Biotechnológia és gyógyszerek. A molekuláris terápia alapjai. Oligonukleotid alapú gyógyszerek Fehérjéken és oligonukleotidokon alapuló gyógyszerek
Az oligonukleotid a nukleinsav rövid, 50 nukleotidnál rövidebb fragmentuma. Az elmúlt 20 év során a jelentés kiterjedt az összes kémiailag szintetizált nukleinsavra, hosszától függetlenül. Az első publikáció egy oligonukleotid célzott kémiai szintéziséről 1955-ben jelent meg.
Azóta évente több millió oligonukleotidot szintetizálnak laboratóriumi felhasználásra szerte a világon. A legtöbb tanulmány csak kis mennyiségű DNS-t igényel. Sokkal nagyobb mennyiségű DNS (10 µmol vagy több) szükséges a biofizikai vizsgálatokhoz (NMR és röntgenkrisztallográfia), ezért ilyen nagy mennyiségek szintézisére olyan szilárd fázisú szintézis módszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik a oligonukleotidok, mint gyógyszermolekulák (például antiszensz oligonukleotidok).
A DNS- vagy RNS-oligonukleotid-szintézis specifikus kémiai szerkezetű vagy különböző méretű szekvenciákkal rendelkező nukleinsav-fragmensek kémiai szintézisére vonatkozik.
1. ábra. Az oligonukleotidok szerkezete.
A szilárd fázisú szintézis elvét először Robert Bruce Merrifield amerikai biokémikus dolgozta ki és alkalmazta a polipeptidek szintézisére, aki 1984-ben kémiai Nobel-díjat kapott a szilárd fázisú peptidszintézis feltalálásáért. Felismerte, hogy a sikeres szintézis kulcsa abban rejlik, hogy az első monomert egy oldhatatlan polimer szilárd fázishoz rögzítik. Más monomerek ezután egymás után csatlakozhatnak a növekvő polimer stacioner terminális végéhez. A szintézis végén a kész polimerlánc leválasztható az oldhatatlan polimerről és megtisztítható. Ezt az eljárást az évek során optimalizálták, hogy rendkívül hatékony legyen, és mára az automatizált oligonukleotid szintetizátorok alapvető módszerévé vált.
Az oligonukleotidok sikeres szintézisének biztosításához a következő feltételek szükségesek:
- Minden reagensnek oldhatónak kell lennie nemvizes oldószerekben.
- A nukleotidbázisok és szénhidrátmaradékok amino- és hidroxilcsoportjait megfelelően blokkolni kell.
- A szintézis során bevitt védőcsoportoknak stabilnak kell lenniük a lánc megnyúlásának körülményei között a nukleotidok közötti foszfodiészter kötés kialakulása során.
- A védőcsoportoknak kellően labilisnak kell lenniük ahhoz, hogy a szintézis végén a reakciótermékek károsítása nélkül eltávolíthatók legyenek.
Az oligonukleotidok funkciói és felhasználásuk kilátásai
Jelenleg az oligonukleotidokat és analógjaikat széles körben használják különféle területeken, például az orvostudományban és a molekuláris biológiai kutatásokban, és ígéretes terápiás szerekként és próbákként tartják számon a molekuláris diagnosztikában.
Az elmúlt 20 évben mindössze kétféle, formálisan elektromosan semleges gerincű nukleinsav-analógot tanulmányoztak viszonylag jól: a peptid nukleinsavakat és a foszfodiamid morfolino-oligonukleotidokat. Mindkét típus analógjai képesek komplementer módon kötődni a természetes DNS- és RNS-molekulákhoz, ezért mind a molekuláris biológiában, mind különösen az orvostudományban potenciális gyógyszerként alkalmazásra találtak.
Emellett a DNS-technológiák fejlődésével lehetővé vált az ismert gének expressziójának tanulmányozása, a különböző élőlények genomjának mutációinak meghatározása, valamint számos fertőző betegség diagnosztizálása. E problémák megoldásában a legígéretesebb a DNS-chipek alkalmazása, amelyek kis lemezek, amelyek felületére DNS-fragmensek rakódnak le.
A DNS-chipek létrehozására szolgáló módszer az oligonukleotidok célzott szintézisén alapuló módszereket kombinálja közvetlenül a chip felületén. A szintézist úgy hajtják végre, hogy a növekvő oligonukleotidlánchoz lépésről lépésre adják a nukleotidokat, amelyek az 5' végén labilis védőcsoportot tartalmaznak, amelyek eltávolítása fénysugárzás, elektromos feszültség hatására vagy savas hidrolízis során lehetséges.
Kimutatták azt is, hogy a génvezérelt oligonukleotidokat a kiválasztott célgéntől függően a tumorszövetekre gyakorolt számos moduláló hatás különbözteti meg, kezdve a tumorsejtek szaporodásának lassításától és leállításától az invazív tulajdonságaik elnyomásáig.
A nukleinsav-alapú rákellenes gyógyszerek rendkívül specifikus eszközt jelentenek a génexpresszió modulálására. Számos olyan gén elnyomása, amelyeknek abnormálisan magas expressziója a neoplasztikus transzformáció során fordul elő, nukleinsav alapú gyógyszerekkel, például antiszensz oligonukleotidokkal (asON) érhető el. Általánosságban elmondható, hogy a génexpresszió elnyomásának mechanizmusa a cél-mRNS-hez való komplementer kötődése, amely után a cél-mRNS vagy lehasad, vagy a transzlációs folyamata blokkolva van.
Az asON-ok 15-20 nukleotid hosszúságú szintetikus egyszálú DNS-ek. A közelmúltban olyan asON-okat kaptak, amelyek megzavarhatják az összeillesztett mRNS transzportját a sejtmagból a citoplazmába, valamint asON-okat, amelyek a pre-mRNS-ben az illesztési hely blokkolásával egy alternatív fehérje expressziójához vezethetnek. változat.
Tekintettel arra, hogy a természetes oligodezoxiribonukleotidok sejttenyészetben és in vivo nukleázok hatására gyors lebomlásnak vannak kitéve, az asON szerkezetébe különféle kémiai módosításokat vezetnek be stabilitásuk növelése érdekében.
Oligonukleotidok kémiai szintézise
A szilárd fázisú szintézist széles körben alkalmazzák a peptidszintézisben, az oligonukleotid szintézisben, az oligoszacharid szintézisben és a kombinatorikus kémiában. A szilárd fázisú kémiai szintézist az 1960-as években Bruce Merrifield találta fel, és 1984-ben kémiai Nobel-díjat kapott.
A szilárd fázisú szintézist szilárd hordozón, szűrők között, olyan oszlopokban hajtják végre, amelyeken minden reagens és oldószer áthalad. A szilárd fázisú szintézis számos előnnyel rendelkezik az oldatban történő szintézishez képest:
nagy reakciósebességet biztosít
a szennyeződések és a felesleges reagensek kimosódnak, így nem szükséges minden egyes lépés után tisztítást végezni
számítógéppel vezérelt szilárdfázisú szintetizátorok segítségével automatizálható a folyamat.
A szilárd hordozók (más néven gyanták) vízben oldhatatlan, jellemzően 50-200 mikron átmérőjű részecskék, amelyekhez a szintézis során az oligonukleotid kapcsolódik.
Bizonyíték van arra, hogy az egyik leghatékonyabb szilárd hordozóanyagként használható anyag a porózus üveg. Meglehetősen merev és nem duzzad. Mély pórusaiban az oligonukleotidok szintézise megy végbe. Az üveg 500 Å (50 nm) pórusokat tartalmaz, amelyek alkalmasak rövid oligonukleotidok szintézisére. Azonban nem alkalmas 40 bázisnál hosszabb oligonukleotidok szintézisére. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a növekvő oligonukleotid blokkolja a pórusokat, és csökkenti a reagensek diffúzióját a mátrixon keresztül.
A hagyományos oligonukleotid-szintézis szilárd hordozóit jellemzően 20-30 μmol nukleozid/g gyanta adagolással állítják elő. Az oligonukleotid szintézis nagyobb terhelésnél kevésbé hatékony a gyantához kapcsolt szomszédos DNS-szálak közötti sztérikus gátlás miatt.
Az oligonukleotidok kémiai szintézisének szakaszai
A foszforamidát oligoszintézis a 3′ és 5′ közötti irányban megy végbe (ellentétben a DNS bioszintézis 5′ és 3′ irányával a DNS replikációjában). Ciklusonként egy nukleotidot adunk hozzá.
Rizs. 2. Foszforamidát oligonukleotid ciklus szintézise
Az oligonukleotid szintézis kezdetén az első nukleozidot előre hozzákapcsolják a gyantához (hordozóhoz), és az A, G, C vagy T szintézisoszlopokat választják ki a kívánt oligonukleotid 3' végén lévő nukleozidtól függően. A lehorgonyzott nukleozidnak van egy 5′-DMT védőcsoportja (DMT = 4,4′-dimetoxitritil), amelynek szerepe a polimerizáció megakadályozása, és ezt a védőcsoportot el kell távolítani (detritilezés). A detriláció mechanizmusa a 3. ábrán látható.
3. ábra. A védőcsoport eltávolításának mechanizmusa.
A detritilezés után a lehorgonyzott nukleozid készen áll arra, hogy reagáljon a következő bázissal, amelyet nukleozid-foszforamidát monomerként adunk hozzá. A megfelelő nukleozid nagy feleslegét aktivátorral (tetrazollal vagy származékaival) keverik össze. A nukleozid diizopropil-amino-csoportját az aktivátor protonálja, és így nagymértékben leválasztható csoporttá válik. A megkötött nukleozid 5'-hidroxilcsoportja gyorsan kiszorítja, létrehozva a foszfit-triésztert (4. ábra).
4. ábra. A protonálódás mechanizmusa aktivátorral.
A nukleozid-foszforamiditek inert atmoszférában meglehetősen stabilak, nagy mennyiségben előállíthatók, világszerte szállíthatók, és felhasználás előtt több hónapig száraz szilárd anyagként tárolhatók.
Azonban még az oligonukleotidok szintézisén végzett nagy pontosságú munka mellett is fennáll annak a lehetősége, hogy számos elreagálatlan 5'-hidroxilcsoport lesz elérhető a következő lépésben. Ha az ilyen rendellenességet nem szüntetik meg, minden következő ciklusban felhalmozódnak, és a végtermék oligonukleotidok összetett keveréke lesz, amelyek többsége helytelen genetikai információkat hordoz.
Ezért az 5'-hidroxilcsoportok acetilezésének módszere közömbössé teszi őket a következő reakcióval szemben. Ez a szennyeződések minimalizálása érdekében is szükséges.
Az addíciós lépés során képződött foszfit-triészter (P(III)) savakkal szemben instabil, és stabil formává kell alakítani (P(V)). Ez a jód víz és piridin jelenlétében történő oxidációjával érhető el (5. ábra). A kapott foszfotriészter valójában egy DNS-tengely, amelyet 2-ciano-etil-csoport véd. A ciano-etil-csoport megakadályozza a foszforral való nem kívánt reakciókat a következő szintézis ciklusok során.
5. ábra. Az oxidatív szakasz mechanizmusa.
Ezt követően a DNS-szál 5' végén lévő DMT-védőcsoportot el kell távolítani, hogy az elsődleges hidroxilcsoport reagálhasson a következő nukleotid-foszforamidáttal. A védőcsoport eltávolítása triklór-ecetsavval diklór-metánban gyors. A ciklust minden bázisra egyszer megismételjük, amíg a kívánt oligonukleotidot el nem érjük.
Ezután a szintetizált oligonukleotidot le kell választani a szilárd hordozóról. Ebben az esetben szukcinilt használnak. Az elválasztás úgy lehetséges, hogy tömény vizes ammóniaoldattal szobahőmérsékleten egy órán át kezeljük (6. ábra).
6. ábra. Az oligonukleotidok szilárd hordozótól való elválasztásának mechanizmusa tömény vizes ammóniaoldatban.
A hasítási reakció egyes szintetizátorokon automatikusan lezajlik, és az oligonukleotidot tartalmazó ammóniaoldatot egy üvegfiolába engedik. Alternatív megoldásként az emésztést manuálisan is elvégezhetjük úgy, hogy kivesszük az oszlopot a szintetizátorból, és ammónium-hidroxidot tartalmazó fecskendőben öblítjük.
Az oligonukleotidot tömény vizes ammóniaoldatban oldjuk, és ezt követő melegítéssel eltávolítjuk a védőcsoportokat a heterociklusos bázisokról és foszfátokról. A vizes oldatot ezután bepárlással eltávolítjuk, és az oligonukleotid készen áll a tisztításra.
A DMT védőcsoporton kívül további védőcsoportokra is szükség van az adeninhez, citozinhoz és guaninhoz (7. ábra). Ez azonban nem szükséges a timinhez.
7. ábra. A DNS-oligonukleotidok foszforamidát szintézise során adenin, citozin és guanin bázisok védelmére általánosan használt védőcsoport-struktúrák.
következtetéseket
1. A mesterségesen szintetizált oligonukleotidokat egyre szélesebb körben alkalmazzák a tudomány különböző területein, és az előállításukra szolgáló módszerek is egyre jobbak, ami lehetővé teszi, hogy megfelelő számú oligonukleotidot szintetizáljunk laboratóriumi kísérletekhez és terápiás gyógyszerek előállításához.
2. Ma az oligonukleotidok szintézisének legelterjedtebb módszere továbbra is a szilárd fázisú szintézis módszer, amely jelentősen felgyorsíthatja az oligonukleotidok kinyerésének folyamatát, valamint csökkentheti a felhasznált reagensek mennyiségét.
Összegzés
Az áttekintés a különböző antiszensz oligonukleotid gyógyszerek farmakokinetikai jellemzőit vizsgálja. Összehasonlították az első és második generációs gyógyszerek farmakokinetikáját. Figyelembe veszik a molekula kémiai módosításának a farmakokinetikájára gyakorolt hatását is.
Kulcsszavak: antiszensz oligonukleotidok, foszforotioát oligodezoxinukleotidok, farmakokinetika
Bevezetés
Az antiszensz oligonukleotidok (ASO-k) farmakokinetikai tulajdonságai akkor érthetők meg a legjobban, ha figyelembe vesszük fizikai és kémiai tulajdonságaikat. Az olyan paraméterek, mint a töltés, a molekulatömeg és a foszforotioát ASO-k amfipatikus természete, jelentős hatással vannak azok farmakokinetikájára. A kémiai szerkezet, különösen a foszforotioátcsoport és a 2'-metoxi-etil (MOE), különösen jelentős hatással van az ASO farmakokinetikai tulajdonságaira.
Az első generációs foszforotioát oligodezoxinukleotidok (ODN-ek) felszívódását, eloszlását, metabolizmusát és kiválasztódását alaposan tanulmányozták laboratóriumi állatokon és klinikai vizsgálatokon. A foszfotioát ASO gyógyszerek farmakokinetikájának sajátosságai a következők: a parenterálisan beadott foszfotioát ODN-ek gyorsan a vérplazmába kerülnek, ahol a plazmafehérjék hidrofil régióihoz kötődnek, és így elkerülik a glomeruláris szűrést. Ezek a hidrofil helyek különböznek más hidrofil helyektől, amelyekhez a lipofil gyógyszerek kötődnek, és így kevés a versengés a plazmafehérjékhez való kötődésért az ASO-kért. A plazma kinetikáját egy rövid eloszlási szakasz (nagyságrendileg több órás) jellemzi, amelyet a gyógyszer eliminációs fázisa követ napok vagy hetek felezési idejével. Az eloszlás kezdeti fázisa szükségszerűen magában foglalja az ASO kötődését a fehérjékhez, és ezeknek a komplexeknek a megoszlását a máj, a vesék, a nyirokcsomók, a csontvelő és a lép szöveteiben, amelyek az ASO legaktívabb kötődési és felhalmozódási helyei. Teljesen nyilvánvaló, hogy az ASO eliminációjának fázisát a kezdeti fehérjékhez való kötődés következtében az eloszlásának kezdeti szakasza határozza meg. Az esetleges fehérjetelítettség miatt , A farmakokinetikai görbe alatti terület (AUC) a dózis növelésével növekszik, mivel az ASO-k telítésük után már nem kötődnek a fehérjékhez, hanem szabadon bejutnak a véráramba. A kötődés után az ASO-k koncentrációgradiens mentén jutnak be a sejtekbe az extracelluláris térből a sejtmembránon keresztül az intracelluláris térbe, valószínűleg egy hordozófehérje segítségével. A sejtekben található ASO-k hozzáférhető célpontokhoz kötődnek, de elsősorban a sejtekben lévő ASO-k valószínűleg intracelluláris fehérjékhez kötődnek. A sejtben mindenütt jelenlévő nukleázok, de nem a citokróm P450 enzimek metabolizálják az ASO-gyógyszereket. Mivel a citokróm P450 enzimek jellemzően kis molekulájú gyógyszereket metabolizálnak, az ASO-k nem versengenek az anyagcseréért a hagyományos kis molekulájú vegyületekkel, így csökken a gyógyszerkölcsönhatások kockázata. Az ASO vizelettel történő kiválasztása végső soron a szövetekben zajló metabolizmus, valamint a metabolitok és a natív anyag egyensúlyának megteremtése a szöveteken kívül és a szisztémás keringésben. Ezek a folyamatok laboratóriumi állatokban és emberekben nagyon hasonlóak, ezért nem lehet azonosítani a fajok közötti összefüggést a laboratóriumi állatok és az emberek között.
Jelenleg az ASO „második generációs” konfigurációját használják a legszélesebb körben a klinikai vizsgálatokban, amelynek jellemzője a MOE csoport a 2" nukleotid pozícióban a 3" és 5" végén. Ez a konfiguráció fejlettebb a nem módosítotthoz képest. foszforotioát ODN-ek, amelyek első generációs antiszensz gyógyszerek. Ez megnövekedett hatékonyságának, csökkent toxicitásának és megnövekedett felezési idejének köszönhető. Az első generációs ASO-kból a második generációba való átmenettel kapcsolatos számos tényező közvetlenül összefügg a farmakokinetikájuk javulásával.
Az ASO kémiai szerkezetének jellemzői
Foszfotioát csontváz
Az antiszensz aktivitású gyógyszerek létrehozására tett legkorábbi kísérletek módosítatlan DNS-t használtak, amely sajnos nagyon érzékeny volt a nukleázok általi elpusztításra. Kiderült, hogy a mindenütt jelenlévő nukleázok felhasítják a natív DNS foszfodiészteráz kötéseit, ami a módosítatlan ASO-k felezési idejét percek alatt eredményezi. Ez a gyors lebomlás a módosítatlan antiszensz DNS farmakokinetikai profiljának fő jellemzője volt. A DNS foszfodiészter gerincének megváltoztatása foszforotioátra drámaian megváltoztatta az ASO farmakokinetikai profilját. Ezekben a készítményekben a foszforotioát szerkezet a foszfodiészter kötésekben egy kénatomot egy nem áthidaló oxigénatomra helyettesít. Ez a szerkezet növeli az ASO-k rezisztenciáját a nukleázokkal szemben, és ennek eredményeként javítja kinetikai tulajdonságaikat.
Foszfotioát kiralitás
Amint azt a vizsgálatok kimutatták, az ASO diésztervázának tiációja nemcsak a nukleázokkal szembeni rezisztenciáját növeli, hanem hozzájárul a kiralitás kialakulásához is, vagyis annak lehetőségéhez, hogy minden foszforotioát kötésnél sztereoizomerek jelenjenek meg, ami arra a tényre vezet, hogy hogy bármely 20 tagú ASO-ban 219 Sp vagy Rp sztereoizomer található. A nukleáz rezisztencia és a fokozott fehérjekötés kombinációja erősen befolyásolja az ASO-k farmakokinetikáját. A foszforotioát ASO-k stabilitásának növelése azt a tényt eredményezi, hogy a gyógyszer felezési ideje a plazmából 30-60 percre nő a foszfodiészter ASO-k felezési idejéhez képest, amely 1-2 perc.
A foszfodiészterrel a foszforotioát kötések helyett kialakuló nukleázrezisztencia és kiralitás azért érdemes megvitatni, mert az ehhez a szerkezeti jellemzőhöz kapcsolódó fizikai tulajdonságok fontosak az ASO-k első és második generációja számára is. A foszforotioát ASO-k nukleázaival szembeni rezisztencia abból adódik, hogy az exonukleáz aktív helyén lévő, nem áthidaló oxigénen lévő kén közel van a fémionhoz. Ez a közelség a fémion kiszorulását okozhatja az aktív helyről. Ezt a hatást a 3"–5" exonukleáz DNS polimeráz modellben mutatták ki. A röntgenkrisztallográfiai adatok alátámasztják ezt a fémion-eltolódási hipotézist. A sztereoizomereknek a DNS-polimeráz exonukleáz aktivitására való érzékenységében mutatkozó látszólagos különbségek összhangban vannak az ODN foszforotioát sztereoizomerjeinek az aktív helyen való feltételezett konformációjával. Valószínű, hogy a foszforotioát kötések kiralitása ugyanúgy zavarhatja a többi nukleázt, vagyis a fémionok kiszorítását, bár a különböző exonukleázok eltérő preferenciát mutathatnak az Rp és Sp kötések tekintetében az enzim aktív helyének természetétől függően.
Alternatív megoldásként a kén egyszerűen átveheti az oxigén helyét a diészter kötésekben. A kénnek az oxigénhez viszonyított negatív töltési képességében mutatkozó különbségek lehetővé teszik az aktív hely változásainak előrejelzését. Ez a változás nagy valószínűséggel a foszfodiészter kötések hidrolízise miatt következik be, és két negatív töltésű oxigénatomot tartalmazó tranziens ötértékű foszfor képződésével fordulhat elő. Az ekvatoriális oxigénatomok egyikének kénnel való helyettesítése negatív hatással lesz az enzimaktivitásra: (1) csökken a víz megkötése, amely stabilizálja az atomok lokális negatív töltését, ami megnehezíti a kén második negatív töltésének elérését. ; és (2) csökkent Mg 2+ kötődése kénhez. Ez utóbbi hatásra bizonyíték van a diasztereomer foszforotioát zárványok ribozim hasítási szintjének vizsgálatában, ahol a Mg 2+ hozzáadása gátolja a foszforotioát ribozimek hasítási hatását. Ezenkívül kimutatták, hogy a csontváznak a foszforotioát kötésektől távolabb eső helyein a nukleázaktivitás enyhén csökken, ami arra utal, hogy a kiralitás hatása átterjed. Ezt a jelenséget leginkább a foszforotioát váz körüli vízmolekulák elrendeződésének változásai magyarázzák a foszfodiészterhez képest.
A nukleázaktivitásra gyakorolt sztereospecifikus hatások szignifikánsan befolyásolják a foszforotioát ASO-k farmakokinetikáját, és ez a legvilágosabban az első generációs foszforotioát ASO-k metabolizmusának sebességében nyilvánul meg a vérplazmában. Az ASO plazmából való teljes kiürülésének sebessége csökken, ami lassabb metabolizmusra utal. Ezek az árfolyamváltozások nem magyarázhatók pusztán elsőrendű kinetikával, de az Rp és Sp kötések érzékenységének különbségével magyarázhatók.
Az exonukleáz aktivitás sztereospecifikus különbségei kevésbé fontosak a második generációs ASO-k esetében. Ez annak köszönhető, hogy a második generációs ASO-k 3" és 5" végén 2"-os módosításokkal rendelkeznek, amelyek megakadályozzák az exonukleáz általi hasításukat. A Serratia marcescens kórokozóból izolált endonukleáz segítségével vizsgálták a foszforotioát kötések kiralitásának hatásait. Az endonukleáz hatáspontja megegyezik az exonukleázokéval - ez a foszfodiészter kötések hidrolízisének egyik nem áthidaló oxigénje.A diasztereomerben a kén az Mg 2+ közvetlen közelében helyezkedik el, ennek eredményeként amely az enzim aktivitása csökken, míg az Rp diasztereomerben nem.Mivel a Serratia endonukleáz jelentős hasonlóságokat mutat néhány emlős endonukleázzal, feltételezhető, hogy ez a mechanizmus széles körben alkalmazható Hogyan hatnak a foszforotioát kötések sztereokémiai jellemzői a Más endonukleázok hatása nem ismert, azonban ha feltételezzük, hogy a reakció a Serratia endonukleázhoz hasonló séma szerint megy végbe, akkor azt gondolhatjuk, hogy az aktív hely fémiont tartalmaz (valószínűleg Mg 2+), és a kén zavarja a a nukleázok működése , amikor a fémion felé orientálódik. Ha az endonukleázok érzékenyek a kiralitásra, ez fontos következményekkel járhat a hatékony, második generációs gyógyszerek létrehozásának problémája szempontjából. Csakúgy, mint a kiralitás hatása az első generációs gyógyszerekre, a második generációs gyógyszerek metabolizmusára gyakorolt királis hatása metabolizmusuk lelassulásához vezethet. Így például feltételezhető, hogy a gyorsan metabolizálódó sztereoizomerek szelektíven elpusztulnak, és csak a lassan metabolizálódó izomerek maradnak működőképesek.
Az ASO kötődése fehérjékhez
Azt találták, hogy a foszfodiészter vázzal rendelkező ASO-kkal összehasonlítva a foszfotioát szerkezetek farmakokinetikáját jelentősen befolyásolja a fehérjékhez való kötődésük. A fokozott fehérjekötés kémiai alapja a foszforotioát kötések megnövekedett lipofilitása a foszfodiészter kötésekhez képest. Mivel a vízzel való molekuláris kölcsönhatásokat a vizes oldatban lévő makromolekulák alakja és funkciója határozza meg, a gerinc lipofilitásában az ASO teljes hosszában bekövetkezett kis változások is következményekkel járhatnak az oligomer vízzel és makromolekulákkal, például fehérjékkel való kölcsönhatásában. .
Az első közelítés szerint a foszforotioát ODN-ek véletlenszerűen kötődnek a sejtfehérjékhez, mint a foszfodiészter ODN-ek. Nem teljesen ismert, hogy a foszforotioát ASO-k miért kötik meg jobban a fehérjéket. A lehetséges magyarázatok közé tartozik a fokozott lipofilitás és a fémionokkal való komplexképződés.
A plazmafehérjékhez való kötődés jelentőségét a foszfotioát ASO-k (első és második generációs) farmakológiája, farmakokinetikája és toxikológiája szempontjából nehéz túlbecsülni. Mikromoláris koncentrációszinteken a foszforotioát ODN-ek több mint 90%-a kötődik a plazmában. Különböző fajok között specifikus különbségek vannak a fehérjékhez való kötődés százalékában és erősségében, valamint minőségi különbségek vannak az ASO-k specifikus fehérjékhez való kötődésében. A foszforotioát ASO-knak a keringő fehérjékhez való kötődése megakadályozza, hogy ezeket a vegyületeket a glomerulusok kiszűrjék és a vizelettel ürüljenek ki. Telítettség esetén, például nagy dózisú ASO beadásakor, a teljes hosszúságú ASO vizelettel történő kiválasztása megnövekszik. A fajok közötti különbségek miatt a telítettséget a különböző fajokban eltérő ASO koncentráció határozza meg. Például az egérplazmafehérjék kisebb affinitással rendelkeznek az ASO-k iránt, mint a patkányoké vagy az embereké. Ezért az ASO plazmafehérjékhez való kötődésének telítési hatása egerekben alacsonyabb koncentrációknál jelentkezik, mint más fajoknál. A fajok közötti különbségek a plazmafehérje kötődésben jelentős tényezőt jelentenek a fajok közötti farmakokinetikai különbségekben.
A foszforotioáthoz kötött ASO-kra jellemző nukleázrezisztencia és fehérjekötés szintén megváltoztatja az ASO-terápia farmakokinetikáját. A kifejlesztés alatt álló második generációs gyógyszerekre jellemző további kémiai szerkezetek más változásokat vezetnek be azok farmakokinetikájában.
Az ASO metoxi-etil-származékai
A második generációs ASO-kat azért fejlesztették ki, hogy javítsák az első generációs ODN-ek néhány jellemzőjét. Így a 2" pozícióban lévő MOE csoportokhoz hozzáadott foszforotioát szerkezetek növelik a nukleázokkal szembeni ellenállásukat és megváltoztatják a fehérjékhez való kötődés hatékonyságát.
A MOE rezisztenciája a nukleázokkal szemben
Kimutatták, hogy a MOE szerkezete befolyásolja az ASO nukleázokkal szembeni rezisztenciáját. Míg a foszforotioát szerkezetek csökkentik az exonukleáz aktivitást, a 2" pozícióban lévő struktúra gyakorlatilag megszünteti az exonukleáz aktivitást. A nukleáz rezisztencia eredhet (1) a 2" pozícióban lévő hidrogénnek MOE-vel való helyettesítéséből, (2) a MOE sztérikus hatásaiból vagy (3) képződéséből. egy merev vízhéjról az ASO csontváz körül. Bármi legyen is a nukleázokkal szembeni rezisztencia oka, a MOE csoport jelenléte a 2" pozícióban módosított ASO-kat gyakorlatilag immunissá teszi a keringő és a legtöbb sejtes nukleáz hatásaival szemben. Az ASO váz központi régiója, amely dezoxifoszfotioátokból áll, közel sem olyan ellenálló Az első és második generációs ASO-k közötti különbségeket a metabolizmusnak kitett területeken a metabolikus modellek különbségei is meghatározzák.
