Modificarea genetică a bolilor infecțioase. Terapia genică sau cum să introduceți ADN într-o celulă și să vindeci pacienții cu el. Principiul tratamentului genetic

Sănătate

Conceptul de înlocuire a genelor defecte cu gene sănătoase, care a început să dobândească în mod activ un înveliș științific încă de la începutul anilor nouăzeci ai secolului trecut, se părea, ar da speranță celor mai deznădăjduiți pacienți. Cu toate acestea, de la primul experiment de terapie genetică, realizat în 1990, optimismul în rândul oamenilor de știință s-a oarecum diminuat - și totul datorită anumitor eșecuri și dificultăți în implementarea metodelor de terapie genetică. Cu toate acestea, posibilitățile pe care terapia genică le oferă pentru tratamentul bolii Parkinson, fibrozei chistice, diferitelor tipuri de cancer și multe alte boli sunt cu adevărat nesfârșite. Acesta este motivul pentru care oamenii de știință lucrează neobosit, încercând să depășească toate dificultățile asociate cu terapia genică care apar pe parcurs.

Ce este terapia genică?

Deci, ce este de fapt terapia genică? Pentru a răspunde la această întrebare, este necesar să ne amintim că Funcția principală a genelor din corpul nostru este de a regla producția de proteine, necesar pentru funcționarea normală și sănătatea tuturor celulelor. Dar unele defecte genetice (defecte ale genelor) interferează cu funcția lor principală, împiedicând într-o măsură sau alta producția de proteine. Scopul terapiei genice (terapia genică) este înlocuirea genelor defecte cu gene sănătoase. Acest lucru va ajuta la stabilirea reproducerii proteinei corespunzătoare, ceea ce înseamnă că persoana va fi vindecată de o anumită boală.

Dacă luăm în considerare scenariul ideal de dezvoltare, celulele cu molecule de acid dezoxiribonucleic (ADN) corectate va începe să se dividă, producând, la rândul lor, mai multe copii ale genei corectate, ceea ce va permite organismului să scape de anomalia genetică și să se vindece complet. Cu toate acestea, introducerea genelor sănătoase în celulele bolnave (precum și încercarea de a corecta anomaliile corespunzătoare) este un proces extrem de complex, care până acum a condus rar la succes. De aceea, majoritatea cercetărilor moderne vizează dezvoltarea unor mecanisme sigure și fiabile pentru introducerea genelor în celulele deteriorate.

Tipuri de terapie genică: terapie ex vivo și in vivo

Terapia genică, în funcție de metoda de introducere a ADN-ului în genomul pacientului, poate fi efectuată fie în cultură celulară (ex vivo), fie direct în organism (in vivo). Cu terapia genică ex vivo, celulele sunt îndepărtate din corpul pacientului, modificate genetic și apoi reintroduse în corpul individului. Această metodă este utilă în special în tratamentul bolilor de sânge, deoarece celulele sanguine pot fi îndepărtate și reintroduse destul de ușor. Cu toate acestea, în cazul majorității celorlalte boli, îndepărtarea celulelor din organism și introducerea lor înapoi nu este atât de simplă. De exemplu, în cazul bolilor cardiace cauzate de cauze genetice, o măsură eficientă este așa-numita terapie genică in vivo, atunci când modificările genelor sunt efectuate direct în corpul pacientului. Pentru a efectua această procedură, informațiile genetice sunt livrate direct în celulă printr-un vector - o moleculă de acid nucleic, utilizate în inginerie genetică pentru a transfera material genetic. În cele mai multe cazuri, pentru a realiza această transmitere, cercetătorii folosesc viruși care nu sunt periculoși pentru sănătate și viață.

Metode pentru furnizarea de informații genetice într-o celulă

După cum arată numeroase studii, utilizarea diverșilor viruși este o soluție foarte eficientă, care vă permite să treceți prin apărarea imunitară a organismuluiși apoi infectați celulele, folosindu-le pentru a răspândi virusul. Pentru a efectua această procedură, inginerii genetici au selectat cei mai potriviti virusuri din grupul de retrovirusuri și adenovirusuri. Retrovirusurile introduc informații genetice sub formă de acid ribonucleic (ARN), o moleculă similară cu ADN-ul care ajută la procesarea informațiilor genetice stocate în ADN. De îndată ce este posibil să pătrundă adânc în așa-numita celulă țintă, se obține o copie a moleculei de ADN din molecula de ARN. Acest proces se numește transcriere inversă. Odată ce o nouă moleculă de ADN este atașată la o celulă, toate copiile noi ale celulelor vor conține această genă modificată.

Adenovirusurile transportă informații genetice direct sub formă de ADN, care este livrat unei celule care nu se divide. Cu toate că acești virusuri furnizează ADN direct în nucleul celulei țintă, ADN-ul nu se potrivește cu genomul celulei. Astfel, gena modificată și informațiile genetice nu sunt transmise celulelor fiice. Avantajul terapiei genice efectuate folosind adenovirusuri este că este posibilă introducerea genelor în celulele sistemului nervos și în membrana mucoasă a tractului respirator, din nou, printr-un vector. În plus, există o a treia metodă de terapie genică, realizată prin așa-numitele virusuri adeno-asociate. Acești viruși conțin cantitate relativ mică de informații geneticeși sunt mult mai greu de eliminat decât retrovirusurile și adenovirusurile. Cu toate acestea, avantajul virusurilor adeno-asociate este că nu provoacă o reacție din partea sistemului imunitar uman.

Dificultăți în utilizarea virușilor în terapia genică

Principala problemă asociată cu metoda de livrare a informațiilor genetice într-o celulă prin viruși este aceea este extrem de dificil să controlezi complet conexiunea genelor cu o celulă țintă. Acest lucru poate fi extrem de periculos, deoarece așa-numita expresie a genelor, care poate transforma celulele sănătoase în celule canceroase, nu poate fi exclusă. În acest moment, această problemă este presantă în special atunci când lucrați cu retrovirusuri. A doua problemă a cărei soluţie nu este încă posibil de organizat, este că o singură procedură de utilizare a terapiei genice este de cele mai multe ori insuficientă. Majoritatea terapiilor genetice trebuie repetate din când în când. Și în al treilea rând, utilizarea virușilor pentru a furniza informații genetice într-o celulă este complicată de riscul unei reacții din partea sistemului imunitar al organismului. Aceasta este, de asemenea, o problemă extrem de gravă, mai ales în cazurile în care când sunt necesare repetări multiple ale procedurii de terapie genică, pe măsură ce organismul pacientului se adaptează treptat și începe să lupte cu virusurile injectate din ce în ce mai eficient.

Terapia genică: cercetările continuă

Dacă vorbim despre succese, atunci în acest moment terapia genetică este o măsură extrem de eficientă în tratamentul așa-numitei imunodeficiențe combinate, legat de gena cromozomului X. Pe de altă parte, există foarte puține cazuri de utilizare cu succes a terapiei genice pentru a trata această boală. În plus, tratamentul în sine este riscant, deoarece poate determina pacienții să experimenteze o serie de simptome care sunt comune la persoanele care suferă de leucemie. În afară de această boală, există foarte, foarte puține cazuri de terapie genică care ar fi la fel de eficace, deși studiile recente dau speranță pentru utilizarea timpurie a terapiei genice pentru tratamentul pacienților care suferă de artrită, cancer cerebral, siclemie, despicătură a retinei și alte afecțiuni.

Se pare că este încă foarte devreme să vorbim despre aplicarea practică a terapiei genice în medicină. Cu toate acestea, Cercetătorii continuă să caute modalități de a utiliza terapia genică în siguranță și eficient, după ce a efectuat majoritatea experimentelor în țesutul viu transferat din corp într-un mediu extern artificial. Printre aceste experimente, extrem de interesante sunt studiile în care oamenii de știință încearcă să introducă un cromozom artificial, al 47-lea, într-o celulă țintă. Cercetările științifice recente au permis oamenilor de știință să înțeleagă mai bine procesele care apar în timpul introducerii unei molecule de ARN. Acest lucru a permis dezvoltarea unui mecanism de suprimare a transcripției genelor (numit închidere a genelor), care poate fi benefic în tratamentul bolii Hamilton. Oamenii de știință raportează, de asemenea, că au reușit să dezvolte o modalitate de a furniza informații genetice în celulele creierului, ceea ce anterior nu putea fi făcut folosind un vector. întrucât această moleculă era prea mare pentru acest scop. Cu alte cuvinte, cercetările continuă, ceea ce înseamnă că omenirea are toate șansele să învețe cum să lupte împotriva bolilor prin utilizarea metodelor de terapie genetică.

Terapia genică este una dintre domeniile în dezvoltare rapidă ale medicinei, care implică tratarea unei persoane prin introducerea de gene sănătoase în organism. În plus, conform oamenilor de știință, cu ajutorul terapiei genice este posibil să adăugați o genă lipsă, să o corectați sau să o înlocuiți, îmbunătățind astfel funcționarea organismului la nivel celular și normalizând starea pacientului.

