în care Gelsinger s-a oferit voluntar în studiile clinice de terapie genetică, cel mai comun sistem de livrare a genelor străine la om era adenovirusurile, care de obicei provoacă infecții ușoare ale tractului respirator superior. Potrivit cercetătorilor de la Universitatea din Pennsylvania, rezultat optim dă injectarea virusului în ficat; aici se află celulele care produc enzima digestivă de care îi lipsea Gelsinger. O copie funcțională a genei pentru această enzimă a fost inserată într-o particulă virală inactivată și un trilion din aceste particule au fost injectate în ficatul pacientului.

Din păcate, unele particule au intrat nu numai în celulele hepatice, așa cum trebuia, ci și într-un număr mare de macrofage - celule mari, "paznici" sistem imunitar, precum și în celulele dendritice, înștiințându-i pe acesta din urmă despre invazia agenților extratereștri. Sistemul imunitar a început imediat să distrugă toate celulele infectate, iar acest proces violent a ucis în cele din urmă pacientul.

Severitatea răspunsului imun i-a uimit pe cercetători. Niciunul dintre ceilalți 17 voluntari nu a experimentat ceva similar. Se știa că adenovirusul ar putea provoca o reacție imună, dar în afară de un incident care a implicat o maimuță care a fost injectată cu un adenovirus ușor diferit de cel descris mai sus, cazul lui Gelsinger a fost unic. „Populația umană este mult mai eterogenă decât populația animală”, spune James Wilson de la Universitatea din Pennsylvania, care a dezvoltat sistemul de livrare genică țintită utilizat în studiile clinice ale lui Gelsinger. „Și în cazul nostru, un pacient a fost într-un fel semnificativ diferit. din rest”. Poate că tragedia nu ar fi avut loc dacă doza de virus ar fi fost mai mică - nu un trilion de particule, ci câteva miliarde. Un alt defect a fost că nici pacientul, nici rudele sale nu au fost informați despre moartea maimuței în teste similare și nimeni nu știa ce decizie ar fi luat dacă ar fi știut despre incident.

Tragedia care i s-a întâmplat lui Gelsinger nu a fost ultima. În curând, s-a încercat eliminarea unei alte patologii folosind terapia genică - imunodeficiența combinată severă XI (SCID-X1). La teste au participat 20 de copii; Cinci dintre ei au făcut leucemie, un copil a murit. Și din nou sistemul de livrare a fost de vină, deși în acest caz, a fost folosit un alt vector - un retrovirus, care inserează genele țintă direct în ADN-ul celular. Locația lor exactă în genom variază ușor și uneori sunt activate în apropierea unei oncogene, ceea ce duce la cancer în anumite condiții.

Revizuirea tehnologiei

Consecințele tragice ale utilizării retro- și adenovirusurilor ca vectori ne-au forțat să apelăm la alți vectori. Drept urmare, au fost selectați doi viruși.

Primul dintre acestea, virusul adeno-asociat (AAV), nu provoacă infecții la oameni. Cei mai mulți dintre noi devin purtători ai acesteia la un moment sau altul în viața noastră și, din această cauză, este puțin probabil ca sistemul imunitar să reacționeze la ea atunci când acționează ca un vector. AAV are o altă caracteristică care ajută la minimizarea riscului de efecte secundare: vine în multe varietăți (serotipuri), fiecare dintre ele preferând să infecteze celulele organului sau țesutului „său”. Deci, pentru AAV2 aceștia sunt ochii, pentru AAV8 - ficatul, pentru AAV9 - mușchiul inimii și creierul. Puteți alege varietatea de virus care este optimă pentru partea țintă a corpului și să minimizați răspunsul imun și altele efecte nedorite. În plus, AAVue încorporează materialul său genetic în genomul celulei gazdă și, prin urmare, nu poate provoca cancer prin activarea aleatorie a oncogenelor.

Virusul adeno-asociat a fost testat pentru prima dată pentru capacitatea sa de a furniza material genetic la țesuturile dorite în 1996. Testele au fost efectuate pe voluntari care suferă de fibroză chistică. De atunci, au fost identificate 11 serotipuri ale acestui virus și din componentele lor au fost construiți sute de vectori siguri, selectivi. Vectorii bazați pe virus AAV sunt în prezent testați pentru terapia genică în patologii precum bolile Parkinson și Alzheimer, precum și în hemofilie, distrofie musculară, insuficiență cardiacă și orbire.

Al doilea virus, surprinzător, este o versiune slăbită a virusului imunodeficienței umane, agentul cauzator al SIDA. Să uităm pentru o clipă de reputația sa proastă și să ne concentrăm asupra avantajelor sale ca vector. HIV este un membru al genului Lentivirus din familia rstrovirusurilor. Afectează celulele sistemului imunitar și – ceea ce este foarte important – nu activează oncogene.

Dacă înlăturăm genele responsabile de efectul letal al HIV, vom obține un vector excelent cu o gamă largă de capacități. Așa spune Stuart Naylor, fost director științific al companiei engleze Oxford Biomedica. Spre deosebire de AAV mai mic, HIV „neutralizat” este potrivit pentru transferul mai multor gene simultan. Este non-toxic și nu provoacă o reacție imună. Lentivirusurile, lipsite de capacitatea de a provoca infecție, sunt testate pentru posibilitatea de a le utiliza pentru a elimina diferite patologii, în special adenoleucodistrofia. Astăzi, câțiva băieți cu acest diagnostic au reușit să se întoarcă la școală datorită terapiei genice.

În paralel cu studiile clinice care utilizează HIV AAVn, se lucrează la modificarea vectorilor virali mai vechi, astfel încât să poată fi utilizați în anumite circumstanțe. Astfel, retrovirusurile (cu excepția HIV) sunt modificate genetic astfel încât să nu provoace leucemie.

Nici măcar adenovirusul, a cărui utilizare a dus la moartea lui Gelsinger, nu a fost complet respins. Acum este injectat numai în părți ale corpului unde este puțin probabil să provoace o reacție imună. Una dintre posibilele sale aplicații este terapia genică pentru xerotomie (gura uscată) la pacienții care au fost expuși la radiații pentru cancerul zonelor capului și gâtului. în care sunt deteriorate glandele salivare.

National Institutes of Health efectuează un studiu clinic (care implică un număr mic de voluntari) a unei abordări bazate pe introducerea de gene în celulele corespunzătoare care mediază formarea canalelor pentru trecerea apei în glandele salivare. Deoarece acestea din urmă sunt de dimensiuni mici și mai mult sau mai puțin izolate, iar doza de virus este de 1 mie de ori mai mică decât cea primită cândva Gelsinger, probabilitatea unei reacții imune prea puternice este redusă la minimum. Particulele virale care nu ajung la celulele țintă, potrivit dezvoltatorilor, ar trebui distruse în salivă, scuipat împreună cu aceasta sau înghițite, ceea ce reduce din nou riscul de a dezvolta o reacție imună. Din 2006, această metodă a îmbunătățit semnificativ starea a 11 pacienți.

Noi ținte

Inspirați de succes, geneticienii medicali au extins domeniul de aplicare al terapiei genice și au încercat să o folosească pentru a elimina defectele genetice neereditare.

Astfel, Universitatea din Pennsylvania folosește deja această abordare în lupta împotriva unuia dintre cele mai frecvente tipuri de cancer la copii - leucemia limfoblastică acută (ALL). Pentru aproximativ 20% dintre copiii cu acest diagnostic, chimioterapia tradițională nu ajută.

