Metode pentru introducerea ADN-ului recombinant într-o celulă. O nouă metodă pentru livrarea ADN-ului celulelor stem embrionare. Metode de administrare a vaccinurilor ADN în celule

Una dintre cele mai promițătoare variante ale sistemelor de livrare a genelor în celule sunt poliplexii, care sunt complexe de ADN transferat și polimeri cationici de natură diferită. Acest articol descrie proprietățile poliplexurilor bazate pe mai multe tipuri de polimeri cationici, transportul lor în nucleele celulelor țintă, precum și una dintre abordările pentru tratamentul neoplasmelor maligne folosind aceste construcții.

Introducere

Terapia genică este tratamentul bolilor ereditare, oncologice și de altă natură prin introducerea materialului genetic necesar în celulele pacientului pentru a modifica defectele genelor sau pentru a conferi celulelor noi funcții [Gorbunova și colab., 1997]. Pentru a furniza ADN sau ARN celulelor țintă, purtători (vectori) sunt creați pentru a asigura un nivel ridicat de transfecție, de exemplu. transfer de ADN sau ARN exogen (străin) în anumite tipuri de celule. În plus, vectorii trebuie să asigure protecția informațiilor genetice, deoarece în condiții in vivo, ADN-ul străin este instabil datorită degradării rapide de către nucleazele serice, enzime care degradează acizii nucleici.

Tipuri de transportatori de material genetic

În natură, există structuri specializate pentru livrarea informațiilor genetice în celule - viruși. Prin urmare, au început să fie utilizați ca transportatori de gene. În același timp, utilizarea vectorilor virali are o serie de limitări. În primul rând, aceasta este capacitatea mică a materialului genetic transferat și specificitatea celulară inerentă a virusurilor. În al doilea rând, este posibilitatea ca virusurile să revină la tipul sălbatic ca urmare a recombinării în timpul trecerii aceluiași tip de infecție. În al treilea rând, proteinele particulelor virale sunt foarte imunogene, drept urmare administrarea lor repetată determină un răspuns imun. În cele din urmă, producția în masă de vectori virali este încă destul de problematică și costisitoare. În prezent, sunt dezvoltate în mod activ diverse variante de purtători nevirali pe bază de lipide cationice și polimeri cationici. Aceste molecule cationice sunt capabile să formeze spontan nanocomplexe cu auto-asamblare cu o moleculă de ADN încărcată negativ datorită interacțiunilor electrostatice. Complexele autoasamblabile constând din lipide cationice și ADN se numesc lipoplexi, constând din polimeri cationici și ADN - poliplexuri.

Polimeri cationici utilizați pentru a crea poliplexuri

În scopul terapiei genice și al biotehnologiei a propus un număr mare de polimeri cationici sau policationi. Policationii condensează ADN-ul în nanocomplexe compacte, oferind stabilitate ADN-ului și protecție împotriva nucleazelor. Proteinele cationice, homopolimerii sintetici ai aminoacizilor (polizine, poliarginine), polizaharida chitosanului, polietilenimina, dendrimerii de diferite compoziții și alți polimeri modificați pot servi drept polimeri de legare la ADN. Gradul de compactare a ADN-ului este determinat de sarcina totală a complexului, care, la rândul său, depinde de raportul dintre numărul de grupări polimerice pozitive și numărul de grupări fosfat ADN negative. Policationul este de obicei în exces în compoziția poliplexurilor, în urma cărora se formează complexe nanodimensionate (de la câteva zeci la câteva sute de nm), care sunt solubile în apă și încărcate pozitiv (Fig. 1, 2). În caz contrar, complexele vor fi instabile.

Orez. 1. Schema formării poliplexurilor din polimeri cationici și o moleculă circulară de ADN (plasmidă). Orez. 2. Imaginea poliplexurilor pe un substrat obținută prin microscopia electronică cu transmisie (diviziunea la scară 200 nm), .

Unul dintre primii policationi utilizați pentru livrarea genelor a fost poli-L-lizina (PL, Fig. 3), care, datorită naturii sale peptidice, este biodegradabilă, ceea ce o face extrem de convenabilă pentru utilizarea in vivo. Adesea, un copolimer de PL cu polietilen glicol (PEG) este utilizat pentru a elimina efectele nedorite asociate cu o densitate mare a sarcinii de suprafață. Ca urmare a acestei modificări, sarcina de suprafață a complexului scade, ceea ce previne adsorbția nespecifică a proteinelor din serul sanguin încărcate negativ pe poliplexuri și, de asemenea, reduce citotoxicitatea complexelor.

Polietilenimina (PEI, Fig. 3) este considerată una dintre cele mai promițătoare variante de policationi pentru crearea de poliplexuri pe baza acesteia. PEI este sintetizat sub două forme: liniar și ramificat. PEI are un număr mare de grupări amino și imino capabile de protonare, drept urmare prezintă proprietăți de tamponare în condiții fiziologice. Poliplexii pe bază de PEI se disting prin transfecție și protecție mai eficientă față de nucleaze în comparație cu alți policationi, ceea ce este asociat cu o densitate mare de sarcină pe PEI și cu plierea ADN-ului mai compactă. Sarcina pozitivă puternică duce la toxicitatea PEI, care împreună cu lipsa de biodegradare a PEI sunt factorii limitatori pentru utilizarea PEI in vivo. Pentru a reduce citotoxicitatea, PEI este modificat cu polietilen glicol, care are toxicitate scăzută și hidrofilitate ridicată.

Orez. 3. Polimeri cationici utilizați pentru a crea poliplexuri și.

Un alt reprezentant al policationilor utilizați în furnizarea de informații genetice sunt poliamidoaminele (PAMAM, Fig. 3). Acești compuși sunt dendrimeri foarte ramificați. Datorită ramificării, PAMAM-urile au o mare flexibilitate, ADN compact într-o măsură mai bună, poliplexii bazați pe ele sunt mai stabili decât toate celelalte, . Prin proprietățile sale, are multe în comun cu PEI.

Chitozanii (Fig. 3) sunt polizaharide construite din D-glucozamină și N-acetil-D-glucozamină legate (1>4) prin legături glicozidice. În funcție de greutatea moleculară și gradul de deacetilare, chitozanii formează complexe stabile de diferite dimensiuni cu ADN-ul transferat. Polimerii chitosan mici sau invers, prea mari conduc la o scădere a expresiei genei transferate. Principalul avantaj al poliplexurilor pe bază de chitosan este biodegradabilitatea, .

Eficiența livrării poliplexurilor este afectată de mulți factori: greutatea moleculară, gradul de ramificare, polimerizarea și tipul de polimer, dimensiunea particulelor, puterea ionică a soluției, încărcăturile de suprafață ale complexelor, precum și condițiile experimentului. Abordarea optimă ar trebui să ia în considerare fiecare dintre acești factori și influența lor asupra proprietăților complexului, absorbția complexelor de către celulele țintă și toxicitatea.

Există mai multe abordări pentru a asigura specificitatea acțiunii poliplexilor asupra celulelor țintă. Una dintre ele implică livrarea țintită a nanocomplexelor către anumite tipuri de celule. Această abordare este asociată cu atașarea componentelor (liganzi) la poliplexuri, receptori pentru care sunt prezenți în număr mare pe suprafața celulelor țintă. Ca liganzi specifici se folosesc diverse proteine, zaharuri, peptide, anticorpi etc. O altă strategie este utilizarea unor astfel de gene transportabile care ar fi active numai în anumite celule, în timp ce livrarea complexelor are loc nespecific, adică la orice celule.

Penetrarea poliplexurilor în celulele țintă

Procesul de livrare a materialului genetic include două etape: extracelular (calea de la locul de injectare la celulele țintă) și intracelular (interacțiunea cu celulele țintă, endocitoză, ieșire din endozomi, livrare la nucleu). Căile de transport intracelular pentru poliplexuri sunt prezentate în Figura 4.

Prima barieră pe care poliplexul trebuie să o depășească în drumul său către celula țintă este sângele și matricea extracelulară. De aceea este necesar să se aleagă astfel de parametri fizico-chimici ai complexului pentru a crește stabilitatea acestuia, a evita interacțiunile nespecifice și posibilitatea unui răspuns imun. În primul rând, ADN-ul dintr-un poliplex trebuie protejat de acțiunea nucleazelor extracelulare. În al doilea rând, proteinele din serul sanguin încărcate negativ (albumină, fibrinogen, imunoglobuline etc.), precum și proteinele matricei extracelulare (colageni) sunt capabile să se adsorbe pe suprafața nanocomplexelor încărcate, ceea ce duce la o modificare a încărcăturii de suprafață a poliplexurilor, duce la creşterea dimensiunii complexelor şi la agregarea acestora. Când poliplexii sunt introduși în organism, se acumulează parțial în țesuturi și suferă fagocitoză. Din aceste motive, administrarea locală de poliplexuri este adesea utilizată (de exemplu, într-o tumoare în cancer) în calculul interacțiunii lor nespecifice cu celulele tisulare.

Orez. 4. Căi de transport intracelular pentru poliplexuri, .

Poliplexii sunt mai întâi adsorbiți de membrana plasmatică, preluați prin endocitoză, după care trebuie să părăsească endolizozomii și să traverseze învelișul nuclear pentru a intra în nucleu. Există, de asemenea, rute alternative de transport care nu duc întotdeauna la livrarea de complexe până la miez. În plus, exprimarea genei transferate necesită disocierea poliplexului într-un polimer cationic și ADN liber.

Următorul pas în livrarea materialului genetic către celulele țintă este interacțiunea acestora cu membrana plasmatică și absorbția de către celulă. După cum s-a menționat mai sus, legarea poliplexurilor de celule în absența unui ligand are loc în mod nespecific ca rezultat al interacțiunii electrostatice cu o membrană plasmatică încărcată negativ. În cele mai multe cazuri, astfel de poliplexuri sunt preluate de endocitoză adsorbtivă nespecifică. Prin încorporarea unui ligand în complex, absorbția poate fi realizată prin endocitoză mediată de receptorul dependent de clatrină. Alte căi de absorbție sunt dependente de tipul celular și includ fagocitoza și endocitoza dependentă de caveolină. O strategie de îmbunătățire a eliberării de poliplexuri în celule implică utilizarea peptidelor de intrare virale, cum ar fi peptida TAT, mai întâi izolată din virusul HIV-1. Utilizarea acestor secvențe asigură că constructele pătrund în celulă și poliplexii sunt livrați la nucleul celulei.

Una dintre cele mai importante etape ale căii de transport a poliplexilor este ieșirea lor din endozomi. După cum se știe, endozomii sunt un sistem de tubuli și vezicule, care este necesar pentru sortarea macromoleculelor absorbite. Endozomii de sortare sunt localizați mai aproape de membrana plasmatică. Datorită muncii pompelor de protoni, pH-ul acestora scade (aproximativ 6,5 la sortarea endozomilor). Transportul suplimentar poate merge fie pe calea recirculării cu eliberarea moleculelor absorbite în spațiul extramembranar, fie pe calea politică, atunci când are loc o acidificare suplimentară a mediului în endozomii tardivi, iar macromoleculele intră în lizozomi. În lizozomi, conținutul este acidulat la pH 5, iar moleculele absorbite sunt degradate de enzimele hidrolitice, care sunt activate la pH scăzut. Produșii de degradare sunt îndepărtați din celulă prin exocitoză sau transferați în citoplasmă, unde sunt utilizați ca material de construcție.

Se crede că poliplexii pe bază de PEI, datorită proprietăților lor, sunt capabili să lase endozomi datorită așa-numitului efect de burete de protoni. Această ipoteză se bazează pe faptul că polimerii cationici, datorită prezenței aminelor secundare și terțiare neprotonate, creează un efect de tampon, în urma căruia H±ATPaza, care pompează protoni în endozomi, începe să funcționeze mai activ. În acest caz, anionii de clorură se acumulează în interiorul endozomilor. Ca urmare, din cauza creșterii puternice a presiunii osmotice, apar umflarea și liza, ceea ce permite poliplexurilor să intre intact în citosol. De asemenea, a fost propus un alt mecanism de eliberare a poliplexurilor din endozomi, care constă în destabilizarea membranei endosomale datorită densității mari de sarcină de suprafață a nanocomplexelor. Complexele pe bază de PL și chitosan nu provoacă efectul de „burete de protoni” și sunt mai puțin capabili să destabilizați membrana endozomală, ceea ce duce la o eficiență mult mai mică de transfecție.

După părăsirea lizozomilor, poliplexii se găsesc în spațiul perinuclear, după care complexul se disociază într-un polication liber și ADN. Se crede că acest lucru se întâmplă din cauza competiției pentru grupările cationice dintre grupările ADN-fosfat și compușii cu greutate moleculară mică și anionii citoplasmei. În unele cazuri, disocierea complexului are loc, aparent, în nucleu. Principala barieră pe calea ADN-ului plasmid către nucleul celulei este învelișul nuclear dublu. Pentru livrarea către nucleul macromoleculelor, acestea includ o secvență de localizare nucleară (NSL), care, în combinație cu β- și β-importinele, va fi recunoscută de complexul de pori nucleari (NPC) și va pătrunde activ în nucleu. Doar moleculele mici pot trece prin NPC prin difuzie pasivă (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Mecanisme de acțiune ale genelor terapeutice

După pătrunderea plasmidei în nucleu, începe expresia genei terapeutice. Pentru a conferi specificitate acțiunii poliplexurilor, gena terapeutică din plasmidă este plasată sub controlul unui promotor (regiunea genei pe care aterizează ARN polimeraza înainte de transcripție), care este activ numai în țesuturile tumorale. Exemple sunt promotorul genei pentru supravieţuirea proteinei anti-apoptotice sau gena pentru enzima telomeraza. Ca genă terapeutică, poate fi utilizată gena timidin kinazei virusului herpes simplex (HSVtk), care are capacitatea de a fosforila compușii anti-herpes aciclovir și ganciclovir. Acești compuși sunt injectați în tumoră după ceva timp. Mai mult, kinazele celulare (enzimele de fosforilare) convertesc aciclovirul sau ganciclovirul fosforilat în trifosfați, care pot fi incluși în ADN-ul nou sintetizat în timpul dublării în timpul diviziunii celulare și să-și încheie sinteza. Ca urmare, celulele din nucleele cărora a intrat gena timidin kinazei sunt distruse în prezența acestor substanțe. În acest caz, celulele care se divide sunt cele care mor, și nu cele aflate în repaus, care nu sintetizează ADN și nu includ ganciclovir sau aciclovir. Acest mecanism de acțiune al unei gene terapeutice poate fi utilizat în scopul terapiei genice a tumorilor canceroase, ale căror celule se divid rapid.