Potrivit oamenilor de știință, 200 de milioane de oameni de pe planetă sunt în prezent potențiali candidați pentru terapia genică, iar această cifră este în continuă creștere. Și este foarte îmbucurător faptul că câteva mii de pacienți au primit deja tratament pentru boli incurabile, ca parte a studiilor în curs.

În acest articol vom vorbi despre ce sarcini își stabilește terapia genică, ce boli pot fi tratate cu această metodă și ce probleme trebuie să se confrunte oamenii de știință.

Unde se folosește terapia genică?

Terapia genică a fost concepută inițial pentru a combate boli moștenite severe, cum ar fi boala Huntington, fibroza chistică și anumite boli infecțioase. Cu toate acestea, anul 1990, când oamenii de știință au reușit să corecteze o genă defectuoasă și, prin introducerea acesteia în corpul pacientului, să învingă fibroza chistică, a devenit cu adevărat revoluționar în domeniul terapiei genice. Milioane de oameni din întreaga lume au primit speranță pentru tratamentul bolilor care anterior erau considerate incurabile. Și deși o astfel de terapie este la începutul dezvoltării sale, potențialul său este surprinzător chiar și în lumea științifică.

De exemplu, pe lângă fibroza chistică, oamenii de știință moderni au făcut progrese în lupta împotriva unor patologii ereditare precum hemofilia, enzimopatia și imunodeficiența. Mai mult, tratamentul genetic face posibilă lupta împotriva unor boli oncologice, precum și a patologiilor cardiace, a bolilor sistemului nervos și chiar a leziunilor, de exemplu, afectarea nervilor. Astfel, terapia genică se ocupă de boli extrem de severe care duc la mortalitate timpurie și de multe ori nu au alt tratament decât terapia genică.

Principiul tratamentului genetic

Ca substanță activă, medicii folosesc informații genetice sau, mai precis, molecule care sunt purtătoare de astfel de informații. Mai rar, acizii nucleici ARN sunt utilizați pentru aceasta și mai des sunt folosite celule ADN.

Fiecare astfel de celulă are un așa-numit „copiator” - un mecanism prin care traduce informațiile genetice în proteine. O celulă care are gena corectă și fotocopiatorul funcționează fără eșecuri este o celulă sănătoasă din punctul de vedere al terapiei genice. Fiecare celulă sănătoasă are o întreagă bibliotecă de gene originale, pe care le folosește pentru funcționarea corectă și armonioasă a întregului organism. Cu toate acestea, dacă dintr-un motiv oarecare se pierde o genă importantă, nu este posibilă restabilirea unei astfel de pierderi.

Aceasta devine cauza dezvoltării unor boli genetice grave, cum ar fi distrofia musculară Duchenne (odată cu aceasta, pacientul dezvoltă paralizie musculară și, în majoritatea cazurilor, nu trăiește până la 30 de ani, murind din cauza stopului respirator). Sau o situație mai puțin fatală. De exemplu, o „defalcare” a unei anumite gene duce la faptul că proteina încetează să-și îndeplinească funcțiile. Și aceasta devine cauza dezvoltării hemofiliei.

În oricare dintre cazurile enumerate, terapia genică vine în ajutor, a cărei sarcină este să livreze o copie normală a genei unei celule bolnave și să o plaseze într-un „copiator” celular. În acest caz, funcționarea celulei se va îmbunătăți și, probabil, funcționarea întregului corp va fi restabilită, datorită căruia persoana va scăpa de o boală gravă și își va putea prelungi viața.

Ce boli poate trata terapia genică?

Cât de mult ajută terapia genică cu adevărat o persoană? Potrivit oamenilor de știință, în lume există aproximativ 4.200 de boli care apar ca urmare a disfuncționalității genelor. În acest sens, potențialul acestui domeniu al medicinei este pur și simplu incredibil. Cu toate acestea, ceea ce este mult mai important este ceea ce medicii au realizat până acum. Desigur, există o mulțime de dificultăți pe această cale, dar astăzi pot fi identificate o serie de victorii locale.

De exemplu, oamenii de știință moderni dezvoltă abordări pentru tratarea bolilor coronariene prin intermediul genelor. Dar aceasta este o boală incredibil de comună care afectează mult mai mulți oameni decât patologiile congenitale. În cele din urmă, o persoană care se confruntă cu o boală coronariană se află într-o stare în care terapia genică poate fi singura sa mântuire.

Mai mult, astăzi patologiile asociate cu afectarea sistemului nervos central sunt tratate cu ajutorul genelor. Acestea sunt boli precum scleroza laterală amiotrofică, boala Alzheimer sau boala Parkinson. Interesant este că pentru tratarea acestor afecțiuni se folosesc viruși care tind să atace sistemul nervos. Astfel, cu ajutorul virusului herpes, citokinele și factorii de creștere sunt livrate sistemului nervos, încetinind dezvoltarea bolii. Acesta este un exemplu izbitor al modului în care un virus patogen care de obicei cauzează boli este procesat în laborator, lipsit de proteinele purtătoare de boli și folosit ca o casetă care furnizează substanțe vindecătoare nervilor și, prin urmare, acționează în beneficiul sănătății, prelungind umanitatea. viaţă.

O altă boală ereditară gravă este colesterolemia, care face ca organismul uman să nu mai poată regla colesterolul, drept urmare grăsimile se acumulează în organism, iar riscul de infarct miocardic și accident vascular cerebral crește. Pentru a face față acestei probleme, specialiștii îndepărtează o parte din ficatul pacientului și corectează gena deteriorată, oprind acumularea în continuare a colesterolului în organism. Gena corectată este apoi plasată într-un virus neutralizat al hepatitei și trimisă înapoi la ficat.

Citeste si:

Există evoluții pozitive în lupta împotriva SIDA. Nu este un secret pentru nimeni că SIDA este cauzată de virusul imunodeficienței umane, care distruge sistemul imunitar și deschide ușa bolilor mortale din organism. Oamenii de știință moderni știu deja cum să schimbe genele, astfel încât să nu mai slăbească sistemul imunitar și să înceapă să-l întărească pentru a contracara virusul. Astfel de gene sunt introduse prin sânge, prin transfuzie de sânge.

Terapia genică funcționează și împotriva cancerului, în special împotriva cancerului de piele (melanomul). Tratamentul unor astfel de pacienti presupune introducerea de gene cu factori de necroza tumorala, i.e. gene care conțin proteine ​​antitumorale. Mai mult, astăzi se desfășoară studii pentru tratamentul cancerului cerebral, în care pacienților bolnavi li se injectează o genă care conține informații pentru a crește sensibilitatea celulelor maligne la medicamentele utilizate.

Boala Gaucher este o boală ereditară severă care este cauzată de o mutație a unei gene care suprimă producția unei enzime speciale, glucocerebrozidaza. La persoanele care suferă de această boală incurabilă, splina și ficatul sunt mărite și, pe măsură ce boala progresează, oasele încep să se deterioreze. Oamenii de știință au reușit deja experimente privind introducerea în corpul unor astfel de pacienți a unei gene care conține informații despre producerea acestei enzime.

Iată un alt exemplu. Nu este un secret pentru nimeni că o persoană nevăzătoare este lipsită de capacitatea de a percepe imagini vizuale pentru tot restul vieții. Una dintre cauzele orbirii congenitale este considerată a fi așa-numita atrofie Leber, care, de fapt, este o mutație genetică. Până în prezent, oamenii de știință au restaurat abilitățile vizuale la 80 de nevăzători folosind un adenovirus modificat care a livrat gena „funcțională” în țesutul ocular. Apropo, în urmă cu câțiva ani, oamenii de știință au reușit să vindece daltonismul la maimuțele experimentale prin introducerea unei gene umane sănătoase în retina ochiului animalului. Și mai nou, o astfel de operație a permis primilor pacienți să vindece daltonismul.

De obicei, metoda de furnizare a informațiilor genetice folosind viruși este cea mai optimă, deoarece virusurile înșiși își găsesc ținta în organism (virusul herpesului va găsi cu siguranță neuroni, iar virusul hepatitei va găsi ficatul). Cu toate acestea, această metodă de livrare a genelor are un dezavantaj semnificativ - virușii sunt imunogeni, ceea ce înseamnă că atunci când intră în organism, ei pot fi distruși de sistemul imunitar înainte de a avea timp să funcționeze sau chiar să provoace răspunsuri imune puternice din partea organismului, doar înrăutățirea stării de sănătate.

Există o altă metodă de livrare a materialului genetic. Este o moleculă circulară de ADN sau plasmidă. Se spiralează perfect, devenind foarte compact, ceea ce permite oamenilor de știință să îl „împacheteze” într-un polimer chimic și să îl introducă într-o celulă. Spre deosebire de virus, o plasmidă nu provoacă un răspuns imun în organism. Cu toate acestea, această metodă este mai puțin potrivită, deoarece după 14 zile, plasmida este îndepărtată din celulă și producția de proteine ​​se oprește. Adică, în acest fel, gena trebuie introdusă pe o perioadă lungă de timp până când celula „se revine”.