Amikor a metabolikus mintázatokat kapilláris gélelektroforézissel (CGE) vagy folyadékkromatográfiával/tömegspektrometriával (LC/MS) értékelték, nem találtak egy nukleotiddal rövidebb metabolitot. Felfedezték a legtöbb metabolitot, amely a dezoxi-helyen hasított (feltehetően endonukleázok hatására), az anyagcsere további útja a hasítási termékek méretének csökkentése. Az exonukleázokkal szembeni rezisztencia és az aktív endonukleázok hatására lelassult anyagcsere hosszú felezési idővel jellemezhető vegyületek képződéséhez vezet. .
A MOE kötődése fehérjékhez
Kísérleti vizsgálatok bebizonyították, hogy a 2"-MOE szerkezetű foszforotioát ASO-k kisebb affinitással rendelkeznek a plazmafehérjékhez, mint a módosítatlan foszfortioát ASO-k. Például, ha öt MOE szerkezetet adunk az első generációs foszforotioát ODN-ek 3"-os végéhez, a disszociációs állandók az albuminok mennyisége körülbelül 18-ról körülbelül 40 µM-ra nő. Ugyanakkor a MOE-vel teljesen felváltott ASO szerkezetben a plazmafehérjékhez való affinitás csak kismértékben csökken. Nem világos, hogy egy oligonukleotidban a MOE struktúrák számának növekedése miért nem befolyásolja a plazmafehérjék iránti affinitás további csökkenését, de ez az ASO másodlagos szerkezetének sajátosságaiból adódhat.
A MOE-struktúrákhoz kapcsolódó fehérjeaffinitás csökkenése bizonyos fizikai tulajdonságokkal magyarázható. Talán a legjelentősebb fizikai tényező, amely megkülönbözteti a MOE-módosított ASO-kat a módosítatlanoktól, a víz molekuláris héjának jelenléte, amely a MOE oldalláncából származik. A szénhidrogénvázban lévő MOE szubsztituensek „kelátozzák” a vízmolekulákat (és esetleg fémionokat), vizes héjat képezve, és csökkentik a „ragadós” kénmolekulák és a plazma- vagy sejtfehérjék közötti potenciális érintkezést. Az ASO-k fehérjekötődésének mértéke fordítottan korrelál a vizelettel történő kiválasztódásukkal. A foszforotioát kötések és a 2"-MOE szubsztituensek bevezetése megváltoztatja a fehérjekötést, és ennek eredményeként megváltoztatja az ASO tulajdonságait.
Az ASO felszívódása, eloszlása, metabolizmusa és kiválasztódása
Szívás
Az ASO parenterális beadási módja
A kutatások kimutatták, hogy az ASO molekulatömege (körülbelül 7000 D) és negatív töltései miatt ezeknek a gyógyszereknek a felszívódása a gyomor-bél traktusból korlátozott. Ezért általában a parenterális beadási módot alkalmazzák. Az első generációs gyógyszerek beadására szubkután, intravénás infúziót vagy intravitreális injekciókat alkalmaznak. A második generációs ASO-k alacsonyabb proinflammatorikus aktivitása alkalmasabbá teszi őket szubkután beadásra. Ezeknek a gyógyszereknek a farmakokinetikája a plazmában szubkután injekció és intravénás infúzió után összehasonlítható. Laboratóriumi állatokon végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy végső soron az ASO eloszlása is összehasonlítható a különböző szervek között, az injekció beadásának helye és a nyirokcsomók kivételével.
Subcutan beadást követően mind az első, mind a második generációs ASO-k gyorsan felszívódnak az injekció helyéről a szisztémás keringésbe. Klinikai vizsgálatokban a második generációs ASO szubkután beadása után a maximális koncentráció eléréséig eltelt idő (Tmax) 1,5 és 4,7 óra között volt 25 és 200 mg közötti dózistartományban, állandó 1 ml térfogat mellett. A szubkután adag biohasznosulása a beadott dózis 36-82%-a. A preklinikai és klinikai vizsgálatok azt sugallják, hogy az ASO-k biohasznosulása koncentrációfüggő módon növekszik.
Az ASO-k kinetikája az injekció beadásának helyén befolyásolhatja a helyi választ, valamint szisztémás kinetikáját és eloszlását. Az ASO koncentrációjának csökkentése az injekció beadásának helyén feltételezhetően csökkenti az injekcióra adott helyi választ. Az injekció beadásának helyén az ASO-koncentráció csökkentésének egyik módja az oldat hígítása, és ennek eredményeként a szubkután depóból származó abszorpciós felület növelése. Elméletileg a híg oldatok és a nagyobb abszorpciós felület csökkenti a helyi koncentrációkat és csökkenti a helyi reakciókat. Ugyanezek a hatások várhatók a szisztémás felszívódás növelésével. Ezért a dózis és a térfogat változása potenciális változónak tekinthető. Azonban még ma is a kis térfogatú és viszonylag magas koncentrációjú szubkután injekciók a felhasznált anyag magas biológiai hozzáférhetőségét mutatják.
Az ASO helyi igazgatása
Az ASO-k különféle beadási módszereinek tanulmányozása azt mutatja, hogy az aeroszolos formákat, a rektális beadást és az intravitreális injekciókat helyi beadásra használják. A tüdőbetegségek kezelésére aeroszolok segítségével viszonylag magas koncentrációjú ASO-t lehet előállítani a tüdőben.
Az első generációs ODN kinetikáját egereken tanulmányozták. Megállapítást nyert, hogy az ilyen gyógyszerek kinetikája dózisfüggő, a clearance pulmonális, felezési ideje körülbelül 2 óra. Ezzel szemben a második generációs MOE-módosított ASO-k vizsgálatai azt mutatják, hogy felezési idejük több mint 4 nap. Más helyi kezelésekhez hasonlóan az inhaláció előnye, hogy magas helyi koncentrációt képes létrehozni a szövetekben, amelyekben általában nem halmozódnak fel a felhasznált anyagok. Az ASO-k általában nem halmozódnak fel a tüdőben parenterális beadás után. A helyi adagolás szintén ritkán okoz szisztémás hatásokat. Például amikor majmoknak 0,1 mg/ttkg ASO-t adtak be inhalálással (három adag 1 hét alatt), a gyógyszer koncentrációja a tüdőben körülbelül 1 μg/g volt. De ugyanezekben a majmokban a májban és a vesében mért koncentráció körülbelül 5%-a volt a tüdőben mért koncentrációnak, ami lényegesen kisebb szisztémás hatást jelez.
Az irodalmi adatok azt mutatják, hogy az ASO rektális adagolását sikeresen alkalmazzák a colitis ulcerosa kezelésére. Ellentétben az inhalációval, ahol kis mennyiségben alkalmazható a beadott anyag, a kezelésre használt beöntés legfeljebb 240 mg első generációs anyagot (alicaforsen) tartalmazhat. Ebben az esetben a rektális hám ki van téve a beadott anyagnak, azonban az erősen töltött ODN gyenge permeabilitása miatt a gyógyszer minimális felszívódása figyelhető meg, csakúgy, mint az általános szisztémás hatás. A számítások azt mutatják, hogy az ASO koncentrációja a bélhámban 12 órával a beadás után 20 μg/g. Emberben a biohasznosulás 0,03 és 2,14% között van, és a plazmában kimutatható ASO maximális koncentrációja csak 0,126 μg/ml. A jelentős szisztémás felszívódás hiánya és a gyógyszer magas helyi koncentrációja pozitív hatással van a kezelésre.
Vizsgálatot végeztek az első és második generációs ASO-gyógyszerek intravitrealis injekcióival. Ebben az esetben az anyagokat nagyon kis mennyiségben fecskendezik a szembe. Az injekció beadásának helyének elszigetelése miatt a gyógyszer szisztémás hatásai még nagyobb mértékben csökkennek. A szembe, az üvegtestbe és a retinába az ASO eltérő sebességgel jut be: az üvegtest gyorsabban, mint a retinában. Mind a lokális metabolizmus, mind a szemből való diffúzió hozzájárul a gyógyszer eliminációjához. Mint már említettük, a kis mennyiségek miatt a beadott gyógyszer szisztémás hatása minimális. A szisztémás eloszlás mechanizmusa azonban hasonló a legtöbb más gyógyszeréhez.
Az ASO enterális beadása
A második generációs ASO nukleázokkal szembeni stabilitása biztosítja a gyógyszer stabilitását a bélben, ami lehetővé teszi további felszívódását. Az ASO molekulamérete és töltései azonban korlátozzák a gyógyszer felszívódását. A bélből történő felszívódás után az ASO kinetikája hasonló a parenterális beadás utánihoz. Bár a máj az ASO felhalmozódásának egyik fő helye, a májon keresztüli first-pass hatás nem fontos befolyásoló tényező az ASO gyógyszerkinetikájában.
Az ASO eloszlása a szervezetben
A perfúzió és a szövetaffinitás szerepe
Az ASO és más gyógyszerek eloszlása a permeabilitástól, a vérellátás intenzitásától, a plazmafehérjékhez, szövetekhez és sejtekhez való kötődéstől függ. Kimutatták, hogy az első és második generációs foszforotioát ASO-k szöveti eloszlása többszörös negatív töltésével és fehérjékhez való kötődésével a legkevésbé függ a vérellátástól, sokkal inkább a sejtbe történő szállításukat befolyásoló tényezőktől.
A plazmából a szövetbe való belső megoszlás viszonylag gyors, az eliminációs felezési idő intravénás beadás után 30-90 perc. Az ASO felezési ideje szubkután beadás után hosszabb, mint iv. Ez a különbség a felszívódáshoz szükséges időnek köszönhető, nem pedig más farmakokinetikai különbségeknek.
Az első és második generációs gyógyszerek kinetikájának vizsgálata kis különbségeket észlelt. A második generációs ASO nukleázokkal szembeni nagyobb stabilitást kompenzálja a fehérjékhez való kisebb kötődésük. Ezzel együtt az 1. és 2. generációs gyógyszerek farmakokinetikai profilja hasonló vagy szinte megkülönböztethetetlen, ha az első generáció natív ASO-jának és metabolitjainak (összes ASO) összegét összehasonlítjuk a második generáció ép gyógyszerével (ISIS 13650). ). Ellenkező esetben az ASO exonukleázok általi gyorsabb elpusztítása lerövidítené az első generációs gyógyszerek felezési idejét a második generációs gyógyszerekhez képest. Mindkét generáció gyógyszereinek megoszlása dózisfüggő.
Amint fentebb megjegyeztük, az injekció helyéről vagy a bélből történő felszívódás után az ASO-k plazmafehérjékhez kötődnek. Két plazmafehérje, amely specifikusan kötődik a foszforotioát ASO-khoz, az albumin és az alfa-2-makroglobulin. Egy másik gyakori fehérje, a savas glikoprotein nem köti az ASO-t. A fehérjekötés nagyon fontos az ASO célszövetbe való eloszlásához. A kötődést csökkentő kémiai szerkezetek a gyógyszer koncentrációjának észrevehető csökkenéséhez vezetnek a szövetekben, növelik a vese glomerulusokon keresztül történő szűrését és a vizelettel való kiválasztódását. Ez a jelenség figyelhető meg olyan ASO-k alkalmazásakor, amelyek diészter kötésekkel rendelkeznek a gyógyszervázban, vagy MOE-struktúra jelenlétében. A diészterek és a MOE struktúrák (vagy mindkettő) affinitásának csökkentése a fehérjékhez lehetővé teszi az ASO szabadabb keringését a véráramban, ami a vizelettel való kiválasztódásának fokozódásához vezet.
A parenterálisan beadott első és második generációs ASO-kkal végzett összes vizsgálatban nem figyeltük meg az ASO-k lineáris kiürülését a plazmából. A clearance a gyógyszer dózisának növelésével csökkent, ezért biohasznosulása nagyobb volt, mint az a beadott dózis alapján várható lenne. Mivel a kezdeti clearance az ASO szövetekben való eloszlásának köszönhető, és megfigyelték a gyógyszer felszívódását a szövetekbe, feltételezhető, hogy ezek ASO-val telítettek. Az ASO beadása következtében kialakuló telítési folyamat vizsgálata májfagociták felhasználásával végezhető el. Amikor az ASO kötődése Kupffer sejtekhez eléri a telítést, az affinitás csökkenése kezdődik. A későbbi ASO egereknek történő beadása javítja az ASO eloszlását a nem fagocita májsejtekben, ami jobb farmakológiai aktivitást eredményez a hepatocitákban a kontrollokhoz képest. Ezzel szemben 1 μg/ml alatti plazmakoncentrációnál az ASO-k aktívabban kötődnek a Kupffer-sejtekhez, és kevésbé halmozódnak fel a hepatocitákban.
Az ASO plazmafehérjékhez való kötődési folyamatának vizsgálata kimutatta, hogy ez a hatás a komplex gyors eloszlásával jár a szövetekben a sejtfelszínen. Bár a celluláris kötődés pontos mechanizmusait nem állapították meg, feltételezhető, hogy az ASO-k plazmafehérjékhez vagy sejtfehérjékhez kötődnek mindaddig, amíg vannak szabad kötőhelyek. A kötött ASO-k ezután koncentrációgradiens mentén oszlanak el a sejtmembránon az extracelluláris fehérjék intracelluláris fehérjére cserélésével.
Így az ASO sejtekbe való bejutásának hajtóereje a koncentráció gradiens. Leírták az ASO-k ingamozgását a citoplazma és a sejtmag között. Összességében egyértelmű, hogy a fehérjekötés megkönnyíti az ASO-k mozgását olyan gáton keresztül, amely normál esetben gátolná a hidrofil, nagy töltésű molekulák mozgását. Ez a membránokon áthaladó inga mechanizmus továbbra is hipotézis marad az ASO esetében, de korábban már leírták fémorganikus vegyületeknél. Az ASO transzportját az extracelluláris mátrixból az intracelluláris térbe egérmájban immunhisztokémiai módszerekkel, patkányvesében pedig vitális mikroszkóppal tettük láthatóvá, a második generációs ASO fluoreszcens jelölésével (S. Henry, B. Molitoris).
Az ASO-nak az extracellulárisból az intracelluláris térbe történő transzportját szabályozó fehérjék azonosítása nem ismert, de úgy gondolják, hogy a fehérje-ASO komplex kötődése a sejthez egy fagocita receptor segítségével történik. Mivel a fagociták, például a Kupffer-sejtek, a szöveti makrofágok és a proximális tubulussejtek nagy affinitást mutatnak az ASO-val szemben, elgondolkodhatunk azon, hogy sejtfelszínükön ilyen receptorokat találhatunk.
Azonban az SR-A I/II fagocita receptort nem tartalmazó transzgenikus egerekben az ASO sejtes eloszlása és farmakodinamikája nem különbözött a kontroll szingén állatokétól. Így úgy tűnik, hogy ez a Scavenger receptorként ismert receptor nem felelős a komplex májba és vesébe történő felvételéért. Az ASO-protein komplex endocitózisában részt vevő egyéb akceptor struktúrák szerepét nem vizsgálták.
Transzporterként funkcionáló membránfehérjék , minden szervezetben jelen van. A fő drogszállítók: ABC ( ATP-kötő kazettás transzporterek)és SLC (oldott hordozócsalád). Ismeretes, hogy a transzporterek által közvetített folyamatok segítségével az anyagok biológiai membránokon keresztül történő átvitelének sebességét a telítettség jellemzi. Az SLC család több ismert funkciójú tagját leírták , főként nukleozidok, nukleozid cukrok és foszfát cukrok szállítására. Úgy gondolják, hogy a jövőbeni kutatások nagy valószínűséggel az ASO membránok közötti transzportjának folyamatait érintik.
Nyilvánvaló, hogy a létrehozott struktúrák különböző szervek és szövetek általi felhalmozódásában, valamint az ilyen vegyületek kiürülésének és eloszlásának dózisuktól való függésében a fent említett különbségek mellett az ASO szövetekben való eloszlását a transzportrendszerek is befolyásolják, az egyének véráramlásának jellemzői, a gyógyszer lehetséges tartózkodási ideje a szervezetben, és végül az ASO szövetek telítettsége. Annak ellenére, hogy ezek a faktorok jelentős szerepet játszanak az ASO szöveti eloszlási folyamataiban, úgy véljük, hogy az ASO kezdeti kötődése a sejtfelszínhez az egyik meghatározó tényező a vizsgált mechanizmusokban. Ez a következtetés azon a tényen alapul, hogy a máj és a vesék az ASO-kötés kezdeti helyei, és az ASO beadását követő első 24 órában további felhalmozódás következik be. Az ASO májban és vesében történő eloszlási paramétereinek vizsgálatakor az első 24 órában a szer koncentrációjának töredékes növekedését mutatták ki a szervekben. Ez az ASO sejtes és szubcelluláris újraeloszlásának időszakában következik be, de feltehetően az elsődleges elosztó szerveknek idővel több anyagot kell felhalmozniuk, mivel ezeknek a szerveknek nagyobb affinitása az ASO-hoz. Az ezért az affinitásért felelős fehérjék tartalmazhatnak heparinszerű kötőhelyeket a laminin és a fibrinogén, valamint a fibroblaszt növekedési faktor (FGF) számára. Az ASO és a sejt közötti korai kölcsönhatás oka lehet ezeknek a fehérjéknek a kötődése, de ezeknek a fehérjéknek a természetét, amint azt fentebb megjegyeztük, kevéssé tanulmányozták.
Figyelembe véve az ASO sejtekhez kötődő specifikus helyeinek kombinációjának jelentőségét a gyógyszer szervezetben történő eloszlásában, meg kell jegyezni egy olyan fontos tényezőt, mint a különböző szervek eltérő vérellátása, amelyeknek az a képessége, hogy befolyásolják a szervezet eltérő eloszlását. foszforotioát ASO nyilvánvaló. Különböző szerzők szerint az első és második generációs anyagok tucatjaival végzett munka hasonló eloszlást mutat, és észrevehetően hasonló eloszlást a különböző fajok egyedei között. A vesék, a máj, a nyirokcsomók, a lép és a csontvelő azok a szervek, amelyek a legnagyobb mennyiségű ASO-t és metabolitjaikat halmozzák fel. Az a tény, hogy a tüdő és a szív nem halmoz fel ASO-t, azt jelzi, hogy az ASO májban és vesében történő kifejezett felhalmozódásának magyarázatához nem elegendő egyetlen magyarázat a jó vérellátásra. Például a vesékben a legjobb vérkeringéssel rendelkező területek a glomerulusok, és nem ezek tartalmazzák a legtöbb ASO-t. Éppen ellenkezőleg, a proximális tubulusokban a vérkeringés kevésbé aktív. A proximális tubulussejteket azonban nagyszámú aktívan fagocitáló sejt jellemzi, és szabad ASO-kat halmoznak fel, valamint fehérjékhez kötődő ASO-kat, amelyek általában a proximális tubulusokban szívódnak fel. Ennek eredményeként a vesekéreg és a proximális tubuláris epitélium tartalmazza a legmagasabb koncentrációban az első és második generációs foszforotioát ASO-kat.
Azt is meg kell jegyezni, hogy a máj vérellátása (ml/g szövet) a vese vérellátásának körülbelül 20%-a. A vese és a máj közötti 4-5-szörös perfúziós különbség nem vezet 4-5-szörös különbséghez az ASO-koncentrációban ezekben a szervekben. A fenestrált kapillárisok megnövelik az ASO és a véráram érintkezési területét, és ezért ez kompenzálhatja a máj elégtelen perfúzióját a vesékhez képest.
Az ASO kötődése a plazmafehérjékhez az eloszlás során
Bár az ASO-k sejttelítettsége végső soron befolyásolja szervi eloszlásukat, az ASO-k plazmafehérjékhez való kötődése megváltoztathatja a vese és a máj eloszlását különböző sorozatokban. A fehérjekötésben sorozatos különbségek vannak. Az ASO plazmafehérjékhez való kötődésének csökkenésével csökken a májban való felhalmozódásuk, és nő a vesékben való felhalmozódásuk. És fordítva, nagyobb kötődés esetén a szabad ASO koncentrációja a véráramban kisebb mennyiségben lesz, kevésbé halmozódik fel a vesékben és több más szervekben. Fordított összefüggés van az ASO-k fehérjekötődésének mértéke és a patkányok és majmok vesében való felhalmozódása között ismételt intravénás és szubkután beadás után.
A fehérjekötés használható kritériumként az ASO-k kiválasztásához a klinikai vizsgálatokhoz. A mai napig a fehérjekötődés meghatározása empirikus folyamat, amelynek során nem lehet megjósolni, hogy melyik tétel kötődik többé vagy kevésbé a fehérjékhez.
Az ASO-k felosztása más szervek között
Az első és második generációs foszforotioát ASO-k eloszlási sorrendjétől függetlenül ezeknek a gyógyszereknek a lokalizációjának jellegzetes mintázata figyelhető meg a vesében és a májban, valamint a lépben és a nyirokcsomókban, a csontokban és a zsírsejtek citoplazmájában. Az ASO limfoid szövetekben való felhalmozódása részben a hisztiociták és más mononukleáris sejtek fagocita aktivitásával magyarázható. A hisztiociták és a makrofág szövetek fagolizoszómáiban az ASO láthatóvá válik hematoxilin festéssel. Kimutatták, hogy az ASO-k endocitózison mennek keresztül, endoszómákban lokalizálódnak, és ezekben a struktúrákban tárolódnak. Az ASO koncentrációja a fagolizoszómákban gyakran olyan, hogy hematoxilin festéssel (hasonlóan a nukleáris DNS-hez) meghatározható. A fagolizoszómákban található ASO valószínűleg a lépben és a limfoid szervekben felhalmozódott ASO többségéért felelős. Ezenkívül a csontok és a csontvelő fagocitikusan aktív sejtjei felhalmozzák az ASO-t ezekben a szövetekben, amit a sejtekben lévő bazofil szemcsék bizonyítanak.
Az izmok (mind a csontváz, mind a szívizmok) nem tartalmaznak jelentős mennyiségű ASO-t. Az izomzat alapos vizsgálata immunhisztokémiai vagy autoradiográfiás módszerekkel azonban feltárja az ASO-tartalmat az izomsztrómában lévő makrofágok fagolizoszómáiban, és ez a felhalmozódás részben tükröződhet az izom és a szív ASO-koncentrációjának mérésében.
Terápiás szempontból jelentős az ASO felhalmozódása a zsírsejtek citoplazmájában. Különösen azért, mert a zsírsejtekben felhalmozódott legtöbb anyaggal ellentétben az ASO-k hidrofilek. Az immunhisztokémiai módszerek egyértelműen azt mutatják, hogy az ASO-k az adipociták citoplazmatikus frakciójában találhatók, míg az ASO-k szinte hiányoznak a zsírvakuólumban. A festődés intenzitása az anyag jelentős felhalmozódását jelzi a citoplazmában. Például majmokban az ISIS 113715 10 mg/ttkg/hét dózisú 13 hetes kezelését követően a májban a koncentráció 301 ± 88,1 μg/g volt, de a zsírszövetben csak 37,3 ± 14,4 μg/g volt. ugyanazok az állatok.
Tekintettel arra, hogy a zsírmentes komponens a teljes zsírtömeg 10%-át teszi ki, az ASO-koncentráció e mutató figyelembevételével történő korrekciója azt jelzi, hogy koncentrációja összehasonlítható a májban lévővel. Az ASO jelentős koncentrációja a zsírsejtekben azt jelzi, hogy felhasználhatók az ilyen típusú sejtek genetikai betegségeinek kezelésére: hormonok és citokinek forrása. Így azt találtuk, hogy az ISIS 113715 gyógyszer hetente kétszer 25 mg/ttkg dózisban történő beadása során az ASO farmakológiailag aktív koncentrációit regisztrálják az egerek zsírsejtekben, és csökkentik a PTP-1B célgén expresszióját mind a májban és zsírsejtekben. Hasonló megfigyeléseket végeztek az ASO ISIS 113715-tel kezelt majmoknál. Mivel a bőr alatti zsírbiopsziák klinikai körülmények között is elvégezhetők, és mivel az aktív ASO-k felhalmozódnak a zsírban, lehetőség van zsír felhasználására biopsziához és a farmakológiai hatások közvetlen mérésére (mRNS csökkenése). ) és a gyógyszer szöveti koncentrációja az emberi szövetekben.
A foszfotioát ASO-k más szövetekben is eloszlanak. Immunhisztokémiai vizsgálatok azt mutatják, hogy az endothelsejtek olyan koncentrációban halmozzák fel az ASO-t, amely jelentős az mRNS-szint csökkentésében, így potenciális célpontjai lehetnek a farmakológiai beavatkozásnak. Egyes szövetekben koncentrációjuk nem elég magas ahhoz, hogy farmakológiai hatást váltsanak ki. Például az érett limfociták nem halmozzák fel az ASO-t, és az antiszensz aktivitást a T-sejtek korlátozzák.
A csontsejtek, különösen a fagocitikusan aktív oszteoblasztok felhalmozhatják az ASO-t, és ez a hatás terápiás célokra használható fel. Emellett a hasnyálmirigy-szigetsejtek is felhalmozzák az ASO-t. Mind az első, mind a második generációs ASO-k erősen töltött hidrofil molekulák, amelyek nem hatolnak át a vér-agy vagy a vér-here gáton. Azonban, mint az izomban, a kimutatható ASO-kat tartalmazó makrofágok a here interstitiumában lokalizálódnak. A petefészkeket nem választja el gát, így az ASO mennyiségileg mérhető a petefészekben, és immunhisztokémiával vizualizálható a stromában.
Az ASO-k korlátozott eloszlása a plazmából az agysejtekbe és a kardiomiocitákba teszi ezeket a szöveteket az antiszensz beavatkozások valószínűtlen célpontjává, bár bizonyos ioncsatorna-fehérjék agyban és izomban történő szelektív gátlása vagy expressziója terápiás szempontból előnyös lehet. Az ASO korlátozott eloszlása azonban ezekben a szövetekben előnynek tekinthető. Az ASO jelentős koncentrációjának hiánya az agyban és a szívben csökkenti a központi idegrendszer (CNS) károsodásának kockázatát és csökkenti a szívre gyakorolt káros hatások előfordulását. Amint azt korábban megjegyeztük, a központi idegrendszer struktúráiba, különösen az agyba történő közvetlen beadás intratekális, intraventrikuláris infúzióval vagy injekcióval az ASO eloszlását okozza a központi idegrendszerben, és terápiásán előnyös lehet.
A terhesség alatt a magzat meglehetősen jól védett az antiszensz gyógyszerek hatásaival szemben. Az ASO transzplacentális kinetikájának vizsgálata nem tárta fel a magzatban való felhalmozódását; rágcsálóknál alacsony ASO-szintet figyeltek meg a placentában. Ezeket az eredményeket következetesen megismételték a különböző második generációs ASO-k teratogén hatásának vizsgálataiban egereken, patkányokon és nyulakon. A méhlepény, magas perfúziója ellenére, nem olyan szerv, ahol magas az ASO felhalmozódása.
Általánosságban elmondható, hogy a bemutatott tények azt mutatják, hogy az ASO-eloszlás az egyik kulcsfontosságú tényező, amely meghatározza az ASO-tevékenység súlyosságát. Az ASO eloszlásában mutatkozó különbségek nagyrészt a szöveti tropizmussal és kisebb mértékben a perfúzióval kapcsolatosak.
Anyagcsere
Az első és második generációs antiszensz gyógyszereket nukleázok metabolizálják, nem pedig oxidázrendszerek, mint például a citokróm P450, amely a hagyományos lipofil kis molekulájú gyógyszereket metabolizálja. Az ASO-k nem szubsztrátjai a citokróm P450 izoenzimeknek, és nem is indukálják vagy gátolják annak aktivitását klinikailag releváns koncentrációkban. Az ASO-k exonukleáz által közvetített hasítása, amely az első generációs foszforotioát ODN-ek metabolizmusának és kiürülésének fő útvonala, másodlagos a második generációs ASO-khoz képest. Az exonukleáz aktivitást két fragmentum korlátozza: egy MOE a 3"-os végén és egy másik MOE az 5"-os végén.
Az ASO anyagcseréért felelős enzimek
A második generációs ASO-kat metabolizáló specifikus enzimek nem ismertek. A nukleázok mindenütt eloszlanak, és a legtöbb szövetben kimutathatók a lebomlott ASO metabolitok. A máj- és vesehomogenizátumok egyaránt képesek a második generációs ASO-k metabolizálására in vitro anélkül, hogy külső energiaforrásokat, például nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot (NADPH) vagy adenozin-5-trifoszfátot (ATP) adnának hozzá. A kezdeti hasítás két terméket eredményez, amelyek mindegyikét egy 5" és 3" MOE-védett vég jellemez. Ezek a metabolitok nem kötődnek fehérjékhez, így kiválasztódnak a szövetekből. Mivel a metabolitok gyorsabban eltávolíthatók, mint amennyire kialakulnak, gyakorlatilag nem halmozódnak fel a metabolitok a szövetekben. Így a szövetben lévő metabolitok mennyiségének meghatározását nem lehet a szövetek ASO-metabolizmusának indexeként használni.
