Kvalitatív és kvantitatív módszerek alfa-aminosavak meghatározására. Az aminosavak mennyiségi meghatározása papírkromatográfiával. Az aminosavak meghatározására szolgáló módszerek

És fehérjéket

Ismeretes, hogy a kanonikus α-aminosavak mind a 20 változata azonos szerkezettel rendelkezik, háromféle funkciós csoporttal (3.3. ábra). Sajnos az amino- és karboxilcsoportokra adott reakciók nem túl specifikusak, mert rendre minden aminra jellemzőek, számos amidra és karbonsavak. Ugyanez vonatkozik a legtöbb gyökükre = R, amelyek közül 10 nem poláris, azaz alifás = szénhidrogéncsoportok képviselik, amelyek többsége kémiailag inert. Az alkoholt (Ser, Tre, Tyr), amidot (Asn, Gln) és karboxilcsoportokat (Asp, Glu) tartalmazó R poláris aminosavak specifitása szintén viszonylag alacsony. Az aminocsoport (Lys), az imidazol His és a guanidinocsoport Arg aktívabb, és a Cys tiocsoport aktivitása maximális. Ezért a legnagyobb gyakorlati jelentősége az α-aminosavak kvalitatív és kvantitatív elemzése során, beleértve az aminosavelemzőket is, egy univerzális ninhidrin reakciót kaptunk, amely specifikus az amino- és karboxilcsoportok egyidejű jelenlétére az α-C atomon.

Rizs. 3.3. Általános képletekα-aminosavak szerkezete és polimerizációs termékeik. Magyarázatok a szövegben.

Az α-aminosavak peptidek és fehérjék szerkezetébe történő polimerizációja (3.3. ábra) megtartja az összes R típusukat, de:

1. A ninhidrin reakció negatívvá válik, mert az N- és C-terminális kivételével az α-amino- és α-karboxilcsoportok a peptidkötések kialakítására fordítódnak. A fehérjével való pozitív ninhidrinreakció nagy valószínűséggel aminosav-szennyeződések jelenlétét jelzi a készítményben vagy a tartályban.

2. Minden peptid és fehérje esetében a biuret reakció olyan peptidcsoportra jellemző, amely hiányzik a monomer aminosavakban.

3. Az R aminosavak specifikusabb reakciói közül a következők hasznosak: xantoprotein reakció tömény salétromsavval, aromás R Fen, Tyr, Tri; reakció izatinnal az öttagú Pro gyűrűn, valamint reakciók az imidazol R His-n, a Cys tiocsoporton és a guanidinocsoporton az Arg. Fontos figyelembe venni, hogy ezeknek az R-eknek egy része fehérjegömbökben rejtőzik, ezért a rájuk adott minőségi reakciók gyengülnek. Ezért végrehajtásuk előtt a fehérjéket általában ilyen vagy olyan módon denaturálják.

4. Az aminosavak valódi oldataival ellentétben a fehérjék kolloid oldatait jellemzik üledékes reakciók, ami a hidratáló héjuk tönkremenetelével jár, és ennek eredményeként az oldhatóságuk csökkenésével vízeltávolító szerek hatására: semleges sók = kisózás, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aceton, karbamid és egyéb szerek.

A kvalitatív reakciók végrehajtásakor a következőket kell tennie:

1. Gondosan kövesse a szabályokat tűzbiztonságés koncentrált savakkal és lúgokkal dolgozzon = EZh.

2. Jelölje meg a kémcsövek 2 sorát üveggrafikonnal vagy filctollal, és az egyikbe legfeljebb 0,5 ml (2-5 csepp) 1%-os aminosav-oldatot, és megközelítőleg ugyanekkora térfogatú 1-es %-os fehérjeoldatot a másikban.

3. Párhuzamosan adjon hozzá 3-5 cseppet a megfelelő reagensekből egy aminosav- és fehérjeoldatot tartalmazó kémcsőpárba, és hajtsa végre a megfelelő reakcióhoz megadott további eljárásokat.