Astfel, oamenii de știință moderni au două metode puternice pentru a furniza gene celulelor „bolnave”, iar utilizarea virușilor pare mai preferabilă. În orice caz, decizia finală cu privire la alegerea unei metode sau alteia este luată de medic, pe baza reacției corpului pacientului.

Provocări cu care se confruntă terapia genică

Se poate trage o concluzie certă că terapia genică este un domeniu al medicinei slab studiat, care este asociat cu un număr mare de eșecuri și efecte secundare, iar acesta este marele său dezavantaj. Cu toate acestea, există și o problemă etică, deoarece mulți oameni de știință sunt categoric împotriva interferenței în structura genetică a corpului uman. De aceea, astăzi există o interdicție internațională privind utilizarea celulelor germinale, precum și a celulelor germinale preimplantare, în terapia genică. Acest lucru a fost făcut pentru a preveni modificările nedorite ale genelor și mutațiile la descendenții noștri.

În caz contrar, terapia genică nu încalcă niciun standard etic, deoarece este concepută pentru a lupta împotriva bolilor grave și incurabile în care medicina oficială este pur și simplu neputincioasă. Și acesta este cel mai important avantaj al tratamentului genetic.
Aveți grijă de dumneavoastră!

Terapia genică

Baranov V.S. Terapia genică – medicina secolului XXI // Jurnal educațional Soros. – 1999. – Nr. 3. – P. 63–68. (Universitatea de Stat din Sankt Petersburg)

© Baranov V.S., text

© Soros Educational Journal, 1999

© A. Afonin, prelucrarea și publicarea versiunii html, 2006

<http:// afonin-59- bio. oameni. ru>

<http:// afonin-59- salix. oameni. ru>

INTRODUCERE

Realizări decisive ale biologiei moleculare și geneticii în studiul structurii fine a genelor eucariote, cartografierea lor pe cromozomii mamiferelor, și în special a oamenilor, succesele impresionante ale Proiectului Genomului Uman în identificarea și clonarea genelor ale căror mutații conduc la numeroase boli ereditare , și, în sfârșit, creșterea rapidă în domeniul biotehnologiei și ingineriei genetice au fost premisele necesare pentru primele încercări de tratare a bolilor monogenice din experimente pe animale și construcții teoretice deja în 1989.

Ce este terapia genică? Înseamnă tratament folosind gena ca medicament sau numai tratament prin corectarea genei mutante? Acestea și multe alte întrebări apar în mod inevitabil atunci când luăm în considerare o astfel de direcție promițătoare, și poate potențial periculoasă pentru umanitate, a medicinei din secolul XXI ca terapie genetică.

SCURT FOND ISTORIC

Terapia genică în stadiul actual poate fi definită ca tratamentul bolilor ereditare, multifactoriale și neereditare (infecțioase) prin introducerea de gene în celulele pacienților cu scopul de a modifica defectele genice sau de a conferi celulelor noi funcții. Primele studii clinice de terapie genică au fost întreprinse pe 22 mai 1989, cu scopul de a marca genetic limfocitele infiltrante tumorale în melanomul avansat. Prima boală ereditară monogenă pentru care s-au aplicat metode de terapie genică a fost imunodeficiența ereditară cauzată de o mutație a genei adenozin deaminazei (ADA). Pe 14 septembrie 1990, la Bethesda (SUA), o fetiță de patru ani care suferă de această boală destul de rară (1:100.000) a fost transplantată cu propriile limfocite, transformate anterior în afara corpului. (ex vivo) genomului ADA (gena ADA + gena oameni + vector retroviral). Efectul terapeutic a fost observat timp de câteva luni, după care procedura s-a repetat la intervale de 3...5 luni. Pe parcursul a trei ani de terapie, au fost efectuate un total de 23 de transfuzii intravenoase. ADA- limfocite T transformate fără efecte adverse vizibile. Ca urmare a tratamentului, starea pacientului s-a îmbunătățit atât de mult încât a putut duce o viață normală și să nu se teamă de infecții întâmplătoare. Tratamentul celui de-al doilea pacient cu această boală a avut la fel de succes. În prezent, studiile clinice de terapie genică pentru această boală se desfășoară în Italia, Franța, Marea Britanie și Japonia.

În 1997, numărul de protocoale aprobate pentru studiile clinice era deja de 175, peste 2000 de pacienți au luat parte la implementarea acestora. Majoritatea acestor proiecte (aproximativ 80%) se referă la tratamentul cancerului, precum și al infecției cu HIV (SIDA). În același timp, în cercetările moderne privind terapia genică este necesar să se țină cont de faptul că consecințele manipulării genelor sau ADN-ului recombinant în vivo insuficient studiat.

În țările cu cel mai avansat nivel de cercetare în acest domeniu, în special în Statele Unite, protocoalele medicale care utilizează secvențe ADN sens sunt supuse revizuirii obligatorii de către comitetele și comisiile relevante. În SUA, acestea sunt Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) și Food and Drug Administration (FDA), cu aprobarea ulterioară obligatorie a proiectului de către directorul National Institutes of Health. În Europa, astfel de protocoale sunt întocmite și aprobate în conformitate cu recomandările Grupului de lucru european privind transferul și terapia genelor umane.

METODE DE TRANSFECȚIE GENETICĂ ÎN TERAPIA GENICA

Condiția decisivă pentru succesul terapiei genice este asigurarea unei livrări eficiente, adică transfecția (în sens larg) sau transducția (când se utilizează vectori virali) a unei gene străine în celule țintă, asigurând funcționarea acesteia pe termen lung în aceste celule și creând condiții pentru funcționarea deplină a genei (expresia acesteia) . Transfecția poate fi efectuată utilizând ADN pur (gol) dopat (integrat) în plasmida corespunzătoare sau ADN complexat (ADN plasmidic conectat la săruri, proteine ​​(transferină), polimeri organici (DEAE-dextran, polilizină, lipozomi sau particule de aur), sau ADN conținut în particule virale lipsite anterior de capacitatea de a se replica.

Principalele metode de livrare a genelor străine în celule sunt împărțite în chimice, fizice și biologice. Eficiența transfecției și capacitatea de integrare a ADN-ului străin transdus nu sunt aceleași pentru diferite metode de transfecție în celulele ADN țintă. Numai vectorii virali sau constructele genetice care conțin secvențe virale sunt capabili de transducție activă și, în unele cazuri, de expresie pe termen lung a genelor străine. Din cele peste 175 de protocoale de studii clinice deja aprobate pentru terapia genică, peste 120 implică utilizarea transducției virale și aproximativ 100 dintre acestea se bazează pe utilizarea vectorilor retrovirali.

O trecere în revistă a datelor ne permite să ajungem la concluzia că, în ciuda eforturilor multor laboratoare din întreaga lume, totul este deja cunoscut și testat. în vivoȘi în vitro sistemele vectoriale sunt departe de a fi perfecte. Dacă există o problemă cu livrarea ADN-ului străin în vitro practic rezolvată și livrarea acestuia către celulele țintă din diferite țesuturi în vivo rezolvate cu succes (în principal prin crearea de constructe care poartă proteine ​​receptorului, inclusiv antigene specifice anumitor țesuturi), apoi alte caracteristici ale sistemelor vectoriale existente - stabilitatea integrării, expresia reglată, siguranță - necesită încă îmbunătățiri serioase.

În primul rând, aceasta se referă la stabilitatea integrării. Până acum, integrarea în genom a fost realizată doar folosind vectori retrovirali sau adeno-asociați. Eficiența integrării stabile poate fi crescută prin îmbunătățirea construcțiilor genelor, cum ar fi sistemele mediate de receptor, sau prin crearea de vectori epizomali suficient de stabili (adică structuri ADN capabile de persistență pe termen lung în interiorul nucleelor).

Transferul de gene mediat de receptor este după cum urmează. Secvența de ADN a genei dorite este conectată la o anumită substanță (de exemplu, o glicoproteină), care are o afinitate mare pentru un anumit receptor de membrană al celulei transformate (de exemplu, un hepatocit). Complexul rezultat este combinat cu un adenovirus, care asigură pătrunderea construcției genice în nucleul celulei. Un astfel de vector combinat asigură livrarea țintită eficientă a genei către celule specifice.

Recent, s-a acordat o atenție deosebită creării de vectori pe baza cromozomilor artificiali de mamifere (Mammalian Artificial Chromosomes). Datorită prezenței elementelor structurale de bază ale cromozomilor obișnuiți, astfel de mini-cromozomi sunt reținuți în celule pentru o lungă perioadă de timp și sunt capabili să transporte gene (genomice) de dimensiune completă și elementele lor de reglare naturale, care sunt necesare pentru funcționarea corectă. a genei, în țesutul potrivit și la momentul potrivit.

