Rekombináns DNS és RNS bejuttatása a sejtbe. Gének bejuttatása a sejtbe A DNS sejtbe történő bejuttatásának módszerei

Bevezetés

1 A genetikailag módosított enzimek fő csoportjai

1.1 Restrikciós enzimek

1.1.1 A restrikciós enzimek hatásmechanizmusa

1.1.2 Korlátozási térképek készítése

1.3 Ligázok

2 Új gén bevitele a sejtbe

2.1 A génexpresszió szabályozása prokariótákban

2.2 Módszerek gén közvetlen sejtbe juttatására

2.3 Gének bejuttatása emlőssejtekbe

2.4 Emlős szomatikus sejtek genetikai transzformációja

2.5 Génterápia

2.6 Transzgénikus állatok előállítása

Következtetés

Bibliográfia

Bevezetés

Génsebészet - funkcionálisan aktív genetikai struktúrák in vitro felépítése ( rekombináns DNS), vagy más módon - mesterséges genetikai programok létrehozása (Baev A. A.). E. S. Piruzyan szerint a génsebészet olyan kísérleti technikák rendszere, amely lehetővé teszi mesterséges genetikai struktúrák laboratóriumi (in vitro) felépítését úgynevezett rekombináns vagy hibrid DNS-molekulák formájában.

Molekuláris genetikai rendszerek szervezeten kívüli irányított, előre meghatározott program szerinti felépítéséről beszélünk, majd azok élő szervezetbe történő bejuttatásáról. Ebben az esetben rekombináns DNS válik szerves része a befogadó szervezet genetikai berendezését, és új egyedi genetikai, biokémiai, majd fiziológiai tulajdonságokat kölcsönöz neki.

Az alkalmazott géntechnológia célja olyan rekombináns DNS-molekulák tervezése, amelyek a genetikai apparátusba bekerülve az ember számára hasznos tulajdonságokat adnának a testnek.

A rekombináns DNS technológia a következő módszereket használja:

A DNS specifikus hasítása restrikciós nukleázokkal, felgyorsítva az egyes gének izolálását és manipulálását;

Az összes nukleotid gyors szekvenálása egy tisztított DNS-fragmensben, amely lehetővé teszi a gén és az általa kódolt aminosav-szekvencia határainak meghatározását;

Rekombináns DNS felépítése;

Hibridizáció nukleinsavak, amely lehetővé teszi specifikus RNS- vagy DNS-szekvenciák nagyobb pontossággal és érzékenységgel történő kimutatását, komplementer nukleinsav-szekvenciák megkötésére való képességük alapján;

DNS klónozás: in vitro amplifikáció láncszem segítségével polimeráz reakció vagy DNS-fragmens bejuttatása egy baktériumsejtbe, amely az ilyen transzformációt követően ezt a fragmentumot milliós másolatban reprodukálja;

Rekombináns DNS bejuttatása sejtekbe vagy organizmusokba.

A géntechnológia története

A géntechnológia számos kutató munkájának köszönhetően jelent meg különböző iparágak biokémia és molekuláris genetika. Sok éven át a fehérjéket a makromolekulák fő osztályának tekintették. Még egy feltételezés is volt, hogy a géneknek van fehérje természet. Avery, McLeod és McCarthy csak 1944-ben mutatta be, hogy a DNS az örökletes információ hordozója. Ettől kezdve megkezdődött a nukleinsavak intenzív kutatása. Egy évtizeddel később, 1953-ban J. Watson és F. Crick megalkotott egy kétszálú DNS-modellt. Ezt az évet tekintik a molekuláris biológia születésének évének.

Az 50-es, 60-as évek fordulóján az ingatlanok genetikai kód, és a 60-as évek végére kísérletileg igazolták egyetemességét. Intenzíven fejlődött a molekuláris genetika, amelynek tárgyai az E. coli, annak vírusai és plazmidjai voltak. Módszereket dolgoztak ki ép DNS-molekulák, plazmidok és vírusok nagy tisztaságú preparátumainak izolálására. A vírusok és plazmidok DNS-ét biológiai úton juttatták be a sejtekbe aktív forma, biztosítva replikációját és a megfelelő gének expresszióját. A 70-es években számos enzimet fedeztek fel, amelyek katalizálják a DNS-konverziós reakciókat. Különleges szerepe a módszerek kidolgozásában génmanipuláció restrikciós enzimek és DNS ligázok közé tartozik.

A géntechnológia fejlődésének története három szakaszra osztható. Az első szakasz a rekombináns DNS-molekulák in vitro kinyerésének alapvető lehetőségének bizonyításához kapcsolódik. Ezek a munkák különböző plazmidok közötti hibridek előállítására vonatkoznak. Rekombináns molekulák létrehozásának lehetősége az eredeti DNS-molekulák felhasználásával különféle típusokés baktériumtörzsek, életképességük, stabilitásuk és működésük.

A második szakasz a prokarióták kromoszómális génjei és a különböző plazmidok közötti rekombináns DNS-molekulák megszerzésére irányuló munka kezdetéhez kapcsolódik, bizonyítva stabilitásukat és életképességüket.

A harmadik szakasz az eukarióta gének, főként állatok, vektor-DNS-molekulákba való beépítésével kapcsolatos munka kezdete (a génátvitelre használt DNS, amely képes integrálódni a befogadó sejt genetikai apparátusába).

Formálisan a géntechnológia születési dátumának 1972-et kell tekinteni, amikor a Stanford Egyetemen P. Berg, S. Cohen, H. Boyer és munkatársai létrehozták az első rekombináns DNS-t, amely az SV40 vírus, a bakteriofág és az E. coli DNS-fragmenseit tartalmazza. .