4. Ha a kémcsöveket melegíteni kell, távolítsa el a tégely fedelét, és gyufával gyújtsa meg a száraz tüzelőanyagot. Ezután rögzítse a kémcsövet egy tartóba, amelynek primitív kialakítása nagyon megbízhatatlan. Ezért jobb, ha néhány kémcsövet becsomagol egy csíkokra hajtogatott papírdarabbal, és tartsa őket hüvelykujj, egyenletesen vezesse át a kémcsövek alsó felét a lángon, kerülje, hogy a nyakát a szomszédokra mutassa, és az oldat hevesen felforrjon. A művelet befejezése után azonnal oltsa el a lángot a tégely fedelével.

5. A kísérletek eredményeit a sablonnak megfelelően elkészítjük a laboratóriumi jegyzetfüzet elterjedéséről táblázat formájában:

6. A kapott eredmények mérlegelése és a jegyzőkönyv kitöltése után egy állvány kémcsővel együtt mutassa be a tanárnak védelem céljából.

1. Ninhidrin reakció. Az α-aminosavak ninhidrin alkoholos oldatával végzett dezaminálása és dekarboxilezése alapján:

A kapott ammónia két ninhidrinmolekulával reagálva színes származékot képez, amelynek abszorpciós maximuma 540 nm-en van (Pro esetében - 440 nm).

Előrehalad: Adjon 3-5 csepp 0,5%-ot a vizsgálati mintákhoz alkoholos oldat ninhidrin. A kémcsöveket a keverékekkel óvatosan lángon melegítjük, majd 2-3 perc múlva feljegyezzük a szín megjelenését.

2. Xantoprotein reakció. Mint fentebb említettük, aminosavak nitroszármazékainak képzésén alapul aromás R-vel: Fen, Tyr, Tri.

Előrehalad: A páraelszívó huzatát bekapcsolva óvatosan adjunk hozzá néhány csepp töményt salétromsav(HNO 3). Óvatosan melegítse fel a kémcsöveket lángon, ne irányítsa a nyakukat a szomszédokra, és jegyezze fel a színek alakulását.

3. Nitroprusszid reakció. A kéntartalmú cisztein aminosav lúgos hidrolízisén alapul, nátrium-szulfid (Na 2 S) felszabadulásával, amely vörös komplexet ad a frissen készített nátrium-nitroprusszid oldattal.

Előrehalad: Adjunk mindkét kémcsőbe azonos térfogatú 20%-os nátrium-hidroxidot 5-10 csepp tesztoldattal, és forraljuk legalább 3-5 percig. Adjunk 3-5 csepp nátrium-nitropruszid oldatot a kémcsövekbe, és jegyezzük fel a szín alakulását.

4. Biuret reakció. Alapja, hogy lúgos környezetben egy peptidkötés színes komplexe képződik Cu 2+ -ionnal. Univerzális tesztként szolgál peptidek és fehérjék azonosítására oldatokban. Mivel a peptidkötések számának növekedésével az oldat színintenzitása lineárisan növekszik, széles körben használják fehérjekoncentrációk fotometriás meghatározására.

Előrehalad. Adjunk hozzá azonos mennyiségű 10%-os nátrium-hidroxid oldatot a kémcsövekbe 5-10 csepp tesztoldattal. Jól keverjük össze, és adjunk hozzá 2 csepp 1%-os réz-szulfát oldatot (CuSO 4). Keverje össze a mintákat, és néhány perc múlva rögzítse a színfejlődést.

5. Forráspróba. A fehérjék termikus denaturációján alapul.

Előrehalad. Mindkét kémcsövet legfeljebb egy csepp 1%-os oldattal savanyítsa ecetsav(AcOH) és forrásig melegítjük. Az oldatok 2-3 perces forralása után jegyezze fel az eredményeket, és magyarázza el a jelenség mechanizmusát.

6. Kicsapás nehézfémek sói által(Meh) . Denaturáló tulajdonságaik a nehéz Me-kationok reakcióképességén alapulnak funkcionális csoportok R fehérje molekulák: tio-, amino-, karboxi-, aromás. Erős anionjaik emellett a fehérjemolekulák ionos csoportjainak újratöltését okozzák, ezáltal tönkreteszik bennük az ionos kötéseket.

Előrehalad. Adjon néhány csepp 5%-os réz-szulfát oldatot (CuSO 4) mindkét kémcsőbe a tesztoldatokkal együtt. Rögzítse és magyarázza el a kapott eredményeket.

7. Kicsapás szerves savakkal. A fehérjék savas denaturációján és az R aminosavak tio-, amino- és aromás csoportjainak kovalens származékainak szerves klórokkal képződésén alapul.