PRINCIPII ALE TERAPIEI GENICE

În funcție de metoda de introducere a ADN-ului exogen în genomul pacientului, terapia genică poate fi efectuată fie în cultură celulară. (ex vivo) sau direct în organism (în vivo). Terapie sau terapie genetică celulară ex vivo implică izolarea și cultivarea tipurilor de celule specifice pacientului în vitro, introducând gene străine în ele (de exemplu, cele care îmbunătățesc răspunsul imun al organismului), selectând clonele de celule transfectate și reinfuzându-le în același pacient. În prezent, majoritatea programelor de terapie genetică aprobate pentru studiile clinice utilizează această abordare.

Terapia genică în vivo se bazează pe introducerea directă a secvențelor de ADN clonate și împachetate în țesuturile specifice ale pacientului. Deosebit de promițător pentru tratamentul bolilor genetice in vivo introducerea de gene folosind vaccinuri aerosolizate sau injectate pare a fi posibilă. Terapia genică cu aerosoli este dezvoltată, de regulă, pentru tratamentul bolilor pulmonare (fibroză chistică, cancer pulmonar).

Dezvoltarea unui program de terapie genetică este precedată de o analiză amănunțită a expresiei specifice țesuturilor a genei corespunzătoare, identificarea defectului biochimic primar, studiul structurii, funcției și distribuției intracelulare a produsului său proteic, precum și analize biochimice. a procesului patologic. Toate aceste date sunt luate în considerare la întocmirea protocolului medical corespunzător. Testarea procedurii de corectare a genelor a unei boli ereditare se efectuează pe culturi de celule primare ale pacientului, în care această genă este în mod normal activă din punct de vedere funcțional. Folosind aceste modele celulare, se evaluează eficacitatea sistemului de transfer de ADN exogen selectat, se determină expresia constructului genetic introdus, se analizează interacțiunea acestuia cu genomul celular și se dezvoltă metode de corecție la nivel biochimic.

Folosind culturi de celule, este posibil să se dezvolte un sistem pentru livrarea țintită a ADN-ului recombinant, cu toate acestea, testarea fiabilității funcționării acestui sistem poate fi efectuată numai la nivelul întregului organism. Acesta este motivul pentru care se acordă atât de multă atenție experimentării în programele de terapie genetică. în vivo pe modele naturale sau obținute artificial de boli ereditare corespunzătoare la animale. Corectarea cu succes a defectelor genetice la astfel de animale și absența efectelor secundare nedorite ale terapiei genice sunt cea mai importantă condiție prealabilă pentru aprobarea studiilor clinice.

Astfel, schema standard de corectare a genelor a unui defect ereditar include o serie de etape succesive. Începe cu crearea unui construct genetic (exprimat) pe deplin funcțional, care conține părțile semantice (codând proteine) și reglatoare ale genei. În etapa următoare, problema unui vector este rezolvată, asigurând livrarea eficientă și, dacă este posibil, țintită a genei către celulele țintă. Apoi se efectuează transfecția (transferul constructului rezultat) în celulele țintă, se evaluează eficiența transfecției și gradul de corectare a defectului biochimic primar în condițiile culturii celulare. (în vitro) si cel mai important, în vivo pe modele biologice animale. Abia după aceasta poate începe programul de studii clinice.

GENOTERAPIA BOLILOR EREDITARE MONOGENICE

Succesul primelor studii clinice a fost un stimulent puternic pentru a accelera dezvoltarea de noi metode de terapie genetică pentru alte boli ereditare. Mai jos este o listă a bolilor pentru care o abordare a terapiei genice este în mod fundamental posibilă, corectarea genică a cărora este probabil să fie efectuată în viitorul apropiat, precum și acele boli pentru care există deja protocoale aprobate oficial și care se află în stadii diferite. a studiilor clinice.

tabelul 1– Boli ereditare, a căror corecție genică se află în stadiul de studii clinice (CT), dezvoltare experimentală (ED) și este în mod fundamental posibilă (PV)

Boala	Gena defectuoasa	Celulele țintă	Etapă
Imunodeficiență	Adenozin deaminaza	Limfocite
Imunodeficiență	Purin nucleozid fosforilază	Limfocite
Hipercolesterolemie familială	Receptor pentru lipoproteine ​​cu densitate joasă	Hepatocite
Hemofilia B	Factorul IX	Fibroblastele
Hemofilia A	Factorul VIII	Mioblaste, fibroblaste
boala Gaucher (sfingolipidoză)	p-Glucocerebrozidaza	Macrofage, celule stem
boala Hunter	Iduronat sulfatază	Macrofage, celule stem
sindromul Hurler	L-iduronidază	Macrofage, celule stem
Emfizem	α -1 -Antitripsină	Limfocite
Fibroză chistică	SG-regulator transmembranar	Epiteliul bronșic
fenilcetonurie	Fenilalanin hidroxilaza	Hepatocite
Hiperamoniemia	Ornitin transcarbamilaza	Hepatocite
Citrulinemia	Arginosuccinat sintetaza	Hepatocite
Distrofia musculară Duchenne	Distrofii	Mioblaste, miofibrile
Talasemia	β-globină	Eritroblaste
Anemia celulelor secera	β-globină	Eritroblaste
Sindromul de detresă respiratorie	Surfactant proteina B	Epiteliul bronșic
Granulomatoza cronică	NADPH oxidaza	Granulocite
Boala Alzheimer	Proteina precursor de amiloid-β (AAP)	Celule nervoase
boala Parkinson	Tirozin hidroxilază	Mioblaste, fibroblaste, celule nervoase
Lecodistrofie metacromatică	Arilsulfataza A	Celule stem din sânge, celule nervoase
Sindromul Lesch-Nyhan	Hipoxantin fosforiboziltransferaza	Celule nervoase

GENOTERAPIA BOLILOR NEERITABILE

Concomitent cu dezvoltarea cercetărilor în domeniul corecției genetice a defectelor ereditare, a avut succes și căutarea metodelor de utilizare terapeutică a secvențelor de ADN simț pentru tratamentul bolilor neereditare și, în principal, a tumorilor maligne și a infecțiilor virale. Este semnificativ faptul că tocmai în aceste secțiuni de patologie se desfășoară în mod deosebit de intens căutarea modalităților de corecție a genelor, iar numărul de protocoale de studii clinice deja aprobate este de multe ori mai mare decât numărul celor pentru tratamentul bolilor monogenice.

Mai jos sunt enumerate principalele abordări metodologice ale terapiei genice pentru diferite tumori care au fost dezvoltate și sunt deja utilizate pe scară largă. Multe dintre aceste abordări sunt aplicabile și pentru combaterea celor mai grave boli infecțioase, cum ar fi infecția cu HIV (SIDA).

Rezultatele studiilor clinice timpurii ale acestor abordări au fost extrem de încurajatoare, în special în tratamentul bolilor neurodegenerative și al cancerelor sistemului nervos.

Masa 2 - Abordări de bază pentru corectarea genetică a bolilor canceroase

	Genele introduse
Imunoreactivitate tumorală crescută	Gene de antigene străine, citokine
Modificarea genetică a celulelor imune	Gene de citokine, costimulatori
Inserarea genelor de „sensibilitate” sau a genelor „de sinucidere”.	HSV timidin kinaza, genele citozin deaminazei
Blocul expresiei oncogene	ARNm Ki-ras antisens, gene de anticorpi intracelulari
Inserarea genelor supresoare tumorale
Protejarea celulelor normale de chimioterapie	Gene de rezistență la medicamente de tip 1
Inducerea sintezei de substanțe antitumorale de către celulele normale	Genele interleukinei-2, interferon
Producerea de vaccinuri recombinate antitumorale	Vaccinuri cum ar fi BCG care exprimă antigenul tumoral
Radioprotecția locală a țesuturilor normale folosind antioxidanți	Gene transferaze, glutation sintetaza

UNELE PROBLEME ETICE ŞI SOCIALE

TERAPIA GENICA

Apariția unor tehnologii fundamental noi care fac posibilă manipularea activă a genelor și a fragmentelor acestora și asigurarea livrării țintite a unor noi blocuri de informații genetice către regiunile specificate ale genomului a devenit un eveniment important în biologie și medicină.

Deja acum, la nivelul actual de cunoștințe despre genomul uman, astfel de modificări sunt teoretic destul de posibile pentru a îmbunătăți unii parametri fizici (de exemplu, înălțimea), mentali și intelectuali. Astfel, știința umană modernă, în noua sa rundă de dezvoltare, a revenit la ideea de îmbunătățire a rasei umane, postulată cândva de remarcabilul genetician englez F. Galton și dezvoltată de studenții și adepții săi din Marea Britanie (K. Pearson). , L. Penrose, J. Haldane) , în Rusia (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), în SUA (G. Möller). Cursul ulterior al istoriei, după cum știm, a discreditat complet însăși ideea de îmbunătățire a rasei umane. Cu toate acestea, atotputernicia viitoare a omului asupra propriului genom ne obligă să revenim la această temă din nou și din nou, făcându-l subiectul unor discuții vie constante în presa generală și științifică. Nu există nicio îndoială că temerile inițiale asociate cu ingineria genetică umană au fost nejustificate. Utilizarea terapiei genice pentru tratamentul multor boli a fost deja recunoscută ca fiind recomandabilă. Singura și indispensabilă limitare, care rămâne valabilă în condițiile moderne, este aceea că toate măsurile de terapie genică ar trebui să vizeze doar un anumit pacient și să privească exclusiv celulele lui somatice.