Mivel az ASO-k szövetekből történő eliminációjának sebessége az anyagcseréjüktől függ, az ASO-k metabolizmusában mutatkozó különbségek a különböző szövetekben megbecsülhetők a jellemzett szövetekből származó ezen gyógyszerek felezési ideje alapján. Négy második generációs ASO adatai alapján arra a következtetésre jutottak, hogy ennek az osztálynak a viselkedése hasonló, de a 4-13 hétig kezelt majmok májában és veséjében kismértékű eltérések vannak felezési idejükben. Kimutatták, hogy az ISIS 104838 és 112989 ASO-gyógyszerek májból és veséből származó felezési ideje nagyon hasonló. Ezek az adatok azt sugallják, hogy egyes ASO-sorozatok esetében nincs szignifikáns különbség a különböző szervek metabolikus sebességében. A szöveti felezési időben azonban eltéréseket találtak az ISIS 107248, 113715 és 301012 esetében. Az ASO-gyógyszerek májban és vesében történő metabolizmusának sebességében megfigyelt különbségek arra utalnak, hogy a különböző szövetekben eltérő lehet az anyagcsere sebessége, vagy összetettebb kinetika a gyógyszer egyes sorozatainál, vagy a kapott eredmények egyszerűen csak kis számú, korlátozott ideig vett mintát tükröznek.
A második generációs ASO-k eliminációs folyamatának részletes vizsgálata azt mutatja, hogy különböző típusú májsejtekből különböző mértékben eliminálódnak. Mivel egyes sejttípusok, például a vesekéreg proximális tubuláris sejtjei általában ASO-kat tartalmaznak a fagolizoszómákban, ez a fajta felvétel valószínűleg felelős a szövetek közötti gyógyszer-anyagcsere-sebesség-különbségekért. Ezenkívül valószínű, hogy az ASO-váz szerkezetében lévő specifikus szekvenciákat az endonukleázok általi hasítással szembeni eltérő érzékenység jellemezheti.
A bakteriális exonukleázok nagyfokú nukleotidszekvencia-specifitást mutatnak az ASO-vázban, feltehetően a vírusok elleni védelem érdekében. Az emlőssejtekben a legtöbb nukleázaktivitás a transzkripciós és DNS-javító mechanizmusokhoz kapcsolódik, így az emlősök fajspecifitása eltérhet a bakteriális endonukleázokétól. Nem ismert, hogy a replikációs folyamatok és a javítás jelenségével összefüggő enzimek működése egyformán felelős-e ezen szintetikus ASO-k katabolizmusáért. Az ssDNS magas koncentrációinál az ASO-k hatékonyan versenyezhetnek a természetes szubsztráttal. A nukleázcsalád számos enzime képes az ASO katabolizálására. Az ASO-metabolizmusban részt vevő specifikus enzimek meghatározása nem kritikus az antiszensz gyógyszerek kifejlesztése szempontjából, de az anyagcsere utak jobb megértése hasznos lesz új technológiák kifejlesztéséhez.
ASO metabolitok
Az első és második generációs ASO-k metabolizmusában mutatkozó különbségek nagyon nyilvánvalóak, ha összehasonlítjuk a metabolikus profilt a CGE-vel. Ha szövet- vagy vizeletmintákat elemeznek egy LC/MS detektorban, az anyagcsere folyamatok természete világosabbá válik. Az első generációs foszforotioát ODN-ek jellemzően ASO metabolitok kaszkádjává metabolizálódnak, amelyek mindegyike egy nukleotidban különbözik az egynukleotidos exonukleáz hasítások eredményeként. Így egy 20 tagú, azaz 20 nukleotidból álló bevitelt követően az első generációs ODN, a plazma és a szövetek szekvenciálisan lerövidített ASO-családokat tartalmaznak, kezdve a 19-merrel és tovább egészen a rövid ASO-ig.
A második generációs ASO metabolizmus kezdeti hasítása közvetítette
endonukleázok, két ASO képződéséhez vezet, az egyik a MOE 3"-os, a másik pedig a MOE 5"-os végével. A szabad végű termékek hasítása végrehajtható 5"-os exonukleázzal vagy 3"-os exonukleázzal. A kombinált endo- és exonukleáz aktivitás eredménye láncrövidült hasítási termékek sorozata, amelyek közül sok, ha nem is az összes kimutatható a kísérleti állatoktól vagy emberektől gyűjtött vizeletben. A gyógyszerrel kezelt állatok vagy a második generációs ASO-kkal kezelt betegek vizelete tartalmazhat metabolitokat, amelyek két lehetséges 15-mertől két lehetséges MOE 5-merig terjednek, és az egyes köztes metabolitok többszörös kombinációját.
A MOE-végek hosszánál rövidebb metabolitok jelen lesznek a szövetekben, ha a MOE-végek maguk is a nukleázok szubsztrátjai. Ezeket a metabolitokat általában nem mutatják ki tömegspektrum-analízissel, ami arra utal, hogy az anyagcsere során jellemzően nem szabadulnak fel MOE mononukleotidok. Ez alól az általánosítás alól azonban előfordul néhány kivétel. Korlátozott számú nukleotidszekvenciához , A szövetekben és a plazmában a második generációs ASO-k egynukleotidos levágását figyelték meg – vagy CGE vagy LC/MS: úgy tűnt, hogy a metabolitok exonukleázos emésztés eredménye. Ezek a metabolitok megfigyelhetők a kezdeti eloszlásban. Várhatóan gyorsan megjelennek a vérplazmában. Az anyagcsere során keletkező MOE-mononukleotidok nem szubsztrátjai a foszforilációnak, ezért nem valószínű, hogy beépülnek a nukleotid-trifoszfátokba, és végső soron az endogén nukleotidokba. A MOE mononukleotidok nem gátolják a DNS szintézisért felelős enzimeket. Így a MOE mononukleotidok, ha kialakulnak, nem épülhetnek be endogén nukleotidokba.
A második generációs ASO-dezoxinukleotidok központi része exonukleázos hasításnak van kitéve, ami egyetlen nukleotid felszabadulását eredményezi. Az exonukleázos emésztéssel előállított monodezoxinukleotidok azonosak az endogén nukleotidokkal, egy tiofoszfátcsoport kivételével, amely elméletileg jelen lehet. A tiofoszfátcsoport azonban labilis az oxidációra és a kénvesztésre, így a terminális foszfátcsoport azonos az endogén nukleotidokkal. Ezért a MOE mononukleotidokkal ellentétben minden felszabaduló dezoxinukleotid természetesen beépül az endogén nukleotidok intracelluláris készletébe. A tiofoszfátcsoportokat megtartó nukleotidok szubsztrátjai lesznek egy vagy két foszfátcsoport hozzáadásához, ami vegyes nukleotid-tiofoszfát-di- vagy -trifoszfátokat eredményez. Foszforiláció lehetséges, de az alfa-tiofoszfát jelenléte termodinamikailag kedvezőtlenné teszi a reakciókat.
Következtetés
Nyilvánvaló a leírtakhoz hasonló adatok és gyógyszerek farmakokinetikájának tanulmányozása, valamint a különböző állatfajokon alapuló modellek létrehozása a szervezetben a gyógyszerszedés után lezajló folyamatok teljes megértéséhez. Hasonló szerekkel kapcsolatos kutatások Oroszországban is folynak.
Irodalom
1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. Az ISIS 2503, a H-ras antiszensz inhibitora, gemcitabinnal kombinált I. fázisú vizsgálata előrehaladott rákos betegeknél. // Clin. Cancer Res. 2003. évf. 9, 1. sz. 115. o.
2. Benimetskaya L., Loike J. D., Loike G. et al. A Mac-1 (CD11b/CD18) egy ODN-kötő fehérje. //Nat. Med. 1997. évf. 3, 4. sz. 414. o.
3. Benimetskaya L., Tonkinson J. L., Koziolkiewicz M. et al. A foszforotioát ODN-ek kötődése alapvető fibroblaszt növekedési faktorhoz, rekombináns oldható CD4-hez, lamininhez és fibronektinhez P-kiralitástól független. Nucl. Acids Res. 1995. évf. 23., 21. sz. 4239. o.
4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. A foszforotioát antiszensz ODN-ek in vitro sorsa: túlnyomórészt a scavenger receptorok felvétele az endotélsejteken. Nucl. Acids Res. 1997. évf. 25., 16. sz. 3290. o.
5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. A plazmafehérje kötődés és a foszforotioát ODN-ek in vitro májsejt-felvételének modulálása koleszterin konjugációval. Nucl. Acids Res. 2000. évf. 28., 14. sz., 2717. o.
6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Az ODN-ek foszforotioát módosításának hatása a specifikus fehérjekötésre. J. Biol. Chem. 1994. évf. 269, 43. sz. R. 26801.
7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. A foszforotioát ODN-ek hasonló eloszlásban vannak az A osztályú scavenger receptor knockout és a vad típusú egerekben. J. Pharmacol. Exp. Ott. 2000. évf. 292, 2. sz. 489. o.
8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. A 2_-O-(2-metoxi-etil)-módosított ASO-k spinális eloszlása és metabolizmusa intratekális adagolás után patkányokban. // Idegtudomány. 2005. évf. 131, 3. sz. 705. o.
9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. A foszforotioát ODN-ek sejtes eloszlása normál rágcsálószövetekben. //Labor. Invest. 1997. évf. 77, 4. sz. 379. o.
10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. A 14C-vel jelölt foszforotioát ASO ISIS 2105 elhelyezése intravénás beadás után patkányoknak. J. Pharmacol. Exp. Ott. 1993. évf. 267, 3. sz. 1181. o.
11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. A 14C-vel jelölt foszforotioát ASO, ISIS 2105 farmakokinetikája patkányoknak történő intradermális beadás után. J. Pharmacol. Exp. Ott. 1994. évf. 269, 1. sz. 89. o.
12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Számos új ASO analóg farmakokinetikai tulajdonságai egerekben. J. Pharmacol. Exp. Ott. 1996. évf. 277, 2. sz. 923. o.
13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Az embrionális génexpresszió ASO-alapú gátlása. //Nat. Biotechnol. 1999. évf. 17. 1184. o.
14. Eckstein F. Foszforotioát ODN-ek: mi az eredetük és mi az egyediségük? //Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. évf. 10, 2. sz. R. 117.
15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Foszforotioát ASO metabolitok on-line HPLC elektrospray tömegspektrometriája. //Anális. Chem. 1997. évf. 69, 3. sz. 313. o.
16. Geary R.S. A PK/PD kapcsolatok jelenlegi értékelése az antiszensz terápiákban. // Gyógyszerészeti és Gyógyszertudományi Világkongresszus, Nizza, Franciaország, 2002.
17. Geary R. S., Bradley J. D., Watanabe T. et al. Farmakokinetikai kölcsönhatás hiánya az ISIS 113715-nél, egy 2_-O-metoxietil módosított antiszensz oligonukleotidnál, amely a protein tirozin-foszfatáz 1B hírvivő RNS-t célozza meg orális antidiabetikus metforminnal, glipiziddel vagy roziglitazonnal. // Clin. Farmakokinet. 2006. évf. 45, 8. sz. 789. o.
18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. A C-raf-1 kináz expressziójának foszforotioát ASO antiszensz inhibitorának farmakokinetikája és metabolizmusa egerekben. // Drug Metab. Dispos. 1997. évf. 25., 11. sz. R. 1272.
19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Antiszensz oligonukleotid inhibitorok rák kezelésére: 1. A foszforotioát ODN-ek farmakokinetikai tulajdonságai. // Anticancer Drug Des. 1997. évf. 12, 5. sz. R. 383.
20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Szekvenciától független plazma és szövet farmakokinetikája 3 antiszensz foszforotioát ASO-hoz: egértől emberhez. // in American Association of Pharmaceutical Scientists, Pharm. Research, Plenum Press, Seattle, Washington. 1996. R. S.
21. Geary R. S., Teng C. L., Truong L. et al. Részlegesen módosított kiméra antiszensz oligonukleotidok hepatikus extrakciója első lépésben Beagle kutyákban. // az American Association of Pharmaceutical Scientists éves találkozóján, Indianapolis, IN, 2000. 216. o.
22. Geary RS, Ushiro-Watanabe T, Truong L et al. 2_-O-(2-metoxi-etil)-módosított ASO-analógok farmakokinetikai tulajdonságai patkányokban. J. Pharmacol. Exp. Ott. 2001. évf. 296, 3. sz. R. 890.
23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. A foszforotioát antiszensz ODN-ek farmakokinetikája. //Curr. Opin. Invest. Kábítószer. 2001. évf. 2, 4. sz. R. 562.
24. Geary R. S., Yu R. Z., Watanabe T. et al. Tumornekrózis faktor-alfa-foszforotioát 2_-O-(2-metoxietil) módosított antiszensz oligonukleotidok farmakokinetikája: fajok összehasonlítása. // Drug Metab. Dispos. 2003. évf. 31., 11. sz. 1419. o.
25. Giacomini K.M., Sugiyama Y., Membrane transporters and drug response, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11. kiadás, Brunton, L.L., szerk., McGraw-Hill, New York, 2006. 41. o.
26. Gleave M., Chi K.N. A citoprotektív gén, a klaszterin leütése a hormonok és a kemoszenzitivitás fokozása érdekében prosztatarákban és más daganatokban. //Ann. NY Acad. Sci. 2005. 1058. évf. o. 1.
27. Gleave M., Miyake H. A citoprotektív gént, klasztert célzó antiszensz oligonukleotidok alkalmazása prosztatarák androgén- és kemoérzékenységének fokozására. // World J. Urol. 23. 2005. 1. sz. 38. o.
28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Egy intercelluláris adhéziós molekula-1 antiszensz ODN (ISIS 2302) I. fázisú biztonságossága és farmakokinetikai profilja. J. Pharmacol. Exp. Ott. 1997. évf. 282, 3. sz. R. 1173.
29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. A foszforotioát ASO in vitro eloszlása és metabolizmusa a patkánymájban intravénás beadás után. J. Pharmacol. Exp. Ott. 1998. évf. 286, 1. sz. 447. o.
30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. A foszforotioát ODN-ek az alap fibroblaszt növekedési faktorhoz kötődnek, gátolják annak sejtfelszíni receptorokhoz való kötődését, és eltávolítják az extracelluláris mátrix kis affinitású kötőhelyeiről. J. Biol. Chem. 1995. évf. 270. 2620. o.
31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Az ICAM-1 humán és egér antiszensz oligonukleotid inhibitorainak hatása a szaporodási teljesítményre, a magzati fejlődésre és a születés utáni fejlődésre egerekben. // Birth Defects Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2004. évf. 71, 6. sz. 359. o.
32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. et al. A spinális protein kináz C alfa expressziójának antiszensz oligonukleotiddal történő gátlása gyengíti a morfin infúzió által kiváltott toleranciát. // Idegtudomány. 2002. évf. 113, 1. sz. 99. o.
33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Az angiogenezis gátlása a klaszterin antiszensz oligonukleotidokkal. // Angiogenezis. 2005. évf. 8, 3. sz. 229. o.
34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Az apolipoprotein B és az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin hatékony csökkentése az apolipoprotein B antiszensz inhibitorának rövid távú beadásával. // Keringés. 2006. évf. 114., 16. sz. 1729. o.
35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Sztereodiferntiáció – az oligo(nukleozid-foszforotioátok) P-kiralitásának hatása a bakteriális RNáz H aktivitására. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol.23, No.24. 5000 R.
36. Leeds J.M., Geary R.S. A foszforotioát ASO-k farmakokinetikai tulajdonságai emberekben, Antisense Research and Applications, 1. kiadás, Crooke, S. T., szerk., Springer, Heidelberg, 1998. 217. o.
37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Foszforotioát oligodezoxinukleotid szubkután és intravénás beadásának farmakokinetikájának összehasonlítása cynomolgus majmokban. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, No.6. R. 435.
38. Levin A.A. A foszforotioát antiszensz oligonukleotidok farmakokinetikájával és toxikológiájával kapcsolatos kérdések áttekintése. //Biochim. Biophys. Acta. 1999. 1489. évf., 1. sz. R. 69.
39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. A foszforotioát ASO-k farmakokinetikája és toxicitása, Biotechnology and Safety Assessment, 2. kiadás, Thomas, J. A., szerk., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. 151. o.
40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Az antiszensz terápiák preklinikai fejlesztése, In Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, 1st ed., Oxender D.L. és Post L.E., szerk., Springer-Verlag, Heidelberg, Németország, 1998, 131. o.
41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toxicity of antisense oligonucleotides. // in Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., szerk., Marcel Dekker, New York, 2001. 201. o.
42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Az ASO transzport jellemzése élő sejtekbe. //Proc. Natl. Acad. Sci. EGYESÜLT ÁLLAMOK. 1989. évf. 86. 3474. o.
43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Nukleocitoplazmatikus shuttling: az antiszensz foszforotioát ODN-ek új in vitro tulajdonsága. Nucl. Acids Res. 2000. évf. 28, 2. sz. 582. o.
44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Az alikaforsén (ISIS 2302) biohasznosulása és terápiás aktivitása rektális retenciós beöntésként alkalmazva aktív vastagbélgyulladásban szenvedő betegeknél. // Ailment Pharmacol. Ott. 2006. évf. 23, 10. sz. R. 1427.
45. Mou T.C., Gray D.M. A foszforotioáttal módosított oligomerek Ff gén 5 fehérje iránti nagy kötési affinitását C-5 propilén vagy 2_-O-metil módosítások hozzáadása mérsékli. Nucl. Acids Res. 2002. évf. 30, 3. sz. R. 749.
46. Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. A foszforotioátok farmakokinetikai tulajdonságai állatokban – felszívódás, eloszlás, metabolizmus és elimináció, Antisense Research and Applications, 1st ed., Crooke, S. T., ed., Springer, Berlin, 1998. 141. o.
47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Az ASO ISIS 1082 antiszensz foszforotioát szöveti eloszlása és fiziológiai alapú farmakokinetikája patkányban. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2001. évf. 11, 1. sz. 15. o.
48. Phillips J. A., Craig S. J., Bayley D. et al. A 20-tagú foszforotioát ODN (CGP 69846A) farmakokinetikája, metabolizmusa és eliminációja intravénás és szubkután beadás után. // Biochem. Pharmacol. 1997. évf. 54, 6. sz. R. 657.
49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Disposition of ASOs in izolált perfundált patkányvese: a scavenger receptorok részvétele a vese felvételében. J. Pharmacol. Exp. Ott. 1996. évf. 279, 1. sz. 284. o.
50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Az ISIS 104838, egy 2_-metoxi-etil módosított antiszensz oligonukleotid I. fázisú kísérlete, amely az alfa-tumornekrózis faktort célozza meg. J. Pharmacol. Exp. Ott. 2002. évf. 303, 3. sz. R. 1334.
51. Slim G., Gait M.J. Konfiguráció szerint meghatározott foszforotioát tartalmú oligoribonukleotidok a kalapácsfejű ribozimek hasítási mechanizmusának vizsgálatában. Nucl. Acids Res. 1991. évf. 19., 6. sz. R. 1183.
52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Az auranofin sejtek asszociációja, intracelluláris eloszlása és kiáramlása szekvenciális ligandumcsere-reakciókon keresztül. // Biochem. Pharmacol. 1986. évf. 35, 6. sz. 923. o.
53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. A foszforotioát ASO anyai és magzati megoszlása patkányokban intravénás infúzió után. // Birth Defects Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2006. évf. 77, 1. sz. 22. o.
54. Spitzer S., Eckstein F. Dezoxiribonukleázok gátlása foszforotioátcsoportokkal oligodezoxiribonukleotidokban. Nucl. Acids Res. 1988. évf. 16., 24. sz. R. 11691.
55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Egy antiszensz oligonukleotid (ISIS 2302) farmakokinetikája és hepatikus first pass hatása patkányokban. // az American Association of Pharmaceutical Scientists éves találkozóján, Indianapolis, IN, 2000. 216. o.
56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. A foszforotioát ASO farmakokinetikai és toxicitási profilja egerek tüdejébe történő inhaláció után. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. évf. 10, 5. sz. R. 359.
57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. A 2_-O-(2-metoxi-etil)-RNS kristályszerkezete és javított antiszensz tulajdonságai. //Nat. Struktúra. Biol. 1999. Vol.6, No.6. R.535.
58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. Az LY900003, a protein-kináz C-alfa antiszensz inhibitora, ciszplatinnal és gemcitabinnal kombinált I/II. fázisú vizsgálata előrehaladott nem-kissejtes tüdőrákban szenvedő betegeknél. // Clin. Cancer Res. 2004. évf. 10., 18. szám Pt 1. 6086. o.
59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. A humán ICAM-1-et (ISIS 2302) megcélzó antiszensz oligonukleotid plazmafehérje kötődése. // ASO-k. 2006. évf. 16, 2. sz. 169. o.
60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Egyszálú foszfodiészter és foszforotioát oligodezoxiribonukleotidok hidratálása. Nucl. Acids Res. 1996. évf. 24., 16. sz. R. 3261.
61. Wilson D.M. Harmadszor, az Ape1 abázikus endonukleáz aktivitását a magnézium és a kálium koncentrációja szabályozza, és erős az alternatív DNS-struktúrákon. // J. Mol. Biol. 2005. évf. 345, 5. sz. 1003. o.
62. Yu D., Kandimalla E. R., Roskey A. et al. Sztereóban dúsított foszforotioát ODN-ek: szintézis, biofizikai és biológiai tulajdonságok. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Vol.8, No.1. R. 275.
63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Ultraszenzitív, nem kompetitív hibridizációs-ligációs enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati eljárás kidolgozása foszforotioát ODN meghatározására plazmában. //Anális. Biochem. 2002. évf. 304, 1. sz. 19. o.
64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. A humán Ha-ras mRNS-t célzó antiszensz foszforotioát ASO farmakokinetikájának és szöveti elhelyezkedésének összehasonlítása egérben és majomban. // J. Pharm. Sci. 2001. évf. 90, 2. sz. 182. o.
65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Új kvantitatív bioanalitikai módszerek alkalmazása antiszensz oligonukleotidok farmakokinetikai és farmakokinetikai/farmakodinamikai értékelésére. //Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2004. évf. 7, 2. sz. R. 195.
66. Yu R. Z., Kim T. W., Hong A. et al. Egy második generációs ISIS 301012 antiszensz oligonukleotid fajok közötti farmakokinetikai összehasonlítása egér és ember között, amely a humán apolipoprotein B-100-at célozza meg. // Drug Metab. Dispos. 2007. évf. 35. 460. o.
67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. A Fas mRNS-t célzó antiszensz foszforotioát ASO farmakokinetikája és farmakodinamikája egerekben. J. Pharmacol. Exp. Ott. 2001. évf. 296, 2. sz. 388. o.
68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillian J.M. et al. A PTP1B antiszensz oligonukleotid csökkenti a PTP1B fehérjét, normalizálja a vércukorszintet, és javítja az inzulinérzékenységet cukorbeteg egerekben. //Proc. Natl. Acad. Sci. EGYESÜLT ÁLLAMOK. 2002. évf. 99, 17. sz. 1137. o.
Gyógyszer a génekre
Az orvosok régi álma, hogy olyan anyagok álljanak rendelkezésükre, amelyek meghatározott génekre hatnak, pl. számos betegség kiváltó oka. Valójában az ilyen anyagok alapján lehet gyógyszereket létrehozni - igazi „varázsgolyókat”, amelyek képesek megtámadni a különféle fertőző ágensek örökletes anyagát anélkül, hogy károsítanák az emberi szervezetet, valamint elnyomhatják a rosszindulatú daganatokért felelős onkogének aktivitását. sejtnövekedés. Az ilyen, a genetikai anyagot specifikusan befolyásoló anyagok létrehozása a molekuláris biológia egyik fő feladata, hiszen segítségükkel lehetőség nyílik a gének működésének tanulmányozására és végső soron az utóbbiak munkájának ellenőrzésére.
De hogyan lehet megváltoztatni a kívánt genetikai programot? Hiszen minden génnek hasonló a kémiai összetétele és szerkezete: a köztük lévő különbségek csak négy monomer blokk - A, T, G, C nukleotidok - váltakozási sorrendjébe mennek vissza. Egy adott gén befolyásolása érdekében a molekula az anyagnak valahogyan fel kell ismernie ezt a nukleotidszekvenciát – a feladat első pillantásra megoldhatatlan.
Ám a szibériai kémikusok egy csoportja, akik a létrehozásának első éveiben érkeztek a Novoszibirszki Akadémiai Városba, másként gondolták. A Szovjetunió Tudományos Akadémia Szibériai Kirendeltsége (Novoszibirszk) Szerves Kémiai Intézetének munkatársai, N. I. Grineva és D. G. Knorre a természet által alkalmazott molekuláris felismerés elve alapján megfogalmazták a génekre gyakorolt irányított hatás gondolatát. oligonukleotidok felhasználásával - nukleinsav-fragmensek, speciális vegyi anyagokkal „fegyverkezve” csoportokban. A szibériai kémikusok 1967-ben publikálták első munkájukat az oligonukleotidokról - ezt a dátumot tartják ma a molekuláris biológia és farmakológia új irányának megjelenésének hivatalos dátumának.
Ők voltak az elsők
Ennek a szokatlanul merész projektnek a végrehajtását (akkoriban a világon sehol nem tervezték ilyen kutatást) a kezdeti szakaszban fiatal alkalmazottak, végzős hallgatók és az NSU hallgatói egy kis csoportja végezte. Gyakorlatilag a nulláról kellett kezdenünk, hiszen akkoriban még nem tudták, hogyan lehet észrevehető mennyiségben szintetizálni az oligonukleotidokat; Nem voltak szükségesek a kis mennyiségű nukleinsavakkal való munkavégzéshez szükséges technikai eszközök, és nem voltak hatékony módszerek azok szekvenciájának meghatározására. Vegyészeinknek sikerült megoldaniuk ezeket a problémákat az interdiszciplinaritásnak köszönhetően – ez az egyik alapelv, amely a Szibériai Kirendeltség tevékenységének alapját képezte.
A NIOH-ban megszervezték a nukleinsavak termelését, és módszereket dolgoztak ki kémiai módosításukra; A Nukleáris Fizikai Intézet munkatársaival közösen sikerült létrehozni a nukleinsavak elemzésére és kis mennyiségű manipulálására alkalmas műszereket, valamint a Moszkvai Állami Egyetem vegyészeivel közösen megkezdték az automatikus oligonukleotid szintetizátorok megalkotását. Ennek eredményeként a tudósok szinte minden szükséges analitikai módszerrel és műszerrel rendelkeztek – kezdődhetett a biológiai kutatás.
Először egyszerű modelleken, majd természetes nukleinsavakon végzett kísérletek azt mutatták, hogy az oligonukleotidok valóban nagy szelektivitással lépnek kölcsönhatásba a célnukleinsavakkal. Abban az esetben, ha reaktív csoportok kapcsolódnak az oligonukleotidokhoz, a célpontok - nukleinsavak - irányított kémiai módosítása következik be. Emellett először igazolták, hogy ezekkel a reagensekkel lehet visszaszorítani állatokban a vírusfertőzéseket, illetve bebizonyosodott a bőrön, nyálkahártyán stb.
Az oligonukleotidok biológiai hatásairól szóló korai publikációk nagy érdeklődést váltottak ki a szakemberek körében szerte a világon. 1988-ban Akademgorodokban rendezték meg a világ első szimpóziumát a nukleinsav-fragmenseken alapuló géncélzott anyagokról. Az Egyesült Államok, Franciaország, majd más országok tudósai csatlakoztak az ilyen gyógyszerek létrehozására irányuló munkához; Vállalatok tucatjai jelentek meg azzal a céllal, hogy oligonukleotidokon alapuló terápiás gyógyszereket hozzanak létre.
Kiegészítő gyógyszer
A gén-célzott gyógyszerek közül az elsők az úgynevezett antiszensz oligonukleotidok voltak, amelyeket a vírus RNS-ek és egyes sejtes RNS-ek szelektív inaktiválására terveztek. Kezdetben azt feltételezték, hogy ezekhez az oligonukleotidokhoz reaktív csoportok kapcsolódnak, amelyek kémiailag módosítják vagy elpusztítják a célnukleinsavakat. Kiderült azonban, hogy magára az oligonukleotidoknak a cél-RNS-hez való kapcsolódása olyan nagy hatással van rá, hogy sejtenzimek által kiválthatja annak pusztulását.