Előrehalad. Adjon néhány csepp 10%-os triklór-ecetsav (TCA) oldatot a kémcsövekbe a tesztoldatokkal, és néhány perc múlva jegyezze fel az eredményeket.

Az aminosavak meghatározására szolgáló módszerek

Az aminosavak biológiai eredetűek hatóanyagok, nagy szerepet játszanak az emberi szervezet életében, széles körben használják, mint gyógyszerek. Némelyikük elengedhetetlen, és táplálékkal kerül a szervezetbe. Jelenleg számos módszer létezik a gyógynövényi anyagokban található aminosavak mennyiségi meghatározására, pl. gyógyszerekÉs biológiai folyadékok, élelmiszeripari termékekben.

Az aminosavak különböző objektumokban történő mennyiségi meghatározásának sokféle módszere közül négy fő csoport különíthető el: kromatográfiás, spektrofotometriás, titrimetriás és elektrokémiai elemzési módszerek.

Kromatográfiás módszerek

Az elmúlt évtizedekben jelentős előrelépések történtek az aminosavak gáz-folyadék kromatográfiája területén. Javasoltak egy mikrocsomagolt oszlopokat használó módszert, amely viszonylagos egy kis idő szinte teljesen elválasztja a 17 biológiailag fontos α-aminosavat.

Eljárást dolgoztak ki aminosavak gáz-folyadék kromatográfiával történő meghatározására szérum-, plazma-, vizelet- és gerincvelői folyadék 2,3,4,5,6-pentafluor-benzoil-izobutil-éterek előállításán alapul, majd polidimetil-sziloxán oszlopon, 140 °C és 250 °C közötti hőmérséklet-programozási módban, lángionizációs detektorral történő elválasztáson alapul. A kromatográfiás elválasztási idő 28 perc. A kutatás eredményeként 27 aminosavat választottak el.

Az aminosavak elemzésére szolgáló nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás módszerek sokfélesége ellenére a leggyorsabb és legelérhetőbb a fordított fázisú változat spektrofotometriás detektálással. A sikeres elválasztás és kimutatás érdekében az aminosavakat hidrofób és fényelnyelő származékokká alakítják, azaz oszlop előtti származékképzést végeznek. Származékképző reagensként ortoftál-aldehidet, naftalin-2,3-dikarboxialdehidet és 9-fluorenil-metil-klór-formiátot használnak.

Módszert fejlesztettek ki az L-cisztin, L-glutaminsav és glicin mennyiségi meghatározására az "Eltacin" gyógyszerben, amely antioxidáns hatással rendelkezik antianginás hatással kombinálva. A glutaminsavat és a glicint fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával határoztuk meg az oszlop előtti származékképzést követően ortoftáldehid/N-acetil-L-cisztein reagenssel. A cisztein származékképzése a szerzők szerint nehézkes magának az aminosavnak és a keletkező származékoknak az instabilitása miatt. Ezért a cisztein analízist bromatometriás titrálással végezték. Megállapítást nyert, hogy jelentős mennyiségű cisztein jelenléte a mintában nem zavarja a glicin és a glutaminsav ortoftálaldehid/N-acetil-L-cisztein reagenssel történő származékképzési termékeinek meghatározását. A módszert a nagy reprodukálhatóság és a meghatározás pontossága jellemzi.

A 4,7-fenantrolin-5,6-dion (fankinon) fluorogén jelölőreagensként való felhasználásának lehetősége származékainak oszlop előtti kialakításához elválasztás céljából, ill. mennyiségi elemzés aminosavakat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. Mivel nincs belső fluoreszcenciája, a fankinon reakcióba lép az aminosavak aminocsoportjaival (68 °C-on 160 percig), iminokinolokat képezve, amelyek fluoreszcenciáját 460 nm-es hullámhosszon mérik. Az izolált származékokat Tm-, IR-, tömeg- és PMR-spektrummal azonosítottuk. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát fluoreszcens detektoros kromatográfiával és gradiens eluálású oszlopon végeztük, trietil-amin oldat - foszfát puffer (pH 3) - metanol elegyekkel. Belső standardként kinidint használtunk. Ez a módszer körülmények között meglehetősen ígéretes nagy laboratóriumokés javasolt a kész adagolási formákban lévő aminosavak elemzésére.