Bibliografie:

1. Gorbunova V.N., Baranov V.S. Introducere în diagnosticul molecular și terapia genică a bolilor ereditare. S.-Pb., „Literatura specială”, 1997, p.287.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Structura nanoscopică a ADN-ului condensat pentru livrarea genelor. //Nucl. Acizi. Res., 1997, voi. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Starea actuală a sistemelor de livrare a genelor polimerice. // Adv. livrare de droguri Rev., 2006, voi. 58, 467–486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. și Stayton P. S. Design și dezvoltare de polimeri pentru livrarea genelor. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, voi. 4.581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G. L. Dirijarea intracelulară a ADN-ului plasmid în timpul transferului de gene non-virale. // Adv. livrare de droguri Rev., 2005, voi. 57, 755–767.
6. Maxfield F.R. și McGraw T.E. Reciclare endocitară. // Natura Rev. Mol. celulă. Biol., 2004, voi. 5, 121-132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. și Topal M.D. Inserția și extinderea nucleotidelor aciclice, dideoxi și ara de către herpesviridae, alfa și beta polimeraze umane umane. // J. Biol. Chem., 1988, voi. 263, 3898-3904.

Durymanov Mihail, student la Facultatea de Biologie, Universitatea de Stat din Moscova

Articolul este câștigătorul concursului de populare științifice la conferința „Lomonosov 2009” (Facultatea de Biologie, secțiunile „Nanobiotehnologie”, „Bioinginerie”, „Biofizică”.

Introducere

1 Grupuri majore de enzime de inginerie genetică

1.1 Enzime de restricție

1.1.1 Mecanismul de acțiune al restrictazelor

1.1.2 Construirea hărților de restricții

1.3 Ligaze

2 Introducerea unei noi gene într-o celulă

2.1 Reglarea expresiei genelor la procariote

2.2 Metode de introducere directă a unei gene într-o celulă

2.3 Introducerea genelor în celulele de mamifere

2.4 Transformarea genetică a celulelor somatice de mamifere

2.5 Terapia genică

2.6 Obținerea animalelor transgenice

Concluzie

Bibliografie

Introducere

Ingineria genetică este construcția in vitro a structurilor genetice active funcțional (ADN recombinant), sau cu alte cuvinte, crearea de programe genetice artificiale (Baev A. A.). Potrivit lui E. S. Piruzyan, ingineria genetică este un sistem de metode experimentale care fac posibilă construirea de structuri genetice artificiale în laborator (într-o eprubetă) sub formă de așa-numite molecule de ADN recombinant sau hibrid.

Vorbim despre direcționat, după un program prestabilit, construcția sistemelor genetice moleculare în afara corpului cu introducerea ulterioară a acestora într-un organism viu. În acest caz, ADN-ul recombinant devine o parte integrantă a aparatului genetic al organismului receptor și îi conferă noi proprietăți genetice, biochimice și apoi fiziologice unice.

Scopul ingineriei genetice aplicate este de a proiecta astfel de molecule de ADN recombinant care, atunci când sunt introduse în aparatul genetic, ar da organismului proprietăți utile pentru oameni.

Tehnologia ADN recombinant folosește următoarele metode:

Scindarea specifică a ADN-ului prin nucleaze de restricție, accelerând izolarea și manipularea genelor individuale;

Secvențierea rapidă a tuturor nucleotidelor unui fragment de ADN purificat, care vă permite să determinați limitele genei și secvența de aminoacizi codificată de aceasta;

Construcția ADN-ului recombinant;

Hibridarea acidului nucleic, care permite detectarea unor secvențe specifice de ARN sau ADN cu o mai mare acuratețe și sensibilitate pe baza capacității lor de a lega secvențe complementare de acid nucleic;

Clonarea ADN: amplificare in vitro prin reacție în lanț a polimerazei sau introducerea unui fragment de ADN într-o celulă bacteriană, care, după o astfel de transformare, reproduce acest fragment în milioane de copii;

Introducerea ADN-ului recombinat în celule sau organisme.

Istoria ingineriei genetice

Ingineria genetică a apărut datorită muncii multor cercetători din diverse ramuri ale biochimiei și geneticii moleculare. De mulți ani, proteinele au fost considerate clasa principală de macromolecule. Exista chiar și presupunerea că genele sunt de natură proteică. Abia în 1944 Avery, McLeod și McCarthy au arătat că ADN-ul este purtătorul de informații ereditare. Din acel moment, a început studiul intensiv al acizilor nucleici. Un deceniu mai târziu, în 1953, J. Watson și F. Crick au creat un model ADN dublu catenar. Acest an este considerat a fi anul nașterii biologiei moleculare.

La începutul anilor 1950 și 1960, proprietățile codului genetic au fost elucidate, iar până la sfârșitul anilor 1960, universalitatea sa a fost confirmată experimental. A existat o dezvoltare intensivă a geneticii moleculare, ale cărei obiecte erau E. coli, virusurile și plasmidele sale. Au fost dezvoltate metode pentru a izola preparate foarte purificate de molecule de ADN, plasmide și virusuri intacte. ADN-ul virusurilor și plasmidelor a fost introdus în celule într-o formă biologic activă, asigurând replicarea acestuia și exprimarea genelor corespunzătoare. În anii '70, au fost descoperite o serie de enzime care catalizează reacțiile de transformare a ADN-ului. Enzimele de restricție și ADN-ligazele joacă un rol deosebit în dezvoltarea metodelor de inginerie genetică.

Istoria dezvoltării ingineriei genetice poate fi împărțită în trei etape. Prima etapă este legată de demonstrarea posibilității fundamentale de a obține in vitro molecule de ADN recombinant. Aceste lucrări se referă la producerea de hibrizi între diferite plasmide. S-a demonstrat posibilitatea creării de molecule recombinante folosind moleculele originale de ADN din diverse specii și tulpini de bacterii, viabilitatea, stabilitatea și funcționarea acestora.

A doua etapă este asociată cu începerea lucrărilor de obținere a moleculelor de ADN recombinant între genele cromozomiale ale procariotelor și diverse plasmide, dovedind stabilitatea și viabilitatea acestora.

A treia etapă este începutul lucrărilor privind includerea genelor eucariote, în principal a genelor animale, în moleculele de ADN vector (ADN utilizat pentru transferul de gene și capabil să fie integrat în aparatul genetic al celulei primitoare).

Formal, data de naștere a ingineriei genetice ar trebui luată în considerare 1972, când P. Berg, S. Cohen, H. Boyer și colegii au creat primul ADN recombinant care conține fragmente de ADN ale virusului SV40, bacteriofagului și E. coli la Stanford. Universitate.

1 Grupuri majore de enzime de inginerie genetică

Ingineria genetică este un descendent al geneticii moleculare, dar își datorează nașterea succeselor enzimologiei genetice și chimiei acizilor nucleici, deoarece enzimele sunt instrumentele manipulării moleculare. Dacă uneori putem lucra cu celule și organele celulare cu micromanipulatoare, atunci nu, chiar și cele mai mici instrumente microchirurgicale, ne vor ajuta atunci când lucrăm cu macromolecule de ADN și ARN. Ce să fac? Enzimele acționează ca „bisturiu”, „foarfece” și „fițe pentru cusătură”.

Numai ei pot găsi anumite secvențe de nucleotide, pot „taia” o moleculă acolo sau, dimpotrivă, „înfuriază” o gaură în lanțul de ADN. Aceste enzime lucrează în celulă de mult timp, efectuând munca de replicare (dublare) ADN-ului în timpul diviziunii celulare, repararea daunelor (restaurând integritatea moleculei), în procesele de citire și transfer de informații genetice de la celulă la celulă. sau în interiorul celulei. Sarcina unui inginer genetic este de a selecta o enzimă care ar îndeplini sarcinile stabilite, adică ar putea lucra cu o anumită secțiune a acidului nucleic.

De remarcat că enzimele folosite în inginerie genetică nu sunt specifice speciei, astfel că experimentatorul poate combina fragmente de ADN de orice origine într-un singur întreg în secvența aleasă de el. Acest lucru permite ingineriei genetice să depășească barierele de specii stabilite de natură și să efectueze încrucișări interspecifice.

Enzimele utilizate în construirea ADN-ului recombinant pot fi împărțite în mai multe grupuri:

Enzime care produc fragmente de ADN (enzime de restricție);

Enzime care sintetizează ADN-ul pe o matriță ADN (polimerază) sau ARN (reverse transcriptază);

Enzime care conectează fragmente de ADN (ligaze);

Enzime care fac posibilă modificarea structurii capetelor fragmentelor de ADN.

1.1 Enzime de restricție

Este în general acceptat că termenii „enzimă de restricție”, „endonuclează de restricție” și „endodezoxiribonuclează specifică locului” sunt considerați sinonimi.

Toate endonucleazele de restricție bacteriene recunosc secvențe de ADN specifice, destul de scurte și se leagă de ele. Acest proces este însoțit de tăierea moleculei de ADN fie la locul de recunoaștere în sine, fie la un alt loc, care este determinat de tipul de enzimă. Alături de activitatea de restricție, tulpina bacteriană are capacitatea de a metila ADN-ul; acest proces este caracterizat de aceeași specificitate pentru secvențele de ADN ca și pentru restricție. Metilaza adaugă grupări metil la resturile de adenină sau citozină în același loc unde se leagă enzima de restricție. Ca urmare a metilării, locul devine rezistent la restricție. Prin urmare, metilarea protejează ADN-ul de a fi tăiat.

Există 3 clase principale de restrictaze: 1, 2 și 3.

Toate enzimele de restricție recunosc secvențe strict definite pe ADN-ul dublu catenar, dar enzimele de restricție din clasa I efectuează pauze în puncte arbitrare ale moleculei de ADN, iar enzimele de restricție din clasele a 2-a și a 3-a recunosc și scindează ADN-ul în puncte strict definite din cadrul locuri de recunoaștere sau la o distanță fixă ​​de acestea.distanță.

Enzimele de tipurile 1 și 3 au o structură complexă de subunități și au două tipuri de activități - de modificare (metilare) și endonuclează dependentă de ATP.

Enzimele din clasa a doua constau din 2 proteine ​​separate: o endonuclează de restricție și o metilază modificatoare, prin urmare, numai enzimele de clasa 2 sunt utilizate în inginerie genetică. Au nevoie de ioni de magneziu ca cofactori.

În prezent, au fost izolate peste 500 de restrictaze de clasa 2, însă, printre enzimele izolate de la diferite microorganisme, există acelea care recunosc aceleași secvențe pe ADN. Astfel de perechi sau grupuri se numesc izoschizomeri. Adevărata izoschizomerie se distinge, atunci când enzimele recunosc aceeași secvență de nucleotide și rup ADN-ul în aceleași puncte, și fals, când enzimele, recunoscând același loc pe ADN, fac rupturi în puncte diferite din același loc.

Cele mai multe restrictaze de clasa 2 recunosc secvențe care conțin de la 4 până la 6 perechi de nucleotide, astfel încât restrictazele sunt împărțite în tăieturi mici și mari. Enzimele de restricție de tăiere mică recunosc tetranucleotida și introduc mult mai multe pauze în molecule decât enzimele de restricție de tăiere mare care recunosc o secvență de șase perechi de nucleotide. Acest lucru se datorează faptului că probabilitatea de apariție a unei anumite secvențe de patru nucleotide este mult mai mare decât secvența de șase nucleotide. De exemplu, ADN-ului de 40.000 bp al bacteriofagului T7 îi lipsește o secvență recunoscută de R1 din E. coli.

Restrictazele cu divizare mică includ Hpa II și Alu (de la Arthrobacter luteus), cu despicare mare - Eco R I (de la Escherichia coli) și Hind III. Dacă presupunem că situsurile de recunoaștere a enzimei de restricție sunt distribuite aleatoriu de-a lungul lanțului ADN, atunci ținta pentru enzimele care recunosc o secvență (situs) de patru nucleotide ar trebui să apară în medie o dată la fiecare 256 de perechi de baze, iar pentru enzimele care recunosc șase nucleotide, după 4096 perechi de baze. Dacă locul de restricție se află în interiorul genei, atunci tratamentul cu o enzimă de restricție ADN va duce la inactivarea acesteia. Probabilitatea unui astfel de eveniment este foarte mare atunci când este tratată cu restrictaze cu tăietură mică și nesemnificativă când se utilizează endonucleaze cu tăietură mare. Prin urmare, pentru a obține o genă intactă, clivarea este efectuată alternativ de mai multe restrictaze cu tăiere mare sau se utilizează metoda „subrestricției”, adică. restricția se efectuează în condițiile în care clivajul are loc la un singur loc.

8860 0

În prezent, sunt cunoscute aproximativ 40 de metode diferite de eliberare a ADN-ului recombinant în celule, care rezolvă problema traversării membranei plasmatice în moduri diferite. Până în prezent, nu există o clasificare unificată a metodelor de livrare a ADN-ului recombinat în celule. Fiecare autor al recenziilor clasifică în felul său, poate pentru că pentru multe metode găsite empiric, mecanismul de depășire a membranei nu este încă clar, de exemplu, pentru transformare. Există, de asemenea, incertitudine în ceea ce privește terminologia, ceea ce nu este surprinzător pentru un nou domeniu de știință și practică care se dezvoltă rapid.