D. G. KNORRE - az Orosz Tudományos Akadémia akadémikusa, a kémiai kinetika, a molekuláris biológia és a bioorganikus kémia szakértője. A Szovjetunió Tudományos Akadémia Szibériai Kirendeltsége Szerves Kémiai Intézetének Biokémiai Tanszékének és Nukleinsavkémiai Laboratóriumának (1960-1984) vezetője (1960-1984), a Szovjetunió Tudományos Akadémia Szibériai Kirendeltsége Szerves Kémiai Intézetének igazgatója. A Szovjetunió Tudományos Akadémia Szibériai Kirendeltségének bioorganikus kémiája és az Orosz Tudományos Akadémia Szibériai Kirendeltsége (1984-1996).
A nukleinsavak biológiai aktivitásának visszaszorítására szolgáló nukleotidok és nukleinsavak felhasználásán alapuló antiszensz megközelítések érdekes távlatokkal kecsegtetnek azokban az esetekben, amikor szükség van a nemkívánatos információk élő szervezetekben való bejutásának visszaszorítására. Mindenekelőtt megnyílik a lehetőség a vírus- és daganatellenes gyógyszerek új generációjának létrehozására. Az ilyen gyógyszereknek van egy tagadhatatlan előnyük a többihez képest... Minden oligonukleotid, függetlenül attól, hogy milyen célpontra irányul, egyetlen technológiával létrehozható. Csak a nukleotid szekvenciát kell variálni. Különösen a virológiában és az onkológiában kell gyakran foglalkozni a gyógyszerrezisztencia jelenségével. Ez leggyakrabban azért történik, mert egyetlen vírusrészecske vagy egyetlen rákos sejt olyan mutáción megy keresztül, amely ilyen rezisztenciához vezet. Minden más esetben el kell kezdenie egy új gyógyszer empirikus keresését. Az antiszensz hatások esetén csak azt kell meghatározni, hogy a vírusgenom vagy onkogén szerkezetében milyen változás vezetett a rezisztencia kialakulásához. Ezt követően azonnal világossá válik, hogyan lehet ugyanazzal az egységes technológiával* új gyógyszert létrehozni. * Soros oktatási magazin. - 1998. - 12. - 25-31.
A gének „kikapcsolásának” legerősebb eszköze az interferáló RNS-ek - RNS-oligonukleotidok rövid, kétszálú komplexei. Amikor egy ilyen komplexet bejuttatnak egy sejtbe, az egyik lánc a sejt hírvivő RNS-ében lévő komplementer szekvenciájához kötődik. Ez jelként szolgál az oligonukleotidokhoz kapcsolódó RNS-t levágó enzimcsoport beindulásához. Ennek eredményeként egy adott fehérje szintetizálására szolgáló program eltűnik.
2006-ban két amerikai kutató kapott élettani vagy orvosi Nobel-díjat az RNS interferencia mechanizmusának magyarázatáért. Az interferáló RNS-en alapuló génexpressziós szabályozók létrehozása nagyszerű lehetőségeket nyitott meg a rendkívül hatékony, nem toxikus gyógyszerek széles skálájának előállítására, amelyek szinte minden gén expresszióját elnyomják, beleértve a tumor- és vírusgéneket is.
Helyes mutációk
A szakemberek figyelmét régóta felkeltették a DNS-re gyakorolt mutagén hatások oligonukleotidok vagy származékaik segítségével. Ha sikerül, a ma tudományos-fantasztikusnak tűnő dolog valósággá válhat: a hibás genetikai programok korrekciója.
Kísérletileg már bebizonyosodott, hogy a rövid oligonukleotidok segítségével pontmutációkat lehet bevinni a genetikai programokba. Hogy kell ezt csinálni? A "rossz" nukleotid blokkokat tartalmazó mutagén oligonukleotidokat bejuttatják a sejtbe, ahol egyesülnek a DNS-sel. Ennek következtében a nukleotidszekvenciák egyes részein „helytelen”, azaz nem komplementer bázispárok jelennek meg, amit a sejtes DNS-javító („repair”) rendszer károsodásként érzékel. Az ilyen párban lévő nukleotidokat javító enzimek helyettesítik, így az „helyes”, komplementer lesz. Ebben az esetben a helyettesítés mind az oligonukleotid-szekvenciában, mind magában a sejt DNS-ben történhet.
Utóbbi esetben a genetikai program változásával, azaz mutációval van dolgunk. És bár egy ilyen mutációs folyamat hatékonysága általában alacsony, új celluláris technológiákkal kapcsolatban alkalmazható. Például valamilyen örökletes betegségben szenvedő beteg őssejtjeit lehet szelektív mutagénnel kezelni, majd azokat, amelyekben a kívánt mutáció megtörtént (vagyis a „korrigált” genetikai programmal rendelkező sejteket) kiválaszthatjuk, szaporíthatjuk és bejuttathatjuk. a testbe.
1967 Megjelent az első munka az oligonukleotidokról - gén-célzott biológiailag aktív anyagokrólÍgy a ma létező oligonukleotidok különböző szinteken képesek szabályozni a gének „munkáját”. Így a fent említett antiszensz oligonukleotidok és interferáló RNS-ek a fehérjeszintézis szakaszában működnek, és hatással vannak a hírvivő RNS-ekre – információs molekulákra, amelyekben polipeptidláncok állnak össze. A DNS-sel komplexet képező antigén oligonukleotidok elnyomják a génexpressziót - maguk a hírvivő RNS-ek képződését, az oligonukleotid-aptamerek pedig az antitestekhez hasonlóan kötéseket alakíthatnak ki bizonyos fehérjékkel, blokkolva azokat. Ezenkívül egyes oligonukleotidok képesek stimulálni az immunrendszert, ma már vakcinák összetevőjeként használják őket.
Jelenleg az oligonukleotidok és analógjaik fejlesztését és szintézisét nagy kutatási és ipari szektorok végzik. Így tavaly csak a kutatási célra szánt oligonukleotidok piaci volumene meghaladta a 800 millió dollárt! Mára több tucat új típusú kémiailag módosított oligonukleotidot fejlesztettek ki és szintetizáltak, és számos, ezekből származó vírus- és gyulladáscsökkentő gyógyszert tesztelnek. Az ilyen jellegű kutatásokat Oroszországban ma főként az SB RAS Kémiai Biológiai és Alapvető Orvostudományi Intézetében végzik, ahol D. G. Knorre akadémikus hallgatói és követői dolgoznak.
Így bizonyította a Szibériai Ágban negyven évvel ezelőtt felmerült gondolat gyümölcsözőségét maga az élet. A nukleinsavak rövid fragmentumait alapszerkezetként használva géncélzott biológiailag aktív anyagok létrehozásához, gyorsan ki lehet fejleszteni és bevezetni a termelésbe specifikus gyógyszereket szinte bármilyen vírus ellen. Ehhez csak a vírusgének nukleotidszekvenciáját kell megfejteni, ami a modern technológiák segítségével könnyen elvégezhető. Ennek az univerzális megközelítésnek nagy jövője van: az elmúlt évek kutatási eredményei, különösen a célzott mutagenezis terén, arra engednek következtetni, hogy hamarosan hatékony gyógyszerek jelennek meg a még gyógyíthatatlannak tartott betegségek leküzdésére.
Bevezetés
A célzott gyógyszerek fejlesztése a modern molekuláris biológia, a bioszerves kémia és az orvostudomány kiemelt feladata. Jelenleg számos olyan munka létezik, amelyek a probléma megoldásának különféle megközelítéseit tükrözik. Számos okból kifolyólag a legígéretesebb megközelítés a patogén fehérje mRNS-en alapul, mint célpont, és a komplementaritás tulajdonságának felhasználásán a nukleinsavak egymás közötti kölcsönhatásában. Jelenleg három irányban folyik a munka:
antiszensz oligonukleotidok;
Ribozimek és DNS-enzimek;
SiRNS és miRNS.
Ezek a módszerek olyan rövid nukleinsavmolekulák (17-70 nt) alkalmazásán alapulnak, amelyek szekvenciája részben vagy teljesen komplementer a cél-mRNS-régióval. Az ilyen szerek általános működési elvei egyesítik őket a felmerülő problémák területén is, amelyek közül a legégetőbb a sejtbe jutás, a nukleázokkal szembeni rezisztencia és a cél-mRNS-sel való kölcsönhatás hatékonysága. Az NC szerek kémiai módosításai részben vagy teljesen megoldják ezeket a problémákat, és növelik a szerek hatékonyságát.
A génexpresszió-szuppresszió mechanizmusainak komplementer kölcsönhatások segítségével történő tanulmányozása olyan analitikai módszerek alkalmazását igényli, amelyek lehetővé teszik az oligonukleotidok antiszensz hatásának egyértelmű meghatározását.
E munka célja egy módszer kidolgozása az EGFP gén expressziójának visszaszorítására sejtekben pirénnel készült oligonukleotid konjugátumok felhasználásával.
Az antiszensz oligonukleotidok módosításai (irodalmi áttekintés)
Az olyan gyógyszerek kifejlesztése, amelyek génszinten lehetővé teszik a patogén fehérjék (vírus, onkogén termékek) vagy a gyógyulását megakadályozó fehérjék (MDR) expressziója által okozott betegségek kialakulásának megelőzését, az antiszensz technológia megjelenéséhez és fejlődéséhez vezetett. . Az antiszensz technológia elve egyszerű: az antiszensz oligoribonukleotidok szekvencia-specifikus módon gátolja a célgén expresszióját, felhasználva az oligonukleotidok azon képességét, hogy Watson-Crick kölcsönhatásokon keresztül hibridizáljanak a cél-mRNS-sel. Az oligonukleotid a cél RNS-hez kötődve megakadályozza annak további feldolgozását. A sejttenyészeteken végzett kísérletek kimutatták, hogy az mRNS egy régiójával komplementer, 20-30 nt hosszú oligodezoxiribonukleotidok (a továbbiakban ODN) alkalmazása jelentősen csökkenti az általa kódolt fehérje expressziós szintjét. A módszer fejlesztése számos okot mutatott ki, amelyek az ODN hatékonyságának csökkenéséhez vezettek: az ODN rövid élettartama a szérumban, a sejtbe való behatolás (transzport) alacsony hatékonysága és a strukturált RNS-fragmensekhez való kötődés elégtelen hatékonysága.
A szerves kémia, különösen a nukleinsavak kémiája fejlődése lehetővé teszi, hogy az ODN különféle kémiai módosításainak bevezetésével módokat keressünk a felmerülő problémák megoldására. Mind a nitrogéntartalmú bázisok, mind a cukor-foszfát gerinc kémiai módosításnak lehet kitéve, ami az ODN nukleáz rezisztenciájának és a komplementer szekvenciához való kötődésének hatékonyságának növekedéséhez vezet. Megpróbálják növelni az ODN sejtbe történő bejuttatásának hatékonyságát azáltal, hogy az egyik végén különböző csoportokat visznek be az összetételébe, megkönnyítve a membránon való átjutást.
Az antiszensz oligonukleotidoknak főként két hatásmechanizmusa van: a transzláció leállítása a szabályozó régió kötődése miatt és az RNS hasítása az RNS-DNS heteroduplex részeként. A módosítások végrehajtása különböző hatásokkal járhat egyik vagy másik mechanizmuson keresztül, amit figyelembe kell venni a módosítási lehetőség kiválasztásakor.
1.1. Az antiszensz oligonukleotidok hatásmechanizmusa
Amikor egy antiszensz oligonukleotid kölcsönhatásba lép az mRNS-sel, két esemény következik be: sztérikus blokkolás és a cél-mRNS hasítása RNáz H által. Egyes oligonukleotidok esetében mindkét esemény bekövetkezik (RNáz H-kompetens oligonukleotidok), mások esetében csak sztérikus blokkolás (RNáz H-független). ). Ez a két lehetőség különböző sejtmechanizmusokon alapul. A molekuláris mechanizmusok legszélesebb skáláját fedi le a második lehetőség használata. Ezt úgy érik el, hogy az oligonukleotidokat specifikus szabályozó szekvenciákhoz irányítják, mind a pre-mRNS-ben, mind az mRNS-ben. A pre-mRNS esetében az ODN-nek az intron és az exon közötti határrégióba történő megcélzása megszakítja a splicinget, ami vagy leállásához, vagy nem funkcionális fehérjét kódoló mRNS kialakulásához vezet (lásd 1. ábra). Egy másik ígéretes ODN-kötő hely a pre-mRNS-ben az 5"-terminális régió. Az ODN kölcsönhatása ezzel a régióval a capping blokkolásához vezet.
Amikor az ODN kölcsönhatásba lép az mRNS-sel, annak transzlációja és ennek következtében a fehérjeszintézis megszakad azáltal, hogy blokkolja a riboszóma mozgását az mRNS mentén, vagy akár annak összeállítását, a kötőhely helyzetétől függően.
1. ábra.
Az RNáz H-kompetens ODN-ek a pre-mRNS és mRNS bármely régiójába célozhatók, mivel hatásuk az RNáz H aktiválásán alapul, amelynek szubsztrátja az RNS az RNS-DNS duplexek részeként. Számos kémiailag módosított antiszensz oligonukleotid azonban nem képes aktiválni ezt a mechanizmust az RNáz H magas sztérikus specificitása miatt. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a legtöbb módosítás az ODN-RNS duplex hélix paramétereinek megváltozásához vezet, és megszűnik. az RNáz H szubsztrátjai lehetnek.
A második generációs antiszensz oligonukleotidok - a cukormaradék 2"-os pozíciójában módosulva - nem RNáz H szubsztrátok, ezért más hasítószert (mesterséges RNázokat) kell keresni. Számos kis molekula (interkalátor, polikation) képes hasítani cél RNS. Reaktív csoportok kapcsolódása az oligonukleotidokhoz a cél RNS kívánt régióinak hasadását eredményezi, ilyenek a fémkomplexek, aminok, oligopeptidek és a nukleázok aktív helyének csoportjait tartalmazó molekuláris konstrukciók (imidazolgyűrű, COO - -, NH). 2 csoport, guanidin).
1.2. Az antiszensz oligonukleotidok módosításai
1.2.1. Stratégiák az oligonukleotidok kémiai módosításainak fejlesztésére
Az antiszensz oligonukleotidok használatára vonatkozó felhalmozott adatok alapján számos olyan kritériumot fogalmaztak meg, amelyeknek az ODN-nek meg kell felelnie ahhoz, hogy hatékony terápiás szer legyen:
Nukleáz rezisztencia
nagy affinitás a célhoz
RNáz H szubsztrát képződése
· különböző hatásmechanizmusok (alternatív splicing hatása, a fordítás leállítása)
nem mérgező és specifikus
A fehérjékhez való nem specifikus kötődés lehetősége a szállításhoz
· egyszerű szintézis, szabadalmazhatóság, előnyök
A natív ODN-ek nem képesek teljes mértékben megfelelni a fenti kritériumoknak. A fő korlátozások a gyenge nukleáz rezisztencia és a nem kellően stabil ODN-RNS komplexek. Az összes vagy az egyes nukleotidok ODN-be történő kémiai módosításainak bevezetése nagymértékben kiküszöbölheti a meglévő hiányosságokat. Az ODN módosításokat a foszfátcsoporton, a szacharózmaradékon, a nitrogéntartalmú bázison vagy a terminális foszfátmaradékokon hajtjuk végre. A nukleáz rezisztencia növelése érdekében a módosítást leggyakrabban a foszfátcsoporton és a dezoxiribóz-maradékon hajtják végre. A kötési hatékonyság növelése a nitrogéntartalmú bázisok, valamint a dezoxiribóz-maradék módosításával érhető el. A fehérjékhez való kötődés hatékonyságának növelése és a transzport javítása érdekében a konjugációt különböző természetű ligandumokkal végezzük. Egyes esetekben a kapcsolódó kémiai szerkezetek katalizátorként működnek az RNS-ben lévő foszfodiészter kötéseknél.
1.2.2 A foszfátcsoport módosításai
A DNS-ben lévő foszfodiészter kötések nukleázok általi hasítása az aktív helyen történő hatékony kötődés révén és a foszfátcsoport sav-bázis tulajdonságainak felhasználásával történik. Az ODN-kötések nukleázokkal szembeni ellenállásának növelésének egyik módja a foszfátcsoport elektronikus konfigurációjának megváltoztatása. Ehhez az egyik nem kötött oxigénatomot egy másik elem atomjával helyettesítjük. A ként az elsők között alkalmazták ilyen elemként, ami foszforotioátok (módosított első generációs antiszensz oligonukleotidok; lásd 2. ábra, II) termelődését eredményezte.
Rizs. 2.
A foszforotioátok magas rezisztenciát mutattak a nukleázokkal szemben, de ez a módosítás jelentősen megnövelte az ODN toxicitását.
A foszfátcsoport kötetlen oxigénatomjának metilcsoporttal való helyettesítésével metil-foszfonátokat kapunk (lásd 3. ábra, III), amelyek nagy ellenállást mutatnak a nukleázok hatásával szemben. A módosítást gyakran csak a terminális nukleotidokon hajtják végre, ami csökkenti a toxicitást.
Ha a foszfát oxigénatomot BH 3 - maradékra cseréljük, boranofoszfátokat kapunk. A maradék -BH 3 - izoelektronikus az oxigénatomhoz a foszfodiészter kötésekben, ennek köszönhetően a boranofoszfátok megtartják negatív töltésüket, jól oldódnak vízben és komplexeket képeznek a cél RNS-sel. Ezenkívül ez a maradék izoelektronikus és izoszterikus a metilcsoporttal szemben, aminek köszönhetően a metil-foszfonátokhoz hasonló tulajdonságok, például nukleáz rezisztencia várható.
Rizs. 3.
1.2.3. A cukormaradék módosítása
A foszfodiészter kötések módosulása nincs jelentős hatással a DNS-RNS heteroduplex stabilitására. Ezért a módosított oligodezoxinukleotidok mellett érdekesek az úgynevezett második generációs módosított antiszensz oligonukleotidok – ezek a ribózmaradék 2"-hidroxilcsoportjában helyettesített oligoribonukleotidok. Ez a módosítás a nukleázok hatásával szembeni ellenállást is növeli. Bár az RNS sokkal kevésbé ellenálló a környezeti hatásokkal szemben, mint a DNS. A 2"-OH csoport jelenléte miatt ennek a csoportnak a módosításai teszik lehetővé olyan stabil termékek előállítását, amelyek a foszfonátokhoz képest kisebb toxicitást mutatnak. Ezenkívül a második generációs módosított antiszensz oligonukleotidok gyakran tartalmaznak nem cukor-foszfát természetű módosított gerincű oligonukleotidokat, például peptid nukleinsavakat, amelyek szintén nukleázrezisztenciát mutatnak, és termodinamikailag stabil hibrideket képeznek cél-mRNS-molekulákkal.
4. ábra. Második generációs módosítások: V - 2"-O-alkil-RNS, VI - LNA, VII - Morpholino, VIII - PNA.
Az alkilcsoportban 1-5 metilénegységet tartalmazó 2"-O-alkil RNS-származékok felhasználására vonatkozó adatok elemzése azt mutatta, hogy a metilénegységek számának növekedésével a módosított oligonukleotid rezisztenciája a hatásokkal szemben. Növekszik a nukleázok mennyisége (pentoxi > propoxi > metoxi > dezoxi) Ez a függőség azzal magyarázható, hogy a nukleotid sztérikusan megközelíthetetlen egy nagyobb szubsztituens kapcsolódása során. Azonban a terjedelmes szubsztituensek jelenléte által okozott sztérikus akadályok csökkentik a nukleotid képződésének hatékonyságát komplementer komplexek a cél-mRNS-sel, ezért a legnagyobb affinitást a célponthoz kis szubsztituensek alkalmazása mellett érte el.A fizikai-kémiai paraméterek 2"-O-metilált foszforotioátok (Me-S-ODN), S-DNS és módosítatlan DNS összehasonlítása során kiderült, hogy hogy a DNS-RNS heteroduplexek olvadási hőmérséklete (T m) a következő sorrendben növekszik: Me-S-ODN - RNS > normál DNS - RNS > S-ODN - RNS . Ennek a módosításnak az a hátránya, hogy az RNáz H nem tudja hasítani a cél-mRNS-t az RNS-RNS komplexben. Ennek a hátránynak a következményeként az ilyen oligonukleotidok kevésbé hatékonyan gátolják a génexpressziót, mint a módosítatlanok.
A 2"-kationos módosítások ikerionos oligonukleotidok képződéséhez vezetnek. Az ilyen oligonukleotidok amellett, hogy a módosítatlanokhoz képest stabilabb heteroduplexeket hoznak létre, nagyobb a biológiai membránok áthatolási képessége és töltésük miatt nagy a nukleázok hatásának stabilitása A 2'-O-etil]-oligonukleotidok (2"-O-DMAEOE, lásd az 5. ábrát) a töltéshatás miatt heteroduplexeket képeznek a cél RNS-sel, olvadáspontja 2 °C-kal magasabb, mint a módosítatlan oligonukleotidoknál. Az ikerionos oligonukleotidok megtartják az RNáz H kompetenciát, ha a módosítások szétszóródnak az oligonukleotid teljes hosszában.
Rizs. 5.2 "-O-DMAEOE
A konformációslag korlátozott „zárt” nukleinsavak (Locked Nucleic Acids, LNA) olyan módosított nukleinsavak, amelyek legalább egy monomert tartalmaznak cukormaradékként biciklusos furanózzal (lásd 4. ábra, VI). Nagy affinitásuk van a komplementer szekvenciához (a duplex olvadási hőmérséklete 6 °C-kal nő, ha egy nukleotidot módosítanak), ami egyszerre előny (hatékony célkötés) és hátrány (hajtűk kialakulása). Ezt az affinitást figyelembe kell venni az LNA-k tervezésekor. Az egereken végzett vizsgálatok az LNA alacsony toxicitását mutatták ki.
A peptidnukleinsavak (PNA-k) olyan nukleinsav-analógok, amelyekben a cukor-foszfát vázat egy pszeudopeptid N-(2-amino-etil)-glicin polimer helyettesíti. Az N-terminális az oligonukleotid 3"-os végét, a C-vég pedig az 5"-es végét utánozza (lásd 3. ábra, VII). A PNS-RNS komplexek stabilabbak, mint a DNS-DNS és RNS-RNS komplexek. Annak ellenére, hogy a PNA-k antiparallel (Watson-Crick) és párhuzamos (Hoogsteen) orientációban is képesek megkötni a célpontot, a PNA-k antiparallel orientációjával stabilabb komplexek jönnek létre. A vizsgálatok a PNA alacsony toxicitását mutatták ki.
A morfolinok (lásd 3., VIII. ábra) olyan reagensek, amelyek egyesítik a stabilitást, a nukleázokkal szembeni rezisztenciát, a hatékonyságot, a hosszú távú aktivitást, a vízoldhatóságot, a nagy specifitást és az alacsony toxicitást. A molekulák semleges töltéssel rendelkeznek. A morfolinok előállítását a Gene Tools, LLC végzi. http://www.gene-tools.com).
Az RNáz H kompetencia fenntartásához szükséges, hogy az oligonukleotid közepén legalább 7 dezoxinukleotidból álló szakasz legyen, ezért „kevert” antiszensz oligonukleotidokat alkalmazunk, pl. különböző módosulásokkal rendelkezik a különböző egységekben (LNA/DNS, LNA/RNS stb.). Ezenkívül olyan vegyületeket adnak a reakcióelegyhez, amelyek olyan csoportokat tartalmaznak, amelyek az RNáz H aktív centrumához való hasonlóságuk miatt a cél-mRNS hasítását okozzák, vagy nem módosítják az összes nukleotidegységet (például csak a 3" és 5" végeit). . .
Így a cukor-foszfát gerinccel módosított antiszensz oligonukleotidok főbb tulajdonságait az alábbi táblázatban foglalhatjuk össze:
1. táblázat: A cukor-foszfát váz módosításainak összehasonlítása.
|
Módosítás |
Nukleáz stabilitás |
Célaffinitás |
RNáz H aktiválása |
Nem mérgező |
1.2.4 Nitrogéntartalmú bázisok módosításai
Hatékony antiszensz aktivitást nehéz elérni önmagában a cukor-foszfát gerinc módosításával. A módosított nitrogéntartalmú bázisok növelik az antiszensz ODN-ek hatékonyságát azáltal, hogy növelik az affinitást a cél RNS-hez (aminoadenozin, G-clamp) és a plazmamembránon keresztüli behatolás sebességét (kationos és ikerionos csoportok).
Ha egy citozin-maradékhoz fenoxazint adunk, akkor egy úgynevezett G-clamp keletkezik (lásd 6. ábra, X), amely további hidrogénkötést képez a guaninmaradékkal, aminek következtében az ODN-RNS hibrid olvadáspontja csökken. 6-18 °C-kal emelkedik. Ez a módosítás általában a 3"-os végén történik, ami nem rontja az RNáz H kompetenciát.
Amikor egy aminocsoportot viszünk be az adenin-maradékba (lásd 6. ábra, XI), a célpont iránti affinitás is megnő, mivel egy további hidrogénkötés képződik a timin-maradékkal.
Rizs. 6. További hidrogénkötések a C és G bilincs (X), T és A között NH2 (XI) között
Pozitív töltésük miatt a nitrogéntartalmú báziscsoportokhoz (például spermidinhez, 7. ábra) kapcsolódó kationos és ikerionos csoportokat tartalmazó ODN-ek nemcsak nagyobb affinitást mutatnak a célponthoz, hanem javítják a sejtekbe való behatolási képességüket és a sejtek hatásának stabilitását is. nukleázok.
Rizs. 7.
Nagy fluoreszcens ligandumokat, például fluoreszceint konjugálnak a terminális nitrogénbázisokhoz, hogy láthatóvá tegyék az ODN helyét a sejtben.
8. ábra.
1.2.5 Terjedelmes szubsztituensek hozzáadása
A sejtmembrán megkerülésével a sejtbe való behatolás képessége egyike azon tulajdonságoknak, amelyeknek jelen kell lenniük egy hatékony antiszensz oligonukleotidban. A fentebb az ODN-ben leírt nukleotid-módosítások többsége nincs jelentős hatással az ODN sejtmembránon keresztüli transzportjára. A molekuláknak számos útja van a plazmalemmán való átjutáshoz, de az ODN szempontjából kettő fontos: a diffúz vagy nem receptor által közvetített és a receptor által közvetített. Az első lehetőség szerinti szállítást az ODN teljes negatív töltése és hidrofilitása nehezíti. A második út alkalmazását korlátozza, hogy nem áll rendelkezésre elegendő adat a nukleinsavak sejtbe szállításáért felelős sejtmembrán felszíni fehérjéiről. Az ODN különböző kémiai csoportokkal való konjugátumainak létrehozása elősegíti a szállítás hatékonyságának növelését egyik vagy másik útvonalon, a kémiai csoport típusától és az ODN-hez való kapcsolódási helyétől függően. A 9. ábra a konjugátumok előállítására használt linkerek lehetőségeit mutatja be. A ligandumok kapcsolódhatnak nitrogéntartalmú bázisokhoz, terminális foszfátokhoz, foszfodiészter (vagy hasonló) kötésekhez és cukormaradékokhoz. A kémiai csoportok bizonyos típusai lehetővé teszik a kompartmentalizációt is fluoreszcens detektálással. módosítás oligonukleotid antiszensz reakció
9. ábra.
Az ODN negatív töltésének részleges vagy akár teljes semlegesítése nincs jelentős hatással az ODN sejtbe történő spontán transzport képességére. Különböző nagyméretű hidrofób ligandumok kapcsolódása, különösen a 9. ábrán láthatók, megkönnyíti az ODN transzportját a membránon keresztül.
10. ábra.
A koleszterinnel alkotott konjugátumokat jól tanulmányozták. A koleszterin hozzáadása révén a sejtbe való behatolást javító mechanizmus még nem teljesen tisztázott, bár feltételezik, hogy a lipoproteinek receptor által közvetített beépülése lehetséges. A koleszterin konjugátumok micellákat képeznek, ami megkönnyíti a sejtbe való bejuttatásukat. A koleszterin-maradék általában a terminális 5" és 3" foszfátokhoz kapcsolódik, és a 3"-monokoleszteril-oligonukleotidok hatékonyabbak az 5"-monokoleszteril-oligonukleotidokhoz képest, és a leghatékonyabbak az 5"-os 3"-biszkoleszteril-oligonukleotidok. Például egy egér vérébe történő injekció beadása után 6 perccel a 3"-monomódiált foszforotioátok szintje a szövetekben 4-szer, az 5"-mono- és 3,5"-biszmodifikált foszforotioátok szintje pedig 7-szer magasabb volt, mint a módosítatlanoknál. foszforotioátok.
5"- és/vagy 3"-koleszteril-szubsztituált foszfátot tartalmazó monomereket, a 3"-terminális nukleozid előtt foszfodiészter-kötéshez konjugált ligandumú oligonukleotidokat, valamint linkerként lizin-maradékot tartalmazó koleszteril-dendrimereket használnak ( lásd 11. ábra).
11. ábra.
Más hidrofób molekulákhoz (adamantán, pirén, eikozánsav stb.) konjugált oligonukleotidokat szintetizáltak és hasonlítottak össze koleszterinnel. A koleszterin-konjugátumok optimális lipofilitást, valamint jó felhalmozódási képességet mutattak a májban.