Kifejlesztettek egy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás technikát potenciometrikus bioszenzorral a lizin mennyiségi meghatározására. A bioszenzort úgy készítik el, hogy egy lizin-oxidázt tartalmazó membránt ionszelektív NH4+ elektródához csatlakoztatnak. A lizin enzimatikus lebontása során keletkező ammóniumionokat potenciometriával detektáljuk. Kifejlesztettek egy kromatodenzitometriás expressz módszert a triptofán tenyészfolyadékokban való analízisére. A vékonyréteg-kromatográfiát Sorbfil lemezeken végeztük. A kromatográfiát propanol-2-25%-os ammónium-hidroxid-oldat (7:3) rendszerben hajtottuk végre 25 percig. A kromatogramokat szobahőmérsékleten szárítottuk, és 15 percig 120 °C-on tartottuk. A foltok kimutatására a kromatogramokon specifikus reagenst használtunk - 4-dimetil-amino-benzaldehidet, amely szelektív a triptofán indolgyűrűjére, 0,5% -os etanolos oldat formájában, 5% tömény kénsav hozzáadásával. A kromatogramokat frissen készített 4-dimetil-amino-benzaldehid oldattal teflon küvettába merítéssel előhívtuk, majd 5-7 percig 110°C-on tartottuk. A triptofánfoltok letapogatását 625 nm hullámhosszon, számítógépes videodenzitométeren végeztük. A kidolgozott módszer a nagy pontosságú meghatározás és termelékenység ellenére triptofánra specifikus.

Biológiai folyadékokban, gyógyszerekben és élelmiszerekben található β-aminosavak elemzésére széles körben alkalmazzák a komponensek szétválasztásán alapuló kapilláris elektroforézis módszereket. összetett keverék kvarckapillárisban alkalmazott elektromos tér hatására. Mivel az aminosavak ikerionos természetűek, megfelelő pH értékű elektrolit pufferoldatokkal különíthetők el, leggyakrabban semleges és bázikus elválasztó puffereket használnak.

Az egyes β-aminosavak elemzésére szolgáló kapilláris elektroforézis módszer specifitásának és érzékenységének növelése érdekében ezek előzetes származékképzését, majd kvarckapillárisban történő elválasztását és a reakciótermékek spektrofotometriás meghatározását alkalmazzuk. Így származékképző szerként 9-fluorenil-metil-formiátot, 9-(2-karbazol)-etil-klór-hangyasav-észtert és cianinfestéket használnak. A módszer kilátásai az olyan előnyöknek köszönhetők, mint a gyors elemzés, a minta-előkészítés egyszerűsége, a reagensek alacsony fogyasztása és a műszerezés egyszerűsége.

Ez a cikk az aminosavak meghatározására szolgáló módszereket tárgyalja, amelyeket nem csak a termékek elemzésében használnak, hanem a biokémiában és a gyógyszerészeti elemzésben is.

Az aminosavak összmennyisége fotometriai módszerrel határozható meg, amely az aminosavakból nyert ammónia Kjeldahl-módszerrel történő meghatározásán alapul.

Reakció 1-naftollal. Az arginin, hisztidin és tirozin meghatározásához 1-naftollal való reakciót javasoltak. Nátrium-hipoklorit (NaOCl) jelenlétében az oldat vörös színűvé válik. Az aminosavat tartalmazó 50%-os etanolos mintaoldatot jéggel lehűtjük, majd 10%-os NaOCl-oldatot és naftololdatot adunk hozzá. A reakciótermék vörös színű (lmax = 550 nm). Az aminosav-tartalmat a kapott oldat színintenzitása határozza meg.

Biuret reakció. Az aminosavak meghatározására használt egyik legfontosabb reakció a biuret reakció. A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy egy lúgos oldathoz híg biuretet adunk vizesoldat réz(II) sók. Ebben az esetben a megoldás intenzíven fordul lila komplex vegyület képződése miatt.

A biuretreakcióban legalább 2 amidcsoportot vagy amino-hidroxi-etiléncsoportot tartalmazó vegyületek, valamint aminosavak amidjai és imidjei vesznek részt. Ezt a reakciót fehérjék, valamint aminosavak és amidok koncentrált oldatai hajtják végre. Az aminosavak híg oldatai nem adnak biuretreakciót, ezért a reakció felhasználható a fehérjehidrolízis végének meghatározására. A reakciót fehérje minőségi és mennyiségi meghatározására is használják. A biuretreakció az alapja a klinikai diagnosztikai laboratóriumokban a fehérjék vérben és más biológiai folyadékokban történő meghatározására használt módszereknek.