1 A genetikailag módosított enzimek fő csoportjai

A génsebészet a molekuláris genetika leszármazottja, de születését a genetikai enzimológia és a nukleinsavkémia sikereinek köszönheti, hiszen az enzimek a molekuláris manipuláció eszközei. Míg néha mikromanipulátorokkal dolgozhatunk sejtekkel és sejtszervszervekkel, a DNS- és RNS-makromolekulákkal való munka során még a legkisebb mikrosebészeti eszközök sem segítenek. Mit kell tenni? Az enzimek „szikeként”, „ollóként” és „fűzőszálként” működnek.

Csak ők találhatnak bizonyos nukleotidszekvenciákat, „vághatnak” oda egy molekulát, vagy fordítva, „befoltozhatnak” egy lyukat a DNS-láncon. Ezek az enzimek már régóta működnek a sejtekben, a sejtosztódás során DNS-replikációt (kettőzést) végeznek, a károsodások helyreállítását (a molekula integritásának helyreállítását), az olvasási és átviteli folyamatokban. genetikai információ sejtről sejtre vagy sejten belül. A génmérnök feladata, hogy olyan enzimet válasszon ki, amely teljesíti a rábízott feladatokat, azaz képes lenne dolgozni a nukleinsav egy bizonyos szakaszával.

Megjegyzendő, hogy a génsebészetben használt enzimek nem rendelkeznek fajspecifikussággal, így a kísérletező tetszőleges eredetű DNS-fragmenseket kombinálhat egyetlen egésszé a választott szekvenciában. Ez lehetővé teszi a géntechnológia számára, hogy legyőzze a természet által felállított faji akadályokat, és fajok közötti keresztezést hajtson végre.

A rekombináns DNS felépítésében használt enzimek több csoportra oszthatók:

DNS-fragmenseket termelő enzimek (restrikciós enzimek);

Olyan enzimek, amelyek DNS-t szintetizálnak DNS-templáton (polimerázok) vagy RNS-t (reverz transzkriptázok);

DNS-fragmenseket összekötő enzimek (ligázok);

Enzimek, amelyek lehetővé teszik a DNS-fragmensek végeinek szerkezetének megváltoztatását.

1.1 Restrikciós enzimek

Általánosan elfogadott, hogy a „restrikciós enzim”, „restrikciós endonukleáz” és „helyspecifikus endodezoxiribonukleáz” kifejezések szinonimák.

Minden bakteriális restrikciós endonukleáz felismer specifikus, meglehetősen rövid DNS-szekvenciákat, és kötődik hozzájuk. Ezt a folyamatot a DNS-molekula levágása kíséri magán a felismerési helyen vagy más helyen, amelyet az enzim típusa határoz meg. A restrikciós aktivitás mellett a baktériumtörzs képes metilálni a DNS-t; Ezt a folyamatot ugyanaz a DNS-szekvencia-specifitás jellemzi, mint a restrikciót. A metiláz metilcsoportokat ad az adenin- vagy citozinmaradékokhoz ugyanazon a helyen, ahol a restrikciós enzim kötődik. A metiláció következtében a hely ellenállóvá válik a restrikcióval szemben. Ezért a metiláció megvédi a DNS-t a vágástól.

A restrikciós enzimeknek 3 fő osztálya van: 1, 2 és 3.

Minden restrikciós enzim felismeri a szigorúan meghatározott szekvenciákat a kettős szálú DNS-en, de az 1. osztályú restrikciós enzimek a DNS-molekula tetszőleges pontjain törést okoznak, a 2. és 3. osztályú restrikciós enzimek pedig felismerik és hasítják a DNS-t a felismerési helyeken belül vagy egy bizonyos ponton szigorúan meghatározott pontokon. tőlük távolságra rögzített hely.

Az 1-es és 3-as típusú enzimek összetett alegység-szerkezettel rendelkeznek, és kétféle aktivitással rendelkeznek - módosító (metilező) és ATP-függő endonukleáz.

A 2. osztályba tartozó enzimek 2 különálló fehérjéből állnak: egy restrikciós endonukleázból és egy módosító metilázból, ezért csak a 2. osztályba tartozó enzimeket használják a géntechnológiában. Kofaktorként magnéziumionokat igényelnek.

Jelenleg több mint 500 2. osztályú restrikciós enzimet izoláltak, de a különféle mikroorganizmusokból izolált enzimek között vannak olyanok is, amelyek ugyanazokat a szekvenciákat ismerik fel a DNS-en. Az ilyen párokat vagy csoportokat izoschizomereknek nevezzük. Megkülönböztetik a valódi izoszkizomériát, amikor az enzimek ugyanazt a nukleotidszekvenciát ismerik fel, és ugyanazon a ponton törik meg a DNS-t, és a hamis izoszkizoméria között, amikor az enzimek a DNS ugyanazon helyét felismerve töréseket okoznak különböző pontokat ugyanazon az oldalon.

A legtöbb 2. osztályba tartozó restrikciós enzim 4-6 nukleotidpárt tartalmazó szekvenciákat ismer fel, ezért a restrikciós enzimeket kis- és nagyvágásúra osztják. A kis vágású restrikciós enzimek felismerik a tetranukleotidokat, és sokkal több törést visznek be a molekulákba, mint a nagy vágású restrikciós enzimek, amelyek hat nukleotidpárból álló szekvenciát ismernek fel. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy egy bizonyos négy nukleotidból álló szekvencia előfordulási valószínűsége sokkal nagyobb, mint egy hat nukleotidból álló szekvencia előfordulásának valószínűsége. Például a T7 bakteriofág 40 000 bázispárból álló DNS-éből hiányzik az E. coliból származó R1 restrikciós enzim által felismert szekvencia.

