Livrarea de ADN și ARN recombinant în celulă. Livrarea genelor într-o celulă Metode de introducere a ADN-ului într-o celulă

Introducere

1 Principalele grupe de enzime modificate genetic

1.1 Enzime de restricție

1.1.1 Mecanismul de acțiune al enzimelor de restricție

1.1.2 Construirea hărților de restricții

1.3 Ligaze

2 Introducerea unei noi gene într-o celulă

2.1 Reglarea expresiei genelor la procariote

2.2 Metode de introducere directă a unei gene într-o celulă

2.3 Introducerea genelor în celulele de mamifere

2.4 Transformarea genetică a celulelor somatice de mamifere

2.5 Terapia genică

2.6 Producția de animale transgenice

Concluzie

Bibliografie

Introducere

Inginerie genetică - construcția in vitro a structurilor genetice active funcțional ( ADN recombinat), sau altfel - crearea de programe genetice artificiale (Baev A. A.). Potrivit lui E. S. Piruzyan, ingineria genetică este un sistem de tehnici experimentale care fac posibilă construirea de structuri genetice artificiale în laborator (in vitro) sub formă de așa-numite molecule de ADN recombinant sau hibrid.

Vorbim despre construcția dirijată, conform unui program prestabilit, a sistemelor genetice moleculare în afara corpului cu introducerea lor ulterioară într-un organism viu. În acest caz, ADN-ul recombinant devine parte integrantă aparatului genetic al organismului receptor și îi conferă noi proprietăți genetice, biochimice și apoi fiziologice unice.

Scopul ingineriei genetice aplicate este de a proiecta astfel de molecule de ADN recombinant care, atunci când sunt introduse în aparatul genetic, ar oferi corpului proprietăți utile oamenilor.

Tehnologia ADN recombinant folosește următoarele metode:

Scindarea specifică a ADN-ului prin nucleaze de restricție, accelerând izolarea și manipularea genelor individuale;

Secvențierea rapidă a tuturor nucleotidelor unui fragment de ADN purificat, care vă permite să determinați limitele genei și secvența de aminoacizi codificată de aceasta;

Construcția ADN-ului recombinant;

Hibridizare acizi nucleici, permițând detectarea unor secvențe specifice de ARN sau ADN cu o mai mare acuratețe și sensibilitate, pe baza capacității lor de a lega secvențe complementare de acid nucleic;

Clonarea ADN-ului: amplificare in vitro folosind legături de lanț reacția polimerazei sau introducerea unui fragment de ADN într-o celulă bacteriană, care, după o astfel de transformare, reproduce acest fragment în milioane de copii;

Introducerea ADN-ului recombinat în celule sau organisme.

Istoria ingineriei genetice

Ingineria genetică a apărut datorită muncii multor cercetători în diferite industrii biochimie și genetică moleculară. Timp de mulți ani, proteinele au fost considerate clasa principală de macromolecule. A existat chiar și o presupunere că genele au natura proteică. Abia în 1944, Avery, McLeod și McCarthy au arătat că ADN-ul este purtătorul de informații ereditare. Din acest moment, a început studiul intensiv al acizilor nucleici. Un deceniu mai târziu, în 1953, J. Watson și F. Crick au creat un model ADN dublu catenar. Acest an este considerat a fi anul nașterii biologiei moleculare.

La cumpăna anilor 50-60, proprietățile lui cod genetic, iar până la sfârșitul anilor ’60 universalitatea sa a fost confirmată experimental. A existat o dezvoltare intensivă a geneticii moleculare, ale cărei obiecte erau E. coli, virusurile și plasmidele sale. Au fost dezvoltate metode pentru izolarea preparatelor înalt purificate de molecule de ADN intacte, plasmide și virusuri. ADN-ul virusurilor și plasmidelor a fost introdus biologic în celule formă activă, asigurând replicarea acesteia și exprimarea genelor corespunzătoare. În anii 70, au fost descoperite o serie de enzime care catalizează reacțiile de conversie a ADN-ului. Rol deosebit în dezvoltarea metodelor Inginerie genetică aparține enzimelor de restricție și ADN ligazelor.

Istoria dezvoltării ingineriei genetice poate fi împărțită în trei etape. Prima etapă este asociată cu demonstrarea posibilității fundamentale de obținere a moleculelor de ADN recombinant in vitro. Aceste lucrări se referă la producerea de hibrizi între diferite plasmide. Posibilitatea de a crea molecule recombinante folosind moleculele originale de ADN din tipuri variateși tulpini bacteriene, viabilitatea, stabilitatea și funcționarea acestora.

A doua etapă este asociată cu începerea lucrărilor de obținere a moleculelor de ADN recombinant între genele cromozomiale ale procariotelor și diverse plasmide, dovedind stabilitatea și viabilitatea acestora.

A treia etapă este începutul lucrărilor privind includerea genelor eucariote, în principal animale, în moleculele de ADN vector (ADN utilizat pentru transferul de gene și capabil să fie integrat în aparatul genetic al celulei primitoare).

Formal, data de naștere a ingineriei genetice ar trebui luată în considerare 1972, când la Universitatea Stanford P. Berg, S. Cohen, H. Boyer și colegii au creat primul ADN recombinant care conține fragmente de ADN ale virusului SV40, bacteriofag și E. coli .