Fiecare dintre metodele de livrare a ADN-ului străin în celule are propriile sale caracteristici, avantaje și dezavantaje în ceea ce privește supraviețuirea celulară, eficiența administrării, versatilitatea și posibilitățile tehnice de implementare. Alegerea metodei depinde de tipul de celule gazdă și de tipul de vector utilizat, precum și de preferințele și capacitățile personale ale experimentatorului. Unele dintre cele mai cunoscute metode pentru livrarea ADN-ului la celulele țintă sunt discutate în detaliu mai jos.

Transformarea în sensul său cel mai general este procesul de introducere a ADN-ului liber într-o celulă. Într-un sens mai restrâns, termenul este folosit în principal în relație cu bacteriile, denotând procesul de absorbție a ADN-ului recombinant de către celulele competente, indus de tranziția de fază a temperaturii a membranei celulare. E. coli este cel mai comun organism atunci când se lucrează cu ADN recombinant, iar pentru a asigura introducerea ADN-ului plasmid în celule, celulele sunt păstrate cu o soluție rece ca gheața de CaCl2 și ADN și apoi supuse șocului termic la 42 °C. timp de ~1 min.

Aparent, ca urmare a unui astfel de tratament, are loc distrugerea locală a peretelui celular. Eficiența transformării, care este definită ca numărul de transformanți per 1 µg de ADN adăugat,
în timp ce este de aproximativ 10000 - 10000000 . Eficiența acestei metode este scăzută, aproximativ mai puțin de 0,1% din celule sunt transformate, dar acest dezavantaj este compensat prin utilizarea schemelor de selecție care vă permit să identificați rapid clonele dorite.

Celulele capabile să absoarbă ADN străin sunt numite competente. Proporția acestor celule în populație este de obicei foarte mică, dar poate fi crescută folosind un mediu nutritiv special, condiții de cultivare și inductori de competență chimică (selectați, de regulă, empiric). O etapă frecvent utilizată în prepararea celulelor competente este producerea de sferoplaste - celule parțial sau complet (protoplaste) lipsite de un perete celular exterior rigid.

De exemplu, aceasta este singura modalitate de a transforma eficient multe bacterii gram-pozitive din genurile Bacillus, Listeria, Streptommyces etc. Unele tehnici de transformare a drojdiei includ, de asemenea, etapele de îndepărtare enzimatică a peretelui celular de drojdie folosind glucozidaze. Pentru organismele rezistente la inductori chimici de competență sau lipsite de competență naturală, sunt utilizate alte sisteme de livrare a ADN-ului.

Conjugare. Există plasmide bacteriene (plasmide conjugative) care au capacitatea de a crea contacte intercelulare prin care trec de la o celulă la alta. Formarea contactelor dintre celulele donatoare și cele primitoare este asigurată de proprietățile conjugative ale plasmidelor, iar transferul de ADN în sine este asigurat de proprietățile de mobilizare. În acest caz, plasmida conjugativă poate transporta de-a lungul vectorului plasmidic obișnuit situat în aceeași celulă.

Astfel, este posibilă transformarea celulelor receptoare care sunt dificil de transformat prin alte mijloace. De exemplu, a fost demonstrat transferul de mobilizare al vectorului navetă pAT187 de la E. coli la diferite bacterii gram-pozitive (genurile Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus etc.), deși cu mult mai puțină eficiență decât pentru transferul între diferite. tulpini de E. coli.

Mai mult, a fost demonstrată recent posibilitatea transferului conjugativ al ADN-ului de la celulele bacteriene la celulele animale de cultură. În timpul conjugării, este transferată doar o singură catenă a plasmidei donor, pe care este apoi sintetizată a doua catenă. Aceasta are ca rezultat ca plasmida transferată conjugativ să nu fie atacată de enzimele de restricție ale gazdei. Eficiența acestei metode pentru bacterii este comparabilă cu cea a transformării.

Infectie virala. Pentru introducerea vectorilor bazați pe viruși, este utilizată pe scară largă calea naturală infecțioasă de infecție a celulei gazdă, care depinde de tipul de virus.

metode de perforare. Una dintre metodele populare de introducere a acizilor nucleici în celulele țintă este electroporarea - crearea temporară a porilor într-o membrană cu două straturi lipidice sub o scurtă expunere la un câmp electric. Este o metodă fizică universală de transformare, a cărei tehnică a fost dezvoltată pentru aproape toate tipurile de celule.

Când se lucrează cu E. coli, suspensia celulară preparată (~50 µl) și ADN-ul sunt plasate între electrozi și se aplică un singur impuls de curent cu o durată de ~4,5 ms la o tensiune de 1,8 kV, distanța dintre electrozi este 1 mm. După un astfel de tratament, eficiența transformării crește la 109-1011 pentru plasmidele mici (~3-6 kb) și până la 106 pentru cele mari (~135 kb). Condiții similare sunt utilizate pentru a introduce vectorul BAC în E. coli.

Efectul electroporativ al unei descărcări de înaltă tensiune asupra unei membrane lipidice cu două straturi depinde aparent de raza curburii acesteia. Prin urmare, celulele bacteriene mici absorb eficient ADN-ul la o intensitate a câmpului mult mai mare (12-18 kV/cm) decât celulele mari de animale și plante care absorb eficient ADN-ul la o putere de câmp de 1-2 kV/cm. Electroporația este cea mai simplă, eficientă și reproductibilă metodă de introducere a moleculelor de ADN în celule, care, totuși, necesită un dispozitiv special de electroporator.

Alte metode de perforare pentru livrarea ADN-ului într-o celulă sunt: ​​tratamentul celulelor cu ultrasunete, răzuirea celulelor de pe un substrat în prezența materialului exogen, centrifugarea celulelor într-un mediu cu ADN în combinație cu electroporarea, perforarea osmotică a membranei plasmatice, celulă. sonda printr-un microraz laser și utilizarea unei toxine streptolizin-O care formează pori.

Transfecția. Inițial, acest termen însemna introducerea ADN-ului viral în celule, acum sensul său s-a extins pentru a însemna introducerea oricărui ADN străin în celulele eucariote. Termenul „transformare”, care desemnează procesul de introducere a ADN-ului într-o celulă pentru procariote și drojdie, sa dovedit a fi incomod de utilizat, deoarece în raport cu celulele animale, transformarea este transformarea celulelor normale în celule canceroase. Într-un sens restrâns, transfecția este în general înțeleasă ca introducerea ADN-ului în celulele eucariote folosind diverși reactivi chimici.

Una dintre primele metode dezvoltate pentru transfecția eficientă a fost incubarea ADN-ului cu DEAE-dextran. Eficiența obținută a fost comparabilă cu transformarea bacteriilor și a ajuns la 106 transfectanți per µg de ADN.

Mecanismul de acțiune al DEAE-dextran nu a fost pe deplin stabilit, dar se știe că se leagă de ADN și de membrana celulară, stimulând pinocitoza (Fig. 2.8), deși nu este el însuși preluat de celule. Dezavantajele metodei includ toxicitatea DEAE-dextran pentru unele tipuri de celule, dependența eficienței de calitatea preparatului și frecvența foarte scăzută de obținere a transfectanților stabili.

Orez. 2.8. Schema de introducere a ADN-ului ca parte a diferitelor complexe în celulă prin endocitoză: fagocitoză și pinocitoză (a). Reprezentare schematică a unei particule dintr-un polication non-lipidic într-un dendroform cu ADN legat, a cărui sarcină negativă este compensată de un polimer cationic (b)

Eficiența transfecției a fost crescută de 10-100 de ori prin incubarea celulelor cu ADN precipitat cu fosfat de calciu. Particulele dense ale precipitatului de calciu al ADN-ului sunt absorbite de celulă prin fagocitoză (Fig. 2.8), dar doar o mică parte din moleculele pătrunzătoare ajunge la nucleu și este integrată în ADN-ul cromozomial. Metoda fosfatului de calciu este mai eficientă și mai ieftină, dar provoacă ruperea moleculelor de ADN, care transformă moleculele circulare într-o formă liniară, uneori neinfecțioasă în cazul transfecției virusurilor. În plus, condițiile pentru transfecția cu fosfat de calciu trebuie selectate individual pentru fiecare celulă țintă.

În timpul căutării altor reactivi de transfecție, s-a descoperit că moleculele de polimer care poartă o sarcină cationică în exces pot crește semnificativ eficiența transfecției. Cationii polimerici formează complexe stabili cu încărcături neutralizate cu acizii nucleici, care pot transporta ADN-ul și ARN-ul în celulă cu eficiență ridicată, protejând împotriva acțiunii endonucleazelor în drumul către nucleu (Fig. 2.9).

Orez. 2. 9. Schema transportului ADN-ului în nucleul celulei ca parte a unui complex polication-ADN asociat cu un ligand specific prin endocitoză mediată de ligand

Cationii polimerici nelipici sintetici într-o conformație liniară sau ramificată (forma dendritică) pot condensa ADN-ul și ARN-ul în particule relativ mici, care apoi se leagă de membrana celulară și intră în celulă prin endocitoză nespecifică. În prezent, pentru transfecția din grupul policationilor non-lipidici, în principal polietilenimină, poliamidoamine și dendrimeri pe bază de aceștia, se folosesc proteine ​​cationice precum polilizina, protamina și histonele, precum și diverse produse comerciale, precum PAMAM.

O revoluție a fost introducerea în practică a primei lipide cationice cu toxicitate scăzută DOTMA (1,2-dioleil-3-N,N,N-trimetilaminopropan) sintetizată de Feigner (Feigner, 1987) și colab. Eficiența transfecției cu lipidele cationice (Figura 2.10) a fost de aproximativ 100 de ori mai mare decât orice altă substanță chimică, cu o proporție mare de celule transgenice stabile.

Orez. Fig. 2. 10. Structura complexului cu ADN (a) și structura generală a polimerului lipidic cationic (b). Polimerii lipidici cationici (liniari și ramificati), similari ca structură și proprietăți cu fosfolipidele membranei celulare, formează complexe cu ADN-ul sub formă de lipozomi cationici multistrat (a) cu amestecare simplă de reactivi. Astfel de complexe intră în celulă prin endocitoză sau fuziune cu membrana celulară prin partea lipidică.

Totodată, a fost introdus în practică un nou termen de „lipofecție”, subliniind eficiența ridicată a transformării genetice a celulelor, aducând complexele lipido-cationice mai aproape de particulele virale infecțioase.

Pe baza acestui succes, au fost dezvoltate numeroase variații ale acestor compuși (Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin etc.).

În paralel, au fost dezvoltate vehicule de livrare bazate pe lipozomi fosfolipidici umpluți cu ADN sau ARN.

Sfere mici de membrane artificiale pot fuziona cu membranele plasmatice ale celulelor sau pot fi preluate de endocitoză, eliberând conținutul în celulă. Eficiența scăzută a transfecției lipozomale a fost crescută prin introducerea de fosfolipide în structura lipozomilor, de exemplu, cardiolipină și fosfatidiletanolamină, care, împreună cu membranele cu două straturi, formează și structuri micelare inversate, cunoscute sub numele de faze cubice și hexagonale, capabile să inițieze membrana. fuziune.

Metoda lipozomală este destul de capricioasă și necesită o selecție atentă a tuturor condițiilor pentru transfecția eficientă a celulelor specifice. În plus, procedura de încapsulare, de obicei sonicare, deteriorează adesea moleculele mari de ADN.

O nouă etapă în dezvoltarea reactivilor de transfecție a fost dezvoltarea unei livrări mai eficiente și mai țintite de acizi nucleici către celulele țintă specifice prin introducerea diferiților liganzi în structura reactivilor de transfecție sintetici și a lipozomilor pentru legarea la proteinele receptorului membranar. Prezența unor astfel de grupuri țintă (liganzi) recunoscute de receptorii celulari face posibilă utilizarea mecanismelor de endocitoză mediată de liganzi (vezi Fig. 2.9).

Ca atare, sunt utilizaţi liganzi, proteine ​​şi peptide recunoscute de receptori; oligozaharide, deoarece pe suprafața multor celule animale există lectine - proteine ​​receptor care le leagă în mod specific; polizaharide. Procesele de interacțiune cu celulele unor astfel de complexe reactiv de transfecție ADN (ARN) țintite sunt similare cu pătrunderea particulelor virale în celulă.

În prezent, companiile de biotehnologie oferă o gamă largă de reactivi de transfecție diferiți - de la cei mai simpli și mai ieftini până la cele mai recente dezvoltări, specializate pentru diferite tipuri de celule și sarcini. Crearea de noi reactivi de transfecție și mai eficienți continuă, de asemenea, intens.

Microinjecție - membrana celulară este străpunsă cu un microac și o soluție care conține ADN este injectată în citoplasma celulei sau direct în nucleu dacă nucleul este suficient de mare (de exemplu, nucleul unui ou). Microinjectarea ADN-ului în celulele de mamifere a devenit posibilă odată cu apariția unui dispozitiv pentru fabricarea de micropipete cu un diametru de 0,1-0,5 microni și a unui micromanipulator. Metoda este foarte eficientă, proporția de celule cu integrare și expresie stabilă a genelor injectate poate ajunge la 50%. Avantajul metodei descrise este, de asemenea, că permite introducerea oricărui ADN în orice celulă și nu este necesară presiunea selectivă pentru a păstra gena introdusă în celule.

Transfecția balistică, biobalistică sau biolistică (bombardamentul cu microparticule), se bazează pe bombardarea celulelor cu microsfere de aproximativ 1-2 microni, acoperite cu ADN. Se folosesc microparticule de aur, wolfram (uneori fitotoxice), silicon și diverse nanosfere sintetice. Microparticulele acoperite cu ADN trec prin straturile celulare și transferă constructul genetic direct în organele și nucleele celulelor. Creat în acest scop, „pistolul cu gene” (pistolul cu gene) sau „pistolul cu gene”, care a fost dezvoltat de J. Sanford în 1987 pentru a introduce ADN în boabele de cereale, este similar în design cu armele pneumatice ( Fig. 2.11) .