Nivelul actual de cunoștințe nu permite corectarea defectelor genelor la nivelul celulelor germinale și celulelor embrionilor umani preimplantați timpurii din cauza pericolului real de a înfunda pool-ul de gene cu constructe de gene artificiale nedorite sau de a introduce mutații cu consecințe imprevizibile. pentru viitorul omenirii. În același timp, în literatura științifică apar tot mai dese și mai persistente apeluri pentru reluarea discuției despre oportunitatea corectării genetice a germenilor și celulelor germinale umane.

Acestea sunt câteva dintre întrebările care trebuie abordate ca parte a dezbaterii mai ample de terapie genetică propusă de geneticieni.

1. Terapia genică va putea în viitor să ofere o corecție genetică atât de completă încât să nu reprezinte o amenințare pentru urmași?

2. În ce măsură beneficiile și necesitatea unei proceduri de terapie genetică pentru un cuplu depășesc riscul unei astfel de intervenții pentru întreaga umanitate?

3. Cât de justificate vor fi aceste proceduri pe fundalul viitoarei suprapopulări a planetei?

4. Cum se vor lega activitățile de inginerie genetică asupra oamenilor cu problemele de homeostazie ale societății și ale biosferei?

Astfel, revoluția genetică, a cărei apoteoză a fost terapia genică, oferă nu numai căi reale de tratare a afecțiunilor grave ereditare și neereditare, dar și în dezvoltarea sa rapidă pune noi probleme societății, a căror rezolvare este urgentă necesară în viitorul apropiat.

Astăzi, terapia genică începe în sfârșit să fie la înălțimea speranțelor puse odată în ea. În ultimii șase ani, ca urmare a introducerii unor gene funcționale specifice în părți ale corpului pacientului, a fost posibilă restabilirea vederii la 40 de pacienți cu orbire ereditară. S-au obținut rezultate strălucitoare în lupta împotriva diferitelor forme de leucemie: din 120 de subiecți, mai mulți pacienți au obținut remisie, cu o durată de trei ani. Terapia genică și-a demonstrat eficiența și în lupta împotriva hemofiliei, o boală ereditară care duce uneori la moartea pacientului. Acum pacientul nu trebuie să ia doze mari de medicamente care cresc coagularea sângelui și au efecte secundare periculoase.

Rezultatele pozitive au fost primite cu mare entuziasm și pentru că terapia genică a fost abandonată în urmă cu 15 ani, după moartea prematură a lui Jesse Gelsinger, un adolescent cu o tulburare digestivă rară. Sistemul imunitar al tânărului a reacționat la introducerea unei gene străine atât de violent, încât organismul nu a suportat-o. Succesele terapiei genice obținute în anii 1990 nu au fost chiar atât de impresionante pe cât se aștepta.

Toate acestea ne-au obligat să reconsiderăm unele dintre metodele folosite și să evaluăm mai sobru posibilitățile de utilizare a terapiei genice pentru eliminarea diferitelor patologii. A trebuit să renunț la iluzii și să mă întorc la cercetarea fundamentală. În primul rând, a fost necesar să se stabilească cauza posibilelor reacții adverse (cum ar fi cele care au dus la moartea lui Gelsinger) și să învețe să le evite. Ar fi trebuit să se acorde mai multă atenție comunicării cu pacienții și rudele acestora, astfel încât deciziile pe care le iau să fie informate.

Un moment de cotitură în situație a avut loc în urmă cu șase ani, după ce terapia genică a fost folosită pentru a vindeca un băiețel de opt ani pe nume Corey Haas, care suferea de o boală degenerativă a ochiului. Inițial, ca urmare a manipulării genelor, proteina lipsă a început să fie produsă în retina afectată a ochiului stâng, iar la patru zile după operație, băiatul a vizitat grădina zoologică și, spre încântarea lui de nedescris, și-a dat seama că vede un albastru. cer și baloane multicolore. Trei ani mai târziu, au fost efectuate manipulări similare cu ochiul drept. Acum Corey poate vedea atât de bine încât poate merge la vânătoare cu bunicul său.

Terapia genică nu a intrat încă în arsenalul medicilor practicanți, dar există speranță că acest lucru se va întâmpla în următorii zece ani. În 2012, s-a încercat în Europa să-l folosească pentru a elimina o patologie rară, dar extrem de dureroasă, așa-numita deficiență familială de lipoprotein lipază. Este de așteptat ca în Statele Unite, aprobarea pentru utilizarea terapiei genice în medicină să fie primită în 2016, iar apoi va trebui să compenseze ceea ce s-a pierdut în zece ani de inacțiune.

Dezamăgire crudă

Eșecurile care s-au întâmplat cercetătorilor în primele etape ale utilizării terapiei genice în practică au arătat clar cât de dificil este să prevăd toate consecințele introducerii genelor străine în organism. Prea des, cele mai sigure sisteme pentru livrarea lor s-au dovedit a fi insuficient de eficiente, iar unele dintre cele mai eficiente sunt nesigure: apare o reacție imună excesiv de violentă, cum a fost cazul Gelsinger, sau se dezvoltă leucemie.

Pentru a înțelege ce declanșează efectele secundare și pentru a afla cum să reducă riscul de apariție a acestora, geneticienii s-au concentrat pe studierea îndeaproape a celui mai comun sistem de livrare a genelor: proiectarea virușilor care acționează ca seringi de injecție microscopice.

În primul rând, o parte semnificativă a ADN-ului viral a fost îndepărtată pentru a face loc genelor destinate a fi introduse în corpul pacientului. (Această procedură a lipsit simultan virusul de capacitatea sa de a se reproduce.) Virusul transformat, purtând genele țintă, a fost injectat în partea dorită a corpului, unde le-a introdus în regiunile adecvate ale ADN-ului celular, în funcție de tip. de virus.

La momentul în care Gelsinger s-a oferit voluntar în studiile clinice de terapie genetică, cel mai comun sistem de livrare a genelor străine la om era adenovirusurile, care de obicei provoacă infecții ușoare ale tractului respirator superior. Potrivit cercetătorilor de la Universitatea din Pennsylvania, rezultatul optim se obține prin injectarea virusului în ficat; aici se află celulele care produc enzima digestivă de care îi lipsea Gelsinger. O copie funcțională a genei pentru această enzimă a fost inserată într-o particulă virală inactivată și un trilion din aceste particule au fost injectate în ficatul pacientului.

Din păcate, unele particule au intrat nu numai în celulele hepatice, așa cum trebuia, ci și într-un număr mare de macrofage - celule mari care „păzesc” sistemul imunitar, precum și în celulele dendritice, notificându-le pe acestea din urmă cu privire la invazie. a agentilor straini. Sistemul imunitar a început imediat să distrugă toate celulele infectate, iar acest proces violent a ucis în cele din urmă pacientul.

Severitatea răspunsului imun i-a uimit pe cercetători. Niciunul dintre ceilalți 17 voluntari nu a experimentat ceva similar. Se știa că adenovirusul ar putea provoca o reacție imună, dar în afară de un incident care a implicat o maimuță care a fost injectată cu un adenovirus ușor diferit de cel descris mai sus, cazul lui Gelsinger a fost unic. „Populația umană este mult mai eterogenă decât populația animală”, spune James Wilson de la Universitatea din Pennsylvania, care a dezvoltat sistemul de livrare genică țintită utilizat în studiile clinice ale lui Gelsinger. „Și în cazul nostru, un pacient a fost într-un fel semnificativ diferit. din rest”. Poate că tragedia nu ar fi avut loc dacă doza de virus ar fi fost mai mică - nu un trilion de particule, ci câteva miliarde. Un alt defect a fost că nici pacientul, nici rudele sale nu au fost informați despre moartea maimuței în teste similare și nimeni nu știa ce decizie ar fi luat dacă ar fi știut despre incident.

Tragedia care i s-a întâmplat lui Gelsinger nu a fost ultima. În curând, s-a încercat eliminarea unei alte patologii folosind terapia genică - imunodeficiența combinată severă XI (SCID-X1). La teste au participat 20 de copii; Cinci dintre ei au făcut leucemie, un copil a murit. Și din nou sistemul de livrare a fost de vină, deși în acest caz a fost folosit un vector diferit - un retrovirus care inserează gene țintă direct în ADN-ul celular. Locația lor exactă în genom variază ușor și uneori sunt activate în apropierea unei oncogene, ceea ce duce la cancer în anumite condiții.