1 Principalele grupe de enzime modificate genetic

Ingineria genetică este un descendent al geneticii moleculare, dar își datorează nașterea succeselor enzimologiei genetice și chimiei acizilor nucleici, deoarece enzimele sunt instrumentele manipulării moleculare. Deși uneori putem lucra cu celule și organele celulare folosind micromanipulatoare, chiar și cele mai mici instrumente microchirurgicale nu vor ajuta atunci când lucrăm cu macromolecule de ADN și ARN. Ce să fac? Enzimele acționează ca un „bisturiu”, „foarfece” și „ață pentru cusătură”.

Numai ei pot găsi anumite secvențe de nucleotide, pot „taia” o moleculă acolo sau, dimpotrivă, pot „petice” o gaură într-un lanț de ADN. Aceste enzime funcționează în celule de mult timp, efectuând lucrări privind replicarea (dublarea) ADN-ului în timpul diviziunii celulare, repararea daunelor (restaurând integritatea moleculei), în procesele de citire și transfer. informația genetică de la celulă la celulă sau în interiorul unei celule. Sarcina unui inginer genetic este să selecteze o enzimă care să îndeplinească sarcinile atribuite, adică să poată lucra cu o anumită secțiune de acid nucleic.

Trebuie remarcat faptul că enzimele utilizate în inginerie genetică sunt lipsite de specificitate de specie, astfel încât experimentatorul poate combina fragmente de ADN de orice origine în secvența pe care o alege într-un singur întreg. Acest lucru permite ingineriei genetice să depășească barierele speciilor stabilite de natură și să efectueze încrucișări interspecifice.

Enzimele utilizate în construirea ADN-ului recombinant pot fi împărțite în mai multe grupuri:

Enzime care produc fragmente de ADN (enzime de restricție);

Enzime care sintetizează ADN pe o matriță ADN (polimeraze) sau ARN (reverse transcriptaze);

Enzime care conectează fragmente de ADN (ligaze);

Enzime care permit modificări ale structurii capetelor fragmentelor de ADN.

1.1 Enzime de restricție

Este în general acceptat că termenii „enzimă de restricție”, „endonuclează de restricție” și „endodezoxiribonuclează specifică locului” sunt sinonimi.

Toate endonucleazele de restricție bacteriene recunosc secvențe de ADN specifice, destul de scurte și se leagă de ele. Acest proces este însoțit de tăierea moleculei de ADN fie la locul de recunoaștere în sine, fie la un alt loc, care este determinat de tipul de enzimă. Alături de activitatea de restricție, tulpina bacteriană are capacitatea de a metila ADN-ul; Acest proces este caracterizat de aceeași specificitate a secvenței ADN ca și restricția. Metilaza adaugă grupări metil la resturile de adenină sau citozină în același loc unde se leagă enzima de restricție. Ca urmare a metilării, locul devine rezistent la restricție. Prin urmare, metilarea protejează ADN-ul de a fi tăiat.

Există 3 clase principale de enzime de restricție: 1, 2 și 3.

Toate enzimele de restricție recunosc secvențe strict definite pe ADN-ul dublu catenar, dar enzimele de restricție de clasa 1 fac pauze în puncte arbitrare ale moleculei de ADN, iar enzimele de restricție de clasa 2 și 3 recunosc și scindează ADN-ul în puncte strict definite din situsurile de recunoaștere sau la un locație fixată de la distanța lor.

Enzimele de tipurile 1 și 3 au o structură complexă de subunități și au două tipuri de activități - de modificare (metilare) și endonuclează dependentă de ATP.

Enzimele de clasa 2 constau din 2 proteine ​​separate: o endonuclează de restricție și o metilază modificatoare; prin urmare, numai enzimele de clasa 2 sunt utilizate în inginerie genetică. Au nevoie de ioni de magneziu ca cofactori.

În prezent, au fost izolate peste 500 de enzime de restricție de clasa 2, dar printre enzimele izolate de la diverse microorganisme, se numără cele care recunosc aceleași secvențe pe ADN. Astfel de perechi sau grupuri se numesc izoschizomeri. Se face o distincție între isoschisomerism adevărat, când enzimele recunosc aceeași secvență de nucleotide și rup ADN-ul în aceleași puncte și isoschisomerism fals, când enzimele, recunoscând același loc pe ADN, fac rupturi la puncte diferite in cadrul aceluiasi site.

Majoritatea enzimelor de restricție de clasa 2 recunosc secvențe care conțin de la 4 până la 6 perechi de nucleotide, prin urmare enzimele de restricție sunt împărțite în tăieturi mici și mari. Enzimele de restricție cu tăieturi mici recunosc tetranucleotidele și introduc mult mai multe pauze în molecule decât enzimele de restricție cu tăieturi mari, care recunosc o secvență de șase perechi de nucleotide. Acest lucru se datorează faptului că probabilitatea de apariție a unei anumite secvențe de patru nucleotide este mult mai mare decât cea a unei secvențe de șase nucleotide. De exemplu, ADN-ului bacteriofagului T7, constând din 40.000 de perechi de baze, nu are o secvență recunoscută de enzima de restricție R1 din E. coli.