Terapia genică în astfel de cazuri este deosebit de complexă și se bazează pe utilizarea receptorilor de antigen himeric (CAR). La fel ca himerele mitologiei grecești antice, formate din părți ale corpului de la diferite animale, acești receptori sunt un complex de două componente ale sistemului imunitar care nu se găsesc în mod normal în organism. Celulele T de care este atașat dobândesc capacitatea de a căuta proteine ​​specifice conținute în celulele leucemice în cantități mai mari decât cele normale și de a distruge celulele anormale. Primii subiecți au fost pacienți adulți cu leucemie cronică: Rezultatele obţinute au fost încurajatoare. Rezultatul studiilor asupra copiilor bolnavi a depășit toate așteptările.

Când Emily Whitehead a fost diagnosticată cu leucemie în mai 2010, avea nouă ani. Două cure de chimioterapie nu au dat rezultate. În primăvara anului 2012, au efectuat un al treilea curs, care ar fi putut ucide un adult, dar fata a supraviețuit, deși a dezvoltat probleme la rinichi, ficatul și splina. Potrivit medicului curant Bruce Levine. „Emily a fost la un pas de moarte”.

Apoi i-au luat sânge, i-au izolat celulele T și i-au injectat lentivirus. în al cărui genom au fost incluse anterior genele țintă. După ce a injectat celulele T himerice înapoi în corpul pacientului, starea ei a început să se îmbunătățească rapid. După trei săptămâni, 25% din celulele T ale măduvei osoase au fost modificate genetic și au început să vâneze celule canceroase. „În aprilie, fata a chel complet. „își amintește Levin, „și până în august își dobândise aspectul anterior și era gata pentru școală”.

Celulele T modificate este puțin probabil să funcționeze pentru tot restul vieții, dar procedura poate fi întotdeauna repetată. Între timp, această fată drăguță cu părul brun și des nu are celule canceroase. În toamna lui 2013, mai multe grupuri de geneticieni medicali au raportat că au folosit tehnica CAR pentru a trata 120 de pacienți cu aceeași formă de leucemie ca cea a lui Emily Whitehead, precum și alte forme. Cinci adulți și 19 din 22 de copii au intrat în remisie.

Perspective

Acum, cercetătorii de terapie genetică se confruntă cu o altă provocare: trebuie să obțină aprobarea de la Food and Drug Administration (FDA) pentru a-și utiliza sistemul vectorial mai sigur decât oricând anterior în clinică. Este necesar să se organizeze studii clinice de fază III care implică un grup mare de voluntari. Acest lucru durează de obicei de la unu la cinci ani. La sfârșitul anului 2013, aproximativ 5% din cele 2.000 de studii ajunseseră în această fază. Creatorii unei metode de tratament care utilizează terapia genică pentru pacienții care suferă de boala Leber (pierderea bilaterală a vederii cauzată de o mutație a ADN-ului mitocondrial: Haas, în vârstă de opt ani, avea această patologie) au avansat mai mult decât alții. Câteva zeci de pacienți au reușit deja să-și recapete vederea folosind terapia genică.

Articol pentru concursul „bio/mol/text”: « Misha s-a născut pe 12 februarie copil sanatos. Dar la 1,5 luni, am început să observ că în toate fotografiile bebelușul ia aceeași poziție, de parcă picioarele lui ar fi nemișcate. În câteva săptămâni, ne-au diagnosticat, ne-au simpatizat și ne-au sfătuit să începem să planificăm pentru o secundă, copil sanatos " Din cauza unei combinații fatale de gene, Misha, ca și alți copii cu această boală, a fost forțat să lupte pentru fiecare mișcare de-a lungul scurtei sale vieți. Luptă cu disperare, cu toată puterea ta, dar în cele din urmă pierzi. Coloanei vertebrale atrofie musculară (SMA) este una dintre anomaliile genetice împotriva căreia omenirea este încă neputincioasă. Cu toate acestea, succesele terapiei genice, pe care lumea medicală le observă astăzi, pot transfera atât SMA, cât și alte patologii ereditare severe în categoria celor vindecabile. În plus, sunt vindecabile în uter.

Sponsorul general al competiției este compania Diaem: cel mai mare furnizor de echipamente, reactivi și consumabile pentru cercetare și producție biologică.

Premiul publicului a fost sponsorizat de Centrul de Genetică Medicală.

Sponsorul „Carte” al competiției - „Alpina Non-Fiction”

Natura face greșeli, corectează omul

Conceptul de terapie genetică este elegant și frumos, ca toate lucrurile ingenioase. Constă în furnizarea de material genetic sănătos într-o celulă folosind sisteme vectoriale pentru a înlocui genele „eronate” cu care sunt asociate diferite boli (Fig. 1).

„Biomolecule” a scris deja în detaliu despre posibilitățile pe care terapia genică le deschide în tratamentul cancerului și a anomaliilor ereditare, în special retinita pigmentară.

Și dacă în anii 80 ai secolului trecut, când au început să vorbească destul de tare despre terapia genică, multora li se părea teoria ei a fi o continuare a scenariului filmului „Înapoi în viitor”, dar astăzi a devenit realitate, deschizând perspective noi, cu adevărat nemărginite.

Cu toate acestea, este clar că terapia genică are o serie de limitări, mai ales când despre care vorbim despre bolile ereditare. În primul rând, procesul patologic în astfel de cazuri poate începe în uter. Până în momentul în care boala este în sfârșit diagnosticată – uneori la ani după nașterea copilului – s-ar putea să se fi dezvoltat leziuni ireversibile ale celulelor și organelor, limitând sau eliminând semnificativ opțiunile terapeutice.

Șansa de a rezolva această problemă a apărut datorită diagnosticului prenatal modern, care face posibilă detectarea defectelor cromozomiale deja în stadiile incipiente ale sarcinii. Prin obținerea oricărui material fetal folosind tehnici invazive, bolile genetice pot fi diagnosticate rapid și fiabil. Și în cazurile cu hemoglobinopatii, nevoia de manipulări invazive dispare cu totul: pentru a le identifica, este suficient să examinăm ADN-ul fetal obținut din celulele sanguine ale mamei.

Tehnicile moderne de diagnostic prenatal în combinație cu progresele în terapia genică oferă o oportunitate unică de a corecta „greșeala” naturii și de a interveni în procesul patologic înainte de deteriorarea ireversibilă a celulelor. Oferiți tratament pentru diferite boli ale copilului în uter sau, conform macar, poate, după toate probabilitățile, să stopeze progresia bolii terapia genică fetală, sau terapia genică fetală.

Ideea terapiei genice fetale este departe de a fi nouă: la doar câțiva ani de la prima încercare de terapie genetică la adulți, în 1994, cercetătorii au început să discute serios despre utilizarea tehnicii inovatoare în uter. Astăzi, când tratamentul bolilor genetice din uter aproape s-a transformat dintr-o perspectivă fantastică în realitate, au fost publicate o mulțime de lucrări în care au fost publicate terapia genică fetală și avantajele acesteia în comparație cu terapia genică la adulți.

Prenatală vs postnatal

Anticipând întrebările despre oportunitatea corectării intrauterine a unei anomalii genetice, să ne concentrăm imediat asupra avantajelor terapiei genice fetale în comparație cu terapia genică postnatală.

Gamă largă de efecte asupra organelor și sistemelor

Se știe că în multe boli genetice (de exemplu, epidermoliza buloasă sau fibroza chistică), poate fi destul de dificil să se influențeze principalele legături. proces patologic aproape imediat după naștere. Corectarea genelor mutante în fătul în curs de dezvoltare vă permite să creșteți rapid populația de celule stem, oferind un grup mare de celule transfectate și, în consecință, un efect terapeutic pronunțat.