Ninhidrin reakció. Az aminosavak meghatározására használt második legfontosabb reakció a ninhidrin reakció - az a-aminosavak színreakciója, amelyet az utóbbiak melegítésével hajtanak végre. lúgos oldat felesleges ninhidrin.

A ninhidrin az a-aminosavak oxidatív dekarboxilezését végzi ammónia képződésével, szén-dioxidés egy aldehid, amely eggyel kevesebb szénatomot tartalmaz, mint a kiindulási aminosav. A redukált ninhidrin tovább reagál a felszabaduló ammóniával és egy második ninhidrin molekulával, és az ammóniával színes kondenzációs terméket képez.

A kapott vegyület (pigment) ibolya-kék színű (l max = 570 nm). Ennek a színes vegyületnek a képződését a kvantitatív a-aminosav tesztben használják fel, amely képes kimutatni az aminosavakat akár 1 µg mennyiségben is.

A prolin és a hidroxiprolin, amelyek nem tartalmaznak a-aminocsoportot, reakcióba lépnek ninhidrinnel, és származékokat képeznek sárga szín(l max = 440 nm). A reakció nem specifikus, mert az ammónia és az aminocsoportot tartalmazó vegyületek (aminok, fehérjék, peptidek) szintén ninhidrinnel színes terméket állítanak elő. Ezekkel a vegyületekkel azonban nem szabadul fel CO 2. A szén-dioxid felszabadulás csak az a-aminosavakra jellemző. A reakciót az a-aminosavak kolorimetriás kvantitatív meghatározására használják, beleértve az automatikus aminosavelemzőket is (CO 2 térfogat mérése).

A ninhidrin reakciót a glicin, izoleucin, leucin meghatározására használják; szerin, fenilalanin, cisztein, tirozin, triptofán stb. kevésbé intenzív színezést adnak.

A kapott termékeket meglehetősen intenzív szín jellemzi (e = 1,8-3,3·10 4), de a színes termékek instabilok. A szín intenzitása gyorsan csökken. CdCl 2-t adunk hozzá stabilizálás céljából. A keletkező vegyületekkel stabil komplexeket képez. A kadmium-klorid szintén felgyorsítja a reakciót.

Az aminosavak és néhány más aminocsoportot tartalmazó vegyület lúgos közegben 1,2-naftokinon-4-szulfoxiláttal kondenzálódik, és az 1,2-naftokinon-monoimin vörös, sárga, narancssárga származékait képezi.

A reakciót az a-aminoxilátok (valin, izoleucin, leucin stb.) meghatározására használják.

A triptofán meghatározásához 4-dimetil-amino-benzaldehiddel végzett reakciót használhatjuk. A reakciótermék lila színű, és a vizsgált oldat triptofántartalmát a szín intenzitása határozza meg.

Meg kell azonban jegyezni, hogy ezt a reakciót ritkán használják élelmiszerelemzésben.

A kéntartalmú aminosavak mennyiségi meghatározására bromatometriás módszert alkalmaznak, amely a következő reakción alapul:

Cisztein 1%-os NaOH-oldattal készült oldatát csiszolt dugóval ellátott lombikba öntjük, és 0,1 N oldatot adunk hozzá. kálium-bromát oldattal, száraz kálium-bromiddal és 10%-os sósavval megsavanyítjuk.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

A reakció eredményeként keletkező bróm, amelynek mennyisége megegyezik a kálium-bromát mennyiségével, reakcióba lép az aminosavval. 10 perc múlva kálium-jodidot adunk hozzá, amely reakcióba lép az el nem reagált brómmal, és a felszabaduló jódot 0,1 N-vel titráljuk. nátrium-tioszulfát oldat keményítővel indikátorként.

2I – + Br 2 → Br - + I 2

A titráláshoz használt tioszulfát mennyisége megegyezik az aminosavval nem reagáló bróm mennyiségével. A hozzáadott kálium-bromát és a tioszulfát mennyisége közötti különbség alapján megállapítható az aminosavval való reakcióba bevitt bróm mennyisége, tehát az aminosav mennyisége.