A pirénszármazékokkal való konjugáció a transzportképesség javítása mellett fluoreszkáló képességük miatt is érdekes. A bisz-pirenil-származékok képesek excimerek - bimolekuláris komplexek - képzésére, amelyekben az egyik molekula alapállapotban, a másik pedig gerjesztett állapotban van. Az ilyen komplexek nagyon érzékenyek a térbeli környezetre; a fluoreszcencia szintje alapján megítélhető, hogy az ODN a cél RNS-hez kötődik-e vagy sem:
12. ábra.
A sejtbe történő szállítás hatékonyságának javítására peptid konjugánsokat is alkalmaznak. Az oligonukleotidokhoz, beleértve A PNA olyan peptidet köt, amely képes nagy poláris töltésű molekulákat szállítani a membránon keresztül. Így az Antennapedia peptidnek vannak DNS-kötő helyei. A hozzákapcsolt Antennapedia peptidet tartalmazó PNA nemcsak hatékonyan behatol a sejtbe, hanem a sejtmagba is bevándorol.
13. ábra.
A nagy, sík interkaláló molekulák, például az akridin (lásd a 14. ábrát) antiszensz ODN-molekulák végeihez való kapcsolódása érdekes, mivel növeli a cél-RNS-molekula hasítási hatékonyságát. Az interkaláció következtében az ODN-RNS kölcsönhatás lokálisan fellazul. Az interkalátor molekula méretéből adódóan a DNS és az RNS közötti távolság növekedése következtében a heteroduplex kettős hélixéből az RNS-molekula „hurka” alakul ki. Az akridinmaradék nitrogénatomjaival koordinált nehézfém-kationok, például a Lu 3+ katalizálják az RNS hidrolízisét az RNáz H részvétele nélkül, és a „hurok” destabilizáló szerkezetként felgyorsítja ezt a folyamatot.
Rizs. 14.
1.3. Az oligonukleotid és a cél-RNS közötti kölcsönhatás fizikai-kémiai vonatkozásai
Az antiszensz oligonukleotidok hatékonyságát kvantitatívan az ODN cél-mRNS-hez való affinitása és az utóbbi hatékony hasítási állandója jellemzi.
Az ODN affinitása a neki címzett RNS-hez (vagy a heteroduplex képződés szabad energiája) a DNS-RNS hibrid stabilitását írja le. r G kalorimetrikusan mérhető vagy elméletileg számítható. A heteroduplex képződés Gibbs-szabadenergiájának számításakor a Hess-törvényt (egy komplex reakció Gibbs-szabadenergiája nem függ a reakció útjától) és a másodlagos és harmadlagos struktúrák képződési energiáinak számításait a „legközelebbi szomszéd szabálya” szerint alkalmazzuk. a Zucker és munkatársai által kifejlesztett mfold program segítségével. A reakció a következőképpen ábrázolható:
Ebben a sémában M, O, H rendre cél-mRNS, antiszensz ODN és ODN - RNS heteroduplex, figyelembe véve azok másodlagos és tercier szerkezetét, M u, O u, H u - rendre cél-mRNS, antiszensz ODN és ODN. - RNS heteroduplex a másodlagos és harmadlagos szerkezetük figyelembevétele nélkül, ENSZ G (M) , ENSZ G (O) , ENSZ G (H)- Gibb szabad energiákat fektet be a másodlagos és harmadlagos struktúrába, r G, r G (kibontva)- az ODN és az mRNS hibridizációs szabad energiái hajtogatott, illetve teljesen denaturált állapotban.
ENSZ G (M) , ENSZ G (O) , ENSZ G (H)És r G (kibontva) elméletileg kiszámítható. Ekkor a hibridizáció szabad energiáját megtaláljuk a Hess-törvény szerint:
A heteroduplex asszociációs folyamat egyensúlyi állandója K 1 megtalálható a hibridizációs folyamat számított Gibbs-szabad energiája alapján:
A heteroduplex olvadási hőmérsékletének becsléséhez a „legközelebbi szomszéd” szabályt is használják, és megfelelő programokkal kiszámítják.
Az effektív sebességi állandó kísérletileg meghatározható k eff az mRNS M feltételes X termékké való átalakulásának bruttó reakciója (ez a konvenció nem befolyásolja a kinetikai számítások eredményét, de jelentősen leegyszerűsíti azokat):
Az effektív bruttó reakciósebesség-állandó a cél-mRNS megfigyelt hasítási sebességét jelzi.
A reakció mechanizmusa a következő diagrammal ábrázolható:
Ebben a sémában E az RNáz H enzim, a HE pedig a H szubsztráttal alkotott közbenső komplexe, K 1 - heteroduplex asszociációs állandó, a (3) képlet alapján számítva.
Egy adott kinetikai sémához létrehozhatunk egy kinetikai egyenletrendszert:
Ahol VAL VEL A- az A anyag koncentrációja, k én - az i-edik elemi reakció sebességi állandója.
Az általánosan mért paraméter az mRNS koncentrációja az oldatban (kezdeti C M0és aktuális C M), Ezért k eff mátrixhoz viszonyítva számítva:
A HE köztes termék kvázi stacionárius közelítésével és a reakciósebesség kifejezésének egyszerűsítésével w a Michaelis-Menten egyenlet segítségével:
ahol a Michaelis-állandó, transzformálhatjuk a heteroduplex H koncentráció változási sebességének kifejezését:
Találjunk kifejezést a cél-mRNS hasításának effektív sebességi állandójára két esetben: amikor a folyamatot az mRNS antiszensz ODN kötődése korlátozza, és amikor a cél-mRNS heteroduplex részeként történő katalitikus hasítása korlátozza. .
1. eset. Korlátozás hibridizációval.
Ebben az esetben a hasítási folyamat sokkal gyorsabb, mint a hibridizáció. Ezért feltételezhetjük, hogy a heteroduplex H stacionárius koncentrációja létrejött, azaz:
Másrészt könnyen belátható (6), hogy:
Vagyis ebben az esetben az mRNS hasítási sebességének kifejezése abszolút értékben egybeesik a reakciósebesség kifejezésével (az X feltételes termék képződési sebessége). Ezt kihasználva transzformáljuk az oligonukleotid koncentráció-változási sebességének kifejezését, látni fogjuk, hogy koncentrációja gyakorlatilag változatlannak tekinthető:
A (14) kifejezés használata, és ennek következtében a kifejezés hozzájárulásának figyelmen kívül hagyása k -1 VAL VEL H c új formában találjuk meg az mRNS hasítási sebességét és expresszáljuk k eff .
2. eset. Korlátozás a hordozó katalitikus hasításával.
Abban az esetben, ha a hasítás sokkal lassabb, mint a heteroduplex képződése, feltételezhetjük, hogy az egyensúlynak van ideje kialakulni.
A heteroduplex egyensúlyi koncentrációja a Michaelis-állandóhoz képest elhanyagolható a sebességkifejezésben:
Az egyensúlyi állandó kifejezésének felírásával K 1 és az M és O anyagmérleg-egyenleteivel elegendő feltételeket kapunk az egyenlet megoldásához:
Ahol [ A] - egyensúlyi koncentráció, VAL VEL A 0 az anyag kezdeti koncentrációja.
A (17) és (18) figyelembe vételével kifejezéseket kapunk a H és az O egyensúlyi koncentrációira:
Ha a (21)-et behelyettesítjük a (16) Michaelis-Menten egyenletbe, egy módosított reakciósebesség-egyenletet kapunk:
Ha a (20), (21) és (22) kifejezéseket (12)-re helyettesítjük, és kihagyjuk a nehézkes köztes számításokat, megkapjuk az mRNS katalitikus hasítási sebességének kifejezését:
ahonnan könnyen megtalálhatjuk a bruttó folyamat effektív sebességi állandójának képletét:
Az antiszensz ODN-eken alapuló gyógyszerek létrehozásának számos akadálya van: gyenge internalizációs képesség, instabilitás a nukleázokkal szemben, toxicitás és mások. A kémiai módosítások sok ilyen problémát kiküszöbölhetnek, de csak részben, és nehéz kompromisszumot találni bármely módosítás előnyei és hátrányai között. Ennek ellenére sok ODN-alapú gyógyszert teszteltek. Az első ODN-alapú gyógyszer a Vitravene, amelynek célja AIDS-betegek citomegalovírus fertőzésének leküzdése.
BEVEZETÉS
FEJEZET 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.
1.1. Alapötletek és módszerek célzott daganatellenes gyógyszerek létrehozására 15 1.1.1. Célzott gyógyszerek az onkológiában: monoklonális antitesteken és antiszensz oligonukleotidokon alapuló gyógyszerek.
1.2. A receptorok által közvetített endocitózis és szerepe a biológiailag aktív vegyületek célsejtekhez való eljuttatásában
1.3. Alternatív rendszerek a rákellenes gyógyszerek célzott bejuttatására a rákterápia hatékonyságának javítása érdekében.
1.4. Tumorspecifikus antigének a daganatellenes gyógyszerek célzott bejuttatásának célpontjai
1.5. Gyógyszerek célzott bejuttatása fehérje- és peptidvektormolekulákkal való konjugátumokban.
1.6. Kiméra fehérjék
1.7. Az alfa-fetoprotein és receptorai a biológiailag aktív anyagok tumorsejtekbe történő szelektív szállításának célpontja.
1.7.1. Az alfa-fetoprotein szerkezete és működése
1.7.2. Alfa-fetoprotein receptorok.
1.7.3. Az alfa-fetoprotein biológiailag aktív fragmensei
1.8. A rákellenes gyógyszerek célzott beadása, mint a multidrug rezisztencia (MDR) leküzdésének fő megközelítése
1.8.1. A daganatsejtek multidrog rezisztenciájának jelensége.
1.8.2. Modern megközelítések a multidrog rezisztencia leküzdésére.
2. FEJEZET ANYAG ÉS MÓDSZER.
2.1. Természetes humán alfa-fetoprotein izolálása és az AFP rekombináns fehérje fragmentumainak előállítása.
2.1.1. Az emberi AFP izolálása
2.1.2. Az AFP rekombináns C-terminális fragmensének (rAFP27) előállítása
2.1.3. Rekombináns PGA fehérje előállítása
2.1.4. Az AFP-3BC rekombináns AFP fragmentum kinyerése
2.2. Fehérje és peptid konjugátumok szintézise FITC-vel, citosztatikumokkal és oligonukleotidokkal.
2.2.1. Az AFP gAFP27 és AFP-3BC FITC-vel jelölt AFP, MAb és C-terminális fragmentumainak szintézise.
2.2.2. A FITC-vel jelölt AFP oktapeptid GIP8 szintézise.
EMTPVNPG (GIP8) doxorubicinnel.
2.2.4. AFP konjugátumok szintézise vinblasztinnal.
2.2.5. AFP konjugátumok szintézise ftalocianinokkal
2.2.6. Az AFP és GIP8 konjugátumainak szintézise esperamicin Aib-vel (EsA).
2.2.9. AFP konjugátumok szintézise oligonukleotidokkal.
2.2.10. ON komplexek előállítása fehérjékkel.
2.3. Sejttenyészetek és tenyésztési feltételek.
2.4. Fluoreszcensen jelölt fehérjék, peptidek és konjugátumok receptorkötődésének és endocitózisának felmérése áramlási citometriával.
2.4.1. Az AFP és a MAb AFP receptorhoz való kötődésének értékelése.
2.4.2. A fluoreszcensen jelölt AFP, az AFP C-terminális fragmentuma és az AFP oktapeptid GIP8 endocitózisának értékelése.
2.5. Fehérje és peptid konjugátumok endocitózisának értékelése DOX-szal áramlási citometriával.
2.6. Immuncitokémiai és immunhisztokémiai vizsgálatok.
2.6.1. Az AFP receptorok expressziójának vizsgálata a sejtfelszínen.
2.6.2. A c-Myc, Bc1-2 és Pgpl70 fehérjék expressziójának vizsgálata.
2.6.3. A szövettani metszetek immunkémiai festése.
2.7. A c-Myc, Bc1-2 és Pgpl70 expressziójának vizsgálata tumorsejtekben.
2.7.1. A c-Myc, Bc1-2 és Pgpl70 expressziójának vizsgálata Western blot segítségével.
2.7.2. A c-Myc, Bc1-2 és Pgpl70 expressziójának vizsgálata tumorsejtekben áramlási citometriával.
2.8. Fluoreszcens mikroszkóp.
2.9. Gyógyszerek citosztatikus aktivitásának meghatározása in vitro.
2.9.1. A sejtek túlélésének meghatározása.
2.9.2. A sejtproliferációs aktivitás gátlásának meghatározása.
2.9.3. Az apoptózis szintjének elemzése fluoreszcens mikroszkóppal.
2.8.4. Aluminium-ftalocianinokkal (A1Pc) és kobalt-ftalocianinokkal (CoPc) alkotott AFP konjugátumok fotocitosztatikus és kemiocitosztatikus aktivitásának meghatározása.
2.9. A sejtproliferációs aktivitás vizsgálata.
2.10. Sejtciklus elemzés áramlási citometriával.
2.11. Gyógyszerek daganatellenes hatásának vizsgálata in vivo.
2.12. Az eredmények statisztikai feldolgozása.
3. FEJEZET EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK.
3.1. Az alfa-fetoprotein receptor expressziójának vizsgálata humán tumorsejtvonalakon.
3.1.1. A MAb klónok APPR-ra vonatkozó specificitásának vizsgálata
3.1.2. Az APPR mennyiségének becslése in vitro tenyésztett humán tumorsejteken.
3.2. APPR immunkémiai kimutatása sejteken és szövetmetszeteken
3.2.1. Az AFP receptorok expressziójának vizsgálata tumorsejtek felszínén immuncitokémia segítségével.
3.2.2. A tumorszövet metszeteinek immunhisztokémiai festése
3.3. Fluoreszcensen jelölt AFP kötődésének és endocitózisának vizsgálata tumorsejtek által in vitro.
3.3.1. A tumorsejtek és a normál humán perifériás vér limfocitáinak felszínén lévő receptorhoz való AFP kötődésének vizsgálata áramlási citometriával.
3.3.2. Az AFP endocitózis in vitro vizsgálata áramlási citometriával és fluoreszcens mikroszkóppal.
3.4. Receptor által közvetített endocitózis alkalmazása daganatellenes gyógyszerek - doxorubicin, vinblasztin, esperamicin, ftalocianinok - célzott bejuttatására.
3.4.1. Konjugátumok tumorsejtek általi in vitro internalizációjának elemzése
AFP antibiotikumokkal/citosztatikumokkal a doxorubicin példájával.
3.4.2. Doxorubicinnel készült fehérjekonjugátumok citosztatikus aktivitásának vizsgálata in vitro.
3.4.3. Az AFP-DOX konjugátumok daganatellenes hatásának vizsgálata in vivo.
3.4.4. Az alumínium- és kobalt-ftalocianinokkal (A1Pc) készült AFP konjugátumok fotocitosztatikus és kemiocitosztatikus aktivitásának vizsgálata
3.4.5. Az AFP konjugátumok citosztatikus aktivitásának vizsgálata más daganatellenes antibiotikumokkal (citosztatikumokkal).
3.4.6. Az AFP és esperamicin Ajb (EsA) konjugátumok citosztatikus aktivitásának vizsgálata in vitro.
3.4.7. Az AFP esperamicin Aib-vel (EsA) konjugátumok daganatellenes hatásának vizsgálata in vivo.
3.5. Az MDR 1 génexpresszió által okozott multidrog rezisztencia leküzdése AFP konjugátumok és daganatellenes gyógyszerekkel in vitro.
3.5.1. A rezisztens sejtvonalak jellemzői.
3.5.2. A DOX és konjugátumai proteinekkel való internalizációjának elemzése rezisztens sejtvonalakban.
3.5.3. A DOX-AFP konjugátumok rezisztens sejtvonalakkal szembeni citosztatikus aktivitásának vizsgálata.
3.6. Az AFP biológiailag aktív fragmensei.
3.6.1. Az AFP rekombináns C-terminális fragmentuma (rAFP27).
3.6.2. Az AFP AFP-ZVS rekombináns C-terminális fragmentuma.
3.6.3. Biológiailag aktív oktapeptid - az AFP fragmense
3.7. Az antiszensz oligonukleotidok célzott szállítása a tumorsejtekbe.
3.7.1. Antiszensz oligonukleotidok célzott eljuttatása tumorsejtekhez AFP-vel konjugátumaik formájában.
3.7.2. Az ASON bejuttatás hatékonyságának vizsgálata AFP-vel nem kovalens komplexek felhasználásával.
A szakdolgozatok ajánlott listája
Lehetséges daganatellenes hatású rekombináns humán fehérjék tulajdonságainak létrehozása és tanulmányozása 2007, a kémiai tudományok kandidátusa, Savvateeva, Ljudmila Vladimirovna
Célzott daganatellenes gyógyszerek fejlesztése peptid vektorokon és antiangiogén szereken 2007, a biológiai tudományok doktora Feldman, Natalia Borisovna
Az alfa-fetoprotein C-terminális doménjének alkalmazása rákellenes gyógyszerek célzott bejuttatására 2012, a biológiai tudományok kandidátusa Godovanny, Artem Vitalievich
Epidermális növekedési faktor konjugátumainak és daganatellenes kemoterápiás gyógyszerekkel való biológiai aktivitásának előállítása és vizsgálata 2000, a biológiai tudományok kandidátusa Gumanov, Sergey Georgievich
Humán α-fetoprotein konjugátumainak szintézise daganatellenes gyógyszerekkel a tumorsejtekbe történő célzott bejuttatás érdekében 2001, a kémiai tudományok kandidátusa, Zabolotnev, Dmitrij Viktorovics
Az értekezés bemutatása (az absztrakt része) „Fehérje- és peptidvektorok alkalmazása tumorellenes gyógyszerek és terápiás oligonukleotidok szelektív bejuttatására tumorsejtekbe” témában
A probléma relevanciája. A rák kemoterápiás kezelésének hatékonyságának hiányának fő okai a daganatellenes szerek alacsony biológiai hozzáférhetősége, a nagy dózisú gyógyszerek alkalmazásának szükségessége és e gyógyszerek nem szelektív jellege. A gyógyszerek korlátozott behatolása a biológiailag heterogén daganatokba egyes daganatsejtek túléléséhez vezet, még hosszan tartó citotoxikus szerekkel végzett kezelés után is. A teljes remisszióhoz szükséges nagy dózisú kezelés súlyos szisztémás mellékhatásokat okoz, amelyek gyakran a kezelés abbahagyására kényszerítik a betegeket. Emellett a kemoterápiás szerek hosszú távú alkalmazása tele van multidrog rezisztencia kialakulásával, ami hatástalanná teszi az alkalmazott gyógyszereket. A gyógyszerrezisztencia jelensége különböző természetű intracelluláris mechanizmusokon alapul, mint például a gyógyszerek plazmamembránon keresztüli transzportjának csökkenése, az onkogének expressziós szintjének megzavarása, a jelátviteli rendszerek károsodása stb. A daganatok hatékonyságának növelése terápia esetén növelni kell a gyógyszerek hatásának szelektivitását. Itt két irány különböztethető meg: új, erősen szelektív gyógyszerek kifejlesztése és új rendszerek létrehozása a jól ismert daganatellenes vegyületek célsejtekbe történő szabályozott szállítására.
Egy gyógyszer hatásának szelektivitása növelhető, ha célzott ágenseket alkalmazunk a bejuttató rendszerekben – olyan molekulák, amelyek képesek kötődni a sejtek felszínén lévő specifikus determinánsokhoz. Így a célzott komponens alkalmazása meghatározza a szelektív szállítórendszer kölcsönhatását szigorúan meghatározott sejtekkel és szövetekkel, különösen a tumorsejtekkel. A növekedési faktor receptorok vagy onkofetális fehérjék fiziológiás ligandumai célzott ágensként vagy vektorként működhetnek, pl. maguk a növekedési faktorok és az onkofetális fehérjék. A tumorellenes gyógyszert kovalensen kombinálhatjuk a vektorral, hogy konjugátumot hozzunk létre, vagy nem kovalensen, hogy stabil komplexet képezzünk. Egy célmolekula kötődése a sejtfelszínen lévő specifikus receptorhoz receptor által közvetített endocitózis folyamatát indukálja, amely biztosítja, hogy a tumorsejtek felhalmozódjanak egy olyan gyógyszerrel, amelynek molekuláris célpontja a sejten belül helyezkedik el.
Meg kell jegyezni, hogy bizonyos esetekben a szelektív adagolórendszerek használata az egyetlen módja egyes erősen toxikus daganatellenes antibiotikumok, például az enediin antibiotikumok terápiás potenciáljának kihasználásának. Példa erre a Mylotarg gyógyszer, amely a kalichemycin Xi és a CD33 elleni humanizált antitestek konjugátuma. Ezen túlmenően a rendkívül hatékony szállítórendszerek alkalmazása jelentősen növelheti az antiszensz oligonukleotidok terápiás hatását, amelyek sajnos még nem találtak alkalmazásra a klinikai gyakorlatban.
A receptor-mediált endocitózison alapuló célzott gyógyszertranszport problémájának sikeres megoldását elsősorban a vektormolekula megválasztása határozza meg. A fehérjevektoroknak számos alapvető követelménynek kell megfelelniük, amelyek közé tartozik a vektorok nagy affinitása a céltumorsejtek felszínén lévő megfelelő receptorokhoz, nagy stabilitás, kémiai módosításuk lehetősége kemoterápiával konjugálva a biológiai tulajdonságok elvesztése nélkül, és a fehérjék rendelkezésre állása preparatív mennyiségben. Ezeknek a követelményeknek leginkább az onkofetális alfa-fetoprotein felel meg. A szelektív bejuttatási rendszerek tervezésénél fontos szempont a gyógyszer (citosztatikus szer, fényérzékenyítő, antiszensz oligonukleotid) és a megcélzott és citosztatikus komponenseket összekötő linker megválasztása is. Az elkészült konstrukciók in vitro rendszerben történő szűrése és intracelluláris viselkedésük vizsgálata lehetővé teszi számunkra, hogy azonosítsuk a legoptimálisabb szállítási rendszereket.
E munka célja az volt, hogy elveket dolgozzanak ki tumorellenes gyógyszerek és terápiás oligonukleotidok tumorsejtekbe történő szelektív bejuttatására szolgáló rendszerek létrehozására, amelyek természetes és rekombináns fehérjéken és peptideken alapulnak, és azonosítsák a hatékonyságukat meghatározó mintákat. Kutatási célok:
Fehérje és peptid vektor molekulák kiválasztása daganatellenes gyógyszerek és antiszensz oligonukleotidok szelektív bejuttatásához;
Konstrukciók létrehozása tumorellenes gyógyszereknek a célsejtekbe történő szelektív bejuttatására alfa-fetoprotein és peptidfragmensei alapján,
A gyógyszerek internalizációjának és intracelluláris eloszlásának tanulmányozása a tervezés típusától függően a bejuttatási rendszerek optimalizálása érdekében;
Megközelítések kidolgozása a multidrog rezisztencia leküzdésére célzott bejuttatási rendszerek alkalmazásával; Alfa-fetoprotein és epidermális növekedési faktor alapú konstrukciók fejlesztése antiszensz oligonukleotidok szelektív szállítására és hatékonyságuk értékelésére.
Tudományos újdonság és gyakorlati jelentősége.
Az AFP receptorok jelenléte humán tumorsejtvonalak felszínén és humán rosszindulatú daganatok szövettani metszetein (petefészek, emlő, máj, gyomor, belek) egyaránt bizonyított. Az AFP receptort nem mutatták ki jóindulatú daganatok és normál szövetek metszetein, valamint egészséges önkéntesek véréből izolált nyugvó limfociták felszínén. Így az AFP-receptor tumormarkerként használható a rosszindulatú daganatok széles körében, a receptor elleni antitestek pedig tumordiagnosztikára.
Kidolgozásra és kidolgozásra került egy olyan rendszer koncepciója, amely a biológiailag aktív vegyületek célzott sejtekbe juttatását szolgálja, célzó motívumként AFP-t és peptidfragmenseit használva.
Olyan módszereket dolgoztak ki, amelyek lehetővé teszik a szelektív gyógyszerek hatékonyságának előrejelzését sejttenyészetekben végzett in vitro kísérletekben.
Először fedezték fel, hogy az AFP rekombináns C-terminális fragmense (357-től 590-ig) specifikusan kötődik az AFP receptorhoz, a tumorsejtek, például az AFP endocitizálják, és az AFP-hez hasonlóan gátolja a hormonok ösztradiol által kiváltott növekedését. függő daganatsejtek. Így ez a rekombináns fehérje vektormolekulaként használható célzott szállítórendszerekben.
Génkonstrukciókat hoztak létre az AFP C-terminális fragmenseinek indukált bioszintézisére E. coliban. Nagyon hatékony módszereket fejlesztettek ki rekombináns AFP-fragmensek izolálására.
Első alkalommal mutatták ki az AFP-oktapeptid GIP8 biológiailag aktív fragmensének (aa 472-479) azon képességét, hogy szelektíven kötődjön a tumorsejtek felszínéhez és azok által nagy hatékonysággal internalizálódjon, ami megnyitja a a GIP8 vektorként való felhasználásának lehetősége a célzott szállítási rendszerekben.
Az AFP, AFP-ZVS és GIP8 konjugátumok tumorellenes hatásának hatékonysága és szelektivitása in vitro humán daganatok széles körének sejtvonalaival szemben bizonyított. Vizsgáltuk intracelluláris transzlokációjuk mintázatát, és igazoltuk a konjugátumok hatékonyságának a fehérje és a citosztatikus szer közötti kémiai kötés labilitásától való függését.
Az AFP-n alapuló célzott bejuttatási rendszerek segítségével felfedezték, hogy a tumorsejtek Pgpl70 aktivitása által okozott multidrog rezisztenciája leküzdhető.
Első alkalommal mutatták ki az AFP esperamicin Aib-vel konjugátum magas daganatellenes hatékonyságát in vivo.
Terápiás oligonukleotidok szelektív bejuttatására szolgáló rendszereket fejlesztettek ki, és bebizonyították a fehérjevektorok (AFP és epidermális növekedési faktor) alkalmazásának alapvető lehetőségét és ígéretét a tumorsejtekbe történő célzott bejuttatásukra.
A védekezésre benyújtott főbb rendelkezések:
1. Az alfa-fetoprotein receptor egy egyedülálló tumorspecifikus antigén, amely a tumorsejtek felszínén található, és a legtöbb normál sejtből hiányzik.
2. Az alfa-fetoprotein receptor célpontként szolgálhat a szelektív daganatellenes terápia során. A receptorához specifikusan kötődő alfa-fetoproteint a tumorsejtek a hozzá kovalensen kötődő gyógyszervegyületek molekuláival együtt internalizálják, így biztosítva a gyógyszerek szelektív eljuttatását a tumorsejtekbe.
3. Az alfa-fetoprotein alapú célzott bejuttató rendszerek alkalmazása lehetővé teszi a tumorsejtek plazmamembrán ABC transzporterei által okozott multidrog rezisztenciájának leküzdését.
4. Az alfa-fetoprotein receptorkötő motívumot tartalmazó rekombináns fragmensei a teljes hosszúságú természetes fehérje helyett szelektív szállítórendszerekben alkalmazhatók.
5. A fehérjevektorok (AFP és epidermális növekedési faktor) alkalmazása jelentősen növelheti az antiszensz oligonukleotidok intracelluláris bejuttatásának hatékonyságát.
A szerző személyes közreműködése az ötlet kidolgozásában, a kísérleti vizsgálatok megszervezésében és lebonyolításában, a kapott eredmények elemzésében, összefoglalásában és értelmezésében áll. A sejttenyészetekkel végzett összes kísérletet közvetlenül a szerző végezte. A munka jóváhagyása.
A munka főbb eredményeiről az V. Nemzetközi Szimpóziumon számoltak be a Biológiai és a Tumormarkerek Klinikai Hasznosságáról (1995, Barcelona, Spanyolország), XVI Intern.
Congress of Clinical Chemistry, (1996, London), A tumorbiológia és a klinikai onkológia kölcsönös függése (1996, Coronado, USA), p. 121. Az Oncodevelopmental Biology and Medicine Nemzetközi Társaságának (ISOBM) ülése (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), ECCO Európai Rákkonferencia (1997, Franciaország), Orosz Nemzeti Kongresszus "Ember és Orvostudomány" (2000, 2005, Moszkva), az Európai Klinikai Vizsgálatok Társaságának 37. éves tudományos ülése (2003, Verona, Olaszország), 1. EUFEPS konferencia a gyógyszerbeadás és -formuláció optimalizálása: új kihívások a gyógyszerszállítás terén (2003, Versailles, Franciaország), Az ISTC/Korea 5. biotechnológiai munkaértekezlete (2004, Chungbuk, Korea), World Conference on Magic Bullets (2004, Nürnberg, Németország), nemzetközi konferencia Molecular Medicine and biosafety (2005, Moszkva), III. Moszkvai nemzetközi kongresszus „Biotechnológia: állam és fejlődési kilátások" (2005, Moszkva), moszkvai nemzetközi konferencia "Biotechnológia és gyógyászat" (2006, Moszkva), 19. Európai Rákkutató Szövetség (EACR) találkozója, Budapest, Magyarország, 2006. július 1-4., konferencia "Új technológiai platform az orvosbiológiai kutatásokhoz (biológia, egészségügy, gyógyszerészet)" (2006, Rostov-on-Don), I. nemzetközi tudományos és gyakorlati konferencia "Posztgenomikus elemzési módszerek a biológiában, laboratóriumi és klinikai gyógyászatban" (2010, Moszkva).