Producerea simplificată a unui vector clinic purtător de material genetic

Dozajul vectorului viral utilizat pentru transferul materialului genetic depinde de greutatea corporală. Datorită dimensiunii mici a fătului, este posibil să se realizeze o biodistribuție mult mai mare a vectorului la aceeași doză ca în timpul terapiei genice pentru un adult. Acest lucru economisește atât timp, cât și bani. Datele comparative simple ne ajută să ne imaginăm cât de semnificative sunt economiile: de exemplu, un făt la 14-16 săptămâni de sarcină ( timp optim inducție vectorială) cântărește aproximativ 100 g, în timp ce greutatea corporală medie a unui adult este de aproximativ 60 kg.

Creșterea eficacității terapiei datorită unui răspuns imun incomplet

O serie de studii au demonstrat că imunitatea umorală la adenovirusuri și virușii adeno-asociați (AAV) (Figura 2) a anumitor serotipuri care sunt utilizate în mod obișnuit ca vectori poate duce la eșecul expresiei transgenei. Acesta poate fi unul dintre barierele critice în calea transplantului de succes.

Aproximativ 50% dintre adulții care au un răspuns imun dobândit la acești vectori virali sunt expuși riscului. Dar chiar și în absența sensibilității, administrarea vectorului la adulți duce adesea la dezvoltarea unui răspuns imun care reduce durata și nivelul expresiei transgenelor. Deci dupa injecție intramusculară vector adenoviral cu gena proteinei distrofinaȘoarecii adulți cu distrofie musculară Duchenne dezvoltă anticorpi la distrofină, care este asociată cu o scădere semnificativă a eficienței expresiei. În același timp, fătul din uter este imunologic imatur, ceea ce permite livrarea vectorului viral și a produsului transgen fără restricția impusă de răspunsul imun.

Avantajele evidente ale terapiei fetale în comparație cu corecția postnatală asigură o eficiență și fezabilitate mai mare a acesteia, în special pentru bolile severe, care pun viața în pericol. Chiar și în cazurile în care vindecarea completă nu poate fi obținută, terapia genică fetală poate influența părțile patologice ale bolii, ușurând cursul acesteia și îmbunătățind prognosticul. Și, prin urmare, poate deveni singura alternativă terapeutică pentru întreruperea sarcinii pentru mii de familii. Mai mult, numărul de boli care ar putea fi controlate atunci când terapia genică fetală este introdusă în practica clinică este cu adevărat enorm.

Perspective și oportunități

Se crede că terapia genică fetală este capabilă să pună sub control multe patologii periculoase. Doar o mică parte dintre acestea sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Boli care pot fi controlate cu terapia genică fetală .

Boala	Medicament de terapie genică	Celulele și/sau organul țintă	Vârsta de manifestare a bolii	Prevalența	Durată de viaţă
Fibroză chistică	CFTR (regulator transmembranar)	Celulele epiteliale ale tractului respirator și ale intestinelor	Al treilea trimestru de sarcină	1:4000	Aproximativ 35 de ani
Distrofia musculară Duchenne	Distrofina	Miocite	2 ani	1:4500	25 de ani
Atrofie musculară spinală	proteina SMN	Neuroni motorii	6 luni (tip I)	1:10 000	2 ani
Hemofilie	Factorul de coagulare VIII sau IX	Hepatocite	1 an	1:6000
Beta talasemie	Globin	Precursori de celule roșii din sânge	Până la un an	1:2700	Până la 20 de ani
boala Gaucher	Glucocerebrozidaza	Hepatocite	9,5 ani	1:59 000	Mai puțin de 2 ani
Defecte ciclului ureei	Ornitin transcarbamilaza	Hepatocite	2 zile	1:30 000	2 zile
Epidermoliza buloasă	Colagen tip VII	Keratinocite	Naștere	1:40 000	Cu o terapie corectă, speranță de viață normală
Encefalopatie ischemică hipoxică	Factori neurotrofici	Neuronii corticali	Naștere	1:1000	Cu o terapie corectă, speranță de viață normală
Restricție severă a creșterii intrauterine	Factori de creștere placentară	Trofoblast	Făt	1:500	Cateva zile

În plus, patologiile despre care se crede că sunt controlate prin terapia fetală includ:

• Tulburări de imunodeficiență- sindromul limfocitelor goale, hipoplazia cartilajului, sindromul Chediak-Higashi, boala cronica granulomatoasa, sindromul Kostman, deficitul de aderenta leucocitara, sindromul Omenn, sindromul Wiskott-Aldrich.
• Hemoglobinopatii- Boala Rh, porfirie eritropoetică congenitală.
• Boli asociate cu deficiența activității enzimatice- boala Gaucher, boala Krabbe, leucodistrofia metacromatică, mucopolizaharidoze, boala Wolman, boala Niemann-Pick.
• Alte- diskratoză congenitală, limfohistiocistoză hemafagocitară familială, osteopetroză infantilă, sindrom Shwachman-Diamond etc.

Lista bolilor care pot fi la îndemâna terapiei genice fetale este uimitoare: probabil că această tehnică va face posibilă intervenția în procese patologice care anterior nu sunt controlate de om care sunt cauzate de boli monogenice. Numărul lor, conform Organizației Mondiale a Sănătății, ajunge la zece mii. Cu toate acestea, este important să se țină seama de existența unui număr de limitări și, în primul rând, de riscurile pentru mamă și făt asociate terapiei genice intrauterine.

Temeri și riscuri

Riscurile specifice ale transferului de gene prenatale sunt fundamental diferite de cele ale terapiei genice postnatale. Acestea includ reacții adverse pe termen scurt și efecte postnatale pe termen lung. Relevanța lor este exacerbată de faptul că, în mod ipotetic, expresia genelor fetale poate avea efecte imprevizibile atât asupra dezvoltării prenatale, cât și asupra dezvoltării postnatale.

În primul rând, procedura de transfer în sine este direct asociată cu o probabilitate crescută de avort spontan, corioamnionită și naștere prematură. Studiile au documentat reacții inflamatorii la vector, în special infiltrarea ficatului și necroza ficatului în terapia genică fetală de oaie.

Succesul terapiei genice fetale poate fi contracarat de răspunsul imun fetal, iar acest lucru implică anumite riscuri pentru rezultatul final. Răspunsurile umorale și celulare la introducerea unui vector sau a unei proteine ​​transgenice prin sistemele de transducție celulară pot elimina produșii de transfer sau pot neutraliza expresia transgenei. În același timp, studiile au demonstrat dependența puterii răspunsului imun de vârsta gestațională. Reacții imune semnificative la introducerea unui vector lentiviral în stadiile incipiente și mijlocii ale sarcinii nu au fost înregistrate, în timp ce s-a observat un răspuns umoral puternic împotriva antigenului capsidei cu introducerea unui vector adenoviral în stadii târzii.

Una dintre problemele extrem de importante ale terapiei genice fetale este riscul potențial care apare la transmiterea secvențelor ADN donatorului către făt. Deoarece integrarea vectorială în celulele germinale este probabil să fie aleatorie, teoretic ar putea avea consecințe catastrofale pentru făt. De fapt, un copil care primește material genetic donator in utero se naște mutant. Componenta etică a terapiei genice îngrijorează mințile oamenilor de știință și teologilor. Aceștia din urmă, de la nașterea celei mai faimoase oi din istoria științei, avertizează asupra pericolelor pe care amestecul în planul lui Dumnezeu le aduce omenirii.