A metionint hasonlóan határozzuk meg. A metionin szulfonná oxidálódik:

Ez a reakció bizonyos körülmények között lehetővé teszi a metionintartalom nagyon pontos meghatározását.



Az aminosavakat színreakciókkal lehet kimutatni: ninhidrin, xantoprotein, Foly, Milone, biuret teszt stb. Ezek a reakciók nem specifikusak, mert Az aminosavak szerkezetében lévő egyedi fragmentumok kimutatásán alapulnak, amelyek más vegyületekben is megtalálhatók.

Ninhidrin reakció, aminosavak, iminosavak és aminok minőségi és mennyiségi meghatározására használt színreakció. Lúgos környezetben, ninhidrin (tricetohidrin-dehidrát, C 9 Hb O 4) primer aminocsoportokat (-NH 2) tartalmazó anyagokkal melegítve olyan termék képződik, amely stabilan intenzív kék-lila színű, maximális felszívódása kb. 570 nm. Mivel ezen a hullámhosszon az abszorpció lineárisan függ a szabad aminocsoportok számától, a ninhidrin reakció szolgált alapul a kvantitatív kolorimetriás vagy spektrofotometriás meghatározásukhoz. Ezt a reakciót használják az iminosavak szekunder aminocsoportjainak (>NH) meghatározására is - prolin és hidroxiprolin; ebben az esetben élénksárga termék képződik. Érzékenység - akár 0,01%. A modern automatikus aminosav-analízist az aminosavak ioncserés elválasztásának és a ninhidrin reakcióval történő mennyiségi meghatározásának kombinálásával végzik. Az aminosav-keverékek papírkromatográfiás elválasztásakor lehetővé válik az egyes aminosavak legalább 2-5 μg mennyiségének meghatározása.

A szín intenzitása alapján meg lehet ítélni az aminosavak mennyiségét.

Ez a reakció nem csak a szabad aminosavakkal pozitív, hanem a peptidekkel, fehérjékkel stb.

Xantoprotein reakció lehetővé teszi aromás aminosavak (fenilalanin, tirozin, hisztidin, triptofán) kimutatását az aromás magban zajló elektrofil szubsztitúciós reakció (nitrálás) alapján.

Amikor tömény salétromsav hat például a tirozinra, sárga színű termék képződik.

Foll reakció. Ez egy reakció a ciszteinre és a cisztinre. A lúgos hidrolízis során a ciszteinben és cisztinben lévő „gyengén kötött kén” meglehetősen könnyen leválik, ami hidrogén-szulfid képződését eredményezi, amely lúggal reagálva nátrium- vagy kálium-szulfidokat termel. Amikor ólom(II)-acetátot adunk hozzá, szürkésfekete ólom(II)-szulfid csapadék képződik.

Az élmény leírása. 1 ml cisztinoldatot öntünk egy kémcsőbe, és 0,5 ml 20%-os nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá. Az elegyet forrásig melegítjük, majd 0,5 ml ólom(II)-acetát-oldatot adunk hozzá. Szürkés-fekete ólom(II)-szulfid csapadék figyelhető meg:

Zimmerman reakciója. Ez egy reakció a glicin aminosavra.

Az élmény leírása. 2 ml 0,1%-os glicin-oldathoz, amelyet 10%-os lúgos oldat hozzáadásával pH = 8-ra állítottak be, adjunk hozzá 0,5 ml o-ftál-dialdehid vizes oldatát. A reakcióelegy lassan élénkzöld színűvé válik. Néhány perc múlva zöld csapadék jelenik meg.

Reakció triptofánra. A triptofán reakcióba lép savas környezet aldehidekkel színes kondenzációs termékeket képez. Például glioxilsavval (amely tömény ecetsav keveréke) a reakció a következő egyenlet szerint megy végbe:

A triptofán és a formaldehid reakciója hasonló séma szerint megy végbe.

