Test fiksacije komplementa je jedan od tradicionalnih seroloških testova koji se koriste za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, a čini i osnovu nekih drugih metoda za otkrivanje antivirusnih antitijela. Iako su reakcija neutralizacije, inhibicija hemaglutinacije, indirektna hemaglutinacija i enzimski imunotest superiorniji od reakcije fiksacije komplementa po osjetljivosti, jednostavnost tehnike, rano otkrivanje antitijela, kao i identifikacija virusnih antigena koji nemaju hemaglutinirajuća svojstva objašnjavaju njegova široka upotreba u virološkim studijama.

Za njegovu proizvodnju nije potreban tako visok stupanj koncentracije i čistoće antigenskih lijekova koji su neophodni za niz drugih imunoloških reakcija. Osim toga, grupna specifičnost antigena za fiksiranje komplementa mnogih virusa omogućuje korištenje reakcije fiksacije komplementa u masovnoj dijagnostici: ova reakcija ne otkriva razlike sojeva i od posebne je vrijednosti kada se proučavaju antigenski odnosi između virusa.

Sam naziv u velikoj mjeri odražava suštinu metode, koja se sastoji od dvije odvojene reakcije. U prvoj fazi reakcija uključuje antigene i antitijela (jedna od ovih komponenti je unaprijed poznata), kao i komplement u titriranoj količini. Ako se antigen i antitijela poklapaju, njihov kompleks veže komplement, što se u drugoj fazi otkriva pomoću indikatorskog sistema (mješavina crvenih krvnih zrnaca ovaca i antiseruma za njih). Ako je komplement vezan interakcijom antigena i antitijela, tada ne dolazi do lize crvenih krvnih zrnaca ovaca (pozitivna reakcija fiksacije komplementa). U slučaju negativne reakcije fiksacije komplementa, nefiksni komplement potiče hemolizu, koja se koristi za procjenu rezultata reakcije.

Glavne komponente reakcije fiksacije komplementa su antigeni (poznati ili detektabilni), antitela (poznati antiserumi ili test serumi), komplement, hemolitički serum i crvena krvna zrnca ovaca; Kao razblaživač koriste se izotonični rastvor natrijum hlorida (pH 7,2-7,4) ili različiti puferski rastvori. Antigeni i serumi mogu biti antikomplementarni, tj. sposobnost adsorpcije komplementa, što odlaže hemolizu i iskrivljuje rezultat reakcije.

Antigeni za CSC se pripremaju iz organa zaraženih životinja, alantoične ili amnionske tečnosti inficiranih pilećih embriona, kao i tečnosti kulture nakon kultivacije virusa u kulturama ćelija tkiva. Antigeni preparati uvijek sadrže mnogo balastnih tvari iz životinjskih stanica ili kultura tkiva, što također može iskriviti rezultate reakcije.

Nastali virusni antigeni se inaktiviraju, utvrđuje se radna doza, kao i antikomplementarna i hemolitička svojstva. Antigen se zatim titrira u prisustvu komplementa.

Druga glavna komponenta u insceniranju reakcije je komplement. Ovaj termin se odnosi na složen sistem proteina i faktora prisutnih u krvi životinja i ljudi. Obično se krvni serum zamorca koristi u reakciji fiksacije komplementa. Aktivnost (titar) komplementa je njegova najmanja količina, u čijoj prisutnosti hemolizin izaziva potpunu hemolizu korišćenog hemolitičkog sistema.

Da bi se identificirala antitijela na viruse koja fiksiraju komplement, serum je potrebno inaktivirati da bi se eliminirao komplement na 560C u trajanju od 30 minuta. Serumi imuniziranih životinja obično se koriste kao referentni serumi. Štoviše, za imunizaciju se koriste virusni antigeni koji su temeljito pročišćeni od nečistoća tkiva, jer u suprotnom dolazi do izražene nespecifične reakcije.

Obavezna komponenta reakcije fiksacije komplementa je hemolitički sistem koji uključuje ovčje eritrocite i hemolitički serum dobijen hiperimunizacijom zečeva eritrocitima ovaca.

Za izvođenje reakcije fiksacije komplementa koriste se sljedeće modifikacije: mikrometoda reakcije fiksacije komplementa u mikrotitratoru sistema Takachi, reakcija dugotrajne fiksacije komplementa, reakcija indirektne fiksacije komplementa, reakcija fiksacije komplementa u gelu, mikrokapljica reakcija fiksacije komplementa, reakcija fiksacije komplementa na čvrstoj bazi.