A restrikciós enzimek a Hpa II és az Alu (az Arthrobacter luteusból) az Eco R I kismértékben osztódó enzimek Escherichia coli) és Hind III. Ha feltételezzük, hogy a restrikciós enzim felismerő helyek véletlenszerűen oszlanak el a DNS-lánc mentén, akkor a négy nukleotidból álló szekvenciát (helyet) felismerő enzimek célpontjának átlagosan 256 bázispáronként, a hat nukleotidot felismerő enzimek esetében pedig minden 4096 bázisban kell előfordulnia. párok. Ha a restrikciós hely a gén belsejében van, akkor a DNS restrikciós enzimmel végzett kezelés a gén inaktiválásához vezet. Egy ilyen esemény valószínűsége nagyon nagy, ha kis vágású restrikciós enzimekkel kezelik, és jelentéktelen nagy vágású endonukleázok alkalmazásakor. Ezért egy ép gén kinyerése érdekében a hasítást felváltva több nagy vágású restrikciós enzimmel végezzük, vagy az „alulrestrikciós” technikát alkalmazzuk, pl. A restrikciót olyan körülmények között hajtják végre, amikor a hasítás csak egy helyen történik.

Amint azt számos tanulmány mutatja, a különféle vírusok használata nagyon hatékony megoldás, amely lehetővé teszi a szervezet immunvédelmének átjutását, majd megfertőzi a sejteket, felhasználva a vírus terjesztésére. Ennek az eljárásnak a végrehajtásához a génmérnökök a retrovírusok és adenovírusok csoportjából választották ki a legmegfelelőbb vírusokat. A retrovírusok ribonukleinsav (RNS) formájában juttatják be a genetikai információt, amely a DNS-hez hasonló molekula, amely segít feldolgozni a DNS-ben tárolt genetikai információkat. Amint lehetséges mélyen behatolni az úgynevezett célsejtbe, a DNS-molekula másolatát nyerik ki az RNS-molekulából. Ez a folyamat fordított transzkripciónak nevezik. Amint egy új DNS-molekula kapcsolódik egy sejthez, a sejt minden új másolata tartalmazza ezt a módosított gént.

Az adenovírusok genetikai információt közvetlenül hordoznak DNS formájában, amelyet egy nem osztódó sejtbe juttatnak. Habár ezek a vírusok közvetlenül a célsejt magjába juttatják a DNS-t, a DNS nem egyezik a sejt genomjával. Így a módosított gén és genetikai információ nem kerül át a leánysejtekbe. Előny génterápia Az adenovírusok felhasználásával végrehajtott gyakorlat az, hogy lehetséges géneket juttatni a sejtekbe idegrendszerés a nyálkahártyába légutak, ismét egy vektoron keresztül. Ezen kívül létezik egy harmadik génterápia módszere is, amelyet az úgynevezett adeno-asszociált vírusokon keresztül hajtanak végre. Ezek a vírusok tartalmaznak viszonylag kis mennyiségben genetikai információ, és sokkal nehezebb eltávolítani őket, mint a retrovírusokat és az adenovírusokat. Az adeno-asszociált vírusok előnye azonban, hogy nem okoznak reakciót immunrendszer személy.

Az antropogenetika genealógiai módszere

Ez a módszer a törzskönyvek összeállításán és elemzésén alapul. Ezt a módszert az ókortól napjainkig széles körben alkalmazzák a lótenyésztésben, értékes nagy vonalak kiválasztásában marhaés sertéseket, fajtatiszta kutyák beszerzésekor, valamint új prémes állatok tenyésztésekor.

Az emberi genetika vizsgálatának módszereként a genealógiai módszert csak a 20. század elejétől kezdték el alkalmazni, amikor is világossá vált, hogy a törzskönyvek elemzése, amely egy bizonyos tulajdonság (betegség) generációról generációra való átörökítését követi nyomon, az emberi genetika vizsgálatának módszere. helyettesítheti a hibridológiai módszert, amely valójában nem alkalmazható emberre.

A törzskönyvek összeállításakor az a személy - a proband - a kiindulópont, akinek a törzskönyvét tanulmányozzák. Általában ez egy beteg vagy egy bizonyos tulajdonság hordozója, amelynek öröklődését tanulmányozni kell. A törzskönyvi táblázatok összeállításakor használja szimbólumok, javasolta G. Just 1931-ben (6.24. ábra). A nemzedékeket római számokkal, az adott generáció egyedeit arab számokkal jelöljük.

A genealógiai módszerrel megállapítható a vizsgált tulajdonság öröklődése, valamint öröklődésének típusa (autoszomális domináns, autoszomális recesszív, X-hez kötött domináns vagy recesszív, Y-kapcsolt). A törzskönyvek több jellemzőre vonatkozó elemzése során feltárható az öröklődés összekapcsoltsága, amelyet a kromoszómatérképek összeállításánál használnak fel. Ez a módszer lehetővé teszi a mutációs folyamat intenzitásának tanulmányozását, az allél expresszivitásának és penetranciájának felmérését. Széles körben használják az orvosi genetikai tanácsadásban az utódok előrejelzésére. Meg kell azonban jegyezni, hogy a genealógiai elemzés lényegesen bonyolultabbá válik, ha a családok kevés gyermeket nevelnek.

Módszerek gének közvetlen sejtekbe juttatására

Egy gén sejtbe történő közvetlen bejuttatása többféle módon történik:

Transzfekció

Mikroinjekció

Elektroporáció

Mini-cellás módszer

Csomagolás liposzómákba

Elektron pisztoly

Nál nél transzfekciók A DNS kalcium-foszfát kristályokon adszorbeálódik (Graham Van der Eb, 1973). Kalciumcsapadék részecskék képződnek. A sejt fagocitózissal veszi fel őket.

A transzformáció hatékonyságának növelése érdekében egy nem specifikus DNS-hordozót adnak a specifikus DNS-hez, amely tartalmazza azt a gént, amelyre szelekciót végeznek. Jellemzően a DNS-t borjú csecsemőmirigyből vagy lazac spermájából veszik erre a célra. A DNS egy része a membránhoz kötődik, és nem jut be a sejtekbe. A DNS-t a sejtek 15-90%-a elfogadja. Néhány nappal a beadás után a sejtek kis hányada képes idegen géneket expresszálni, de ekkor az expressziós szint lecsökken, és 10 -3 - 10 -5 sejt többé-kevésbé stabil átalakuláson megy keresztül.