Sakaguchi reakciója. Ez a reakció az arginin aminosavra az arginin és az α-naftol kölcsönhatásán alapul, oxidálószer jelenlétében. Ennek mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. A reakciót nyilvánvalóan a következő egyenlet szerint hajtják végre:

Mivel a kinonimin származékok (in ebben az esetben naftokinon), amelyben az –NH– iminocsoport hidrogénjét alkil- vagy arilcsoport helyettesíti, mindig sárgásvörös színűek, majd a Sakaguchi-reakció során az oldat narancsvörös színét a jelek szerint a a naftokinon-imin származék megjelenése. Nem zárható ki azonban annak a lehetősége, hogy az arginin maradék NH-csoportjainak és az α-naftol benzolgyűrűjének további oxidációja következtében még összetettebb vegyület keletkezzen:

Az élmény leírása. Egy kémcsőbe 2 ml 0,01%-os argininoldatot öntünk, majd 2 ml 10%-os nátrium-hidroxid-oldatot és néhány csepp 0,2%-os α-naftol alkoholos oldatot adunk hozzá. A kémcső tartalmát jól összekeverjük, 0,5 ml hipobromit oldatot adunk hozzá, és újra összekeverjük. Azonnal adjon hozzá 1 ml 40%-os karbamidoldatot, hogy stabilizálja a gyorsan fejlődő narancsvörös színt.

Biuret reakció– fehérjék színreakciójaként használják. Lúgos környezetben, réz(II)-sók jelenlétében lila színt adnak. A szín a peptidcsoport következtében réz(II) komplex vegyület képződésének köszönhető -CO-NH-, ami a fehérjékre jellemző. Ez a reakció egy karbamid-származékról - biuretről kapta a nevét, amely akkor képződik, amikor a karbamidot az ammónia eltávolításával hevítik:

A fehérjéken és a biureten kívül ugyanezt a színt adják más, ezt a csoportot tartalmazó vegyületek is: amidok, karbonsavak imidjei, valamint a molekulában a -CS-NH- vagy =CH-NH- csoportot tartalmazó vegyületek. A fehérjék, egyes aminosavak, peptidek, biuret és közepes peptonok is reagálnak.

A biuret különböző peptidekkel végzett reakciójával kapott komplex színe némileg eltérő, és a peptidlánc hosszától függ. A négy aminosavból álló és annál nagyobb lánchosszúságú peptidek vörös komplexet alkotnak, a tripeptidek lila, a dipeptidek pedig kékek.

a polipeptid keton formája

a polipeptid enol formája

Amikor egy polipeptid kölcsönhatásba lép a Cu (OH) 2-vel, komplex képződik, amelynek szerkezete a következőképpen mutatható be.

Berendezés és reagens: kromatográfiás papír; kromatográfiás kamra; fotoelektromos koloriméter; olló; üveglapok (3´32 cm) - 3 db; kromatogram tartó; szárítószekrény; mikropipetták; kémcsövek földelt dugóval; 25 ml büretta; aminosavak standard keveréke; aminosavak tesztkeveréke; butanol, ecetsav, víz 15:3:7 arányban; ninhidrin 1%-os oldata 95%-os acetonban; réz-szulfáttal telített etil-alkohol (75%).

A munka befejezése

Vegyünk egy 18 x 28 cm-es kromatográfiás papírlapot, és egyszerű ceruzával rajzoljunk egy vízszintes vonalat a rövid szélétől 3 cm távolságra. Ezután a mellékelt diagramnak megfelelően egyenlőtlen szakaszokra osztják, és nyilakkal megjelölik a szabvány és a tesztkeverékek alkalmazási határait, és a megfelelő feliratokat egyszerű ceruzával készítik.

A papírt az asztal felülete felett megerősítjük, és a standard keveréket először a nyilakkal határolt rajtvonalra visszük fel speciális mikropipettával vékony vonalban, amíg a mikropipettából származó teljes oldat át nem kerül a startvonalra (a mikropipetta 2-3 cm-re töltve). A felvitt oldat tömegét a standard keverékkel töltött pipetta (az oldat felhordása előtt) és üresen (az oldat felvitele után) lemérésével mérjük. A papírra általában 0,02-0,03 g standard oldatot viszünk fel. Ezután töltsön meg egy tiszta pipettát az aminosavak tesztkeverékével (a tanár által a vizsgálathoz kiadott), mérje le és vigye fel a keveréket a megfelelő jelzéssel ellátott kezdővonalra.

