Oligonukleotyd to krótki fragment kwasu nukleinowego o długości mniejszej niż 50 nukleotydów. W ciągu ostatnich 20 lat znaczenie rozszerzyło się i obejmuje wszystkie chemicznie syntetyzowane kwasy nukleinowe, niezależnie od długości. Pierwsza publikacja na temat celowanej syntezy chemicznej oligonukleotydu ukazała się w 1955 roku.

Od tego czasu co roku syntetyzuje się miliony oligonukleotydów do użytku w laboratoriach na całym świecie. Większość badań wymaga jedynie niewielkich ilości DNA. Do stosowania w badaniach biofizycznych (NMR i krystalografia rentgenowska) potrzebne są znacznie większe ilości DNA (10 µmol i więcej), dlatego aby umożliwić syntezę tak dużych ilości, opracowano metody syntezy w fazie stałej, które pozwalają na wykorzystanie oligonukleotydy jako cząsteczki leku (np. oligonukleotydy antysensowne).

Synteza oligonukleotydów DNA lub RNA odnosi się do chemicznej syntezy fragmentów kwasów nukleinowych o określonych strukturach chemicznych lub sekwencjach o różnej wielkości.

Ryc.1. Struktury oligonukleotydów.

Zasada syntezy w fazie stałej została po raz pierwszy opracowana i zastosowana do syntezy polipeptydów przez Roberta Bruce'a Merrifielda, amerykańskiego biochemika, który w 1984 roku otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za wynalezienie syntezy peptydów w fazie stałej. Uświadomił sobie, że kluczem do udanej syntezy jest zakotwiczenie pierwszego monomeru w nierozpuszczalnej fazie stałej polimeru. Następnie można przyłączać inne monomery, jeden po drugim, do stacjonarnego końcowego końca rosnącego polimeru. Pod koniec syntezy gotowy łańcuch polimeru można odłączyć od nierozpuszczalnego polimeru i oczyścić. Proces ten był przez lata optymalizowany, aby stał się wysoce wydajny, a obecnie stał się podstawową metodą stosowaną w zautomatyzowanych syntezatorach oligonukleotydów.

Aby zapewnić pomyślną syntezę oligonukleotydów, konieczne są następujące warunki:

• Wszystkie odczynniki muszą być rozpuszczalne w rozpuszczalnikach niewodnych.
• Grupy aminowe i hydroksylowe zasad nukleotydowych i reszt węglowodanowych muszą być odpowiednio zablokowane.
• Grupy zabezpieczające wprowadzone podczas syntezy muszą być trwałe w warunkach wydłużania łańcucha podczas tworzenia międzynukleotydowego wiązania fosfodiestrowego.
• Grupy zabezpieczające muszą być na tyle labilne, aby można je było usunąć na końcu syntezy bez uszkodzenia produktów reakcji.

Funkcje oligonukleotydów i perspektywy ich zastosowania

Obecnie oligonukleotydy i ich analogi są szeroko stosowane w różnych dziedzinach, takich jak medycyna i badania z zakresu biologii molekularnej, a także są uważane za obiecujące środki terapeutyczne i sondy do diagnostyki molekularnej.

W ciągu ostatnich 20 lat stosunkowo dobrze zbadano tylko dwa typy analogów kwasów nukleinowych o formalnie elektrycznie obojętnym szkielecie: peptydowe kwasy nukleinowe i fosfodiamidomorfolino oligonukleotydy. Analogi obu typów mają zdolność komplementarnego wiązania się z naturalnymi cząsteczkami DNA i RNA, dzięki czemu znalazły zastosowanie zarówno w biologii molekularnej, jak i zwłaszcza w medycynie jako potencjalne leki.

Ponadto wraz z rozwojem technologii DNA stało się możliwe badanie ekspresji znanych genów, określanie mutacji w genomach różnych organizmów i diagnozowanie szeregu chorób zakaźnych. W rozwiązaniu tych problemów najbardziej obiecujące jest wykorzystanie chipów DNA, czyli małych płytek, na których powierzchni osadzone są fragmenty DNA.

Metoda tworzenia chipów DNA łączy metody oparte na ukierunkowanej syntezie oligonukleotydów bezpośrednio na powierzchni chipa. Synteza odbywa się poprzez stopniowe dodawanie do rosnącego łańcucha oligonukleotydowego nukleotydów zawierających na końcu 5' labilną grupę zabezpieczającą, której usunięcie jest możliwe pod wpływem promieniowania świetlnego, napięcia elektrycznego lub podczas hydrolizy kwasowej.

Wykazano także, że oligonukleotydy ukierunkowane genowo, w zależności od wybranego genu docelowego, wyróżniają się znaczną różnorodnością działania modulującego na tkanki nowotworowe, począwszy od spowolnienia i zatrzymania proliferacji komórek nowotworowych, aż po tłumienie ich właściwości inwazyjnych.

Leki przeciwnowotworowe na bazie kwasów nukleinowych stanowią wysoce specyficzne narzędzie modulowania ekspresji genów. Supresję szeregu genów, których nienormalnie wysoka ekspresja zachodzi podczas transformacji nowotworowej, można osiągnąć stosując leki na bazie kwasów nukleinowych, takie jak oligonukleotydy antysensowne (asON). Ogólnie rzecz biorąc, mechanizmem tłumienia ekspresji genów jest ich komplementarne wiązanie z docelowym mRNA, po czym docelowy mRNA zostaje albo rozszczepiony, albo zablokowany jest proces jego translacji.

asON to syntetyczne jednoniciowe DNA o długości 15–20 nukleotydów. Ostatnio uzyskano asON, które mogą zakłócać transport splicowanego mRNA z jądra do cytoplazmy, a także asON, które blokując miejsce splicingu w pre-mRNA, mogą prowadzić do ekspresji alternatywnego białka wariant.

Ze względu na fakt, że naturalne oligodeoksyrybonukleotydy w hodowli komórkowej oraz in vivo ulegają szybkiej degradacji pod działaniem nukleaz, do struktury asON wprowadza się różne modyfikacje chemiczne w celu zwiększenia ich stabilności.

Synteza chemiczna oligonukleotydów

Synteza w fazie stałej jest szeroko stosowana w syntezie peptydów, syntezie oligonukleotydów, syntezie oligosacharydów i chemii kombinatorycznej. Synteza chemiczna na fazie stałej została wynaleziona w latach 60. XX wieku przez Bruce'a Merrifielda i otrzymała Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1984 r.

Syntezę w fazie stałej prowadzi się na podłożu stałym, pomiędzy filtrami, w kolumnach przepuszczających wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki. Synteza w fazie stałej ma wiele zalet w porównaniu z syntezą w roztworze:

 zapewnia dużą szybkość reakcji

 zanieczyszczenia i nadmiar odczynników są zmywane, dzięki czemu czyszczenie po każdym etapie nie jest wymagane

 proces można zautomatyzować za pomocą sterowanych komputerowo syntezatorów fazy stałej.

Stałe nośniki (zwane także żywicami) to nierozpuszczalne w wodzie cząstki, zazwyczaj o średnicy 50-200 mikronów, do których przyłączany jest oligonukleotyd podczas syntezy.

Istnieją dowody na to, że jednym z najskuteczniejszych materiałów, który można zastosować jako stały nośnik, jest szkło porowate. Jest dość sztywny i nie pęcznieje. W jego głębokich porach zachodzi synteza oligonukleotydów. Szkło zawiera pory o średnicy 500 Å (50 nm), które nadają się do syntezy krótkich oligonukleotydów. Jednakże nie nadaje się dobrze do syntezy oligonukleotydów o długości większej niż 40 zasad. Dzieje się tak dlatego, że rosnący oligonukleotyd blokuje pory i ogranicza dyfuzję odczynników przez matrycę.

Stałe nośniki do konwencjonalnej syntezy oligonukleotydów typowo formułuje się z zawartością 20-30 µmol nukleozydu na gram żywicy. Synteza oligonukleotydów przy wyższych obciążeniach staje się mniej wydajna z powodu zawady przestrzennej pomiędzy sąsiadującymi niciami DNA przyłączonymi do żywicy.

Etapy syntezy chemicznej oligonukleotydów

Synteza oligofosfoamidów zachodzi w kierunku od 3′ do 5′ (w przeciwieństwie do kierunku biosyntezy DNA w kierunku od 5′ do 3′ podczas replikacji DNA). Na cykl syntezy dodaje się jeden nukleotyd.

Ryż. 2. Synteza cyklu oligonukleotydów fosforoamidowych

Na początku syntezy oligonukleotydów pierwszy nukleozyd jest wstępnie przyłączany do żywicy (nośnika) i wybierane są kolumny syntezy A, G, C lub T w zależności od nukleozydu na końcu 3' pożądanego oligonukleotydu. Zakotwiczony nukleozyd ma grupę zabezpieczającą 5′-DMT (DMT = 4,4′-dimetoksytrityl), której rolą jest zapobieganie polimeryzacji i tę grupę zabezpieczającą należy usunąć (detrytylacja). Mechanizm detrylacji pokazano na rycinie 3.

Ryc.3. Mechanizm usuwania grupy zabezpieczającej.

Po detrytylacji zakotwiczony nukleozyd jest gotowy do reakcji z następną zasadą, która jest dodawana jako monomer fosforoamidanowy nukleozydu. Duży nadmiar odpowiedniego nukleozydu miesza się z aktywatorem (tetrazolem lub jego pochodnymi). Grupa diizopropyloaminowa nukleozydu jest protonowana przez aktywator i w ten sposób staje się grupą łatwo odłączalną. Jest on szybko wypierany przez grupę 5′-hydroksylową związanego nukleozydu, tworząc trójester fosforynowy (ryc. 4).

Ryc.4. Mechanizm protonowania przez aktywator.

Fosforoamidyty nukleozydów są dość stabilne w obojętnej atmosferze i można je wytwarzać w dużych ilościach, wysyłać na cały świat i przechowywać w postaci suchej substancji stałej przez kilka miesięcy przed użyciem.

Jednak nawet przy bardzo precyzyjnych pracach nad syntezą oligonukleotydów istnieje możliwość, że będzie kilka nieprzereagowanych grup 5′-hydroksylowych, które będą dostępne do udziału w kolejnym etapie. Jeśli takie zaburzenie nie zostanie zatrzymane, będą one kumulować się z każdym kolejnym cyklem, a produktem końcowym będzie złożona mieszanina oligonukleotydów, z których większość będzie zawierała nieprawidłową informację genetyczną.

Dlatego sposób acetylowania grup 5′-hydroksylowych czyni je obojętnymi w stosunku do późniejszej reakcji. Jest to również konieczne, aby zminimalizować zanieczyszczenia.

Triester fosforynowy (P(III)) powstały na etapie dodawania jest niestabilny w stosunku do kwasów i musi zostać przekształcony w stabilną formę (P(V)). Osiąga się to poprzez utlenianie jodu w obecności wody i pirydyny (ryc. 5). Powstały fosfotriester jest w rzeczywistości osią DNA zabezpieczoną grupą 2-cyjanoetylową. Grupa cyjanoetylowa zapobiega niepożądanym reakcjom z fosforem podczas kolejnych cykli syntezy.

Ryc.5. Mechanizm etapu utleniania.

Następnie należy usunąć grupę zabezpieczającą DMT na końcu 5' nici DNA, aby pierwszorzędowa grupa hydroksylowa mogła zareagować z fosforoamidanem następnego nukleotydu. Reakcja odbezpieczania za pomocą kwasu trichlorooctowego w dichlorometanie jest szybka. Cykl powtarza się raz dla każdej zasady, aż do otrzymania pożądanego oligonukleotydu.

Następnie konieczne jest odłączenie zsyntetyzowanego oligonukleotydu od stałego podłoża. W tym przypadku stosuje się sukcynyl. Rozdzielenie jest możliwe poprzez działanie stężonym wodnym roztworem amoniaku w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę (rys. 6).

Ryc.6. Mechanizm oddzielania oligonukleotydu od stałego nośnika w stężonym wodnym roztworze amoniaku.

W niektórych syntezatorach reakcja rozszczepienia jest przeprowadzana automatycznie, a roztwór amoniaku zawierający oligonukleotyd jest uwalniany do szklanej fiolki. Alternatywnie, trawienie można przeprowadzić ręcznie, wyjmując kolumnę z syntezatora i przepłukując ją w strzykawkach zawierających wodorotlenek amonu.

Oligonukleotyd rozpuszcza się w stężonym wodnym roztworze amoniaku, a następnie ogrzewanie usuwa grupy zabezpieczające z zasad heterocyklicznych i fosforanów. Następnie wodny roztwór usuwa się przez odparowanie i oligonukleotyd jest gotowy do oczyszczania.

Oprócz grupy zabezpieczającej DMT wymagane są także dodatkowe grupy zabezpieczające dla adeniny, cytozyny i guaniny (ryc. 7). Nie jest to jednak konieczne w przypadku tyminy.

Ryc.7. Struktury grup ochronnych powszechnie stosowane do ochrony zasad adeninowych, cytozynowych i guaninowych podczas syntezy fosforoamidów oligonukleotydów DNA.

wnioski

1. Sztucznie syntetyzowane oligonukleotydy są coraz częściej stosowane w różnych dziedzinach nauki i udoskonalane są metody ich wytwarzania, co pozwala na syntezę wystarczającej liczby oligonukleotydów do eksperymentów laboratoryjnych i do tworzenia leków terapeutycznych.

2. Obecnie najpowszechniejszą metodą syntezy oligonukleotydów pozostaje metoda syntezy w fazie stałej, która może znacznie przyspieszyć proces otrzymywania oligonukleotydów, a także zmniejszyć objętość zużywanych odczynników.

Kupryushkin, M. S. Fosforyloguanidyny. Nowa klasa analogów kwasów nukleinowych / M.S. Kupryushkin, D.V. Pyszny, D.A. Stetsenko // Acta Naturae (wersja rosyjska). – 2014 r. – nr 4 (23). – s. 123-125.

Garafutdinov, R.R. Chemiczne aspekty tworzenia chipów DNA / R.R. Garafutdinov, I.S. Shepelevich, A.V. Chemeris, R.F. Talipow // Vestnik Baszkirsk. nie-ta. – 2005. – nr 1. – s. 49-54.

Patutina, O.A. Nowe podejścia do leczenia chorób onkologicznych: leki przeciwnowotworowe oparte na kwasach nukleinowych ukierunkowanych genowo/O.A. Patutina, N.L. Mironova, V.V. Własow, MA Zenkova // Acta Naturae (wersja rosyjska). – 2009 r. – nr 2. – s. 47-66.

Rodriguez, AA Konwersja adeniny do 5-amino-4-pirymidynyloimidazolu spowodowana przez czapeczkę acetylową podczas syntezy oligonukleotydów w fazie stałej/ A.A. Rodriguez, I. Cedillo, A.K. McPherson // Bioorg Med Chem Lett. – 2016 r. – s. 30653-9.

Liczba wyświetleń publikacji: Proszę czekać

Streszczenie

W przeglądzie zbadano właściwości farmakokinetyczne różnych leków oligonukleotydowych antysensownych. Porównano farmakokinetykę leków pierwszej i drugiej generacji. Rozważany jest także wpływ modyfikacji chemicznej cząsteczki na farmakokinetykę.

Słowa kluczowe: oligonukleotydy antysensowne, oligodeoksynukleotydy tiofosforanowe, farmakokinetyka

Wstęp

Właściwości farmakokinetyczne oligonukleotydów antysensownych (ASO) najlepiej zrozumieć, biorąc pod uwagę ich właściwości fizyczne i chemiczne. Parametry takie jak ładunek, masa cząsteczkowa i amfipatyczny charakter tiofosforanowych ASO mają istotny wpływ na ich farmakokinetykę. Szczególnie istotny wpływ na właściwości farmakokinetyczne ASO ma budowa chemiczna, w szczególności grupa fosforotionianowa i 2'-metoksyetylowa (MOE).

Wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie oligodeoksynukleotydów tiofosforanowych pierwszej generacji (ODN) były szeroko badane na zwierzętach laboratoryjnych i w badaniach klinicznych. Właściwości farmakokinetyczne leków zawierających tiofosforanowe ASO są następujące: podawane pozajelitowo ODN tiofosforanowe szybko pojawiają się w osoczu krwi, gdzie wiążą się z hydrofilowymi obszarami białek osocza, zapobiegając w ten sposób filtracji kłębuszkowej. Te miejsca hydrofilowe różnią się od innych miejsc hydrofilowych, z którymi wiążą się leki lipofilowe, a zatem konkurencja o wiązanie ASO z białkami osocza jest niewielka. Kinetyka w osoczu charakteryzuje się krótką fazą dystrybucji (rzędu kilku godzin), po której następuje faza eliminacji leku z okresem półtrwania wynoszącym dni lub tygodnie. Początkowa faza dystrybucji koniecznie obejmuje wiązanie ASO z białkami i dystrybucję tych kompleksów w tkankach wątroby, nerek, węzłów chłonnych, szpiku kostnego i śledziony, które są miejscami najbardziej aktywnego wiązania i akumulacji ASO. Jest rzeczą oczywistą, że o fazie eliminacji ASO w wyniku początkowego wiązania z białkami decyduje początkowy etap jego dystrybucji. Ze względu na możliwe nasycenie białkiem , Pole pod krzywą farmakokinetyczną (AUC) zwiększa się wraz ze wzrostem dawki, ponieważ ASO po ich nasyceniu nie wiążą się już z białkami, ale swobodnie dostają się do krwioobiegu. Po związaniu ASO przedostają się do komórek zgodnie z gradientem stężeń z przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez błonę komórkową do przestrzeni wewnątrzkomórkowej, prawdopodobnie za pomocą białka nośnikowego. ASO w komórkach wiążą się z dostępnymi celami, ale przede wszystkim ASO w komórkach najprawdopodobniej wiążą się z białkami wewnątrzkomórkowymi. W komórce wszechobecne nukleazy, ale nie enzymy cytochromu P450, metabolizują leki ASO. Ponieważ enzymy cytochromu P450 zazwyczaj metabolizują leki małocząsteczkowe, ASO nie konkurują z konwencjonalnymi związkami drobnocząsteczkowymi w procesach metabolicznych, zmniejszając ryzyko interakcji leków. Wydalanie ASO z moczem jest ostatecznie wynikiem metabolizmu w tkankach i ustalenia równowagi metabolitów i substancji natywnej poza tkankami i w krążeniu ogólnoustrojowym. Procesy te u zwierząt laboratoryjnych i u ludzi są bardzo podobne, dlatego nie jest możliwe stwierdzenie korelacji międzygatunkowej pomiędzy zwierzętami laboratoryjnymi i ludźmi.

Obecnie w badaniach klinicznych najczęściej stosowana jest konfiguracja ASO „drugiej generacji”, której cechą jest obecność grupy MOE w pozycji 2” nukleotydu na końcach 3” i 5”. Konfiguracja ta jest strukturą bardziej zaawansowaną w porównaniu do konfiguracji niezmodyfikowanej tiofosforanowe ODN, które są lekami antysensownymi I generacji. Wynika to z ich zwiększonej skuteczności, zmniejszonej toksyczności i wydłużonego okresu półtrwania.Wiele czynników związanych z przejściem z ASO pierwszej do drugiej generacji jest bezpośrednio związanych z poprawą ich farmakokinetyki.

Cechy struktury chemicznej ASO

Szkielet fosforanowy

Najwcześniejsze próby stworzenia leków o działaniu antysensownym polegały na wykorzystaniu niezmodyfikowanego DNA, które niestety było bardzo podatne na zniszczenie przez nukleazy. Okazało się, że wszechobecne nukleazy rozcinają wiązania fosfodiesterazy natywnego DNA, co skutkuje okresem półtrwania niezmodyfikowanych ASO wynoszącym minuty. Ta szybka degradacja była główną cechą profilu farmakokinetycznego niezmodyfikowanego antysensownego DNA. Zmiana fosfodiestrowego szkieletu DNA na tiofosforanowy radykalnie zmieniła profil farmakokinetyczny ASO. W tych preparatach struktura tiofosforanowa zastępuje jeden atom siarki w wiązaniach fosfodiestrowych jednym niemostkującym atomem tlenu. Struktura ta zwiększa odporność ASO na nukleazy i w efekcie poprawia ich właściwości kinetyczne.

Chiralność fosforanowa

Jak wykazały badania, tiacja szkieletu diestrowego ASO nie tylko zwiększa jego odporność na nukleazy, ale także przyczynia się do powstania chiralności, czyli możliwości istnienia stereoizomerów przy każdym wiązaniu fosforotionianowym, co prowadzi do tego, że że w dowolnym 20-merowym ASO znajduje się 219 stereoizomerów Sp lub Rp. Połączenie oporności na nukleazy i zwiększonego wiązania białek silnie wpływa na farmakokinetykę ASO. Zwiększenie stabilności tiofosforanowych ASO prowadzi do tego, że okres półtrwania leku w osoczu wzrasta do 30-60 minut w porównaniu z okresem półtrwania fosfodiestrowych ASO, który wynosi 1-2 minuty.

Oporność na nukleazy i chiralność wynikająca z podstawienia fosfodiestrów wiązaniami tiofosforanowymi są warte dyskusji, ponieważ właściwości fizyczne związane z tą cechą strukturalną są ważne zarówno dla pierwszej, jak i drugiej generacji ASO. Odporność na nukleazy w tiofosforanowych ASO wynika z bliskości siarki na niemostkującym tlenie w miejscu aktywnym egzonukleazy z jonem metalu. Ta bliskość może spowodować wyparcie jonu metalu z miejsca aktywnego. Efekt ten wykazano w modelu polimerazy DNA egzonukleazy 3”–5”. Dane krystalograficzne rentgenowskie potwierdzają tę hipotezę o przemieszczeniu jonów metali. Widoczne różnice we wrażliwości stereoizomerów na aktywność egzonukleazy polimerazy DNA są zgodne z proponowaną konformacją stereoizomerów tiofosforanowych ODN w miejscu aktywnym. Jest prawdopodobne, że chiralność wiązań tiofosforanowych może w ten sam sposób zakłócać inne nukleazy, to znaczy wypieranie jonów metali, chociaż różne egzonukleazy mogą wykazywać różne preferencje dla wiązań Rp i Sp w zależności od charakteru miejsca aktywnego enzymu.

Alternatywnie siarka może po prostu zastąpić tlen w wiązaniach diestrowych. Różnice w zdolności siarki do przyjmowania ładunku ujemnego w porównaniu z tlenem umożliwiają przewidywanie zmian w miejscu aktywnym. Zmiana ta najprawdopodobniej zachodzi w wyniku hydrolizy wiązań fosfodiestrowych i może nastąpić poprzez utworzenie przejściowego pięciowartościowego fosforu z dwoma ujemnie naładowanymi atomami tlenu. Zastąpienie jednego z równikowych atomów tlenu siarką będzie miało negatywne skutki dla aktywności enzymu: (1) wiązanie wody, które stabilizuje lokalny ładunek ujemny na atomach, zostaje zmniejszone, co utrudnia uzyskanie drugiego ładunku ujemnego na siarki ; oraz (2) zmniejszone wiązanie Mg 2+ z siarką. Istnieją dowody na ten ostatni efekt w badaniach poziomu rozszczepienia przez rybozymy diastereomerycznych wtrąceń tiofosforanowych, gdzie dodatek Mg2+ hamuje działanie rozszczepiające rybozymów tiofosforanowych. Ponadto wykazano, że następuje nieznaczny spadek aktywności nukleaz w miejscach szkieletu położonych dalej od wiązań fosforotionianowych, co sugeruje przenoszenie efektu chiralności. Zjawisko to najlepiej tłumaczy się zmianami w ułożeniu cząsteczek wody wokół szkieletu fosforotionianowego w porównaniu ze szkieletem fosfodiestrowym.

Stereospecyficzny wpływ na aktywność nukleaz znacząco wpływa na farmakokinetykę tiofosforanowych ASO, co najwyraźniej objawia się szybkością metabolizmu tiofosforanowych ASO pierwszej generacji w osoczu krwi. Szybkość całkowitego usuwania ASO z osocza zmniejsza się, co sugeruje wolniejszy metabolizm. Tych zmian szybkości nie można wyjaśnić wyłącznie na podstawie kinetyki pierwszego rzędu, ale można je wyjaśnić różnicami w podatności wiązań Rp i Sp.

Stereospecyficzne różnice w aktywności egzonukleazy są mniej istotne w przypadku ASO drugiej generacji. Wynika to z faktu, że ASO drugiej generacji posiadają modyfikacje 2" na końcach 3" i 5", które zapobiegają ich rozszczepieniu przez egzonukleazę. Wykorzystując endonukleazę wyizolowaną z patogenu Serratia marcescens, zbadano wpływ chiralności wiązań fosforotionianowych Miejsce działania endonukleazy jest takie samo jak egzonukleazy - jest to jeden z niemostkujących atomów tlenu służących do hydrolizy wiązań fosfodiestrowych.W diastereomerze siarka jest zlokalizowana w pobliżu Mg 2+ w wyniku których aktywność enzymu maleje, podczas gdy w diastereomerze Rp nie.Ponieważ endonukleaza Serratia wykazuje istotne podobieństwa do niektórych endonukleaz ssaczych, należy przypuszczać, że mechanizm ten może mieć szerokie zastosowanie.Jak cechy stereochemiczne wiązań fosforotionianowych wpływają na działanie innych endonukleaz nie jest znane, jednak jeśli przyjmiemy, że reakcja przebiega według schematu podobnego do endonukleazy Serratia, można sądzić, że w miejscu aktywnym będzie znajdował się jon metalu (prawdopodobnie Mg 2+), a siarka będzie przeszkadzać działanie nukleaz , gdy jest zorientowany w stronę jonu metalu. Jeżeli endonukleazy są wrażliwe na chiralność, może to mieć istotne implikacje dla rozwoju problemu tworzenia skutecznych leków drugiej generacji. Podobnie jak wpływ chiralności na leki pierwszej generacji, efekt chiralny na metabolizm leków drugiej generacji może prowadzić do spowolnienia ich metabolizmu. Można więc na przykład założyć, że szybko metabolizujące stereoizomery zostaną selektywnie zniszczone, pozostawiając jedynie funkcjonujące wolno metabolizujące izomery.

Wiązanie ASO z białkami

Stwierdzono, że w porównaniu z ASO o szkielecie fosfodiestrowym, na farmakokinetykę struktur tiofosforanowych istotny wpływ ma ich wiązanie z białkami. Chemiczną podstawą zwiększonego wiązania białek jest zwiększona lipofilowość wiązań fosforotionianowych w porównaniu z wiązaniami fosfodiestrowymi. Ponieważ interakcje molekularne z wodą są zdeterminowane kształtem i funkcją makrocząsteczek w roztworze wodnym, nawet niewielkie zmiany w lipofilowości szkieletu na całej długości ASO mogą mieć konsekwencje dla interakcji oligomeru z wodą i makrocząsteczkami, takimi jak białka .

W pierwszym przybliżeniu ODN tiofosforanowe wiążą się z białkami komórkowymi bardziej losowo niż ODN fosfodiestrowe. Dlaczego ASO fosforotionianowe lepiej wiążą się z białkami, nie jest w pełni zrozumiałe. Możliwe wyjaśnienia obejmują zwiększoną lipofilowość i kompleksowanie jonami metali.

Znaczenie wiązania z białkami osocza dla farmakologii, farmakokinetyki i toksykologii tiofosforanowych ASO (zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji) jest trudne do przecenienia. Przy stężeniach mikromolowych ponad 90% ODN tiofosforanowych wiąże się w osoczu. Istnieją specyficzne różnice w odsetku i sile wiązania z białkami, a także różnice jakościowe w wiązaniu ASO z określonymi białkami u różnych gatunków. Wiązanie tiofosforanowych ASO z krążącymi białkami zapobiega filtrowaniu tych związków przez kłębuszki i wydalaniu ich z moczem. W przypadku nasycenia, np. po podaniu dużej dawki ASO, następuje zwiększone wydalanie z moczem ASO pełnej długości. Ze względu na różnice gatunkowe nasycenie u różnych gatunków jest określane przez różne stężenia ASO. Na przykład białka osocza myszy mają mniejsze powinowactwo do ASO w porównaniu do białek szczurów i ludzi. Dlatego efekt nasycenia wiązania ASO z białkami osocza u myszy występuje przy niższych stężeniach w porównaniu z innymi gatunkami. Różnice gatunkowe w wiązaniu z białkami osocza są istotnym czynnikiem różnic w farmakokinetyce międzygatunkowej.

Oporność na nukleazy i wiązanie białek, które są charakterystyczne dla ASO połączonych tiofosforanami, również zmieniają farmakokinetykę terapii ASO. Dodatkowe struktury chemiczne charakterystyczne dla opracowywanych leków drugiej generacji wprowadzają inne zmiany w ich farmakokinetyce.