Orez. 2.11. Introducerea ADN-ului recombinant în frunzele plantelor folosind un pistol cu ​​gene reutilizabile Bio-Rad (a) și schema sa generală (b). Pulsul de heliu ejectează microparticule acoperite cu ADN sau ARN din capsula eșantionului. Microparticulele care transportă ADN sunt accelerate și concentrate pentru o penetrare maximă în celule, mișcându-se de-a lungul canalului de accelerare și de-a lungul țevii pistolului, în timp ce la o ieșire largă fluxul de heliu diverge difuz spre laterale. Distanțiatorul filtrului menține distanța optimă pentru a lovi ținta cu o îndepărtare maximă a heliului pentru a minimiza efectele dăunătoare asupra suprafeței celulei.

Adâncimea de penetrare a microparticulelor, de regulă, este mică - până la 1 mm, cu toate acestea, în condiții speciale de decojire, microparticulele pot pătrunde în țesut la o adâncime de 4-5 mm și pot transfera gene, de exemplu, în fibrele musculare striate. Transfecția balistică este foarte eficientă chiar și acolo unde pereții celulari groși (drojdii, plante) reprezintă un obstacol în calea multor alte metode de livrare și se aplică țesuturilor, organelor și chiar organismelor întregi. În prezent este utilizat pe scară largă în terapia genică pentru a obține animale și plante transgenice.

O astfel de varietate de mijloace și metode de transfecție se datorează diferitelor sarcini, unei game largi de celule țintă și tipuri de acizi nucleici livrate celulelor, precum și nevoii societății de a obține mijloace din ce în ce mai eficiente de a furniza informații genetice în celule. , țesuturi și organisme întregi. O atenție deosebită este acordată dezvoltării de reactivi și metode de transfecție în legătură cu perspectivele uimitoare ale terapiei genetice umane, care necesită vehicule de livrare a genelor țintite, foarte eficiente și sigure.

Introducerea stabilă și tranzitorie de ADN străin în celulă. După introducerea ADN-ului recombinant într-o celulă eucariotă, doar o mică parte din acesta ajunge în nucleu, deoarece membrana nucleară este o barieră formidabilă pentru ADN-ul străin. În nucleu, ADN-ul recombinant poate fi integrat în cromozom sau poate exista de ceva timp în stare extracromozomială.

În consecință, se face o distincție între transfecția stabilă, atunci când ADN-ul recombinant se integrează în cromozomii celulelor primitoare și devine parte integrantă a acestora, precum și transfecția temporară sau tranzitorie, în care moleculele de ADN recombinant există și sunt transcrise în nuclee într-un extracromozomial. stare pentru scurt timp. Moștenirea stabilă a ADN-ului străin introdus este condiția principală pentru obținerea de organisme transgenice în scopuri economice.

Prin urmare, se acordă o atenție deosebită dezvoltării metodelor de introducere a ADN-ului în celule, conducând la producerea unei proporții mai mari de transformanți stabili. În plus, un procent mare de transformanți stabili face, de asemenea, posibilă abandonarea genelor selective și marker care sunt balast în crearea organismelor transgenice.

PE. Voinov, T.G. Volova

Invenţia se referă la domeniul biotehnologiei, în special la o metodă pentru livrarea ţintită a ADN-ului la celulele tumorale şi stem care exprimă receptorul CXCR4. Prezenta invenţie poate fi utilizată pentru livrarea ţintită a constructelor genetice către celulele tumorale stem şi maligne pentru a corecta defectele genelor şi a preveni bolile. Metoda include prepararea purtătorilor de construcții genetice prin includerea secvențelor semnal în compoziția moleculelor purtătoare, care este o secvență de legare la ADN din opt resturi de aminoacizi de lizină - KKKKKKKKK. Atașarea secvenței semnal la secvența de legare a ADN-ului se realizează folosind o secțiune linker din două molecule de acid e-aminohexanoic. După aceea, se formează complexe ADN/purtător. Apoi se efectuează transfecția in vitro. Invenţia propusă face posibilă creşterea eficienţei eliberării genei de interes la tumori şi celulele stem. 2 w.p. f-ly, 4 bolnav.

Invenția se referă la medicina genetică, terapia genică, biotehnologie și produse farmaceutice și poate fi utilizată pentru livrarea țintită a constructelor genetice la celulele tumorale stem și maligne pentru a corecta defectele genelor și a preveni bolile. Livrarea specifică țesutului a constructelor genelor este asigurată prin utilizarea secvențelor semnal pentru receptorul CXCR4, care este exprimat în celule de acest tip.

Ceea ce distinge terapia genică de abordările medicinei convenționale este concentrarea pe combaterea cauzei bolii, mai degrabă decât asupra simptomelor și consecințelor. În prezent sunt dezvoltate abordări de terapie genetică pentru a trata sau a preveni o gamă largă de boli umane. Aceste abordări pot fi aplicabile terapiei in vivo și ex vivo. Terapia in vivo se bazează pe introducerea directă a constructelor genetice direct în țesuturile corpului. Livrarea se poate face intravenos folosind dozatoare de aerosoli sau injecții în țesuturi specifice. Terapia genică ex vivo se bazează pe izolarea unui anumit tip de celule din organism, introducerea unui construct de genă „terapeutic” în ele, selecția celulelor transfectate și reimplantarea ulterioară la un pacient.

Există trei direcții principale în abordările dezvoltate în prezent pentru furnizarea de constructe genetice:

1) clonarea ca parte a vectorilor virali;

2) utilizarea metodelor fizice de transfecție;

3) utilizarea complecșilor de vectori de expresie plasmidică și a moleculelor purtătoare nevirale.

Transferul mediat de virus este o metodă extrem de eficientă pentru livrarea ADN-ului către celulele țintă, deoarece intrarea unui vector viral modificat este similară cu procesul care are loc în mod natural atunci când genomul virusului este transferat în celulele gazdă. Cei mai studiati sunt vectorii creati pe baza virusurilor retro-, adeno-, adeno-asociate. Avantajele virusurilor includ, în primul rând, combinația dintre proprietățile vectorului de expresie și ale purtătorului, posibilitatea de livrare specifică, capacitatea de a transfecta celulele în diviziune și nedivizarea, posibilitatea de a încorpora ADN în cromozom pentru a asigura expresie pe termen lung. Datorită acestor avantaje, această abordare este încă utilizată pe scară largă în studiile de livrare a genelor, deși are unele dezavantaje. Virușii retro- și adeno-asociați au o dimensiune limitată a fragmentului de ADN donat și riscul de mutageneză inserțională atunci când virusul este inserat în genomul gazdă. Un dezavantaj serios al vectorilor adenovirali este un răspuns imun pronunțat la doze mari și injecții repetate de constructe adenovirale (Walther W., Stein U. Vectori virali pentru transferul de gene: o revizuire a utilizării lor în tratamentul bolilor umane // Medicamente. - 2000. - v. 60. - P. 249-271, brevet RF nr. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, publicat în 20.05.2005).

Injectarea de constructe de ADN plasmidic gol a fost una dintre primele abordări în dezvoltarea strategiilor de tratament cu terapie genică. Eficiența scăzută a transfecției folosind ADN-ul „gol” a dat impuls dezvoltării de noi metode pentru livrarea constructelor genetice. Au fost studiate diferite metode fizice pentru livrarea ADN-ului în celulele corpului. Cele mai populare dintre ele sunt metoda de transfecție balistică și electroporare, care sunt utilizate pe scară largă pentru transfecția pielii și a celulelor musculare. Metoda de transfecție balistică se bazează pe pătrunderea în celula a ADN-ului depus pe microparticule de aur sau tungsten. Transfecția are loc sub presiunea unui curent de gaz sau lichid comprimat. Metoda electroporării se bazează pe o modificare locală a potențialului electric al membranei celulare datorită acțiunii unui curent electric. Impulsurile electrice duc la formarea de pori în membrana celulară, făcând-o astfel permeabilă la biomolecule. Pentru a depăși eficiența scăzută a transfecției ADN-ului gol in vivo, se folosește și metoda șocului hidrodinamic - injectarea intravenoasă sau intra-arterială a unui vector plasmid într-o soluție de volum mare. Principalele dezavantaje ale metodelor fizice existente de transfecție sunt eficiența scăzută și localitatea efectului de livrare a ADN-ului. Ele permit plasmidei să depășească membrana celulară și să evite includerea în endozomi, prevenind astfel degradarea enzimatică, dar, de regulă, nu asigură persistența pe termen lung a constructelor genetice introduse (Wells D.J. Progresul și perspectivele terapiei genice: electroporarea și alte metode fizice // Gene Ther. - 2004. - v.11, No. 18. - P.1363-1369, Wang S., Joshi S, Lu S. Delivery of DNA to skin by particule bombardement // Methods Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196;Herweijer H., Wolff J.A. Progrese și perspective: transferul și terapia de gene ale ADN-ului gol // Terapia genică. - 2003. - v.10, nr. 6. - P .453-458).

Purtătorii non-virali sunt o alternativă la transferul mediat de virus al constructelor genetice în celulele de mamifere. Purtătorii nevirali sunt ușor de sintetizat, ușurința modificării lor face posibilă efectuarea de modificări în structura și compoziția moleculelor, îmbunătățind astfel mijloacele de livrare. Când se utilizează medii non-virale, nu există restricții cu privire la dimensiunea vectorului de expresie furnizat. În plus, sunt mai puțin toxice, în cele mai multe cazuri nu provoacă un răspuns imun specific și sunt mai sigure de utilizat in vivo decât vectorii virali. Prin urmare, introducerea unui construct genetic ambalat în purtători non-virali poate fi repetată. Studiul purtătorilor nevirali se dezvoltă în direcția îmbunătățirii proprietăților de transfecție ale ADN-ului plasmidic prin formarea de complexe ADN cu diverși compuși sintetici (lipide, oligo- și polipeptide, polimeri etc.) (de exemplu, brevetul RF nr. 2336090). , A61K 39/00, A61K 47/00, publicat în 20.10.2008). Îmbunătățirea vehiculelor de livrare non-virale depinde în mare măsură de o înțelegere detaliată a barierelor din calea pătrunderii ADN-ului în celulele corpului (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Vectori non-virali și hibridi în terapia genetică umană: o actualizare // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72;Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectori și sisteme de livrare în terapia genică // Med Sci Monit - 2005. - v .11, nr. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Bariere la livrarea genelor nonvirale // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, nr. 2. - P .203-217).

Se crede că un purtător non-viral ar trebui să aibă următoarele caracteristici:

1) să fie netoxice, compacte și să protejeze ADN-ul plasmidic de degradarea enzimatică, să fie excretată din organism după utilizare;

2) asigură pătrunderea plasmidei în celulă prin legarea specifică de membrana plasmatică a celulei:

3) au capacitatea de a elibera ADN din compartimentul endozomal;

asigura disocierea ADN-ului de complex pentru transportul ulterior al plasmidei în nucleu.

În scopul terapiei genice, metoda cea mai preferată de livrare a constructelor genetice este transferul lor specific țesuturilor în celulele și țesuturile corpului.

Prima barieră în calea pătrunderii intracelulare a complexelor este membrana plasmatică. Majoritatea complexelor interacționează cu suprafața celulei folosind forțe electrostatice. Un posibil mecanism pentru legarea complexelor de celulă este interacțiunea acestora cu proteinele de suprafață celulară, glicozaminoglicanii. Cu toate acestea, cu acest mecanism de penetrare a complexelor, nu există un transfer specific de țesut al constructelor genice. În același timp, problema eliberării specifice de țesut a constructelor genetice este relevantă pentru terapia genică pentru o serie de boli. Pentru o interacțiune specifică cu suprafața celulei, complexele includ liganzi la receptorii de pe suprafața celulei. Până în prezent, un număr de liganzi peptidici integrinei au fost caracterizați. Acestea includ, în special, fragmentul tripeptidic RGD (integrinele sunt prezente pe suprafața multor celule), transferrina (receptorul său are o expresie crescută în celulele în proliferare), asialorosomucoid (receptorul asialoglicoproteinelor are o expresie specifică în hepatocitele hepatice).

Pentru livrarea specifică a materialului genetic în celulele nervoase, Zeng și colegii au propus utilizarea unui purtător constând dintr-o regiune semnal către receptorul TrkA (80-108 aminoacizi din factorul de creștere nervoasă) și o secvență de legare la ADN din 10 reziduuri de aminoacizi de lizină. . Acest purtător, în prezența agentului endosomolitic clorochina, care facilitează eliberarea complexelor din compartimentul endosomal al celulei, a fost capabil să livreze gena marker în mod specific de țesut numai celulelor care exprimă receptorul TrkA. Acest purtător poate fi utilizat pentru tratamentul de terapie genică a diferitelor boli neurologice, cum ar fi epilepsia, bolile Parkinson și Alzheimer. Cu toate acestea, nu este potrivit pentru furnizarea de material genetic la alte tipuri de celule (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S O peptidă sintetică care conține bucla 4 a factorului de creștere nervoasă pentru livrarea țintită a genelor // J Gene Med 2004; 6; : 1247 -1256).

Celulele stem umane sunt considerate agenți promițători pentru terapia celulară și genică pentru diferite boli umane. În același timp, ele sunt printre cele mai greu de transfectat tipuri de celule. În tratamentul cu terapia genică a cancerului, este necesar să se asigure livrarea genelor direct către celulele tumorale.

CXCR4 este un receptor al factorului de migrare a celulelor stem pentru chemokina SDF-1α. CXCR4 este exprimat în celulele hematopoietice, endoteliul vascular și celulele satelite musculare. Un nivel ridicat de expresie a acestei gene a fost observat în peste 20 de tipuri de tumori canceroase (cancer de sân, cancer de prostată etc.), precum și în celulele stem migratoare. Receptorul CXCR4 este, de asemenea, capabil să se lege de chemokina virală vMIP-II (virusul sarcomului Kaposi). Astfel, includerea secvențelor semnal pentru legarea la receptorul CXCR4 în moleculele purtătoare este o modalitate promițătoare de a crea sisteme pentru livrarea țintită a genelor către tumori și celulele stem.