A DEAE-dextránt, a DNS-t adszorbeáló polimert szintén használják transzfekcióhoz. A sejtbejutási hatás és az expressziós idő magas, de a stabil transzformáció gyakorisága alacsonyabb, mint kalciumcsapadék alkalmazásakor. A transzfekció gyakoriságát növeli a glicerinsokk (4 perc 15%-os glicerines oldatban HEPES pufferben).

Bármely gén bejuttatható a sejtekbe, ha előzőleg klónozott szelektálható markerrel ligálták. További vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a sejten kívüli lekötés nem szükséges. A szelektív gént elnyelő sejtek a kalciumcsapadékban jelenlévő más DNS-t is felszívják. Így a módszer segítségével kotranszformációk, a DNS szinte bármely klónozott szegmense bevihető tenyésztett eukarióta sejtekbe, ha ezt a DNS-t egy szelektálható markerrel együtt tartalmazza a keverékben, hogy kalcium-csapadékot képezzen.

A transzfekcióhoz kromoszómák vagy kromoszómafragmensek használhatók. A donorsejtek blokkolják a mitózis szakaszában. Ozmotikus sokk és homogenizáció hatására mitotikus kromoszómák szabadulnak fel. Ezeket differenciális centrifugálással tisztítják. A kromoszómák a sejtek felszínén rakódnak le kalcium-klorid, majd néhány óra elteltével olyan reagenssel kezelik őket, amely képes áttörni a membránokat (például glicerinnel).

A recipiens sejtek feldolgozásához durván tisztított kromoszómakészítményeket használnak, mivel a kromoszómák semmisülnek meg a legkevésbé. Az 1 sejt feldolgozásához szükséges kromoszómák száma korlátozott. Jobb, ha 1 befogadó sejtenként legfeljebb 20 kromoszómát használunk, mióta magas koncentrációk Szuszpenzióban agglutinálják a kromoszómákat. A recipiens sejt donor kromoszómák fragmenseit tartalmazza, amelyek beépülhetnek a genomba, és függetlenül replikálódnak. A bevitt töredékekben gyakran deléciók figyelhetők meg.

Nem minden sejt képes nagy frekvencián transzformálni a genomiális DNS-t. A humán fibroblasztok hatékonyan építik be a plazmid DNS-t, és alig építenek be genomi DNS-t.

DNS mikroinjekció emlőssejtekbe a 0,1-0,5 mikron átmérőjű mikropipetták gyártására alkalmas készülék és a mikromanipulátor megjelenésével vált lehetővé (45. ábra). Így a herpeszvírus timidin-kináz (TK) gént és pBR322 plazmidot tartalmazó plazmidokat injektáltunk TK - sejtekbe, és kimutatták, hogy a TK - gén behatol a sejtmagokba és normálisan replikálódik bennük. A DNS mikroinjekcióval történő bejuttatásának módszerét Anderson és Diakoumacos fejlesztette ki a 70-es évek elején. Elvileg jó felszereléssel 1 óra alatt 500-1000 sejt injektálható, és a legjobb kísérletekben a sejtek 50%-ában figyelhető meg a beinjektált gének stabil integrációja, expressziója. A leírt módszer előnye az is, hogy lehetővé teszi bármilyen DNS bejuttatását bármely sejtbe, és nincs szükség szelektív nyomásra a bejuttatott gén sejtekben való megtartásához.

Rizs. 45. DNS bejuttatása mikroinjekcióval

Elektroporáció azon alapul, hogy a nagyfeszültségű impulzusok reverzibilisen növelik a biomembránok permeabilitását. A sejtekbe juttatandó sejteket és DNS-fragmenseket az elektroporációs táptalajhoz adjuk (46. ábra). A nagyfeszültségű impulzusok (feszültség 200-350 V, impulzus időtartama 54 ms) áthaladnak a közegen, ami pórusok kialakulásához (elektromos lebomlás) vezet a citoplazmában. plazma membrán, amelynek élettartama és mérete elegendő a makromolekulák, például a DNS számára külső környezet ozmotikus erők hatására bejutnak a sejtbe. Ugyanakkor a sejt térfogata növekszik.

Az elektromos térerősséget és hatástartamát, a transzformáló DNS koncentrációját és a recipiens sejteket az egyes sejtrendszerekhez kísérleti úton választják ki annak érdekében, hogy a túlélő sejtek magas százalékos DNS-abszorpciót érjenek el. Kimutatták, hogy optimális elektroporációs körülmények között a transzformánsok száma elérheti a túlélő sejtek 80%-át.

Az elektroporáció inkább fizikai, mint biokémiai módszer, és úgy tűnik, ezért használják széles körben. Számos tanulmány kimutatta, hogy az elektroporáció sikeresen alkalmazható DNS-molekulák különböző típusú sejtekbe, például tenyésztett állati sejtekbe, protozoákba, élesztőgombákba, baktériumokba és növényi protoplasztokba történő bejuttatására. A kétrétegű lipidmembránon a nagyfeszültségű kisülés elektroporációs hatása a görbületi sugarától függ. Ezért a kis baktériumsejtek sokkal nagyobb feszültségen (10 kV/cm vagy több) hatékonyan szívják fel a DNS-t, mint a nagy állatok és növényi sejtek, hatékonyan elnyeli a DNS-t 1-2 kV/cm térerősség mellett.

Az elektroporáció a legegyszerűbb, leghatékonyabb és reprodukálható módszer a DNS-molekulák sejtekbe való bejuttatására. Ezt a módszert azonban egészen a közelmúltig korlátozott számú laboratóriumban alkalmazták a soros eszközök - elektroporátorok - hiánya miatt. Az ilyen eszközök megjelenése és fejlesztése az elkövetkező években ahhoz vezet, hogy széles körű alkalmazás ez a megközelítés a géntechnológiában a leginkább különböző típusok sejteket.