Metoksyetylowe pochodne ASO

ASO drugiej generacji zostały opracowane w celu ulepszenia niektórych cech ODN pierwszej generacji. Zatem struktury tiofosforanowe dodane do grup MOE w pozycji 2” zwiększają ich odporność na nukleazy i zmieniają skuteczność wiązania z białkami.

Oporność MOE na nukleazy

Wykazano, że struktura MOE wpływa na oporność ASO na nukleazy. Podczas gdy struktury tiofosforanowe zmniejszają aktywność egzonukleazy, struktura w pozycji 2” praktycznie eliminuje aktywność egzonukleazy. Oporność na nukleazy może wynikać z (1) podstawienia wodoru w pozycji 2” przez MOE, (2) efektów sterycznych MOE lub (3) tworzenia sztywnej powłoki wodnej wokół szkieletu ASO. Bez względu na przyczyny oporności na nukleazy, obecność grupy MOE sprawia, że ​​ASO zmodyfikowane w pozycji 2” są praktycznie odporne na działanie krążących i większości nukleaz komórkowych. Centralny obszar szkieletu ASO, składający się z deoksyfosfotionianów, nie jest tak odporny do rozszczepień za pośrednictwem nukleaz.Różnice w ASO pierwszej i drugiej generacji w obszarach podlegających metabolizmowi są również zdeterminowane różnicami w modelach metabolicznych.

Kiedy wzorce metaboliczne oceniano za pomocą elektroforezy w żelu kapilarnym (CGE) lub chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (LC/MS), nie znaleziono żadnych metabolitów krótszych o jeden nukleotyd. Odkryto większość metabolitów, które zostały rozszczepione w miejscu dezoksy (prawdopodobnie przez endonukleazy); dalszą drogą metabolizmu jest zmniejszenie wielkości produktów rozszczepienia. Odporność na egzonukleazy i powolny metabolizm pod wpływem aktywnych endonukleaz prowadzi do tworzenia związków charakteryzujących się długim okresem półtrwania .

Wiązanie MOE z białkami

Badania eksperymentalne wykazały, że ASO tiofosforanowe ze strukturami 2"-MOE mają mniejsze powinowactwo do białek osocza w porównaniu z niezmodyfikowanymi ASO tiofosforanowymi. Na przykład, gdy do 3-calowych końców ODN fosforotionianowych pierwszej generacji doda się pięć struktur MOE, stałe dysocjacji dla albuminy wzrastają z około 18 do około 40 µM. Jednocześnie w strukturze ASO całkowicie zastąpionej przez MOE powinowactwo do białek osocza tylko nieznacznie maleje. Nie jest jasne, dlaczego wzrost liczby struktur MOE w oligonukleotydzie nie wpływa na dalszy spadek powinowactwa do białek osocza, ale może to wynikać ze specyfiki struktury drugorzędowej ASO.

Spadek powinowactwa białek związany ze strukturami MOE można wytłumaczyć pewnymi właściwościami fizycznymi. Być może najbardziej znaczącym czynnikiem fizycznym odróżniającym ASO modyfikowane MOE od niezmodyfikowanych jest obecność molekularnej powłoki wodnej, która powstaje z łańcucha bocznego MOE. Podstawniki MOE w szkielecie węglowodorowym „chelatują” cząsteczki wody (i ewentualnie jony metali), tworząc wodną otoczkę i redukując potencjalny kontakt pomiędzy „lepkimi” cząsteczkami siarki a białkami osocza lub komórkowymi. Stopień wiązania ASO z białkami jest odwrotnie skorelowany z ich wydalaniem z moczem. Wprowadzenie wiązań fosforotionianowych i podstawników 2”-MOE zmienia wiązanie białek i w efekcie zmienia właściwości ASO.

Wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie ASO

Ssanie

Pozajelitowa droga podawania ASO

Badania wykazały, że ze względu na masę cząsteczkową (około 7000 D) i ładunki ujemne ASO wchłanianie tych leków z przewodu pokarmowego jest ograniczone. Dlatego najczęściej stosuje się drogę pozajelitową. Do podawania leków I generacji stosuje się wlewy podskórne, dożylne lub zastrzyki do ciała szklistego. Niższa aktywność prozapalna ASO drugiej generacji czyni je bardziej odpowiednimi do podawania podskórnego. Farmakokinetyka tych leków w osoczu po wstrzyknięciu podskórnym i infuzji dożylnej jest porównywalna. Badania na zwierzętach laboratoryjnych wykazały, że ostatecznie dystrybucja ASO jest również porównywalna w różnych narządach, z wyjątkiem miejsca wstrzyknięcia i węzłów chłonnych.

Po podaniu podskórnym ASO pierwszej i drugiej generacji szybko wchłaniają się z miejsca wstrzyknięcia do krążenia ogólnego. W badaniach klinicznych po podskórnym podaniu ASO drugiej generacji czas do osiągnięcia maksymalnego stężenia (Tmax) wahał się od 1,5 do 4,7 godziny w zakresie dawek od 25 do 200 mg przy stałej objętości 1 ml. Biodostępność dawki podskórnej wynosi od 36 do 82% podanej dawki. Badania przedkliniczne i kliniczne sugerują, że biodostępność ASO wzrasta w sposób zależny od stężenia.

Kinetyka ASO w miejscu wstrzyknięcia może wpływać na odpowiedź lokalną, a także na ich kinetykę i dystrybucję ogólnoustrojową. Zmniejszenie stężenia ASO w miejscu wstrzyknięcia hipotetycznie zmniejsza lokalną odpowiedź na wstrzyknięcie. Jednym ze sposobów zmniejszenia stężenia ASO w miejscu wstrzyknięcia jest rozcieńczenie roztworu i w efekcie zwiększenie powierzchni wchłaniania z miejsca podskórnego. Teoretycznie rozcieńczone roztwory i większa powierzchnia absorpcji powinny zmniejszać lokalne stężenia i ograniczać lokalne reakcje. Takich samych skutków można by się spodziewać po zwiększeniu wchłaniania ogólnoustrojowego. Dlatego zmiany dawki i objętości można uznać za potencjalne zmienne. Jednak już dziś iniekcje podskórne o małych objętościach i stosunkowo wysokich stężeniach wykazują wysoką biodostępność użytego materiału.

Administracja lokalna ASO

Badanie różnych metod podawania ASO pokazuje, że jako środki podawania miejscowego stosuje się postacie aerozolu, podawanie doodbytnicze i zastrzyki do ciała szklistego. W leczeniu chorób płuc możliwe jest wytworzenie stosunkowo wysokich stężeń ASO w płucach za pomocą aerozoli.

Kinetykę ODN pierwszej generacji badano na myszach. Ustalono, że kinetyka takich leków jest zależna od dawki, klirens następuje w płucach, a okres półtrwania wynosi około 2 godziny. Natomiast badania ASO drugiej generacji modyfikowanych MOE pokazują, że ich okres półtrwania wynosi ponad 4 dni. Podobnie jak w przypadku innych terapii miejscowych, zaletą inhalacji jest możliwość wytworzenia wysokich miejscowych stężeń w tkankach, które normalnie nie kumulują zastosowanych substancji. Po podaniu pozajelitowym ASO zwykle nie kumulują się w płucach. Administracja lokalna rzadko powoduje również skutki ogólnoustrojowe. Na przykład, gdy ASO podawano małpom w dawce 0,1 mg/kg poprzez inhalację (trzy dawki w ciągu tygodnia), stężenie leku w płucach wynosiło około 1 μg/g. Jednak u tych samych małp stężenia w wątrobie i nerkach wynosiły około 5% stężeń w płucach, co wskazuje na znacznie mniejsze działanie ogólnoustrojowe.

Dane literaturowe wskazują, że doodbytnicze podawanie ASO jest z powodzeniem stosowane w leczeniu wrzodziejącego zapalenia jelita grubego. W odróżnieniu od inhalacji, gdzie można zastosować niewielką ilość podawanej substancji, lewatywa stosowana w leczeniu może zawierać aż 240 mg substancji I generacji (alikaforsen). W tym przypadku nabłonek odbytnicy jest narażony na działanie podawanej substancji, jednak ze względu na słabą przepuszczalność silnie naładowanego ODN obserwuje się minimalne wchłanianie leku i ogólny efekt ogólnoustrojowy. Z obliczeń wynika, że ​​stężenie ASO w nabłonku jelitowym po 12 godzinach od podania wynosi 20 µg/g. Biodostępność u człowieka waha się od 0,03 do 2,14%, a maksymalne stężenie ASO wykrywalne w osoczu wynosi zaledwie 0,126 µg/ml. Brak znaczącego wchłaniania ogólnoustrojowego i wysokie miejscowe stężenie leku mają pozytywny wpływ na leczenie.

Przeprowadzono badanie iniekcji doszklistkowych leków ASO zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji. W tym przypadku substancje wstrzykuje się do oka w bardzo małych ilościach. Dzięki izolacji miejsca wstrzyknięcia ogólnoustrojowe działanie leku jest jeszcze bardziej zmniejszone. Do oka, ciała szklistego i siatkówki ASO przenika z różną szybkością: ciało szkliste wchodzi szybciej w porównaniu do siatkówki. Zarówno lokalny metabolizm, jak i dyfuzja z oka przyczyniają się do eliminacji leku. Jak już wspomniano, ze względu na małe ilości ogólnoustrojowe działanie podawanego leku jest minimalne. Jednakże mechanizm dystrybucji ogólnoustrojowej jest podobny jak w przypadku większości innych leków.

Dojelitowe podanie ASO

Stwierdzona stabilność ASO drugiej generacji wobec nukleaz zapewnia stabilność leku w jelitach, co umożliwia jego dalsze wchłanianie. Jednakże wielkość cząsteczki i ładunki ASO ograniczają wchłanianie leku. Po wchłonięciu z jelita kinetyka ASO jest podobna jak po podaniu pozajelitowym. Chociaż wątroba jest jednym z głównych miejsc akumulacji ASO, efekt pierwszego przejścia przez wątrobę nie jest ważnym czynnikiem wpływającym na kinetykę leku ASO.

Rozmieszczenie ASO w organizmie

Rola perfuzji i powinowactwa tkankowego

Dystrybucja ASO i innych leków zależy od przepuszczalności, intensywności ukrwienia, wiązania z białkami osocza, tkankami i komórkami. Wykazano, że dystrybucja tkankowa tiofosforanowych ASO pierwszej i drugiej generacji z ich wieloma ładunkami ujemnymi i wiązaniem z białkami jest najmniej zależna od ukrwienia, a znacznie bardziej zależna od czynników wpływających na ich transport do komórki.

Wewnętrzna dystrybucja z osocza do tkanek jest stosunkowo szybka, a okres półtrwania w fazie eliminacji po podaniu dożylnym wynosi 30–90 minut. Okres półtrwania ASO po podaniu podskórnym jest dłuższy niż po podaniu dożylnym. Różnica ta wynika z czasu wymaganego do wchłaniania, a nie z innych różnic farmakokinetycznych.

Badanie kinetyki leków pierwszej i drugiej generacji wykazało niewielkie różnice. Większa stabilność nukleaz ASO drugiej generacji jest kompensowana przez ich mniejsze wiązanie z białkami. Ponadto profile farmakokinetyczne leków pierwszej i drugiej generacji są podobne lub prawie nie do odróżnienia, gdy suma natywnego ASO i jego metabolitów (całkowita ASO) pierwszej generacji jest porównywana z nienaruszonym lekiem drugiej generacji (ISIS 13650 ). W przeciwnym razie szybsze zniszczenie ASO przez egzonukleazy skróciłoby okres półtrwania leków pierwszej generacji w porównaniu z lekami drugiej generacji. Dystrybucja leków obu generacji jest zależna od dawki.

Jak zauważono powyżej, po wchłonięciu z miejsca wstrzyknięcia lub jelita, ASO wiążą się z białkami osocza. Dwa białka osocza, które specyficznie wiążą ASO fosforotionianowe, to albumina i alfa-2-makroglobulina. Inne powszechne białko, kwaśna glikoproteina, nie wiąże ASO. Wiązanie z białkami jest bardzo ważne dla dystrybucji ASO w tkance docelowej. Struktury chemiczne zmniejszające wiązanie prowadzą do zauważalnego zmniejszenia stężenia leku w tkankach, zwiększają stopień jego filtracji przez kłębuszki nerkowe i wydalanie z moczem. Zjawisko to można zaobserwować stosując ASO z wiązaniami diestrowymi w szkielecie leku lub w obecności struktury MOE. Zmniejszenie powinowactwa diestrów i struktur MOE (lub obu) do białek powoduje, że ASO może swobodniej krążyć w krwiobiegu, co prowadzi do wzmożenia jego wydalania z moczem.

We wszystkich badaniach z pozajelitowo podawanymi ASO pierwszej i drugiej generacji nie zaobserwowaliśmy liniowego klirensu ASO z osocza. Klirens zmniejszał się wraz ze zwiększaniem dawki leku, w związku z czym jego biodostępność była większa, niż można by oczekiwać na podstawie podanej dawki. Ponieważ początkowy klirens wynika z dystrybucji ASO w tkankach i zaobserwowano wchłanianie leku do tkanek, można przypuszczać, że są one nasycone ASO. Badanie procesu nasycenia w wyniku podawania ASO można przeprowadzić wykorzystując fagocyty wątroby. Kiedy wiązanie ASO z komórkami Kupffera osiągnie nasycenie, rozpocznie się spadek powinowactwa. Późniejsze podanie ASO myszom poprawia dystrybucję ASO do niefagocytarnych komórek wątroby, co skutkuje poprawą aktywności farmakologicznej w hepatocytach w porównaniu z grupą kontrolną. I odwrotnie, przy stężeniach w osoczu poniżej 1 μg/ml ASO aktywniej wiążą się z komórkami Kupffera i mniej gromadzą się w hepatocytach.

Badanie procesu wiązania ASO z białkami osocza wykazało, że efektowi temu towarzyszy szybka dystrybucja kompleksu w tkankach na powierzchni komórki. Chociaż dokładne mechanizmy wiązania komórkowego nie zostały ustalone, można założyć, że ASO wiążą się z białkami osocza lub białkami komórkowymi, o ile istnieją wolne miejsca wiązania. Związane ASO są następnie rozprowadzane wzdłuż gradientu stężeń przez błonę komórkową poprzez wymianę białka zewnątrzkomórkowego na białko wewnątrzkomórkowe.

Zatem siłą napędową wejścia ASO do komórek jest gradient stężenia. Opisano ruch wahadłowy ASO pomiędzy cytoplazmą a jądrem. Ogólnie rzecz biorąc, jasne jest, że wiązanie białek ułatwia przemieszczanie się ASO przez bariery, które normalnie hamują ruch hydrofilowych, silnie naładowanych cząsteczek. Ten mechanizm wahadłowy ruchu przez membrany pozostaje hipotezą dla ASO, ale został wcześniej opisany dla związków metaloorganicznych. Transport ASO z macierzy zewnątrzkomórkowej do przestrzeni wewnątrzkomórkowej wizualizowano w wątrobie myszy metodami immunohistochemicznymi oraz w nerkach szczurów przy użyciu mikroskopii przyżyciowej ze znacznikiem fluorescencyjnym dla ASO drugiej generacji (S. Henry, B. Molitoris).

Tożsamość białek kontrolujących transport ASO z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do przestrzeni wewnątrzkomórkowej nie jest znana, ale uważa się, że wiązanie kompleksu białko-ASO z komórką odbywa się za pomocą receptora fagocytarnego. Ponieważ fagocyty, takie jak komórki Kupffera, makrofagi tkankowe i komórki kanalików bliższych, mają duże powinowactwo do ASO, można myśleć o możliwości znalezienia takich receptorów na powierzchni ich komórek.

Jednakże dystrybucja komórkowa i farmakodynamika ASO u myszy transgenicznych pozbawionych receptora fagocytarnego SR-A I/II nie różniły się od kontrolnych zwierząt syngenicznych. Zatem receptor ten, znany jako receptor zmiatający, nie wydaje się być odpowiedzialny za wychwyt kompleksu do wątroby i nerek. Nie badano roli innych struktur akceptorowych biorących udział w procesach endocytozy kompleksu ASO-białko.

Białka błonowe pełnią rolę transporterów , obecny we wszystkich organizmach. Głównymi transporterami leków są: ABC ( transportery kaset wiążących ATP) i SLC (rodzina nośników substancji rozpuszczonych). Wiadomo, że szybkość przenikania substancji przez błony biologiczne przy wykorzystaniu procesów, w których pośredniczą transportery, charakteryzuje się nasyceniem. Opisano kilku członków rodziny SLC o znanych funkcjach , głównie do transportu nukleozydów, cukrów nukleozydowych i cukrów fosforanowych. Uważa się, że przyszłe badania najprawdopodobniej będą dotyczyć procesów transportu międzybłonowego ASO.

Oczywiste jest, że oprócz wspomnianych różnic w akumulacji utworzonych struktur przez różne narządy i tkanki oraz zależności klirensu i dystrybucji tych związków od ich dawki, na dystrybucję ASO w tkankach wpływają układy transportu, charakterystyka przepływu krwi u poszczególnych osób, możliwy czas przebywania leku w organizmie i wreszcie nasycenie tkanek ASO. Pomimo istotnej roli tych czynników w procesach dystrybucji ASO w tkankach, uważa się, że początkowe wiązanie ASO z powierzchnią komórki jest jednym z czynników determinujących analizowane mechanizmy. Wniosek ten opiera się na fakcie, że wątroba i nerki są początkowymi miejscami wiązania ASO, z pewną dodatkową kumulacją w ciągu pierwszych 24 godzin po podaniu ASO. Badając parametry dystrybucji ASO w wątrobie i nerkach, wykazano ułamkowy wzrost stężenia leku w narządach w ciągu pierwszych 24 godzin. Dzieje się tak w okresie komórkowej i subkomórkowej redystrybucji ASO, ale prawdopodobnie pierwotne narządy dystrybucji powinny z czasem gromadzić więcej substancji ze względu na większe powinowactwo tych narządów do ASO. Białka odpowiedzialne za to powinowactwo mogą zawierać heparynopodobne miejsca wiązania lamininy i fibrynogenu oraz czynnika wzrostu fibroblastów (FGF). Wczesna interakcja ASO z komórką może wynikać z wiązania tych białek, ale charakter tych białek, jak zauważono powyżej, został słabo zbadany.

Biorąc pod uwagę znaczenie połączenia specyficznych miejsc wiązania ASO z komórkami w dystrybucji leku w organizmie, należy zwrócić uwagę na tak istotny czynnik, jak różne ukrwienie poszczególnych narządów, którego zdolność wpływania na różną dystrybucję leku tiofosforan ASO jest oczywisty. Według różnych autorów prace nad kilkudziesięciu seriami substancji zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji wskazują na ich podobne rozmieszczenie i zauważalnie podobne rozmieszczenie u osobników różnych gatunków. Nerki, wątroba, węzły chłonne, śledziona i szpik kostny to narządy, które gromadzą największe ilości ASO i ich metabolitów. Fakt, że płuca i serce nie kumulują ASO, wskazuje, że aby wyjaśnić wyraźną akumulację ASO w wątrobie i nerkach, nie wystarczy tylko jedno wyjaśnienie ich dobrego ukrwienia. Na przykład obszarami o najlepszym krążeniu krwi w nerkach są kłębuszki i nie są to obszary zawierające najwięcej ASO. Przeciwnie, w kanalikach proksymalnych krążenie krwi jest mniej aktywne. Jednakże komórki kanalików proksymalnych charakteryzują się dużą liczbą komórek aktywnie fagocytarnych i gromadzą wolne ASO, a także ASO związane z białkami, które zwykle są ponownie wchłaniane w kanalikach proksymalnych. W rezultacie kora nerek i nabłonek kanalików bliższych zawierają najwyższe stężenie ASO tiofosforanowych, zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji.

Należy również zauważyć, że dopływ krwi (ml/g tkanki) wątroby stanowi około 20% tego, co ma nerka. 4-5-krotne różnice w perfuzji nerek i wątroby nie powodują 4-5-krotnych różnic w stężeniu ASO w tych narządach. Fenestrowane naczynia włosowate zwiększają powierzchnię kontaktu ASO z krwią, co może kompensować niedostateczną perfuzję wątroby w stosunku do nerek.

Wiązanie ASO z białkami osocza podczas dystrybucji

Chociaż nasycenie komórek ASO ostatecznie wpływa na ich dystrybucję w narządach, wiązanie ASO z białkami osocza może zmieniać dystrybucję w nerkach i wątrobie w różnych seriach. Istnieją seryjne różnice w wiązaniu białek. Wraz ze spadkiem wiązania ASO z białkami osocza zmniejsza się ich akumulacja w wątrobie i wzrasta ich akumulacja w nerkach. I odwrotnie, przy większym wiązaniu stężenie wolnego ASO w krwiobiegu będzie mniejsze, będzie gromadzić się mniej w nerkach, a więcej w innych narządach. Istnieje odwrotna zależność pomiędzy stopniem wiązania ASO z białkami a ich akumulacją w nerkach szczurów i małp po wielokrotnym podaniu dożylnym i podskórnym.

Wiązanie z białkami może służyć jako kryterium wyboru ASO do badań klinicznych. Jak dotąd określanie wiązania białek jest procesem empirycznym i nie można przewidzieć, która partia zwiąże się z białkami w większym lub mniejszym stopniu.

Dystrybucja ASO wśród innych organów

Niezależnie od kolejności dystrybucji tiofosforanowych ASO pierwszej i drugiej generacji, charakterystyczny wzór lokalizacji tych leków obserwuje się w nerkach i wątrobie, a także śledzionie i węzłach chłonnych, kościach oraz cytoplazmie adipocytów. Nagromadzenie ASO w tkance limfatycznej można częściowo wyjaśnić aktywnością fagocytarną histiocytów i innych komórek jednojądrzastych. Możliwe jest uwidocznienie ASO w fagolizosomach histiocytów i tkankach makrofagów za pomocą barwienia hematoksyliną. Wykazano, że ASO ulegają endocytozie, są zlokalizowane w endosomach i magazynowane w tych strukturach. Stężenie ASO w fagolizosomach jest często takie, że można je określić za pomocą barwienia hematoksyliną (podobnie jak DNA jądrowy). ASO w fagolizosomach prawdopodobnie odpowiada za większość ASO zgromadzonego w śledzionie i narządach limfatycznych. Ponadto aktywne fagocytarnie komórki kości i szpiku kostnego gromadzą w tych tkankach ASO, o czym świadczy obecność w ich komórkach ziarnistości zasadochłonnych.

Mięśnie (zarówno szkieletowe, jak i sercowe) nie zawierają znaczących ilości ASO. Jednakże dokładne badanie mięśni metodami immunohistochemicznymi lub autoradiograficznymi ujawnia zawartość ASO w fagolizosomach makrofagów w zrębie mięśniowym, a akumulacja ta może częściowo znaleźć odzwierciedlenie w pomiarze stężenia ASO w mięśniach i sercu.

Kumulacja ASO w cytoplazmie adipocytów jest istotna z terapeutycznego punktu widzenia. Tym bardziej, że w odróżnieniu od większości substancji gromadzonych w adipocytach, ASO są hydrofilowe. Metody immunohistochemiczne wyraźnie pokazują, że ASO znajdują się we frakcji cytoplazmatycznej adipocytów, podczas gdy ASO są prawie nieobecne w wakuoli tłuszczowej. Intensywność zabarwienia wskazuje na znaczną akumulację substancji w cytoplazmie. Przykładowo u małp po 13 tygodniach leczenia ISIS 113715 w dawce 10 mg/kg/tydzień stężenie w wątrobie wynosiło 301 ± 88,1 μg/g, ale już tylko 37,3 ± 14,4 μg/g w tkance tłuszczowej w te same zwierzęta.

Biorąc pod uwagę, że składnik beztłuszczowy stanowi 10% całkowitej masy tłuszczowej, korekta stężenia ASO z uwzględnieniem tego wskaźnika wskazuje na porównywalność jego stężenia ze stężeniem w wątrobie. Znaczące stężenia ASO w adipocytach wskazują, że można je stosować w leczeniu chorób genetycznych tego typu komórek, będących źródłem hormonów i cytokin. Tym samym stwierdzono, że farmakologicznie aktywne stężenia ASO rejestrowane są w adipocytach myszy, gdy lek ISIS 113715 podawany dwa razy w tygodniu w dawce 25 mg/kg powoduje zmniejszenie ekspresji docelowego genu PTP-1B zarówno w komórkach wątrobie i w adipocytach. Podobne obserwacje poczyniono u małp leczonych ASO ISIS 113715. Ponieważ biopsję tłuszczu podskórnego można wykonywać w warunkach klinicznych, a aktywne ASO gromadzą się w tłuszczu, możliwe jest wykorzystanie tłuszczu do biopsji i bezpośredni pomiar efektów farmakologicznych (redukcja mRNA ) i stężenie leku w tkankach ludzkich.

ASO fosforanowe są również dystrybuowane do innych tkanek. Badania immunohistochemiczne wskazują, że komórki śródbłonka gromadzą ASO w stężeniach znaczących dla obniżenia poziomu mRNA, co czyni je potencjalnym celem interwencji farmakologicznej. W niektórych tkankach ich stężenia nie są na tyle wysokie, aby wywołać efekt farmakologiczny. Na przykład dojrzałe limfocyty nie gromadzą ASO, a aktywność antysensowna jest ograniczona przez limfocyty T.

Komórki kostne, szczególnie aktywne fagocytarnie osteoblasty, mogą akumulować ASO i efekt ten można wykorzystać w celach terapeutycznych. Ponadto komórki wysp trzustkowych również gromadzą ASO. Zarówno ASO pierwszej, jak i drugiej generacji są wysoce naładowanymi cząsteczkami hydrofilowymi, które nie przenikają przez barierę krew-mózg ani krew-jądro. Jednakże, podobnie jak w mięśniach, makrofagi zawierające wykrywalne ASO są zlokalizowane w śródmiąższu jądra. Jajniki nie są oddzielone barierą, dlatego ASO można ilościowo zmierzyć w jajnikach i uwidocznić w zrębie metodą immunohistochemiczną.

Ograniczona dystrybucja ASO z osocza do komórek mózgowych i kardiomiocytów sprawia, że ​​tkanki te są mało prawdopodobnymi celami interwencji antysensownej, chociaż selektywne hamowanie lub ekspresja niektórych białek kanałów jonowych w mózgu i mięśniach może być korzystne terapeutycznie. Za zaletę można jednak uznać ograniczone rozmieszczenie ASO w tych tkankach. Brak znaczących stężeń ASO w mózgu i sercu zmniejsza ryzyko uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i ogranicza występowanie niekorzystnych skutków kardiologicznych. Jak zauważono wcześniej, bezpośrednie podanie do struktur OUN, zwłaszcza mózgu, poprzez wlew lub zastrzyk dooponowy, dokomorowy powoduje dystrybucję ASO w całym ośrodkowym układzie nerwowym i może być korzystne terapeutycznie.

W czasie ciąży płód jest dość dobrze chroniony przed działaniem leków antysensownych. W badaniu kinetyki przezłożyskowej ASO nie stwierdzono jego kumulacji u płodu, natomiast u gryzoni w łożysku stwierdzono niski poziom ASO. Wyniki te konsekwentnie powtarzano w badaniach teratogenności różnych ASO drugiej generacji u myszy, szczurów i królików. Łożysko, pomimo dużej perfuzji, nie jest narządem o dużej kumulacji ASO.

Ogólnie rzecz biorąc, z przedstawionych faktów wynika, że ​​rozkład ASO jest jednym z kluczowych czynników determinujących intensywność działalności ASO. Wydaje się, że różnice w rozmieszczeniu ASO są w dużej mierze związane z tropizmem tkankowym tych leków i, w mniejszym stopniu, z perfuzją.

Metabolizm

Leki antysensowne pierwszej i drugiej generacji są metabolizowane przez nukleazy, a nie przez układy oksydaz, takie jak cytochrom P450, który metabolizuje konwencjonalne lipofilowe leki małocząsteczkowe. ASO nie są substratem izoenzymów cytochromu P450, ani nie indukują ani nie hamują jego aktywności w klinicznie istotnych stężeniach. Rozszczepianie ASO za pośrednictwem egzonukleazy, które jest głównym szlakiem metabolizmu i usuwania ODN tiofosforanowych pierwszej generacji, jest wtórne w stosunku do ASO drugiej generacji. Aktywność egzonukleazy jest ograniczona przez dwa fragmenty: jeden MOE na końcu 3" i drugi MOE na końcu 5".