Pentru a furniza material genetic celulelor care exprimă receptorul CXCR4, Le Bon și colegii au folosit un ligand sintetic pentru acest receptor, AMD3100, care a fost cuplat cu polietilenimină sau lipide cationice. Complexele de material genetic cu acești compuși nu au condus la o creștere semnificativă a eficienței livrării genei marker la celulele CXCR4+ în comparație cu compușii fără semnale. Purtătorii folosiți de Le Bon nu au fost eficienți, deoarece livrarea specifică cu ajutorul lor este posibilă numai atunci când în mediul de transfecție se adaugă o substanță care favorizează internalizarea receptorului CXCR4 (ester de forbol). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Gene Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells. // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).

Astfel, există o nevoie de a crea un purtător de constructe genetice care să poată asigura livrarea specifică celulelor CXCR4(+) și să nu afecteze țesuturile din apropiere. O astfel de metodă este furnizată de prezenta invenţie.

Invenția se bazează pe sarcina de a dezvolta o metodă pentru livrarea specifică a constructelor genetice la celulele care exprimă receptorul CXCR4, în care, prin utilizarea purtătorilor de constructe genetice care conțin secvențe semnal pentru receptorul CXCR4, o creștere a eficienței de livrare a se realizează gena „interesului”. Este important de remarcat faptul că sinteza purtătorilor revendicaţi poate fi efectuată utilizând oricare dintre metodele cunoscute de sinteză a peptidelor în fază solidă.

Soluția problemei tehnice este oferită de faptul că în metoda de livrare țintită a ADN-ului către celulele tumorale și stem care exprimă receptorul CXCR4, inclusiv prepararea purtătorilor de constructe genetice prin includerea în compoziția moleculelor purtătoare, care este o secvență de legare ADN a opt resturi de aminoacizi de lizină - KKKKKKKK, secvențe semnal, formarea de complexe ADN/purtător, efectuarea transfecției in vitro, secvența semnal este selectată din grupul: un fragment de la 1 la 8 aminoacizi de secvența capătului N-terminal al proteinei SDF-1a - KPVSLSYR; un fragment de la 1 la 17 aminoacizi din secvența capătului N-terminal al proteinei SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, unde 9 și 11 aminoacizi sunt înlocuiți cu serină; sau un fragment de la 1 la 10 aminoacizi ai secvenţei N-terminale a chemokinei virale vMIP-II - LGASWHRPDK; atașarea secvenței semnal la secvența de legare a ADN-ului se realizează folosind un situs linker a două molecule de acid ε-aminohexanoic.

în acest caz, secvenţa semnal poate fi un fragment de la aminoacizii 1 la 8 din secvenţa capătului N-terminal al proteinei SDF-1a-KPVSLSYR.

Alternativ, secvența semnal poate fi un fragment de la 1 la 17 aminoacizi din secvența capătului N-terminal al proteinei SDF-1a - KPVSLSYRCPCRFFESH, unde 9 și 11 aminoacizi sunt înlocuiți cu serină.

Un fragment de la aminoacizii 1 la 10 din secvența N-terminală a chemokinei virale vMIP-II - LGASWHRPDK, sintetizat din D-aminoacizi, poate fi de asemenea utilizat ca regiune semnal.

Glicerolul sau clorochina pot fi utilizate ca o componentă care asigură ieșirea din endozomi a unor complexe constând din purtători și material genetic.

ADN-ul plasmid poate fi folosit ca material genetic pentru purtători.

Rezultatul tehnic specificat în prezenta invenție este obținut prin utilizarea moleculelor de oligolizină - KKKKKKKK (K8) ca purtător, conjugat cu secvențe semnal la receptorul CXCR4 de la proteinele SDF-1 sau vMIP-II, și anume secvența N-terminală a chemokina SDF-1 (cu 1 la 8 aa) sau secvența N-terminală a chemokinei SDF-1 (de la 1 la 17 aa, cu înlocuirea lui 9 și 11 aa cu serină) sau secvența N-terminală a Chemokină virală vMIP-II (de la 1 la 10 aa în conformația D). Prezența oligolizinei KKKKKKKK în compoziția purtătorului permite conjugaților să formeze complexe cu acizii nucleici, în special cu ADN-ul plasmid, datorită interacțiunii electrostatice.

Rezultatul tehnic specificat este atins prin trei variante ale suportului propus.

Rezultatul tehnic specificat conform primei variante este atins prin faptul că în purtătorul scurt CDP bazat pe analogi sintetici ai chemokinei SDF-1, care include o componentă cationică, care este oligolizina K8 utilizată pentru condensarea ADN-ului plasmid, și un ligand. componentă pentru interacțiunea cu receptorul CXCR4, conform invenției, un fragment (1-8 aa) din secvența capătului N-terminal al proteinei SDF-1, având structura KPVSLSYR și având activitate de agonişti ai receptorul CXCR4, este utilizat ca componentă ligand, iar componenta cationică a conjugatului are structura KKKKKKKK și este atașată la componenta ligand printr-un distanțier - două molecule de acid ε-aminohexanoic (Ahx).

Rezultatul tehnic specificat conform celei de-a doua variante este atins prin faptul că în purtătorul (CDP lung) bazat pe analogi sintetici ai chemokinei SDF-1, care include o componentă cationică, care este oligolizina K8 utilizată pentru condensarea ADN-ului plasmid și o componentă ligand pentru interacțiunea cu receptorul CXCR4, în conformitate cu invenția revendicată, un fragment (1-17 aa; aa9 și aa11 înlocuit cu serină) din secvența capătului N-terminal al proteinei SDF-1, având structura KPVSLSYRSPSRFFESH și având activitate de agonişti ai receptorului CXCR4, este utilizat ca componentă ligand, iar componenta cationică a conjugatului are structura KKKKKKKK și atașată la componenta ligand printr-un distanțier - două molecule de acid ε-aminohexanoic.

Rezultatul tehnic specificat conform celei de-a treia variante este atins prin faptul că în purtătorul (CDP viral) pe bază de analogi sintetici ai proteinei virusului sarcomului Kaposi vMIP-II, care include o componentă cationică, care este oligolizina K8, utilizată pentru a condensa ADN-ul plasmidic și o componentă ligand pentru interacțiunea cu receptorul CXCR4, în conformitate cu invenția revendicată, un fragment (1-10 Daa - sintetizat din D-aminoacizi) din secvența capătului N-terminal al vMIP- Proteina II, având structura LGASWHRPDK și având activitate de antagoniști ai receptorului CXCR4, este utilizată ca componentă ligand, iar componenta cationică a conjugatului are structura KKKKKKKKK și atașată la componenta ligand printr-un distanțier - două molecule de ε -acid aminohexanoic.

Toate cele trei variante ale purtătorului revendicat pot fi sintetizate folosind metode cunoscute de sinteză a peptidelor, de exemplu, metoda Boc în fază solidă (Merrifield, R.B. Sinteza peptidei în fază solidă. I. Sinteza unei tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society). 1963. V.85 (14), p.2149-2154).

Exemple specifice de implementare

Invenţia este ilustrată folosind figura 1, care arată modificarea intensităţii fluorescenţei bromurii de etidio cu creşterea raporturilor de încărcare purtător/ADN în complexe CDP/ADN scurte, CDP/ADN lungi şi CDP/ADN virale. O scădere a intensității fluorescenței indică o creștere a densității complexelor formate. Platanizarea curbelor de fluorescență indică faptul că complexele au atins o densitate suficientă pentru a stinge fluorescența bromurii de etidio.

Figura 2 arată dependența activității luciferazei în celulele HeLa (CXCR4+) după transfecția cu complexe CDP/ADN scurte, CDP/ADN lungi și CDP/ADN virale în prezența agentului endozomolitic glicerol. În acest caz, s-au folosit complexele formate la următoarele rapoarte purtător/încărcare ADN: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Molecula intactă, ADN, complexele PEI/ADN 1/8 (control pozitiv al experimentului - polietilenimină ramificată purtător comercial 25 kDa - PEI) și complexele care conțin ADN și peptidă de control (CP) au servit drept controale experimentale. CP diferă de purtătorii din prezenta invenție prin faptul că îi lipsește un semnal de legare la receptorul CXCR4 și este structural o oligolizină KKKKKKKK. Eficiența eliberării genei marker de către purtătorii CDP scurt, CDP lung și CDP viral a fost de 10-100 de ori mai mare decât cea a CP de control.

Figura 3 arată dependența activității luciferazei în celulele A172 (CXCR4+) după transfecția cu complexe CDP/ADN scurte, CDP/ADN lungi și CDP/ADN virale în prezența agentului endosomolitic glicerol. Aici am folosit complecși formați la următoarele rapoarte de încărcare purtător/ADN: 9/1, 12/1. O moleculă de ADN intactă, complexe PEI/ADN 1/8 și complexe care conțin ADN și peptidă CP au servit drept controale experimentale. Eficiența eliberării genei marker de către purtătorii CDP scurt, CDP lung și CDP viral a fost de 10 ori mai mare decât cea a CP martor.

Rezultatele din Figura 2 și Figura 3 susțin specificitatea purtătorilor din prezenta invenție pentru receptorul CXCR4.

Figura 4 prezintă dependența activității luciferazei în celulele CHO (CXCR4-) după transfecția cu complexe CDP/ADN scurte, CDP/ADN lungi și complexe virale CDP/ADN în prezența agentului endosomolitic glicerol. S-au folosit complexele formate la următoarele rapoarte purtător/încărcare ADN: 9/1, 12/1. O moleculă de ADN intactă, complexe PEI/ADN 1/8 și complexe care conțin ADN și peptidă CP au servit drept controale experimentale. Eficiența eliberării genei marker de către purtătorii CDP scurt, CDP lung și CDP viral a fost aproape aceeași cu utilizarea CP de control.

Purtătorii cu un semnal nu sunt capabili să ofere un nivel semnificativ mai mare de livrare a materialului genetic în celule fără expresia receptorului în comparație cu controlul.

Implementarea invenţiei poate fi explicată după cum urmează. Obiectivul prezentei invenţii este de a asigura livrarea ţintită a constructelor genetice la celulele care exprimă receptorul CXCR4 utilizând purtători de material genetic care conţin secvenţe semnal pentru acest receptor.

În prima etapă, se realizează formarea de complexe ale uneia dintre exemplele de realizare ale purtătorului cu un construct genetic care conține gena „de interes”. Complecșii formați sunt utilizați pentru a livra materialul genetic la celulele țintă adecvate. Analiza eficienței penetrării celulare este evaluată prin metode enzimatice sau imunohistochimice.

Formarea complexelor se realizează într-o soluție izotonă. Este preferat tamponul fără sare HBM (manitol tamponat cu Hepes). Dimensiunea complexelor rezultate este de 170–230 nm.

Ca constructe genetice într-una dintre exemplele de realizare folosind ADN plasmid.

ADN-ul plasmidic conține un marker (luc, lacZ) sau o genă terapeutică (în funcție de boală), sub controlul unor promotori și amplificatori corespunzători (CMV, SV40 etc.) și alte elemente necesare, de exemplu, pentru replicarea în celula gazdă. sau integrarea în genom. În tratamentul cu terapie genică a cancerului, pot fi utilizate genele HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, timidin kinazei etc.

Într-un alt exemplu de realizare, oligonucleotidele constând din ADN sau ARN mic complementar unei secvenţe specifice din ARNm sau precursorul său sunt utilizate ca construct genetic pentru a suprima sinteza unui produs proteic sau pentru a elimina un exon care poartă o mutaţie din ARNm. Complexele formate sunt utilizate pentru a furniza material genetic celulelor care exprimă receptorul CXCR4. Penetrarea complecşilor purtători din prezenta invenţie are loc predominant prin transportul mediat de receptor prin legarea la domeniile extracelulare ale receptorului CXCR4 şi internalizarea ulterioară a receptorului.

Doza de purtători și material genetic este determinată individual și depinde de tipul de celule, de cantitatea de receptor CXCR4 de pe suprafața lor și de complexitatea transfectării acestor celule.

Pentru a crește eficiența acestor purtători, transfecția celulelor este de preferință efectuată folosind un agent endosomolitic. Acestea includ glicerol, clorochina și altele.Aceste substanțe sunt adăugate în mediul de transfecție imediat înainte ca complexele să fie adăugate la celule. Ei rămân nelegați de complexe și, prin urmare, nu le afectează structura.

Peptidele, alți compuși polimerici, lipozomii capabili să compacteze acizii nucleici pot fi utilizați ca parte de legare la ADN a purtătorului. În plus, ele pot avea proprietăți endosomolitice (nu este nevoie să se utilizeze un agent endosomolitic suplimentar) și, atunci când este necesar (de exemplu, pentru livrarea de gene terapeutice sau marker), eliberează material genetic în nucleu.

Atunci când se selectează condițiile de transfecție, acestea sunt concepute pentru a oferi cea mai mare eficiență de livrare. Este de preferat să se incubeze complexe cu celule timp de 4 ore. Cu toate acestea, puteți varia acest timp de la 3 la 6 ore. După ce a trecut timpul de incubare, mediul este schimbat și celulele sunt lăsate timp de 24-48 de ore (în funcție de tipul celulei și de materialul genetic) pentru exprimarea constructelor introduse cu gena de interes sau manifestarea efectului terapeutic. de oligonucleotide.

Analiza eficienței eliberării este efectuată prin metode enzimatice sau imunohistochimice, în funcție de tipul de construcție genică introdusă.

Exemplul 1 Formarea complexelor ADN/purtător și studiul procesului de complexare.

Plasmida pCLUC4 care conține gena luciferază de licurici sub controlul promotorului citomegalovirusului a fost utilizată ca material genetic pentru livrarea țintită a genelor în celule. A fost utilizată una dintre exemplele de realizare ale purtătorului.

Soluții de 1 μg de ADN în 40 μl de tampon HBM 1X (manitol 5% g/v, 5 mM Hepes, pH 7,5) și soluții de purtător corespunzătoare diferitelor rapoarte de încărcare ADN/purtător au fost preparate într-un volum egal de tampon. Soluția purtător a fost adăugată treptat în tubul Eppendorf cu soluția de ADN și agitată energic timp de 20 de secunde. Amestecul rezultat a fost lăsat timp de 30 de minute la temperatura camerei pentru a finaliza formarea complexelor.