O alta aspect important este cauzată de probabilitatea mutagenezei în celulele fetale, ducând la un defect al oricărei gene funcționale, care în cele din urmă poate deveni cauza unei boli genetice acum noi, dobândite sau tumoare maligna. Această posibilitate pare chiar mai probabilă având în vedere dovezile dintr-un studiu la șoarece în care expresia genelor în embrionii de șoarece a declanșat dezvoltarea tumorilor hepatice.

În acest context, rezultatele a două studii care demonstrează dezvoltarea unor efecte secundare grave după terapia genică de succes pentru imunodeficiența combinată legată de X pot fi departe de a fi coincidente: în primul caz, a fost înregistrată manifestarea unei boli limfoproliferative monoclonale, iar în în al doilea rând, proliferarea celulelor T alfa/beta. Atât în ​​primul cât și în al doilea caz, vectorul retroviral a fost integrat în imediata apropiere a genei LMO2în proliferarea celulelor T.

Teoretic terapia genică ex vivo poate fi mai sigur decât in vivo injectarea fetală a vectorului. Deși acest lucru nu exclude posibilitatea mutagenezei în celulele care sunt transduse retroviral in vitro, introducerea mutagenului poate fi mai ușor detectată și controlată. Cu toate acestea, din păcate, aceste complicații nu pot fi excluse complet.

În cele din urmă, terapia genică fetală crește susceptibilitatea celulelor fetale la transducție. Transducția retrovirală la nivel scăzut în progenitorii celulelor germinale a fost observată în gonadele masculine și feminine după injectarea intraperitoneală a vectorului în embrionii de oaie și, respectiv, de maimuță. Analiza factorilor care conduc la transducția neintenționată a arătat că susceptibilitatea țesutului fetal la aceasta depinde de vârsta gestațională, cu rate mai mari de transducție la începutul sarcinii.

Din punct de vedere al riscurilor potențiale, este evident că terapia genică fetală poate fi o metodă rezonabilă de tratare doar a bolilor genetice severe pentru care nu există alte opțiuni de corectare. Iar printre acestea, desigur, se numără boala Gaucher, posibilitatea terapiei genice intrauterine pentru care a fost demonstrată într-un studiu publicat destul de recent.

Primul care merge: boala Gaucher

În iulie 2018, revista Medicina Naturii a publicat rezultatele unui studiu pe șoareci condus de Simon Waddington ( Simon Waddington) de la Institutul din Londra sanatatea femeilor. Rezultatele lucrării au demonstrat eficacitatea terapiei genice fetale în tratamentul bolilor neurodegenerative și, în special, a bolii Gaucher. Aceasta este cea mai comună formă printre enzimopatiile ereditare rare, care se bazează pe o deficiență a activității enzimelor lizozomale. glucozecerebrozidaza(Fig. 3), cauzate de mutații ale genei glucozilceramidaza. În funcție de natura mutațiilor, se poate dezvolta o formă neuropatică severă a bolii, care se manifestă încă din copilărie, sau o formă cu debut mai gradual și simptome mai puțin severe. În timp ce formele mai ușoare ale bolii Gaucher răspund bine la terapia de substituție, forma severă rămâne fatală. Semnele formei incurabile de boala Gaucher apar in primele luni de viata si includ hipotonia musculara progresiva, intarzierea si regresia dezvoltarii psihomotorii si alte semne neurologice.

Într-un studiu, Waddington și colab. au demonstrat că injectarea intracraniană a vectorului viral 9 adeno-asociat (AAV9) la șoarecii embrionari în ziua 16 de gestație a dus la o expresie crescută a glucozecerebrozidazei, care a inversat neurodegenerarea. În același timp, activitatea enzimelor din creier a fost comparabilă cu cea a șoarecilor sănătoși. În ciuda faptului că rozătoarele bolnave erau încă diagnosticate proces inflamatorîn creier, s-au dezvoltat semnificativ mai bine decât șoarecii din grupul de control, care au trebuit să fie eutanasiați la două săptămâni după tratament din cauza severității bolii.

Șoarecii tratați cu terapie genetică fetală au trăit cel puțin 18 săptămâni, au fost fertili și mobili. În mod interesant, administrarea postnatală a vectorului a atenuat, de asemenea, boala, dar a fost mai puțin eficientă decât expresia prenatală.

Deoarece AAV9 a putut să intre în creier din sânge, echipa lui Waddington a efectuat un alt experiment în care au injectat o doză semnificativ mai mare de vector nu în creier, ci direct în sângele fetușilor de șoarece. După exprimare, șoarecii nu se distingeau de șoarecii sănătoși, dar pentru că au trăit doar 55 de zile, oamenii de știință nu au putut trage concluzii despre eficacitatea pe termen lung a terapiei genice intravenoase.

Experimentul lui Waddington a fost cea mai complexă lucrare de până acum în care terapia genică fetală a fost efectuată la animale. Astăzi, echipa lucrează cu corporația Apollo Therapeutics, care a reunit eforturile a trei universități britanice și a trei mari companii farmaceutice. Waddington și colegii săi urmăresc un nou obiectiv: de data aceasta au sarcina de a obține date preclinice și, eventual, de a testa tratamentul la om. Și în timp ce scepticii se gândesc la gama de posibilități de utilizare a terapiei genice fetale la om, care poate fi redusă semnificativ de faptul că boala Gaucher nu este inclusă în testele prenatale, echipa lui Waddington se îndreaptă cu încredere în viitor. Un viitor în care copiii cu boala Gaucher, distrofie musculară Duchenne, SMA și multe altele rare, dar astăzi, din păcate, bolile incurabile se pot recupera.

Literatură

1. 12 metode în imagini: inginerie genetică. Partea II: Instrumente și tehnici;
Răspunsurile imune la vectorii terapiei genice: influența asupra funcției vectorului și a mecanismelor efectoare. Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Răspunsul imun la distrofina de lungime completă furnizată mușchiului Dmd de către un vector adenoviral de mare capacitate. Terapia Moleculară. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). Terapia genică in utero și editarea genomului. Curr Stem Cell Rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Cele mai bune practici și cercetare în obstetrică și ginecologie clinică. 22 , 203-218;
5. Rezumat din partea terapiei genice. Noua strategie de neutralizare a hemofiliei;
6. Charles Coutell. (2008). De ce să te deranjezi?: Merită efortul terapiei genetice in utero? . Terapia Moleculară. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al.. (2005). Oncogeneza după livrarea unui vector de terapie genică lentivirală nonprimată la șoareci fetali și neonatali. Terapia Moleculară. 12 , 763-771;
8. Comunicat de presă al Societății Europene de Terapie Genetică (ESGT), Bernd Gansbacher. (2003). Raportarea unui al doilea eveniment advers grav într-un studiu clinic de terapie genică pentru deficiența imună combinată severă legată de X (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al.. (2018). Terapia genică fetală pentru bolile neurodegenerative ale sugarilor. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Introducere

În fiecare an din ce în ce mai multe articole despre medical studii clinice, în care, într-un fel sau altul, s-a folosit tratamentul bazat pe introducerea diverselor gene – terapia genică. Această direcție a apărut din ramuri atât de bine dezvoltate ale biologiei, cum ar fi genetica moleculară și biotehnologia.

Adesea, atunci când metodele convenționale (conservatoare) au fost deja încercate, terapia genică este cea care poate ajuta pacienții să supraviețuiască și chiar să se recupereze complet. De exemplu, acest lucru se aplică bolilor monogenice ereditare, adică celor care sunt cauzate de un defect la o singură genă, precum și multe altele. Sau, de exemplu, terapia genică poate ajuta și salva un membru pentru acei pacienți care au îngustat lumenul vaselor de sânge în membrele inferioareși, ca urmare, s-a dezvoltat ischemia persistentă a țesuturilor înconjurătoare, adică aceste țesuturi se confruntă cu o lipsă severă de nutrienți și oxigen, care sunt în mod normal transportate de sânge în tot organismul. Manipulari chirurgicaleși este adesea imposibil să se trateze astfel de pacienți cu medicamente, dar dacă celulele sunt forțate local să elibereze mai mulți factori proteici care ar afecta procesul de formare și germinare a noilor vase, atunci ischemia ar deveni mult mai puțin pronunțată și viața ar deveni mult mai ușoară. pentru pacienti.