Revizuirea tehnologiei

Consecințele tragice ale utilizării retro- și adenovirusurilor ca vectori ne-au forțat să apelăm la alți vectori. Drept urmare, au fost selectați doi viruși.

Primul dintre acestea, virusul adeno-asociat (AAV), nu provoacă infecții la oameni. Cei mai mulți dintre noi devin purtători ai acesteia la un moment sau altul în viața noastră și, din această cauză, este puțin probabil ca sistemul imunitar să reacționeze la ea atunci când acționează ca un vector. AAV are o altă caracteristică care ajută la minimizarea riscului de efecte secundare: vine în multe varietăți (serotipuri), fiecare dintre ele preferând să infecteze celulele organului sau țesutului „său”. Deci, pentru AAV2 aceștia sunt ochii, pentru AAV8 - ficatul, pentru AAV9 - mușchiul inimii și creierul. Este posibil să selectați varianta de virus care este optimă pentru partea țintă a corpului și să minimizați răspunsul imun și alte efecte nedorite. În plus, AAVue încorporează materialul său genetic în genomul celulei gazdă și, prin urmare, nu poate provoca cancer prin activarea aleatorie a oncogenelor.

Virusul adeno-asociat a fost testat pentru prima dată pentru capacitatea sa de a furniza material genetic la țesuturile dorite în 1996. Testele au fost efectuate pe voluntari care suferă de fibroză chistică. De atunci, au fost identificate 11 serotipuri ale acestui virus și din componentele lor au fost construiți sute de vectori siguri, selectivi. Vectorii bazați pe virus AAV sunt în prezent testați pentru terapia genică în patologii precum bolile Parkinson și Alzheimer, precum și în hemofilie, distrofie musculară, insuficiență cardiacă și orbire.

Al doilea virus, surprinzător, este o versiune slăbită a virusului imunodeficienței umane, agentul cauzator al SIDA. Să uităm pentru o clipă de reputația sa proastă și să ne concentrăm asupra avantajelor sale ca vector. HIV este un membru al genului Lentivirus din familia rstrovirusurilor. Afectează celulele sistemului imunitar și – ceea ce este foarte important – nu activează oncogene.

Dacă înlăturăm genele responsabile de efectul letal al HIV, vom obține un vector excelent cu o gamă largă de capacități. Așa spune Stuart Naylor, fost director științific al companiei engleze Oxford Biomedica. Spre deosebire de AAV mai mic, HIV „neutralizat” este potrivit pentru transferul mai multor gene simultan. Este non-toxic și nu provoacă o reacție imună. Lentivirusurile, lipsite de capacitatea de a provoca infecție, sunt testate pentru posibilitatea de a le utiliza pentru a elimina diferite patologii, în special adenoleucodistrofia. Astăzi, câțiva băieți cu acest diagnostic au reușit să se întoarcă la școală datorită terapiei genice.

În paralel cu studiile clinice care utilizează HIV AAVn, se lucrează la modificarea vectorilor virali mai vechi, astfel încât să poată fi utilizați în anumite circumstanțe. Astfel, retrovirusurile (cu excepția HIV) sunt modificate genetic astfel încât să nu provoace leucemie.

Nici măcar adenovirusul, a cărui utilizare a dus la moartea lui Gelsinger, nu a fost complet respins. Acum este injectat numai în părți ale corpului unde este puțin probabil să provoace o reacție imună. Una dintre posibilele sale aplicații este terapia genică pentru xerotomie (gura uscată) la pacienții care au fost expuși la radiații pentru cancerul zonelor capului și gâtului. în care glandele salivare sunt afectate.

National Institutes of Health efectuează un studiu clinic (care implică un număr mic de voluntari) a unei abordări bazate pe introducerea de gene în celulele corespunzătoare care mediază formarea canalelor pentru trecerea apei în glandele salivare. Deoarece acestea din urmă sunt de dimensiuni mici și mai mult sau mai puțin izolate, iar doza de virus este de 1 mie de ori mai mică decât cea primită cândva Gelsinger, probabilitatea unei reacții imune prea puternice este redusă la minimum. Particulele virale care nu ajung la celulele țintă, potrivit dezvoltatorilor, ar trebui distruse în salivă, scuipat împreună cu aceasta sau înghițite, ceea ce reduce din nou riscul de a dezvolta o reacție imună. Din 2006, această metodă a îmbunătățit semnificativ starea a 11 pacienți.

Noi ținte

Inspirați de succes, geneticienii medicali au extins domeniul de aplicare al terapiei genice și au încercat să o folosească pentru a elimina defectele genetice neereditare.

Astfel, Universitatea din Pennsylvania folosește deja această abordare în lupta împotriva unuia dintre cele mai frecvente tipuri de cancer la copii - leucemia limfoblastică acută (ALL). Pentru aproximativ 20% dintre copiii cu acest diagnostic, chimioterapia tradițională nu ajută.

Terapia genică în astfel de cazuri este deosebit de complexă și se bazează pe utilizarea receptorilor de antigen himeric (CAR). La fel ca himerele mitologiei grecești antice, formate din părți ale corpului de la diferite animale, acești receptori sunt un complex de două componente ale sistemului imunitar care nu se găsesc în mod normal în organism. Celulele T de care este atașat dobândesc capacitatea de a căuta proteine ​​specifice conținute în celulele leucemice în cantități mai mari decât cele normale și de a distruge celulele anormale. Primii subiecți au fost pacienți adulți cu leucemie cronică: rezultatele obținute au fost încurajatoare. Rezultatul studiilor asupra copiilor bolnavi a depășit toate așteptările.

Când Emily Whitehead a fost diagnosticată cu leucemie în mai 2010, avea nouă ani. Două cure de chimioterapie nu au dat rezultate. În primăvara anului 2012, au efectuat un al treilea curs, care ar fi putut ucide un adult, dar fata a supraviețuit, deși a dezvoltat probleme la rinichi, ficatul și splina. Potrivit medicului curant Bruce Levine. — Emily a fost la un pas de moarte.

Apoi i-au luat sânge, i-au izolat celulele T și i-au injectat lentivirus. în al cărui genom au fost incluse anterior genele țintă. După ce a injectat celulele T himerice înapoi în corpul pacientului, starea ei a început să se îmbunătățească rapid. După trei săptămâni, 25% din celulele T ale măduvei osoase au fost modificate genetic și au început să vâneze celule canceroase. „În aprilie, fata a chel complet. „își amintește Levin, „și până în august își dobândise aspectul anterior și era gata pentru școală”.

Celulele T modificate este puțin probabil să funcționeze pentru tot restul vieții, dar procedura poate fi întotdeauna repetată. Între timp, această fată drăguță cu părul brun și des nu are celule canceroase. În toamna lui 2013, mai multe grupuri de geneticieni medicali au raportat că au folosit tehnica CAR pentru a trata 120 de pacienți cu aceeași formă de leucemie ca cea a lui Emily Whitehead, precum și alte forme. Cinci adulți și 19 din 22 de copii au intrat în remisie.

Perspective

Acum, cercetătorii de terapie genetică se confruntă cu o altă provocare: trebuie să obțină aprobarea de la Food and Drug Administration (FDA) pentru a-și utiliza sistemul vectorial mai sigur decât oricând anterior în clinică. Este necesar să se organizeze studii clinice de fază III care implică un grup mare de voluntari. Acest lucru durează de obicei de la unu la cinci ani. La sfârșitul anului 2013, aproximativ 5% din cele 2.000 de studii ajunseseră în această fază. Creatorii unei metode de tratament care utilizează terapia genică pentru pacienții care suferă de boala Leber (pierderea bilaterală a vederii cauzată de o mutație a ADN-ului mitocondrial: Haas, în vârstă de opt ani, avea această patologie) au avansat mai mult decât alții. Câteva zeci de pacienți au reușit deja să-și recapete vederea folosind terapia genică.

Articol pentru concursul „bio/mol/text”: « Misha s-a născut pe 12 februarie ca un copil sănătos. Dar la 1,5 luni, am început să observ că în toate fotografiile bebelușul ia aceeași poziție, de parcă picioarele lui ar fi nemișcate. În câteva săptămâni, am fost diagnosticați, simpatizați și sfătuiți să începem să planificăm pentru un al doilea copil sănătos." Din cauza unei combinații fatale de gene, Misha, ca și alți copii cu această boală, a fost forțat să lupte pentru fiecare mișcare de-a lungul scurtei sale vieți. Luptă cu disperare, cu toată puterea ta, dar în cele din urmă pierzi. Atrofie musculară spinală (SMA) este una dintre anomaliile genetice împotriva căreia omenirea este încă neputincioasă. Cu toate acestea, succesele terapiei genice, pe care lumea medicală le observă astăzi, pot transfera atât SMA, cât și alte patologii ereditare severe în categoria celor vindecabile. În plus, sunt vindecabile în uter.

Sponsorul general al competiției este compania Diaem: cel mai mare furnizor de echipamente, reactivi și consumabile pentru cercetare și producție biologică.