Az értekezés felépítése és terjedelme. A munka 256 oldalas, gépelt szövegben jelenik meg, és egy bevezetőből, szakirodalmi áttekintésből, a kutatási módszerek ismertetéséből, az eredmények bemutatásából és megvitatásából, következtetésekből, következtetésekből és irodalomjegyzékből áll, amely 406 forrást tartalmaz. A dolgozat 94 ábrát és 14 táblázatot tartalmaz.
Hasonló értekezések a "Biokémia" szakterületen, 01/03/04 kód VAK
Célzott daganatellenes gyógyszerek fejlesztése peptid vektorokon és kemoterápiás gyógyszereken 2004, a biológiai tudományok kandidátusa, Al-Nazwani Nasser Salem
Humán alfa-fetoprotein rekombináns fragmentumai célzott gyógyszerek létrehozásához 2012, a biológiai tudományok kandidátusa Sharapova, Olga Andreevna
Fehérje-nukleinsav komplexek felépítése idegen DNS célzott szállítására a sejtekbe 2010, a biológiai tudományok kandidátusa Tatarinova, Olga Nikolaevna
Alfa-fetoprotein és polimer nanorészecskék alapú daganatellenes gyógyszerek transzportformáinak szintézise és vizsgálata 2000, a biológiai tudományok kandidátusa, Bobruskin, Alekszej Igorevics
Antiangiogén polipeptidek és célzott kemoterápiás gyógyszerek daganatellenes potenciáljának megszerzése és tanulmányozása 2006, a biológiai tudományok kandidátusa Digtyar, Anton Vasziljevics
A dolgozat következtetései a „Biokémia” témában, Posypanova, Galina Aronovna
1. Koncepciót dolgoztak ki a biológiailag aktív vegyületek daganatsejtekbe történő célzott bejuttatására szolgáló rendszerhez, amelyben az alfa-fetoproteint (AFP) és fragmenseit célzó motívumként alkalmazzák.
2. Az AFP receptorok jelenlétét mind a humán tumorvonalak sejtjeinek felszínén, mind a humán rosszindulatú daganatok (petefészek, emlő, máj, gyomor, belek) sejtjein megállapították. Jóindulatú daganatok és normál szövetek metszetein, valamint egészséges önkéntesekből származó limfociták felszínén nem mutatták ki az AFP receptort.
3. Kimutatták, hogy nemcsak az AFP, hanem annak rekombináns C-terminális fragmentumai is specifikusan kötődnek az AFP receptorhoz, és a tumorsejtek endocitizálják.
4. Felfedeztük, hogy az AFP biológiailag aktív fragmense, a GIP8 oktapeptid szelektíven kötődik egy ismeretlen receptorhoz a tumorsejtek felszínén, nagy hatékonysággal internalizálódik, és vektorként használható célzott bejuttató rendszerekben.
5. Megállapítást nyert, hogy a daganatellenes gyógyszerek AFP-vel alkotott konjugátumait a célsejtek szelektíven halmozzák fel, kifejezett citosztatikus hatást fejtenek ki a tumorsejtekre, és alacsony toxicitásúak a normál emberi sejtekre; Ezenkívül a konjugátumok hatékonyságát a fehérje és a citotoxikus szer közötti kémiai kötés labilitása határozza meg.
6. Az AFP-n alapuló célzott bejuttatási rendszerek alkalmazása lehetővé teszi a tumorsejtek Pgpl70 aktivitása által okozott multidrog rezisztenciájának leküzdését.
7. A doxorubicin tumorsejtekbe történő transzportjának hatékonysága AFP-vel konjugátumok részeként jelentősen meghaladja a transzferrin és szérumalbumin konjugátumok részeként történő transzportjának hatékonyságát.
8. Az AFP esperamycin Aib-vel konjugátum magas daganatellenes aktivitását in vivo egér transzplantálható tumormodell segítségével mutattuk ki (gyógyulás -30%, élettartam növekedés -163%).
9. A GIP8 AFP fragmentum doxorubicinnel alkotott konjugátuma szelektíven felhalmozódik érzékeny és rezisztens tumorsejtvonalakban, kifejezett citosztatikus hatással rendelkezik a tumorsejtekre, és alacsony toxikus a humán mononukleáris leukocitákra.
Bebizonyosodott, hogy az AFP-n és az epidermális növekedési faktoron alapuló fehérjevektorok alkalmazásának ígéretét az antiszensz oligonukleotidok célzott sejtekbe juttatására használják.
Következtetés.
Ezt a munkát a fehérjevektorokon alapuló, célzott gyógyszerbejuttató rendszerek tervezési mintáinak tanulmányozásával foglalkozik. A vizsgált gyógyszerek intracelluláris transzlokációjának jellemzőinek tanulmányozása és összehasonlítása a daganatos és normál sejtek elleni biológiai aktivitással in vitro segít előre jelezni egy adott stratégia sikerét, és ezáltal optimalizálni a hatékony, szelektív hatású daganatellenes gyógyszerek előállításának folyamatát.
A célzott komponens alkalmazása meghatározza az SAD kölcsönhatását szigorúan meghatározott sejtekkel és szövetekkel, így biztosítva a gyógyszerek hatásának szelektivitását. A receptor által közvetített endocitózis mechanizmusa elősegíti egy olyan gyógyszer felhalmozódását, amelynek molekuláris célpontja a sejten belül található.
A konjugátumok (vektor fehérje)-linker (gyógyszer) SAD-ek összehasonlítása, ahol szérumalbumint, transzferrint és alfa-fetoproteint használtak vektorfehérjeként, megmutatta az utóbbi előnyét mind a tumorsejtekben való felhalmozódásban, mind a ezen sejtek citotoxikus aktivitásában. Ezek a konjugátumok 3-maleimido-benzoesav-hidrazidot használtak linkerként és doxorubicint gyógyszerként. Ez a linker savra labilis, és sejtes kompartmentekben, például endoszómákban és lizoszómákban hidrolizálható, felszabadítva a gyógyszert az SAD-ből. A doxorubicin, egy antraciklin antibiotikum, hatékony és széles körben alkalmazott terápiás szer. A gyógyszer két fő mechanizmussal idézi elő a sejthalált: DNS interkaláció, melynek eredményeként a DOX két szomszédos nukleotid közé inszertálódik, erős kölcsönhatást biztosítva a DNS-sel és megzavarva a replikációt és transzkripciót; topoizomeráz kötődése és gátlása II. A szerkezetben a kinoncsoport jelenléte miatt a DOX részt vesz a redox folyamatokban, ami szabad gyökök képződéséhez vezet, amelyek DNS károsodást és lipid peroxidációt indukálnak. A DOX terápia hatékonysága az intracelluláris felhalmozódásától függ.
A szabad DOX hidrofób jellegének köszönhetően gyorsan behatol a sejtekbe és sejtmagokba. A sejtek DOX-felvételének sebességét a konjugátumban a célsejtek felszínén lévő specifikus receptorok száma és a receptor által közvetített endocitózis intenzitása határozza meg.
Vektorfehérjeként (célzó komponensként) az AFP mellett a jól ismert HSA és Trf transzportfehérjéket használtuk, amelyeket a tumorsejtek aktívan endocitizálnak, és változó sikerrel alkalmaznak intratumorális gyógyszerbejuttatásra (lásd Irodalmi áttekintés, fejezet). 1.5). Azonban az AFP és a DOX konjugátuma szignifikánsan jobb volt, mint a hasonló DOX konjugátumok HSA-val és Trf-vel, mind a tumorsejtekben való felhalmozódás hatékonysága, mind az ezekkel a sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitás tekintetében.
Az AFP receptor expressziójának humán tumorsejtvonalak és normál perifériás vér limfociták felszínén, valamint rákos, jóindulatú és normál szövetek szövettani metszetein AFP elleni monoklonális antitestek felhasználásával végzett vizsgálata kimutatta, hogy ez a receptor túlnyomórészt jelen van rosszindulatú daganatok sejtjei. Eredményeinket később R. Moro kutatásai is megerősítették. Így az AFP egyedülálló célpontként szolgálhat a tumorsejtek felszínén, és a természetes ligandumán, az AFP-n alapuló szállítórendszerek szelektíven szállíthatják a gyógyszereket ezekhez a sejtekhez. A fluoreszcensen jelölt AFP kötődésének és endocitózisának elemzése az AFP felhalmozódásának nagy hatékonyságára és specifitására utal az aktívan proliferáló tumorsejtekben, valamint arra, hogy ez a fehérje nem halmozódik fel a nem proliferáló limfocitákban.
Számos AFP-alapú konjugátum daganatellenes hatásosságának in vitro vizsgálata, amelyben különböző citosztatikumok, daganatellenes antibiotikumok, antimetabolitok, fényérzékenyítők (doxorubicin, daunomicin, kalicheamicin, bleomicin, eszperamicin, ciszplatin, vinblasztalinozin, karboxilin, karboxidinát) citotoxikus komponensként alkalmazzák.nagy szelektív daganatellenes aktivitás. Az esperamicin Aib-vel készített AFP konjugátum jelentős hatékonyságot mutatott in vivo modellkísérletekben kísérleti daganatos egerek kezelésében, megelőzve a daganatok kialakulását és többszörösen növelve az állatok várható élettartamát. Meg kell jegyezni, hogy ez az enediinekkel rokon antibiotikum rendkívül mérgező vegyület. Az enediin antibiotikumok kémiai szerkezetének van egy közös eleme, amelyet gyakran "harcfejnek" neveznek, amely egy 10 tagú enediin gyűrű, amely két acetilénkötést tartalmaz a kettős kötés vagy oxirángyűrű a-helyzetében. Fiziológiás körülmények között és bizonyos aktiválás mellett egy ilyen „robbanófej” átrendeződik reaktív diradikálissá. Az esperamicin citotoxikus hatása az egy- és kétszálú DNS-törések indukciójának köszönhető. Ennek a gyógyszernek a klinikai vizsgálatai kudarcot vallottak magas szisztémás toxicitása miatt. Talán az egyetlen módja annak, hogy kihasználjuk az antibiotikumban rejlő lehetőségeket, ha növeljük szelektivitását a vektormolekulákhoz kémiai úton történő kapcsolással, biztosítva a célzott eljuttatást a daganatba, amit mi meg is tettünk.
Meg kell jegyezni, hogy az SAD megalkotásakor különösen fontos a vektorfehérjét a citotoxikus szerhez kötő linker megválasztása. Egy citosztatikus szer sikeresen eljuttatható a célsejtbe, de ha nem biztosított a vektorról való időben történő lehasítása, akkor a biológiai hatás vagy nem valósul meg, vagy gyengén fejeződik ki. Az AFP és DOX konjugátumok hatékonyságának elemzése, amelyben a labilitásukban eltérő linkereket alkalmaztak, azt mutatta, hogy a legaktívabb konjugátumok a glutáraldehiddel és 3-maleimidobenzoesav-hidraziddal szintetizált konjugátumok voltak. Az AFP DOX-szal konjugátumok citotoxikus aktivitása korrelált a DOX sejtmagokban való felhalmozódásával: minél gyorsabban történt ez, annál aktívabb volt a konjugátum. Amikor 3-(2-ditiopiridil)-propionsav N-hidroxi-szukcinimid-észterét használták linkerként, a DOX lokalizációja a sejtekben túlnyomórészt citoplazmatikus volt, még 24 órával a konjugátum alkalmazása után is. Ez a konjugátum azonban nagyon alacsony aktivitást mutatott (25-ször alacsonyabb, mint a szabad DOX). Úgy tűnik, az erős diszulfid kötés megakadályozza a DOX gyors hasadását az endoszómákban. A sejtekben a diszulfidkötések redukálására képes enzimek (tiol-protein diszulfid-reduktáz, tioredoxin, glutaredoxin, gamma-interferonnal indukálható lizoszómális tiolreduktáz - GILT) a mikroszómák üregében, a Gollgi-komplexum szerkezetében lokalizálódnak; A tioredoxin és a glutaredoxin katalizálja a diszulfidkötések redukcióját a sejtmagban és a citoplazmában; GILT - késői endoszómákban/lizoszómákban (optimális pH 4-5). A fehérjékben a diszulfidkötések redukciója a késői endoszómákban/lizoszómákban következik be, miután a katepsinek korlátozott proteolízist végeznek. A diszulfidkötés tiol-protein-diszulfid-reduktáz általi redukciója jelentősen lelassul a pH csökkenésével. Úgy tűnik, hogy a DOX felszabadulása olyan konjugátumokból, amelyekben az antibiotikum diszulfidkötésen keresztül kapcsolódik a fehérjéhez, meglehetősen lassan megy végbe, ami megmagyarázza az ilyen konjugátumok alacsony citotoxikus aktivitását. A második tényező, amely befolyásolhatja a tárgyalt konjugátum hatékonyságát, a DOX cukormaradékának aminocsoportjának módosítása egy tiolcsoport SPDP-vel történő bevezetésekor. Bár számos tanulmány kimutatta a DOX aktív konjugátumainak előállítását antitestekkel ezzel a szintézisstratégiával, más tanulmányok kimutatták, hogy a DOX aminocukor módosítása csökkenti ennek az antibiotikumnak a citotoxikus aktivitását, és a szervezet citotoxikus aktivitásának elvesztéséhez vezet. a konjugátumban lévő antraciklin.
Ennek ellenére az SPDP alkalmazása az AFP-EsA konjugátumok szintézisében nagyon hatékonynak bizonyult. Valójában a konjugátum citotoxicitása in vitro teszteléskor többnyire alacsonyabb volt, mint a szabad EsA toxicitása. Azonban a konjugátumban az EsA hatásának szelektivitásának növelése eredményeként jelentős sikereket értek el a konjugátum in vivo tesztelése során.
A kapott eredmények lehetővé teszik a célzott gyógyszerek hatékonysági szintjének előrejelzését fehérjevektor molekulák alapján. Az ilyen gyógyszerek hatékonysága nemcsak a vektorfehérjétől függ, hanem nagymértékben a fehérje és a daganatellenes antibiotikum közötti kémiai kötés típusától is. Ez a kapcsolat nem lehet túl erős, hiszen a célzott bejuttatás előnyei elvesznek: az antibiotikum magas intracelluláris koncentrációja ellenére előfordulhat, hogy az utóbbinak nincs farmakológiai hatása, ha nem éri el célját. De a kapcsolat nem lehet túl labilis, mivel a gyógyszernek meg kell őriznie integritását, mielőtt kölcsönhatásba lépne a célsejtekkel. Ugyanakkor a célzott konstrukció létrehozásakor figyelembe kell venni, hogy egy gyógyszer (antibiotikum, citosztatikum stb.) fehérjemolekuláról való lehasadása nagy valószínűséggel az endoszómákban 5,5-es pH-érték mellett történik. 6, vagyis az AFP molekulát a gyógyszerrel összekötő linkernek ideális esetben hidrolizálódnia kell a feltüntetett pH-értékeken, vagy endoszomális enzimek szubsztrátjának kell lennie.
A szintetizált AFP-alapú konjugátumok legfontosabb tulajdonsága az ABC transzporterek aktivitása által okozott multidrog rezisztencia visszafordítása volt.
A kapott eredmények arra engednek következtetni, hogy az AFP hatékonyan alkalmazható célzott szerként daganatellenes gyógyszerek különböző eredetű daganatsejtekbe juttatására.
A természetes emberi AFP talán egyetlen jelentős hátránya az izoláció forrása: az AFP preparatív mennyiségben csak abortív anyagból izolálható. A köldökzsinórvérben, az általunk használt bioanyagban az AFP-tartalom sokkal alacsonyabb, és szigorúan véve ez sem a legjobb biológiai forrás. Ezért azt a feladatot tűztük ki célul, hogy előállítsunk egy rekombináns fehérjevektort – egy olyan AFP-fragmenst, amely a természetes molekulában lévővel azonos receptorkötő helyet tartalmaz. A kapott AFP rekombináns C-terminális fragmense (rAFP27) specifikusan kötődött a tumorsejtek AFP receptorához, és a teljes hosszúságú humán AFP-hez hasonlóan endocitizálták. A gAFP27 a teljes hosszúságú fehérje néhány más biológiai tulajdonságát is megőrizte. A gAFP27 vektorként való alkalmazása SAD-ben megnyitja a fehérje potenciáljának gyakorlati hasznosítását az AFP ligandumában.
A transzformált sejteket a sejtproliferáció és az apoptózis szabályozásával összefüggő gének megváltozása jellemzi. A tumorsejtek új szelektív ágenseinek kifejlesztésével foglalkozó számos tanulmány között különleges helyet foglalnak el az antiszensz oligonukleotidok. Az ASON-ok azon új szerek egyik osztályát képezik, amelyek gátolhatják a specifikus daganathoz kapcsolódó fehérjék szintézisét azáltal, hogy kötődnek az ezeket a fehérjéket kódoló mRNS-hez, és ezáltal blokkolják a fehérjeszintézist. Számos módosított (különösen tiofoszfát) ASON bizonyítottan meggyőző csökkenést mutatott a célgén expressziójában in vitro, és azt feltételezték, hogy sikeresek a daganatok széles körében. Az ASON szelektivitását csökkentő akadály, hogy ezeknek a vegyületeknek a célsejtekben jelenleg nincs megfelelő és hatékony SAD-ja, amely szükséges az ASON terápiás potenciáljának megvalósításához.
A transzformált sejteket a sejtproliferáció és az apoptózis szabályozásával összefüggő gének megváltozása jellemzi. A tumorsejtek új szelektív ágenseinek kifejlesztésével foglalkozó számos tanulmány között különleges helyet foglalnak el az antiszensz oligonukleotidok. Az antiszensz oligonukleotidok az új ágensek egyik ilyen osztálya, amelyek gátolhatják a specifikus tumorhoz kapcsolódó fehérjék szintézisét azáltal, hogy kötődnek az ezeket a fehérjéket kódoló mRNS-hez, ezáltal blokkolva a fehérjeszintézist. Az elmúlt évtizedekben számos antiszensz került kifejlesztésre és tesztelésre preklinikai és klinikai vizsgálatok során. Sokuk meggyőző csökkenést mutatott a célgén-expresszióban in vitro rendszerekben, és azt feltételezték, hogy sikeresek a daganatok széles körében. A daganatok genetikai heterogenitása miatt azonban az antiszenszek egyetlen gyógyszerként történő alkalmazása nem tűnik hatékonynak a betegség kezelésében. A sejtproliferációban és az apoptózisban részt vevő jelátviteli útvonalak megzavarását célzó antiszensz terápiák különösen ígéretesek, ha hagyományos daganatellenes kezelésekkel kombinálják őket.
A tiofoszfát A8(G) tumorsejtekbe történő eljuttatása AFP-vel konjugátumok formájában rendkívül hatékonynak bizonyult, mivel lehetővé tette a citoplazmatikus membrán gátjának leküzdését, amely korlátozza az ABOI bejutását a sejtekbe. akár direkt citosztatikus hatás formájában, akár a célsejtek más daganatellenes szerek hatására való szenzitizálása formájában Megállapítást nyert, hogy egyes szekvenciák nem specifikus toxicitása (G) nem akadályozta ezek alkalmazását (G), mivel egy vektormolekula alkalmazása SAD-ben korlátozta azok toxicitását a tumorsejtekre.A konjugátumok szintézise azonban nagyon munkaigényes folyamatnak bizonyult, amely jelentős fehérje- és ABOM-veszteséggel járt.Alternatív kialakítások, amelyek nem kovalensek A fehérjék ABOM-mal alkotott komplexei technológiailag fejlettebbek lehetnek. Az AO-k, különösen tiofoszfát analógjaik, nagy negatív töltéssel rendelkeznek, és képesek erős komplexeket képezni polikationos molekulákkal. Az ilyen komplexek képződésének hatékonyságának növelése érdekében a rekombináns fehérjék (gAFP27 és EvP) molekuláiba pozitív töltésű szekvenciát vittek be, biztosítva azok erős kölcsönhatását az LBOM-mal. Az így létrejött konstrukciók sikeres SAD-nek bizonyultak, nemcsak nagymértékben növelték az ABOA felhalmozódásának hatékonyságát az említett fehérjék megnövekedett receptortartalmával jellemezhető sejtekben, hanem megvédték a természetes foszfodiészter OA-kat a lebomlástól. A mitogén, azaz az EOP alkalmazása azonban az SAD célzott összetevőjeként korlátozza a felhasznált ABO-k körét, és bizonyos esetekben megakadályozza a biológiai hatás érvényesülését. Lehetséges, hogy az EUR molekula receptorkötő régiójának módosítása segíthet a probléma megoldásában, aminek következtében a receptor aktiválódási képessége (autofoszforilációs képessége) elvész, de nem befolyásolja a képességet. a ligandumához való kötődés után internalizálandó receptor.
A jelen munkában bemutatott kísérleti vizsgálatok eredményei az alfa-fetoprotein, fragmensei és módosított epidermális növekedési faktor alapú célzott bejuttatási rendszerek nagy hatékonyságát és szelektivitását jelzik.
A betegségek patogenezisének molekuláris mechanizmusainak vizsgálatában elért előrehaladás, a molekuláris biológia és biotechnológia területén új módszerek megjelenése lehetőséget teremt olyan új gyógyszerek kifejlesztésére, amelyek szelektíven befolyásolják a tumorsejtekre jellemző különféle jelátviteli utakat, és ezáltal lehetőséget adnak. célzott egyéni kezelés, amely a páciens daganata által termelt egyedi molekuláris célpontok komplexén alapul. A gyógyszerek önmagukban is elérhetik a célpontokat (például terápiás antitesteket), vagy a tumor által érintett specifikus szerveket célzó szállítórendszerek részeként, vagy közvetlenül a rákos sejtek felszínére vagy belsejébe. A daganat sejtbiológiájának megértése és a daganatsejtek mikrokörnyezetének tanulmányozása lehetővé teszi számunkra, hogy hatékony lehetőségeket fejlesszünk ki célzott gyógyszerekre.
Az értekezés kutatásához szükséges irodalomjegyzék A biológiai tudományok doktora, Posypanova, Galina Aronovna, 2013
1. Jain R.K. Molekuláris és sejtes gyógyszer szállítása szolid daganatokba. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. 1-3. P. 149-168.
2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Gyógyszerszállítás és szállítás szolid daganatokba. //Pharm Res. 2003. V. 20. 9. sz. P. 1337-1350.
3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. A rituximab klinikai fejlődésének áttekintése: az első limfóma kezelésére jóváhagyott monoklonális antitest. // Semin Oncol. 1999. V. 26. No. 5 Suppl 14. P. 66-73.
4. Huhn D., von Schilling C„ Wilhelm M„ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W„ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab B-sejtes krónikus limfocitás leukémiában szenvedő betegek kezelése. // Vér. 2001. V. 98. 5. sz. P. 1326-1331.
5. Gribben J.G., Hallek M. Az alemtuzumab újrafelfedezése: jelenlegi és kialakulóban lévő terápiás szerepek. //Br J Haematol. 2009. V. 144. 6. sz. P. 818-831.
6. Ravandi F., O"Brien S. Alemtuzumab CLL-ben és más limfoid neoplazmákban. // Cancer Invest. 2006. V. 24. No. 7. P. 718-725.
7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-IH) a krónikus limfocitás leukémia kezelésében. //Onkogén. 2007. V. 26. 25. sz. P. 3644-3653.
8. Baselga J. Az EGFR célzott terápia áttekintése. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. 4. sz. P. 218-219.
9. Fischgrabe J., Wulfing P. Célzott terápiák mellrákban: bevált gyógyszerek és legújabb fejlesztések. // Curr Clin Pharmacol. 2008. V. 3. 2. sz. P. 85-98.
10. Goldenberg M.M. A trastuzumab, egy rekombináns DNS-eredetű humanizált monoklonális antitest, egy új szer az áttétes emlőrák kezelésére. // Clin Ther. 1999. V. 21. 2. sz. P. 309-318.
11. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Humán emlőrák: a visszaesés és a túlélés összefüggése a HER-2/neu onkogén amplifikációjával. // Tudomány. 1987. V. 235. 4785. sz. P. 177-182.
12. Azim H., Azim H.A., Jr. A Her-2/neu megcélzása mellrákban: ilyen egyszerű! // Onkológia. 2008. V. 74. 3-4. P. 150-157.
13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado V., Gascon P. Az anti-HER2 monoklonális antitestek hatásmechanizmusa: tudományos frissítés a trastuzumabról és a 2C4-ről. // Adv Exp Med Biol. 2003. V. 532. P.253-268.
14. Stern M., Herrmann R. A monoklonális antitestek áttekintése a rákterápiában: jelen és ígéret. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. 1. sz. P. 11-29.
15. Gutheil J. A monoklonális antitestek ígérete a rák terápiájában. // Crit Rev Oncol Hematol. 2001. V. 38. 1. sz. P. 1-2.
16. Moiseenko B.M. Monoklonális antitestek a rosszindulatú daganatok kezelésében. // Gyakorlati onkológia. 2003. V. 4. 3. sz. R. 148-156.
17. Guillemard V., Uri Saragovi N. A prodrug kemoterápiás szerek megkerülik a p-glikoprotein rezisztenciát és elpusztítják a daganatokat in vivo nagy hatékonysággal és célfüggő szelektivitással. //Onkogén. 2004. V. 23. 20. sz. P. 3613-3621.
18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Technology Insight: citotoxikus gyógyszeres immunkonjugátumok rákterápiához. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. 4. sz. P. 245-255.
19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) visszaeső CD30-pozitív limfómák esetén. // New England Journal of Medicine. V. 363. 19. sz. P. 1812-1821.
20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. A trastuzumab I. fázisú vizsgálata
21. DM1, egy HER2 antitest-gyógyszer konjugátum, 3 hetente adják HER2-pozitív áttétes emlőrákos betegeknek. // Journal of Clinical Oncology. V. 28. 16. sz. P. 2698-2704.
22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: anti-CD33 immunkonjugátum az akut mieloid leukémia kezelésére. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. 4. sz. P. 527-540.
23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O"Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. A gemtuzumab ozogamicin szerepe az akut leukémia kezelésében. // Br J Haematol. 2006. V. 132. 4. sz. 398-409.
24. Gao Z., McAlister V.C., Williams G.M. A máj endotéliumának újratelepítése csontvelőből származó sejtek által. // Lancet. 2001. V. 357. 9260. sz. P. 932-933.
25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Calicheamicin gamma II: daganatellenes antibiotikum, amely specifikusan hasítja a kettős szálú DNS-helyet. // Tudomány. 1988. V. 240. 4856. sz. P. 1198-1201.
26. Reiter Y. Rekombináns immuntoxinok a rákos sejt célzott terápiájában. // Adv Cancer Res. 2001. V. 81. P. 93-124.
27. Goyal A., Batra J.K. Furin-érzékeny spacer beépítése fokozza a ribotoxin restriktocint tartalmazó rekombináns egyláncú immunotoxinok citotoxicitását. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.
28. Kreitman R.J. Csonka bakteriális toxinokat tartalmazó rekombináns immuntoxinok hematológiai rosszindulatú daganatok kezelésére. // BioDrugs. 2009. V. 23. 1. sz. P. 1-13.
29. Jain R.K., Baxter L.T. A monoklonális antitestek és egyéb makromolekulák heterogén eloszlásának mechanizmusai daganatokban: a megemelkedett intersticiális nyomás jelentősége. // Cancer Res. 1988. V. 48. 24. szám Pt 1. P. 7022-7032.
30. Green M.C., Murray J.L., Hortobágyi G.N. Monoklonális antitestterápia szolid daganatok kezelésére. // Cancer Treat Rev. 2000. V. 26. 4. sz. P. 269-286.
31. Brada M. BCL2 gén: jelenlegi jelentősége a klinikai onkológiában. // Eur J Rák. 1992. V. 28. 1. sz. P. 270-272.
32. Yip K.W., Reed J.C. A Bcl-2 család fehérjéi és a rák. //Onkogén. 2008. V. 27. 50. sz. P. 6398-6406.
33. Reed J.C. Bcl-2 család fehérjék: stratégiák a kemoterápia leküzdésére rák esetén. Adv Pharmacol. 1997. V. 41. P. 501-532.
34. Reed J.C. A Bel-2 család fehérjéi: a kemorezisztencia szabályozói a rákban. Toxicol Lett. 1995. V. 82-83. P. 155-158.