Enzimele de restricție Hpa II și Alu (de la Arthrobacter luteus) sunt cele cu diviziune mică; Eco R I (din Escherichia coli) și Hind III. Dacă presupunem că situsurile de recunoaștere a enzimelor de restricție sunt distribuite aleatoriu de-a lungul lanțului ADN, atunci ținta pentru enzimele care recunosc o secvență (situs) de patru nucleotide ar trebui să apară în medie o dată la 256 de perechi de baze, iar pentru enzimele care recunosc șase nucleotide - la fiecare 4096 de baze. perechi. Dacă locul de restricție se află în interiorul genei, atunci tratamentul cu enzima de restricție ADN va duce la inactivarea acesteia. Probabilitatea unui astfel de eveniment este foarte mare atunci când este tratată cu enzime de restricție cu tăieturi mici și nesemnificativă când se utilizează endonucleaze cu tăieturi mari. Prin urmare, pentru a obține o genă intactă, clivarea este efectuată alternativ cu mai multe enzime de restricție cu tăieturi mari sau se utilizează tehnica „subrestricției”, adică. restricția se efectuează în condițiile în care clivajul are loc la un singur loc.

După cum arată numeroase studii, utilizarea diverșilor viruși este foarte solutie eficienta, care vă permite să treceți prin apărarea imunitară a organismuluiși apoi infectați celulele, folosindu-le pentru a răspândi virusul. Pentru a efectua această procedură, inginerii genetici au selectat cei mai potriviti virusuri din grupul de retrovirusuri și adenovirusuri. Retrovirusurile introduc informații genetice sub formă de acid ribonucleic (ARN), o moleculă similară cu ADN-ul care ajută la procesarea informațiilor genetice stocate în ADN. De îndată ce este posibil să pătrundă adânc în așa-numita celulă țintă, se obține o copie a moleculei de ADN din molecula de ARN. Acest proces numită transcriere inversă. Odată ce o nouă moleculă de ADN este atașată la o celulă, toate copiile noi ale celulelor vor conține această genă modificată.

Adenovirusurile transportă informații genetice direct sub formă de ADN, care este livrat unei celule care nu se divide. Cu toate că acești virusuri furnizează ADN direct în nucleul celulei țintă, ADN-ul nu se potrivește cu genomul celulei. Astfel, gena modificată și informațiile genetice nu sunt transmise celulelor fiice. Avantaj terapia genică realizat folosind adenovirusuri, este că este posibilă introducerea genelor în celule sistem nervosși în membrana mucoasă tractului respirator, din nou, printr-un vector. În plus, există o a treia metodă de terapie genică, realizată prin așa-numitele virusuri adeno-asociate. Acești viruși conțin relativ o cantitate mică de informația geneticăși sunt mult mai greu de eliminat decât retrovirusurile și adenovirusurile. Cu toate acestea, avantajul virusurilor adeno-asociate este că nu provoacă o reacție sistem imunitar persoană.

Metoda genealogică a antropogeneticii

Această metodă se bazează pe compilarea și analiza pedigree-urilor. Această metodă este utilizată pe scară largă din cele mai vechi timpuri până în zilele noastre în creșterea cailor, selecția de linii valoroase de mari dimensiuni. bovineși porci, la obținerea de câini de rasă pură, precum și la creșterea de noi rase de animale purtătoare de blană.

Ca metodă de studiere a geneticii umane, metoda genealogică a început să fie utilizată abia de la începutul secolului XX, când a devenit clar că analiza genealogiei, care urmărește transmiterea din generație în generație a unei anumite trăsături (boală), poate înlocui metoda hibridologică, care este de fapt inaplicabilă la om.

La compilarea pedigree-urilor, punctul de plecare este persoana - probanda, al cărei pedigree este studiat. De obicei, acesta este fie un pacient, fie un purtător al unei anumite trăsături, a cărei moștenire trebuie studiată. Când compilați tabele genealogice, utilizați simboluri, propus de G. Tocmai în 1931 (Fig. 6.24). Generațiile sunt desemnate cu cifre romane, indivizii dintr-o anumită generație sunt desemnați cu cifre arabe.

Prin metoda genealogică se poate stabili natura ereditară a trăsăturii studiate, precum și tipul moștenirii acesteia (autosomal dominant, autosomal recesiv, X-linked dominant sau recesiv, Y-linked). Atunci când se analizează pedigree-urile pentru mai multe caracteristici, poate fi dezvăluită natura legată a moștenirii lor, care este utilizată în compilarea hărților cromozomiale. Această metodă vă permite să studiați intensitatea procesului de mutație, să evaluați expresivitatea și penetranța alelei. Este utilizat pe scară largă în consilierea genetică medicală pentru a prezice descendența. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că analiza genealogică devine semnificativ mai complicată atunci când familiile au puțini copii.

Metode de introducere directă a genelor în celule

Introducerea directă a unei gene într-o celulă se realizează în mai multe moduri:

Transfectarea

Microinjecție

Electroporarea

Metoda mini-celule

Ambalare în lipozomi

tun cu electroni

La transfecții ADN-ul este adsorbit pe cristale de fosfat de calciu (Graham Van der Eb, 1973). Se formează particule de precipitat de calciu. Ele sunt preluate de celulă prin fagocitoză.

Pentru a crește eficiența transformării, se adaugă un purtător ADN nespecific la ADN-ul specific care conține gena pentru care se va face selecția. De obicei, ADN-ul este prelevat din timus de vițel sau spermă de somon în acest scop. O parte din ADN se leagă de membrană și nu intră în celule. ADN-ul este acceptat de 15 până la 90% din celule. La câteva zile după administrare, o mică proporție de celule sunt capabile să exprime gene străine, dar apoi nivelul de expresie scade și 10 -3 - 10 -5 celule suferă o transformare mai mult sau mai puțin stabilă.