Enzymy odpowiedzialne za metabolizm ASO

Nie są znane specyficzne enzymy metabolizujące ASO drugiej generacji. Nukleazy są wszechobecne i możliwe jest wykrycie zdegradowanych metabolitów ASO w większości tkanek. Homogenaty wątrobowe i nerkowe są zdolne do metabolizowania ASO drugiej generacji in vitro bez dodatku egzogennych źródeł energii, takich jak fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH) lub 5-trifosforan adenozyny (ATP). Początkowe rozszczepienie skutkuje dwoma produktami, każdy charakteryzujący się końcem 5" i 3" chronionym MOE. Metabolity te nie wiążą się z białkami i dlatego są wydalane z tkanek. Ponieważ metabolity są usuwane szybciej niż powstają, praktycznie nie dochodzi do akumulacji metabolitów w tkankach. Tym samym nie ma możliwości wykorzystania oznaczenia ilości metabolitów w tkankach jako wskaźnika metabolizmu ASO w tkankach.

Ponieważ szybkość eliminacji ASO z tkanek zależy od ich metabolizmu, różnice w metabolizmie ASO w różnych tkankach można oszacować na podstawie okresu półtrwania tych leków w scharakteryzowanych tkankach. Na podstawie danych dotyczących czterech ASO drugiej generacji stwierdzono, że zachowanie przedstawicieli tej klasy jest podobne, ale istnieją niewielkie różnice w ich okresie półtrwania w wątrobie i nerkach małp leczonych przez 4–13 tygodni. Wykazano, że okres półtrwania leków ASO ISIS 104838 i 112989 z wątroby i nerek jest bardzo podobny. Dane te sugerują, że w przypadku niektórych serii ASO nie ma znaczących różnic w tempie metabolizmu w różnych narządach. Stwierdzono jednak różnice w okresie półtrwania w tkankach dla ISIS 107248, 113715 i 301012. Zaobserwowane różnice w szybkości metabolizmu leków ASO w wątrobie i nerkach wskazują, że mogą występować różnice w szybkości metabolizmu w różnych tkankach, lub bardziej złożoną kinetykę dla jakiejś serii leku, lub uzyskane wyniki po prostu odzwierciedlają niewielką liczbę próbek pobranych w ograniczonym czasie.

Szczegółowe badanie procesu eliminacji ASO drugiej generacji wskazuje na występowanie zróżnicowanego tempa ich eliminacji z różnych typów komórek wątroby. Ponieważ niektóre typy komórek, takie jak komórki kanalików bliższych kory nerek, zwykle zawierają ASO w fagolizosomach, ten typ wychwytu jest prawdopodobnie odpowiedzialny za różnice w szybkości metabolizmu leków w tkankach. Ponadto prawdopodobne jest, że określone sekwencje w strukturze szkieletu ASO mogą charakteryzować się różną wrażliwością na rozszczepienie przez endonukleazy.

Egzonukleazy bakteryjne wykazują wysoki stopień specyficzności sekwencji nukleotydów w szkielecie ASO, prawdopodobnie w celu ochrony przed wirusami. Większość aktywności nukleaz w komórkach ssaków jest związana z mechanizmami transkrypcji i naprawy DNA, dlatego specyficzność gatunkowa ssaków może różnić się od endonukleaz bakteryjnych. Nie wiadomo, czy za katabolizm tych syntetycznych ASO w równym stopniu odpowiadają procesy replikacji i działanie enzymów związanych ze zjawiskiem naprawy. Przy wysokich stężeniach ssDNA ASO mogą skutecznie konkurować z naturalnym podłożem. Wiele enzymów z rodziny nukleaz jest zdolnych do katabolizowania ASO. Identyfikacja konkretnych enzymów biorących udział w metabolizmie ASO nie jest kluczowa dla opracowania leków antysensownych, ale lepsze zrozumienie szlaków metabolicznych będzie przydatne w opracowywaniu nowych technologii.

Metabolity ASO

Różnice w metabolizmie ASO pierwszej i drugiej generacji są bardzo oczywiste porównując profil metaboliczny z CGE. Kiedy próbki tkanek lub moczu są analizowane w detektorze LC/MS, charakter procesów metabolicznych staje się wyraźniejszy. Zazwyczaj ODN fosforotionianowe pierwszej generacji są metabolizowane do kaskady metabolitów ASO, z których każdy różni się o jeden nukleotyd w wyniku rozszczepienia egzonukleazy o pojedynczym nukleotydzie. Zatem po wprowadzeniu 20-meru, czyli składającego się z 20 nukleotydów, ODN pierwszej generacji, osocze i tkanki zawierają rodziny kolejno skróconych ASO, zaczynając od 19-meru i dalej aż do krótkiego ASO.

Początkowe rozszczepienie za pośrednictwem metabolizmu ASO drugiej generacji
endonukleazy, prowadzi do powstania dwóch ASO, jednego z 3" końcem MOE i drugiego z 5" końcem MOE. Rozszczepianie produktów z odsłoniętymi końcami można przeprowadzić albo za pomocą egzonukleazy 5-calowej, albo egzonukleazy 3-calowej. Wyniki połączonej aktywności endo- i egzonukleazy tworzą kaskadę produktów rozszczepienia o skróconych łańcuchach, z których wiele, jeśli nie wszystkie, można wykryć w moczu pobranym od zwierząt doświadczalnych lub ludzi. Mocz zwierząt leczonych lekiem lub pacjentów leczonych ASO drugiej generacji może zawierać metabolity w zakresie od dwóch możliwych 15-merów do dwóch możliwych 5-merów MOE oraz wiele kombinacji każdego metabolitu pośredniego.

Metabolity krótsze niż długość końców MOE będą obecne w tkankach, jeśli same końce MOE są substratami dla nukleaz. Metabolity te zazwyczaj nie są wykrywane za pomocą analizy widma mas, co sugeruje, że zazwyczaj nie występują mononukleotydy MOE uwalniane podczas metabolizmu. Zdarzają się jednak pewne wyjątki od tego uogólnienia. Dla ograniczonej liczby sekwencji nukleotydowych , w tkankach i osoczu obserwuje się jednonukleotydowe skrócenia ASO drugiej generacji – lub CGE lub LC/MS: metabolity wydają się być wynikiem trawienia egzonukleazą. Metabolity te można zaobserwować w początkowej dystrybucji. Oczekuje się, że szybko pojawią się w osoczu krwi. Mononukleotydy MOE powstające podczas metabolizmu nie są substratami do fosforylacji, a zatem jest mało prawdopodobne, że zostaną włączone do trifosforanów nukleotydów i ostatecznie do endogennych nukleotydów. Mononukleotydy MOE nie hamują enzymów odpowiedzialnych za syntezę DNA. Zatem mononukleotydy MOE, jeśli powstają, nie powinny być włączane do nukleotydów endogennych.

Centralna część deoksynukleotydów ASO drugiej generacji ulega rozszczepieniu egzonukleazą, w wyniku czego uwalnia się pojedynczy nukleotyd. Monodeoksynukleotydy wytwarzane w wyniku trawienia egzonukleazą są identyczne z nukleotydami endogennymi, z wyjątkiem grupy tiofosforanowej, która teoretycznie może być obecna. Jednakże grupa tiofosforanowa jest podatna na utlenianie i utratę siarki, co sprawia, że ​​końcowa grupa fosforanowa jest identyczna z endogennymi nukleotydami. Dlatego też, w przeciwieństwie do mononukleotydów MOE, każdy uwolniony deoksynukleotyd będzie naturalnie zawarty w wewnątrzkomórkowym magazynie endogennych nukleotydów. Nukleotydy, które zachowują grupy tiofosforanowe, będą substratami do dodania jednej lub dwóch grup fosforanowych, w wyniku czego powstaną mieszane di- lub trifosforany tiofosforanowe nukleotydów. Fosforylacja jest możliwa, ale obecność alfa tiofosforanu powoduje, że reakcje są niekorzystne termodynamicznie.

Wniosek

Znaczenie badania farmakokinetyki danych i leków podobnych do opisanych, a także tworzenia modeli na różnych gatunkach zwierząt, aby w pełni zrozumieć procesy zachodzące w organizmie po zażyciu leków, jest oczywiste. Badania nad podobnymi lekami trwają także w Rosji.

Literatura

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. i in. Badanie I fazy ISIS 2503, antysensownego inhibitora H-ras, w połączeniu z gemcytabiną u pacjentów z zaawansowanym nowotworem. // Klin. Rak Res. 2003. tom. 9, nr 1. s. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. i in. Mac-1 (CD11b/CD18) jest białkiem wiążącym ODN. //Nat. Med. 1997. Cz. 3, nr 4. s. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziołkiewicz M. i in. Wiązanie ODN tiofosforanowych z zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, rekombinowanym rozpuszczalnym CD4, lamininą i fibronektyną w sposób niezależny od P-chiralności. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 1995. tom. 23, nr 21. Str. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. i in. Losy in vitro antysensownych ODN tiofosforanów: dominujący wychwyt przez receptory zmiatające na komórkach śródbłonka. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 1997. Cz. 25, nr 16. Str. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. i in. Modulacja wiązania białek osocza i wychwytu ODN tiofosforanów in vitro przez komórki wątroby przez sprzęganie cholesterolu. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 2000. tom. 28, nr 14. s. 2717.

6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. i in. Wpływ modyfikacji tiofosforanowej ODN na specyficzne wiązanie białek. // J. Biol. Chem. 1994. tom. 269, nr 43. R.26801.

7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. i in. Fosforotionianowe ODN rozprowadzają się podobnie u myszy z nokautem receptora klasy A i myszy typu dzikiego. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2000. tom. 292, nr 2. s. 489.

8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Dystrybucja w rdzeniu kręgowym i metabolizm 2_-O-(2-metoksyetylo)-modyfikowanych ASO po podaniu dooponowym szczurom. // Neuronauka. 2005. Cz. 131, nr 3. s. 705.

9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Komórkowa dystrybucja ODN fosforotionianów w normalnych tkankach gryzoni. //Laboratorium. Inwestować. 1997. Cz. 77, nr 4. s. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. i in. Dyspozycja tiofosforanu znakowanego 14C ASO ISIS 2105 po dożylnym podaniu szczurom. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1993. tom. 267, nr 3. Str. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. i in. Farmakokinetyka tiofosforanu ASO znakowanego 14C, ISIS 2105, po śródskórnym podaniu szczurom. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1994. tom. 269, nr 1. s. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. i in. Właściwości farmakokinetyczne kilku nowych analogów ASO u myszy. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1996. tom. 277, nr 2. s. 923.

13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Oparte na ASO hamowanie ekspresji genów embrionalnych. //Nat. Biotechnologia. 1999. Cz. 17. s. 1184.

14. Eckstein F. Fosforotionianowe ODN: jakie jest ich pochodzenie i co jest w nich wyjątkowego? //Nukl antysensowny Acid Drug Dev. 2000. tom. 10, nr 2. R. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Spektrometria masowa HPLC on-line z elektrorozpylaniem metabolitów tiofosforanu ASO. //Analny. Chem. 1997. Cz. 69, nr 3. s. 313.

16. Geary R.S. Aktualna ocena zależności PK/PD dla leków antysensownych. // Światowy Kongres Farmacji i Nauk Farmaceutycznych, Nicea, Francja, 2002.

17. Geary R. S., Bradley J. D., Watanabe T. i in. Brak interakcji farmakokinetycznych dla ISIS 113715, zmodyfikowanego 2_-O-metoksyetylem oligonukleotydu antysensownego ukierunkowanego na informacyjny RNA białkowej fosfatazy tyrozynowej 1B, z doustnymi związkami przeciwcukrzycowymi metforminą, glipizydem lub rozyglitazonem. // Klin. Farmakokineta. 2006. tom. 45, nr 8. s. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. i in. Farmakokinetyka i metabolizm u myszy antysensownego inhibitora tiofosforanowego ASO ekspresji kinazy C-raf-1.// Drug Metab. Usuwa. 1997. Cz. 25, nr 11. R. 1272.

19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Antysensowne inhibitory oligonukleotydowe do leczenia raka: 1. Właściwości farmakokinetyczne ODN tiofosforanowych. // Des. leku przeciwnowotworowego. 1997. Cz. 12, nr 5. R. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. i in. Niezależna od sekwencji farmakokinetyka osocza i tkanek dla 3 antysensownych ASO tiofosforanów: mysz do człowieka. // w Amerykańskim Stowarzyszeniu Naukowców Farmaceutycznych, Pharm. Badania, Plenum Press, Seattle, Waszyngton. 1996. RS

21. Geary R. S., Teng C. L., Truong L. i in. Ekstrakcja wątrobowa pierwszego przejścia częściowo zmodyfikowanych chimerycznych oligonukleotydów antysensownych u psów rasy Beagle. // na dorocznym spotkaniu Amerykańskiego Stowarzyszenia Naukowców Farmaceutycznych, Indianapolis, IN, 2000. s. 216.

22. Geary RS, Ushiro-Watanabe T, Truong L i in. Właściwości farmakokinetyczne 2_-O-(2-metoksyetylo)-modyfikowanych analogów ASO u szczurów. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2001. tom. 296, nr 3. R. 890.

23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Farmakokinetyka antysensownych ODN tiofosforanów. //Bieżący Opinia. Inwestować. Narkotyki. 2001. tom. 2, nr 4. R. 562.

24. Geary R. S., Yu R. Z., Watanabe T. i in. Farmakokinetyka czynnika martwicy nowotworu - tiofosforanu alfa 2_-O-(2-metoksyetylo) modyfikowanego oligonukleotydów antysensownych: porównanie różnych gatunków. // Metab. leków Usuwa. 2003. tom. 31, nr 11. Str. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y., Membrane transporters and drug Response, w: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 11, Brunton, L.L., wyd., McGraw-Hill, Nowy Jork, 2006. s. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Powalenie genu cytoprotekcyjnego, klusteryny, w celu zwiększenia wrażliwości hormonalnej i chemicznej w przypadku raka prostaty i innych nowotworów. //Anna. NY Acad. Nauka. 2005. Tom 1058. Str. 1.

27. Gleave M., Miyake H. Zastosowanie antysensownych oligonukleotydów ukierunkowanych na gen cytoprotekcyjny, klaster, w celu zwiększenia wrażliwości na androgeny i chemię w raku prostaty. // Świat J. Urol. 23. 2005. Nr 1. s. 38.

28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. i in. Profil bezpieczeństwa i farmakokinetyki fazy I antysensownej ODN cząsteczki adhezji międzykomórkowej-1 (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1997. Cz. 282, nr 3. R. 1173.

29. Graham M.J., Crooke ST., Monteith D.K. i in. Dystrybucja in vitro i metabolizm tiofosforanu ASO w wątrobie szczura po podaniu dożylnym. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1998. Cz. 286, nr 1. s. 447.

30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Fosforotionianowe ODN wiążą się z zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, hamują jego wiązanie z receptorami na powierzchni komórki i usuwają go z miejsc wiązania o niskim powinowactwie na macierzy zewnątrzkomórkowej. // J. Biol. Chem. 1995. tom. 270. s.2620.

31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Wpływ ludzkich i mysich inhibitorów oligonukleotydów antysensownych ICAM-1 na zdolności reprodukcyjne, rozwój płodu i rozwój pourodzeniowy u myszy. // Wady wrodzone Res. B rozw. Odtwórz Toksyk. 2004. Cz. 71, nr 6. s. 359.

32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. i in. Hamowanie ekspresji kinazy białkowej C alfa rdzenia kręgowego przez antysensowny oligonukleotyd osłabia tolerancję wywołaną wlewem morfiny. // Neuronauka. 2002. tom. 113, nr 1. s. 99.

33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Hamowanie angiogenezy przez antysensowne oligonukleotydy do klusteryny. // Angiogeneza. 2005. Cz. 8, nr 3. s. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. i in. Silna redukcja apolipoproteiny B i cholesterolu lipoprotein o małej gęstości poprzez krótkotrwałe podanie antysensownego inhibitora apolipoproteiny B. // Krążenie. 2006. tom. 114, nr 16. Str. 1729.

35. Koziołkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodyferncja – wpływ chiralności P oligo(tiofosforanów nukleozydów) na aktywność bakteryjnej RNazy H. // Nucl. Kwasy Rozdzielczość 1995. tom 23, nr 24. 5000 R.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Farmakokinetyczne właściwości tiofosforanowych ASO u ludzi, w Antisense Research and Applications, wyd. 1, Crooke, S. T., wyd., Springer, Heidelberg, 1998. str. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Porównanie farmakokinetyki podskórnego i dożylnego podawania oligodeoksynukleotydu tiofosforanowego u małp cynomolgus. // Antysensowny Nukl. Acid Drug Dev. 2000. tom 10, nr 6. R. 435.

38. Levin A.A. Przegląd zagadnień farmakokinetyki i toksykologii antysensownych oligonukleotydów tiofosforanowych. //Biochim. Biofizyka. Akta. 1999. tom 1489, nr 1. R. 69.

39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. i in. The farmakokinetyka i toksyczność tiofosforanowych ASO, w: Biotechnology and Safety Assessment, 2nd ed., Thomas, J.A., ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. str. 151.

40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. i in. Przedkliniczny rozwój środków terapeutycznych antysensownych, w Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, wyd. 1, Oxender D.L. i Post L.E., red., Springer-Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1998, s. 131.

41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toxicity of antysensownych oligonukleotydów. // w Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., red., Marcel Dekker, Nowy Jork, 2001. s. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. i in. Charakterystyka transportu ASO do żywych komórek. //Proc. Natl. Acad. Nauka. USA. 1989. tom. 86. s. 3474.

43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Przemieszczanie się nukleocytoplazmy: nowa właściwość in vitro antysensownych ODN tiofosforanów. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 2000. tom. 28, nr 2. s. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. i in. Biodostępność i aktywność terapeutyczna alicaforsenu (ISIS 2302) podawanego w postaci wlewu zatrzymującego w odbycie pacjentom z czynnym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego. // Dolegliwość Pharmacol. Tam. 2006. tom. 23, nr 10. R. 1427.

45. Mou T.C., Gray D.M. Wysokie powinowactwo wiązania oligomerów modyfikowanych tiofosforanem do białka genu Ff 5 jest łagodzone przez dodanie modyfikacji C-5 propynowych lub 2_-O-metylowych. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 2002. tom. 30, nr 3. R. 749.

46. ​​​​Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Właściwości farmakokinetyczne tiofosforanów u zwierząt – absorpcja, dystrybucja, metabolizm i eliminacja, w Antisense Research and Applications, wydanie 1, Crooke, S. T., red., Springer, Berlin, 1998. str. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. i in. Dystrybucja w tkankach i farmakokinetyka antysensownego tiofosforanu ASO ISIS 1082 u szczurów oparta na fizjologii. // Antysensowny Nukl. Acid Drug Dev. 2001. tom. 11, nr 1. Str. 15.

48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. i in. Farmakokinetyka, metabolizm i eliminacja 20-merowego tiofosforanu ODN (CGP 69846A) po podaniu dożylnym i podskórnym. // Biochemia. Farmakol. 1997. Cz. 54, nr 6. R. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Dyspozycja ASO w izolowanej perfundowanej nerce szczura: zaangażowanie receptorów zmiatających w ich wychwycie przez nerki. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1996. tom. 279, nr 1. s. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. i in. Badanie fazy I ISIS 104838, zmodyfikowanego 2_-metoksyetylem oligonukleotydów antysensownych ukierunkowanych na czynnik martwicy nowotworu alfa. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2002. tom. 303, nr 3. R. 1334.

51. Slim G., Gait M.J. Konfigurowalnie zdefiniowane oligorybonukleotydy zawierające tiofosforan w badaniu mechanizmu rozszczepiania rybozymów typu młotek. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 1991. tom. 19, nr 6. R. 1183.

52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Asocjacja komórkowa, dystrybucja wewnątrzkomórkowa i wypływ auranofiny poprzez sekwencyjne reakcje wymiany ligandów. // Biochemia. Farmakol. 1986. tom. 35, nr 6. s. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. i in. Rozkład tiofosforanu ASO u matki i płodu u szczurów po wlewie dożylnym. // Wady wrodzone Res. B rozw. Odtwórz Toksyk. 2006. tom. 77, nr 1. Str. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Hamowanie dezoksyrybonukleaz przez grupy fosforotionianowe w oligodeoksyrybonukleotydach. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 1988. tom. 16, nr 24. R. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Farmakokinetyka i efekt pierwszego przejścia przez wątrobę antysensownego oligonukleotydu (ISIS 2302) u szczurów. // na dorocznym spotkaniu Amerykańskiego Stowarzyszenia Naukowców Farmaceutycznych, Indianapolis, IN, 2000. s. 216.

56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. i in. Profil farmakokinetyczny i toksyczności tiofosforanu ASO po podaniu wziewnym do płuc u myszy. // Antysensowny Nukl. Acid Drug Dev. 2000. tom. 10, nr 5. R. 359.

57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. i in. Struktura krystaliczna i ulepszone właściwości antysensowne 2_-O-(2-metoksyetylo)-RNA. //Nat. Struktura. Biol. 1999. tom 6, nr 6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. i in. Badanie fazy I/II dotyczące LY900003, antysensownego inhibitora kinazy białkowej C-alfa, w skojarzeniu z cisplatyną i gemcytabiną u pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc. // Klin. Rak Res. 2004. Cz. 10, nr 18 pkt 1. s. 6086.

59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Wiązanie antysensownego oligonukleotydu z białkami osocza nakierowanego na ludzki ICAM-1 (ISIS 2302). // ASO. 2006. tom. 16, nr 2. s. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. i in. Hydratacja jednoniciowych oligodeoksyrybonukleotydów fosfodiestrowych i tiofosforanowych. // Nukl. Kwasy Rozdzielczość 1996. tom. 24, nr 16. R. 3261.

61. Wilson D.M. Po trzecie, aktywność endonukleazy zasadowej Ape1 jest regulowana przez stężenie magnezu i potasu i jest odporna na alternatywne struktury DNA. // J. Mol. Biol. 2005. Cz. 345, nr 5. Str. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E. R., Roskey A. i in. Fosforotioniany ODN wzbogacone stereofonicznie: synteza, właściwości biofizyczne i biologiczne. //Biorg. Med. Chem. 2000. tom 8, nr 1. R. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Opracowanie ultraczułego, niekonkurencyjnego testu immunoenzymatycznego z hybrydyzacją-ligacją do oznaczania ODN fosforotionianu w osoczu. //Analny. Biochemia. 2002. tom. 304, nr 1. Str. 19.

64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. i in. Porównanie farmakokinetyki i rozmieszczenia w tkankach antysensownego tiofosforanu ASO nakierowanego na ludzki mRNA Ha-ras u myszy i małp. // J.Pharm. Nauka. 2001. tom. 90, nr 2. s. 182.

65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Zastosowanie nowych ilościowych metod bioanalitycznych do oceny farmakokinetyki i farmakokinetyki/farmakodynamiki oligonukleotydów antysensownych. //Bieżący Opinia. Odkrycie narkotyków. Rozw. 2004. Cz. 7, nr 2. R. 195.

66. Yu R. Z., Kim T. W., Hong A. i in. Porównanie farmakokinetyki międzygatunkowej od myszy do człowieka antysensownego oligonukleotydu drugiej generacji ISIS 301012, ukierunkowanego na ludzką apolipoproteinę B-100. // Metab. leków Usuwa. 2007. Cz. 35. s. 460.

67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. i in. Farmakokinetyka i farmakodynamika antysensownego tiofosforanu ASO ukierunkowanego na mRNA Fas u myszy. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2001. tom. 296, nr 2. s. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillian J.M. i in. Antysensowny oligonukleotyd PTP1B obniża białko PTP1B, normalizuje poziom glukozy we krwi i poprawia wrażliwość na insulinę u myszy z cukrzycą. //Proc. Natl. Acad. Nauka. USA. 2002. tom. 99, nr 17. Str. 1137.

Lek na geny

Wieloletnim marzeniem lekarzy jest dysponowanie substancjami działającymi na określone geny, czyli tzw. do pierwotnej przyczyny wielu chorób. Rzeczywiście, na bazie takich substancji można stworzyć leki - prawdziwe „magiczne kule”, które mogą atakować dziedziczny materiał różnych czynników zakaźnych, nie wyrządzając szkody organizmowi ludzkiemu, a także tłumić aktywność onkogenów odpowiedzialnych za nowotwory złośliwe Wzrost komórek. Tworzenie takich substancji, które specyficznie wpływają na materiał genetyczny, jest jednym z głównych zadań biologii molekularnej, ponieważ za ich pomocą można badać funkcje genów i ostatecznie kontrolować pracę tego ostatniego

Ale jak zmienić pożądany program genetyczny? Przecież wszystkie geny mają podobny skład chemiczny i budowę: różnice między nimi sprowadzają się jedynie do kolejności naprzemienności czterech bloków monomerów – nukleotydów A, T, G, C. Aby wpłynąć na konkretny gen, cząsteczka substancja musi w jakiś sposób rozpoznać tę sekwencję nukleotydów - zadanie na pierwszy rzut oka jest nierozwiązywalne.

Inaczej jednak myślała grupa syberyjskich chemików, która przybyła do Nowosybirskiego Miasta Akademickiego w pierwszych latach jego powstania. Pracownicy Instytutu Chemii Organicznej Oddziału Syberyjskiego Akademii Nauk ZSRR (Nowosybirsk) N.I. Grineva i D.G. Knorre, w oparciu o zasadę rozpoznawania molekularnego stosowaną przez samą naturę, sformułowali ideę ukierunkowanego wpływu na geny przy użyciu oligonukleotydów - fragmentów kwasów nukleinowych, „uzbrojonych” w specjalne substancje chemiczne w grupach. Syberyjscy chemicy opublikowali swoją pierwszą pracę na temat oligonukleotydów w 1967 roku - datę tę dziś uważa się za oficjalną datę pojawienia się nowego kierunku w biologii molekularnej i farmakologii.

Oni byli pierwsi

Realizacją tego niezwykle śmiałego projektu (wówczas nie planowano prowadzenia takich badań gdziekolwiek na świecie) w początkowej fazie zajmowała się niewielka grupa młodych pracowników, doktorantów i studentów NSW. Musieliśmy zaczynać praktycznie od zera, ponieważ w tamtym czasie nie wiedzieli jeszcze, jak syntetyzować oligonukleotydy w zauważalnych ilościach; Brakowało instrumentów technicznych niezbędnych do pracy z małymi ilościami kwasów nukleinowych i skutecznych metod określania ich sekwencji. Naszym chemikom udało się rozwiązać te problemy dzięki interdyscyplinarności – jednej z zasad, która leżała u podstaw działalności Oddziału Syberyjskiego.

W NIOH zorganizowano produkcję kwasów nukleinowych i opracowano metody ich chemicznej modyfikacji; wspólnie z pracownikami Instytutu Fizyki Jądrowej udało się stworzyć instrumenty do analizy kwasów nukleinowych i manipulacji niewielkimi ich ilościami oraz wspólnie z chemikami z Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego rozpoczęli prace nad stworzeniem automatycznych syntezatorów oligonukleotydów. Dzięki temu naukowcy mieli do dyspozycji niemal wszystkie niezbędne metody i instrumenty analityczne – można było rozpocząć badania biologiczne.

Eksperymenty przeprowadzone najpierw na prostych modelach, a następnie na naturalnych kwasach nukleinowych wykazały, że oligonukleotydy rzeczywiście oddziałują z docelowymi kwasami nukleinowymi z wysokim stopniem selektywności. W przypadku przyłączenia grup reaktywnych do oligonukleotydów następuje ukierunkowana modyfikacja chemiczna celów – kwasów nukleinowych. Ponadto po raz pierwszy wykazano, że za pomocą tych odczynników można tłumić infekcje wirusowe u zwierząt, a także wykazano możliwość ich wprowadzenia do organizmu przez skórę, błony śluzowe itp.

Wczesne publikacje na temat efektów biologicznych wywoływanych przez oligonukleotydy wzbudziły duże zainteresowanie wśród specjalistów na całym świecie. W 1988 r. w Akademgorodok odbyło się pierwsze na świecie sympozjum na temat substancji ukierunkowanych genowo, opartych na fragmentach kwasów nukleinowych. Do prac nad stworzeniem takich leków włączyli się naukowcy z USA, Francji, a następnie innych krajów; Powstały dziesiątki firm, których celem jest tworzenie leków terapeutycznych opartych na oligonukleotydach.

Medycyna komplementarna

Pierwszym z leków nakierowanych genowo były tak zwane oligonukleotydy antysensowne, zaprojektowane do selektywnej inaktywacji wirusowych RNA i niektórych komórkowych RNA. Początkowo zakładano, że te oligonukleotydy będą miały przyłączone grupy reaktywne, które będą chemicznie modyfikować lub niszczyć docelowe kwasy nukleinowe. Okazało się jednak, że samo przyłączenie oligonukleotydów do docelowego RNA ma na niego tak duży wpływ, że może wywołać jego zniszczenie przez enzymy komórkowe.