Rizs. 46. ​​Elektroporációs módszer

"Mini cellák" mitózisban lévő donorsejtek colcemiddel történő blokkolásával nyerték. A sejtek hosszan tartó colcemid-kezelésével minden kromoszóma körül új nukleáris membrán képződik. A citokalazin B-vel végzett kezelés és a centrifugálás a citoplazma membránba kapszulázott mikronukleuszokat képviselő minisejtek kialakulásához vezet.

A keletkező minisejtek nagyon érzékenyek a különféle fajták befolyásolja, ezért az összevonáshoz speciálisakat választanak ki enyhe körülmények. A módszer nehéz, szeszélyes, alacsony hatékonyságú - 10 -6 - 10 -7.

Csomagolás liposzómákba exogén genetikai anyag védelmére használják a restrikciós enzimek pusztító hatásaitól.

A liposzómák gömb alakú héjak, amelyek foszfolipidekből állnak. Ezeket a keverék éles rázásával kapják vizesoldatés lipidek, vagy foszfolipidek vizes emulzióinak ultrahangos kezelésével. A foszfatidil-szerinből és koleszterinből álló liposzómák a legalkalmasabbak DNS állati és növényi sejtekbe történő bejuttatására. A liposzómatranszfer rendszerek alacsony toxicitásúak a sejtekre.

A biológiai ballisztika módszere (biolisztika) ma az egyik leghatékonyabb módszer a növények, különösen az egyszikűek átalakítására.

A módszer lényege, hogy a transzformációhoz szükséges génkonstrukciót tartalmazó vektor-DNS-t apró, 0,6-1,2 mikron átmérőjű volfrámszemcsékre permetezzük. A DNS-t hordozó volfrámrészecskéket celofán szubsztrátumra visszük, és egy biolisztikus pisztolyba helyezzük. A kallusz- vagy sejtszuszpenziót Petri-csészére agar tápközeggel visszük fel, és biolisztikus pisztoly alá helyezzük 10-15 cm távolságra. A pisztolyban lévő nyomást vákuumszivattyúval 0,1 atm-re csökkentjük. Abban a pillanatban, amikor a nyomás felszabadul, a volfrámrészecskék óriási sebességgel kilökődnek a biolisztikus pisztolyból, és szakadnak. sejtfalak, bejutnak a sejtek citoplazmájába és magjába.

Jellemzően a közvetlenül a központban elhelyezkedő sejtek a volfrámrészecskék hatalmas száma és nyomása miatt pusztulnak el, míg a legsikeresebben transzformált sejtek a központtól 0,6-1 cm-re lévő zónában helyezkednek el. Ezután a sejteket óvatosan átvisszük a táptalajba további tenyésztés és regenerálás céljából.

Biolisztikus pisztoly segítségével egyszikű növényeket, például kukoricát, rizst, búzát és árpát transzformáltak. Ebben az esetben stabil transzformáns növényeket kaptunk. A transzgénikus egyszikűek kinyerésének sikere mellett a biolisztikus transzformációt a DNS közvetlen embriogén pollenbe történő átvitelére és az ezt követő transzgenikus dihaploid növények gyors termelésére használják, ami fontos lépés a nemesítési munkában. Jelenleg a dohánynövények transzformációját ezzel a módszerrel hajtják végre, és a haploid növények regenerálása után stabil transzformánsokat kaptak.

A sejtekbe történő génbejuttató rendszerek egyik legígéretesebb lehetősége a poliplexek - transzferált DNS és különböző természetű kationos polimerek komplexei. Ez a cikk ismerteti a többféle kationos polimeren alapuló poliplexek tulajdonságait, a célsejtek sejtmagjaiba való transzportjukat, valamint a kezelés egyik módszerét. rosszindulatú daganatok ezen struktúrák felhasználásával.

Bevezetés

A génterápia az örökletes, onkológiai és egyéb betegségek kezelése a szükséges genetikai anyag bejuttatásával a páciens sejtjeibe annak érdekében, hogy specifikusan megváltoztassák a génhibákat vagy új funkciókat adjanak a sejteknek [Gorbunova et al., 1997]. A DNS vagy RNS célsejtekhez való eljuttatásához hordozókat (vektorokat) hoznak létre, amelyek biztosítják magas szint transzfekciók, azaz exogén (idegen) DNS vagy RNS átvitele bizonyos típusú sejtekbe. Emellett a vektoroknak biztosítaniuk kell a genetikai információ védelmét, mert In vivo körülmények között az idegen DNS instabil a szérum nukleázok, a nukleinsavakat lebontó enzimek általi gyors lebomlás miatt.

A genetikai anyag transzporterek típusai

A természetben léteznek speciális struktúrák a genetikai információ sejtekbe - vírusok -ba való eljuttatására. Ezért kezdték géntranszporterként használni őket. Ugyanakkor a vírusvektorok használata igen egész sor korlátozásokat. Először is, ez az átvitt genetikai anyag kis kapacitása és a vírusok eredendő sejtspecifitása. Másodszor, ez annak a lehetősége, hogy a vírusok visszatérjenek a vad típusba a rekombináció eredményeként az azonos típusú fertőzés áthaladása során. Harmadszor, a vírusrészecskék fehérjéi erősen immunogének, ennek következtében ismételt beadásuk immunválaszt vált ki. Végül, tömegtermelés A vírusvektorok még mindig meglehetősen problematikusak és költségesek. Jelenleg aktív fejlesztés alatt áll különféle lehetőségeket kationos lipideken és kationos polimereken alapuló nem vírusos hordozók. Ezek a kationos molekulák elektrosztatikus kölcsönhatások révén képesek spontán önszerveződő nanokomplexeket képezni egy negatív töltésű DNS-molekulával. A kationos lipidekből és DNS-ből álló komplexeket lipoplexeknek és a DNS-ből álló komplexeket poliplexeknek nevezzük.