Rezultatele complexării sunt analizate prin metoda deplasării bromurii de etidio. Fluorescența bromurii de etidio este măsurată folosind un cititor multimod de scanare spectrală Varioscan Flash (Thermo, Finlanda). Deplasarea bromurii de etidio a fost observată la 590 nm (excitație la 544 nm) după adăugarea purtătorului la ADN (20 μg/ml) preincubat cu agent de intercalare bromură de etidio (400 ng/ml). Deplasarea a fost calculată utilizând formula (F-Ff)/(Fb-Ff), în care Ff și Fb sunt intensitățile de fluorescență a bromurii de etidio în absența și respectiv prezența ADN-ului.Rezultatele sunt prezentate în FIG.

Exemplul 2 Efectuarea transfecției in vitro.

Celulele HeLa, A172 și CHO au fost plasate pe plăci de cultură cu 48 de godeuri (Nunc) cu 24 de ore înainte de transfecție la 50.000 de celule per godeu, care conține 500 µl dintr-un amestec de cultură standard constând din mediu de cultură DMEM (GIBCO), ser fetal bovin 10% (GIBCO), glutamina 2 mM, suplimentată cu penicilină (50 U/ml), streptomicina (50 pg/ml) și piruvat de sodiu 1 mM. Suspensia de complexe a fost preparată conform metodei descrise în exemplul 1 la o rată de 2 μg de ADN per godeu al plăcii de cultură. Cu 10 minute înainte de adăugarea suspensiei de complexe ADN/purtător, celulele au fost spălate de mai multe ori cu DMEM și s-au adăugat în fiecare godeu 500 pl de mediu care conține 15% glicerol și 1,5% etanol. Transfecția a fost efectuată prin adăugarea unei suspensii de complexe ADN/purtător la mediu. După realizarea complexelor, plăcile cu celule au fost plasate într-un termostat cu o temperatură de 37°C și 5% CO2 timp de 4 ore. După timpul de incubare, celulele au fost spălate cu mediu DMEM și s-au adăugat 500 pl de amestec de cultură standard în fiecare godeu. Placa de cultură a fost incubată într-un termostat la o temperatură de 37°C și 5% C02 timp de 48 de ore, după care a fost detectată expresia genei marker.

Exemplul 3 Detectarea expresiei genei luciferazei după transfecție in vitro.

Mediul a fost îndepărtat de pe plăcile de cultură, celulele au fost spălate în 1x PBS (pH 7,2). La fiecare godeu s-au adăugat 80 pl tampon de liză (25 M Gly-Gly, 15 mM MgS04, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8). 50 μl de lizat au fost transferați în plăci de polistiren cu pereți opaci pentru a măsura activitatea luciferazei. Măsurarea a fost efectuată utilizând un cititor multi-mod de scanare spectrală Varioscan Flash (Thermo, Finlanda). Măsurarea a fost efectuată folosind o soluție de amestec flash de luciferază (20 mM Tricină, 1,07 mM (MgCO3) 4 Mg(OH) 2 x 5 H2O, 2,67 mM MgS04, 01 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 μM ATP , 270 μM acetil coenzima A, 470 μM luciferină). Fiecare măsurătoare a fost efectuată timp de 10 secunde. Citirile instrumentelor au fost obținute în unități de lumină relativă (RLU). Rezultatele experimentului au fost evaluate în unități ușoare relative la 1 mg de proteină totală din extractele celulare din godeul plăcii de cultură. Cantitatea totală de proteină din fiecare godeu a fost măsurată utilizând un kit de testare a proteinei (Bio-Rad), față de o curbă standard pentru albumina serică bovină. Rezultatele sunt prezentate în figurile 2, 3, 4.

Vaccin ADN(De asemenea vaccin genetic, vaccin cu acid nucleic)- un construct modificat genetic care, după ce a fost introdus într-o celulă, asigură producerea de proteine ​​​​patogene sau antigene tumorale și provoacă un răspuns imun. Introducerea vaccinurilor ADN în organism se numește imunizare genetică. Vaccinarea ADN are mai multe avantaje față de vaccinurile convenționale. În special, s-a demonstrat că astfel de vaccinuri asigură nu numai producerea de anticorpi (imunitate umorală), ci și un răspuns citotoxic specific (imunitate celulară), care anterior era realizabil numai cu vaccinuri vii. Astăzi, vaccinurile ADN nu sunt folosite pentru a trata oamenii, dar se prevede că imunizarea genetică va ajuta la depășirea unei game de boli.

Istoria creației

Ideea de a folosi fragmente de ADN pentru vaccinare a apărut în anii 1950 și 1960. După o serie de experimente, s-a constatat că informația genetică a ADN-ului își păstrează capacitatea de a fi transcrisă și tradusă după ce a fost transferată într-o altă celulă. În același an, s-a descoperit că introducerea genomului virusului poliomielitei în animale stimulează producția de anticorpi. Mai târziu, a fost demonstrată activarea imunității umorale pentru moleculele de ADN derivate din agenți neinfecțioși. Începând cu anii 1990, laboratoarele științifice au început să investigheze din ce în ce mai mult proprietățile imunostimulatoare ale ADN-ului. În 1992, Tang și colegii săi au arătat că gena hormonului uman de creștere introdusă într-o plasmidă este exprimată stabil la șoareci, iar hormonul sintetizat este recunoscut de sistemul imunitar ca antigen și stimulează producția de anticorpi. Procesul de introducere a ADN-ului plasmidic pentru a stimula imunitatea umorală a fost numit Tango „imunizare genetică”. Cu toate acestea, în anul următor, un alt grup de oameni de știință a declarat că introducerea unei plasmide care codifică proteinele virusului gripal provoacă atât un răspuns umoral, cât și unul celular. Inducerea ambelor ramuri ale imunității din același an a fost găsită și pentru plasmida care conține genele HIV. Din 1995, au început să apară dovezi că vaccinarea ADN poate activa sistemul imunitar împotriva cancerului. În urmă cu aproximativ 20 de ani, au avut loc primele teste clinice ale vaccinurilor ADN care, în primul rând, trebuiau să demonstreze siguranța noii metode. Pacienților li s-au injectat gene pentru HIV, virusul gripal, herpesul, hepatita B, agentul cauzal al malariei. Rezultatele tuturor testelor au fost destul de încurajatoare: vaccinurile ADN au fost exprimate în mod constant, au provocat un răspuns imunitar și nu au provocat efecte secundare grave, ceea ce a servit drept impuls pentru cercetările lor ulterioare.

Construcția unui vaccin ADN

Din punct de vedere structural, un vaccin ADN este o secvență de nucleotide încorporată într-un vector care codifică un antigen sau antigeni specifici. Un vector în inginerie genetică este o moleculă de acid nucleic care servește la livrarea materialului genetic în celule și asigură replicarea sau exprimarea acestuia. Anterior, vectori bazați pe viruși erau utilizați pentru a transporta gene în celulă: un virus variolic modificat (slăbit), adenovirusuri și retrovirusuri. Vectorii virali sunt destul de eficienți, dar au o probabilitate semnificativă de efecte secundare asociate cu imunogenitatea relativ ridicată a vectorului însuși. Prin urmare, astăzi o plasmidă bacteriană este folosită cel mai adesea ca vector - o moleculă circulară mică de ADN, capabilă de replicare autonomă. În sine, plasmida nu provoacă răspunsul imun specific dorit; pentru aceasta, genele proteinelor imunogene sunt cusute în ea. De asemenea, vaccinul ADN trebuie să conțină secvențele reglatoare necesare pentru expresia genelor în celulele eucariote. Construcția de ADN finită este livrată unei celule bacteriene, unde numărul de copii ale acesteia este crescut. Aceasta este urmată de izolarea și purificarea plasmidelor care poartă inserția dorită.

Design vectorial plasmid

O etapă importantă în crearea vaccinurilor ADN este proiectarea (construcția) unui vector. Structurile obligatorii ale unui vector plasmid sunt situsuri de restricție, un marker selectabil și o origine de replicare a unui vaccin ADN într-o celulă bacteriană. Pentru ca sinteza antigenului să aibă loc, vaccinul ADN trebuie să conțină un promotor și un semnal de poliadenilare. Promotorul este un factor important în eficacitatea vaccinului, deoarece determină puterea răspunsului imun: cu cât expresia genei care codifică antigenul viral sau tumoral este mai mare, cu atât răspunsul imun este mai puternic. Promotorul cel mai frecvent utilizat este virusul SV40 sau citomegalovirusul (CMV). Pentru a stabiliza transcriptele ARNm, în plasmidă este inserat un semnal de poliadenilare, cel mai adesea derivat din gena hormonului de creștere bovină. (BGH) sau virusul SV40. Genele bacteriene de rezistență la antibiotice sunt alese ca markeri selectabili, adesea gena de rezistență la kanamicină. La proiectarea vaccinurilor ADN, cel mai popular punct de origine al replicării Escherichia coli.

Selectarea genelor pentru imunizare

Vectorul este o componentă importantă a vaccinului ADN, dar imunogenitatea acestuia este determinată tocmai de inserție, secvența ADN care codifică antigenul. Dintre antigenele virale, proteinele de fuziune sunt cele mai potrivite pentru imunizare; acestea sunt proteine ​​relativ conservate care permit virusului să intre în celulă. Pentru vaccinarea împotriva bacteriilor gram-pozitive, este indicat să se introducă în vectorul plasmidic genele acelor proteine ​​bacteriene care determină patogeneza bolii. Dintre proteinele bacteriilor gram-negative, acestea au o imunogenitate ridicată. Pentru vaccinurile ADN antitumorale terapeutice se folosesc proteine ​​marker de celule canceroase.

Metode de administrare a vaccinurilor ADN în celule

Vaccinul finit trebuie livrat organismului uman sau animal, unde destinația sa sunt celulele prezentatoare de antigen (APC) - macrofage, celule dendritice, limfocite B. Aici va avea loc sinteza și modificarea post-translațională a antigenicului, după care va fi introdus în membrana celulară pentru a atrage atenția sistemului imunitar. Problema principală este de a furniza suficientă plasmidă la APC. Metodele de livrare a materialului genetic în celulă sunt de obicei împărțite în 2 grupuri: virale și non-virale. Deoarece vectorii virali au o serie de dezavantaje semnificative, în această secțiune sunt prezentate numai metode non-virale pentru administrarea vaccinurilor ADN.

microinjectie

La începutul anilor 1990, microinjecțiile intramusculare erau cel mai comun mod de a introduce ADN într-o celulă, datorită simplității metodei. Pentru a face acest lucru, ADN-ul este dizolvat în apă sau soluție izotonă, dacă este necesar, se adaugă un adjuvant (o substanță care sporește răspunsul imun). Apoi, folosind un tub subțire de sticlă, soluția este injectată în țesutul muscular, unde rolul APC este îndeplinit de celulele dendritice. Odată ajuns în nucleul celulei dendritice, vaccinul începe să fie exprimat și are loc sinteza proteinelor antigenului. Cu ajutorul microinjecțiilor, ADN-ul poate fi injectat subcutanat, în timus, ficat și țesutul tumoral; totuși, în țesutul muscular se observă cea mai lungă expresie (până la un an) a vaccinului ADN. Datorită concentrației mari de celule Langerhans (un subtip de celule dendritice), pielea este o țintă atractivă pentru vaccinarea ADN. Pentru administrarea intradermică (subcutanată), se utilizează o serie de microace, a căror lungime este de câteva sute de microni. Există diferite opțiuni pentru vaccinarea intradermică. Este mai ușor să includeți slăbirea cu o serie de microace a stratului cornos al pielii (stratul exterior al pielii, de obicei 10-20 microni) pentru a crește permeabilitatea acestuia pentru injectarea locală ulterioară a soluției de ADN. Mai eficientă este utilizarea de microace acoperite cu un vaccin uscat care se dizolvă sub piele. Eficiența acestei metode este de obicei scăzută, deoarece ADN-ul intră mai întâi în spațiul intercelular și abia apoi este inclus în celule.

electroporație

Electroporarea este o abordare tradițională pentru livrarea ADN-ului către celulele bacteriene și culturile celulare, bazată pe aplicarea unui impuls electric. Un astfel de impuls creează pori în membrana celulară, ceea ce facilitează intrarea ADN-ului încărcat negativ. Această metodă a fost adoptată pentru livrarea vaccinurilor ADN animalelor și oamenilor și poate crește semnificativ eficiența unei injecții convenționale. Dispozitivul pentru electroporare conține o sursă de curent electric și o rețea de unică folosință, care constă dintr-o seringă și electrozi cu ac. Seringa injectează vaccinul în țesutul muscular, iar electrozii creează un câmp electric care facilitează intrarea ADN-ului în miocite și celulele dendritice. Până în prezent, au fost dezvoltate dispozitive care pot crește eficacitatea vaccinării de 1000 de ori comparativ cu o injecție convențională. Electroporarea poate fi utilizată atât pentru administrarea intramusculară, cât și subcutanată a unui vaccin ADN. Dezavantajele sunt ușoare dureri la locul injectării, nevoia de dispozitive specializate. În loc de un câmp electric, se poate folosi un câmp magnetic. Astfel de dispozitive funcționează pe același principiu, dar în acest caz, procedura este complet nedureroasă și mai puțin dăunătoare pentru celule.

Acțiunea câmpului electric nu numai că sporește absorbția vaccinului ADN de către celule, dar stimulează și dezvoltarea unui răspuns imun. Utilizarea electroporării duce la leziuni minore ale țesuturilor - se dezvoltă un proces inflamator local. Când celulele sunt deteriorate, chemokinele sunt eliberate, astfel încât macrofagele, limfocitele și celulele dendritice sunt trimise la ele. Creșterea concentrației de celule imune la locul injectării crește eficacitatea vaccinului.