DEAE-dextran, un polimer care adsorb ADN-ul, este, de asemenea, utilizat pentru transfecție. Efectul de intrare în celule și timpul de expresie sunt mari, dar frecvența transformării stabile este mai mică decât atunci când se utilizează precipitat de calciu. Frecvența transfectării este crescută de șocul cu glicerol (4 minute într-o soluție de glicerol 15% în tampon HEPES).

Orice genă poate fi introdusă în celule dacă este legată anterior cu un marker selectabil donat. Cu toate acestea, studii suplimentare au arătat că ligatura în afara celulei nu este necesară. Celulele care absorb o genă selectivă absorb și alt ADN prezent în precipitatul de calciu. Astfel, folosind metoda cotransformări, aproape orice segment de ADN donat poate fi introdus în celule eucariote cultivate dacă acest ADN este inclus împreună cu un marker selectabil în amestec pentru a forma un precipitat de calciu.

Cromozomii sau fragmentele de cromozomi pot fi utilizați pentru transfecție. Celulele donatoare sunt blocate în stadiul de mitoză. Cromozomii mitotici sunt eliberați sub influența șocului osmotic și a omogenizării. Ele sunt purificate prin centrifugare diferențială. Cromozomii sunt depuși pe suprafața celulelor clorura de calciu, iar după câteva ore se tratează cu un reactiv care poate perfora membranele (de exemplu, glicerol).

Pentru a procesa celulele primitoare, se folosesc preparate cromozomiale purificate grosier, deoarece cromozomii sunt cel mai puțin distruși. Numărul de cromozomi pentru procesarea unei celule este limitat. Este mai bine să nu folosiți mai mult de 20 de cromozomi pe 1 celulă primitoare, de când concentratii mari Aceștia aglutinează cromozomii în suspensie. Celula primitoare conține fragmente de cromozomi donatori care pot fi integrate în genom și se pot replica independent. Deleții sunt adesea observate în fragmentele introduse.

Nu toate celulele sunt capabile să transforme ADN-ul genomic la frecvențe înalte. Fibroblastele umane încorporează eficient ADN plasmidic și abia încorporează ADN genomic.

microinjecție de ADNîn celulele de mamifere a devenit posibilă odată cu apariția unui dispozitiv pentru fabricarea micropipetelor cu un diametru de 0,1-0,5 microni și a unui micromanipulator (Fig. 45). Astfel, plasmide care conțin un fragment de virus herpes cu gena timidin kinazei (TK) și plasmida pBR322 au fost injectate în celule TK - și s-a demonstrat că gena TK - a pătruns în nuclei și s-a replicat normal în ele. Metoda de introducere a ADN-ului prin microinjecție a fost dezvoltată la începutul anilor 70 de Anderson și Diakoumacos. În principiu, cu un echipament bun, se pot injecta 500-1000 de celule în 1 oră, iar în cele mai bune experimente se observă integrarea și expresia stabilă a genelor injectate în 50% din celule. Avantajul metodei descrise este, de asemenea, că vă permite să introduceți orice ADN în orice celulă și nu este necesară nicio presiune selectivă pentru a menține gena introdusă în celule.

Orez. 45. Introducerea ADN-ului prin microinjecție

Electroporarea se bazează pe faptul că impulsurile de înaltă tensiune cresc reversibil permeabilitatea biomembranelor. Celulele și fragmentele de ADN care trebuie introduse în celule sunt adăugate în mediul de electroporare (Fig. 46). Impulsurile de înaltă tensiune (tensiune 200 - 350 V, durata impulsului 54 ms) sunt trecute prin mediu, ducând la formarea de pori (defalcare electrică) în citoplasmă. membrană plasmatică, a căror durată de viață și dimensiune sunt suficiente pentru macromolecule precum ADN-ul Mediul extern pătrunde în celulă ca urmare a forțelor osmotice. În același timp, volumul celulei crește.

Intensitatea câmpului electric și durata acțiunii sale, concentrația ADN-ului transformator și a celulelor receptoare pentru fiecare sistem celular sunt selectate experimental pentru a obține un procent ridicat de absorbție a ADN-ului de către celulele supraviețuitoare. S-a demonstrat că în condiții optime de electroporare numărul de transformanți poate ajunge la 80% din celulele supraviețuitoare.

Electroporația este o metodă mai degrabă fizică decât biochimică și acesta pare să fie motivul pentru care este utilizată pe scară largă. Numeroase studii au demonstrat că electroporația poate fi folosită cu succes pentru a introduce molecule de ADN în diferite tipuri de celule, cum ar fi celulele animale de cultură, protozoarele, drojdiile, bacteriile și protoplastele vegetale. Efectul de electroporare al unei descărcări de înaltă tensiune asupra unei membrane lipidice cu două straturi pare să depindă de raza de curbură a acesteia. Prin urmare, celulele bacteriene mici absorb eficient ADN-ul la o tensiune mult mai mare (10 kV/cm sau mai mult) decât animalele mari și celule vegetale, absorbind eficient ADN-ul la o intensitate a câmpului de 1-2 kV/cm.

Electroporația este cea mai simplă, eficientă și reproductibilă metodă de introducere a moleculelor de ADN în celule. Cu toate acestea, până de curând, această metodă a fost folosită într-un număr limitat de laboratoare din cauza lipsei de dispozitive seriale - electroporatoare. Apariția și îmbunătățirea unor astfel de dispozitive în următorii ani va duce la aplicare largă această abordare în inginerie genetică este cea mai mare tipuri diferite celule.