35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen a metasztatikus melanoma kezelésében. // Future Oncol. 2007. V. 3. 3. sz. P. 263-271.
36. Oblimersen: Augmerosen, BCL-2 antiszensz oligonukleotid Genta, G 3139, GC 3139, oblimersen nátrium. // Drugs R D. 2007. V. 8. 5. sz. P. 321-334.
37. Manoharan M. Oligonukleotid konjugátumok, mint potenciális antiszensz gyógyszerek, jobb felvétellel, biológiai eloszlással, célzott szállítással és hatásmechanizmussal. /"/ Antisense Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. No. 2. P. 103-128.
38. Abels C. Solid tumorok érrendszerének megcélzása fotodinamikus terápiával (PDT). Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. 8. sz. P. 765-771.
39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. A fotodinamikus terápia közvetlen tumorkárosodásának mechanizmusai. Acta Biochim Pol. 2005. V. 52. 2. sz. P. 339-352.
40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Fotodinamikus terápia (PDT): rövid áttekintés a PDT sejtmechanizmusairól és rákkutatási alkalmazásairól. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. 1. sz. P. 1-8.
41. Aveline B.M., Redmond R.W. A celluláris fotoszenzitizáció exkluzív szabad gyökös mechanizmusai. // Fotokémia és fotobiológia. 1998. V. 68. 3. sz. P. 266-275.
42. Henderson B.W., Dougherty T.J. Hogyan működik a fotodinamikus terápia? // Photochem Photobiol. 1992. V. 55. 1. sz. P. 145-157.
43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Mellkasi fájdalommal, légszomjjal és verteporfinnal (visudyne) kapcsolatos syncope jellemezhető mellékhatás. // Am J Ophthalmol. 2002. V. 134. 2. sz. P. 281-282.
44. Cheng Y., A C.S., Meyers J.D., Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Nagyon hatékony gyógyszerszállítás arany nanorészecskék vektorokkal a rák in vivo fotodinamikus terápiájában. J Am Chem Soc. 2008. V. 130. 32. sz. P. 10643-10647.
45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Célzott fotodinamikus terápia receptor közvetített szállítórendszereken keresztül. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. 1. sz. P. 53-76.
46. Oleinick N.L., Evans H.H. A fotodinamikus terápia fotobiológiája: celluláris célpontok és mechanizmusok. //Radiat Res. 1998. V. 150. 5. sz. melléklet. P. S146-156.
47. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Fényérzékenyítők célzott intracelluláris bejuttatása a fotodinamikus hatékonyság fokozása érdekében. Immunol Cell Biol. 2000. V. 78. 4. sz. P. 452-464.
48. Rozanova Torshina N., Zhang J.Z., Heck D.E. A rák katalitikus terápiája porfirinekkel és aszkorbáttal. // Cancer Lett. 2007. V. 252. 2. sz. P. 216-224.
49. Khorosheva E.V., Gerasimova G.K., Kalia O.J1. A teraftál tumorsejtekbe történő transzportjának mechanizmusának tanulmányozása
50. Russian Biotherapeutic Journal 2007. V. 6. 1. sz. R. 8.
51. Kulbachevskaya N.Yu., Manzyuk L.V., Mikhailova JI.M. A „teraftál + aszkorbinsav” („TF + AK”) daganatellenes katalitikus rendszer toxicitásának klinikai és kísérleti vizsgálata. // Orosz bioterápiás folyóirat. 2004. V. 3. 2. sz. R. 70.
52. Ravi Kumar M.N. Nano- és mikrorészecskék, mint szabályozott gyógyszeradagoló eszközök. J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. 2. sz. P. 234-258.
53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanorészecskés és célzott rendszerek a rákterápiához. // Adv Drug Deliv Rev. 2012. V.P.
54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Nanoparticle Albumin bound (nab) Technology is a Promiting Method for Cancer Drug Delivery. // Legutóbbi Pat Anticancer Drim Dkrnv 9PP9 V P
55. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Targeting of albumin-embedded paclitaxel nanoparticles to tumors. //Nanomedicina. 2009. V, 5. 1. sz. P. 73-82.
56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paclitaxel emlőrák kezelésére: új készítmény jobb biztonsági profillal és nagyobb hatékonysággal. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. 7. sz. P. 919-943.
57. Moreno-Aspitia A., Perez E.A. Nanopartikulum albuminhoz kötött paklitaxel (ABI-007): újabb taxán alternatíva emlőrákban. // Future Oncol. 2005. V. 1. 6. sz. P. 755-762.
58. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocita mechanizmusok a célzott gyógyszerszállításhoz. // Speciális gyógyszerszállítási vélemények. 2007. V. 59. 8. sz. P. 748-758.
59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // Biochem J. 2004. V. 377. No. Pt l.P. 1-16.
60. Rodemer C., Haucke V. Clathrin/AP-2-függő endocitózis: új játszótér a farmakológiai eszköztár számára? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. 186. sz. P. 105-122.
61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // A Biokémiai folyóirat. 2004. V. 377. szám Pt 1. P. 1-16.
62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Kiegészítő faktorok klatrin-függő szinaptikus vezikula endocitózisban. //Nat Rev Neurosci. 2000. V. 1. 3. sz. P. 161-172.
63. Marsh M., McMahon H.T. Az endocitózis szerkezeti korszaka. // Tudomány. 1999. V. 285. 5425. sz. P. 215-220.
64. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocita mechanizmusok a célzott gyógyszerszállításhoz. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. 8. sz. P. 748-758.
65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. A Dynamin gyűrűkké áll össze, ami a bevont hólyagok kialakulásának mechanizmusát sugallja. //Természet. 1995. V. 374. 6518. sz. P. 190-192.
66. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, a membrán-remodeling GTPase. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. 2. sz. P. 75-88.
67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Citoplazmatikus dynein-dependens vezikuláris transzport a korai endoszómáktól a későiig. // A sejtbiológia folyóirata. 1993. V. 123. 6. szám Pt 1. P. 1373-1387.
68. Stahl P.D., Barbieri M.A. Multivezikuláris testek és multivezikuláris endoszómák: az endoszómális forgalom "csínja-bínja". // Science's STKE: jelátviteli tudáskörnyezet 2002. V. 2002. No. 141. P. pe32.
69. Piper R.C., Luzio J.P. Késői endoszómák: válogatás és felosztás multivezikuláris testekben. // Forgalom. 2001. V. 2. 9. sz. P. 612-621.
70. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Endolysosomal proteolízis és szabályozása. // A Biokémiai folyóirat. 2002. V. 363. szám Pt 3. P. 417-429.
71. Eskelinen E.-L. A LAMP-1 és LAMP-2 szerepe a lizoszóma biogenezisében és az autofágiában. // Az orvostudomány molekuláris vonatkozásai. 2006. V. 27. No. 5-6. P. 495-502.
72. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Caveolinok, folyadék-rendezett domének és jelátvitel. Mol Cell Biol. 1999. V. 19. 11. sz. P. 7289-7304.
73. Khalil I. A., Kogure K., Akita H., Harashima H. · Felvételi útvonalak és ezt követő intracelluláris kereskedelem a nem vírusos génszállításban. Pharmacol Rev. 2006. V. 58. 1. sz. P. 32-45.
74. Lajoie P., Nabi I.R. 3. fejezet Lipid tutajok, caveolák és endocitózisuk. In: Kwang WJ, szerkesztő. International Review of Cell and Molecular Biology: Academic Press; 2010. p. 135163.
75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Klatrin- és caveolin-1-független endocitózis: majomvírus 40 bejutása caveoláktól mentes sejtekbe. J Cell Biol. 2005. V. 168. 3. sz. P. 477-488.
76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. A terápiák célzott intracelluláris bejuttatása: áttekintés. // Die Pharmazie. 2007. V. 62. 9. sz. P. 643-658.
77. Fenton C., Perry C.M. Gemtuzumab ozogamicin: az akut mieloid leukémiában való alkalmazásának áttekintése. // Kábítószerek. 2005. V. 65. 16. sz. P. 2405-2427.
78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Új CD20 monoklonális antitestek limfóma terápiához. // Journal of Hematology & Oncology. 2012. V. 5. 1. sz. 64. o.
79. Chari R.V.J. Célzott rákterápia: Specificitás biztosítása a citotoxikus gyógyszereknek. // Beszámolók a kémiai kutatásokról. 2007. V. 41. 1. sz. P. 98-107.
80. Casi G., Neri D. Antitest-drug konjugátumok: alapfogalmak, példák és jövőbeli perspektívák. // A szabályozott kibocsátás folyóirata: a Controlled Release Society hivatalos lapja. 2012. V. 161. 2. sz. P. 422-428.
81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren T., Venkatachalam T., Waddick K.G., Rostostev A., Myers D.E. Az epidermális növekedési faktor-genistein citotoxikus aktivitása az emlőráksejtekkel szemben. // Clin Cancer Res. 1998. V. 4. 4. sz. P. 901-912.
82. Rihova B. A kábítószerek sejtfelszíni receptorokra történő célzása. // Kritikai áttekintések a biotechnológiában. 1997. V. 17. 2. sz. P. 149-169.
83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Recent progress in tumor-targeting anticancer drug conjugates. // Bioorganic és gyógyászati kémia. 2005. V. 13. 17. sz. P. 50435054.
84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Rákellenes szerek prodrug-alapú intracelluláris bejuttatása. // Speciális gyógyszerszállítási vélemények. 2011. V. 63. 1-2. P. 3-23.
85. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J. A célzott rákellenes gyógyszerek és konjugátumok tervezésének legújabb trendjei. // Jelenlegi orvosi kémia. 2008. V. 15. 18. sz. P. 1802-1826.
86. Sanderson R.J., Hering M.A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. Anti-CD30 dipeptiddel kötött aurisztatin immunkonjugátum in vivo gyógyszer-linker stabilitása. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. 2. szám Pt 1. P. 843-852.
87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Receptor-mediált endocitózisból eredő terápiás fehérjék nemlineáris farmakokinetikája. // J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2009. V. 36. 3. sz. P. 239-260.
88. Malyankar U.M. Tumor-asszociált antigének és biomarkerek a rákban és az immunterápiában. Int Rev Immunol. 2007. V. 26. 3-4. P. 223-247.
89. Tyuryaeva I.I. Tumor antigének. // Citológia. 2008. V. 50. 3. sz. R. 189-209.
90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon T., van der Bruggen P. A HLA-A2 által bemutatott MAGE-A4 peptidet a citolitikus T-limfociták felismerik. Eur J Immunol. 1999. V. 29. 10. sz. P. 3329-3337.
91. Houghton A.N. Rák antigének: az én és a megváltozott én immunrendszeri felismerése. // J Exp Med. 1994. V. 180. 1. sz. P. 1-4.
92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Normál és neoplasztikus humán melanociták gangliozidjai. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 120. 2. sz. P. 500-504.
93. Tang C.K., Katsara M., Apostolopoulos V. A MUC1 immunterápiához használt stratégiák: humán klinikai vizsgálatok. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. 7. sz. P. 963-975.
94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Role of HER receptors family in development and differentiation. //J Cell Physiol. 2004. V. 200. 3. sz. P. 343-350.
95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. Az ErbB jelátviteli hálózat: receptor heterodimerizáció a fejlődésben és a rákban. // EMBO J. 2000. V. 19. 13. sz. P. 3159-3167.
96. Barysnyikov A.Yu. A daganat és a szervezet immunrendszerének kapcsolata. // Gyakorlati onkológia. 2003. V. 4. 3. sz. R. 127-130.
97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Karcinoembrionális antigén, mint vakcina célpontja. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. 7. sz. P. 987-993.
98. Singer J.W., De Vries P., Bhatt R., Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis R.A., Wallace S. Conjugation of camptothecins to poly-(L-glutamic acid). Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 922. P.136-150.
99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Adriamicin-mitokondrium kölcsönhatások citofluoreszcens kimutatása izolált, perfundált patkányszívben. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. 1. sz. P. 35-41.
100. Evdokimova V.N., Butterfield L.H. Alfa-fetoprotein és más tumorhoz kapcsolódó antigének a hepatocelluláris rák immunterápiájához. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. 3. sz. P. 325336.
101. Abelev G.I., Radír T.L. Az alfa-fetoprotein reexpressziójának sejtes vonatkozásai daganatokban. // Semin Cancer Biol. 1999. V. 9. 2. sz. P. 95-107.
102. Mizejewski G.J. Alfa-fetoprotein szerkezete és funkciója: jelentősége az izoformák, epitópok és konformációs változatok szempontjából. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. 5. sz. P. 377-408.
103. Castelli C., Rivoltini L., Andreola G., Carrabba M., Renkvist N., Parmiani G. Melanoma-asszociált antigének T-sejt felismerése. // J Cell Physiol. 2000. V. 182. 3. sz. P. 323-331.
104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. Az autológ citolitikus T limfociták által felismert antigén kódoló gének új családja humán melanomán. // J Exp Med. 1995. V. 182. 3. sz. P. 689-698.
105. Lewis J.J., Houghton A.N. Vakcinakészítésre alkalmas tumorantigének meghatározása. // Semin Cancer Biol. 1995. V. 6. 6. sz. P. 321-327.
106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Drug targeting in cancer treatment: active daunorubicin-protein conjugates. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pt A. P. 291-298.
107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. A tumor vaszkuláris permeabilitása és az EPR hatása makromolekuláris terápiában: áttekintés. // J Control Release. 2000. V. 65. 1-2. P. 271-284.
108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Makromolekulák korai fázisú daganatos felhalmozódása: nagy különbség a tumor és a normál szövetek kiürülési sebességében. // Jpn J Cancer Res. 1998. V. 89. 3. sz. P. 307-314.
109. Kratz F., Beyer U. A szérumfehérjék mint rákellenes szerek gyógyszerhordozói: áttekintés. // Drug Deliv. 1998. V. 5. 4. sz. P. 281-299.
110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. A doxorubicin albuminkonjugátumainak előállítása, jellemzése és in vitro hatékonysága. Biol Pharm Bull. 1998. V. 21. 1. sz. P. 56-61.
111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. A rákellenes klórambucil albumin konjugátumai: szintézis, jellemzés és in vitro hatékonyság. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. V. 331. 2. sz. P. 47-53.
112. A Német Rákszövetség Orvosi Onkológiai Egyesülete. // Clin Cancer Res. 1999. V. 5. 4. sz. P. 753-759.
113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. A metotrexát albuminkötő prodrugjának szintézise, hasítási profilja és daganatellenes hatékonysága, amelyet plazmin és katepszin B hasít. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. V. 340. 8. sz. P. 389-395.
114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Új MMP2 és MMP9 specifikus doxorubicin albumin konjugátumok fejlesztése és in vitro hatékonysága. Bioorg Med Chem Lett. 2001. V. 11. 15. sz. P. 2001-2006.
115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Savval hasítható kötéseket tartalmazó gyógyszer-polimer konjugátumok. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. V. 16. 3. sz. P. 245-288.
116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung D.E., Gitzel M. Anthracyclines prodrugs in chemotherapy cancer. // Curr Med Chem. 2006. V. 13. 5. sz. P. 477-523.
117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. A doxorubicin (6-maleimidokaproil)-hidrazon származékának I. fázisa és farmakokinetikai vizsgálata. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. 16. sz. P. 4858-4866.
118. Kratz F., Mansour A., Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Prosztata-specifikus antigén által hasított albuminkötő doxorubicin prodrugok fejlesztése. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. V. 338. 10. sz. P. 462-472.
119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. A katepszin B által hasított doxorubicin albuminkötő gyógyszerének in vitro és in vivo vizsgálata. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. V. 64. 2. sz. P. 413-418.
120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Fehérjekötő bifunkciós linkerek fejlesztése kettős hatású gyógyszerek új generációjához. Bioconjug Chem. 2009. V. 20. 2. sz. P. 390-396.
121. Abu Ajaj K., Kratz F. Kettős hatású prodrugok fejlesztése a multidrog rezisztencia megkerülésére. Bioorg Med Chem Lett. 2009. V. 19. 3. sz. P. 995-1000.
122. Dautry-Varsat A. Receptor-mediált endocitózis: a transzferrin és receptora intracelluláris utazása. // Biochimie. 1986. V. 68. 3. sz. P. 375-381.
123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez J.A., Helguera G., Penichet M.L. A transzferrin receptor I. rész: Biológia és célzás citotoxikus antitestekkel a rák kezelésére. Clin Immunol. 2006. V. 121. 2. sz. P. 144-158.
124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: szerkezet, funkció és lehetséges terápiás hatások. // Drug Discov Today. 2005. V. 10. 4. sz. P. 267-273.
125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Az adriamicin transzferrin által irányított szállítása emberi sejtekbe. // Anticancer Res. 1998. V. 18. 3A. sz. P. 1423-1427.
126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. A humán transzferrin adriamicin konjugátumai megkötik a transzferrin receptorokat és elpusztítják a K562 és HL60 sejteket. // Arch Biochem Biophys. 1993. V. 300. 1. sz. P. 356-363.
127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. A transzplazma membrán elektrontranszport gátlása transzferrin-adriamicin konjugátumokkal. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1105. 1. sz. P. 84-88.
128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Influence of conjugation of doxorubicin to transferrin on the iron uptake by K562 cells via receptor-mediated endocytosis. Eur J Biochem. 1993. V. 213. 1. sz. P. 427-436.
129. Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Doxorubicin-transzferrin konjugátumra érzékeny sejtvonalak hatásmechanizmusa és spektruma. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. V. 41. 2. sz. P. 155160.
130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. A transzferrin receptor II. rész: terápiás szerek célzott bejuttatása a rákos sejtekbe. Clin Immunol. 2006. V. 121. 2. sz. P. 159-176.
131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. In vitro citotoxicitások és transzferrin-platina(II) komplex in vivo eloszlása. J Pharm Sci. 1995. V. 84. 2. sz. P. 216-221.
132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. A platina transzferrin (MPTC-63) előzetes értékelése, mint az emlőrák potenciális nem toxikus kezelése. // Cancer Detect Prev. 1988. V. 12. No. 1-6. P. 469-480.
133. Vezető J.F., Wang F., Elliott R.L. A thai daganatellenes gyógyszerek megzavarják a vas anyagcseréjét a rákos sejtekben. //Adv Enzyme Regul. 1997. V. 37. P. 147-169.
134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. A klórambucil rákellenes gyógyszer transzferrin konjugátumainak szintézise és in vitro hatékonysága. //J Med Chem. 1998. V. 41. 15. sz. P. 2701-2708.
135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Tumor targeting a fokozott permeabilitás és retenció (EPR) és a receptor-mediált endocitózis (RME) mechanizmusa alapján. // Int J Pharm. 2004. V. 277. 1-2. P. 39-61.
136. Frankel A.E. Az immuntoxinok fokozott kifinomultsága. // Clin Cancer Res. 2002. V. 8. 4. sz. P. 942-944.
137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Hematológiai rosszindulatú daganatok immuntoxin terápiája. // Semin Oncol. 2003. V. 30. 4. sz. P. 545-557.
138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. A transzferrin receptor célzott immuntoxinok hatékonysága agydaganatos sejtvonalakban és gyermekkori agydaganatokban. // Cancer Res. 1993. V. 53. 6. sz. P. 1348-1353.
139. Weaver M., Laske D.W. Transzferrin receptor ligandum célzott toxin konjugátum (Tf-CRM107) rosszindulatú gliómák kezelésére. // J Neuroncol. 2003. V. 65. 1. sz. P. 3-13.
140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. A c-FLIP leszabályozása érzékenyíti a DU145 prosztatarák sejteket a Fas-közvetített apoptózisra. // Cancer Biol Ther. 2002. V. 1. 4. sz. P. 401-406.
141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. A chlorin e6 epidermális növekedési faktor által közvetített célzása szelektíven fokozza fotodinamikus aktivitását. // Cancer Res. 2000. V. 60. 8. sz. P. 2197-2202.
142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. EGF-ricin A konjugátumok: citotoxikus hatások és rezisztens sejtváltozatok kinetikai profilja. // Cell Struct Function. 1984. V. 9. 3. sz. P. 203-212.
143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. A pAntp peptid celluláris felvételének fizikai-kémiai követelményei. A lipidkötő affinitás szerepe. Eur J Biochem. 2001. V. 268. 5. sz. P. 1304-1314.
144. Vives E., Richard J. P., Rispal C., Lebleu B. TAT peptid internalization: seeking the mechaniz of entry. Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. 2. sz. P. 125-132.
145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Humán kalcitonin szegmensekből származó új daunorubicin-hordozó peptid konjugátumok. // J Mol Felismerés. 2003. V. 16. 5. sz. P. 280-287.
146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. A telomer gátlás és a telomer megszakítás, mint a gyógyszercélzás folyamatai. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. V. 43. P. 359-379.
147. Chomczynski P., Sacchi N. Az RNS izolálás egylépéses módszere savas guanidinium-tiocianát-fenol-kloroformos extrakcióval. // Analitikai biokémia. 1987. V. 162. 1. sz. P. 156159.
148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Az adenokarcinóma sejteket az új GnRH-PE66 kiméra toxin célozza meg specifikus gonadotropin-releasing hormon kötőhelyeken keresztül. J Biol Chem. 1997. V. 272. 17. sz. P. 11597-11603.
149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. Egy diftériatoxin-epidermális növekedési faktor fúziós fehérje citotoxikus a humán glioblasztóma multiforme sejtekre. // Cancer Res. 2003. V. 63. 8. sz. P. 1834-1837.
150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. Az epidermális növekedési faktor receptor megcélzása mellrák sejtvonalakban rekombináns ligandumfúziós toxinnal (DAB389EGF). // Cancer J Sci Am. 1996. V. 2. 3. sz. P. 175-180.
151. Turturro F. Denileukin diftitox: bioterápiás paradigmaváltás a limfoid eredetű rendellenességek kezelésében. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. 1. sz. P. 11-17.
152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox, mint új célzott terápia a limfoid rosszindulatú daganatok kezelésére. // Cancer Invest. 2007. V. 25. 6. sz. P. 495-501.
153. Duvic M., Talpur R. A denileukin diftitox (Ontak) terápia optimalizálása. // Future Oncol. 2008. V. 4. 4. sz. P. 457-469.
154. Foss F. Denileukin diftitoxszal (ONTAK) szerzett klinikai tapasztalat. // Semin Oncol. 2006. V. 33. 1. sz. Melléklet 3. P. SI 1-16.
155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. A krónikus limfocitás leukémia új terápiái. // Blood Rev. 2004. V. 18. 2. sz. P. 137-148.
156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox mint új célzott terápia non-Hodgkin limfómában // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. No. 2. P. 169-174.
157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: tömör klinikai áttekintés. // Expert Rev Anticancer Ther. 2005. V. 5. 1. sz. P. 33-38.
158. Black J.H., McCubrey J.A., Willingham M.C., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. A diftériatoxin-interleukin-3 fúziós fehérje (DT(388)IL3) meghosszabbítja a leukémiás immunhiányos egerek betegségmentes túlélését. // Leukémia. 2003. V. 17. 1. sz. P. 155-159.
159. Frankel A., Liu J.S., Rizzieri D., Hogge D. Diphtheria toxin-interleukin 3 fúziós fehérje I. fázisú klinikai vizsgálata akut mieloid leukémiában és myelodysplasiában szenvedő betegeknél. // Leuk limfóma. 2008. V. 49. 3. sz. P. 543-553.
160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. Az IL-4 és IL-13 pseudomonas exotoxinok: új remény az agydaganat-terápia számára. // Neurosurg Focus. 2006. V. 20. 4. sz. P. El 1.
161. Terápia temozolomiddal és anélkül újonnan diagnosztizált rosszindulatú gliomákban: 1. fázisú vizsgálat a végső biztonsági eredményekről. //Idegsebészet. 2008. V.P.
162. Jarboe J.S., Johnson K.R., Choi Y., Lonser R.R., Park J.K. Az interleukin-13 receptor alfa2 expressziója glioblastoma multiforme-ban: a célzott terápiák következményei. // Cancer Res. 2007. V. 67. 17. sz. P. 7983-7986.
163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: humán kiméra fehérjék új prototípusa célzott terápiához. FEBS Lett. 1999. V. 457. 2. sz. P. 271-276.
164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Az interleukin-2 (IL-2)-Bax hatásmechanizmusa, egy apoptózist indukáló kiméra fehérje, amely az IL-2-t expresszáló sejtek ellen irányul receptor // Biochem J. 2003. V. 370. No. Pt 1. P. 129-140.
165. Bergstrand C.G., Czar B. Új fehérjefrakció kimutatása emberi magzat szérumában. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. 2. sz. 174. o.
166. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., S.I.I. A magzati szérum a-globulin és szintézise transzplantálható egérhepatómákkal. // Biokémia. 1963. V. 28. 4. sz. R. 625-634.
167. Tatarinov Yu.S. Embriospecifikus a-globulin kimutatása elsődleges májrákos beteg vérszérumában. // Kérdés édesem. kémia. 1964. V. 10. R. 90-91.
168. Abelev G.I., Elgort D.A. Az alfa-fetoprotein a hepatocelluláris rák és a herék és a petefészkek teratocarcinoma immunológiai markere. // Onkológia. 1978. V. 10. R. 3-17.
169. Brock D.J., Bolton A.E., Monaghan J.M. Anencephalia prenatális diagnózisa anyai szérum-alfafetoprotein méréssel. // Lancet. 1973. V. 2. 7835. sz. P. 923-924.
170. Aitken D.A., Crossley J.A. Idegcső defektusok/alfa-fetoprotein/Down-szindróma szűrése // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. No. 2. P. 113-120.
171. Deutsch H.F. Az alfa-fetoprotein kémiája és biológiája. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.t» t i ng. zjj-j1z.
172. Luft A.J., Lorscheider F.L. Humán és szarvasmarha alfa-fetoprotein szerkezeti elemzése elektronmikroszkóppal, képfeldolgozással és cirkuláris dikroizmussal. // Biokémia. 1983. V. 22. 25. sz. P. 5978-5981.
173. Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake S., Ho S.K. A betegség-specifikus szérum alfa-fetoprotein izoformák szerkezete. // Br J Rák. 2000. V. 83. 10. sz. P. 1330-1337.
174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. A zsírsavak jelenléte az emberi alfa-fetoproteinben. J Biol Chem. 1978. V. 253. 7. sz. P. 2114-2119.
175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Az albumin és az alfa-fetoprotein gének tandem elrendezése a humán genomban. // Gene. 1984. V. 32. 3. sz. P. 255-261.
176. Lazarevics N.L. Az alfa-fetoprotein génexpresszió szabályozásának molekuláris mechanizmusai. // Biokémia. 2000. V. 65. 1. sz. R. 139-158.
177. Jose-Estanyol M., Danan J.L. A patkány alfa-fetoprotein promoteréhez egy májspecifikus faktor és egy nukleáris faktor I kötődik. J Biol Chem. 1988. V. 263. 22. sz. P. 10865-10871.
178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. A hepatocita nukleáris faktor 3 enyhíti az alfa-fetoprotein gén kromatin által közvetített represszióját. J Biol Chem. 1999. V. 274. 35. sz. P. 25113-25120.
179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. Az alfa-1-fetoprotein lókuszt a Drosophila FTZ- egy nukleáris receptora aktiválja F1 család. // Mol. Sejt. Biol. 1996. V. 16. 7. sz. P. 3853-3865.
180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. A ZHX2 az a-fetoprotein expresszió represszora humán hepatoma sejtvonalakban. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. 6b. sz. P. 2772-2780.
181. Van Reeth T., Gabant P., Szpirer C., Szpirer J. Az alfa-feioprotein promoter stimulálása unliganded thyroid hormone receptor által protein deacetilációval kapcsolatban. // Molekuláris és sejtes endokrinológia. 2002. V. 188. 1-2. P. 99-109.
182. Lienard P., De Mees C., Drnze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Az alfa-fetoprotein promoter szabályozása: Ku kötés és DNS térbeli konformáció. // Biochimie. 2006. V. 88. 10. sz. P. 1409-1417.
183. Mizejewski G.J. Az alfa-fetoprotein biológiai szerepe a terhesség és a perinatális fejlődés során. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. V. 229. 6. sz. P. 439-463.
184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. A humán alfa-fetoprotein zsírsavkötő helye. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. V. 196. 3. sz. P. 1049-1057.
185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Alfa-fetoprotein és albumin hatása patkány hepatomasejtek és magzati patkány hepatociták többszörösen telítetlen zsírsavak felvételére. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. 1. sz. P. 81-88.
186. Mizejewski G.J., Pass K.A. Zsírsavak, alfa-fetoprotein és cisztás fibrózis. // Gyermekgyógyászat. 2001. V. 108. 6. sz. P. 1370-1373.
187. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. A nehézfémek hatása az alfa-fetoproteinre vemhes egerek anyai szérumában és magzatvízében. // Toxikológia. 1990. V. 64. 1. sz. P. 19-32.
188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. A tisztított humán alfa-fetoprotein gátolja a sertés granulosa sejtek tüszőstimuláló hormon által stimulált ösztradiol termelését a tenyészetben. // Mol Cell Endocrinol. 1993. V. 94. 1. sz. P. 21-25.