Kationos polimerek, amelyeket poliplexek létrehozására használnak

Számos kationos polimert vagy polikationt javasoltak génterápia és biotechnológia céljaira. A polikációk a DNS-t kompakt nanokomplexekké kondenzálják, biztosítva a DNS stabilitását és védelmet a nukleázokkal szemben. DNS-kötő polimerként kationos fehérjék, aminosavak szintetikus homopolimerei (polilizinek, poliargininek), kitozán poliszacharid, polietilénimin, dendrimerek szolgálhatnak. különböző összetételűés egyéb módosított polimerek. A DNS tömörítés mértékét a komplex teljes töltése határozza meg, ami viszont a mennyiség arányától függ. pozitív csoportok polimereket a DNS negatív foszfátcsoportjainak számához. Jellemzően a poliplexek összetételében a polikation feleslegben van jelen, ennek eredményeként nanoméretű (több tíz-több száz nm-es) komplexek keletkeznek, amelyek vízben oldódnak és pozitív töltésűek (1., 2. ábra). ). Ellenkező esetben a komplexek instabilok lesznek.

Rizs. 1. Kationos polimerekből és cirkuláris DNS-molekulából (plazmidból) poliplexek képződésének vázlata. Rizs. 2. Transzmissziós elektronmikroszkóppal (200 nm-es skálaosztás) nyert poliplexek képe egy hordozón.

Az egyik első génszállításra használt polikation a poli-L-lizin volt (PL, 3. ábra), amely peptid jellegéből adódóan biológiailag lebontható, ami rendkívül kényelmessé teszi in vivo alkalmazását. Gyakran megszüntetésére nem kívánt hatások kapcsolatos nagy sűrűségű felületi töltet esetén PL és polietilénglikol (PEG) kopolimerjét használjuk. A módosítás eredményeként a komplex felületi töltése csökken, ami megakadályozza a negatív töltésű szérumfehérjék nem specifikus adszorpcióját a poliplexeken, valamint csökkenti a komplexek citotoxicitását.

A polietilén-imint (PEI, 3. ábra) tartják az egyik legígéretesebb lehetőségnek a polikationok számára az ezen alapuló poliplexek létrehozására. A PEI-t két formában szintetizálják: lineáris és elágazó. A PEI rendelkezik nagy mennyiség protonálódásra képes amino- és iminocsoportok, melynek eredményeként pufferelő tulajdonságokat mutat, amikor élettani állapotok. A PEI-n alapuló poliplexeket a többi polikationhoz képest hatékonyabb transzfekció és a nukleázok hatásával szembeni védelem jellemzi, ami a PEI-en lévő nagy töltéssűrűséggel és kompaktabb DNS-foldinggel jár. Az erős pozitív töltés a PEI toxicitásához vezet, ami a PEI biológiai lebomlásának hiányával együtt korlátozó tényezők a PEI in vivo alkalmazásában. A citotoxicitás csökkentése érdekében a PEI-t polietilénglikollal módosítják, amely alacsony toxicitású és magas hidrofilitású.

Rizs. 3. Poliplexek létrehozására használt kationos polimerek, ill.

A genetikai információ továbbításában használt polikationok másik képviselője a poliamidoaminok (PAMAM, 3. ábra). Ezek a vegyületek erősen elágazó dendrimerek. Az elágazásnak köszönhetően a PAMAM-ok nagy rugalmassággal rendelkeznek, jobban tömörítik a DNS-t, a rájuk épülő poliplexek pedig stabilabbak, mint az összes többi. Tulajdonságai sok hasonlóságot mutatnak a PEI-vel.

A kitozánok (3. ábra) D-glükózaminból és N-acetil-D-glükózaminból (1>4) glikozidos kötésekkel összekapcsolt poliszacharidok. A molekulatömegtől és a dezacetilezés mértékétől függően a kitozánok különböző méretű stabil komplexeket képeznek az átvitt DNS-sel. A kicsi, vagy fordítva, a túl nagy kitozán polimerek az átvitt gén expressziójának csökkenéséhez vezetnek. A kitozán alapú poliplexek fő előnye a biológiai lebonthatóság.

A poliplexek szállítási hatékonyságát számos tényező befolyásolja: a molekulatömeg, az elágazás mértéke, a polimerizáció és a polimer típusa, a szemcseméret, az oldat ionerőssége, a komplexek felületi töltése, valamint a kísérleti körülmények. Az optimális megközelítésnek figyelembe kell vennie ezen tényezők mindegyikét, valamint ezek hatását a komplex tulajdonságaira, a komplexek célsejtek általi felvételére és a toxicitásra.

Számos megközelítés létezik a poliplexek célsejtekre gyakorolt ​​hatásának specifitásának biztosítására. Az egyik a nanokomplexek célzott szállítása bizonyos típusú sejtekhez. Ez a megközelítés komponensek (ligandumok) poliplexekhez való hozzáadásával jár, amelyek receptorai igen Nagy mennyiségű jelen vannak a célsejtek felszínén. Különféle fehérjéket, cukrokat, peptideket, antitesteket stb. használnak specifikus ligandumként. Egy másik stratégia az, hogy transzportálható géneket használnak, amelyek csak bizonyos sejtekben lennének aktívak, míg a komplexek szállítása nem specifikusan történik, azaz bármely sejtbe.

A poliplexek behatolása a célsejtekbe

A genetikai anyag bejuttatásának folyamata két szakaszból áll: extracelluláris (út az injekció helyétől a célsejtekig) és intracelluláris (kölcsönhatás a célsejtekkel, endocitózis, kilépés az endoszómákból, szállítás a sejtmagba). Intracelluláris utak A poliplexek transzportját a 4. ábra mutatja be.