Iako je osjetljivost reakcije fiksacije komplementa niska, ona ima visoku specifičnost. S tim u vezi, široko se koristi za dijagnostiku virusnog pneumoenteritisa kod mladih goveda.

Posebna prednost RSC-a je u tome što priroda antigena uključenog u njega (korpuskularnog ili rastvorljivog) nije bitna, budući da se komplement vezuje za Fc fragment bilo kog antitela povezanog sa IgG i IgM, bez obzira na njegovu specifičnost antitela. Osim toga, RSA je vrlo osjetljiv: omogućava vam da otkrijete količinu antitijela 10 puta manju nego, na primjer, u reakciji precipitacije. RSC su 1901. predložili J. Bordet i O. Zhang. Zasniva se na dva svojstva komplementa:

1) sposobnost vezivanja za kompleks "antigen + antitelo";

2) liza crvenih krvnih zrnaca koja se koriste za dobijanje hemolitičkog seruma.

RSK se izvodi u dvije faze, a u njega su uključena dva sistema – eksperimentalni, odnosno dijagnostički i indikatorski. Dijagnostički sistem se sastoji od testnog (ili dijagnostičkog) seruma, koji se zagrijava na 56 °C 30 minuta prije nego što se izvrši reakcija za inaktivaciju komplementa i antigena koji su prisutni u njemu.

Ovom sistemu se dodaje standardni dodatak. Njegov izvor je svježa ili sušena surutka zamorca. Smjesa je inkubirana na 37 °C jedan sat. Ako test serum sadrži antitijela, ona će stupiti u interakciju s dodanim antigenom, a rezultirajući kompleksi “antigen + antitijelo” će vezati dodani komplement. Ako u serumu nema antitijela, neće doći do stvaranja kompleksa antigen + antitijelo, a komplement će ostati slobodan.

Obično nema vidljivih manifestacija fiksacije komplementa u ovoj fazi reakcije. Stoga, da bi se razjasnilo pitanje da li je došlo do fiksacije komplementa ili ne, dodaje se drugi indikatorski sistem (inaktivirani hemolitički serum + ovčja crvena krvna zrnca) i mješavina svih RSC komponenti se ponovo inkubira na 37 °C 30-60 minuta. , nakon čega se procjenjuju rezultati reakcije. Pomoću pametnog telefona (kao što je ovaj) možete izračunati tačno vrijeme reakcije. Ako je komplement vezan u prvoj fazi, u dijagnostičkom sistemu, tj. postoje antitela u serumu pacijenta, a komplement je vezan kompleksom „antitelo + antigen“, neće doći do lize crvenih krvnih zrnaca – eritrociti su pozitivni: tečnost je bezbojna, na dnu epruvete se nalazi sediment crvenih krvnih zrnaca

Ako u serumu nema specifičnih antitijela i ne dođe do vezivanja komplementa u dijagnostičkom sistemu, tj. RSC je negativan, tada se komplement nepotrošen u dijagnostičkom sistemu vezuje za kompleks “crvena krvna zrnca + antitijela” indikatorskog sistema i dolazi do hemolize: u epruveti „lakirana krv“ nema sedimenta crvenih krvnih zrnaca. Intenzitet RSC se procjenjuje korištenjem četiri križnog sistema u zavisnosti od stepena kašnjenja hemolize i prisustva sedimenta crvenih krvnih zrnaca. Reakcija je praćena odgovarajućim kontrolama: kontrola seruma (bez antigena) i kontrola antigena (bez seruma), jer neki serumi i neki antigeni imaju antikomplementarno djelovanje. Prije izvođenja RSC, sve komponente uključene u njega, osim test seruma ili antigena, podliježu pažljivoj titraciji.

Posebno je važno u reakciju uvesti tačnu dozu komplementa, jer njegov nedostatak ili višak može dovesti do lažnih rezultata. Titar komplementa je minimalna količina koja, u prisustvu radne doze hemolitičkog seruma, osigurava potpuno otapanje crvenih krvnih zrnaca. Za izvođenje glavnog eksperimenta uzmite dozu komplementa povećanu za 20-25% u odnosu na utvrđeni titar. Titar hemolitičkog seruma je njegovo maksimalno razrjeđenje, koje, kada se pomiješa sa jednakom zapreminom 10% otopine komplementa, potpuno hemolizira odgovarajuću dozu crvenih krvnih stanica u roku od 1 sata na temperaturi od 37 °C.