Az elkészített kromatogramot egy kromatográfiás kamrába helyezzük, amelybe előzőleg öntöttünk oldószerrendszert az aminosavak elegyének, például butanol, ecetsav és víz 15:3:7 arányú keverékének elválasztására. Az elválasztást növekvő kromatográfiával végezzük, amíg az elülső vonal el nem éri a 2-3 cm-t a kromatográfiás papír felső szélétől (befejező vonal). Ezt követően a kromatogramot eltávolítják a kamrából, és a papír felső végét azonnal behelyezik egy három üvegrúdból álló, gumigyűrűvel rögzített tartóba, és 20 percre elszívófülkebe helyezik, hogy eltávolítsák a papírból az oldószereket.

Rizs. 8. Az aminosavak elrendezésének sémája a kromatogramon:

A - aminosavak keverékének alkalmazási pontja; I - cisztin és cisztein;

2 - lizin; 3 - hisztidin; 4 - arginin; 5 - aszparaginsav,

sorozat és glicin; 6 - glutaminsavés treonin; 7 - alanin;

8 - prolin; 9 - tirozin; 10 - valin és metionin; II - triptofán;

12 - fenilalanin; 13 – leucin és izoleucin

A szárított kromatogramot ninhidrin 1%-os acetonos oldatába mártjuk, hogy megállapítsuk az aminosavfoltok helyzetét rajta. A kromatogramot ezután 10 percre füstelszívóba helyezzük, hogy eltávolítsuk az acetont, és átvisszük egy szárítószekrénybe, ahol 15 percig 70 °C-on állni hagyjuk. A standard és a tesztkeverékek aminosavait kék-ibolya foltok formájában mutatjuk ki, amelyek láncban helyezkednek el az oldószerrendszer mozgásának irányában a kiindulási vonaltól a kromatogram felső széléig.

A tesztkeverékben lévő aminosavak azonosítását a standard és a tesztkeverék aminosavai által elfoglalt pozíciók kromatogramján lévő egybeesés alapján végezzük (8. ábra).

A tesztkeverékekben található aminosavak mennyiségi meghatározásához a kromatogramot egyszerű ceruzával megrajzoljuk úgy, hogy az azonos szinten fekvő, azonos aminosavnak megfelelő színes zónák megközelítőleg azonos téglalapokba kerüljenek (9. ábra). .

I II III IV

Rizs. 9. Az aminosavak elrendezése a kromatogramon:

I - I. számú keverék; II - 2. számú keverék; 1U - 3. számú keverék; Ш - standard

aminosav keverék

A körvonalazott papírterületeket kivágjuk és kémcsövekbe helyezzük, amelyek számának meg kell egyeznie a kromatogramon lévő foltok számával. Minden kémcsőbe bürettából 10 ml 75%-os oldatot öntünk. etilalkohol méz-szulfáttal telített (adjunk 0,2 ml telített réz-szulfát oldatot 500 ml etil-alkoholhoz). A kémcsövet lezárjuk, és időnként megkeverve a téglavörös szín (Ruheman kék-ibolya rézsó) teljesen átkerül a papírból az oldatba. Ez 15-20 percig tart. A standard és a vizsgálati oldatok abszorpcióját (optikai sűrűségét) zöld fényszűrővel (540 nm) ellátott fotoelektromos kaloriméteren mérjük. A referenciaáramba 75%-os réz-szulfátos etil-alkohol-oldatot tartalmazó küvettát helyeznek be.

A vizsgálati oldat aminosav-tartalmát a vizsgált és a standard minták extinkcióinak arányából számítjuk ki.

Számítási példa. Tegyük fel, hogy a standard keverék 1 ml-ben 1,8 mg glicint tartalmaz, és ebből a standard oldatból 0,02 g-ot viszünk a kiindulási csíkra. Ezért a kapott kromatogram (1,8 × 0,02) = 0,036 mg glicin. Állapodjunk meg továbbá, hogy a színes oldatok abszorpciója a standard esetében 0,288, az ismeretlen keveréknél 0,336 volt. Ekkor a vizsgált keverék glicintartalma a kromatogramon ábrázolva (36×0,336): 0,288=42 μg. Ha továbbá feltételezzük, hogy a vizsgálati keveréket például 0,0250 g mennyiségben visszük fel a kromatogramra, akkor a vizsgált oldat 1 ml-ében a glicintartalom (42:0,0250) = 1680 μg, vagyis 1,68 mg/ ml.

Mutassa be saját kísérletének eredményeit, és vonjon le következtetéseket belőlük!

15. sz. laboratóriumi munka

Ion elválasztásFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+