Terapia genică astăzi poate fi definit ca tratamentul bolilor prin introducerea de gene în celulele pacienților pentru a modifica în mod specific defectele genelor sau pentru a da celulelor noi funcții. Primele teste clinice ale metodelor de terapie genetică au fost întreprinse destul de recent - la 22 mai 1989, în scopul diagnosticării cancerului. Prima boală ereditară pentru care s-au aplicat metode de terapie genică a fost imunodeficiența ereditară.

În fiecare an, numărul de studii clinice efectuate cu succes pentru tratamentul diferitelor boli folosind terapia genică crește, iar până în ianuarie 2014 a ajuns la 2 mii.

În același timp, în cercetările moderne privind terapia genică este necesar să se țină cont de faptul că consecințele manipulării genelor sau ale ADN-ului „amestecat” (recombinant) in vivo(Latina literalmente „în cei vii”) nu au fost studiate suficient. În țările cu cel mai avansat nivel de cercetare în acest domeniu, în special în Statele Unite, protocoalele medicale care utilizează secvențe ADN sens sunt supuse revizuirii obligatorii de către comitetele și comisiile relevante. În SUA, acestea sunt Comitetul consultativ pentru ADN recombinant (RAC) și Food and Drug Administration (FDA), cu aprobarea ulterioară obligatorie a proiectului de către director. Institutele Nationale sănătate (Institutele Naționale de Sănătate).

Deci, noi am decis asta acest tratament se bazează pe faptul că, dacă unor țesuturi ale corpului le lipsesc anumiți factori proteici individuali, atunci acest lucru poate fi corectat prin introducerea genelor corespunzătoare care codifică proteine ​​în aceste țesuturi și totul va deveni mai mult sau mai puțin minunat. Nu va fi posibilă introducerea în sine a proteinelor, deoarece organismul nostru va reacționa imediat cu o reacție imunitară puternică, iar durata de acțiune ar fi insuficientă. Acum trebuie să decideți asupra metodei de livrare a genei în celule.

Transfecția celule

În primul rând, merită să introduceți definițiile unor termeni.

Transportul genelor se realizează datorită vector este o moleculă de ADN folosită ca " vehicul„pentru transferul artificial de informații genetice într-o celulă. Există multe tipuri de vectori: plasmidi, virali, precum și cosmide, fasmide, cromozomi artificiali etc. Este esențial important ca vectorii (în special cei plasmidici) să aibă proprietăți caracteristice lor:

1. Originea replicării (ori)- secvența de nucleotide de la care începe duplicarea ADN-ului. Dacă ADN-ul vector nu se poate dubla (se poate replica), atunci efectul terapeutic necesar nu va fi atins, deoarece pur și simplu va fi descompus rapid de enzimele nucleaze intracelulare și, din cauza lipsei șabloanelor, se vor forma în cele din urmă mult mai puține molecule de proteine. Trebuie menționat că aceste puncte sunt specifice fiecărei specii biologice, adică dacă ADN-ul vector se presupune a fi obținut prin propagarea lui într-o cultură bacteriană (și nu doar prin sinteză chimică, care este de obicei mult mai costisitoare), atunci două vor fi necesare origini separate de replicare - pentru oameni și pentru bacterii;

2. Site-uri de restricții- secvențe scurte specifice (de obicei palindromice), care sunt recunoscute de enzime speciale (endonucleaze de restricție) și tăiate de acestea într-un anumit mod - cu formarea de „capete lipicioase” (Fig. 1).

Fig.1 Formarea „capetelor lipicioase” cu participarea enzimelor de restricție

Aceste situsuri sunt necesare pentru a lega vectorul ADN (care, în esență, este un „martor”) cu genele terapeutice dorite într-o singură moleculă. O astfel de moleculă reticulată din două sau mai multe părți este numită „recombinantă”;

3. Este clar că am dori să obținem milioane de copii ale unei molecule de ADN recombinat. Din nou, dacă avem de-a face cu o cultură de celule bacteriene, atunci acest ADN trebuie izolat. Problema este că nu toate bacteriile vor ingera molecula de care avem nevoie; unele nu vor face acest lucru. Pentru a distinge aceste două grupuri, ele inserează markeri selectivi- zone de rezistenţă la anumite chimicale; Acum, dacă adăugați aceste substanțe în mediu, atunci doar cele care sunt rezistente la ele vor supraviețui, iar restul vor muri.

Toate aceste trei componente pot fi observate în prima plasmidă sintetizată artificial (Fig. 2).

Fig.2

Procesul de introducere a unui vector plasmid în anumite celule se numește transfecție. O plasmidă este o moleculă de ADN destul de scurtă și de obicei circulară care se găsește în citoplasma unei celule bacteriene. Plasmidele nu sunt asociate cu cromozomul bacterian, ele se pot replica independent de acesta și pot fi eliberate de bacterie în mediu inconjurator sau, dimpotrivă, să fie absorbită (procesul de absorbție este transformare). Cu ajutorul plasmidelor, bacteriile pot face schimb de informații genetice, de exemplu, transmitând rezistența la anumite antibiotice.

Plasmidele există în bacterii conditii naturale. Dar nimeni nu poate împiedica un cercetător să sintetizeze artificial o plasmidă care va avea proprietățile de care are nevoie, să introducă o inserție de genă în ea și să o introducă într-o celulă. În aceeași plasmidă pot fi introduse diferite inserții .

Metode de terapie genică

Există două abordări principale, care diferă prin natura celulelor țintă:

1. Fetal, în care ADN-ul străin este introdus în zigot (oul fecundat) sau embrion într-un stadiu incipient de dezvoltare; în acest caz, este de așteptat ca materialul introdus să intre în toate celulele primitorului (și chiar în celulele germinale, asigurând astfel transmiterea către generația următoare). La noi este de fapt interzis;

2. Somatic, în care materialul genetic este introdus în celulele nereproductive ale unei persoane deja născute și nu este transmis la celulele germinale.

Terapia genică in vivo se bazează pe introducerea directă a secvențelor de ADN clonate (multiplicate) și împachetate într-un anumit mod în anumite țesuturi ale pacientului. Deosebit de promițătoare pentru tratamentul bolilor genetice in vivo este introducerea de gene folosind aerosoli sau vaccinuri injectate. Terapia genică cu aerosoli este dezvoltată, de regulă, pentru tratamentul bolilor pulmonare (fibroză chistică, cancer pulmonar).

Există mulți pași implicați în dezvoltarea unui program de terapie genică. Aceasta include o analiză amănunțită a expresiei specifice țesutului a genei corespunzătoare (adică sinteza pe matricea unei gene a unei proteine ​​într-un anumit țesut) și identificarea unui defect biochimic primar și un studiu al structurii, funcției. și distribuția intracelulară a produsului său proteic, precum și o analiză biochimică a procesului patologic. Toate aceste date sunt luate în considerare la întocmirea protocolului medical corespunzător.

Este important ca la elaborarea schemelor de corecție a genelor să se evalueze eficiența transfecției și gradul de corectare a defectului biochimic primar în condiții de cultură celulară ( in vitro,„in vitro”) și, cel mai important, in vivo pe modele biologice animale. Abia după aceasta poate începe programul de studii clinice .