Premiul publicului a fost sponsorizat de Centrul de Genetică Medicală.

Sponsorul „Carte” al competiției - „Alpina Non-Fiction”

Natura face greșeli, corectează omul

Conceptul de terapie genetică este elegant și frumos, ca toate lucrurile ingenioase. Constă în furnizarea de material genetic sănătos într-o celulă folosind sisteme vectoriale pentru a înlocui genele „eronate” cu care sunt asociate diferite boli (Fig. 1).

„Biomolecule” a scris deja în detaliu despre posibilitățile pe care terapia genică le deschide în tratamentul cancerului și a anomaliilor ereditare, în special retinita pigmentară.

Și dacă în anii 80 ai secolului trecut, când au început să vorbească destul de tare despre terapia genică, multora li se părea teoria ei a fi o continuare a scenariului filmului „Înapoi în viitor”, dar astăzi a devenit realitate, deschizând perspective noi, cu adevărat nemărginite.

Cu toate acestea, este clar că terapia genică are o serie de limitări, mai ales când vine vorba de boli moștenite. În primul rând, procesul patologic în astfel de cazuri poate începe în uter. Până în momentul în care boala este în sfârșit diagnosticată – uneori la ani după nașterea copilului – s-ar putea să se fi dezvoltat leziuni ireversibile ale celulelor și organelor, limitând sau eliminând semnificativ opțiunile terapeutice.

Șansa de a rezolva această problemă a apărut datorită diagnosticului prenatal modern, care face posibilă detectarea defectelor cromozomiale deja în stadiile incipiente ale sarcinii. Prin obținerea oricărui material fetal folosind tehnici invazive, bolile genetice pot fi diagnosticate rapid și fiabil. Și în cazurile cu hemoglobinopatii, nevoia de manipulări invazive dispare cu totul: pentru a le identifica, este suficient să examinăm ADN-ul fetal obținut din celulele sanguine ale mamei.

Tehnicile moderne de diagnostic prenatal în combinație cu progresele în terapia genică oferă o oportunitate unică de a corecta „greșeala” naturii și de a interveni în procesul patologic înainte de deteriorarea ireversibilă a celulelor. Oferirea de tratament pentru diferite boli ale copilului în uter sau cel puțin stoparea progresiei bolii, după toate probabilitățile, poate terapia genică fetală, sau terapia genică fetală.

Ideea terapiei genice fetale este departe de a fi nouă: la doar câțiva ani de la prima încercare de terapie genetică la adulți, în 1994, cercetătorii au început să discute serios despre utilizarea tehnicii inovatoare în uter. Astăzi, când tratamentul bolilor genetice din uter aproape s-a transformat dintr-o perspectivă fantastică în realitate, au fost publicate o mulțime de lucrări în care au fost publicate terapia genică fetală și avantajele acesteia în comparație cu terapia genică la adulți.

Prenatală vs postnatal

Anticipând întrebările despre oportunitatea corectării intrauterine a unei anomalii genetice, să ne concentrăm imediat asupra avantajelor terapiei genice fetale în comparație cu terapia genică postnatală.

Gamă largă de efecte asupra organelor și sistemelor

Se știe că în cazul multor boli genetice (de exemplu, epidermoliza buloasă sau fibroza chistică), poate fi destul de dificil să influențezi principalele legături ale procesului patologic aproape imediat după naștere. Corectarea genelor mutante în fătul în curs de dezvoltare vă permite să creșteți rapid populația de celule stem, oferind un grup mare de celule transfectate și, în consecință, un efect terapeutic pronunțat.

Producerea simplificată a unui vector clinic purtător de material genetic

Dozajul vectorului viral utilizat pentru transferul materialului genetic depinde de greutatea corporală. Datorită dimensiunii mici a fătului, este posibil să se realizeze o biodistribuție mult mai mare a vectorului la aceeași doză ca în timpul terapiei genice pentru un adult. Acest lucru economisește atât timp, cât și bani. Datele comparative simple ajută să ne imaginăm cât de semnificative sunt economiile: de exemplu, un făt la 14-16 săptămâni de sarcină (perioada optimă pentru inducția vectorului) cântărește aproximativ 100 g, în timp ce greutatea corporală medie a unui adult este de aproximativ 60 kg.

Creșterea eficacității terapiei datorită unui răspuns imun incomplet

O serie de studii au demonstrat că imunitatea umorală la adenovirusuri și virușii adeno-asociați (AAV) (Figura 2) a anumitor serotipuri care sunt utilizate în mod obișnuit ca vectori poate duce la eșecul expresiei transgenei. Acesta poate fi unul dintre barierele critice în calea transplantului de succes.

Aproximativ 50% dintre adulții care au un răspuns imun dobândit la acești vectori virali sunt expuși riscului. Dar chiar și în absența sensibilității, administrarea vectorului la adulți duce adesea la dezvoltarea unui răspuns imun care reduce durata și nivelul expresiei transgenelor. Astfel, după injectarea intramusculară a unui vector adenoviral cu gena proteinei distrofinaȘoarecii adulți cu distrofie musculară Duchenne dezvoltă anticorpi la distrofină, care este asociată cu o scădere semnificativă a eficienței expresiei. În același timp, fătul din uter este imunologic imatur, ceea ce permite livrarea vectorului viral și a produsului transgen fără restricția impusă de răspunsul imun.

Avantajele evidente ale terapiei fetale în comparație cu corecția postnatală asigură o eficiență și fezabilitate mai mare a acesteia, în special pentru bolile severe, care pun viața în pericol. Chiar și în cazurile în care vindecarea completă nu poate fi obținută, terapia genică fetală poate influența părțile patologice ale bolii, ușurând cursul acesteia și îmbunătățind prognosticul. Și, prin urmare, poate deveni singura alternativă terapeutică pentru întreruperea sarcinii pentru mii de familii. Mai mult, numărul de boli care ar putea fi controlate atunci când terapia genică fetală este introdusă în practica clinică este cu adevărat enorm.

Perspective și oportunități

Se crede că terapia genică fetală este capabilă să pună sub control multe patologii periculoase. Doar o mică parte dintre acestea sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Boli care pot fi controlate cu terapia genică fetală .

Boala	Medicament de terapie genică	Celulele și/sau organul țintă	Vârsta de manifestare a bolii	Prevalența	Durată de viaţă
Fibroză chistică	CFTR (regulator transmembranar)	Celulele epiteliale ale tractului respirator și ale intestinelor	Al treilea trimestru de sarcină	1:4000	Aproximativ 35 de ani
Distrofia musculară Duchenne	Distrofina	Miocite	2 ani	1:4500	25 de ani
Atrofie musculară spinală	proteina SMN	Neuroni motorii	6 luni (tip I)	1:10 000	2 ani
Hemofilie	Factorul de coagulare VIII sau IX	Hepatocite	1 an	1:6000
Beta talasemie	Globin	Precursori de celule roșii din sânge	Până la un an	1:2700	Până la 20 de ani
boala Gaucher	Glucocerebrozidaza	Hepatocite	9,5 ani	1:59 000	Mai puțin de 2 ani
Defecte ale ciclului ureei	Ornitin transcarbamilaza	Hepatocite	2 zile	1:30 000	2 zile
Epidermoliza buloasă	Colagen tip VII	Keratinocite	Naștere	1:40 000	Cu o terapie corectă, speranță de viață normală
Encefalopatie ischemică hipoxică	Factori neurotrofici	Neuronii corticali	Naștere	1:1000	Cu o terapie corectă, speranță de viață normală
Restricție severă a creșterii intrauterine	Factori de creștere placentară	Trofoblast	Făt	1:500	Cateva zile

În plus, patologiile despre care se crede că sunt controlate prin terapia fetală includ:

• Tulburări de imunodeficiență- sindromul limfocitelor goale, hipoplazia cartilajului, sindromul Chediak-Higashi, boala cronica granulomatoasa, sindromul Kostman, deficitul de aderenta leucocitara, sindromul Omenn, sindromul Wiskott-Aldrich.
• Hemoglobinopatii- Boala Rh, porfirie eritropoetică congenitală.
• Boli asociate cu deficiența activității enzimatice- boala Gaucher, boala Krabbe, leucodistrofia metacromatică, mucopolizaharidoze, boala Wolman, boala Niemann-Pick.
• Alte- diskratoză congenitală, limfohistiocistoză hemafagocitară familială, osteopetroză infantilă, sindrom Shwachman-Diamond etc.

Lista bolilor care pot fi la îndemâna terapiei genice fetale este uimitoare: probabil că această tehnică va face posibilă intervenția în procese patologice care anterior nu sunt controlate de om care sunt cauzate de boli monogenice. Numărul lor, conform Organizației Mondiale a Sănătății, ajunge la zece mii. Cu toate acestea, este important să se țină seama de existența unui număr de limitări și, în primul rând, de riscurile pentru mamă și făt asociate terapiei genice intrauterine.