Az első akadály, amelyet a polyplexnek le kell győznie a célsejt felé vezető úton, a vér és az extracelluláris mátrix. Éppen ezért szükséges a komplex olyan fizikai-kémiai paramétereinek kiválasztása, hogy növeljük a stabilitást, elkerüljük a nem specifikus kölcsönhatásokat és az immunválasz lehetőségét. Először is, a poliplexben lévő DNS-t védeni kell az extracelluláris nukleázok hatásától. Másodszor, a negatív töltésű vérszérum fehérjék (albumin, fibrinogén, immunglobulinok stb.), valamint az extracelluláris mátrix fehérjéi (kollagének) képesek adszorbeálódni a töltött nanokomplexek felületén, ami a sejt felületi töltésének megváltozásához vezet. a poliplexek, ami a komplexek méretének növekedéséhez és aggregációjukhoz vezet. Amikor a poliplexek bekerülnek a szervezetbe, részben felhalmozódnak a szövetekben, és fagocitózison mennek keresztül. Ezen okok miatt gyakran alkalmazzák a poliplexek lokális beadását (például rákos daganatok esetén) a szöveti sejtekkel való nem specifikus kölcsönhatásuk alapján.

Rizs. 4. A poliplexek transzportjának intracelluláris útvonalai.

A poliplexek először a plazmamembránon adszorbeálódnak, endocitózissal veszik fel, majd el kell hagyniuk az endolizoszómákat, és át kell haladniuk a nukleáris burkon, hogy bejussanak a sejtmagba. Vannak alternatív szállítási utak is, amelyek nem mindig vezetnek komplexek eljuttatásához a sejtmagba. Ezenkívül az átvitt gén kifejeződése megköveteli a poliplex disszociációját kationos polimerré és szabad DNS-sé.

A genetikai anyag célsejtekhez való eljuttatásának következő szakasza a plazmamembránnal való kölcsönhatás és a sejt általi felszívódás. Amint fentebb megjegyeztük, a poliplexek kötődése a sejtekhez ligandum hiányában nem specifikusan a negatív töltésű plazmamembránnal való elektrosztatikus kölcsönhatás eredményeként megy végbe. A legtöbb esetben az ilyen poliplexeket nem specifikus adszorptív endocitózis szívja fel. Egy ligandum komplexbe történő beépítésével a felvétel klatrin-függő receptor által közvetített endocitózison keresztül érhető el. Egyéb felvételi utak a sejttípustól függenek, ide tartozik a fagocitózis és a caveolin-függő endocitózis. A poliplexek sejtbejuttatásának javítására szolgáló egyik stratégia magában foglalja a vírusbejutási peptidek, például a HIV-1 vírusból először izolált TAT peptidek alkalmazását. Ezeknek a szekvenciáknak a használata biztosítja, hogy a konstrukciók belépjenek a sejtbe, és a poliplexeket a sejtmagba szállítsák.

A poliplexek transzportútjának egyik legfontosabb szakasza az endoszómákból való kilépés. Mint ismeretes, az endoszómák csövekből és vezikulákból álló rendszer, amely az abszorbeált makromolekulák szétválogatásához szükséges. A szortírozó endoszómák közelebb helyezkednek el a plazmamembránhoz. Munka miatt protonpumpák pH-juk csökken (körülbelül 6,5 a szortírozó endoszómákban). A további transzport történhet az újrahasznosítási útvonalon az abszorbeált molekulák extramembrán térbe jutásával, vagy a lítikus úton, amikor a késői endoszómákban a környezet további savasodása következik be, és a makromolekulák bejutnak a lizoszómákba. A lizoszómák tartalmát pH 5-re savanyítják, és az elnyelt molekulákat hidrolitikus enzimek lebontják, amelyek alacsony pH-n aktiválódnak. A bomlástermékeket exocitózissal távolítják el a sejtből, vagy a citoplazmába juttatják, ahol építőanyagként használják fel.

Úgy tartják, hogy a PEI-alapú poliplexek tulajdonságaiknál ​​fogva az úgynevezett „protonszivacs-effektus” révén képesek kilépni az endoszómákból. Ez a hipotézis azon alapul, hogy a kationos polimerek a protonálatlan szekunder és tercier aminok jelenléte miatt pufferhatást hoznak létre, melynek eredményeként a protonokat endoszómákba pumpáló H±ATPáz aktívabban kezd működni. Ebben az esetben a klór anionok felhalmozódnak az endoszómák belsejében. Ennek eredményeként, mivel éles növekedés ozmotikus nyomás duzzanat és lízis lép fel, lehetővé téve a poliplexek ép bejutását a citoszolba. Egy másik mechanizmust javasoltak az endoszómákból való kilépésre a poliplexeknél, amely magában foglalja az endoszómális membrán destabilizálódását a nanokomplexek nagy felületi töltéssűrűsége miatt. A PL és kitozán alapú komplexek nem okozzák a „protonszivacs” hatást, és kevésbé képesek destabilizálni az endoszóma membránt, ami sokkal alacsonyabb transzfekciós hatékonyságot eredményez.