Livrarea directă și purtătorii celulari ai genelor terapeutice

Există multe metode de introducere a ADN-ului străin într-o celulă eucariotă: unele depind de procesarea fizică (electroporare, magnetofecție etc.), altele depind de aplicare. materiale chimice sau particule biologice (de exemplu, viruși) care sunt utilizate ca vectori. Merită menționat imediat că substanța chimică și metode fizice(de exemplu, electroporare + ADN învelit cu lipozomi)

Metode directe

1. Transfecția pe bază de substanțe chimice poate fi clasificată în mai multe tipuri: folosind o substanță ciclodextrină, polimeri, lipozomi sau nanoparticule (cu sau fără funcționalizare chimică sau virală, adică modificarea suprafeței).
a) Una dintre cele mai ieftine metode este utilizarea fosfatului de calciu. Mărește eficiența încorporării ADN-ului în celule de 10-100 de ori. ADN-ul formează un complex puternic cu calciul, care asigură absorbția eficientă a acestuia. Dezavantaj - doar aproximativ 1 - 10% din ADN ajunge la nucleu. Metoda folosita in vitro pentru transferul ADN-ului în celule umane (Fig. 3);

Fig.3

b) Utilizarea moleculelor organice foarte ramificate - dendrimer, pentru a lega ADN-ul și a-l transfera în celulă (Fig. 4);

Fig.4

c) Foarte metoda eficienta Pentru a transfecta ADN-ul, acesta este introdus prin lipozomi - corpuri mici, înconjurate de membrană, care pot fuziona cu membrana citoplasmatică celulară (CPM), care este un strat dublu de lipide. Pentru celulele eucariote, transfecția este mai eficientă folosind lipozomi cationici, deoarece celulele sunt mai sensibile la aceștia. Procesul are propriul nume - lipofecție. Această metodă este considerată una dintre cele mai sigure astăzi. Lipozomii sunt non-toxici și non-imunogene. Cu toate acestea, eficiența transferului de gene folosind lipozomi este limitată, deoarece ADN-ul pe care îl introduc în celule este de obicei capturat imediat de lizozomi și distrus. Introducerea ADN-ului în celulele umane folosind lipozomi este pilonul terapiei de astăzi. in vivo(Fig. 5);

Fig.5

d) O altă metodă este utilizarea polimerilor cationici precum dietilaminoetil dextran sau polietilenimina. Moleculele de ADN încărcate negativ se leagă de policationi încărcați pozitiv, iar acest complex intră în continuare în celulă prin endocitoză. Modificări ale DEAE-dextran proprietăți fizice membrană plasmaticăși stimulează absorbția acestui complex de către celulă. Principalul dezavantaj al metodei este că DEAE-dextran în concentratii mari toxic. Metoda nu a devenit larg răspândită în terapia genică;

e) Cu ajutorul histonelor şi a altor proteine ​​nucleare. Aceste proteine, care conțin mulți aminoacizi încărcați pozitiv (Lys, Arg), în condiții naturale ajută la împachetarea compactă a unui lanț lung de ADN într-un nucleu celular relativ mic.

2. Metode fizice:

a) Electroporarea este o metodă foarte populară; O creștere imediată a permeabilității membranei este obținută prin supunerea celulelor la expuneri scurte la un câmp electric intens. S-a demonstrat că în condiții optime numărul de transformanți poate ajunge la 80% din celulele supraviețuitoare. În prezent, nu este utilizat la om (Fig. 6).

Fig.6

b) „Strângerea celulelor” este o metodă inventată în 2013. Vă permite să livrați molecule în celule „strângând ușor” membrana celulară. Metoda elimină posibilitatea de toxicitate sau de direcționare greșită, deoarece nu se bazează pe materiale externe sau câmpuri electrice;

c) Sonoporarea este o metodă de transfer artificial de ADN străin în celule prin expunerea acestora la ultrasunete, determinând deschiderea porilor în membrana celulară;
d) Transfecția optică - metodă prin care se face o gaură minusculă în membrană (aproximativ 1 μm în diametru) folosind un laser foarte focalizat;
e) Transfecția hidrodinamică - o metodă de eliberare a constructelor genetice, proteinelor etc. printr-o creștere controlată a presiunii în capilare și lichidul intercelular, ceea ce determină o creștere pe termen scurt a permeabilității membranele celulareși formarea de pori temporari în ele. Se efectuează prin injectare rapidă în țesut, iar livrarea este nespecifică. Eficiența de livrare pentru mușchiul scheletic - de la 22 la 60% ;

f) Microinjecție de ADN - introducere în nucleul unei celule animale folosind microtubuli subțiri de sticlă (d=0,1-0,5 µm). Dezavantajul este complexitatea metodei, există o probabilitate mare de distrugere a nucleului sau ADN-ului; un număr limitat de celule poate fi transformat. Nu pentru uz uman.

3. Metode bazate pe particule.

a) O abordare directă a transfecției este un pistol genic, în care ADN-ul este concatenat într-o nanoparticulă cu solide inerte (de obicei aur, wolfram), care este apoi „împușcat” direcționat în nucleele celulelor țintă. Se aplică această metodă in vitroȘi in vivo pentru introducerea de gene, în special, în celulele țesutului muscular, de exemplu, într-o boală precum distrofia musculară Duchenne. Dimensiunea particulelor de aur este de 1-3 microni (Fig. 7).

Fig.7

b) Magnetoinfectia este o metoda care foloseste fortele magnetismului pentru a furniza ADN celulelor tinta. În primul rând, acizii nucleici (NA) sunt asociați cu nanoparticule magnetice, iar apoi, sub influența unui câmp magnetic, particulele sunt conduse în celulă. Eficacitatea este de aproape 100%, se remarcă o nontoxicitate evidentă. În 10-15 minute, particulele sunt înregistrate în celulă - acest lucru este mult mai rapid decât alte metode.
c) Impalefecție; „împalement”, lit. „impalment” + „infectie”) - o metodă de livrare care utilizează nanomateriale precum nanotuburi de carbon și nanofibre. În acest caz, celulele sunt literalmente perforate de un strat de nanofibrile. Prefixul „nano” este folosit pentru a desemna dimensiunile lor foarte mici (în limita a miliardelor de metru) (Fig. 8).

Fig.8

Separat, merită evidențiată o astfel de metodă precum transfecția ARN: nu ADN-ul este livrat în celulă, ci moleculele de ARN - „succesorii” lor în lanțul de biosinteză a proteinelor; în acest caz, sunt activate proteine ​​speciale care taie ARN-ul în fragmente scurte - așa-numitele. ARN interferent mic (ARNsi). Aceste fragmente se leagă de alte proteine ​​și, în cele din urmă, acest lucru duce la inhibarea expresiei celulei a genelor corespunzătoare. În acest fel, este posibil să blocăm acțiunea acelor gene din celulă care pot face mai mult rău decât bine în acest moment. Transfecția ARN și-a găsit o aplicație largă, în special, în oncologie.

Sunt trecute în revistă principiile de bază ale eliberării genelor folosind vectori plasmidici. Acum putem trece la luarea în considerare a metodelor virale. Virușii sunt forme de viață necelulare, cel mai adesea constând dintr-o moleculă de acid nucleic (ADN sau ARN) învelită într-o înveliș proteic. Dacă tăiați din materialul genetic al virusului toate acele secvențe care provoacă boli, atunci întregul virus poate fi, de asemenea, transformat cu succes într-un „vehicul” pentru gena noastră.