D. G. KNORRE – Akademik Rosyjskiej Akademii Nauk, specjalista w dziedzinie kinetyki chemicznej, biologii molekularnej i chemii bioorganicznej. Kierownik Pracowni Chemii Polimerów Naturalnych (1960-1984), Zakładu Biochemii i Pracowni Chemii Kwasów Nukleinowych (1970-1984) Instytutu Chemii Organicznej Oddziału Syberyjskiego Akademii Nauk ZSRR, Dyrektor Instytutu Chemii Bioorganicznej Oddziału Syberyjskiego Akademii Nauk ZSRR i Oddziału Syberyjskiego Rosyjskiej Akademii Nauk (1984-1996). ) Podejścia antysensowne oparte na zastosowaniu nukleotydów i kwasów nukleinowych do tłumienia aktywności biologicznej kwasów nukleinowych stwarzają interesujące perspektywy w przypadkach, gdy konieczne jest powstrzymanie wdrażania niepożądanych informacji w organizmach żywych. Przede wszystkim otwiera się perspektywa stworzenia nowej generacji leków przeciwwirusowych i przeciwnowotworowych. Leki takie mają jedną niezaprzeczalną przewagę nad innymi... Wszystkie oligonukleotydy, niezależnie od celu, w jakim są skierowane, można wytworzyć przy użyciu jednej technologii. Należy jedynie zmienić sekwencję nukleotydów. Szczególnie w wirusologii i onkologii często mamy do czynienia ze zjawiskiem lekooporności. Dzieje się tak najczęściej, gdy pojedyncza cząsteczka wirusa lub pojedyncza komórka nowotworowa ulega mutacji, która prowadzi do takiej oporności. W każdym innym przypadku należy rozpocząć empiryczne poszukiwania nowego leku. W przypadku skutków antysensownych konieczne jest jedynie określenie, jaka zmiana w strukturze genomu wirusa lub onkogenu doprowadziła do pojawienia się oporności. Po czym od razu staje się jasne, jak stworzyć nowy lek przy użyciu tej samej ujednoliconej technologii*.

* Magazyn edukacyjny Sorosa. - 1998. - 12. - s. 25-31.

Najpotężniejszym sposobem „wyłączenia” genów okazały się interferujące RNA - krótkie dwuniciowe kompleksy oligonukleotydów RNA. Kiedy taki kompleks zostaje wprowadzony do komórki, jeden z łańcuchów wiąże się z jego komplementarną sekwencją w informacyjnym RNA komórki. Służy to jako sygnał do uruchomienia grupy enzymów, które przecinają RNA związany z oligonukleotydami. W efekcie zanika program syntezy konkretnego białka.

W 2006 roku dwóch amerykańskich badaczy otrzymało Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny za wyjaśnienie mechanizmu interferencji RNA. Stworzenie regulatorów ekspresji genów w oparciu o interferujący RNA otworzyło ogromne możliwości uzyskania szerokiej gamy wysoce skutecznych, nietoksycznych leków, które hamują ekspresję niemal wszystkich genów, w tym genów nowotworowych i wirusowych.

Poprawne mutacje

Uwagę specjalistów od dawna przyciągają metody mutagennego oddziaływania na DNA z wykorzystaniem oligonukleotydów lub ich pochodnych. Jeśli się powiedzie, to, co dziś wydaje się science fiction, może stać się rzeczywistością: korekta wadliwych programów genetycznych.

Udowodniono już eksperymentalnie, że przy użyciu krótkich oligonukleotydów możliwe jest wprowadzenie mutacji punktowych do programów genetycznych. Jak to zrobić? Mutagenne oligonukleotydy zawierające „niewłaściwe” bloki nukleotydowe wprowadzane są do komórki, gdzie łączą się z DNA. W efekcie w niektórych fragmentach sekwencji nukleotydowych pojawiają się „nieprawidłowe”, czyli niekomplementarne pary zasad, co jest odbierane przez komórkowy system naprawy („naprawy”) DNA jako uszkodzenie. Nukleotydy w takiej parze zastępowane są przez enzymy naprawcze, dzięki czemu staje się ona „poprawna”, komplementarna. W tym przypadku zamiana może nastąpić zarówno w sekwencji oligonukleotydowej, jak i w samym komórkowym DNA.

W tym drugim przypadku mamy do czynienia ze zmianą w programie genetycznym, czyli z mutacją. I choć efektywność takiego procesu mutacji jest generalnie niska, można go zastosować w odniesieniu do nowych technologii komórkowych. Przykładowo komórki macierzyste od pacjenta z jakąś chorobą dziedziczną można leczyć selektywnym mutagenem, a następnie można selekcjonować, namnażać i wprowadzać te, w których wystąpiła pożądana mutacja (czyli komórki z „skorygowanym” programem genetycznym) w ciało.

1967 Opublikowano pierwszą pracę dotyczącą oligonukleotydów – substancji biologicznie czynnych ukierunkowanych na geny

Zatem istniejące dziś oligonukleotydy są w stanie regulować „pracę” genów na różnych poziomach. Tym samym wspomniane antysensowne oligonukleotydy i interferujące RNA działają na etapie syntezy białek, wpływając na informacyjne RNA – cząsteczki informacyjne, w których zbudowane są łańcuchy polipeptydowe. Oligonukleotydy antygenowe tworzące kompleksy z DNA hamują ekspresję genów – tworzenie samych informacyjnych RNA, a aptamery oligonukleotydowe mogą, podobnie jak przeciwciała, tworzyć wiązania z określonymi białkami, blokując je. Ponadto niektóre oligonukleotydy mają zdolność stymulowania układu odpornościowego, dziś są stosowane jako składniki szczepionek.

Obecnie opracowywaniem i syntezą oligonukleotydów i ich analogów zajmują się duże sektory badawcze i przemysłowe. Tym samym w zeszłym roku wielkość rynku oligonukleotydów przeznaczonych wyłącznie do celów badawczych przekroczyła 800 milionów dolarów! Obecnie opracowano i zsyntetyzowano dziesiątki nowych typów chemicznie modyfikowanych oligonukleotydów, a także testuje się szereg pochodzących z nich leków przeciwwirusowych i przeciwzapalnych. Badania tego rodzaju w Rosji prowadzone są obecnie głównie w Instytucie Biologii Chemicznej i Medycyny Podstawowej SB RAS, gdzie pracują studenci i naśladowcy akademika D. G. Knorre'a.

W ten sposób samo życie udowodniło płodność idei, która zrodziła się w Oddziale Syberyjskim czterdzieści lat temu. Wykorzystując krótkie fragmenty kwasów nukleinowych jako podstawowe struktury do tworzenia ukierunkowanych genowo substancji biologicznie aktywnych, możliwe jest szybkie opracowanie i wprowadzenie do produkcji specyficznych leków przeciwko niemal każdemu wirusowi. Aby to zrobić, wystarczy rozszyfrować sekwencję nukleotydów genów wirusa, co jest łatwe do wykonania przy pomocy nowoczesnych technologii. To uniwersalne podejście ma wielką przyszłość: wyniki badań prowadzonych w ostatnich latach, w szczególności nad mutagenezą celowaną, pozwalają oczekiwać, że wkrótce pojawią się skuteczne leki zwalczające choroby wciąż uważane za nieuleczalne.

Wstęp

Rozwój leków celowanych jest priorytetowym zadaniem współczesnej biologii molekularnej, chemii bioorganicznej i medycyny. Obecnie istnieje duża liczba prac odzwierciedlających różne podejścia do rozwiązania tego problemu. Z wielu powodów najbardziej obiecujące podejście opiera się na wyborze mRNA białka patogennego jako celu i wykorzystaniu właściwości komplementarności w interakcji kwasów nukleinowych ze sobą. Obecnie prace prowadzone są w trzech kierunkach:

Oligonukleotydy antysensowne;

Rybozymy i DNAzymy;

SiRNA i miRNA.

Metody te opierają się na zastosowaniu krótkich cząsteczek kwasu nukleinowego (17 - 70 nt) o sekwencji, która jest częściowo lub całkowicie komplementarna do docelowego regionu mRNA. Ogólne zasady działania takich środków jednoczą je także w obszarze pojawiających się problemów, spośród których najbardziej palące to dostarczanie do komórki, odporność na nukleazy oraz skuteczność oddziaływania z docelowym mRNA. Modyfikacje chemiczne środków NC pomagają częściowo lub całkowicie rozwiązać wiele z tych problemów i zwiększyć skuteczność środków.

Badanie mechanizmów supresji ekspresji genów za pomocą oddziaływań komplementarnych wymaga zastosowania metod analitycznych, które pozwalają jednoznacznie określić antysensowny efekt oligonukleotydów.

Celem pracy jest opracowanie metody hamowania ekspresji genu EGFP w komórkach z wykorzystaniem koniugatów oligonukleotydów z pirenem.

Modyfikacje oligonukleotydów antysensownych (przegląd literatury)

Rozwój leków pozwalających na poziomie genów zapobiegać rozwojowi chorób wywołanych ekspresją białek chorobotwórczych (produktów wirusowych, onkogenowych) lub białek uniemożliwiających ich wyleczenie (MDR) doprowadził do pojawienia się i rozwoju technologii antysensownej . Zasada technologii antysensownej jest prosta: antysensowne oligorybonukleotydy powodują supresję ekspresji genu docelowego w sposób specyficzny dla sekwencji, wykorzystując zdolność oligonukleotydów do hybrydyzacji z docelowym mRNA poprzez interakcje Watsona-Cricka. Oligonukleotyd, wiążąc się z docelowym RNA, zapobiega jego dalszej obróbce. Doświadczenia na hodowlach komórkowych wykazały, że zastosowanie oligodeoksyrybonukleotydów (zwanych dalej ODN) o długości 20 - 30 nt, komplementarnych do regionu mRNA, znacząco zmniejsza poziom ekspresji kodowanego przez nie białka. Rozwój metody wykazał szereg przyczyn prowadzących do zmniejszenia skuteczności ODN: krótki czas życia ODN w surowicy, niską skuteczność przenikania (transportu) do wnętrza komórki oraz niewystarczającą skuteczność wiązania z fragmentami ustrukturyzowanego RNA.

Rozwój chemii organicznej, w szczególności chemii kwasów nukleinowych, pozwala szukać sposobów rozwiązywania pojawiających się problemów poprzez wprowadzanie różnych modyfikacji chemicznych ODN. Zarówno zasady azotowe, jak i szkielet cukrowo-fosforanowy można poddać modyfikacji chemicznej, co prowadzi do zwiększenia jego oporności na nukleazę ODN i efektywności jego wiązania z sekwencją komplementarną. Próbują zwiększyć efektywność dostarczania ODN do komórki, wprowadzając do jej składu na jednym końcu różne grupy, ułatwiające przejście przez membranę.

Istnieją głównie dwa mechanizmy działania oligonukleotydów antysensownych: zatrzymanie translacji w wyniku wiązania regionu regulatorowego i rozszczepienie RNA jako części heterodupleksu RNA-DNA. Dokonywanie modyfikacji może mieć różne skutki poprzez taki czy inny mechanizm, co należy wziąć pod uwagę przy wyborze opcji modyfikacji.

1.1 Mechanizm działania oligonukleotydów antysensownych

Kiedy antysensowny oligonukleotyd oddziałuje z mRNA, zachodzą dwa zdarzenia: blokowanie steryczne i rozszczepienie docelowego mRNA przez RNazę H. W przypadku niektórych oligonukleotydów zachodzą oba zdarzenia (oligonukleotydy kompetentne pod względem RNazy H), w przypadku innych tylko blokowanie steryczne (niezależne od RNazy H). ). Te dwie opcje opierają się na różnych mechanizmach komórkowych. W przypadku drugiej opcji uwzględniony zostanie najszerszy zakres mechanizmów molekularnych. Osiąga się to poprzez ukierunkowanie oligonukleotydów na określone sekwencje regulatorowe, zarówno w pre-mRNA, jak i w mRNA. W przypadku pre-mRNA skierowanie ODN na obszar graniczny pomiędzy intronem a eksonem zakłóca splicing, prowadząc albo do jego zatrzymania, albo do powstania mRNA kodującego niefunkcjonalne białko (patrz ryc. 1). Innym obiecującym miejscem wiązania ODN w pre-mRNA jest region 5"-końcowy. Oddziaływanie ODN z tym regionem prowadzi do blokowania czapeczki.

Kiedy ODN oddziałuje z mRNA, jego translacja, a w konsekwencji synteza białek, zostaje zakłócona poprzez zablokowanie ruchu rybosomu wzdłuż mRNA lub nawet jego składania, w zależności od położenia miejsca wiązania.

Ryc.1.

ODN kompetentne wobec RNazy H można celować w dowolny region pre-mRNA i mRNA, ponieważ ich działanie opiera się na aktywacji RNazy H, której substratem jest RNA będący częścią dupleksów RNA-DNA. Jednakże wiele chemicznie modyfikowanych oligonukleotydów antysensownych nie jest w stanie aktywować tego mechanizmu ze względu na wysoką specyficzność przestrzenną RNazy H. Dzieje się tak dlatego, że większość modyfikacji prowadzi do zmian parametrów helisy dupleksu ODN – RNA i przestają one działać. być substratami dla RNazy H.

Oligonukleotydy antysensowne drugiej generacji - modyfikowane w pozycji 2" reszty cukrowej - nie są substratami RNazy H, dlatego należy szukać innych czynników rozszczepiających (sztucznych RNaz). Szereg małych cząsteczek (interkalatory, polikationy) jest zdolnych do rozszczepiania docelowy RNA.Przyłączenie grup reaktywnych do oligonukleotydów prowadzi do rozszczepienia pożądanych regionów docelowego RNA.Grupami takimi są kompleksy metali, aminy, oligopeptydy i konstrukty molekularne z grupami miejsca aktywnego nukleaz (pierścień imidazolowy, COO - -, NH 2 grupy, guanidyna).

1.2 Modyfikacje oligonukleotydów antysensownych

1.2.1 Strategie rozwoju modyfikacji chemicznych oligonukleotydów

Na podstawie zgromadzonych danych na temat stosowania oligonukleotydów antysensownych sformułowano szereg kryteriów, jakie musi spełniać ODN, aby był skutecznym środkiem terapeutycznym:

Oporność na nukleazy

wysokie powinowactwo do celu

tworzenie substratu RNazy H

· różne mechanizmy działania (wpływ alternatywnego splicingu, zatrzymanie translacji)

nietoksyczny i specyficzny

Możliwość nieswoistego wiązania się z białkami w celu transportu

· łatwość syntezy, zdolność patentowa, korzyści

Natywne ODN nie są w stanie w pełni spełnić wszystkich powyższych kryteriów. Głównymi ograniczeniami są słaba oporność na nukleazy i niewystarczająco stabilne kompleksy ODN - RNA. Wprowadzenie modyfikacji chemicznych do ODN dla wszystkich lub poszczególnych nukleotydów może w dużym stopniu wyeliminować istniejące niedociągnięcia. Modyfikacje ODN przeprowadza się na grupie fosforanowej, reszcie sacharozy, zasadzie azotowej lub końcowych resztach fosforanowych. Aby zwiększyć oporność na nukleazy, modyfikację najczęściej przeprowadza się na grupie fosforanowej i reszcie dezoksyrybozy. Zwiększenie skuteczności wiązania uzyskuje się poprzez modyfikację zasad azotowych, a także reszty dezoksyrybozy. Aby zwiększyć efektywność wiązania z białkami i usprawnić transport, przeprowadza się koniugację z ligandami o różnym charakterze. W niektórych przypadkach przyłączone struktury chemiczne działają jak katalizatory wiązań fosfodiestrowych w RNA.

1.2.2 Modyfikacje grupy fosforanowej

Rozszczepienie wiązań fosfodiestrowych w DNA przez nukleazy następuje poprzez efektywne wiązanie w miejscu aktywnym i wykorzystanie właściwości kwasowo-zasadowych grupy fosforanowej. Jednym ze sposobów zwiększenia odporności wiązań ODN na nukleazy jest zmiana konfiguracji elektronowej grupy fosforanowej. Aby to zrobić, jeden z niezwiązanych atomów tlenu zostaje zastąpiony atomem innego pierwiastka. Siarka była jednym z pierwszych zastosowanych jako taki pierwiastek, co doprowadziło do wytworzenia tiofosforanów (modyfikowanych oligonukleotydów antysensownych pierwszej generacji; patrz ryc. 2, II).

Ryż. 2.

Fosforotioniany wykazywały wysoką odporność na nukleazy, jednak modyfikacja ta znacznie zwiększała toksyczność ODN.

Zastępując niezwiązany atom tlenu grupy fosforanowej grupą metylową, otrzymuje się metylofosfoniany (patrz ryc. 3, III), które wykazują dużą odporność na działanie nukleaz. Modyfikację często przeprowadza się tylko na końcowych nukleotydach, co prowadzi do zmniejszenia toksyczności.

Jeśli zastąpisz atom tlenu fosforanu resztą BH3, otrzymasz boranofosforany. Reszta -BH3 - jest izoelektronowa w stosunku do atomu tlenu w wiązaniach fosfodiestrowych, dzięki czemu boranofosforany zachowują swój ładunek ujemny, są dobrze rozpuszczalne w wodzie i tworzą kompleksy z docelowym RNA. Reszta ta jest również izoelektroniczna i izosteryczna w stosunku do grupy metylowej, dzięki czemu można spodziewać się właściwości podobnych do metylofosfonianów, takich jak odporność na nukleazy.

Ryż. 3.

1.2.3 Modyfikacje pozostałości cukru

Modyfikacje wiązań fosfodiestrowych nie mają istotnego wpływu na stabilność heterodupleksu DNA-RNA. Dlatego też oprócz modyfikowanych oligodeoksynukleotydów interesujące są tzw. modyfikowane oligonukleotydy antysensowne drugiej generacji – są to oligorybonukleotydy podstawione przy grupie 2”-hydroksylowej reszty rybozy. Modyfikacja ta zwiększa także odporność na działanie nukleaz. Chociaż RNA jest znacznie mniej odporny na wpływy środowiska w porównaniu do DNA. Ze względu na obecność grupy 2”-OH, to właśnie modyfikacje tej grupy pozwalają na otrzymanie stabilnych produktów, które w porównaniu do fosfonianów wykazują mniejszą toksyczność. Ponadto modyfikowane oligonukleotydy antysensowne drugiej generacji często obejmują oligonukleotydy ze zmodyfikowanym szkieletem o charakterze innym niż cukrowo-fosforanowy, na przykład peptydowe kwasy nukleinowe, które również wykazują oporność na nukleazy i tworzenie termodynamicznie stabilnych hybryd z docelowymi cząsteczkami mRNA.

Ryc.4. Modyfikacje drugiej generacji: V - 2"-O-alkilo-RNA, VI - LNA, VII - Morfolino, VIII - PNA.

Analiza danych dotyczących stosowania szeregu pochodnych 2"-O-alkilowego RNA zawierających od jednej do pięciu jednostek metylenowych w rodniku alkilowym wykazała, że ​​wraz ze wzrostem liczby jednostek metylenowych odporność modyfikowanego oligonukleotydu na działanie wzrasta liczba nukleaz (pentoksy > propoksy > metoksy > deoksy). Zależność tę można wytłumaczyć steryczną niedostępnością nukleotydu po przyłączeniu podstawnika o większej objętości. Jednakże przeszkody przestrzenne spowodowane obecnością podstawników o większej objętości zmniejszają skuteczność tworzenia komplementarne kompleksy z docelowym mRNA, dlatego też największe powinowactwo do celu uzyskano przy zastosowaniu małych podstawników. Porównując parametry fizykochemiczne 2"-O-metylowanych tiofosforanów (Me-S-ODN), S-DNA i DNA niezmodyfikowanego stwierdzono że temperatura topnienia (T m) heterodupleksów DNA - RNA wzrasta w następującej kolejności: Me-S-ODN - RNA > normalny DNA - RNA > S-ODN - RNA . Wadą tej modyfikacji jest to, że RNaza H nie może przeciąć docelowego mRNA w kompleksie RNA-RNA. W wyniku tej wady takie oligonukleotydy są słabszymi inhibitorami ekspresji genów w porównaniu z oligonukleotydami niezmodyfikowanymi.

Modyfikacje 2"-kationowe prowadzą do powstania oligonukleotydów obojnaczych. Oligonukleotydy takie oprócz tworzenia bardziej stabilnych heterodupleksów w porównaniu do niemodyfikowanych, ze względu na swój ładunek, charakteryzują się większą zdolnością przenikania przez błony biologiczne i dużą odpornością na działanie nukleaz 2a-O-etylo]oligonukleotydy (2"-O-DMAEOE, patrz fig. 5), ze względu na efekt ładunku, tworzą heterodupleksy z docelowym RNA o temperaturze topnienia wyższej o 2°C w porównaniu z oligonukleotydami niezmodyfikowanymi. Oligonukleotydy obojnacze zachowują kompetencję RNazy H, jeśli modyfikacje są rozproszone na całej długości oligonukleotydu.

Ryż. 5.2 „-O-DMAEOE

Konformacyjnie ograniczone „zablokowane” kwasy nukleinowe (Locked Nucleic Acids, LNA) to modyfikowane kwasy nukleinowe, które mają co najmniej jeden monomer z bicykliczną furanozą jako resztą cukrową (patrz ryc. 4, VI). Mają duże powinowactwo do sekwencji komplementarnej (temperatura topnienia dupleksu wzrasta o 6°C w przypadku modyfikacji jednego nukleotydu), co jest zarówno zaletą (efektywne wiązanie celu), jak i wadą (tworzenie spinek do włosów). Takie powinowactwo należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu LNA. Badania na myszach wykazały niską toksyczność LNA.

Peptydowe kwasy nukleinowe (PNA) to analogi kwasów nukleinowych, w których szkielet cukrowo-fosforanowy zastąpiono pseudopeptydowym polimerem N-(2-aminoetylo)-glicyny. N-koniec imituje 3" koniec oligonukleotydu, a C-koniec imituje jego 5" koniec (patrz ryc. 3, VII). Kompleksy PNA-RNA są bardziej stabilne niż kompleksy DNA-DNA i RNA-RNA. Pomimo faktu, że PNA mogą wiązać cel zarówno w orientacji antyrównoległej (Watson-Crick), jak i równoległej (Hoogsteen), bardziej stabilne kompleksy powstają przy orientacji antyrównoległej PNA. Badania wykazały niską toksyczność PNA.

Morfoliny (patrz ryc. 3, VIII) to odczynniki, które łączą stabilność, odporność na nukleazy, skuteczność, aktywność w długim okresie, rozpuszczalność w wodzie, wysoką specyficzność i niską toksyczność. Cząsteczki mają ładunek neutralny. Produkcją morfolin zajmuje się Gene Tools, LLC ( http://www.gene-tools.com).

Aby zachować kompetencję RNazy H, konieczne jest, aby w środku oligonukleotydu znajdował się odcinek co najmniej 7 deoksynukleotydów, dlatego stosuje się „mieszane” oligonukleotydy antysensowne, tj. posiadające różne modyfikacje w różnych jednostkach (LNA/DNA, LNA/RNA itp.). Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się także związki zawierające grupy powodujące rozszczepienie docelowego mRNA ze względu na ich podobieństwo do centrum aktywnego RNazy H, w przeciwnym razie nie modyfikuje się wszystkich jednostek nukleotydowych (np. tylko końce 3” i 5”) . .

Zatem główne właściwości antysensownych oligonukleotydów zmodyfikowanych szkieletem cukrowo-fosforanowym można podsumować w poniższej tabeli:

Tabela 1. Porównanie modyfikacji szkieletu fosforanu cukru.

Modyfikacja	Stabilność nukleaz	Docelowe powinowactwo	Aktywacja RNazy H	Nietoksyczny

1.2.4 Modyfikacje zasad azotowych

Skuteczna aktywność antysensowna może być trudna do osiągnięcia poprzez modyfikację samego szkieletu cukrowo-fosforanowego. Zmodyfikowane zasady azotowe zwiększają skuteczność antysensownych ODN poprzez zwiększenie powinowactwa do docelowego RNA (aminoadenozyny, G-clamp) i szybkości penetracji przez błonę plazmatyczną (grupy kationowe i obojnacze).

Po dodaniu fenoksazyny do reszty cytozyny uzyskuje się tzw. zacisk G (patrz ryc. 6, X), który tworzy dodatkowe wiązanie wodorowe z resztą guaniny, dzięki czemu temperatura topnienia hybrydy ODN – RNA wzrasta o 6–18°C. Modyfikację tę przeprowadza się zwykle na końcu 3", co nie wpływa na kompetencje RNazy H.

Kiedy do reszty adeniny wprowadza się grupę aminową (patrz ryc. 6, XI), powinowactwo do celu również wzrasta w wyniku utworzenia dodatkowego wiązania wodorowego z resztą tyminy.

Ryż. 6. Dodatkowe wiązania wodorowe pomiędzy C i G zacisk (X), pomiędzy T i A NH2 (XI)

Ze względu na swój dodatni ładunek ODN z grupami kationowymi i obojnaczymi przyłączonymi do reszt zasady azotowej (np. spermidyna, ryc. 7) mają nie tylko większe powinowactwo do celu, ale także lepszą zdolność przenikania do komórek i stabilność działania nukleazy.

Ryż. 7.

Duże ligandy fluorescencyjne, takie jak fluoresceina, są sprzężone z końcowymi zasadami azotowymi w celu wizualizacji lokalizacji ODN w komórce.

Ryc.8.

1.2.5 Dodawanie dużych podstawników

Zdolność wnikania do wnętrza komórki z pominięciem błony komórkowej jest jedną z cech, które musi posiadać skuteczny oligonukleotyd antysensowny. Większość modyfikacji nukleotydów opisanych powyżej w ODN nie ma znaczącego wpływu na transport ODN przez błonę komórkową. Istnieje kilka dróg przechodzenia cząsteczek przez plazmalemę, ale dwie są ważne dla ODN: rozproszona, czyli niezależna od receptora i pośredniczona przez receptor. Transport według pierwszego wariantu jest utrudniony przez całkowity ładunek ujemny ODN i ich hydrofilowość. Zastosowanie drugiej drogi jest ograniczone ze względu na niewystarczającą ilość danych na temat białek powierzchniowych błony komórkowej odpowiedzialnych za transport kwasów nukleinowych do wnętrza komórki. Tworzenie koniugatów ODN z różnymi grupami chemicznymi pozwala zwiększyć efektywność transportu tą czy inną drogą, w zależności od rodzaju grupy chemicznej i miejsca jej przyłączenia do ODN. Figura 9 przedstawia opcje łączników stosowanych do otrzymania koniugatów. Ligandy mogą być przyłączone do zasad azotowych, końcowych fosforanów, wiązań fosfodiestrowych (lub podobnych) i reszt cukrowych. Niektóre typy grup chemicznych umożliwiają również wizualizację przedziałów za pomocą detekcji fluorescencji. reakcja antysensowna modyfikacji oligonukleotydu

Ryc.9.

Częściowa lub nawet całkowita neutralizacja ładunku ujemnego ODN nie ma istotnego wpływu na zdolność ODN do spontanicznego transportu do komórki. Przyłączenie różnych nieporęcznych ligandów hydrofobowych, szczególnie tych przedstawionych na Figurze 9, ułatwia transport ODN przez membranę.

Ryc. 10.

Koniugaty z cholesterolem zostały dobrze zbadane. Mechanizm poprawiający przenikanie do komórki w wyniku dodatku cholesterolu nie jest jeszcze całkowicie jasny, choć zakłada się włączenie lipoprotein za pośrednictwem receptora. Koniugaty cholesterolu tworzą micele, co ułatwia ich transport do komórki. Reszta cholesterolu jest zwykle przyłączona do końcowych 5" i 3" fosforanów, a oligonukleotydy 3"-monocholesterylowe są bardziej skuteczne w porównaniu z oligonukleotydami 5"-monocholesterylowymi, a najskuteczniejsze są oligonukleotydy 5", 3"-bischolesterylowe. Przykładowo, po 6 minutach od wstrzyknięcia do krwi myszy poziom 3”-monomodyfikowanych tiofosforanów był 4 razy wyższy, a 5”-mono- i 3,5”-bismodyfikowanych tiofosforanów 7 razy wyższy w porównaniu do niemodyfikowanych fosforotioany.

Stosuje się monomery z fosforanem podstawionym 5" i/lub 3" cholesterolem, oligonukleotydy z ligandem sprzężonym z wiązaniem fosfodiestrowym przed 3"-końcowym nukleozydem, a także dendrymery cholesterolowe z resztą lizyny jako łącznikiem ( patrz rys. 11).

Ryc. 11.

Zsyntetyzowano oligonukleotydy sprzężone z innymi cząsteczkami hydrofobowymi (adamantanem, pirenem, kwasem eikozanowym itp.) i porównano je z oligonukleotydami. Koniugaty cholesterolu wykazały optymalną lipofilowość, a także dobrą zdolność do akumulacji w wątrobie.

Koniugacja z pochodnymi pirenu, oprócz poprawy zdolności transportu, jest interesująca ze względu na ich zdolność do fluorescencji. Pochodne bis-pirenylu są zdolne do tworzenia ekscymerów – kompleksów dwucząsteczkowych, w których jedna cząsteczka znajduje się w stanie podstawowym, a druga w stanie wzbudzonym. Takie kompleksy są bardzo wrażliwe na środowisko przestrzenne; poziom fluorescencji można wykorzystać do oceny, czy ODN jest w stanie związanym z docelowym RNA, czy nie:

Ryc. 12.