Sonoporație

Sonoporarea este o metodă de transfer de ADN străin în celule folosind ultrasunete. Ultrasunetele măresc permeabilitatea membranei celulare, drept urmare ADN-ul exogen pătrunde mai ușor în celulă. Sonoporarea a fost folosită pentru prima dată pentru a transfera gene într-o celulă în 1986. Această metodă este folosită pentru a introduce molecule de ADN în celulele corneei, creierului, țesutului osos, rinichilor, pancreasului, țesutului embrionar, mușchilor scheletici și cardiaci. Comparativ cu alte metode, sonoporația este puțin studiată, este nevoie de mult mai mult efort pentru a-și îmbunătăți eficacitatea, mai ales la nivelul întregului organism.

Transfecția balistică

Transfecția balistică se bazează pe decojirea (bombardarea) organelor și țesuturilor cu microparticule de metale grele (aur, wolfram) cu diametrul de 1-3 microni acoperite cu molecule de ADN. Introdus în acest fel, vaccinul ADN este exprimat în celulele țintă, iar produsele lor intră în sânge. Pentru a asigura accelerarea particulelor, se folosește un dispozitiv similar cu armele mici - un pistol cu ​​gene sau un pistol cu ​​gene. Microparticulele trec prin membranele celulare și transportă constructul genetic direct la nucleul celulei. Adâncimea de penetrare a microparticulelor, de regulă, este mică - până la 1 mm, astfel încât metoda este utilizată în principal pentru transfecția pielii sau a țesutului cartilajului adiacent. Condițiile speciale de înveliș permit microparticulelor să pătrundă la o adâncime de 4-5 mm și să transfere construcții genetice în fibrele musculare striate. De obicei, celulele situate direct în centrul împușcatului mor, în timp ce în zona de 0,6-1 cm de centru sunt celulele pro-transformate cu cel mai mare succes. Această tehnologie se mai numește și biobalistică sau biolistică.

Primul pistol genetic a fost creat de un grup de oameni de știință între 1983 și 1986 cu scopul de a transforma celulele vegetale. Era un pistol dezvoltat dintr-un dispozitiv de bătut automat în cuie. ADN-ul de la gena reporter (marker) a fost aplicat pe o minge de tungsten și împușcat într-o cutie Petri. Exprimarea genei reporter a indicat eficacitatea imunizării. Astăzi, particulele de aur sau argint sunt folosite pentru a furniza ADN, deoarece nu sunt toxice pentru celulă, spre deosebire de cele de tungsten.

Sub presiune mare

În 1999, au fost dezvoltate dispozitive de injectare care sunt capabile să administreze un vaccin ADN fără utilizarea unui ac. Astfel de dispozitive funcționează datorită forței Lorentz: un mic magnet puternic creează o presiune semnificativă, acționează un piston care ejectează medicamentul cu viteza sunetului. Schimbând puterea curentă, puteți alege adâncimea injecției și puteți doza medicamentele. Procedura este complet nedureroasă și a fost folosită anterior pentru administrarea de insulină la pacienții diabetici și pentru vaccinări la scară largă. Un dezavantaj semnificativ al acestei metode este că presiunea ridicată poate modifica teoretic structura moleculelor care sunt injectate. Cu toate acestea, această tehnologie de inserție continuă să fie îmbunătățită, iar astăzi au fost dezvoltate dispozitive care pot furniza ADN la o adâncime de până la 16 mm.

Ca parte a unui vector bacterian viu

Vectorii bacterieni vii sunt tulpini salmonela, Shigella sau listeria, care poartă o mutație în genele de biosinteză sau de invazie care elimină patogenitatea și capacitatea de a-și menține viabilitatea în organismul gazdă sau în mediu. În schimb, genele necesare pentru proteinele imunogene sunt inserate în genomul bacterian. Bacteria atenuată se administrează pe cale orală (prin gură, prin înghițire) sau intranazal (prin injectare în orificiul nazal), deci această metodă de vaccinare nu necesită niciun echipament. În plus, o astfel de administrare stimulează răspunsul imun al mucoasei, ceea ce este important deoarece majoritatea agenților patogeni intră în organism prin gură și orificiile nazale. Ocolind stomacul, bacteria slăbită intră în intestinul subțire. În plus, bacteria pătrunde în plăcile Peer - ganglionii limfatici intestinali. Odată ajunse în mijlocul plasturilor lui Peyer, bacteriile devin o țintă pentru macrofage și suferă fagocitoză. În citoplasma macrofagelor, bacteria eliberează vaccinul ADN, după care ADN-ul intră în nucleu, iar bacteria este făcută inofensivă de către sistemul imunitar.

Ambalare în lipozomi

Lipozomi - formațiuni sferice (aproximativ 100 nm în diametru), formate dintr-un strat dublu lipidic. Lipozomii sunt goale în interior, care este de obicei umplut cu un solvent, dar pot fi utilizați pentru a furniza diferite substanțe, inclusiv vaccinuri ADN. Învelișul lor hidrofob le permite să fuzioneze cu membranele celulare și să-și transporte conținutul în celulă. Utilizarea lipozomilor a început în 1965, iar acesta a devenit un motor puternic pentru dezvoltarea bionanotehnologiei.

O metodă promițătoare pentru introducerea directă a unui construct ADN în celulele țintă este livrarea unui construct genetic ca parte a lipozomilor cationici construiți din lipide încărcate pozitiv. Lipozomii cationici cu o moleculă de ADN încărcată negativ formează un complex ADN-lipid - lipoplex. Avantajele utilizării unor astfel de complexe sunt capacitatea de a transporta o cantitate mare de informații, neinfecțiozitatea, în plus, sunt simple și ieftin de fabricat. În 2003, au fost creați lipozomi extrem de mici, milimicroni, care sunt acoperiți cu un polimer de polietilen glicol, care sunt capabili să transporte ADN-ul terapeutic prin bariera hemato-encefalică și să-l transmită neuronilor din creier, ceea ce anterior era imposibil.

Format din poliplex

Poliplexurile, sisteme care constau din polimeri încărcați pozitiv (policationi) și molecule de ADN încărcate negativ, sunt utilizate pentru a introduce constructe mari de ADN (>10 kb) în celulă. Dimensiunea unor astfel de complexe este mai mică de 100 nm, ceea ce, pe de o parte, le expune la digestie cu macrofage (deoarece reacţionează la particule mai mari de 200 nm), iar pe de altă parte, sunt suficient de mari pentru a nu fi filtrate în rinichii.

Policationii condensează molecula de ADN în complexe, asigurându-i astfel stabilitatea și protecția împotriva acțiunii nucleazelor. Proteinele cationice, homopolimerii sintetici ai aminoacizilor (polizine, poliarginine), polizaharida chitosanului, polietilenamina pot servi drept polimeri de legare a ADN-ului. De obicei, policationul este în exces în compoziția poliplexului, drept urmare acest complex este solubil și încărcat pozitiv. Dacă un ligand pentru un receptor celular specific este atașat la poliplex, atunci vaccinul ADN poate fi direcționat către un tip de celulă specific. Procesul de livrare a materialului genetic în poliplex include două etape: extracelular (calea de la locul de injectare la celulele țintă) și intracelular (interacțiunea cu celulele țintă, endocitoză, ieșire din endozomi, livrare la nucleu). Prima barieră care trebuie depășită de complex este sângele și matricea extracelulară. Prin urmare, astfel de parametri fizici și chimici ai poliplexului sunt selectați pentru a crește stabilitatea acestuia, pentru a evita interacțiunile nedorite cu proteinele din sânge și reacția imună cauzată de natura chimică a policationului. Odată ajuns în celulele țintă, poliplexul este absorbit pe membrana plasmatică, absorbit prin endocitoză, după care trebuie să părăsească endozomul și să se disocieze într-un polimer cationic și o moleculă de ADN. ADN-ul liber este trimis la nucleu, iar cationii polimeri părăsesc celula și sunt excretați din organism.

Caracteristicile celor mai comune metode de livrare pentru vaccinurile ADN
Metodă	Avantaje	Defecte
Injecții intramusculare sau subcutanate	Nu este necesar un echipament special Expresie permanentă sau pe termen lung ADN-ul este transportat către țesuturile adiacente	Eficiență scăzută Necesită o cantitate relativ mare de ADN
electroporație	Eficiență ridicată	leziune de tesut
pistolul genelor	Precizie ridicată Necesită o cantitate mică de ADN	Necesită microparticule inerte Deteriorarea celulelor de la locul împușcării
Introducere datorita presiunii ridicate	Metodă relativ simplă Nu este nevoie de microparticule ADN-ul poate pătrunde la adâncimi de la câțiva mm până la 1,5 cm	Afectează structura ADN-ului Eficiență scăzută a imunizării Necesită o cantitate mare de ADN (până la 300 mcg)
Ambalare în lipozomi	Eficiență ridicată in vitro Ușurință de fabricație Capacitate mare Poate fi combinat cu alte metode Atunci când este administrat intravenos, vaccinul are potențialul de a ajunge la toate țesuturile Administrarea intranazală asigură exprimarea vaccinului în mucoasa nazală și producerea de imunoglobuline de clasa A (IgA)	Posibilă toxicitate Eficiență scăzută in vivo

Mecanismul de dezvoltare a răspunsului imun

Antigenul sintetizat în celulă este supus procesării, după care este prezentat celulelor imunocompetente. Procesarea este divizarea unei proteine ​​antigenice în fragmente de peptide imunogene. Prezentare înseamnă depunerea unui fragment de antigen conectat la molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC) al celulelor imunocompetente. Există două clase cele mai semnificative ale acestor molecule: MHC clasa I (MHC-I) și MHC clasa II (MHC-II). Pentru a se lega de moleculele fiecărei clase, antigenul este preparat în compartimente specializate ale celulei. Proteinele antigenului endogene sunt direcționate către proteazom pentru degradare, după care sunt prezentate în complex cu MHC-I pe suprafața celulei. Aici, când se întâlnesc, sunt recunoscuți de celulele T CD8 + (T-killers), care implementează un răspuns imun citotoxic. Proteinele exogene sunt scindate de proteaze lisomnimale, încorporate în MHC-II și recunoscute de receptorii celulelor T CD4+ (T-helper). Acestea din urmă provoacă atât răspunsuri celulare, cât și umorale.

Prezentarea antigenului prin calea MHC-I

Vaccinarea ADN implică sinteza antigenului endogen, deci această cale este predominantă. Procesarea antigenului de-a lungul căii MHC-I are loc în mai multe etape. Proteina sintetizată în nucleu este transportată în citoplasmă, proteazomul este scindat în peptide scurte - epitopi, care sunt transferați în reticulul endoplasmatic (EPR) prin proteine ​​speciale transportoare de antigen (TAP). În EPR, fiecare epitop este combinat cu molecula MHC-I, după care complexul format este trimis la aparatul Golgi (AG) pentru glicozilare. De acolo, complexul din compoziția veziculei tinde spre membrana plasmatică. După fuziunea veziculei cu membrana plasmatică, complexul apare pe suprafața celulei, unde este recunoscut de receptorii T-killer, care au activitate citotoxică.

Prezentarea antigenului prin calea MHC-II

Principala sursă de peptide care se leagă de MChS-II sunt proteinele exogene care au intrat în celulă prin endocitoză. Cu toate acestea, s-a demonstrat că unele proteine ​​intracelulare pot fi prezentate și în complex cu MChS-II. În acest caz, proteinele nou sintetizate, după ce intră în citoplasmă, sunt transferate la lizozomi, unde antigenul este scindat sub acțiunea proteazelor acide. După aceea, lizozomul care conține epitopii fuzionează cu vezicula care poartă molecula MChS-II. În interiorul veziculei unite se formează un complex epitop-MChS-II; după fuziunea veziculei cu plasmalema, acesta este adus la suprafața celulei. Aici, acest complex este recunoscut de receptorii T-helper, ducând la activarea lor. Acest lucru duce la stimularea imunității atât celulare (activarea T-killers) cât și umorală (activarea limfocitelor B).

Vaccinarea tradițională cu antigene proteice solubile are ca scop mobilizarea ajutoarelor T. Răspunsul relativ scăzut al T-helpers este unul dintre dezavantajele vaccinurilor ADN. De asemenea, generația actuală de vaccinuri ADN nu este capabilă să inducă producția de titruri mari de anticorpi. Pentru a crește activarea celulelor T-helper, antigenul trebuie redirecționat către calea MChS-II. Pentru a face acest lucru, în vaccinul ADN este inserat un semnal de localizare lizozomală; antigenul sintetizat va fi direcționat către lizozomi, ceea ce înseamnă că va lua calea MChS-II.

Strategii pentru îmbunătățirea eficacității unui vaccin ADN

Principala întrebare privind viitorul vaccinurilor ADN se referă la modul de creștere a eficacității acestora. Un număr mare de studii sunt în curs de desfășurare pentru a optimiza vaccinurile ADN dezvoltate. Căutarea unei soluții se efectuează în două direcții: creșterea expresiei vaccinului și creșterea imunogenității antigenului codificat.

Optimizarea elementelor transcripționale

O componentă importantă a vaccinului ADN este promotorul. Promotorii bacterieni nu sunt adecvați pentru exprimarea antigenică în celulele de mamifere, așa că au fost utilizați în schimb promotorii virusurilor oncogene. Acum, pentru a îmbunătăți siguranța vaccinurilor, acestea au fost înlocuite cu promotori din obiecte necancerogene, cum ar fi citomegalovirusul uman (CMV). Pentru majoritatea vaccinurilor ADN, acest promotor este alegerea optimă: este foarte exprimat într-o gamă largă de celule. Pentru expresia genelor în țesuturi specifice, este promițător să se utilizeze promotori specifici pentru acest tip de țesut. De exemplu, utilizarea unui promotor CPK muscular atunci când este administrat conduce la o creștere de zece ori a sintezei de anticorpi și la inducerea unui răspuns celulei T decât utilizarea unui vaccin ADN similar cu un promotor CMV. Promotorul genei desmină care codifică una dintre proteinele citoscheletice a arătat, de asemenea, eficiență ridicată în miocite. Pentru a crește expresia vaccinului ADN în keratinocite (celule ale țesutului epitelial), se folosesc promotori ai genei metalotioneinei (o proteină care leagă metalele grele) sau gena 3 a hidroxilazei vitaminei D.