Reakcija indirektne hemolize koristi se kao ubrzana metoda za otkrivanje specifičnih antitijela. Crvena krvna zrnca se koriste kao nosioci antigena. Ako u pacijentovom serumu postoje specifična antitijela, senzibilizirana crvena krvna zrnca se liziraju u prisustvu komplementa.

Niste pronašli relevantne informacije? Nema problema! Koristite pretragu na sajtu u gornjem desnom uglu.

61. Reakcije koje uključuju komplement. Reakcija fiksacije komplementa. Mehanizam, komponente, metode ugradnje, primjena. Reakcija radijalne hemolize

Reakcije koje uključuju komplement

Reakcije koje uključuju komplementzasnivaju se na aktivaciji komplementa kompleksom antigen-antitijelo (reakcija fiksacije komplementa, radijalna hemoliza, itd.).

Reakcija fiksacije komplementa (RSK) je da kada antigeni i antitela odgovaraju jedni drugima, oni formiraju imuni kompleks, na koji preko Fc -fragment antitijela je vezan za komplement (C), tj. komplement je vezan kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitelo ne formira, komplement ostaje slobodan (slika 13.8). RSK se izvodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - otkrivanje slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sistema koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži antitijela na njih. U 1. fazi reakcije, kada se formira kompleks antigen-antitijelo, komplement se vezuje, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih antitijelima; reakcija je pozitivna. Ako se antigen i antitijelo međusobno ne poklapaju (nema antigena ili antitijela u uzorku za testiranje), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit - anti-eritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; reakcija je negativna.

RSC se koristi za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti, posebno sifilisa (Wassermannova reakcija).

Ova reakcija se koristi za otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata s bakterijskim, virusnim, protozoalnim infekcijama, kao i za identifikaciju i tipizaciju virusa izoliranih od pacijenata. RSC se odnosi na složene serološke reakcije u kojima pored antigena, antitela i komplementa učestvuje i hemolitički sistem koji otkriva rezultate reakcije. RSC se odvija u dve faze: prva je interakcija antigena sa antitelom uz učešće komplementa i druga je identifikacija stepena vezivanja komplementa pomoću hemolitičkog sistema. Ovaj sistem se sastoji od crvenih krvnih zrnaca ovaca i hemolitičkog seruma dobijenog imunizacijom laboratorijskih životinja crvenim krvnim zrncima. Eritrociti se obrađuju - senzibiliziraju dodavanjem seruma na temperaturu od 37°C u trajanju od 30 minuta. Do lize senzibiliziranih eritrocita ovaca dolazi samo ako se pridruže hemolitičkom sistemu komplementa. U njegovom nedostatku, crvena krvna zrnca se ne mijenjaju. Rezultati RSC zavise od prisustva antitela u test serumu. Ako serum sadrži antitijela homologna antigenu korištenom u reakciji, tada se nastali kompleks antigen-antitijelo vezuje i vezuje komplement. Prilikom dodavanja hemolitičkog sistema, u ovom slučaju neće doći do hemolize, jer se sav komplement troši na specifičnu vezu kompleksa antigen-antitijelo. Crvena krvna zrnca ostaju nepromijenjena, pa se izostanak hemolize u epruveti bilježi kao pozitivan RBC. U nedostatku antitijela koja odgovaraju antigenu u serumu, specifični kompleks antigen-antitijelo se ne formira i komplement ostaje slobodan. Kada se doda hemolitički sistem, komplement se veže za njega i izaziva hemolizu crvenih krvnih zrnaca. Uništavanje crvenih krvnih stanica i njihova hemoliza karakterizira negativnu reakciju.