Procesul de introducere a ADN-ului într-o celulă, mediat de un virus, se numește transducție.
În practică, cele mai frecvent utilizate sunt retrovirusurile, adenovirusurile și virusurile adeno-asociate (AAV). În primul rând, merită să ne dăm seama care ar trebui să fie candidatul ideal pentru transducția printre viruși. Criteriile sunt că trebuie să fie:

Grajd;
. încăpător, adică pentru a găzdui o cantitate suficientă de ADN;
. inertă în raport cu căile metabolice ale celulei;
. precis - în mod ideal, ar trebui să-și integreze genomul într-un loc specific al genomului nucleului gazdă etc.

În viața reală, este foarte dificil să combinați cel puțin mai multe puncte, așa că de obicei alegerea se face atunci când luăm în considerare fiecare caz individual separat (Fig. 9).

Fig.9

Dintre toți cei trei viruși enumerați cei mai folosiți, cei mai siguri și, în același timp, cei mai precisi sunt AAV. Aproape singurul lor dezavantaj este capacitatea lor relativ mică (aproximativ 4800 bp), care, totuși, se dovedește a fi suficientă pentru multe gene. .

Pe lângă metodele enumerate, terapia genică este adesea folosită în combinație cu terapia celulară: în primul rând, o cultură a anumitor celule umane este plantată într-un mediu nutritiv, după care genele necesare sunt introduse în celule într-un fel sau altul, cultivate. de ceva timp și din nou transplantat în corpul gazdei. Ca rezultat, celulele pot fi restabilite la proprietățile lor normale. Deci, de exemplu, globulele albe umane (leucocitele) au fost modificate pentru leucemie (Fig. 10).

Fig.10

Soarta genei după ce intră în celulă

Deoarece totul este mai mult sau mai puțin clar cu vectorii virali datorită capacității lor de a livra gene mai eficient la scopul final - nucleul, ne vom opri asupra soartei vectorului plasmidic.

În această etapă, am reușit că ADN-ul a trecut de prima barieră mare - membrana citoplasmatică a celulei.

Apoi, în combinație cu alte substanțe, învelite sau nu, trebuie să ajungă la nucleul celulei, astfel încât o enzimă specială - ARN polimeraza - să sintetizeze o moleculă de ARN mesager (ARNm) pe o matrice de ADN (acest proces se numește transcriere). Abia după aceasta ARNm va fi eliberat în citoplasmă, formează un complex cu ribozomi și, conform cod genetic se sintetizează o polipeptidă - de exemplu, factorul de creștere vasculară (VEGF), care va începe să îndeplinească o anumită funcție terapeutică (în acest caz, va începe procesul de formare a ramificării vaselor în țesutul susceptibil la ischemie).

În ceea ce privește exprimarea genelor introduse în tipul de celulă necesar, această problemă este rezolvată cu ajutorul elementelor de reglare a transcripției. Țesutul în care are loc expresia este adesea determinat de combinația unui amplificator specific țesuturilor (secvență de „întărire”) cu un promotor specific (o secvență de nucleotide din care ARN polimeraza începe sinteza), care poate fi inductibil. . Se știe că activitatea genelor poate fi modulată in vivo semnale externe și, deoarece amplificatorii pot lucra cu orice genă, izolatorii pot fi introduși în vectori, care ajută amplificatorul să funcționeze indiferent de poziția sa și pot acționa ca bariere funcționale între gene. Fiecare amplificator conține un set de situsuri de legare pentru activarea sau supresia factorilor proteici. Promotorii pot fi, de asemenea, utilizați pentru a regla nivelul de expresie a genelor. De exemplu, există metalotioneină sau promotori sensibili la temperatură; promotori controlați de hormoni.

Exprimarea unei gene depinde de poziția sa în genom. În cele mai multe cazuri, metodele virale existente au ca rezultat doar inserarea aleatorie a unei gene în genom. Pentru a elimina o astfel de dependență, la construirea vectorilor, gena este furnizată cu secvențe de nucleotide cunoscute, care permit exprimarea genei indiferent de locul în care este inserată în genom.

Cel mai simplu mod de a regla expresia transgenei este de a-i oferi un promotor indicator care este sensibil la un semnal fiziologic, cum ar fi eliberarea de glucoză sau hipoxia. Astfel de sisteme de control „endogen” pot fi utile în unele situații, cum ar fi controlul dependent de glucoză al producției de insulină. Sistemele de control „exogene” sunt mai fiabile și universale, atunci când expresia genelor este controlată farmacologic prin introducerea unei molecule mici de medicament. În prezent, sunt cunoscute 4 sisteme principale de control - reglementate de tetraciclină (Tet), steroidul de insecte, ecdysone sau analogii săi, medicamentul antiprogestin mayfpristone (RU486) și dimerizatorii chimici precum rapamicina și analogii săi. Toate includ atracția dependentă de medicament a domeniului de activare a transcripției către promotorul principal care conduce gena dorită, dar diferă în mecanismele acestei atracție. .

Concluzie

O trecere în revistă a datelor ne permite să ajungem la concluzia că, în ciuda eforturilor multor laboratoare din întreaga lume, totul este deja cunoscut și testat. in vivoȘi in vitro sistemele vectoriale sunt departe de a fi perfecte . Dacă există o problemă cu livrarea ADN-ului străin in vitro practic rezolvată și livrarea acestuia către celulele țintă din diferite țesuturi in vivo rezolvate cu succes (în principal prin crearea de constructe care poartă proteine ​​receptorului, inclusiv antigene specifice anumitor țesuturi), apoi alte caracteristici ale sistemelor vectoriale existente - stabilitatea integrării, expresia reglată, siguranță - necesită încă îmbunătățiri serioase.

În primul rând, aceasta se referă la stabilitatea integrării. Până acum, integrarea în genom a fost realizată doar folosind vectori retrovirali sau adeno-asociați. Eficiența integrării stabile poate fi crescută prin îmbunătățirea construcțiilor de gene, cum ar fi sistemele mediate de receptor sau prin crearea de vectori epizomali suficient de stabili (adică structuri ADN capabile de rezidență pe termen lung în interiorul nucleelor). Recent, s-a acordat o atenție deosebită creării de vectori pe baza cromozomilor artificiali de mamifere. Datorită prezenței elementelor structurale de bază ale cromozomilor obișnuiți, astfel de mini-cromozomi sunt reținuți în celule pentru o lungă perioadă de timp și sunt capabili să transporte gene (genomice) de dimensiune completă și elementele lor de reglare naturale, care sunt necesare pentru funcționarea corectă. a genei, în țesutul potrivit și la momentul potrivit.

Terapia genică și celulară deschide perspective strălucitoare pentru restaurarea celulelor și țesuturilor pierdute și pentru proiectarea ingineriei genetice a organelor, ceea ce, fără îndoială, va extinde semnificativ arsenalul de metode pentru cercetarea biomedicală și va crea noi oportunități pentru conservarea și extinderea vieții umane.

Sănătate

Conceptul de înlocuire a genelor defecte cu gene sănătoase, care a început să dobândească în mod activ un înveliș științific încă de la începutul anilor nouăzeci ai secolului trecut, se părea, ar da speranță celor mai deznădăjduiți pacienți. Cu toate acestea, de la primul experiment de terapie genetică, realizat în 1990, optimismul în rândul oamenilor de știință s-a oarecum diminuat - și totul datorită anumitor eșecuri și dificultăți în implementarea metodelor de terapie genetică. Cu toate acestea, oportunitățile pe care terapia genică le oferă pentru tratamentul bolii Parkinson fibroză chistică, tipuri variate cancerul și multe alte boli sunt cu adevărat nelimitate. Acesta este motivul pentru care oamenii de știință lucrează neobosit, încercând să depășească toate dificultățile asociate cu terapia genică care apar pe parcurs.