Aby poprawić efektywność transportu do wnętrza komórki, stosuje się także koniugaty peptydowe. Do oligonukleotydów, m.in. PNA przyłącza peptyd zdolny do transportu dużych, polarnie naładowanych cząsteczek przez błonę. Zatem peptyd Antennapedia ma miejsca wiązania DNA. PNA z dołączonym peptydem Antennapedia nie tylko skutecznie penetruje komórkę, ale także migruje do jądra.

Ryc. 13.

Przyłączenie dużych płaskich cząsteczek interkalujących, takich jak akrydyna (patrz ryc. 14), do końców antysensownych cząsteczek ODN jest interesujące ze względu na wzrost wydajności rozszczepiania docelowej cząsteczki RNA. W wyniku interkalacji interakcja ODN - RNA zostaje lokalnie rozluźniona. W wyniku wzrostu odległości pomiędzy DNA i RNA ze względu na wielkość cząsteczki interkalatora powstaje „pętla” cząsteczki RNA z podwójnej helisy heterodupleksu. Kationy metali ciężkich, np. Lu 3+, skoordynowane z atomami azotu reszty akrydyny, katalizują hydrolizę RNA bez udziału RNazy H, a „zapętlenie” jako struktura destabilizująca przyspiesza ten proces.

Ryż. 14.

1.3 Fizykochemiczne aspekty interakcji pomiędzy oligonukleotydem i docelowym RNA

Skuteczność oligonukleotydów antysensownych charakteryzuje się ilościowo poprzez powinowactwo ODN do docelowego mRNA i efektywną stałą rozszczepienia tego ostatniego.

Powinowactwo ODN do adresowanego do niego RNA (lub swobodna energia tworzenia heterodupleksu) opisuje stabilność hybrydy DNA-RNA. R G można zmierzyć kalorymetrycznie lub obliczyć teoretycznie. Przy obliczaniu energii swobodnej Gibbsa tworzenia heterodupleksu wykorzystuje się prawo Hessa (energia swobodna Gibbsa reakcji złożonej nie zależy od jej ścieżki) oraz obliczenia energii tworzenia struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych zgodnie z „regułą najbliższego sąsiada” przy użyciu programu mfold opracowanego przez Zuckera i in. Reakcję można przedstawić następująco:

Na tym schemacie M, O, H oznaczają odpowiednio docelowy mRNA, antysensowny ODN i ODN – heterodupleks RNA, biorąc pod uwagę ich drugorzędową i trzeciorzędową strukturę, M u, O u, H u – odpowiednio docelowy mRNA, antysensowny ODN i ODN - heterodupleks RNA bez uwzględnienia ich struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej, nie G (M) , nie G (O) , nie G (H)- Energie swobodne Gibbsa ułożenia ich w strukturę drugorzędową i trzeciorzędową, R G, R G (rozłożony)- swobodne energie hybrydyzacji ODN i mRNA odpowiednio w stanie złożonym i całkowicie zdenaturowanym.

nie G (M) , nie G (O) , nie G (H) I R G (rozłożony) można teoretycznie obliczyć. Następnie wyznaczamy energię swobodną hybrydyzacji zgodnie z prawem Hessa:

Stała równowagi procesu asocjacji heterodupleksowej K 1 można znaleźć na podstawie obliczonej energii swobodnej Gibbsa procesu hybrydyzacji:

Aby oszacować temperaturę topnienia heterodupleksu, posługują się także zasadą „najbliższego sąsiada” i obliczają ją za pomocą odpowiednich programów.

Efektywną stałą szybkości można znaleźć eksperymentalnie k efekt reakcja brutto transformacji mRNA M w produkt warunkowy X (konwencja ta nie wpływa na wynik obliczeń kinetycznych, ale znacznie je upraszcza):

Efektywna stała szybkości reakcji brutto wskazuje obserwowaną szybkość cięcia docelowego mRNA.

Mechanizm reakcji można przedstawić za pomocą następującego schematu:

Na tym schemacie E to enzym RNaza H, HE to jego kompleks pośredni z substratem H, K 1 - stała asocjacji heterodupleksu, obliczona ze wzoru (3).

Dla danego schematu kinetycznego możemy stworzyć układ równań kinetycznych:

Gdzie Z A- stężenie substancji A, k I - stała szybkości i-tej reakcji elementarnej.

Powszechnie mierzonym parametrem jest stężenie mRNA w roztworze (początkowe C M0 i aktualne C M), Dlatego k efekt obliczone względem macierzy:

Zastosowanie quasi-stacjonarnego przybliżenia produktu pośredniego HE i uproszczenie wyrażenia na szybkość reakcji w korzystając z równania Michaelisa-Mentena:

gdzie jest stała Michaelisa, możemy przekształcić wyrażenie na szybkość zmian stężenia heterodupleksu H:

Znajdźmy wyrażenie na stałą szybkości efektywnego rozszczepiania docelowego mRNA w dwóch przypadkach: gdy proces jest ograniczony przez wiązanie mRNA przez antysensowny ODN i gdy jest ograniczony przez katalityczne rozszczepienie docelowego mRNA w ramach heterodupleksu .

Przypadek 1. Ograniczenie przez hybrydyzację.

W tym przypadku proces rozszczepienia jest znacznie szybszy niż hybrydyzacja. Można zatem założyć, że ustalono stacjonarne stężenie heterodupleksu H, tj.:

Z drugiej strony łatwo zauważyć (6), że:

Oznacza to, że w tym przypadku wyrażenie na szybkość cięcia mRNA pokrywa się w wartości bezwzględnej z wyrażeniem na szybkość reakcji (szybkość tworzenia warunkowego produktu X). Korzystając z tego, przekształcamy wyrażenie na szybkość zmiany stężenia oligonukleotydu i zobaczymy, że jego stężenie można uznać za praktycznie niezmienione:

Użycie wyrażenia (14) i w konsekwencji zaniedbywanie wkładu tego terminu k -1 Z H c znajdujemy szybkość cięcia mRNA w nowej formie i ekspresję k efekt .

Przypadek 2. Ograniczenie poprzez katalityczny rozkład substratu.

W przypadku, gdy rozszczepienie jest znacznie wolniejsze niż utworzenie heterodupleksu, możemy założyć, że równowaga ma czas na ustalenie się.

Stężenie równowagowe heterodupleksu można pominąć w porównaniu ze stałą Michaelisa w wyrażeniu szybkości:

Zapisując wyrażenie na stałą równowagi K 1 oraz równania bilansu materiałowego dla M i O, otrzymujemy warunki wystarczające do rozwiązania równania:

Gdzie [ A] - stężenie równowagowe, Z A 0 to początkowe stężenie substancji.

Biorąc pod uwagę (17) i (18) otrzymujemy wyrażenia na równowagowe stężenia H i O:

Podstawiając (21) do równania Michaelisa-Mentena (16) otrzymujemy zmodyfikowane równanie szybkości reakcji:

Podstawiając wyrażenia (20), (21) i (22) do (12) i pomijając uciążliwe obliczenia pośrednie, otrzymujemy wyrażenie na szybkość katalitycznego cięcia mRNA:

skąd łatwo znaleźć wzór na stałą szybkości efektywnej procesu brutto:

Istnieje wiele przeszkód w tworzeniu leków opartych na antysensownych ODN: słaba zdolność internalizacji, niestabilność nukleaz, toksyczność i inne. Modyfikacje chemiczne mogą wyeliminować wiele z tych problemów, ale tylko częściowo i trudno jest znaleźć kompromis pomiędzy zaletami i wadami jakiejkolwiek modyfikacji. Mimo to przetestowano wiele leków na bazie ODN. Pierwszym lekiem na bazie ODN jest Vitravene, mający na celu zwalczanie infekcji wirusem cytomegalii u pacjentów z AIDS.

WSTĘP

ROZDZIAŁ 1. PRZEGLĄD LITERATURY.

1.1. Podstawowe idee i sposoby tworzenia celowanych leków przeciwnowotworowych 15 1.1.1. Leki celowane w onkologii: leki oparte na przeciwciałach monoklonalnych i oligonukleotydach antysensownych.

1.2. Endocytoza za pośrednictwem receptorów i jej rola w dostarczaniu związków biologicznie aktywnych do komórek docelowych

1.3. Alternatywne systemy celowanego dostarczania leków przeciwnowotworowych w celu poprawy efektywności terapii nowotworowej.

1.4. Antygeny specyficzne dla nowotworu jako cele ukierunkowanego dostarczania leków przeciwnowotworowych

1,5. Ukierunkowane dostarczanie leków w koniugatach z cząsteczkami wektorów białkowych i peptydowych.

1.6. Białka chimeryczne

1.7. Alfa-fetoproteina i jej receptory jako cel selektywnego dostarczania substancji biologicznie czynnych do komórek nowotworowych.

1.7.1. Struktura i funkcja alfa-fetoproteiny

1.7.2. Receptory alfa-fetoproteiny.

1.7.3. Biologicznie aktywne fragmenty alfa-fetoproteiny

1.8. Ukierunkowane dostarczanie leków przeciwnowotworowych jako główne podejście do przezwyciężenia oporności wielolekowej (MDR)

1.8.1. Zjawisko oporności wielolekowej komórek nowotworowych.

1.8.2. Nowoczesne podejścia do pokonywania oporności wielolekowej.

ROZDZIAŁ 2. MATERIAŁY I METODY.

2.1. Izolacja naturalnej ludzkiej alfa-fetoproteiny i produkcja rekombinowanych fragmentów białka AFP.

2.1.1. Izolacja ludzkiego AFP

2.1.2. Przygotowanie rekombinowanego C-końcowego fragmentu AFP (rAFP27)

2.1.3. Przygotowanie rekombinowanego białka PGA

2.1.4. Otrzymywanie rekombinowanego fragmentu AFP AFP-3BC

2.2. Synteza koniugatów białkowych i peptydowych z FITC, cytostatykami i oligonukleotydami.

2.2.1. Synteza znakowanych FITC AFP, MAb i C-końcowych fragmentów AFP gAFP27 i AFP-3BC.

2.2.2. Synteza oktapeptydu AFP GIP8 znakowanego FITC.

EMTPVNPG (GIP8) z doksorubicyną.

2.2.4. Synteza koniugatów AFP z winblastyną.

2.2.5. Synteza koniugatów AFP z ftalocyjaninami

2.2.6. Synteza koniugatów AFP i GIP8 z esperamycyną Aib (EsA).

2.2.9. Synteza koniugatów AFP z oligonukleotydami.

2.2.10. Przygotowanie kompleksów ON z białkami.

2.3. Hodowle komórkowe i warunki hodowli.

2.4. Ocena wiązania receptorów i endocytozy znakowanych fluorescencyjnie białek, peptydów i koniugatów za pomocą cytometrii przepływowej.

2.4.1. Ocena wiązania AFP i MAb z receptorem AFP.

2.4.2. Ocena endocytozy znakowanego fluorescencyjnie AFP, C-końcowego fragmentu AFP i oktapeptydu AFP GIP8.

2.5. Ocena endocytozy koniugatów białkowych i peptydowych z DOX za pomocą cytometrii przepływowej.

2.6. Badania immunocytochemiczne i immunohistochemiczne.

2.6.1. Badanie ekspresji receptorów AFP na powierzchni komórki.

2.6.2. Badanie ekspresji białek c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70.

2.6.3. Barwienie immunochemiczne skrawków histologicznych.

2.7. Badanie ekspresji c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 w komórkach nowotworowych.

2.7.1. Badanie ekspresji c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 za pomocą Western blot.

2.7.2. Badanie ekspresji c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 w komórkach nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej.

2.8. Mikroskopia fluorescencyjna.

2.9. Oznaczanie aktywności cytostatycznej leków in vitro.

2.9.1. Oznaczanie przeżycia komórek.

2.9.2. Oznaczanie hamowania aktywności proliferacyjnej komórek.

2.9.3. Analiza poziomu apoptozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

2.8.4. Oznaczanie aktywności fotocytostatycznej i chemiocytostatycznej koniugatów AFP z ftalocyjaninami glinu (A1Pc) i ftalocyjaninami kobaltu (CoPc).

2.9. Badanie aktywności proliferacyjnej komórek.

2.10. Analiza cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej.

2.11. Badanie działania przeciwnowotworowego leków in vivo.

2.12. Statystyczne przetwarzanie wyników.

ROZDZIAŁ 3. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE.

3.1. Badanie ekspresji receptora alfa-fetoproteiny na ludzkich liniach komórkowych nowotworu.

3.1.1. Badanie specyficzności klonów MAb wobec APPR

3.1.2. Oszacowanie ilości APPR na ludzkich komórkach nowotworowych hodowanych in vitro.

3.2. Immunochemiczne wykrywanie APPR na komórkach i skrawkach tkanek

3.2.1. Badanie ekspresji receptorów AFP na powierzchni komórek nowotworowych z wykorzystaniem metod immunocytochemicznych.

3.2.2. Barwienie immunohistochemiczne skrawków tkanki nowotworowej

3.3. Badanie wiązania i endocytozy znakowanej fluorescencyjnie AFP przez komórki nowotworowe in vitro.

3.3.1. Badanie wiązania AFP z receptorem na powierzchni komórek nowotworowych i prawidłowych limfocytów ludzkiej krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej.

3.3.2. Badanie in vitro endocytozy AFP przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

3.4. Zastosowanie endocytozy receptorowej do celowanego dostarczania leków przeciwnowotworowych – doksorubicyny, winblastyny, esperamycyny, ftalocyjanin.

3.4.1. Analiza internalizacji koniugatów in vitro przez komórki nowotworowe

AFP z antybiotykami/cytostatykami na przykładzie doksorubicyny.

3.4.2. Badanie aktywności cytostatycznej koniugatów białkowych z doksorubicyną in vitro.

3.4.3. Badanie aktywności przeciwnowotworowej koniugatów AFP-DOX in vivo.

3.4.4. Badanie aktywności fotocytostatycznej i chemiocytostatycznej koniugatów AFP z ftalocyjaninami glinu i kobaltu (A1Pc)

3.4.5. Badanie aktywności cytostatycznej koniugatów AFP z niektórymi innymi antybiotykami przeciwnowotworowymi (cytostatykami).

3.4.6. Badanie aktywności cytostatycznej koniugatów AFP z esperamycyną Ajb (EsA) in vitro.

3.4.7. Badanie aktywności przeciwnowotworowej koniugatów AFP z esperamycyną Aib (EsA) in vivo.

3.5. Pokonanie oporności wielolekowej spowodowanej ekspresją genu MDR 1 przy użyciu koniugatów AFP z lekami przeciwnowotworowymi in vitro.

3.5.1. Charakterystyka opornych linii komórkowych.

3.5.2. Analiza internalizacji DOX i jego koniugatów z białkami w opornych liniach komórkowych.

3.5.3. Badanie aktywności cytostatycznej koniugatów DOX-AFP wobec opornych linii komórkowych.

3.6. Biologicznie aktywne fragmenty AFP.

3.6.1. Rekombinowany C-końcowy fragment AFP (rAFP27).

3.6.2. Rekombinowany C-końcowy fragment AFP AFP-ZVS.

3.6.3. Biologicznie aktywny oktapeptyd - fragment AFP

3.7. Ukierunkowane dostarczanie antysensownych oligonukleotydów do komórek nowotworowych.

3.7.1. Ukierunkowane dostarczanie antysensownych oligonukleotydów do komórek nowotworowych w postaci ich koniugatów z AFP.

3.7.2. Badanie efektywności dostarczania ASON z wykorzystaniem niekowalencyjnych kompleksów z AFP.

Polecana lista prac dyplomowych

• Tworzenie i badanie właściwości rekombinowanych białek ludzkich o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym 2007, kandydat nauk chemicznych Savvateeva, Ludmiła Władimirowna

• Opracowanie celowanych leków przeciwnowotworowych w oparciu o wektory peptydowe i czynniki antyangiogenne 2007, doktor nauk biologicznych Feldman, Natalia Borisovna

• Zastosowanie domeny C-końcowej alfa-fetoproteiny do ukierunkowanego dostarczania leków przeciwnowotworowych 2012, kandydat nauk biologicznych Godovanny, Artem Vitalievich

• Otrzymywanie i badanie aktywności biologicznej koniugatów naskórkowego czynnika wzrostu z przeciwnowotworowymi lekami chemioterapeutycznymi 2000, kandydat nauk biologicznych Gumanow, Siergiej Georgiewicz

• Synteza koniugatów ludzkiej α-fetoproteiny z lekami przeciwnowotworowymi w celu ukierunkowanego dostarczania do komórek nowotworowych 2001, kandydat nauk chemicznych Zabołotniew, Dmitrij Wiktorowicz

Wprowadzenie do rozprawy doktorskiej (część streszczenia) na temat „Zastosowanie wektorów białkowych i peptydowych do selektywnego dostarczania leków przeciwnowotworowych i oligonukleotydów terapeutycznych do komórek nowotworowych”

Istotność problemu. Głównymi przyczynami braku skuteczności chemioterapeutycznego leczenia nowotworów są niska biodostępność leków przeciwnowotworowych dla nowotworu, konieczność stosowania dużych dawek leków oraz nieselektywny charakter tych leków. Ograniczona penetracja leków do guzów heterogennych biologicznie prowadzi do przeżycia części komórek nowotworowych, nawet po długotrwałym leczeniu środkami cytotoksycznymi. Leczenie dużymi dawkami, niezbędnymi do uzyskania całkowitej remisji, powoduje poważne ogólnoustrojowe skutki uboczne, które często zmuszają pacjentów do przerwania leczenia. Ponadto długotrwałe stosowanie chemioterapeutyków obarczone jest rozwojem oporności wielolekowej, co powoduje, że stosowane leki są nieskuteczne. Zjawisko lekooporności opiera się na mechanizmach wewnątrzkomórkowych o różnym charakterze, takich jak zmniejszenie transportu leków przez błonę komórkową, zaburzenie poziomu ekspresji onkogenów, uszkodzenie układów przekazywania sygnału itp. W celu zwiększenia skuteczności leczenia nowotworu terapii konieczne jest zwiększenie selektywności działania leków. Można tu wyróżnić dwa kierunki: rozwój nowych, wysoce selektywnych leków oraz stworzenie nowych systemów regulowanego transportu znanych związków przeciwnowotworowych do komórek docelowych.

Selektywność działania leku można zwiększyć poprzez zastosowanie w układach dostarczania środków celowanych – cząsteczek, które mogą wiązać się ze specyficznymi determinantami na powierzchni komórek. Zatem zastosowanie ukierunkowanego składnika warunkuje oddziaływanie selektywnego układu dostarczania ze ściśle określonymi komórkami i tkankami, w szczególności komórkami nowotworowymi. Fizjologiczne ligandy receptorów czynników wzrostu lub białek onkofetalowych mogą działać jako czynniki lub wektory docelowe, tj. same czynniki wzrostu i białka onkofetalowe. Lek przeciwnowotworowy można łączyć z wektorem kowalencyjnie, tworząc koniugat, lub niekowalencyjnie, tworząc stabilny kompleks. Związanie docelowej cząsteczki ze specyficznym receptorem na powierzchni komórki indukuje proces endocytozy za pośrednictwem receptora, który zapewnia akumulację przez komórki nowotworowe leku, którego cel molekularny znajduje się wewnątrz komórki.

Należy zaznaczyć, że w niektórych przypadkach zastosowanie selektywnych systemów dostarczania jest jedynym sposobem wykorzystania potencjału terapeutycznego niektórych silnie toksycznych antybiotyków przeciwnowotworowych, np. antybiotyków ediynowych. Przykładem jest lek Mylotarg, który jest koniugatem kalchemycyny Xi z humanizowanymi przeciwciałami przeciwko CD33. Ponadto zastosowanie wysoce wydajnych systemów dostarczania może znacząco zwiększyć efekt terapeutyczny antysensownych oligonukleotydów, które niestety nie znalazły dotychczas zastosowania w praktyce klinicznej.

O pomyślnym rozwiązaniu problemu ukierunkowanego transportu leków w oparciu o endocytozę receptorową decyduje przede wszystkim wybór cząsteczki wektora. Wektory białkowe muszą spełniać szereg podstawowych wymagań, do których należy wysokie powinowactwo wektorów do odpowiednich receptorów na powierzchni docelowych komórek nowotworowych, wysoka stabilność, możliwość ich modyfikacji chemicznej poprzez koniugację z chemioterapią bez utraty właściwości biologicznych oraz dostępność białek w ilościach preparatywnych. Alfa-fetoproteina białka onkofetalowego najlepiej spełnia te wymagania. Ważnymi czynnikami przy projektowaniu systemów dostarczania selektywnego jest także wybór leku (cytostatyk, fotosensybilizator, oligonukleotyd antysensowny) oraz łącznika łączącego komponent docelowy i cytostatyczny. Badanie przesiewowe utworzonych konstruktów w systemie in vitro i badanie ich zachowania wewnątrzkomórkowego pozwala nam zidentyfikować najbardziej optymalne opcje systemów dostarczania.

Celem pracy było opracowanie zasad tworzenia systemów selektywnego dostarczania leków przeciwnowotworowych i oligonukleotydów terapeutycznych do komórek nowotworowych w oparciu o naturalne i rekombinowane białka i peptydy oraz identyfikacja wzorców determinujących ich skuteczność. Cele badań:

Selekcja cząsteczek wektorów białkowych i peptydowych do selektywnego dostarczania leków przeciwnowotworowych i oligonukleotydów antysensownych;

Tworzenie konstruktów do selektywnego dostarczania leków przeciwnowotworowych do komórek docelowych w oparciu o alfa-fetoproteinę i jej fragmenty peptydowe,

Badanie internalizacji i wewnątrzkomórkowej dystrybucji leków w zależności od rodzaju projektu w celu optymalizacji systemów dostarczania;

Rozwój podejść do przezwyciężenia oporności wielolekowej przy użyciu systemów ukierunkowanego dostarczania; Opracowanie konstruktów opartych na alfa-fetoproteinie i naskórkowym czynniku wzrostu do selektywnego dostarczania antysensownych oligonukleotydów i ocena ich skuteczności.

Nowość naukowa i znaczenie praktyczne.

Obecność receptorów AFP wykazano zarówno na powierzchni ludzkich linii komórkowych nowotworów, jak i na skrawkach histologicznych ludzkich nowotworów złośliwych (jajnik, pierś, wątroba, żołądek, jelita). Receptora AFP nie wykryto na skrawkach guzów łagodnych i prawidłowych tkankach, a także na powierzchni spoczynkowych limfocytów wyizolowanych z krwi zdrowych ochotników. Zatem receptor AFP można zastosować jako marker nowotworowy dla szerokiego zakresu nowotworów złośliwych, a przeciwciała przeciwko receptorowi można zastosować do diagnozy nowotworu.

Sformułowano i opracowano koncepcję systemu ukierunkowanego dostarczania związków biologicznie aktywnych do komórek docelowych z wykorzystaniem AFP i jego fragmentów peptydowych jako motywu kierującego.

Opracowano metody pozwalające przewidzieć skuteczność leków selektywnych w doświadczeniach in vitro na kulturach komórkowych.

Po raz pierwszy odkryto, że rekombinowany C-końcowy fragment AFP (od aminokwasów 357 do 590) specyficznie wiąże się z receptorem AFP, ulega endocytozie przez komórki nowotworowe takie jak AFP i podobnie jak AFP hamuje indukowany estradiolem wzrost hormonów zależne komórki nowotworowe. Zatem to rekombinowane białko można zastosować jako cząsteczkę wektora w ukierunkowanych systemach dostarczania.

Stworzono konstrukty genowe do indukowanej biosyntezy C-końcowych fragmentów AFP w E.coli. Opracowano wysoce wydajne metody izolowania rekombinowanych fragmentów AFP.

Po raz pierwszy wykazano zdolność biologicznie aktywnego fragmentu AFP-oktapeptydu GIP8 (aa 472-479) do selektywnego wiązania się z powierzchnią komórek nowotworowych i bycia przez nie internalizowane z dużą wydajnością, co otwiera możliwości możliwość wykorzystania GIP8 jako wektora w systemach ukierunkowanego dostarczania.

Udowodniono skuteczność i selektywność działania przeciwnowotworowego koniugatów AFP, AFP-ZVS i GIP8 in vitro przeciwko liniom komórkowym szerokiego zakresu nowotworów ludzkich. Zbadano wzorce ich wewnątrzkomórkowej translokacji i wykazano zależność skuteczności koniugatów od labilności wiązania chemicznego pomiędzy białkiem a cytostatykiem.

Stosując systemy ukierunkowanego dostarczania oparte na AFP odkryto, że możliwe jest przezwyciężenie oporności wielolekowej komórek nowotworowych spowodowanej aktywnością Pgpl70

Po raz pierwszy wykazano in vivo wysoką skuteczność przeciwnowotworową koniugatu AFP z esperamycyną Aib.

Opracowano systemy selektywnego dostarczania terapeutycznych oligonukleotydów oraz wykazano zasadniczą możliwość i obietnicę wykorzystania wektorów białkowych (AFP i naskórkowego czynnika wzrostu) do ich ukierunkowanego dostarczania do komórek nowotworowych.

Główne postanowienia przedstawione do obrony:

1. Receptor alfa-fetoproteiny jest unikalnym antygenem specyficznym dla nowotworu, obecnym na powierzchni komórek nowotworowych i nieobecnym w większości normalnych komórek.

2. Receptor alfa-fetoproteiny może służyć jako cel selektywnej terapii przeciwnowotworowej. Wiążąc się specyficznie ze swoim receptorem, alfa-fetoproteina jest internalizowana przez komórki nowotworowe wraz z kowalencyjnie przyłączonymi do niej cząsteczkami związków leczniczych, zapewniając w ten sposób selektywne dostarczanie leków do komórek nowotworowych.

3. Zastosowanie systemów celowanego dostarczania opartych na alfa-fetoproteinie umożliwia przezwyciężenie oporności wielolekowej komórek nowotworowych wywołanej przez transportery ABC błony komórkowej.

4. Rekombinowane fragmenty alfa-fetoproteiny zawierające motyw wiążący receptor można stosować w selektywnych systemach dostarczania zamiast naturalnego białka pełnej długości.

5. Zastosowanie wektorów białkowych (AFP i naskórkowego czynnika wzrostu) może znacząco zwiększyć efektywność wewnątrzkomórkowego dostarczania oligonukleotydów antysensownych.

Wkład własny autora polega na opracowaniu pomysłu, zorganizowaniu i przeprowadzeniu badań eksperymentalnych, analizie, podsumowaniu i interpretacji uzyskanych wyników. Wszystkie doświadczenia z kulturami komórkowymi przeprowadził bezpośrednio autor. Zatwierdzenie pracy.

Główne wyniki prac przedstawiono na V Międzynarodowym Sympozjum Biologii i Przydatności Klinicznej Markerów Nowotworowych (1995, Barcelona, ​​Hiszpania), XVI Staż.

Kongres Chemii Klinicznej, (1996, Londyn), The współzależność biologii nowotworów i onkologii klinicznej (1996, Coronado, USA), s. 10-10. 121. Spotkanie Międzynarodowego Towarzystwa Biologii i Medycyny Onkorozwojowej (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), Europejska konferencja onkologiczna ECCO (1997, Francja), Rosyjski Kongres Narodowy „Człowiek i medycyna” (2000, 2005, Moskwa), 37. Doroczne Spotkanie Naukowe Europejskiego Towarzystwa Badań Klinicznych (2003, Werona, Włochy), 1. Konferencja EUFEPS na temat optymalizacji dostarczania i formułowania leków: nowe wyzwania w dostarczaniu leków (2003, Wersal, Francja), 5. warsztaty ISTC/Korea na temat biotechnologii (2004, Chungbuk, Korea), Światowa Konferencja na temat Magicznych Pocisków (2004, Norymberga, Niemcy), międzynarodowa konferencja Medycyna molekularna i bezpieczeństwo biologiczne (2005, Moskwa), III Międzynarodowy kongres w Moskwie „Biotechnologia: stan i perspektywy rozwoju” (2005, Moskwa), międzynarodowa konferencja w Moskwie „Biotechnologia i medycyna” (2006, Moskwa), 19. Spotkanie Europejskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem (EACR), Budapeszt, Węgry, 1-4 lipca 2006, konferencja „Nowe platforma technologiczna badań biomedycznych (biologia, opieka zdrowotna, farmacja)” (2006, Rostów nad Donem), I międzynarodowa konferencja naukowo-praktyczna „Postgenomiczne metody analizy w biologii, laboratorium i medycynie klinicznej” (2010, Moskwa).