189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Az ösztradiollal aktivált alfa-fetoprotein elnyomja az ösztrogénekre adott uterotrop választ. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. 9. sz. P. 2733-2737.
190. Jacobson H.I., Bennett J.A., Mizejewski G.J. Az ösztrogénfüggő emlőrák növekedésének gátlása az alfa-fetoprotein és az ösztradiol reakciótermékével. // Cancer Res. 1990. V. 50. 2. sz. P. 415-420.
191. Mizejewski G.J., Warner A.S. Az alfa-fetoprotein szabályozhatja a növekedést az éretlen és felnőtt petefészek-eltávolított egér méhében. // J Reprod Fertil. 1989. V. 85. 1. sz. P. 177-185.
192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Az egér alfa-fetoprotein belső antiuterotróp aktivitásának vizsgálata. // Tumorbiológia. 1986. V. 7. 1. sz. P. 19-36.
193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Terhességhormonok, alfa-feto fehérje és a mellrák kockázatának csökkentése. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. P. 477-484.
194. Mizejewski G.J. Az alfa-fetoprotein biológiai szerepe a rákban: a rákellenes terápia kilátásai. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. 6. sz. P. 709-735.
195. Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. Az alfa-fetoprotein elősegítő molekuláris mechanizmusa a humán hepatoma Bel7402 sejtvonal növekedésén. // World J Gastroenterol. 2002. V. 8. 3. sz. P. 469-475.
196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. Az alfa-fetoprotein intracelluláris mechanizmusa, amely elősegíti az NIH 3T3 sejtek proliferációját. Cell Res. 2002. V. 12. 2. sz. P. 151156.
197. Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. A HeLa sejtek proliferációjának fokozása az alfa-fetoprotein által. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Sanghaj). 2002. V. 34. 6. sz. P. 769-774.
198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alfa-fetoprotein: Az intracelluláris jel új tagja molekulák a PI3K/AKT jelátvitel szabályozásában humán hepatoma sejtvonalakban. // Int J Cancer. V.P.
199. Chakraborty M., Mandal C. Az emberi alfafetoprotein immunszuppresszív hatása: fajok közötti vizsgálat. // Immunol Invest. 1993. V. 22. 5. sz. P. 329-339.
200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. (alfa)-Fetoprotein Impairs APC Function and Induces Their Apoptosis. J Immunol. 2004. V. 173. 3. sz. P. 1772-1778.
201. Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Az autoimmun neuroinflammation javítása rekombináns humán alfa-fetoproteinnel. // Exp Neurol. 2006. V. 198. 1. sz. P. 136-144.
202. Cheresnev B.A., Rodionov S.Yu. Cherkasov V.A., Maljutina N.N., Orlov O.A. Alfa fetoprotein. Jekatyerinburg: az Orosz Tudományos Akadémia Uráli Fiókja; 2004.
203. Dudich E. MM-093, egy rekombináns humán alfa-fetoprotein a rheumatoid arthritis és más autoimmun betegségek lehetséges kezelésére. // Curr Opin Mol Ther. 2007. V. 9. 6. sz. P. 603-610.
204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. Az apoptózis gátlása alfa-fetoprotein (AFP) által és az AFP receptorok szerepe az anticelluláris öregedésben. // Anticancer Res. 1994. V. 14. 6B sz. P. 2429-2438.
205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. A protein-doxorubicin konjugátumok kemoterápiás hatékonysága multidrug rezisztens patkány hepatoma sejtvonalon in vitro. // Br J Rák. 1993. V. 67. 2. sz. P. 274-278.
206. Lubgan D., Jozwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. A doxorubicin-transzferrin konjugátum szelektíven legyőzi a multidrog rezisztenciát a leukémiás sejtekben. Cell Mol Biol Lett. 2009. V. 14. 1. sz. P. 113-127.
207. Sarti D.A., Crandall B.F., Winter J., Robertson R.D., Kaback N.M., Karp L.E. Biparietalis és magzati testátmérők összefüggése: 12-26 hetes terhesség. // A.J.R. Amerikai roentgenológiai folyóirat. 1981. V. 137. 1. sz. P. 87-91.
208. Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus P.E., Giaccone G. Topoisomerase Ilalpha és egyéb gyógyszerrezisztencia markerek előrehaladott nem-kissejtes tüdőrákban. // Tüdőrák. 2001. V. 32. 2. sz. P. 117-128.
209. Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Veleszületett kontraktikus arachnodactylia, keratoconus és valószínű Marfan-szindróma ugyanabban a származásban. // The Journal of Pediatrics. 1981. V. 98. 4. sz. P. 591-593.
210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Késői replikációs vizsgálatok humán X/13 transzlokációban: összefüggés az autoszomális génexpresszióval. // Citogenetika és sejtgenetika. 1981. V. 29. 4. sz. P. 215-220.
211. Uriel J., Villacampa M. J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Radioaktívan jelölt alfa-fetoprotein felvétele egér emlőkarcinómák által és hasznossága a tumorszcintigráfiában. // Cancer Res. 1984. V. 44. 11. sz. P. 5314-5319.
212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. A dinamin szerepe a klatrin bevonatú vezikulák képződésében. // Cold Spring Harbor szimpózium a kvantitatív biológiáról. 1995. V. 60. P. 235-242.
213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Alfafoetoprotein felvétel nikkel-indukált patkány rhabdomyosarcomából származó klónozott sejtvonalak által. // Br J Rák. 1983. V. 48. 2. sz. P. 261-269.
214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. Az alfa-foetoprotein felvétele C-1300 egér neuroblasztóma sejtek által. // Br J Rák. 1985. V. 51. 6. sz. P. 791-797.
215. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alfa-fetoprotein receptors in a human mellrák sejtvonal. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. 3. sz. P. 1322-1327.
216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Alfa-fetoprotein sejttípus-specifikus receptorai egér T-limfóma sejtvonalban. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. 10. sz. P. 3301-3305.
217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Egy specifikus alfa-fetoprotein receptor izolálása és részleges jellemzése humán monocitákon. // J Clin Invest. 1992. V. 90. 4. sz. P. 1530-1536.
218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Alfa-fetoprotein (AFP)/receptor autokrin hurok aktiválása HT-29 humán vastagbél karcinóma sejtekben. // Int J Cancer. 1991. V. 49. 3. sz. P. 425430.
219. Torres J. M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Alfa-fetoprotein receptorok expressziója humán T-limfociták által blasztikus transzformáció során. Mol Immunol. 1989. V. 26. 9. sz. P. 851-857.
220. Biddle W., Sarcione E.J. Specifikus citoplazmatikus alfa-fetoprotein-kötő fehérje MCF-7 humán emlőráksejtekben és elsődleges mellrákszövetben. // Breast Cancer Res Treat. 1987. V. 10. 3. sz. P. 279-286.
221. Mizejewski G.J. Alfa-fetoprotein-kötő fehérjék: a transzmembrán áthaladásra és a szubcelluláris lokalizációra gyakorolt hatások. // Life Sci. 1995. V. 56. 1. sz. P. 1-9.
222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoklonális irányított antitestek egy széles körben elterjedt onkofetális antigén: az alfa-fetoprotein receptor ellen. // Tumor Biol. 1993. V. 14. 2. sz. P. 116-130.
223. Kanevszkij V., Pozdnyakova L.P., Aksenova O.A., Severin S.E., Katukov V., Severin E.S. AFP-kötő fehérjék izolálása és jellemzése daganatos és magzati emberi szövetekből. Biochem Mol Biol Int. 1997. V. 41. 6. sz. P. 1143-1151.
224. Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Alfa-fetoprotein és albumin specifikus felvétele patkány Morris 7777 hepatomasejtek által. // Tumor Biol. 1999. V. 20. 1. sz. P. 52-64.
225. Mizejewski G.J., MacColl R. Alfa-fetoprotein növekedést gátló peptidek: potenciális vezetők a rákterápiához. // Mol Cancer Ther. 2003. V. 2. 11. sz. P. 1243-1255.
226. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Alfa-fetoprotein eredetű szintetikus peptidek: ösztrogénmódosító szabályozó szegmens vizsgálata. // Mol Cell Endocrinol. 1996. V. 118. 1-2. P. 15-23.
227. Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Az alfa-fetoprotein gátolja a béka metamorfózisát: a fehérje motívum megőrzésének következményei. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. V. 124. 1. sz. P. 39-45.
228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Az alfa-fetoprotein és a származtatott peptidek hatása az inzulin és az ösztrogén által kiváltott magzati toxicitásra. // Magzati diagnosztika Ther. 2003. V. 18. 5. sz. P. 360-369.
229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Alfa-fetoproteinből és néhány analógból származó növekedést gátló peptid vizsgálata. // J Pept Res. 2001. V. 57. 1. sz. P. 29-38.
230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Tanulmányok egy alfa-fetoproteinből származó peptid analógjain, amelyek növekedést gátló tulajdonságokkal rendelkeznek. // J Pept Res. 2001. V. 57. 6. sz. P. 539-546.
231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Alfa-fetoprotein eredetű növekedést gátló peptidek funkcionális aktivitásainak felmérése: áttekintés és kilátások. Curr Protein Pept Sci. 2006. V. 7. 1. sz. P. 73-100.
232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. A növekedést gátló peptid áttekintése bioterápiás szerként a tumor növekedéséhez, adhéziójához és metasztázisához. // Cancer Metastasis Rev. 2005. V. 24. 3. sz. P. 441-467.
233. Vakharia D., Mizejewski G.J. A humán alfa-fetoprotein peptidek megkötik az ösztrogénreceptort és az ösztradiolt, és elnyomják a mellrák kialakulását. // Breast Cancer Res Treat. 2000. V. 63. 1. sz. P. 41-52.
234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Studies on 99mTc-labeling of the modified fragment of human alfa-fetoprotein (P149-QY). // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2008. V. 275. 1. sz. P. 101-107.
235. Linton K.J., Higgins C.F. Az Escherichia coli ATP-kötő kazetta (ABC) fehérje. Mol Microbiol. 1998. V. 28. 1. sz. P. 5-13.
236. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. The human ATP-binding cassette (ABC) transzporter szupercsalád. // Genome Res. 2001. V. 11. 7. sz. P. 1156-1166.
237. Dean M., Annilo T. Evolution of the ATP-binding cassette (ABC) transzporter szupercsalád gerincesekben. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. V. 6. P. 123-142.
238. Riordan J.R., Ling V. P-glikoprotein tisztítása csökkent kolhicin-permeabilitással rendelkező kínai hörcsög petefészek-sejt-mutánsok plazmamembrán-vezikuláiból. J Biol Chem. 1979. V. 254. 24. sz. P. 12701-12705.
239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC transzporterek: a változás ereje. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10. 3. sz. P. 218-227.
240. Choi C.H. Az ABC transzporterek mint multidrog rezisztencia mechanizmusok és kemoszenzibilizátorok fejlesztése ezek visszafordítására. // Cancer Cell Int. 2005. V. 5. P. 30.
241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Endo- és xenobiotikumok transzmembrán transzportja emlős ATP-kötő kazettás multidrog rezisztencia fehérjék által. Physiol Rev. 2006. V. 86. 3. sz. P. 849-899.
242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, kemoterápia és kromatin remodeling. // Cancer Biol Ther. 2004. V. 3. 9. sz. P. 819-824.
243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. A humán multidrog rezisztencia 1 gén transzkripciós szabályozói: legújabb nézetek. Biochem Pharmacol. 2002. V. 64. 5-6. P. 943-948.
244. Breier A., Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-glikoprotein – neoplasztikus sejtek metabolizmusának hatásai és a rákterápia. // Curr Cancer Drug Targets. 2005. V. 5. 6. sz. P. 457-468.
245. Doz F., Roosen N., Rosenblum M.L. Metallothionein és rákellenes szerek: a metallotionein szerepe a rák kemoterápiájában. // J Neuroncol. 1993. V. 17. 2. sz. P. 123-129.
246. Lazo J.S., Basu A. Metallothionein expresszió és átmeneti rezisztencia elektrofil antineoplasztikus gyógyszerekkel szemben. // Semin Cancer Biol. 1991. V. 2. 4. sz. P. 267-271.
247. Chen A.Y., Liu L.F. DNS topoizomerázok: esszenciális enzimek és halálos célpontok. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. V. 34. P. 191-218.
248. Makin G. Az apoptózis megcélzása a rák kemoterápiájában. // Expert Opin Ther Targets. 2002. V. 6. 1. sz. P. 73-84.
249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2., Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,
250. P "RAPPAG \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct lomlag nolle +A Lionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/YCH/I VI 1U11VUU11 JVllJiU^UJl WUU11 JVllJiU^UJl1/1l. W1. X*A\/1 / WHO IU WlOUlUlill ШШШpentoxifylline // Cancer Res. 1995. V. 55. No. 8. P. 1649-1654.
251. Sarkar R., Jain R.K., Puri P. Melasma indiai hímekben. // Dermatol Surg. 2003. V. 29. 2. sz. 204. o.
252. Smith D.J., Ng H., Kluck R.M., Nagley P. A sejthalál mitokondriális kapuja. // IUBMB Life. 2008. V. 60. 6. sz. P. 383-389.
253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Mitokondriális hordozók és pórusok: a mitokondriális apoptotikus program kulcsfontosságú szabályozói? // Apoptózis. 2007. V. 12. 5. sz. P. 869-876.
254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. Irodalmi áttekintés a citotoxikus kemoterápiára adott klinikai választ előrejelző molekuláris markerekről mellrákos betegeknél. // Int J Clin Oncol. 2009. V. 14. 2. sz. P. 112-119.
255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. 2-3. P. 229-249.
256. Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. A Bcl-2 klinikai vizsgálatai és a kezelés előnyei emlőrákos betegeknél. // Endocr Relat Cancer. 1999. V. 6. 1. sz. P. 61-68.
257. Adams J. M., Cory S. Bcl-2 által szabályozott apoptózis: mechanizmus és terápiás potenciál. Curr Opin Immunol. 2007. V. 19. 5. sz. P. 488-496.
258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Egy citozin analóg közvetlen megfigyelése, amely guanozinnal öt hidrogénkötést hoz létre: guanidino G-clamp. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. V. 41. 1. sz. P. 115-117.
259. Cowling V.H., Cole M.D. A Myc onkoproteinek transzkripciós aktiválásának mechanizmusa. // Semin Cancer Biol. 2006. V. 16. 4. sz. P. 242-252.
260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Rákterápia: a Myc sötét oldalának megcélzása. // Eur J Rák. 2005. V. 41. 16. sz. P. 2485-2501.
261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. A DNS-replikáció nem transzkripciós kontrollja szerző: c-Myc. //Természet. 2007. V. 448. 7152. sz. P. 445-451.
262. Spencer C.A., Groudine M. A c-myc szabályozás szabályozása normál és neoplasztikus sejtekben. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. P. 1-48.
263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. MYC onkogének és humán neoplasztikus betegség. //Onkogén. 1999. V. 18. 19. sz. P. 3004-3016.
264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Az angiogenezis és az adipocita differenciálódás parakrin szabályozása az in vivo adipogenezis során. // Circ Res. 2003. V. 93. 9. sz. P. e88-97.
265. Sears R.C. A C-myc életciklusa: a szintézistől a lebomlásig. // Sejtciklus. 2004. V. 3. 9. sz. P. 1133-1137.
266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. A spontán autochton daganatok és izotranszplantátumaik antiangiogenezis kezelésére adott válaszok. // Cancer Res. 2003. V. 63. 4. sz. P. 747-751.
267. Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc Is a Metastasis Gene for Non-Small-Cell Lung Cancer. // PLoS One. 2009. V. 4. 6. sz. P. e6029.
268. Ahmed F.E. Molekuláris markerek, amelyek előrejelzik a vastagbélrák-terápiára adott választ. // Expert Rev Mol Diagn. 2005. V. 5. 3. sz. P. 353-375.
269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. A növekedési faktor és az ösztrogén jelátvitel és az endokrin rezisztencia downstream célpontjai: a c-Myc, a ciklin Dl és a ciklin E lehetséges szerepei. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12. melléklet 1. P. S47-59.
270. Blackburn E.H. Telomerek: szerkezet és szintézis. J Biol Chem. 1990. V. 265. 11. sz. P. 5919-5921.
271. Olovnikov A.M. A marginotómia elmélete. A templátmargó nem teljes másolása a polinukleotidok enzimes szintézisében és a jelenség biológiai jelentősége. // J Theor Biol. 1973. V. 41. 1. sz. P. 181-190.
272. Wright W.E., Shay J.W. A sejtek öregedését és halhatatlanságát szabályozó kétlépcsős mechanizmus. // Exp Gerontol. 1992. V. 27. 4. sz. P. 383-389.
273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Telomere építészet. // EMBO Rep. 2002. V. 3. 12. sz. P. 1139-1145.
274. Liu J.P. A telomeráz aktivitás szabályozásának molekuláris mechanizmusainak vizsgálata. // FASEB J. 1999. V. 13. 15. sz. P. 2091-2104.
275. Wu K.J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. A TERT transzkripció közvetlen aktiválása c-MYC által. // Nat Genet. 1999. V. 21. 2. sz. P. 220224.
276. Tian X., Chen B., Liu X. Telomer és telomeráz, mint célpontok a rákterápiában. // Appl Biochem Biotechnol. V. 160. 5. sz. P. 1460-1472.
277. Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. A liposzóma összetétele fontos a liposzómális rodamin megtartásához a P-glikoproteint túltermelő rákos sejtekben. // Drug Deliv. 2009. V. 16. 5. sz. P. 261-267.
278. Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Liposome-encapsulated daunorubicin for PGP-related multidrug rezisztencia. // Br J Haematol. 1999. V. 106. 1. sz. P. 92-99.
279. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tamaoki T. Primary structures of human alfa-fetoprotein and its mRNS. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. 15. sz. P. 4604-4608.
280. Bogush T., Robert J. Az idarubicin és daunorubicin intracelluláris felhalmozódásának és DNS-kötődésének összehasonlító értékelése érzékeny és multirezisztens humán leukémia K562 sejtekben. // Anticancer Res. 1996. V. 16. 1. sz. P. 365-368.
281. Cartier R., Reszka R. Maglokalizációs szignálokat tartalmazó szintetikus peptidek hasznosítása nem vírusos géntranszfer rendszerekben. // Gene Ther. 2002. V. 9. 3. sz. P. 157-167.
282. Collas P., Alestrom P. Nukleáris lokalizációs jelek: a plazmid DNS nukleáris transzportjának hajtóereje zebradánban. Biochem Cell Biol. 1997. V. 75. 5. sz. P. 633-640.
283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Olvassa el M.L. A nukleáris lokalizációs szekvenciapeptidek képességét befolyásoló tényezők a nem vírusos génszállítás fokozására. // Biokonjugált kémia. 2003. V. 15. 1. sz. P. 152-161.
284. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. 2"-0-2-[(N,N-dimetilamino)oxi-etil]-módosított nukleozidok és oligonukleotidok szintézise. // J Org Chem. 2002. V. 67. No. 2. P. 357-369.
285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Doxorubicin-transferrin conjugate citotoxikus hatásai multidrug-rezisztens KB sejtekben. Biochem Pharmacol. 1996. V. 51. 4. sz. P. 489-493.
286. Lemieux P., Page M. Multidrug-rezisztens MCF-7 sejtek érzékenysége transzferrin-doxorubicin konjugátumra. // Anticancer Res. 1994. V. 14. 2A. sz. P. 397-403.
287. Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Cellular accumulation and cytotoxicity of makromolekuláris platina komplexek cisplatin-rezisztens tumorsejtekben. // J Control Release. 2008. V. 131. 2. sz. P. 100-106.
288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Multidrug-rezisztens KB-C1 sejtek érzékenysége antitest-dextrán-adriamicin konjugátumra. // Anticancer Res. 1989. V. 9. 3. sz. P. 637-641.
289. Chitambar C.R. Galliumvegyületek, mint daganatellenes szerek. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. 6. sz. P. 547-552.
290. Ehrlich P. A sejtek részleges funkciója. (1908. december 11-én, Stockholmban a Nobel-díjas beszéd). // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. V. 5. 2. sz. P. 67-86.
291. Mészáros E.C., Weissman I.L. A sejtek közvetlen fluoreszcens jelölése fluoreszceinnel vagy rodamin-izotiocianáttal. I. Technikai szempontok. // J Immunol Methods. 1980. V. 37. 2. sz. P. 97108.
292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. HLA I. osztályú molekulák áramlási citofluorimetriás mérése klónozott HLA-génekkel transzformált egérsejtek felszínén. // J Immunol Methods. 1983. V. 61. 3. sz. P. 301-315.
293. Fenton C., Perry C.M. Reflektorfényben a gemtuzumab ozogamicin az akut mieloid leukémiában. // BioDrugs: klinikai immunterápia, biogyógyszerek és génterápia. 2006. V. 20. 2. sz. P. 137-139.
294. Torres J. M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediált endocitózis és az alfa-fetoprotein újrahasznosítása humán B-limfóma és T-leukémia sejtekben. // Int J Cancer. 1991. V. 47. 1. sz. P. 110-117.
295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Alfa-fetoprotein/receptor útvonal aktiválása emberi normál és rosszindulatú perifériás vér mononukleáris sejtekben. // Leukémia. 1993. V. 7. 11. sz. P. 1807-1816.
296. Biaglow J.E., Miller R.A. A tioredoxin reduktáz / tioredoxin rendszer: új redox célok a rákterápiában. // Cancer Biol Ther. 2005. V. 4. 1. sz. P. 6-13.
297. Arunachalam V., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Diszulfidkötések enzimatikus redukciója lizoszómákban: gamma-interferonnal indukálható lizoszómális tiolreduktáz (GILT) jellemzése. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. 2. sz. P. 745-750.
298. Kooistra T., Millard P.C., Lloyd J.B. A tiolok szerepe a fehérjék katepsinek általi lebontásában. // Biochem J. 1982. V. 204. 2. sz. P. 471-477.
299. Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Diszulfid kötések hasítása endocitált makromolekulákban. Lizoszómákkal vagy endoszómákkal nem kapcsolatos feldolgozás. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx y y V/ . t^■v<-л. л. » x w I vy v x v f w
300. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Hasonlóság a természetes és a rekombináns humán alfa-fetoprotein között, mint az ösztrogénfüggő emlőrák növekedésének inhibitorai között. // Breast Cancer Res Treat. 1997. V. 45. 2. sz. P. 169-179.
301. DiMarco A. Adriamycin (NSC-123127): hatásmechanizmus és hatásmechanizmus. // Rák kemoterápia. Ismétlés. 1975. V. 6. P. 91-106.
302. Hamza A., Sarma M.H., Sarma R.H. Egy alfa-fetoprotein ciklopeptid valószínű kölcsönhatása a G-protein-kapcsolt receptormodellel, GPR30: dokkoló vizsgálat molekuláris dinamikával szimulált annealing segítségével. // J Biomol Struct Dyn. 2003. V. 20. 6. sz. P. 751-758.
303. Tan W., Loke Y.H., Stein C.A., Miller P., Colombini M. A foszforotioát oligonukleotidok blokkolják a VDAC csatornát. // Biophys J. 2007. V. 93. 4. sz. P. 1184-1191.
304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. A G3139 farmakológiai célpontja a melanomasejtekben a mitokondriális VDAC lehet. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. No. 19. P. 7494-7499.
305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein C.A., Colombini M. A foszforotioát oligonukleotidok csökkentik a mitokondriális külső membrán ADP permeabilitását. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. V. 292. 4. sz. P. C1388-1397.
306. Carpenter G., Cohen S. Epidermális növekedési faktor. // Annu Rev Biochem. 1979. V. 48. P. 193-216.
307. Saeki T., Takashima S., Tachibana M., Koga M., Hiyama E., Salomon D. S., Holland J. F., Ohnuma T. Telomer-utánzó foszforotioát oligodezoxi nukleotidok (S-ODNS) gátló hatása humán tumorsejtvonalakra . // Onkológia. 1999. V. 57 Suppl 2. P. 27-36.
308. oldal T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. Az egyszálú telomer utánzók citotoxikus hatásai az OMA-BL1 sejteken. // Exp Cell Res. 1999. V. 252. 1. sz. P. 41-49.
309. Berkers J.A., van Bergen és Henegouwen P.M., Boonstra J. Az epidermális növekedési faktor receptorok három osztálya a HeLa sejteken. J Biol Chem. 1991. V. 266. 2. sz. P. 922-927.
310. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Emberi rosszindulatú daganatok gyógyszerérzékenységének fokozása epidermális növekedési faktorral. // Br J Rák. 1995. V. 72. 3. sz. P. 615-619.
311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molecular manifestations and molecular determinants of telomer capping. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. P. 253-263.
312. Collas P., Alestrom P. A nukleáris lokalizációs jelek fokozzák a transzgén csíravonali átvitelét zebradánban. // Transgenic Res. 1998. V. 7. 4. sz. P. 303-309.
313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Egy új peptidvektor oligonukleotidok hatékony bejuttatására emlőssejtekbe. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. 14. sz. P. 2730-2736.
314. Sinha B.K., Politi P.M. Antraciklinek. // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1990. V. 11. P. 45-57.
315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamicinek, az erős daganatellenes antibiotikumok osztálya: hatásmechanizmus. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. 1. sz. P. 2-6.
316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Az MSN-1 monoklonális antitest adriamicin immunkonjugátumának szelektív citotoxicitása endometriális adenokarcinómára in vitro és in vivo. // Oncol Rep. 2000. V. 7. 5. sz. P. 1099-1106.
317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. A C-erbB-2 terméket felismerő adriamicin immunkonjugátum hatékonysága mellrák sejtvonalakon. // Surg Today. 1996. V. 26. 7. sz. P. 501-507.
318. Yamamoto K., Acton E.M., Henry D.W. A daunorubicin egyes származékainak daganatellenes hatása az amino- és metil-keton-funkciókban. // Journal of Medicinal Chemistry. 2002. V. 15. 8. sz. P. 872-875.
319. Arnon R., Sela M. Daunomicin és daganatellenes antitestek konjugátumainak in vitro és in vivo hatékonysága. Immunol Rev. 1982. V. 62. P. 5-27.
320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. A daunomicin és adriamicin kovalens kötődése antitestekhez, mind a gyógyszerek, mind az antitestaktivitások megtartásával. // Cancer Res. 1975. V. 35. 5. sz. P. 1175-1181.
321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. Az antiszensz terápia jövője: kombináció a rákellenes kezelésekkel. //Onkogén. 2003. V. 22. 42. sz. P. 6579-6588.
Kérjük, vegye figyelembe, hogy a fent bemutatott tudományos szövegek csak tájékoztató jellegűek, és eredeti disszertációszöveg-felismeréssel (OCR) szerezték be. Ezért tökéletlen felismerési algoritmusokhoz kapcsolódó hibákat tartalmazhatnak. Az általunk szállított szakdolgozatok és absztraktok PDF-fájljaiban nincsenek ilyen hibák.
Hasonló cikkek
-
Hogyan készítsünk zebratortát a sütőben
A tojásokat a cukorral, a sóval és a vaníliás cukorral habosra keverjük. Majd a kapott masszához adjuk az olvasztott és kihűlt vajat és az ecettel locsolt szódát. A liszt teljes tömegéből különíts el 3 evőkanál...
-
Mit kell főzni körtéből gyorsan és ízletesen
Néha a receptek lapjait lapozgatva a fotóra fókuszálunk, és szemünkkel megesszük a képet. Pontosan a képen látható módon szeretnénk elkészíteni, de... a recepteket követve és próbálkozva néha azt vesszük észre, hogy a fotó és az igazi desszert nagyon más...
-
Hogyan kell főzni a pulykafilét
A pulykahús egyre gyakrabban kezdett megjelenni az asztalainkon. És ez nem meglepő, mivel a pulykahús hasznos anyagok tartalma sokkal magasabb, mint bármely más baromfiban. Ez egy diétás termék, amely ajánlott...
-
Hogyan kell helyesen főzni a zselét egy csomagból
A kissel egyike azoknak az italoknak (vagy ételeknek), amelyeket gyermekkorunk óta szeretünk. Ebben a cikkben megtudhatja, hogyan kell főzni a zselét. Sokféle recept létezik, de mielőtt elolvasnád, jó tudni egy kicsit...
-
Saláta uborkával és kolbásszal - ízlésesen elkészítve!
Az uborkát és a kolbászt is lehet enni, de jobb, ha salátát készítünk. Rengeteg recept létezik ezeken a népszerű összetevőkön. Mindegyik különbözik a termékek kombinációjában, beleértve a fűszereket, önteteket, de egységesek...
-
Az egészséges teljes kiőrlésű kenyér arányban áll a boltok polcain található névvel és minőséggel?
Kenyérgéppel nagyon könnyen lehet tápláló és egészséges teljes kiőrlésű kenyeret sütni. Ha azonban nincs ilyen egység, akkor is süthet kenyeret a sütőben. Mérsékelt sűrűséggel és csodálatos aranybarna és ropogós kéreggel derül ki....