A lizoszómák elhagyása után a poliplexek a perinukleáris térben találják magukat, majd a komplex szabad polikationná és DNS-sé disszociál. Úgy gondolják, hogy ez a DNS foszfátcsoportjai és a citoplazma kis molekulatömegű vegyületek és anionjai közötti kationos csoportok közötti versengés miatt következik be. Egyes esetekben a komplex disszociációja nyilvánvalóan a sejtmagban történik. A plazmid DNS sejtmagba jutásának fő akadálya a kettős nukleáris burok. A makromolekulák sejtmagba juttatásához tartalmaznak egy nukleáris lokalizációs szekvenciát (NLS), amelyet α- és β-importinokkal kombinálva a nukleáris póruskomplex (NPC) felismer, és aktívan behatol a sejtmagba. Csak kis molekulák tudnak átjutni az NPC-n passzív diffúzióval (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Terápiás gének hatásmechanizmusai

Miután a plazmid belép a sejtmagba, megkezdődik a terápiás gén expressziója. A poliplexek hatásának specifitása érdekében a plazmidban lévő terápiás gént egy promoter (a gén azon régiója, amelyen az RNS-polimeráz a transzkripció előtt landol) irányítása alá helyezzük, amely csak a tumorszövetekben aktív. A példák közé tartozik az anti-apoptotikus survivin fehérje génjének promótere vagy a telomeráz enzim génje. A herpes simplex vírus timidin-kináz (HSVtk) génje, amely képes foszforilálni az acyclovir és ganciklovir herpeszellenes vegyületeket, terápiás génként használható. Ezeket a vegyületeket bizonyos idő elteltével a daganatba fecskendezik. Ezután a celluláris kinázok (foszforiláló enzimek) a foszforilált acyclovirt vagy ganciklovirt trifoszfátokká alakítják, amelyek a sejtosztódás során a megkettőződés során beépülhetnek az újonnan szintetizált DNS-be, és leállítják annak szintézisét. Ennek eredményeként azok a sejtek, amelyek magjába a timidin-kináz gén bejutott, ezen anyagok jelenlétében elpusztulnak. Ebben az esetben az osztódó sejtek pusztulnak el, és nem a nyugvó sejtek, amelyek nem szintetizálnak DNS-t, és nem tartalmaznak ganciklovirt vagy aciklovirt. A terápiás génnek ez a hatásmechanizmusa felhasználható olyan rákos daganatok génterápiájában, amelyek sejtjei gyorsan osztódnak.

Bibliográfia:

1. Gorbunova V.N., Baranov V.S. Bevezetés az örökletes betegségek molekuláris diagnosztikájába és génterápiájába. S.-Pb., „Speciális irodalom”, 1997, 287. o.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. A génszállításhoz kondenzált DNS nanoszkopikus szerkezete. //Nucl. Savak. Res., 1997, vol. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. A polimer génszállító rendszerek jelenlegi állapota. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, vol. 58, 467–486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. és Stayton P. S. Polimerek tervezése és fejlesztése génszállításhoz. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4,581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. A plazmid DNS intracelluláris útválasztása nem vírusos géntranszfer során. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, vol. 57, 755–767.
6. Maxfield F.R. és McGraw T.E. Endocita újrahasznosítás. // Nature Rev. Mol. Sejt. Biol., 2004, vol. 5, 121–132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. és Topal M.D. Aciklikus, didezoxi- és ara nukleotidok beépítése és kiterjesztése herpesviridae, humán alfa és humán béta polimerázok által. J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 3898–3904.

Durimanov Mihail, a Moszkvai Állami Egyetem Biológiai Karának hallgatója

A cikk a Lomonoszov 2009 konferencia népszerű tudományos versenyének díjazottja (Biológiai Kar, „Nanobiotechnológia”, „Biomérnöki”, „Biofizika”).

A Kaliforniai Egyetem (Irvine) tudósai által Dr. Peter Donovan irányítása alatt kifejlesztett technika, amely az embrionális őssejtek manipulálására szolgáló két ismert módszer kombinációján alapul, megkétszerezi az emberi embrionális őssejtekbe történő DNS-szállítás hatékonyságát.

A DNS hESC-kbe kémiai transzfekcióval, nukleofekcióval és elektroporációval történő bevitelének modern módszereinek komoly hátránya van - alacsony hatékonyság. A genetikai anyag vírusfertőzéssel történő eljuttatása a hESC-kbe hatékonyabb, de számos nemkívánatos következménnyel jár az őssejtekre nézve, és orvosi szempontból nem nevezhető teljesen biztonságosnak, ha a sejteket további transzplantációra szánják.

Egy új technika, amely egyetlen őssejt nukleofekciójának és a létrejövő transzgenikus telepek kiválasztására szolgáló optimalizált módszer kombinációján alapul, biztosítja a transzgének időben történő és stabil expresszióját a sejtekben. A nukleofekció magában foglalja a pórusok kialakulását a sejtmembránban elektromos impulzusok segítségével, és ezt követően a DNS-t a sejtbe.

A módosító DNS-konstrukció az érdeklődésre számot tartó gén mellett tartalmaz egy gént, amely lehetővé teszi a transzformált sejt könnyű nyomon követését, például a humanizált Renilla zöld fluoreszcens fehérjét (hrGFP) kódoló gént. Ez a sejtjelölési módszer lehetővé teszi a transzformált sejtek mozgásának megfigyelését, amikor azokat állatokba ültetik át.

Ez a módszer potenciálisan hasznos lehet olyan monogén betegségek kezelésére, amelyeket egy beteg ember összes sejtjében egy gén mutációi okoznak. Az Egészségügyi Világszervezet szerint több mint 10 000 emberi betegség monogén jellegű. Világszerte emberek milliói szenvednek monogén betegségekben, amelyek közé tartozik a Huntington-kór, a sarlósejtes vérszegénység, a hemofília és a cisztás fibrózis.

Az új módszer kibővíti a hES-sejtek manipulálásának lehetőségeit, lehetővé téve az emberi betegségek modellezését és a megfelelő gyógyszerek megtalálását. Ezzel a technikával a tudósok képesek lesznek korrigálni az őssejtek genetikai rendellenességeit, és egészséges sejteket használni a regeneratív gyógyászatban.

A hrGFP zöld fluoreszcens fehérjéket expresszáló hES sejtek kolóniája.

Hohenstein KA et al. A „Nucleofection Mediates High-efficiency Stable Gene Knockdown and Transgene Expression in Human Ebryonic Stem Cells” című kiadvány elérhető a folyóirat online változatában Őssejtek 2008. március 6. óta.