Temeri și riscuri

Riscurile specifice ale transferului de gene prenatale sunt fundamental diferite de cele ale terapiei genice postnatale. Acestea includ reacții adverse pe termen scurt și efecte postnatale pe termen lung. Relevanța lor este exacerbată de faptul că, în mod ipotetic, expresia genelor fetale poate avea efecte imprevizibile atât asupra dezvoltării prenatale, cât și asupra dezvoltării postnatale.

În primul rând, procedura de transfer în sine este direct asociată cu o probabilitate crescută de avort spontan, corioamnionită și naștere prematură. Studiile au documentat reacții inflamatorii la vector, în special infiltrarea ficatului și necroza ficatului în terapia genică fetală de oaie.

Succesul terapiei genice fetale poate fi contracarat de răspunsul imun fetal, iar acest lucru implică anumite riscuri pentru rezultatul final. Răspunsurile umorale și celulare la introducerea unui vector sau a unei proteine ​​transgenice prin sistemele de transducție celulară pot elimina produșii de transfer sau pot neutraliza expresia transgenei. În același timp, studiile au demonstrat dependența puterii răspunsului imun de vârsta gestațională. Reacții imune semnificative la introducerea unui vector lentiviral în stadiile incipiente și mijlocii ale sarcinii nu au fost înregistrate, în timp ce s-a observat un răspuns umoral puternic împotriva antigenului capsidei cu introducerea unui vector adenoviral în stadii târzii.

Una dintre problemele extrem de importante ale terapiei genice fetale este riscul potențial care apare la transmiterea secvențelor ADN donatorului către făt. Deoarece integrarea vectorială în celulele germinale este probabil să fie aleatorie, teoretic ar putea avea consecințe catastrofale pentru făt. De fapt, un copil care primește material genetic donator in utero se naște mutant. Componenta etică a terapiei genice îngrijorează mințile oamenilor de știință și teologilor. Aceștia din urmă, de la nașterea celei mai faimoase oi din istoria științei, avertizează asupra pericolelor pe care amestecul în planul lui Dumnezeu le aduce omenirii.

Un alt aspect important se datorează probabilității mutagenezei în celulele fetale, ducând la un defect al oricărei gene funcționale, care în cele din urmă poate deveni cauza unei noi boli genetice dobândite sau a unei tumori maligne. Această posibilitate pare chiar mai probabilă având în vedere dovezile dintr-un studiu la șoarece în care expresia genelor în embrionii de șoarece a declanșat dezvoltarea tumorilor hepatice.

În acest context, rezultatele a două studii care demonstrează dezvoltarea unor efecte secundare grave după terapia genică de succes pentru imunodeficiența combinată legată de X pot fi departe de a fi coincidente: în primul caz, a fost înregistrată manifestarea unei boli limfoproliferative monoclonale, iar în în al doilea rând, proliferarea celulelor T alfa/beta. Atât în ​​primul cât și în al doilea caz, vectorul retroviral a fost integrat în imediata apropiere a genei LMO2în proliferarea celulelor T.

Teoretic terapia genică ex vivo poate fi mai sigur decât in vivo injectarea fetală a vectorului. Deși acest lucru nu exclude posibilitatea mutagenezei în celulele care sunt transduse retroviral in vitro, introducerea mutagenului poate fi mai ușor detectată și controlată. Cu toate acestea, din păcate, aceste complicații nu pot fi excluse complet.

În cele din urmă, terapia genică fetală crește susceptibilitatea celulelor fetale la transducție. Transducția retrovirală la nivel scăzut în progenitorii celulelor germinale a fost observată în gonadele masculine și feminine după injectarea intraperitoneală a vectorului în embrionii de oaie și, respectiv, de maimuță. Analiza factorilor care conduc la transducția neintenționată a arătat că susceptibilitatea țesutului fetal la aceasta depinde de vârsta gestațională, cu rate mai mari de transducție la începutul sarcinii.

Din punct de vedere al riscurilor potențiale, este evident că terapia genică fetală poate fi o metodă rezonabilă de tratare doar a bolilor genetice severe pentru care nu există alte opțiuni de corectare. Iar printre acestea, desigur, se numără boala Gaucher, posibilitatea terapiei genice intrauterine pentru care a fost demonstrată într-un studiu publicat destul de recent.

Primul care merge: boala Gaucher

În iulie 2018, revista Medicina Naturii a publicat rezultatele unui studiu pe șoareci condus de Simon Waddington ( Simon Waddington) de la Institutul de Sănătate a Femeii din Londra. Rezultatele lucrării au demonstrat eficacitatea terapiei genice fetale în tratamentul bolilor neurodegenerative și, în special, a bolii Gaucher. Aceasta este cea mai comună formă printre enzimopatiile ereditare rare, care se bazează pe o deficiență a activității enzimelor lizozomale. glucozecerebrozidaza(Fig. 3), cauzate de mutații ale genei glucozilceramidaza. În funcție de natura mutațiilor, se poate dezvolta o formă neuropatică severă a bolii, care se manifestă încă din copilărie, sau o formă cu debut mai gradual și simptome mai puțin severe. În timp ce formele mai ușoare ale bolii Gaucher răspund bine la terapia de substituție, forma severă rămâne fatală. Semnele formei incurabile de boala Gaucher apar in primele luni de viata si includ hipotonia musculara progresiva, intarzierea si regresia dezvoltarii psihomotorii si alte semne neurologice.

Într-un studiu, Waddington și colab. au demonstrat că injectarea intracraniană a vectorului viral 9 adeno-asociat (AAV9) la șoarecii embrionari în ziua 16 de gestație a dus la o expresie crescută a glucozecerebrozidazei, care a inversat neurodegenerarea. În același timp, activitatea enzimelor din creier a fost comparabilă cu cea a șoarecilor sănătoși. În ciuda faptului că rozătoarele bolnave au fost încă diagnosticate cu un proces inflamator în creier, acestea s-au dezvoltat semnificativ mai bine decât șoarecii din grupul de control, care au trebuit eutanasiați la două săptămâni după tratament din cauza severității bolii.

Șoarecii tratați cu terapie genetică fetală au trăit cel puțin 18 săptămâni, au fost fertili și mobili. În mod interesant, administrarea postnatală a vectorului a atenuat, de asemenea, boala, dar a fost mai puțin eficientă decât expresia prenatală.

Deoarece AAV9 a putut să intre în creier din sânge, echipa lui Waddington a efectuat un alt experiment în care au injectat o doză semnificativ mai mare de vector nu în creier, ci direct în sângele fetușilor de șoarece. După exprimare, șoarecii nu se distingeau de șoarecii sănătoși, dar pentru că au trăit doar 55 de zile, oamenii de știință nu au putut trage concluzii despre eficacitatea pe termen lung a terapiei genice intravenoase.

Experimentul lui Waddington a fost cea mai complexă lucrare de până acum în care terapia genică fetală a fost efectuată la animale. Astăzi, echipa lucrează cu corporația Apollo Therapeutics, care a reunit eforturile a trei universități britanice și a trei mari companii farmaceutice. Waddington și colegii săi urmăresc un nou obiectiv: de data aceasta au sarcina de a obține date preclinice și, eventual, de a testa tratamentul la om. Și în timp ce scepticii se gândesc la gama de posibilități de utilizare a terapiei genice fetale la om, care poate fi redusă semnificativ de faptul că boala Gaucher nu este inclusă în testele prenatale, echipa lui Waddington se îndreaptă cu încredere în viitor. Un viitor în care copiii cu boala Gaucher, distrofie musculară Duchenne, SMA și multe altele rare, dar astăzi, din păcate, bolile incurabile se pot recupera.

Literatură

1. 12 metode în imagini: inginerie genetică. Partea II: Instrumente și tehnici;
Răspunsurile imune la vectorii terapiei genice: influența asupra funcției vectorului și a mecanismelor efectoare. Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Răspunsul imun la distrofina de lungime completă furnizată mușchiului Dmd de către un vector adenoviral de mare capacitate. Terapia Moleculară. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). Terapia genică in utero și editarea genomului. Curr Stem Cell Rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Cele mai bune practici și cercetare în obstetrică și ginecologie clinică. 22 , 203-218;
5. Rezumat din partea terapiei genice. Noua strategie de neutralizare a hemofiliei;
6. Charles Coutell. (2008). De ce să te deranjezi?: Merită efortul terapiei genetice in utero? . Terapia Moleculară. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al.. (2005). Oncogeneza după livrarea unui vector de terapie genică lentivirală nonprimată la șoareci fetali și neonatali. Terapia Moleculară. 12 , 763-771;
8. Comunicat de presă al Societății Europene de Terapie Genetică (ESGT), Bernd Gansbacher. (2003). Raportarea unui al doilea eveniment advers grav într-un studiu clinic de terapie genică pentru deficiența imună combinată severă legată de X (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al.. (2018). Terapia genică fetală pentru bolile neurodegenerative ale sugarilor. Nat Med. 24 , 1317-1323.