Struktura i zakres rozprawy doktorskiej. Praca ujęta jest na 256 stronach maszynopisu i składa się ze wstępu, przeglądu literatury, opisu metod badawczych, prezentacji i dyskusji wyników, wniosków, wniosków oraz spisu piśmiennictwa, który obejmuje 406 źródeł. Rozprawa zawiera 94 ryciny i 14 tabel.

Podobne rozprawy w specjalności „Biochemia”, 01.03.04 kod VAK

• Rozwój celowanych leków przeciwnowotworowych opartych na wektorach peptydowych i lekach stosowanych w chemioterapii 2004, kandydat nauk biologicznych Al-Nazwanie Nasser Salem

• Rekombinowane fragmenty ludzkiej alfa-fetoproteiny do tworzenia leków celowanych 2012, kandydat nauk biologicznych Sharapova, Olga Andreevna

• Konstrukcja kompleksów białko-kwas nukleinowy do ukierunkowanego transportu obcego DNA do komórek 2010, kandydat nauk biologicznych Tatarinova, Olga Nikołajewna

• Synteza i badanie form transportu leków przeciwnowotworowych na bazie alfa-fetoproteiny i nanocząstek polimerowych 2000, kandydat nauk biologicznych Bobruskin, Aleksiej Igorevich

• Pozyskiwanie i badanie potencjału przeciwnowotworowego polipeptydów antyangiogennych i leków stosowanych w chemioterapii celowanej 2006, kandydat nauk biologicznych Digtyar, Anton Wasiljewicz

Zakończenie rozprawy na temat „Biochemia”, Posypanova, Galina Aronovna

1. Opracowano koncepcję układu celowanego dostarczania związków biologicznie aktywnych do komórek nowotworowych, w którym jako motyw kierujący wykorzystano alfa-fetoproteinę (AFP) i jej fragmenty.

2. Stwierdzono obecność receptorów AFP zarówno na powierzchni komórek ludzkich linii nowotworowych, jak i na komórkach ludzkich nowotworów złośliwych (jajnika, piersi, wątroby, żołądka, jelit). W skrawkach guzów łagodnych i tkankach prawidłowych, a także na powierzchni limfocytów zdrowych ochotników nie wykryto receptora AFP.

3. Wykazano, że nie tylko AFP, ale także jego rekombinowane fragmenty C-końcowe specyficznie wiążą się z receptorem AFP i są endocytozowane przez komórki nowotworowe.

4. Odkryto, że biologicznie aktywny fragment AFP, oktapeptyd GIP8, selektywnie wiąże się z nieznanym receptorem na powierzchni komórek nowotworowych, ulega internalizacji z dużą wydajnością i może być stosowany jako wektor w systemach celowanego dostarczania.

5. Ustalono, że koniugaty leków przeciwnowotworowych z AFP są selektywnie akumulowane przez komórki docelowe, mają wyraźny efekt cytostatyczny na komórki nowotworowe i mają niską toksyczność dla normalnych komórek ludzkich; Ponadto o skuteczności koniugatów decyduje niestabilność wiązania chemicznego pomiędzy białkiem a czynnikiem cytotoksycznym.

6. Zastosowanie systemów celowanego dostarczania opartych na AFP umożliwia przezwyciężenie oporności wielolekowej komórek nowotworowych wywołanej działaniem Pgpl70.

7. Efektywność transportu doksorubicyny do komórek nowotworowych w ramach koniugatów z AFP znacznie przewyższa efektywność jej transportu w ramach koniugatów z transferyną i albuminą surowicy.

8. Wysoką aktywność przeciwnowotworową koniugatu AFP z esperamycyną Aib in vivo wykazano w mysim modelu guza przeszczepialnego (wyleczenie -30%, wzrost oczekiwanej długości życia - 163%).

9. Koniugat fragmentu AFP GIP8 z doksorubicyną selektywnie gromadzi się we wrażliwych i opornych liniach komórek nowotworowych, ma wyraźne działanie cytostatyczne na komórki nowotworowe i jest mało toksyczny dla ludzkich leukocytów jednojądrzastych.

Wykazano potencjał wykorzystania wektorów białkowych opartych na AFP i naskórkowym czynniku wzrostu do ukierunkowanego dostarczania antysensownych oligonukleotydów do komórek docelowych.

Wniosek.

Niniejsza praca poświęcona jest badaniu wzorców projektowania systemów celowanego dostarczania leków w oparciu o wektory białkowe. Badanie charakterystyki wewnątrzkomórkowej translokacji badanych leków i porównanie ich z aktywnością biologiczną wobec komórek nowotworowych i prawidłowych in vitro pozwala przewidzieć powodzenie danej strategii, a tym samym zoptymalizować proces tworzenia skutecznych leków przeciwnowotworowych o działaniu selektywnym.

Zastosowanie ukierunkowanego składnika warunkuje oddziaływanie SAD ze ściśle określonymi komórkami i tkankami, zapewniając w ten sposób selektywność działania leków. Mechanizm endocytozy za pośrednictwem receptorów sprzyja akumulacji leku, którego cel molekularny znajduje się wewnątrz komórki.

Porównanie SAD, które są koniugatami (białko wektorowe)-łącznik-(lek), w których jako białka wektorowe wykorzystano albuminę surowicy, transferynę i alfa-fetoproteinę, wykazało przewagę tych ostatnich zarówno pod względem zdolności do akumulacji w komórkach nowotworowych, jak i w działaniu cytotoksycznym dla tych komórek. W koniugatach tych zastosowano hydrazyd kwasu 3-maleimidobenzoesowego jako łącznik i doksorubicynę jako lek. Łącznik ten jest nietrwały w środowisku kwasowym i może ulegać hydrolizie w przedziałach komórkowych, takich jak endosomy i lizosomy, uwalniając lek z SAD. Doksorubicyna, antybiotyk antracyklinowy, jest skutecznym i szeroko stosowanym środkiem terapeutycznym. Istnieją dwa główne mechanizmy, za pomocą których lek powoduje śmierć komórki: interkalacja DNA, w wyniku której DOX zostaje wstawiony pomiędzy dwa sąsiednie nukleotydy, zapewniając silną interakcję z DNA i zakłócając replikację i transkrypcję; wiązanie i hamowanie topoizomerazy II. Dzięki obecności w strukturze grupy chinonowej DOX bierze udział w procesach redoks, co prowadzi do powstawania wolnych rodników, które indukują uszkodzenia DNA i peroksydację lipidów. Skuteczność terapii DOX zależy od jej wewnątrzkomórkowej akumulacji.

Wolny DOX dzięki swojej hydrofobowości szybko przenika do komórek i jąder komórkowych. Szybkość wychwytu DOX w koniugacie przez komórki zależy od liczby specyficznych receptorów na powierzchni komórek docelowych i intensywności endocytozy za pośrednictwem receptorów.

Jako białka wektora (składniki docelowe), oprócz AFP, wykorzystaliśmy dobrze znane białka transportowe HSA i Trf, które są aktywnie endocytozowane przez komórki nowotworowe i są stosowane z różnym powodzeniem do podawania leków do guza (patrz przegląd literatury, część 1,5). Jednakże koniugat AFP z DOX był znacząco lepszy od podobnych koniugatów DOX z HSA i Trf zarówno pod względem wydajności akumulacji w komórkach nowotworowych, jak i aktywności cytotoksycznej wobec tych komórek.

Badanie ekspresji receptora AFP na powierzchni ludzkich linii komórkowych nowotworów i prawidłowych limfocytów krwi obwodowej, a także na skrawkach histologicznych tkanek nowotworowych, łagodnych i prawidłowych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko AFP, ujawniło dominującą obecność tego receptora w komórki nowotworów złośliwych. Nasze wyniki zostały później potwierdzone badaniami R. Moro. Zatem AFP może służyć jako unikalny cel na powierzchni komórek nowotworowych, a systemy dostarczania oparte na jego naturalnym ligandzie, AFP, mogą zapewniać selektywne dostarczanie leków do tych komórek. Analiza wiązania i endocytozy znakowanej fluorescencyjnie AFP sugeruje wysoką skuteczność i specyficzność akumulacji AFP w aktywnie proliferujących komórkach nowotworowych oraz brak akumulacji tego białka w nieproliferujących limfocytach.

Badanie in vitro skuteczności przeciwnowotworowej szeregu koniugatów na bazie AFP, w którym stosowano różne cytostatyki, antybiotyki przeciwnowotworowe, antymetabolity, fotouczulacze (doksorubicyna, daunomycyna, kalicheamycyna, bleomycyna, esperamycyna, cisplatyna, karboksyfosfamid, winblastyna, metotreksat, ftalocyjaniny). stosowane jako składniki cytotoksyczne, wysoka selektywna aktywność przeciwnowotworowa. Koniugat AFP z esperamycyną Aib wykazał znaczną skuteczność w modelowych eksperymentach in vivo w leczeniu myszy z nowotworami doświadczalnymi, zapobiegając rozwojowi nowotworów i kilkukrotnie zwiększając oczekiwaną długość życia zwierząt. Należy zaznaczyć, że antybiotyk ten, spokrewniony z enediynami, jest związkiem niezwykle toksycznym. Struktura chemiczna antybiotyków enediynowych ma wspólny element, często nazywany „głowicą bojową”, którym jest 10-członowy pierścień enediynowy zawierający dwa wiązania acetylenowe w pozycjach a wiązania podwójnego lub pierścienia oksiranowego. W warunkach fizjologicznych i po pewnej aktywacji taka „głowica” ulega przegrupowaniu w reaktywny dwurodnik. Cytotoksyczne działanie esperamycyny wynika z indukcji pęknięć jedno- i dwuniciowych DNA. Badania kliniczne tego leku nie powiodły się ze względu na jego wysoką toksyczność ogólnoustrojową. Być może jedynym sposobem wykorzystania potencjału tego antybiotyku jest zwiększenie jego selektywności poprzez chemiczne przyłączenie go do cząsteczek wektora, co zapewni ukierunkowane dostarczenie do nowotworu, co też zrobiliśmy.

Należy zaznaczyć, że przy konstruowaniu SAD szczególne znaczenie ma wybór łącznika wiążącego białko wektora z czynnikiem cytotoksycznym. Środek cytostatyczny można z powodzeniem dostarczyć do komórki docelowej, ale jeśli nie zapewni się jego szybkiego odcięcia od wektora, efekt biologiczny albo nie zostanie zrealizowany, albo będzie słabo wyrażony. Analiza efektywności koniugatów AFP z DOX, w których zastosowano linkery różniące się labilnością, wykazała, że ​​najbardziej aktywnymi koniugatami były koniugaty syntetyzowane przy użyciu aldehydu glutarowego i hydrazydu kwasu 3-maleimidobenzoesowego. Aktywność cytotoksyczna koniugatów AFP z DOX korelowała z akumulacją DOX w jądrach komórkowych: im szybciej to zachodziło, tym koniugat był bardziej aktywny. Gdy jako łącznik zastosowano ester N-hydroksysukcynimidowy kwasu 3-(2-ditiopirydylo)propionowego, lokalizacja DOX w komórkach była głównie cytoplazmatyczna, nawet 24 godziny po zastosowaniu koniugatu. Jednakże koniugat ten wykazywał bardzo niską aktywność (25 razy niższą niż wolny DOX). Najwyraźniej silne wiązanie dwusiarczkowe zapobiega szybkiemu rozszczepieniu DOX w endosomach. W komórkach enzymy zdolne do redukcji wiązań dwusiarczkowych (reduktaza disiarczkowa tiolowo-białkowa, tioredoksyna, glutaredoksyna, lizosomalna reduktaza tiolowa indukowana interferonem gamma - GILT) zlokalizowane są we wnęce mikrosomów, w strukturach kompleksu Golgiego; Tioredoksyna i glutaredoksyna katalizują redukcję wiązań dwusiarczkowych w jądrze i cytoplazmie; GILT - w późnych endosomach/lizosomach (optymalne pH 4-5). Redukcja wiązań dwusiarczkowych w białkach następuje w późnych endosomach/lizosomach po ograniczonej proteolizie przez katepsyny. Redukcja wiązania dwusiarczkowego przez reduktazę disiarczkową tiolowo-białkową ulega znacznemu spowolnieniu wraz ze spadkiem pH. Wydaje się, że uwalnianie DOX z koniugatów, w których antybiotyk jest przyłączony do białka wiązaniem dwusiarczkowym, zachodzi raczej powoli, co wyjaśnia niską aktywność cytotoksyczną takich koniugatów. Drugim czynnikiem mogącym mieć wpływ na skuteczność omawianego koniugatu jest modyfikacja grupy aminowej reszty cukrowej DOX po wprowadzeniu grupy tiolowej za pomocą SPDP. Chociaż wiele badań wykazało wytwarzanie aktywnych koniugatów DOX z przeciwciałami przy użyciu tej strategii syntezy, inne badania wykazały, że modyfikacja DOX na poziomie aminocukru zmniejsza aktywność cytotoksyczną tego antybiotyku i prowadzi do utraty aktywności cytotoksycznej antybiotyku antracyklinę w koniugacie.

Niemniej jednak zastosowanie SPDP w syntezie koniugatów AFP-EsA okazało się bardzo efektywne. Rzeczywiście, cytotoksyczność koniugatu testowana in vitro była w większości niższa niż toksyczność wolnego EsA. Jednakże w wyniku zwiększenia selektywności działania EsA w koniugacie uzyskano znaczący sukces w testowaniu koniugatu in vivo.

Uzyskane wyniki pozwalają przewidzieć poziom skuteczności leków celowanych opartych na cząsteczkach wektorów białkowych. Skuteczność takich leków zależy nie tylko od białka wektora, ale w dużej mierze od rodzaju wiązania chemicznego pomiędzy białkiem a antybiotykiem przeciwnowotworowym. Powiązanie to nie powinno być zbyt silne, gdyż tracą zalety podawania celowanego: pomimo wysokiego wewnątrzkomórkowego stężenia antybiotyku, ten ostatni może nie działać farmakologicznie, jeśli nie osiągnie celu. Jednak połączenie nie powinno być zbyt labilne, ponieważ lek musi zachować swoją integralność przed interakcją z komórkami docelowymi. Jednocześnie tworząc ukierunkowany konstrukt należy wziąć pod uwagę, że odszczepienie leku (antybiotyku, cytostatyka itp.) od cząsteczki białka najprawdopodobniej nastąpi w endosomach przy wartościach pH 5,5- 6, czyli łącznik łączący cząsteczkę AFP z lekiem idealnie musi ulegać hydrolizie przy wskazanych wartościach pH lub stanowić substrat enzymów endosomalnych.

Najważniejszą właściwością zsyntetyzowanych koniugatów na bazie AFP była ich zdolność do odwracania oporności wielolekowej wywołanej działaniem transporterów ABC.

Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, że AFP może być skutecznie stosowany jako środek celowany do dostarczania leków przeciwnowotworowych do komórek nowotworowych różnego pochodzenia.

Być może jedyną znaczącą wadą naturalnego ludzkiego AFP jest źródło jego izolacji: AFP w ilościach preparatywnych można wyizolować jedynie z materiału poronnego. W krwi pępowinowej, którą wykorzystaliśmy, zawartość AFP jest znacznie niższa, a ściśle rzecz biorąc, nie jest to również najlepsze źródło biologiczne. Dlatego postawiliśmy sobie za zadanie otrzymanie rekombinowanego wektora białkowego – fragmentu AFP zawierającego miejsce wiązania receptora identyczne z tym, które występuje w naturalnej cząsteczce. Powstały rekombinowany C-końcowy fragment AFP (rAFP27) specyficznie wiązał się z receptorem AFP na komórkach nowotworowych i ulegał przez nie endocytozie podobnie jak ludzki AFP pełnej długości. gAFP27 zachował także pewne inne właściwości biologiczne białka pełnej długości. Zastosowanie gAFP27 jako wektora w SAD otwiera możliwość praktycznego wykorzystania potencjału białka jako liganda dla AFP.

Transformowane komórki charakteryzują się zmianami w genach związanych z regulacją proliferacji komórek i apoptozy. Wśród licznych badań poświęconych opracowaniu nowych czynników selektywnych wobec komórek nowotworowych szczególne miejsce zajmują oligonukleotydy antysensowne. ASON należą do klasy nowych czynników, które mogą hamować syntezę specyficznych białek związanych z nowotworem poprzez wiązanie się z mRNA kodującym te białka, blokując w ten sposób syntezę białek. Wiele zmodyfikowanych (szczególnie tiofosforanowych) ASON wykazało przekonujące zmniejszenie ekspresji docelowego genu in vitro i sugeruje się, że są skuteczne w leczeniu szerokiego zakresu nowotworów. Przeszkodą zmniejszającą selektywność ASON jest obecny brak odpowiedniego i skutecznego SAD tych związków w komórkach docelowych, niezbędnego do wykorzystania potencjału terapeutycznego ASON.

Transformowane komórki charakteryzują się zmianami w genach związanych z regulacją proliferacji komórek i apoptozy. Wśród licznych badań poświęconych opracowaniu nowych czynników selektywnych wobec komórek nowotworowych szczególne miejsce zajmują oligonukleotydy antysensowne. Antysensowne oligonukleotydy stanowią jedną z takich klas nowych środków, które mogą hamować syntezę specyficznych białek towarzyszących nowotworowi poprzez wiązanie się z mRNA kodującym te białka, blokując w ten sposób syntezę białek. W ostatnich dziesięcioleciach opracowano i przetestowano kilka antysensów w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Wiele z nich wykazało przekonujące zmniejszenie ekspresji genów docelowych w systemach in vitro i sugeruje się, że są skuteczne w leczeniu szerokiego zakresu nowotworów. Jednakże ze względu na genetyczną heterogeniczność nowotworów stosowanie antysensów jako pojedynczego leku nie wydaje się skuteczne w leczeniu tej choroby. Terapie antysensowne mające na celu zakłócanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w proliferację komórek i apoptozę są szczególnie obiecujące w połączeniu z konwencjonalnymi metodami leczenia przeciwnowotworowego.

Dostarczenie tiofosforanu A8(G) do komórek nowotworowych w postaci koniugatów z AFP okazało się niezwykle skuteczne, gdyż umożliwiło pokonanie bariery błony cytoplazmatycznej ograniczającej przenikanie ABOI do wnętrza komórek, co objawiło się albo w postaci bezpośredniego efektu cytostatycznego, albo w postaci uwrażliwienia komórek docelowych na działanie innych leków przeciwnowotworowych.Stwierdzono, że niespecyficzna toksyczność niektórych sekwencji (G nie stanowiła przeszkody w stosowaniu tych (G), ponieważ zastosowanie cząsteczki wektora w SAD ograniczyło ich toksyczność wobec komórek nowotworowych, jednak synteza koniugatów okazała się procesem bardzo pracochłonnym, któremu towarzyszyły znaczne straty białka i ABOM. Alternatywne projekty, które są niekowalencyjne kompleksy białek z ABOM, mogą być bardziej zaawansowane technologicznie. AO, zwłaszcza ich analogi tiofosforanowe, mają wysoki ładunek ujemny i są w stanie tworzyć silne kompleksy z cząsteczkami polikationowymi. Aby zwiększyć efektywność tworzenia takich kompleksów, do cząsteczek rekombinowanych białek (gAFP27 i EvP) wprowadzono sekwencję o ładunku dodatnim, zapewniając ich silną interakcję z LBOM. Powstałe konstrukty okazały się skutecznymi SAD, nie tylko znacznie zwiększając efektywność akumulacji ABOA w komórkach charakteryzujących się zwiększoną zawartością receptorów dla wspomnianych białek, ale także chroniąc naturalne fosfodiestrowe OA przed degradacją. Jednakże zastosowanie mitogenu, jakim jest EOP, jako docelowego składnika SAD ogranicza zakres stosowanych ABO, uniemożliwiając w niektórych przypadkach realizację efektu biologicznego. Możliwe, że modyfikacja regionu wiążącego receptor cząsteczki EUR może pomóc w rozwiązaniu tego problemu, w wyniku czego zdolność receptora do aktywacji (zdolność do autofosforylacji) zostanie utracona, ale nie będzie miała wpływu na zdolność receptora, który ma zostać internalizowany po związaniu się z jego ligandem.

Wyniki badań eksperymentalnych przedstawione w tej pracy wskazują na wysoką skuteczność i selektywność systemów celowanego dostarczania opartych na alfa-fetoproteinie, jej fragmentach i modyfikowanym naskórkowym czynniku wzrostu.

Postęp w badaniach molekularnych mechanizmów patogenezy chorób oraz pojawienie się nowych metod z zakresu biologii molekularnej i biotechnologii otwierają możliwości opracowania nowych leków, które selektywnie oddziałują na różne szlaki sygnałowe charakterystyczne dla komórek nowotworowych, a tym samym możliwość ukierunkowanego indywidualnego leczenia opartego na unikalnym kompleksie celów molekularnych wytwarzanych przez nowotwór pacjenta. Leki mogą docierać do celów samodzielnie (na przykład przeciwciała terapeutyczne) lub jako część systemów dostarczania ukierunkowanych na określone narządy dotknięte nowotworem lub bezpośrednio na powierzchnię lub do wnętrza komórek nowotworowych. Zrozumienie biologii komórki nowotworowej i zbadanie mikrośrodowiska komórek nowotworowych umożliwi nam opracowanie skutecznych opcji leków celowanych.

Lista referencji do badań do rozprawy doktorskiej Doktor nauk biologicznych Posypanova, Galina Aronovna, 2013

1. Jain R.K. Dostarczanie medycyny molekularnej i komórkowej guzom litym. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. nr 1-3. Str. 149-168.

2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Dostarczanie i transport leku do guzów litych. //Pharm Res. 2003. V. 20. nr 9. Str. 1337-1350.

3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. Przegląd rozwoju klinicznego rytuksymabu: pierwszego przeciwciała monoklonalnego zatwierdzonego do leczenia chłoniaka. // Semin Onkol. 1999. V. 26. nr 5 Dodatek 14. s. 66-73.

4. Huhn D., von Schilling C„ Wilhelm M„ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W„ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rytuximab Terapia chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną z komórek B. // Krew. 2001. V. 98. nr 5. Str. 1326-1331.

5. Gribben J.G., Hallek M. Odkrywanie na nowo alemtuzumabu: obecne i nowe role terapeutyczne. //Br J Hematol. 2009. V. 144. Nr 6. Str. 818-831.

6. Ravandi F., O”Brien S. Alemtuzumab w CLL i innych nowotworach limfatycznych. // Cancer Invest. 2006. V. 24. Nr 7. P. 718-725.

7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-IH) w leczeniu przewlekłej białaczki limfatycznej. //Onkogen. 2007. V. 26. Nr 25. Str. 3644-3653.

8. Baselga J. Przegląd terapii celowanej EGFR. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. nr 4. s. 218-219.

9. Fischgrabe J., Wulfing P. Terapie celowane w raku piersi: ustalone leki i najnowsze osiągnięcia. // Curr Clin Pharmacol. 2008. V. 3. Nr 2. Str. 85-98.

10. Goldenberg M.M. Trastuzumab, humanizowane przeciwciało monoklonalne pochodzące z rekombinowanego DNA, nowy środek w leczeniu przerzutowego raka piersi. // Clin Ther. 1999. V. 21. nr 2. s. 309-318.

11. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Rak piersi u człowieka: korelacja nawrotu i przeżycia z amplifikacją onkogenu HER-2/neu. // Nauka. 1987. V. 235. Nr 4785. Str. 177-182.

12. Azim H., Azim H.A., Jr. Celowanie w Her-2/neu w przypadku raka piersi: takie proste! // Onkologia. 2008. V. 74. nr 3-4. s. 150-157.

13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado V., Gascon P. Mechanizm działania przeciwciał monoklonalnych anty-HER2: aktualizacja naukowa na temat trastuzumabu i 2C4. // Adw Exp Med Biol. 2003. V. 532. s. 253-268.

14. Stern M., Herrmann R. Przegląd przeciwciał monoklonalnych w terapii nowotworów: obecne i obiecujące. // Krytyczny Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. nr 1. Str. 11-29.

15. Gutheil J. Obietnica przeciwciał monoklonalnych w terapii raka. // Krytyczny Rev Oncol Hematol. 2001. V. 38. nr 1. Str. 1-2.

16. Moiseenko B.M. Przeciwciała monoklonalne w leczeniu nowotworów złośliwych. // Onkologia praktyczna. 2003. V. 4. nr 3. R. 148-156.

17. Guillemard V., Uri Saragovi N. Chemioterapeutyki prolekowe omijają oporność na glikoproteinę p i zabijają nowotwory in vivo z wysoką skutecznością i selektywnością zależną od celu. //Onkogen. 2004. V. 23. Nr 20. Str. 3613-3621.

18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Spostrzeżenie technologiczne: immunokoniugaty leków cytotoksycznych do terapii nowotworów. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. nr 4. Str. 245-255.

19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) for Relapsed CD30-Positive Lymphomas. // Dziennik medycyny Nowej Anglii. W. 363. Nr 19. Str. 1812-1821.

20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. Badanie fazy I dotyczące trastuzumabu

21. DM1, koniugat przeciwciała HER2 z lekiem, podawany co 3 tygodnie pacjentom z HER2-dodatnim rakiem piersi z przerzutami. // Dziennik Onkologii Klinicznej. W. 28. Nr 16. Str. 2698-2704.

22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamycyna: immunokoniugat anty-CD33 do leczenia ostrej białaczki szpikowej. // Opinia eksperta Biol Ther. 2008. V. 8. nr 4. s. 527-540.

23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O"Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. Rola gemtuzumabu ozogamycyny w terapii ostrej białaczki. // Br J Haematol. 2006. V. 132. nr 4. P 398-409.

24. Gao Z., McAlister V.C., Williams G.M. Ponowna populacja śródbłonka wątroby przez komórki pochodzące ze szpiku kostnego. // Lancet. 2001. V. 357. Nr 9260. Str. 932-933.

25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Kalicheamycyna gamma II: antybiotyk przeciwnowotworowy, który specyficznie rozcina miejsca dwuniciowego DNA. // Nauka. 1988. V. 240. Nr 4856. Str. 1198-1201.

26. Reiter Y. Rekombinowane immunotoksyny w celowanej terapii komórkami nowotworowymi. // Adv Cancer Res. 2001. V. 81. s. 93-124.

27. Goyal A., Batra J.K. Włączenie wrażliwego na furynę odstępnika zwiększa cytotoksyczność rybotoksyny restrykcyny zawierającej rekombinowane immunotoksyny jednołańcuchowe. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.

28. Kreitman R.J. Rekombinowane immunotoksyny zawierające skrócone toksyny bakteryjne do leczenia nowotworów hematologicznych. // Bioleki. 2009. V. 23. nr 1. Str. 1-13.

29. Jain R.K., Baxter L.T. Mechanizmy niejednorodnego rozmieszczenia przeciwciał monoklonalnych i innych makrocząsteczek w nowotworach: znaczenie podwyższonego ciśnienia śródmiąższowego. // Rak Res. 1988. V. 48. Nr 24 Pt 1. P. 7022-7032.

30. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Terapia przeciwciałami monoklonalnymi w przypadku guzów litych. // Leczenie raka ks. 2000. V. 26. nr 4. s. 269-286.

31. Gen Brada M. BCL2: aktualne znaczenie w onkologii klinicznej. // Eur J Rak. 1992. V. 28. nr 1. s. 270-272.

32. Yip KW, Reed J.C. Białka z rodziny Bcl-2 i nowotwory. //Onkogen. 2008. V. 27. Nr 50. Str. 6398-6406.

33. Reed J.C. Białka z rodziny Bcl-2: strategie pokonywania chemioterapii w przypadku raka. // Adw. Pharmacol. 1997. V. 41. s. 501-532.

34. Reed J.C. Białka z rodziny Bel-2: regulatory chemiooporności w nowotworach. // Toksykol Lett. 1995. V. 82-83. Str. 155-158.

35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen w leczeniu czerniaka z przerzutami. // Przyszły onkol. 2007. V. 3. Nr 3. s. 263-271.

36. Oblimersen: Augmerosen, antysensowny oligonukleotyd BCL-2 Genta, G 3139, GC 3139, oblimersen sodu. // Narkotyki R D. 2007. V. 8. nr 5. s. 321-334.

37. Koniugaty oligonukleotydowe Manoharan M. jako potencjalne leki antysensowne o lepszym wychwytywaniu, biodystrybucji, ukierunkowanym dostarczaniu i mechanizmie działania. /"/ Antisense Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. nr 2. s. 103-128.

38. Abels C. Celowanie w układ naczyniowy guzów litych za pomocą terapii fotodynamicznej (PDT). // Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. nr 8. Str. 765-771.

39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. Bezpośrednie mechanizmy niszczenia nowotworów w terapii fotodynamicznej. // Acta Biochim Pol. 2005. V. 52. nr 2. s. 339-352.

40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Terapia fotodynamiczna (PDT): krótki przegląd mechanizmów komórkowych i zastosowań PDT w badaniach nad nowotworami. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. nr 1. Str. 1-8.