Nivelul de inițiere a transcripției tinde să crească in spate cont de utilizare puternic promotor și amplificator, iar caracteristicile de terminare pot deveni un factor limitator. Eficiența poliadenilării și procesării transcriptului ARN primar variază în funcție de secvența semnalului poliA. Adică, secvența de poliadenilare afectează sinteza antigenului. De exemplu, semnalul poliA utilizat pe scară largă al virusului SV40 este mai puțin eficient decât semnalul de poliadenilare al genei p-globinei de iepure sau al genei hormonului de creștere bovin.

Pentru o traducere eficientă, ARNm de mamifer trebuie să aibă un așa-numit secvența Kozak. Inserarea acestei secvențe într-un construct ADN poate crește semnificativ nivelul sintezei antigenului. Pentru ca ARN polimeraza să NU săriască codonul stop al genei și să nu aibă loc sinteza unei proteine ​​alungite, care nu poate dobândi apoi stilul corect, gena poate fi terminată. linie de oprire dublă.

Atunci când proiectează vaccinuri ADN, ei încearcă, de asemenea să-și optimizeze codonii. Procedura de optimizare înseamnă înlocuirea codonilor în secvența genei în așa fel încât secvența de aminoacizi a proteinei să nu se modifice, dar eficiența translației ARNm a acesteia să crească. Motivul este că majoritatea aminoacizilor sunt codificați de mai mult de o limită. Fiecare codon are propriul ARNt și reprezentarea diferitelor ARNt în celulă nu este aceeași și, de asemenea, variază în funcție de tipul de organism. Codonii sunt selectați în așa fel încât prezența ARNt-ului dorit în timpul sintezei antigenului să nu devină un factor limitator.

Optimizarea antigenului

Deși puterea răspunsului imun se corelează cu nivelul de exprimare al vaccinului ADN, totuși, pentru fiecare antigen există un anumit platou, după care o creștere a cantității de proteină antigenică va crește producția de anticorpi. În același timp, se poate obține un răspuns imun mai puternic prin optimizarea antigenului. De exemplu, de către combinarea unui antigen cu un ligand la un receptor specific pentru celulele prezentatoare de antigen. Un astfel de ligand poate fi proteina marker CD40, domeniul extracelular al tirozin kinazei-3 în formă de Fms sau antigenul T-killer-4. Datorită interacțiunii ligand-receptor, crește eficiența captării proteinei antigenice a APC.

Facilitează degradarea antigenului în proteazom sau lizozom de asemenea, stimulează răspunsul imun. Pentru a îmbunătăți clivajul proteoliotic al antigenului, în secvența sa este inserat un semnal de ubiquitinare. Eroare citat: Apel greșit: O etichetă ref fără titlu trebuie să aibă o intrare. Utilizarea vaccinurilor ADN care codifică în locul întregului antigen, mai mulți epitopi de origine diferită, vă permite să extindeți semnificativ spectrul răspunsului imun.

Pentru vaccinurile ADN antitumoral, combinația este eficientă „antigen tumoral + antigen viral sau bacterian”. De exemplu, combinația unui antigen tumoral cu un epitop de toxină tetanica crește semnificativ activarea celulelor T ucigașe împotriva celulelor canceroase.

Includerea adjuvanților

Atunci când se utilizează vaccinuri tradiționale, li se adaugă adjuvanți pentru a crește răspunsul imun. Vaccinul ADN este de origine bacteriană, deci este el însuși un imunostimulant. Pentru a spori răspunsul imun, genele adjuvante sunt inserate în vaccinul ADN sau este utilizată o plasmidă suplimentară care codifică proteine ​​imunostimulatoare.

Efectul imunostimulant al dinucleotidelor CpG bacteriene

Funcția unei plasmide nu se limitează la furnizarea de gene către celule. În 1893, s-a descoperit că un amestec de lizate bacteriene reduce progresia tumorilor canceroase, dar abia în 1983 s-a stabilit că proprietățile imunostimulatoare ale lizatului se datorau moleculelor de ADN bacterian. În 1995, s-a demonstrat că stimularea imună este cauzată de motivele CpG din ADN-ul bacterian. În bacterii, precum și în virusurile ADN, aceste motive sunt nemetilate. La oameni și la primatele superioare, dimpotrivă, citozina în majoritatea dinucleotidelor CpG conține o grupare metil. Prin urmare, motivele de non-metilare CpG sunt percepute de corpul uman ca modele moleculare asociate patogenului (PAMP). Compușii Ramri sunt recunoscuți de receptorii de tip Toll, care, în funcție de tipul de ligand, sunt împărțiți în mai multe tipuri. Motivele de demetilare CpG sunt recunoscute de receptorul TLR-9 situat pe membranele reticulului endoplasmatic ale limfocitelor B, celulelor dendritice și celulelor natural killer. Legarea receptorului de motive CpG nemetilate declanșează o cascadă de reacții care induce sinteza de citokine proinflamatorii - interferon-1 și IL-12.

Exprimarea citokinelor și a altor imunomodulatori

Pentru vaccinarea ADN, genele citokinelor sunt cel mai adesea folosite ca adjuvanți. Citokinele sunt o clasă de molecule proteice care reglează interacțiunile intercelulare și intersisteme din organism, în special, funcționarea sistemului imunitar. Toate citokinele, și mai mult de 30 dintre ele sunt cunoscute, pot modula răspunsul imun. Citokinele IL2, IL-12, interferonul γ, IL-15, IL-18 și IL-23 au un efect stimulator asupra T-helpers de prima clasă. Citokinele care modulează acțiunea ajutoarelor T din clasa a doua includ: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Tipul de citokină este selectat în funcție de tipul de răspuns imun care se dorește a fi îmbunătățit.

Este posibil să se realizeze o creștere a răspunsului imun cu ajutorul chemokinelor. Chemokinele sunt o familie de citokine care pot provoca chemotaxia celulelor sensibile, inclusiv a celor imune. În special, receptorii de chemokine se găsesc pe celulele chemokine prezentatoare de antigen. Legarea unei chemokine la receptorul său duce la endocitoza complexului antigen-chemokină din interiorul APC. Această strategie este utilizată eficient atât în ​​dezvoltarea vaccinurilor ADN antivirale, cât și a celor antitumorale.

Funcția unui adjuvant poate fi îndeplinită și de proteina HSP70 (proteine ​​de șoc termic, proteine ​​de șoc termic). Efectul imunostimulator al HSP70 se bazează pe capacitatea sa de a intra în spațiul extracelular și de a se lega de receptorii APC. Mecanismul de transport al HSP70 în exterior nu a fost încă pe deplin elucidat, dar cel mai probabil există mai multe moduri - exocitoză, secreție în exterior sau ieșire prin canal. Legarea HSP70 la receptorul său are ca rezultat activarea celulelor dendritice, mediază prezentarea antigenului și stimulează producția de chemokine. Deoarece antigenul este fuzionat cu HSP70, acesta intră și în spațiul extracelular, astfel încât poate fi prezentat prin calea MES-II și poate activa celulele B. Vaccinurile ADN folosesc gena bacteriană HSP70 pentru a evita reacțiile autoimune.

Avantajele și dezavantajele vaccinurilor ADN

Metoda de vaccinare cu ADN are o serie de avantaje, dintre care cel mai important este declanșarea răspunsurilor imune atât umorale, cât și celulare. Vaccinurile pe bază de ADN asigură expresia antigenului pe termen lung și, în consecință, un răspuns imun stabil. Factorii suplimentari care conduc la dezvoltarea imunizării ADN includ ușurința și costul scăzut al producției de vaccin.

Avantaje

Defecte

Antigenul capătă o conformație nativă Activarea ambelor ramuri ale imunității: umorală și celulară Antigenul sintetizat poate fi direcționat selectiv către calea MES-I sau MES-II Poate acționa selectiv asupra diferitelor populații de T-helper Oferă expresia antigenului pe termen lung Simplu și rapid de făcut Cost redus de producție Nu necesită condiții speciale de depozitare Poate fi folosit atât pentru prevenirea, cât și pentru tratamentul bolilor Potențial eficient împotriva unei game largi de boli: boli bacteriene, virale, autoimune și canceroase

Imunogenitate slabă Pentru vectorii virali, există riscul ca ADN-ul străin să se integreze în genomul celulei Posibilă dezvoltare a reacțiilor autoimune Vectorii plasmidi și virali pot provoca un răspuns imun nespecific

Utilizarea vaccinurilor ADN

Primele studii clinice ale vaccinurilor ADN, împreună cu siguranța noii metode, au demonstrat eficiența sa scăzută. Realizând promisiunea imunizării ADN, laboratoarele științifice, împreună cu companiile de biotehnologie, și-au îndreptat eforturile spre optimizarea noii metode, iar în câțiva ani s-au înregistrat progrese semnificative. În 2005, primul vaccin ADN a primit aprobarea FDA. Administrația pentru Alimente și Medicamente) pentru utilizare la animale. Începând cu 2013, peste o sută de vaccinuri ADN sunt în studii clinice și patru vaccinuri ADN sunt autorizate pentru utilizare în producția animală.

Vaccinurile ADN în medicina veterinară

Toate cele patru vaccinuri aprobate de FDA se bazează pe plasmide. Pentru trei dintre ele, producătorul a recomandat metoda de administrare - intramusculară, pentru vaccinul LifeTide® - injectare combinată cu electroporare. Dacă restul vaccinurilor vizează activarea sistemului imunitar, atunci pentru vaccinul LifeTide® efectul imunostimulator este suplimentar. Produsul vaccinului este somatoliberina, un hormon care stimulează eliberarea hormonului de creștere și a prolactinei de către glanda pituitară. Acțiunea ultimilor doi hormoni la porci duce la creșterea masei animalelor și la creșterea numărului de pui. În același timp, introducerea în animale a unei plasmide care codifică somatoliberina stimulează producția de limfocite T, ucigași naturali și, prin urmare, crește rezistența imună a organismului.

Denumirea de marcă a vaccinului	Anul licenței	Ţintă	Animal	Produs de vaccin	Scopul vaccinului
West Nile-Innovator® (SUA)	2005	Virusul West Nile	Cai	Proteina structurală a virusului PreM-E	Protecție împotriva virusului
Apex-IHN® (Canada)	2005	Agentul cauzal al necrozei infecțioase a țesutului hematopoietic	Pește din familia somonului	Glicoproteină virală	Creșterea cantității și calității hranei pentru pește
LifeTide® SW 5 (Australia)	2008	Un hormon de creștere	Porci și alte animale	Somatoliberină de porc	Așternut crescut la scroafe; reduce semnificativ reducerea mortalității și morbidității perinatale
ONCEPT® (SUA)	2010	Melanomul	Câini	Tirozinaza umană	Ca alternativă la radioterapie și chirurgie în tratamentul melanomului

Perspective pentru vaccinarea ADN

Vaccinuri ADN pentru cancer

În timp ce inducerea răspunsurilor imune celulare și umorale a fost demonstrată în mod convingător pentru antigenele străine asociate cu boli infecțioase, utilizarea vaccinurilor ADN pentru tratamentul cancerului a avut până acum mai puțin succes. Inducerea imunității antitumorale eficace este o sarcină dificilă. Studiile clinice au confirmat siguranța generală și toxicitatea scăzută a vaccinurilor ADN antitumoral, cu toate acestea, eficacitatea răspunsului imun pe care l-au provocat s-a dovedit a fi slabă, iar activitatea antitumorală, în unele cazuri, este în general îndoielnică.

Vaccinuri ADN împotriva agenților patogeni virali și bacterieni

Vaccin ADN împotriva cariilor

Cauza cariilor este o modificare locală a pH-ului ca urmare a fermentației (glicolizei) carbohidraților efectuată de bacterii. Oamenii de știință de la Institutul de Virologie din Wuhan (China) au dezvoltat un vaccin ADN îndreptat împotriva unuia dintre agenții patogeni carii - Streptococcus mutans. Vaccinul se bazează pe o plasmidă și codifică două proteine: o proteină de suprafață Sf. mutans PAcși flagelina, derivată din bacterie Salmonella care acţionează ca adjuvant. În stadiul studiilor preclinice, vaccinul a fost administrat pe nas la rozătoarele de laborator, după care s-a verificat la animale nivelul imunoglobulinelor G din serul sanguin și al imunoglobulinelor secretoare A din salivă. În urma studiilor, oamenii de știință au descoperit că nivelul proteinelor imune din sânge și salivă a crescut, dar, mai important, creșterea coloniilor a fost inhibată. Streptococcus mutans pe smaltul dintilor. Adică, dinții animalelor vaccinate erau mai bine protejați de carii.

Vaccinuri ADN și tratamente pentru boli autoimune

Vaccin ADN pentru diabet zaharat de tip 1

Diabetul zaharat de tip 1 se caracterizează prin pierderea celulelor beta producătoare de insulină situate în insulele pancreatice Langerhans. Principala cauză a pierderii celulelor beta este deteriorarea autoimună de către celulele T ucigașe. Pentru a proteja celulele beta de un sistem imunitar hiperactiv, oamenii de știință de la universitățile Stanford (SUA) și Leiden (Țările de Jos) au dezvoltat vaccinul ADN BHT-3021. Vaccinul a fost creat pe baza unei plasmide și codifică precursorul insulinei, proinsulina. Acesta este un vaccin retroactiv: dacă vaccinurile convenționale ar trebui să activeze răspunsurile imune, atunci BHT-3021, dimpotrivă, neutralizează efectul citotoxic al T-killers direcționat împotriva insulelor Langerhans.

În prima fază a studiilor clinice, BHT-3021 și-a arătat eficacitatea într-un grup de 80 de persoane. Jumătate dintre ei au primit injecții intramusculare cu BHT-3021 la fiecare șapte zile timp de 12 săptămâni, iar cealaltă jumătate a primit un placebo. După această perioadă, grupul care a primit vaccinul a arătat o creștere a nivelului de peptide C din sânge, indicând restabilirea funcției celulelor beta. Nu au fost înregistrate efecte secundare grave la unul dintre participanți. Efectul vaccinului a fost menținut timp de 2 luni.