Orez. 46. ​​​​Metoda electroporării

"mini celule" obtinut prin blocarea celulelor donatoare in mitoza cu colcemid. Cu tratamentul prelungit al celulelor cu colcemid, se formează o nouă membrană nucleară în jurul fiecărui cromozom. Tratamentul cu citocalazină B și centrifugare duce la formarea de mini-celule reprezentând micronuclei încapsulați în membrana citoplasmatică.

Minicelulele rezultate sunt foarte sensibile la diferite feluri influențe, prin urmare sunt selectate unele speciale pentru fuziune condiții blânde. Metoda este dificilă, capricioasă, eficiență scăzută - 10 -6 - 10 -7.

Ambalare în lipozomi folosit pentru a proteja materialul genetic exogen de acțiunea distructivă a enzimelor de restricție.

Lipozomii sunt învelișuri sferice formate din fosfolipide. Se obțin prin agitarea puternică a amestecului soluție apoasăşi lipide, sau prin sonicarea emulsiilor apoase de fosfolipide. Lipozomii constând din fosfatidilserina și colesterol sunt cei mai adecvați pentru introducerea ADN-ului în celulele animale și vegetale. Sistemele de transfer de lipozomi au toxicitate scăzută pentru celule.

Metoda de balistică biologică (biolistică) este una dintre cele mai eficiente metode de transformare a plantelor de astăzi, în special monocotiledonei.

Esența metodei este că ADN-ul vector care conține construcția genică necesară transformării este pulverizat pe particule minuscule de wolfram cu un diametru de 0,6-1,2 microni. Particulele de wolfram care poartă ADN sunt aplicate pe un substrat de celofan și plasate în interiorul unui pistol biolist. Calusul sau suspensia celulara se aplica pe o placa Petri cu mediu de agar si se pune sub un pistol biolist la o distanta de 10-15 cm.Presiunea din pistol se reduce la 0,1 atm folosind o pompa de vid. În momentul în care presiunea este eliberată, particulele de wolfram sunt ejectate din pistolul biolist cu o viteză enormă și, rupând pereții celulari, intră în citoplasmă și nucleul celulelor.

De obicei, celulele situate direct în centru mor din cauza numărului mare și presiunii particulelor de wolfram, în timp ce celulele cel mai bine transformate sunt situate în zona de 0,6-1 cm de centru. Apoi, celulele sunt transferate cu atenție în mediu pentru cultivare și regenerare ulterioară.

Folosind un pistol biolist, au fost transformate plante monocotiledonate precum porumb, orez, grâu și orz. În acest caz, s-au obținut plante transformante stabile. Pe lângă succesul în obținerea monocotiledonelor transgenice, transformarea biolistă este utilizată pentru transferul direct al ADN-ului în polen embriogen și producerea rapidă ulterioară de plante dihaploide transgenice, care reprezintă un pas important în activitatea de reproducere. În prezent, transformarea plantelor de tutun a fost realizată prin această metodă și, după regenerarea plantelor haploide, s-au obținut transformanți stabili.

Una dintre cele mai promițătoare opțiuni pentru sistemele de livrare a genelor în celule sunt poliplexele - complexe de ADN transferat și polimeri cationici de diferite naturi. Acest articol descrie proprietățile poliplexurilor bazate pe mai multe tipuri de polimeri cationici, transportul lor în nucleele celulelor țintă, precum și una dintre abordările de tratament. neoplasme maligne folosind aceste structuri.

Introducere

Terapia genică este tratamentul bolilor ereditare, oncologice și de altă natură prin introducerea materialului genetic necesar în celulele pacientului pentru a modifica în mod specific defectele genelor sau pentru a da noi funcții celulelor [Gorbunova și colab., 1997]. Pentru a furniza ADN sau ARN celulelor țintă, purtătorii (vectorii) sunt creați pentru a furniza nivel inalt transfecții, adică transfer de ADN sau ARN exogen (străin) în anumite tipuri de celule. În plus, vectorii trebuie să asigure protecția informațiilor genetice, deoarece În condiții in vivo, ADN-ul străin este instabil datorită degradării rapide de către nucleazele serice, enzime care descompun acizii nucleici.

Tipuri de transportatori de material genetic

În natură, există structuri specializate pentru furnizarea informațiilor genetice către celule - viruși. Prin urmare, au început să fie utilizați ca transportatori de gene. În același timp, utilizarea vectorilor virali are întreaga linie restricții. În primul rând, aceasta este capacitatea mică a materialului genetic transferat și specificitatea celulară inerentă a virusurilor. În al doilea rând, aceasta este posibilitatea ca virusurile să revină la tipul sălbatic ca urmare a recombinării în timpul trecerii aceluiași tip de infecție. În al treilea rând, proteinele particulelor virale sunt foarte imunogene, drept urmare administrarea lor repetată determină un răspuns imun. In cele din urma, productie in masa vectorii virali sunt încă destul de problematici și costisitoare. În prezent în curs de dezvoltare diverse opțiuni purtători nevirali pe bază de lipide cationice și polimeri cationici. Aceste molecule cationice sunt capabile să formeze spontan nanocomplexe auto-asamblate cu o moleculă de ADN încărcată negativ prin interacțiuni electrostatice. Complexele auto-asamblate constând din lipide cationice și ADN se numesc lipoplexe; cele care constau din polimeri cationici și ADN se numesc poliplexuri.