41. Aveline B.M., Redmond R.W. Ekskluzywne wolnorodnikowe mechanizmy fotouczulania komórkowego. // Fotochemia i fotobiologia. 1998. V. 68. nr 3. s. 266-275.

42. Henderson B.W., Dougherty T.J. Jak działa terapia fotodynamiczna? // Fotochemik Fotobiol. 1992. V. 55. nr 1. Str. 145-157.

43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Reakcja niepożądana charakteryzująca się bólem w klatce piersiowej, dusznością i omdleniem związanym z werteporfiną (wizudyną). // Jestem J. Oftalmol. 2002. V. 134. Nr 2. Str. 281-282.

44. Cheng Y., A. CS, Meyers J.D., Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Wysoce wydajne dostarczanie leków za pomocą wektorów nanocząstek złota do fotodynamicznej terapii raka in vivo. // J Am Chem Soc. 2008. V. 130. Nr 32. Str. 10643-10647.

45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Ukierunkowana terapia fotodynamiczna za pośrednictwem systemów dostarczania za pośrednictwem receptorów. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. nr 1. Str. 53-76.

46. ​​​​Oleinick N.L., Evans H.H. Fotobiologia terapii fotodynamicznej: cele i mechanizmy komórkowe. //Rozdzielczość promieniowania 1998. V. 150. nr 5 Dodatek Str. S146-156.

47. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Ukierunkowane wewnątrzkomórkowe dostarczanie fotosensybilizatorów w celu zwiększenia wydajności fotodynamicznej. // Immunol Cell Biol. 2000. V. 78. nr 4. Str. 452-464.

48. Rozanova Torshina N., Zhang J.Z., Heck D.E. Katalityczna terapia nowotworów porfirynami i askorbinianem. // Rak Lett. 2007. V. 252. nr 2. Str. 216-224.

49. Khorosheva E.V., Gerasimova G.K., Kalia O.J1. Badanie mechanizmu transportu teraftalu do komórek nowotworowych

50. Rosyjski dziennik bioterapeutyczny 2007. V. 6. nr 1. R. 8.

51. Kulbachevskaya N.Yu., Manzyuk L.V., Mikhailova JI.M. Kliniczne i eksperymentalne badanie toksyczności przeciwnowotworowego układu katalitycznego „teraftal + kwas askorbinowy” („TF + AK”). // Rosyjskie czasopismo bioterapeutyczne. 2004. V. 3. nr 2. R. 70.

52. Ravi Kumar M.N. Nano i mikrocząstki jako urządzenia do kontrolowanego dostarczania leków. // J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. nr 2. s. 234-258.

53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanocząsteczki i systemy celowane w terapii nowotworów. // Adv Drug Deliv Rev. 2012. V.P.

54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Technologia nanocząsteczek związanych z albuminą (nab) to obiecująca metoda dostarczania leków przeciwnowotworowych. // Najnowsze Pat Anticancer Drim Dkrnv 9PP9 V P

55. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Targeting of albumin-embedded paclitaxel nanoparticles to nowotwory. //Nanomedycyna. 2009. V, 5. nr 1. Str. 73-82.

56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paklitaksel na raka piersi: nowy preparat o ulepszonym profilu bezpieczeństwa i większej skuteczności. // Ekspert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. nr 7. Str. 919-943.

57. Moreno-Aspitia A., Perez E.A. Paklitaksel związany z albuminą nanocząsteczek (ABI-007): nowsza alternatywa taksanu w leczeniu raka piersi. // Przyszły onkol. 2005. V. 1. nr 6. Str. 755-762.

58. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytowe mechanizmy ukierunkowanego dostarczania leków. // Zaawansowane recenzje podawania leków. 2007. V. 59. nr 8. Str. 748-758.

59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Endocytoza zależna od klatryny. // Biochem J. 2004. V. 377. Nr Pt l.P. 1-16.

60. Rodemer C., Haucke V. Endocytoza zależna od klatryny/AP-2: nowatorski plac zabaw dla zestawu narzędzi farmakologicznych? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. nr 186. Str. 105-122.

61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Endocytoza zależna od klatryny. // Czasopismo biochemiczne. 2004. V. 377. Nr Pt 1. s. 1-16.

62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Czynniki dodatkowe w endocytozie pęcherzyków synaptycznych zależnej od klatryny. //Nat Rev Neurosci. 2000. V. 1. nr 3. s. 161-172.

63. Marsh M., McMahon H.T. Strukturalna era endocytozy. // Nauka. 1999. V. 285. Nr 5425. s. 215-220.

64. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytowe mechanizmy ukierunkowanego dostarczania leków. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. nr 8. Str. 748-758.

65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. Dynamina samoorganizuje się w pierścienie, co sugeruje mechanizm pączkowania pokrytych pęcherzyków. //Natura. 1995. V. 374. Nr 6518. Str. 190-192.

66. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, GTPaza przebudowująca błonę. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. Nr 2. Str. 75-88.

67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Cytoplazmatyczny transport pęcherzykowy zależny od dyneiny od wczesnych do późnych endosomów. // Dziennik biologii komórki. 1993. V. 123. nr 6 pkt 1. s. 1373-1387.

68. Stahl PD, Barbieri M.A. Ciała wielopęcherzykowe i endosomy wielopęcherzykowe: „tajniki” ruchu endosomalnego. // Science's STKE: środowisko wiedzy o transdukcji sygnału 2002. V. 2002. Nr 141. P. pe32.

69. Piper R.C., Luzio J.P. Endosomy późne: sortowanie i podział w ciałach wielopęcherzykowych. // Ruch drogowy. 2001. V. 2. nr 9. Str. 612-621.

70. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Endolysosomal proteoliza i jej regulacja. // Czasopismo biochemiczne. 2002. V. 363. Nr Pt 3. S. 417-429.

71. Eskelinen E.-L. Rola LAMP-1 i LAMP-2 w biogenezie i autofagii lizosomów. // Molekularne aspekty medycyny. 2006. V. 27. nr 5-6. s. 495-502.

72. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Caveoliny, domeny uporządkowane płynnie i przekazywanie sygnału. // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. Nr 11. Str. 7289-7304.

73. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. ​​​​Szlaki wychwytu i późniejszy wewnątrzkomórkowy handel w niewirusowym dostarczaniu genów. // Pharmacol ks. 2006. V. 58. nr 1. Str. 32-45.

74. Lajoie P., Nabi I.R. Rozdział 3 Tratwy lipidowe, jaskinie i ich endocytoza. W: Kwang WJ, wyd. Międzynarodowy Przegląd Biologii Komórkowej i Molekularnej: Prasa Akademicka; 2010. s. 135163.

75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Endocytoza niezależna od klatryny i kaweoliny-1: wejście małpiego wirusa 40 do komórek pozbawionych kaweoli. // J Cell Biol. 2005. V. 168. Nr 3. Str. 477-488.

76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. Ukierunkowane wewnątrzkomórkowe dostarczanie leków: przegląd. // Die Pharmazie. 2007. V. 62. nr 9. Str. 643-658.

77. Fenton C., Perry C.M. Gemtuzumab ozogamycyna: przegląd jego stosowania w ostrej białaczce szpikowej. // Narkotyki. 2005. V. 65. Nr 16. Str. 2405-2427.

78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Nowe przeciwciała monoklonalne CD20 do terapii chłoniaka. // Dziennik Hematologii i Onkologii. 2012. V. 5. nr 1. s. 64.

79. Chari R.V.J. Ukierunkowana terapia raka: nadanie specyficzności lekom cytotoksycznym. // Relacje z badań chemicznych. 2007. V. 41. nr 1. Str. 98-107.

80. Casi G., Neri D. Koniugaty przeciwciało-lek: podstawowe pojęcia, przykłady i perspektywy na przyszłość. // Dziennik kontrolowanego uwalniania: oficjalny dziennik Towarzystwa Kontrolowanego Uwalniania. 2012. V. 161. Nr 2. Str. 422-428.

81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren T., Venkatachalam T., Waddick K.G., Rostostev A., Myers D.E. Działanie cytotoksyczne naskórkowego czynnika wzrostu-genisteiny wobec komórek raka piersi. // Clin Cancer Res. 1998. V. 4. nr 4. Str. 901-912.

82. Rihova B. Ukierunkowanie leków na receptory na powierzchni komórki. // Krytyczne recenzje w biotechnologii. 1997. V. 17. nr 2. s. 149-169.

83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Najnowsze postępy w koniugatach leków przeciwnowotworowych ukierunkowanych na nowotwór. // Chemia bioorganiczna i medyczna. 2005. V. 13. Nr 17. Str. 50435054.

84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Wewnątrzkomórkowe dostarczanie środków przeciwnowotworowych oparte na prodrugach. // Zaawansowane recenzje podawania leków. 2011. V. 63. nr 1-2. Str. 3-23.

85. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J. Najnowsze trendy w projektowaniu ukierunkowanych leków przeciwnowotworowych i koniugatów. // Aktualna chemia lecznicza. 2008. V. 15. Nr 18. Str. 1802-1826.

86. Sanderson R.J., Hering M.A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. Stabilność łącznika leku in vivo immunokoniugatu aurystatyny połączonego z dipeptydem anty-CD30. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. nr 2 pkt 1. s. 843-852.

87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Farmakokinetyka nieliniowa białek terapeutycznych wynikająca z endocytozy za pośrednictwem receptora. // J Pharmacokinet Farmakodyn. 2009. V. 36. nr 3. s. 239-260.

88. Malyankar U.M. Antygeny i biomarkery związane z nowotworem w terapii nowotworów i terapii immunologicznej. // Int Rev Immunol. 2007. V. 26. nr 3-4. Str. 223-247.

89. Tyuryaeva I.I. Antygeny nowotworowe. // Cytologia. 2008. V. 50. nr 3. R. 189-209.

90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon T., van der Bruggen P. Peptyd MAGE-A4 prezentowany przez HLA-A2 jest rozpoznawany przez cytolityczne limfocyty T. // Eur J Immunol. 1999. V. 29. nr 10. Str. 3329-3337.

91. Houghton A.N. Antygeny nowotworowe: immunologiczne rozpoznawanie siebie i zmienionego siebie. // J Exp Med. 1994. V. 180. nr 1. Str. 1-4.

92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Gangliozydy normalnych i nowotworowych ludzkich melanocytów. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 120. nr 2. s. 500-504.

93. Tang C.K., Katsara M., Apostolopoulos V. Strategie stosowane w immunoterapii MUC1: badania kliniczne na ludziach. // Ekspert Rev Szczepionki. 2008. V. 7. Nr 7. Str. 963-975.

94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Rola rodziny receptorów HER w rozwoju i różnicowaniu. //J Cell Physiol. 2004. V. 200. nr 3. s. 343-350.

95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. Sieć sygnalizacyjna ErbB: heterodimeryzacja receptorów w rozwoju i nowotworach. // EMBO J. 2000. V. 19. nr 13. Str. 3159-3167.

96. Barysznikow A.Yu. Związek między nowotworem a układem odpornościowym organizmu. // Onkologia praktyczna. 2003. V. 4. nr 3. R. 127-130.

97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Antygen rakowo-embrionalny jako cel szczepionki. // Ekspert Rev Szczepionki. 2008. V. 7. Nr 7. Str. 987-993.

98. Singer J.W., De Vries P., Bhatt R., Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis R.A., Wallace S. Koniugacja kamptotecyn do poli-(L-kwasu glutaminowego). // Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 922. s. 136-150.

99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Cytofluorescencyjne wykrywanie interakcji adriamycyna-mitochondria w izolowanym, perfundowanym sercu szczura. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. Nr 1. Str. 35-41.

100. Evdokimova V.N., Butterfield L.H. Alfa-fetoproteina i inne antygeny związane z nowotworem do immunoterapii raka wątrobowokomórkowego. // Opinia eksperta Biol Ther. 2008. V. 8. nr 3. Str. 325336.

101. Abelev G.I., Gumka T.L. Komórkowe aspekty reekspresji alfa-fetoproteiny w nowotworach. // Rak nasienia Biol. 1999. V. 9. nr 2. s. 95-107.

102. Miżejewski G.J. Struktura i funkcja alfa-fetoproteiny: znaczenie dla izoform, epitopów i wariantów konformacyjnych. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. Nr 5. s. 377-408.

103. Castelli C., Rivoltini L., Andreola G., Carrabba M., Renkvist N., Parmiani G. Rozpoznawanie antygenów związanych z czerniakiem przez komórki T. //J Cell Physiol. 2000. V. 182. Nr 3. s. 323-331.

104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. Nowa rodzina genów kodujących antygen rozpoznawany przez autologiczne cytolityczne limfocyty T na ludzkim czerniaku. // J Exp Med. 1995. V. 182. Nr 3. Str. 689-698.

105. Lewis J.J., Houghton A.N. Definicja antygenów nowotworowych odpowiednich do konstrukcji szczepionek. // Rak nasienia Biol. 1995. V. 6. nr 6. s. 321-327.

106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Drug targeting in raka leczenie: aktywne koniugaty daunorubicyny-białko. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pkt A. P. 291-298.

107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Przepuszczalność naczyń nowotworowych i efekt EPR w terapiach makromolekularnych: przegląd. // J Zwolnienie kontroli. 2000. V. 65. nr 1-2. Str. 271-284.

108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Wczesna faza guza nagromadzenie makrocząsteczek: wielka różnica w szybkości usuwania między nowotworem a normalnymi tkankami. // Jpn J Cancer Res. 1998. V. 89. nr 3. s. 307-314.

109. Kratz F., Beyer U. Białka surowicy jako nośniki leków przeciwnowotworowych: przegląd. //Dostawa leków. 1998. V. 5. nr 4. Str. 281-299.

110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Przygotowanie, charakterystyka i skuteczność in vitro koniugatów albuminy i doksorubicyny. // Biol Pharm Bull. 1998. V. 21. nr 1. s. 56-61.

111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Koniugaty albuminy leku przeciwnowotworowego chlorambucyl: synteza, charakterystyka i skuteczność in vitro. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. V. 331. Nr 2. Str. 47-53.

112. Stowarzyszenie Onkologii Medycznej Niemieckiego Towarzystwa Onkologicznego. // Clin Cancer Res. 1999. V. 5. nr 4. Str. 753-759.

113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. Synteza, profil rozszczepienia i skuteczność przeciwnowotworowa proleku metotreksatu wiążącego albuminę, który jest rozszczepiany przez plazminę i katepsynę B. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. V. 340. nr 8. s. 389-395.

114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Rozwój i skuteczność in vitro nowych koniugatów doksorubicyny specyficznych dla MMP2 i MMP9. // Bioorg Med Chem Lett. 2001. V. 11. Nr 15. Str. 2001-2006.

115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Koniugaty lek-polimer zawierające wiązania rozszczepialne kwasem. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. V. 16. nr 3. Str. 245-288.

116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung D.E., Gitzel M. Prodrugs of antracyklins in chemochemioterapia raka. // Curr Med Chem. 2006. V. 13. nr 5. Str. 477-523.

117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. Faza I i badanie farmakokinetyczne pochodnej (6-maleimidokaproilo)hydrazonowej doksorubicyny. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. Nr 16. Str. 4858-4866.

118. Kratz F., Mansour A., ​​​​Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Rozwój proleków doksorubicyny wiążących albuminę, które są rozszczepiane przez antygen specyficzny dla prostaty. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. V. 338. Nr 10. Str. 462-472.

119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. Badanie in vitro i in vivo leku doksorubicyny wiążącego albuminę, który jest rozszczepiany przez katepsynę B. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. V. 64. nr 2. Str. 413-418.

120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Opracowanie dwufunkcyjnych linkerów wiążących białka dla nowej generacji leków o podwójnym działaniu. // Bioconjug Chem. 2009. V. 20. nr 2. s. 390-396.

121. Abu Ajaj K., Kratz F. Opracowanie proleków o podwójnym działaniu w celu obejścia oporności wielolekowej. // Bioorg Med Chem Lett. 2009. V. 19. nr 3. Str. 995-1000.

122. Dautry-Varsat A. Endocytoza za pośrednictwem receptora: wewnątrzkomórkowa podróż transferyny i jej receptora. // Biochimie. 1986. V. 68. nr 3. Str. 375-381.

123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez J.A., Helguera G., Penichet M.L. Receptor transferyny, część I: Biologia i celowanie za pomocą przeciwciał cytotoksycznych w leczeniu raka. // Clin Immunol. 2006. V. 121. Nr 2. Str. 144-158.

124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: struktura, funkcja i potencjalne działanie terapeutyczne. //Dziś odkrycie narkotyków. 2005. V. 10. nr 4. s. 267-273.

125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Transferrin kierował dostarczaniem adriamycyny do ludzkich komórek. // Przeciwnowotworowy Res. 1998. V. 18. nr 3A. Str. 1423-1427.

126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. Koniugaty adriamycyny z ludzką transferyną wiążą się z receptorami transferyny i zabijają komórki K562 i HL60. // Arch Biochem Biofizyka. 1993. V. 300. nr 1. s. 356-363.

127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. Hamowanie transportu elektronów przez błonę plazmatyczną przez koniugaty transferyny i adriamycyny. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1105. Nr 1. Str. 84-88.

128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Wpływ koniugacji doksorubicyny do transferyny na wychwyt żelaza przez komórki K562 poprzez endocytozę za pośrednictwem receptora. // Eur J Biochem. 1993. V. 213. Nr 1. Str. 427-436.

129. Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Mechanizm działania i spektrum linii komórkowych wrażliwych na koniugat doksorubicyny z transferyną. // Rak Chemother Pharmacol. 1998. V. 41. nr 2. Str. 155160.

130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. Receptor transferyny, część II: ukierunkowane dostarczanie środków terapeutycznych do komórek nowotworowych. // Clin Immunol. 2006. V. 121. Nr 2. s. 159-176.

131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. Cytotoksyczność in vitro i dystrybucja kompleksu transferyna-platyna(II) in vivo. // J Pharm Sci. 1995. V. 84. nr 2. s. 216-221.

132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. Wstępna ocena transferyny platynowej (MPTC-63) jako potencjalnej nietoksycznej metody leczenia raka piersi. // Wykrywanie raka Poprzednie 1988. V. 12. nr 1-6. s. 469-480.

133. Szef J.F., Wang F., Elliott R.L. Leki przeciwnowotworowe zakłócają metabolizm żelaza w komórkach nowotworowych. //Adv Enzym Regul. 1997. V. 37. S. 147-169.

134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Synteza i skuteczność in vitro koniugatów transferyny leku przeciwnowotworowego chlorambucylu. //J Med Chem. 1998. V. 41. Nr 15. Str. 2701-2708.

135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Celowanie w guz w oparciu o efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) oraz mechanizm endocytozy za pośrednictwem receptora (RME). // Int J.Pharm. 2004. V. 277. nr 1-2. s. 39-61.

136. Frankel A.E. Zwiększone złożoność immunotoksyn. // Clin Cancer Res. 2002. V. 8. nr 4. Str. 942-944.

137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Terapia immunotoksynowa nowotworów układu krwiotwórczego. // Semin Onkol. 2003. V. 30. nr 4. s. 545-557.

138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. Skuteczność immunotoksyn ukierunkowanych na receptor transferyny w liniach komórkowych nowotworu mózgu i nowotworach mózgu u dzieci. // Rak Res. 1993. V. 53. nr 6. Str. 1348-1353.

139. Weaver M., Laske D.W. Koniugat toksyny ukierunkowany na ligand receptora transferyny (Tf-CRM107) do leczenia glejaków złośliwych. // J Neuroonkol. 2003. V. 65. nr 1. Str. 3-13.

140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. Obniżenie poziomu c-FLIP uwrażliwia komórki raka prostaty DU145 na apoptozę za pośrednictwem Fas. // Rak Biol Ther. 2002. V. 1. nr 4. Str. 401-406.

141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. Celowanie chloryny e6 za pośrednictwem naskórkowego czynnika wzrostu selektywnie wzmacnia jej aktywność fotodynamiczną. // Rak Res. 2000. V. 60. nr 8. Str. 2197-2202.

142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. Koniugaty EGF-rycyna A: profile kinetyczne efektów cytotoksycznych i oporne warianty komórek. // Funkcja struktury komórkowej. 1984. V. 9. nr 3. s. 203-212.

143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. Physicochemiczne wymagania dotyczące komórkowe wychwytu peptydu pAntp. Rola powinowactwa wiązania lipidów. // Eur J Biochem. 2001. V. 268. nr 5. Str. 1304-1314.

144. Vives E., Richard J.P., Rispal C., Lebleu B. Internalizacja peptydu TAT: poszukiwanie mechanizmu wejścia. // Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. nr 2. Str. 125-132.

145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Nowe koniugaty peptydu nośnikowego daunorubicyny pochodzące z segmentów ludzkiej kalcytoniny. // J Mol Rozpoznaj. 2003. V. 16. nr 5. Str. 280-287.

146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. Hamowanie i zakłócanie telomerów jako procesy ukierunkowane na leki. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. V. 43. S. 359-379.

147. Chomczynski P., Sacchi N. Jednoetapowa metoda izolacji RNA metodą ekstrakcji kwasem tiocyjanianem guanidyny-fenol-chloroformem. // Biochemia analityczna. 1987. V. 162. Nr 1. Str. 156159.

148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Komórki gruczolakoraka są celem nowej chimerycznej toksyny GnRH-PE66 poprzez specyficzne miejsca wiązania hormonu uwalniającego gonadotropiny. // J Biol Chem. 1997. V. 272. Nr 17. Str. 11597-11603.

149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. Białko fuzyjne toksyna błonicza-naskórkowy czynnik wzrostu jest cytotoksyczne dla ludzkich komórek glejaka wielopostaciowego. // Rak Res. 2003. V. 63. nr 8. Str. 1834-1837.

150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. Celowanie w receptor naskórkowego czynnika wzrostu w liniach komórkowych raka piersi za pomocą rekombinowanej toksyny fuzyjnej ligandu (DAB389EGF). // Rak J. Sci Am. 1996. V. 2. nr 3. Str. 175-180.

151. Turturro F. Denileukin diftitox: bioterapeutyczna zmiana paradygmatu w leczeniu zaburzeń pochodzenia limfoidalnego. // Ekspert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. nr 1. Str. 11-17.

152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox jako nowa terapia celowana w nowotworach układu limfatycznego. // Inwestycja w raka. 2007. V. 25. nr 6. Str. 495-501.

153. Duvic M., Talpur R. Optymalizacja terapii denileukin diftitox (Ontak). // Przyszły onkol. 2008. V. 4. nr 4. Str. 457-469.

154. Foss F. Doświadczenia kliniczne z denileukin diftitox (ONTAK). // Semin Onkol. 2006. V. 33. Nr 1 Dodatek 3. P. SI 1-16.

155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. Nowe terapie przewlekłej białaczki limfatycznej. // Krew ks. 2004. V. 18. nr 2. s. 137-148.

156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox jako nowa terapia celowana w chłoniaku nieziarniczym. // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. No. 2. P. 169-174.

157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: zwięzły przegląd kliniczny. // Ekspert Rev Anticancer Ther. 2005. V. 5. nr 1. s. 33-38.

158. Black J.H., McCubrey J.A., Willingham M.C., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. Białko fuzyjne toksyna błonicza-interleukina-3 (DT(388)IL3) przedłuża przeżycie wolne od choroby myszy z białaczką z obniżoną odpornością. // Białaczka. 2003. V. 17. nr 1. s. 155-159.

159. Frankel A., Liu J.S., Rizzieri D., Hogge D. Badanie kliniczne fazy I dotyczące białka fuzyjnego toksyna błonicza-interleukina 3 u pacjentów z ostrą białaczką szpikową i mielodysplazją. // Chłoniak białaczkowy. 2008. V. 49. nr 3. Str. 543-553.

160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. Egzotoksyny IL-4 i IL-13 pseudomonas: nowa nadzieja w terapii nowotworów mózgu. // Skupienie neurochirurgii. 2006. V. 20. nr 4. P. El 1.

161. Terapia z użyciem temozolomidu lub bez niego w nowo zdiagnozowanych glejakach złośliwych: badanie fazy 1 dotyczące ostatecznych wyników bezpieczeństwa. //Neurochirurgia. 2008. V.P.

162. Jarboe J.S., Johnson K.R., Choi Y., Lonser R.R., Park J.K. Ekspresja receptora interleukiny-13 alfa2 w glejaku wielopostaciowym: implikacje dla terapii celowanych. // Rak Res. 2007. V. 67. nr 17. Str. 7983-7986.

163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: nowatorski prototyp ludzkich białek chimerycznych do terapii celowanej. // FEBS Lett. 1999. V. 457. Nr 2. s. 271-276.

164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Mechanizm działania interleukiny-2 (IL-2)-Bax, an chimeryczne białko indukujące apoptozę, skierowane przeciwko komórkom wyrażającym IL-2 chwytnik // Biochem J. 2003. V. 370. Nr Pt 1. s. 129-140.

165. Bergstrand C.G., Czar B. Wykazanie nowej frakcji białkowej w surowicy płodu ludzkiego. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. nr 2. s. 174.

166. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., S.I.I. A-globulina surowicy płodowej i jej synteza przez przeszczepialne wątrobiaki myszy. // Biochemia. 1963. V. 28. nr 4. R. 625-634.

167. Tatarinov Yu.S. Wykrywanie embriospecyficznej a-globuliny w surowicy krwi pacjenta z pierwotnym rakiem wątroby. // Pytanie Miód. chemia. 1964. V. 10. R. 90-91.

168. Abelev G.I., Elgort D.A. Alfa-fetoproteina jako marker immunologiczny raka wątrobowokomórkowego i potworniaka jąder i jajników. // Onkologia. 1978. V. 10. R. 3-17.

169. Brock D.J., Bolton A.E., Monaghan J.M. Diagnostyka prenatalna bezmózgowia poprzez pomiar alfafetoproteiny w surowicy matki. // Lancet. 1973. V. 2. nr 7835. Str. 923-924.

170. Aitken D.A., Crossley J.A. Wady cewy nerwowej/alfa-fetoproteina/Badania przesiewowe w kierunku zespołu Downa. // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. nr 2. s. 113-120.

171. Deutsch H.F. Chemia i biologia alfa-fetoproteiny. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.t» ting. zjj-j1z.

172. Luft A.J., Lorscheider F.L. Analiza strukturalna alfa-fetoproteiny ludzkiej i bydlęcej za pomocą mikroskopii elektronowej, przetwarzania obrazu i dichroizmu kołowego. // Biochemia. 1983. V. 22. Nr 25. Str. 5978-5981.

173. Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake S., Ho S.K. Struktury specyficznych dla choroby izoform alfa-fetoproteiny surowicy. // Br J Rak. 2000. V. 83. nr 10. Str. 1330-1337.

174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. Obecność kwasów tłuszczowych w ludzkiej alfa-fetoproteinie. // J Biol Chem. 1978. W. 253. Nr 7. Str. 2114-2119.

175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Tandemowa aranżacja genów albuminy i alfa-fetoproteiny w ludzkim genomie. // Gene. 1984. V. 32. nr 3. s. 255-261.

176. Lazarevich N.L. Molekularne mechanizmy regulacji ekspresji genu alfa-fetoproteiny. // Biochemia. 2000. V. 65. nr 1. R. 139-158.

177. Jose-Estanyol M., Danan J.L. Czynnik specyficzny dla wątroby i czynnik jądrowy wiążą się z promotorem alfa-fetoproteiny szczura. // J Biol Chem. 1988. V. 263. Nr 22. Str. 10865-10871.

178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Czynnik jądrowy 3 hepatocytów łagodzi represję genu alfa-fetoproteiny za pośrednictwem chromatyny. // J Biol Chem. 1999. V. 274. Nr 35. Str. 25113-25120.

179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. Locus alfa 1-fetoproteiny jest aktywowany przez receptor jądrowy Drosophila FTZ- Rodzina F1. // Mol. Komórka. Biol. 1996. V. 16. nr 7. Str. 3853-3865.

180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 jest represorem ekspresji a-fetoproteiny w liniach komórkowych ludzkiego wątrobiaka. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. Nr 6b. Str. 2772-2780.

181. Van Reeth T., Gabant P., Szpirer C., Szpirer J. Stymulacja promotora alfa-feioproteiny przez nieligandowy receptor hormonu tarczycy w związku z deacetylacją białka. // Endokrynologia molekularna i komórkowa. 2002. V. 188. nr 1-2. s. 99-109.

182. Lienard P., De Mees C., Drnze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Regulacja promotora alfa-fetoproteiny: wiązanie Ku i konformacja przestrzenna DNA. // Biochimie. 2006. V. 88. nr 10. Str. 1409-1417.

183. Miżejewski G.J. Biologiczna rola alfa-fetoproteiny podczas ciąży i rozwoju okołoporodowego. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. V. 229. Nr 6. Str. 439-463.

184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. Miejsce wiązania kwasów tłuszczowych ludzkiej alfa-fetoproteiny. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. V. 196. Nr 3. Str. 1049-1057.