Ce este terapia genică?

Deci, ce este de fapt terapia genică? Pentru a răspunde această întrebare, este necesar să reamintim că Funcția principală a genelor din corpul nostru este de a regla producția de proteine, necesar pentru funcționarea normală și sănătatea tuturor celulelor. Dar unele defecte genetice (defecte ale genelor) le împiedică să fie efectuate functie principala, într-o măsură sau alta împiedicând producerea de proteine. Scopul terapiei genice (terapia genică) este înlocuirea genelor defecte cu gene sănătoase. Acest lucru va ajuta la stabilirea reproducerii proteinei corespunzătoare, ceea ce înseamnă că persoana va fi vindecată de o anumită boală.

Dacă luăm în considerare scenariul ideal de dezvoltare, celulele cu molecule de acid dezoxiribonucleic (ADN) corectate va începe să se dividă, producând, la rândul lor, mai multe copii ale genei corectate, ceea ce va permite organismului să scape de anomalia genetică și să se vindece complet. Cu toate acestea, introducerea genelor sănătoase în celulele bolnave (precum și încercarea de a corecta anomaliile corespunzătoare) este un proces extrem de complex, care până acum a condus rar la succes. De aceea majoritatea cercetarea modernăîși propune să dezvolte mecanisme sigure și fiabile pentru introducerea genelor în celulele deteriorate.

Tipuri de terapie genică: terapie ex vivo și in vivo

Terapia genică, în funcție de metoda de introducere a ADN-ului în genomul pacientului, poate fi efectuată fie în cultură celulară (ex vivo), fie direct în organism (in vivo). Cu terapia genică ex vivo, celulele sunt îndepărtate din corpul pacientului, modificate genetic și apoi reintroduse în corpul individului. Această metodă este utilă în special în tratamentul bolilor de sânge, deoarece celulele sanguine pot fi îndepărtate și reintroduse destul de ușor. Cu toate acestea, în cazul majorității celorlalte boli, îndepărtarea celulelor din organism și introducerea lor înapoi nu este atât de simplă. De exemplu, în cazul bolilor cardiace cauzate de cauze genetice, o măsură eficientă este așa-numita terapie genică in vivo, atunci când modificările genelor sunt efectuate direct în corpul pacientului. Pentru a face această procedură, informațiile genetice sunt livrate direct în celulă printr-un vector - o moleculă de acid nucleic, utilizate în inginerie genetică pentru a transfera material genetic. În cele mai multe cazuri, pentru a realiza această transmitere, cercetătorii folosesc viruși care nu sunt periculoși pentru sănătate și viață.

Metode pentru furnizarea de informații genetice într-o celulă

După cum arată numeroase studii, utilizarea diverșilor viruși este o soluție foarte eficientă, care vă permite să treceți prin apărarea imunitară a organismuluiși apoi infectați celulele, folosindu-le pentru a răspândi virusul. Pentru a efectua această procedură, inginerii genetici au selectat cei mai potriviti virusuri din grupul de retrovirusuri și adenovirusuri. Retrovirusurile introduc informații genetice sub formă de acid ribonucleic (ARN), o moleculă similară cu ADN-ul care ajută la procesarea informațiilor genetice stocate în ADN. De îndată ce este posibil să pătrundă adânc în așa-numita celulă țintă, se obține o copie a moleculei de ADN din molecula de ARN. Acest proces se numește transcriere inversă. Odată ce o nouă moleculă de ADN este atașată la o celulă, toate copiile noi ale celulelor vor conține această genă modificată.

Adenovirusurile transportă informații genetice direct sub formă de ADN, care este livrat unei celule care nu se divide. Cu toate că acești virusuri furnizează ADN direct în nucleul celulei țintă, ADN-ul nu se potrivește cu genomul celulei. Astfel, gena modificată și informațiile genetice nu sunt transmise celulelor fiice. Avantajul terapiei genice efectuate folosind adenovirusuri este că este posibilă introducerea genelor în celulele sistemului nervos și în membrana mucoasă a tractului respirator, din nou, printr-un vector. În plus, există o a treia metodă de terapie genică, realizată prin așa-numitele virusuri adeno-asociate. Acești viruși conțin cantitate relativ mică de informații geneticeși sunt mult mai greu de eliminat decât retrovirusurile și adenovirusurile. Cu toate acestea, avantajul virusurilor adeno-asociate este că nu provoacă o reacție din partea sistemului imunitar uman.

Dificultăți în utilizarea virușilor în terapia genică

Principala problemă asociată cu metoda de livrare a informațiilor genetice într-o celulă prin viruși este aceea este extrem de dificil să controlezi complet conexiunea genelor cu o celulă țintă. Acest lucru poate fi extrem de periculos, deoarece așa-numita expresie a genelor, care se poate transforma celule sănătoaseîn cele canceroase. În acest moment, această problemă este presantă în special atunci când lucrați cu retrovirusuri. A doua problemă a cărei soluţie nu este încă posibil de organizat, este că o singură procedură de utilizare a terapiei genice este de cele mai multe ori insuficientă. Majoritatea terapiilor genetice trebuie repetate din când în când. Și în al treilea rând, utilizarea virușilor pentru a furniza informații genetice într-o celulă este complicată de riscul unei reacții din partea sistemului imunitar al organismului. Aceasta este, de asemenea, o problemă extrem de gravă, mai ales în cazurile în care când sunt necesare repetări multiple ale procedurii de terapie genică, pe măsură ce organismul pacientului se adaptează treptat și începe să lupte cu virusurile injectate din ce în ce mai eficient.

Terapia genică: cercetările continuă

Dacă vorbim despre succese, atunci în acest moment terapia genetică este o măsură extrem de eficientă în tratamentul așa-numitei imunodeficiențe combinate, legat de gena cromozomului X. Pe de altă parte, există foarte puține cazuri de utilizare cu succes a terapiei genice pentru a trata această boală. În plus, tratamentul în sine este riscant, deoarece poate determina pacienții să experimenteze o serie de simptome care sunt comune la persoanele care suferă de leucemie. În afară de această boală, există foarte, foarte puține cazuri de terapie genică care ar fi la fel de eficace, deși studiile recente dau speranță pentru utilizarea timpurie a terapiei genice pentru tratamentul pacienților care suferă de artrită, cancer cerebral, siclemie, despicătură a retinei și alte afecțiuni.

Se dovedește că despre aplicație practică Este încă foarte devreme să vorbim despre terapia genică în medicină. Cu toate acestea, Cercetătorii continuă să caute modalități de a utiliza terapia genică în siguranță și eficient, după cheltuire cel mai experimente în țesutul viu transferat din corp într-un mediu extern artificial. Printre aceste experimente, extrem de interesante sunt studiile în care oamenii de știință încearcă să introducă un cromozom artificial, al 47-lea, într-o celulă țintă. Cercetările științifice recente au permis oamenilor de știință să înțeleagă mai bine procesele care apar în timpul introducerii unei molecule de ARN. Acest lucru a permis dezvoltarea unui mecanism de suprimare a transcripției genelor (numit închidere a genelor), care poate fi benefic în tratamentul bolii Hamilton. Oamenii de știință raportează, de asemenea, că au reușit să dezvolte o modalitate de a furniza informații genetice în celulele creierului, ceea ce anterior nu putea fi făcut folosind un vector. întrucât această moleculă era prea mare pentru acest scop. Cu alte cuvinte, cercetările continuă, ceea ce înseamnă că omenirea are toate șansele să învețe cum să lupte împotriva bolilor prin utilizarea metodelor de terapie genetică.