Polimeri cationici utilizați pentru a crea poliplexuri

Un număr mare de polimeri cationici sau policationi au fost propuși în scopuri de terapie genetică și biotehnologie. Policationii condensează ADN-ul în nanocomplexe compacte, oferind stabilitate ADN-ului și protecție împotriva nucleazelor. Proteinele cationice, homopolimerii sintetici ai aminoacizilor (polilizine, poliarginine), polizaharida chitosanului, polietilenimina, dendrimerii pot servi drept polimeri de legare a ADN-ului. compoziție diferităși alți polimeri modificați. Gradul de compactare a ADN-ului este determinat de sarcina totală a complexului, care, la rândul său, depinde de raportul dintre cantitatea grupuri pozitive polimeri la numărul de grupări fosfat negative ale ADN-ului. De obicei, în compoziția poliplexurilor, policationul este prezent în exces, în urma căruia se formează complexe de dimensiuni nanometrice (de la câteva zeci la câteva sute de nm), care sunt solubile în apă și încărcate pozitiv (Fig. 1, 2). ). În caz contrar, complexele vor fi instabile.

Orez. 1. Schema formării poliplexurilor din polimeri cationici și o moleculă circulară de ADN (plasmidă). Orez. 2. Imaginea poliplexurilor pe un substrat obținută prin microscopia electronică cu transmisie (diviziunea la scară 200 nm).

Unul dintre primii policationi utilizați pentru livrarea genelor a fost poli-L-lizina (PL, Fig. 3), care, datorită naturii sale peptidice, este biodegradabilă, ceea ce o face extrem de convenabilă pentru utilizare in vivo. Adesea pentru a elimina efecte nedoriteîn legătură cu densitate mare sarcină de suprafață, se folosește un copolimer de PL cu polietilen glicol (PEG). Ca urmare a acestei modificări, sarcina de suprafață a complexului scade, ceea ce previne adsorbția nespecifică a proteinelor serice încărcate negativ pe poliplexuri și, de asemenea, reduce citotoxicitatea complexelor.

Polietilenimina (PEI, Fig. 3) este considerată una dintre cele mai promițătoare opțiuni pentru policationi pentru a crea poliplexuri pe baza acesteia. PEI este sintetizat sub două forme: liniar și ramificat. PEI are o cantitate mare grupări amino și imino capabile de protonare, drept urmare prezintă proprietăți de tamponare când conditii fiziologice. Poliplexurile bazate pe PEI sunt caracterizate printr-o transfecție mai eficientă și protecție împotriva acțiunii nucleazelor în comparație cu alți policationi, ceea ce este asociat cu o densitate mare de sarcină pe PEI și cu plierea ADN-ului mai compactă. Sarcina pozitivă puternică duce la toxicitatea PEI, care, împreună cu lipsa degradării biologice a PEI, sunt factori limitanți pentru utilizarea PEI in vivo. Pentru a reduce citotoxicitatea, PEI este modificat cu polietilen glicol, care are toxicitate scăzută și hidrofilitate ridicată.

Orez. 3. Polimeri cationici utilizați pentru a crea poliplexuri și.

Un alt reprezentant al policationilor utilizați în furnizarea de informații genetice sunt poliamidoaminele (PAMAM, Fig. 3). Acești compuși sunt dendrimeri foarte ramificați. Datorită ramificării, PAMAM-urile au o mare flexibilitate, compactează ADN-ul într-o măsură mai bună, iar poliplexurile bazate pe acestea sunt mai stabile decât toate celelalte. Proprietățile sale au multe în comun cu PEI.

Chitozanii (Fig. 3) sunt polizaharide construite din D-glucozamină și N-acetil-D-glucozamină legate prin legături glicozidice (1>4). În funcție de greutatea moleculară și gradul de deacetilare, chitozanii formează complexe stabile de diferite dimensiuni cu ADN-ul transferat. Polimerii chitosan mici sau, invers, prea mari conduc la o scădere a expresiei genei transferate. Principalul avantaj al poliplexurilor pe bază de chitosan este biodegradabilitatea.

Eficiența de livrare a poliplexurilor este influențată de mulți factori: greutatea moleculară, gradul de ramificare, polimerizarea și tipul de polimer, dimensiunea particulelor, puterea ionică a soluției, încărcăturile de suprafață ale complexelor, precum și condițiile experimentale. Abordarea optimă ar trebui să țină cont de fiecare dintre acești factori și de influența lor asupra proprietăților complexului, a absorbției complexelor de către celulele țintă și a toxicității.

Există mai multe abordări pentru a asigura specificitatea acțiunii poliplexilor asupra celulelor țintă. Una dintre ele implică livrarea direcționată a nanocomplexelor către anumite tipuri de celule. Această abordare este asociată cu adăugarea de componente (liganzi) la poliplexuri, receptorii pentru care sunt cantitati mari prezente pe suprafața celulelor țintă. Ca liganzi specifici se folosesc diverse proteine, zaharuri, peptide, anticorpi etc. O altă strategie este utilizarea genelor transportabile care ar fi active numai în anumite celule, în timp ce livrarea complexelor are loc nespecific, adică la orice celule.

Penetrarea poliplexurilor în celulele țintă

Procesul de livrare a materialului genetic include două etape: extracelular (calea de la locul de injectare la celulele țintă) și intracelular (interacțiunea cu celulele țintă, endocitoză, ieșire din endozomi, livrare la nucleu). Căile intracelulare transportul poliplexurilor este prezentat în Figura 4.