185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Wpływ alfa-fetoproteiny i albuminy na wychwyt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych przez komórki wątrobiaka szczura i hepatocyty płodu szczura. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. Nr 1. Str. 81-88.

186. Miżejewski G.J., Pass K.A. Kwasy tłuszczowe, alfa-fetoproteina i mukowiscydoza. // Pediatria. 2001. V. 108. nr 6. Str. 1370-1373.

187. Miżejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Wpływ metali ciężkich na alfa-fetoproteinę w surowicy matki i płynie owodniowym ciężarnych myszy. // Toksykologia. 1990. V. 64. nr 1. Str. 19-32.

188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. Oczyszczona ludzka alfa-fetoproteina hamuje stymulowaną hormonami folikulotropowymi produkcję estradiolu przez komórki ziarniste świń w hodowli. // Mol Cell Endokrynol. 1993. V. 94. nr 1. Str. 21-25.

189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Alfa-fetoproteina aktywowana estradiolem hamuje odpowiedź macicy na estrogeny. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. nr 9. Str. 2733-2737.

190. Jacobson H.I., Bennett J.A., Miżejewski G.J. Hamowanie wzrostu raka piersi zależnego od estrogenu przez produkt reakcji alfa-fetoproteiny i estradiolu. // Rak Res. 1990. V. 50. nr 2. Str. 415-420.

191. Miżejewski G.J., Warner A.S. Alfa-fetoproteina może regulować wzrost macicy u niedojrzałych i dorosłych myszy po wycięciu jajników. // J Reprod Fertil. 1989. V. 85. nr 1. Str. 177-185.

192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Badania wewnętrznej aktywności antyuterotropowej mysiej alfa-fetoproteiny. // Biologia nowotworu. 1986. V. 7. nr 1. Str. 19-36.

193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Hormony ciąży, białko alfa-feto i zmniejszenie ryzyka raka piersi. // Adw Exp Med Biol. 2008. V. 617. S. 477-484.

194. Miżejewski G.J. Biologiczna rola alfa-fetoproteiny w nowotworach: perspektywy terapii przeciwnowotworowej. // Ekspert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. nr 6. Str. 709-735.

195. Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. Promujący mechanizm molekularny alfa-fetoproteiny na wzrost linii komórkowej ludzkiego wątrobiaka Bel7402. // Świat J Gastroenterol. 2002. V. 8. nr 3. s. 469-475.

196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. Wewnątrzkomórkowy mechanizm alfa-fetoproteiny promujący proliferację komórek NIH 3T3. // Rozdzielczość komórki 2002. V. 12. nr 2. Str. 151156.

197. Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Wzmocnienie proliferacji komórek HeLa przez alfa-fetoproteinę. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Szanghaj). 2002. V. 34. Nr 6. Str. 769-774.

198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alfa-fetoproteina: nowy członek sygnału wewnątrzkomórkowego cząsteczki w regulacji sygnalizacji PI3K/AKT w liniach komórkowych ludzkiego wątrobiaka. // Int J Rak. wiceprezes

199. Chakraborty M., Mandal C. Immunosupresyjne działanie ludzkiej alfafetoproteiny: badanie międzygatunkowe. // Immunol Inwest. 1993. V. 22. nr 5. s. 329-339.

200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. (alfa)-fetoproteina upośledza funkcję APC i indukuje ich apoptozę. // J Immunol. 2004. V. 173. Nr 3. Str. 1772-1778.

201. Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Amelioration of autoimmune neuroinflammation by recombinant human alfa-fetoprotein. // Eksp. Neurol. 2006. V. 198. Nr 1. Str. 136-144.

202. Czereszniew B.A., Rodionow S.Yu. Czerkasow V.A., Malyutina N.N., Orłow O.A. Alfa-fetoproteiny. Jekaterynburg: Uralski Oddział Rosyjskiej Akademii Nauk; 2004.

203. Dudich E. MM-093, rekombinowana ludzka alfa-fetoproteina do potencjalnego leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów i innych chorób autoimmunologicznych. // Curr Opin Mol Ther. 2007. V. 9. nr 6. s. 603-610.

204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. Hamowanie apoptozy przez alfa-fetoproteinę (AFP) i rola receptorów AFP w starzeniu się komórek. // Przeciwnowotworowy Res. 1994. V. 14. Nr 6B. Str. 2429-2438.

205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. Chemoterapeutyczna skuteczność koniugatów białko-doksorubicyna na linii komórkowej wątrobiaka szczura opornego na wiele leków in vitro. // Br J Rak. 1993. V. 67. nr 2. s. 274-278.

206. Lubgan D., Jóźwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. Koniugat doksorubicyna-transferyna selektywnie pokonuje oporność wielolekową w komórkach białaczkowych. // Komórka Mol Biol Lett. 2009. V. 14. nr 1. Str. 113-127.

207. Sarti D.A., Crandall B.F., Winter J., Robertson R.D., Kaback N.M., Karp L.E. Korelacja średnicy ciała dwuciemieniowego i płodu: 12-26 tydzień ciąży. // A.J.R. Amerykański dziennik rentgenologii. 1981. V. 137. Nr 1. Str. 87-91.

208. Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus PE, Giaccone G. Topoizomeraza Ilalpha i inne markery oporności na leki w zaawansowanym niedrobnokomórkowym raku płuc. // Rak płuc. 2001. V. 32. nr 2. Str. 117-128.

209. Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Wrodzona arachnodaktylia przykurczowa, stożek rogówki i prawdopodobny zespół Marfana w tym samym rodowodzie. // Dziennik pediatrii. 1981. V. 98. nr 4. Str. 591-593.

210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Badania późnej replikacji w ludzkiej translokacji X/13: korelacja z autosomalną ekspresją genów. // Cytogenetyka i genetyka komórki. 1981. V. 29. nr 4. s. 215-220.

211. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Uptake of radiolaled alfa-fetoprotein by mysich mamary carcinomas i jego przydatność w scyntygrafii nowotworów. // Rak Res. 1984. V. 44. Nr 11. Str. 5314-5319.

212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Rola dynaminy w tworzeniu pęcherzyków pokrytych klatryną. // Sympozja w Cold Spring Harbor na temat biologii ilościowej. 1995. V. 60. s. 235-242.

213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Wychwyt alfafoetoproteiny przez klonowane linie komórkowe pochodzące z indukowanego niklem mięsaka prążkowanokomórkowego szczura. // Br J Rak. 1983. V. 48. nr 2. s. 261-269.

214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. The uptake of alfa-fetoproteina przez komórki nerwiaka niedojrzałego myszy C-1300. // Br J Rak. 1985. V. 51. nr 6. Str. 791-797.

215. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Receptory alfa-fetoproteiny w linii komórkowej ludzkiego raka piersi. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. Nr 3. Str. 1322-1327.

216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Receptory specyficzne dla typu komórkowego dla alfa-fetoproteiny w linii komórek chłoniaka T myszy. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. nr 10. Str. 3301-3305.

217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Izolacja i częściowa charakterystyka specyficznego receptora alfa-fetoproteiny na ludzkich monocytach. // J Clin Invest. 1992. V. 90. nr 4. Str. 1530-1536.

218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Aktywacja alfa-fetoproteiny (AFP)/pętla autokrynna receptora w ludzkich komórkach raka okrężnicy HT-29. // Int J Rak. 1991. V. 49. nr 3. Str. 425430.

219. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Expression of alfa-fetoprotein receptors by human T-limfocytes podczas transformacji blastycznej. // Mol Immunol. 1989. V. 26. nr 9. Str. 851-857.

220. Biddle W., Sarcione E.J. Specyficzne cytoplazmatyczne białko wiążące alfa-fetoproteinę w ludzkich komórkach raka piersi MCF-7 i tkance pierwotnego raka piersi. // Leczenie raka piersi. 1987. V. 10. nr 3. s. 279-286.

221. Miżejewski G.J. Białka wiążące alfa-fetoproteinę: implikacje dla przejścia przezbłonowego i lokalizacji subkomórkowej. // Nauka o życiu. 1995. V. 56. nr 1. Str. 1-9.

222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko szeroko rozpowszechnionemu antygenowi onkofetalowemu: receptorowi alfa-fetoproteiny. // Biol guza. 1993. V. 14. nr 2. s. 116-130.

223. Kanevsky V., Pozdnyakova L.P., Aksenova O.A., Severin S.E., Katukov V., Severin E.S. Izolacja i charakterystyka białek wiążących AFP z ludzkich tkanek nowotworowych i płodowych. // Biochem Mol Biol Int. 1997. V. 41. nr 6. Str. 1143-1151.

224. Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Specyficzny wychwyt alfa-fetoproteiny i albuminy przez szczurze komórki wątrobiaka Morrisa 7777. // Biol guza. 1999. V. 20. nr 1. Str. 52-64.

225. Miżejewski G.J., MacColl R. Peptydy hamujące wzrost alfa-fetoproteiny: potencjalne wskazówki dotyczące terapii nowotworów. // Mol Rak Tam. 2003. V. 2. nr 11. Str. 1243-1255.

226. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Alpha-fetoprotein pochodne syntetyczne peptydy: test segmentu regulacyjnego modyfikującego estrogen. // Mol Cell Endokrynol. 1996. V. 118. nr 1-2. Str. 15-23.

227. Butterstein G.M., Miżejewski G.J. Alfa-fetoproteina hamuje metamorfozę żab: implikacje dla zachowania motywu białkowego. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. V. 124. Nr 1. Str. 39-45.

228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Wpływ alfa-fetoproteiny i pochodnych peptydów na fetotoksyczność indukowaną insuliną i estrogenem. // Diagnostyka płodu Tam. 2003. V. 18. nr 5. s. 360-369.

229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Badania nad peptydem hamującym wzrost pochodzącym z alfa-fetoproteiny i niektórych analogów. // J Pept Res. 2001. V. 57. nr 1. Str. 29-38.

230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Badania nad analogami peptydu pochodzącego z alfa-fetoproteiny o właściwościach hamujących wzrost. // J Pept Res. 2001. V. 57. nr 6. s. 539-546.

231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Przegląd aktywności funkcjonalnych peptydów hamujących wzrost pochodzących z alfa-fetoproteiny: przegląd i perspektywy. // Curr Protein Pept Sci. 2006. V. 7. nr 1. s. 73-100.

232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. Przegląd peptydu hamującego wzrost jako środka bioterapeutycznego na wzrost nowotworu, adhezję i przerzuty. // Przerzuty raka Rev. 2005. V. 24. nr 3. Str. 441-467.

233. Vakharia D., Miżejewski G.J. Ludzkie peptydy alfa-fetoproteinowe wiążą receptor estrogenowy i estradiol i hamują raka piersi. // Leczenie raka piersi. 2000. V. 63. nr 1. Str. 41-52.

234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Badania nad znakowaniem 99mTc zmodyfikowanego fragmentu ludzkiej alfa-fetoproteiny (P149-QY). // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2008. V. 275. Nr 1. Str. 101-107.

235. Linton K.J., Higgins C.F. Białka kasety wiążącej ATP (ABC) Escherichia coli. // Mol Mikrobiolu. 1998. V. 28. nr 1. Str. 5-13.

236. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. Nadrodzina ludzkich transporterów kasety wiążącej ATP (ABC). // Genom Res. 2001. V. 11. nr 7. Str. 1156-1166.

237. Dean M., Annilo T. Ewolucja nadrodziny transporterów kasety wiążącej ATP (ABC) u kręgowców. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. V. 6. s. 123-142.

238. Riordan J.R., Ling V. Oczyszczanie glikoproteiny P z pęcherzyków błony komórkowej mutantów komórek jajnika chomika chińskiego o zmniejszonej przepuszczalności kolchicyny. // J Biol Chem. 1979. V. 254. Nr 24. Str. 12701-12705.

239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. Przewoźnicy ABC: siła zmian. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10. nr 3. s. 218-227.

240. Choi C.H. Transportery ABC jako mechanizmy oporności wielolekowej i rozwój chemosuczulaczy w celu ich odwrócenia. //Międzynarodowe Komórki Nowotworowe 2005. V. 5. S. 30.

241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Transport przezbłonowy endo- i ksenobiotyków przez białka oporności wielolekowej kasety wiążącej ATP u ssaków. //Fizjol ks. 2006. V. 86. nr 3. Str. 849-899.

242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, chemioterapia i przebudowa chromatyny. // Rak Biol Ther. 2004. V. 3. nr 9. Str. 819-824.

243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. Regulatory transkrypcji ludzkiego genu oporności wielolekowej 1: najnowsze poglądy. // Biochem Pharmacol. 2002. V. 64. nr 5-6. Str. 943-948.

244. Breier A., ​​​​Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-glikoproteina – implikacje metabolizmu komórek nowotworowych i terapii nowotworów. // Curr Cele leków na raka. 2005. V. 5. Nr 6. Str. 457-468.

245. Doz F., Roosen N., Rosenblum M.L. Metalotioneina i leki przeciwnowotworowe: rola metalotioneiny w chemioterapii nowotworów. // J Neuroonkol. 1993. V. 17. nr 2. Str. 123-129.

246. Lazo J.S, Basu A. Ekspresja metalotioneiny i przejściowa oporność na elektrofilowe leki przeciwnowotworowe. // Rak nasienia Biol. 1991. V. 2. nr 4. s. 267-271.

247. Chen A.Y., Liu L.F. Topoizomerazy DNA: niezbędne enzymy i cele śmiertelne. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. V. 34. S. 191-218.

248. Makin G. Celowanie w apoptozę w chemioterapii nowotworów. // Ekspercka opinia o celach. 2002. V. 6. nr 1. Str. 73-84.

249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2., Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,

250. P "RAPPAG \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct lomlag nolle +A Lionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/YCH/I VI 1U11VUU11 JVllJiU^VJ l/l WUJl W14J.11/ W1.X*A\/1 / WHO IU WlOUlUlill ШШpentoksyfilina. // Cancer Res. 1995. V. 55. nr 8. str. 1649-1654.

251. Sarkar R., Jain R.K., Puri P. Melasma u indyjskich mężczyzn. // Chirurg Dermatol. 2003. V. 29. nr 2. s. 204.

252. Smith D.J., Ng H., Kluck R.M., Nagley P. The mitochondrial gateway to cell death. // Życie IUBMB. 2008. V. 60. nr 6. s. 383-389.

253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Mitochondrialne nośniki i pory: kluczowe regulatory mitochondrialnego programu apoptotycznego? // Apoptoza. 2007. V. 12. nr 5. Str. 869-876.

254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. Przegląd literatury dotyczący markerów molekularnych predykcyjnych odpowiedzi klinicznej na chemioterapię cytotoksyczną u pacjentów z rakiem piersi. // Int J Clin Oncol. 2009. V. 14. Nr 2. s. 112-119.

255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. Rola członków rodziny Bcl-2 w powstawaniu nowotworów. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. nr 2-3. s. 229-249.

256. Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. Badania kliniczne Bcl-2 i korzyści z leczenia u pacjentów z rakiem piersi. // Endocr Relat Cancer. 1999. V. 6. nr 1. s. 61-68.

257. Adams J.M., Cory S. Apoptoza regulowana przez Bcl-2: mechanizm i potencjał terapeutyczny. // Curr Opin Immunol. 2007. V. 19. nr 5. Str. 488-496.

258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Bezpośrednia obserwacja analogu cytozyny, który tworzy pięć wiązań wodorowych z guanozyną: guanidino G-clamp. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. V. 41. Nr 1. Str. 115-117.

259. Cowling V.H., Cole M.D. Mechanizm aktywacji transkrypcji przez onkoproteiny Myc. // Rak nasienia Biol. 2006. V. 16. nr 4. Str. 242-252.

260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Terapia przeciwnowotworowa: celowanie w ciemną stronę Myc. // Eur J Rak. 2005. V. 41. Nr 16. Str. 2485-2501.

261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. Non-transscriptional control of DNA replikation przez c-Myca. //Natura. 2007. V. 448. Nr 7152. Str. 445-451.

262. Spencer C.A., Groudine M. Kontrola regulacji c-myc w komórkach normalnych i nowotworowych. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. s. 1-48.

263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. Onkogeny MYC i ludzka choroba nowotworowa. //Onkogen. 1999. V. 18. Nr 19. Str. 3004-3016.

264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Parakrynna regulacja angiogenezy i różnicowania adipocytów podczas adipogenezy in vivo. // Okr Rez. 2003. V. 93. nr 9. Str. e88-97.

265. Sears R.C. Cykl życiowy C-myc: od syntezy do degradacji. // Cykl komórkowy. 2004. V. 3. nr 9. Str. 1133-1137.

266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., ​​​​Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. Odpowiedzi na leczenie antyangiogenetyczne spontanicznych guzów autochtonicznych i ich izoprzeszczepów. // Rak Res. 2003. V. 63. nr 4. Str. 747-751.

267. Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc Is a Metastasis Gene for Non-Small-cell Lung Cancer. // PLoS Jeden. 2009. V. 4. Nr 6. Str. e6029.

268. Ahmed F.E. Markery molekularne przewidujące odpowiedź na terapię raka okrężnicy. // Ekspert Rev Mol Diagn. 2005. V. 5. nr 3. s. 353-375.

269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. Dalsze cele czynnika wzrostu i sygnalizacji estrogenowej oraz oporności hormonalnej: potencjalna rola c-Myc, cykliny Dl i cykliny E. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12 Suppl 1. P. S47-59.

270. Blackburn E.H. Telomery: budowa i synteza. // J Biol Chem. 1990. V. 265. Nr 11. Str. 5919-5921.

271. Olovnikov A.M. Teoria marginalotomii. Niepełne kopiowanie marginesu matrycy w enzymatycznej syntezie polinukleotydów i biologiczne znaczenie zjawiska. // J Teor Biol. 1973. V. 41. nr 1. Str. 181-190.

272. Wright WE, Shay J.W. Dwustopniowy mechanizm kontrolujący starzenie się i unieśmiertelnienie komórek. // Exp Gerontol. 1992. V. 27. nr 4. s. 383-389.

273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Telomere Architecture. // Przedstawiciel EMBO 2002. V. 3. nr 12. Str. 1139-1145.

274. Liu J.P. Badania mechanizmów molekularnych w regulacji aktywności telomerazy. // FASEB J. 1999. V. 13. nr 15. Str. 2091-2104.

275. Wu K.J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Bezpośrednia aktywacja transkrypcji TERT przez c-MYC. // Nat Genet. 1999. V. 21. nr 2. Str. 220224.

276. Tian X., Chen B., Liu X. Telomery i telomeraza jako cele terapii nowotworów. // Appl Biochem Biotechnologia. W. 160. Nr 5. Str. 1460-1472.

277. Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Skład liposomów jest ważny dla zatrzymywania liposomalnej rodaminy w komórkach nowotworowych z nadekspresją glikoproteiny P. //Dostawa leków. 2009. V. 16. nr 5. s. 261-267.

278. Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Liposome-encapsulated daunorubcin for PGP-based multidrug Resistance. // Br J. Hematol. 1999. V. 106. nr 1. Str. 92-99.

279. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tamaoki T. Podstawowe struktury ludzkiej alfa-fetoproteiny i jej mRNA. // Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. nr 15. Str. 4604-4608.

280. Bogush T., Robert J. Ocena porównawcza wewnątrzkomórkowej akumulacji i wiązania DNA idarubicyny i daunorubicyny we wrażliwych i wielolekoopornych komórkach ludzkiej białaczki K562. // Przeciwnowotworowy Res. 1996. V. 16. nr 1. s. 365-368.

281. Cartier R., Reszka R. Wykorzystanie syntetycznych peptydów zawierających sygnały lokalizacji jądrowej dla niewirusowych systemów transferu genów. // Gene The. 2002. V. 9. nr 3. Str. 157-167.

282. Collas P., Alestrom P. Sygnały lokalizacji jądrowej: siła napędowa transportu jądrowego plazmidowego DNA u danio pręgowanego. // Biochem Komórka Biol. 1997. V. 75. nr 5. s. 633-640.

283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Czytaj M.L. Czynniki wpływające na zdolność peptydów sekwencji lokalizacji jądrowej do wzmacniania dostarczania genów niewirusowych. // Chemia biokoniugatu. 2003. V. 15. nr 1. s. 152-161.

284. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Synthesis of 2"-0-2-[(N,N-dimetyloamino)oksy.etylo] modyfikowane nukleozydy i oligonukleotydy. // J Org Chem. 2002. V. 67. nr 2. s. 357-369.

285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Cytotoksyczne działanie koniugatu doksorubicyny-transferyny w wielolekoopornych komórkach KB. // Biochem Pharmacol. 1996. V. 51. nr 4. Str. 489-493.

286. Lemieux P., strona M. Wrażliwość wielolekoopornych komórek MCF-7 na koniugat transferyny-doksorubicyny. // Przeciwnowotworowy Res. 1994. V. 14. Nr 2A. s. 397-403.

287. Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Komórkowa akumulacja i cytotoksyczność makromolekularnych kompleksów platyny w komórkach nowotworowych opornych na cisplatynę. // J Zwolnienie kontroli. 2008. V. 131. Nr 2. s. 100-106.

288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Czułość wielolekoopornych komórek KB-C1 na koniugat przeciwciało-dekstran-adriamycyna. // Przeciwnowotworowy Res. 1989. V. 9. nr 3. Str. 637-641.

289. Chitambar C.R. Związki galu jako leki przeciwnowotworowe. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. Nr 6. s. 547-552.

290. Ehrlich P. Częściowa funkcja komórek. (Przemówienie Nagrody Nobla wygłoszone 11 grudnia 1908 w Sztokholmie).. // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. V. 5. nr 2. s. 67-86.

291. Butcher E.C., Weissman I.L. Bezpośrednie fluorescencyjne znakowanie komórek fluoresceiną lub izotiocyjanianem rodaminy. I. Aspekty techniczne. // Metody J Immunol. 1980. V. 37. nr 2. Str. 97108.

292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. Kwantyfikacja metodą cytofluorymetrii przepływowej cząsteczek HLA klasy I na powierzchni mysich komórek transformowanych sklonowanymi genami HLA. // Metody J Immunol. 1983. V. 61. nr 3. s. 301-315.

293. Fenton C., Perry C.M. W centrum uwagi gemtuzumab ozogamycyny w ostrej białaczce szpikowej. // BioDrugs: immunoterapeutyka kliniczna, biofarmaceutyka i terapia genowa. 2006. V. 20. nr 2. s. 137-139.

294. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Endocytoza za pośrednictwem receptora i recykling alfa-fetoproteiny w ludzkich komórkach chłoniaka B i białaczki T. // Int J Rak. 1991. V. 47. nr 1. Str. 110-117.

295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Aktywacja ścieżki alfa-fetoproteiny/receptora w ludzkich normalnych i złośliwych jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. // Białaczka. 1993. V. 7. nr 11. Str. 1807-1816.

296. Biaglow J.E., Miller R.A. Układ reduktaza tioredoksyny / tioredoksyna: nowe cele redoks w terapii raka. // Rak Biol Ther. 2005. V. 4. nr 1. Str. 6-13.

297. Arunachalam V., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Enzymatyczna redukcja wiązań dwusiarczkowych w lizosomach: charakterystyka lizosomalnej reduktazy tiolowej indukowanej gamma-interferonem (GILT). // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. nr 2. Str. 745-750.

298. Kooistra T., Millard P.C., Lloyd J.B. Rola tioli w degradacji białek przez katepsyny. // Biochem J. 1982. V. 204. nr 2. Str. 471-477.

299. Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Rozszczepianie wiązań dwusiarczkowych w makrocząsteczkach endocytozowanych. Przetwarzanie niezwiązane z lizosomami ani endosomami. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx y y V/ . t^„w<-л. л. » x w I vy v x v f w

300. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Podobieństwo między naturalną i rekombinowaną ludzką alfa-fetoproteiną jako inhibitorami estrogenozależnego wzrostu raka piersi. // Leczenie raka piersi. 1997. V. 45. nr 2. s. 169-179.

301. DiMarco A. Adriamycyna (NSC-123127): tryb i mechanizm działania. // Chemika raka. Reprezentant. 1975. V. 6. s. 91-106.

302. Hamza A., Sarma M.H., Sarma R.H. Prawdopodobna interakcja cyklopeptydu alfa-fetoproteiny z modelem receptora sprzężonego z białkiem G GPR30: badanie dokowania metodą symulowanego wyżarzania dynamiki molekularnej. // J Biomol Struct Dyn. 2003. V. 20. nr 6. Str. 751-758.

303. Tan W., Loke Y.H., Stein C.A., Miller P., Colombini M. Oligonukleotydy fosforotionianowe blokują kanał VDAC. // Biophys J. 2007. V. 93. nr 4. Str. 1184-1191.

304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. Celem farmakologicznym G3139 w komórkach czerniaka może być mitochondrialny VDAC. // Proc Natl Acad Sci USA A. 2006. V. 103. Nr 19. Str. 7494-7499.

305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein C.A., Colombini M. Oligonukleotydy fosforotionianowe zmniejszają przepuszczalność błony zewnętrznej mitochondriów dla ADP. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. V. 292. nr 4. Str. C1388-1397.

306. Carpenter G., Cohen S. Naskórkowy czynnik wzrostu. // Annu Rev Biochem. 1979. V. 48. S. 193-216.

307. Saeki T., Takashima S., Tachibana M., Koga M., Hiyama E., Salomon D.S., Holland J.F., Ohnuma T. Inhibitory Effect of telomer-mimic fosforotionian oligodeoksynukleotydów (S-ODNS) na ludzkie linie komórkowe nowotworu . // Onkologia. 1999. V. 57 Dodatek 2. s. 27-36.

308. Strona T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. Cytotoksyczne działanie jednoniciowych naśladowców telomerów na komórki OMA-BL1. // Rozdzielczość komórki Exp. 1999. V. 252. Nr 1. Str. 41-49.

309. Berkers J.A., van Bergen en Henegouwen P.M., Boonstra J. Trzy klasy receptorów naskórkowego czynnika wzrostu na komórkach HeLa. // J Biol Chem. 1991. V. 266. Nr 2. Str. 922-927.

310. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Zwiększanie wrażliwości na leki ludzkich nowotworów złośliwych przez naskórkowy czynnik wzrostu. // Br J Rak. 1995. V. 72. nr 3. s. 615-619.

311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molecular manifestations and molekularne determinanty czapeczki telomerów. // Zimna wiosna Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. S. 253-263.

312. Collas P., Alestrom P. Sygnały lokalizacji jądrowej zwiększają transmisję transgenu w linii zarodkowej u danio pręgowanego. // Transgeniczna res. 1998. V. 7. nr 4. s. 303-309.

313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Nowy wektor peptydowy do wydajnego dostarczania oligonukleotydów do komórek ssaków. // Kwasy nukleinowe Res. 1997. V. 25. nr 14. Str. 2730-2736.

314. Sinha B.K., Politi P.M. Antracykliny. // Rak Chemother Biol Modyfikacja odpowiedzi. 1990. V. 11. s. 45-57.

315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial ST., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamycyny, klasa silnych antybiotyków przeciwnowotworowych: mechanizm działania. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. nr 1. Str. 2-6.

316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Selective cytotoksyczność immunokoniugatu adriamycyny przeciwciała monoklonalnego MSN-1 do gruczolakoraka endometrium in vitro i in vivo. // Przedstawiciel Oncol. 2000. V. 7. nr 5. Str. 1099-1106.

317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. Skuteczność immunokoniugatu adriamycyny rozpoznającego produkt C-erbB-2 na liniach komórkowych raka piersi. // Chirurg dzisiaj. 1996. V. 26. nr 7. Str. 501-507.

318. Yamamoto K., Acton E.M., Henry D.W. Aktywność przeciwnowotworowa niektórych pochodnych daunorubicyny przy funkcjach aminowych i ketonowych. // Dziennik Chemii Lekarskiej. 2002. V. 15. nr 8. Str. 872-875.

319. Arnon R., Sela M. Skuteczność in vitro i in vivo koniugatów daunomycyny z przeciwciałami przeciwnowotworowymi. // Immunol Rev. 1982. V. 62. S. 5-27.

320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. The kowalencyjne wiązanie daunomycyny i adriamycyny z przeciwciałami, z zachowaniem zarówno leków, jak i aktywności przeciwciał. // Rak Res. 1975. V. 35. nr 5. Str. 1175-1181.

321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. Przyszłość terapii antysensownej: połączenie z terapiami przeciwnowotworowymi. //Onkogen. 2003. V. 22. Nr 42. Str. 6579-6588.

Należy pamiętać, że teksty naukowe przedstawione powyżej zostały zamieszczone wyłącznie w celach informacyjnych i zostały uzyskane poprzez rozpoznawanie oryginalnego tekstu rozprawy doktorskiej (OCR). Dlatego mogą zawierać błędy związane z niedoskonałymi algorytmami rozpoznawania. W dostarczanych przez nas plikach PDF prac dyplomowych i abstraktów nie ma tego typu błędów.