Prima barieră pe care poliplexul trebuie să o depășească în drumul său către celula țintă este sângele și matricea extracelulară. De aceea este necesar să se selecteze astfel de parametri fizico-chimici ai complexului pentru a crește stabilitatea acestuia, a evita interacțiunile nespecifice și posibilitatea unui răspuns imun. În primul rând, ADN-ul dintr-un poliplex trebuie protejat de acțiunea nucleazelor extracelulare. În al doilea rând, proteinele din serul sanguin încărcate negativ (albumină, fibrinogen, imunoglobuline etc.), precum și proteinele din matricea extracelulară (colageni) sunt capabile să se adsorbe pe suprafața nanocomplexelor încărcate, ceea ce duce la o modificare a încărcăturii de suprafață a poliplexurilor. , ducând la creșterea dimensiunii complexelor și la agregarea acestora. Când poliplexii sunt introduși în organism, se acumulează parțial în țesuturi și suferă fagocitoză. Din aceste motive, administrarea locală a poliplexelor (de exemplu, într-o tumoare în cancer) este adesea utilizată pe baza interacțiunii lor nespecifice cu celulele tisulare.

Orez. 4. Căi intracelulare pentru transportul poliplexilor.

Poliplexii sunt mai întâi adsorbiți de membrana plasmatică, preluați prin endocitoză, după care trebuie să părăsească endolizozomii și să traverseze învelișul nuclear pentru a intra în nucleu. Există și rute alternative de transport care nu duc întotdeauna la livrarea de complexe către nucleu. În plus, expresia genei transferate necesită disocierea poliplexului într-un polimer cationic și ADN liber.

Următoarea etapă de livrare a materialului genetic către celulele țintă este interacțiunea acestora cu membrana plasmatică și absorbția de către celulă. După cum s-a menționat mai sus, legarea poliplexurilor de celule în absența unui ligand are loc în mod nespecific ca rezultat al interacțiunii electrostatice cu membrana plasmatică încărcată negativ. În cele mai multe cazuri, astfel de poliplexuri sunt absorbite de endocitoză adsorbtivă nespecifică. Prin încorporarea unui ligand în complex, absorbția poate fi realizată prin endocitoză mediată de receptorul dependent de clatrină. Alte căi de absorbție depind de tipul de celulă și includ fagocitoza și endocitoza dependentă de caveolină. O strategie de îmbunătățire a eliberării celulare a poliplexurilor implică utilizarea peptidelor de intrare virale, cum ar fi peptida TAT, mai întâi izolată din virusul HIV-1. Utilizarea acestor secvențe asigură că constructele intră în celulă și livrează poliplexii în nucleul celulei.

Una dintre cele mai importante etape în calea de transport a poliplexelor este ieșirea lor din endozomi. După cum se știe, endozomii sunt un sistem de tuburi și vezicule, care este necesar pentru sortarea macromoleculelor absorbite. Endozomii de sortare sunt localizați mai aproape de membrana plasmatică. Din cauza muncii pompe de protoni pH-ul lor scade (aproximativ 6,5 la endozomii de sortare). Transportul suplimentar poate continua fie de-a lungul căii de reciclare cu eliberarea moleculelor absorbite în spațiul extramembranar, fie de-a lungul căii litice, când are loc o acidificare suplimentară a mediului în endozomii tardivi și macromoleculele intră în lizozomi. În lizozomi, conținutul este acidulat la pH 5, iar moleculele absorbite sunt degradate de enzimele hidrolitice care sunt activate la pH scăzut. Produșii de degradare sunt îndepărtați din celulă prin exocitoză sau transferați în citoplasmă, unde sunt utilizați ca material de construcție.

Se crede că poliplexii pe bază de PEI, datorită proprietăților lor, sunt capabili să iasă din endozomi datorită așa-numitului „efect de burete de protoni”. Această ipoteză se bazează pe faptul că polimerii cationici, datorită prezenței aminelor secundare și terțiare neprotonate, creează un efect de tampon, în urma căruia H±ATPaza, care pompează protoni în endozomi, începe să funcționeze mai activ. În acest caz, anionii de clor se acumulează în interiorul endozomilor. Ca urmare, din cauza creștere bruscă presiune osmotica apar umflarea și liza, permițând poliplexurilor să intre intact în citosol. Un alt mecanism de ieșire din endozomi a fost propus pentru poliplexuri, care implică destabilizarea membranei endosomale din cauza densității mari de sarcină de suprafață a nanocomplexelor. Complexele pe bază de PL și chitosan nu provoacă efectul de „burete de protoni” și sunt mai puțin capabili să destabilizați membrana endozomală, ceea ce duce la o eficiență mult mai mică de transfecție.

După ce au părăsit lizozomii, poliplexii se găsesc în spațiul perinuclear, după care complexul se disociază într-un polication liber și ADN. Se crede că acest lucru se întâmplă din cauza competiției pentru grupările cationice dintre grupările fosfat ale ADN-ului și compușii cu greutate moleculară mică și anionii citoplasmei. În unele cazuri, disocierea complexului apare aparent în nucleu. Principala barieră în calea ADN-ului plasmid în nucleul celulei este învelișul nuclear dublu. Pentru a livra macromolecule în nucleu, acestea includ o secvență de localizare nucleară (NLS), care, în combinație cu α- și β-importine, va fi recunoscută de complexul de pori nucleari (NPC) și va pătrunde activ în nucleu. Doar moleculele mici pot trece prin NPC prin difuzie pasivă (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Mecanisme de acțiune ale genelor terapeutice

După ce plasmida intră în nucleu, începe expresia genei terapeutice. Pentru a conferi specificitate acțiunii poliplexurilor, gena terapeutică din plasmidă este plasată sub controlul unui promotor (regiunea genei pe care aterizează ARN polimeraza înainte de transcripție), care este activ numai în țesuturile tumorale. Exemplele includ promotorul genei pentru supravieţuirea proteinei anti-apoptotice sau gena pentru enzima telomeraza. Gena timidin kinazei virusului herpes simplex (HSVtk), care are capacitatea de a fosforila compușii antiherpetici aciclovir și ganciclovir, poate fi utilizată ca genă terapeutică. Acești compuși sunt injectați în tumoră după ceva timp. În continuare, kinazele celulare (enzimele de fosforilare) convertesc aciclovirul sau ganciclovirul fosforilat în trifosfați, care pot fi incluși în ADN-ul nou sintetizat în timpul dublării în timpul diviziunii celulare și pot termina sinteza acestuia. Ca urmare, celulele în ale căror nuclee a intrat gena timidin kinazei sunt distruse în prezența acestor substanțe. În acest caz, celulele care se divide sunt cele care mor, și nu cele aflate în repaus, care nu sintetizează ADN și nu includ ganciclovir sau aciclovir. Acest mecanism de acțiune al unei gene terapeutice poate fi utilizat pentru terapia genică a tumorilor canceroase ale căror celule se divid rapid.

Bibliografie:

1. Gorbunova V.N., Baranov V.S. Introducere în diagnosticul molecular și terapia genică a bolilor ereditare. S.-Pb., „Literatura specială”, 1997, p.287.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Structura nanoscopică a ADN-ului condensat pentru livrarea genelor. //Nucl. Acizi. Res., 1997, voi. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Starea actuală a sistemelor de livrare a genelor polimerice. // Adv. Livrare droguri. Rev., 2006, voi. 58, 467–486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. și Stayton P. S. Design și dezvoltare de polimeri pentru livrarea genelor. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, voi. 4.581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. Dirijarea intracelulară a ADN-ului plasmid în timpul transferului de gene non-virale. // Adv. Livrare droguri. Rev., 2005, voi. 57, 755–767.
6. Maxfield F.R. și McGraw T.E. Reciclare endocitară. // Natura Rev. Mol. Celulă. Biol., 2004, voi. 5, 121–132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. și Topal M.D. Inserția și extinderea nucleotidelor aciclice, dideoxi și ara de către herpesviridae, alfa și beta polimeraze umane umane. // J. Biol. Chem., 1988, voi. 263, 3898–3904.

Durymanov Mihail, student al Facultății de Biologie a Universității de Stat din Moscova

Articolul este laureat al concursului de populară știință la conferința Lomonosov 2009 (Facultatea de Biologie, secțiunile „Nanobiotehnologie”, „Bioinginerie”, „Biofizică”.

Tehnica, dezvoltată de oamenii de știință de la Universitatea din California, Irvine sub conducerea dr. Peter Donovan și bazată pe o combinație a două metode cunoscute de manipulare a celulelor stem embrionare, dublează eficiența livrării de ADN către celulele stem embrionare umane.

Metodele moderne de introducere a ADN-ului în HESC folosind transfecția chimică, nucleofecția și electroporarea au un dezavantaj serios - eficiență scăzută. Livrarea materialului genetic către HESC folosind o infecție virală este mai eficientă, dar are multe consecințe nedorite pentru celulele stem și nu poate fi numită complet sigură din punct de vedere medical dacă celulele sunt destinate transplantului ulterioar.

O nouă tehnică bazată pe o combinație de nucleofecție a unei singure celule stem și o metodă optimizată de selectare a coloniilor transgenice rezultate asigură exprimarea în timp util și stabilă a transgenelor în celule. Nucleofecția implică formarea de pori în membrana celulară folosind impulsuri electrice și introducerea ulterioară a ADN-ului în celulă.

În plus față de gena de interes, constructul de ADN modificator poartă o genă care permite urmărirea ușoară a celulei transformate, de exemplu, gena care codifică proteina fluorescentă verde Renilla umanizată (hrGFP). Această metodă de etichetare a celulelor face posibilă observarea mișcării celulelor transformate atunci când sunt transplantate la animale.

Potenţial, această metodă ar putea fi utilă pentru tratamentul bolilor monogenice cauzate de mutaţiile unei gene în toate celulele unei persoane bolnave. Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății, peste 10.000 de boli umane sunt de natură monogenă. Milioane de oameni din întreaga lume suferă de boli monogenice, care includ boala Huntington, anemia falciformă, hemofilia și fibroza chistică.

Noua metodă va extinde posibilitățile de manipulare a celulelor hES, făcând posibilă modelarea bolilor umane și găsirea de medicamente adecvate. Folosind această tehnică, oamenii de știință vor putea corecta tulburările genetice din celulele stem și vor folosi celulele sănătoase în medicina regenerativă.

Colonie de celule hES care exprimă proteine ​​verzi fluorescente hrGFP.

Articol de Hohenstein KA et al. „Nucleofection mediates High-Eficiency Stable Gene Knockdown and Transgene Expression in Human Embrionic Stem Cells” este disponibil în versiunea online a revistei Celule stem din 6 martie 2008.