Za stadijum RSC potrebno je: pacijentov serum, komplement, hemolitički sistem koji se sastoji od ovčijih eritrocita i hemolitičkog seruma, kao i izotonični rastvor natrijum hlorida. Reakcija se provodi u serološkim epruvetama. Ovčja crvena krvna zrnca se dobijaju iz defibrinirane ovčje krvi ispiranjem tri puta izotoničnom otopinom natrijevog klorida. Hemolitički serum proizvodi se gotov u ampulama, čija oznaka označava njegov titar, odnosno maksimalno razrjeđenje seruma, koji i dalje uzrokuje hemolizu kada se doda crvenim krvnim zrncima u prisustvu komplementa. Hemolitički serum se dobija imunizacijom životinja, kao što su zečevi, crvenim krvnim zrncima ovaca. Prilikom postavljanja reakcije serum se koristi u trostrukom titru. Na primjer, titar hemolitičkog seruma je 1:1200, a radno razrjeđenje je 1:400. Kao komplement se koristi svježi krvni serum zamorca (unutar 24-48 sati) ili suvi komplement u ampulama. Prije izvođenja RSC, komplement se razblaži 1:10 i titrira da bi se ustanovio titar – najmanja količina komplementa koja nastaje hemolizom crvenih krvnih zrnaca kada se kombinuje sa hemolitičkim sistemom koji se koristi u ovoj reakciji. Uzimajući u obzir moguća antikomplementarna svojstva antigena, prilikom stadijuma reakcije dolazi do povećanja od 20-30% do utvrđenog radnog titra komplementa.
Antigen za RSC su suspenzije ubijenih bakterija, ekstrakti pripremljeni iz ovih suspenzija i pojedinačne hemijske frakcije mikroba. Glavni zahtjev za antigen je odsustvo inhibicije aktivnosti komplementa. Ne bi trebalo da ima antikomplementarna svojstva. Da bi se identifikovala ova svojstva antigena, komplement se dodatno titrira u prisustvu antigena koji se koristi u reakciji. Postoje određene šeme za postavljanje RSC-a. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir prisustvom ili odsustvom hemolize crvenih krvnih zrnaca u hemolitičkom sistemu. RSC se koristi u dijagnostici sifilisa (Wassermannova reakcija), gonoreje (Bordet-Gengou reakcija), toksoplazmoze, rikecija i virusnih bolesti.

Reakcija radijalne hemolize (RRH) ) stavljen u jažice agar gela koji sadrži ovčije crvena krvna zrnca i komplement. Nakon unošenja hemolitičkog seruma (antitijela protiv crvenih krvnih zrnaca ovaca) u jažice gela, oko njih se formira zona hemolize (kao rezultat radijalne difuzije antitijela). Na ovaj način je moguće utvrditi aktivnost komplementa i hemolitičkog seruma, kao i antitijela u krvnom serumu pacijenata oboljelih od gripe, rubeole i krpeljnog encefalitisa. Da bi se to postiglo, odgovarajući antigeni virusa se adsorbiraju na eritrocite, a pacijentov krvni serum se dodaje u jažice gela koji sadrže ove eritrocite. Antivirusna antitijela stupaju u interakciju s virusnim antigenima adsorbiranim na eritrocitima, nakon čega se komponente komplementa pridružuju ovom kompleksu, uzrokujući hemolizu.

Reakciju su razvili J. Bordet i O. Zhangou 1901. Oni su ustanovili da kada se formira kompleks antigen-antitelo, on vezuje komplement.

Dobijeni spoj je fino raspršen i ne može se vizualno otkriti. Za detekciju adsorpcije (vezivanja) komplementa, autori su koristili hemolitički indikatorski sistem: ovčije eritrocite i hemolitički serum. Ako u test sistemu antigen ne odgovara antitelu, imunološki kompleks se ne formira i komplement ostaje slobodan. Komplement se adsorbuje samo na kompleks antigen-antitelo; ne adsorbuje se zasebno na antigen ili antitelo. Stoga, kada se testnom sistemu doda hemolitički sistem koji se sastoji od gotovog kompleksa antigen-antitijelo (crvena krvna zrnca ovaca i antitijela na njih), komplement se veže za ovaj kompleks, uzrokujući hemolizu crvenih krvnih zrnaca ovaca - vidljiv rezultat .

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) je vrlo osjetljiva i specifična. RSC se koristi u serodijagnostici gonoreje, sifilisa, velikog kašlja, svih rikecioza i mnogih virusnih bolesti. Kao i druge serološke reakcije, RSC se također može koristiti za serotipizaciju.

RSC je složena serološka reakcija. Uključuje dva antigenska sistema - antitelo i komplement.

Za postavljanje RSC-a potrebno vam je:

Složenost reakcije određena je brojem uključenih sastojaka i, uglavnom, potrebom da se odredi njihov tačan kvantitativni omjer. Stoga glavnom eksperimentu prethodi titracija njegovih sastojaka.

Hemolitički serum se priprema u proizvodnim uslovima 3-4 puta intravenskom imunizacijom zeca sa 50% suspenzijom eritrocita ovaca i inaktivira na 56 °C 30 minuta. Da bi se titrirao, uzimaju se sukcesivno opadajuće doze (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% suspenzija crvenih krvnih zrnaca, komplement 1:10 u jednakim količinama (ali 0,5 ml ). Oznaka ampula sa hemolitičkim serumom označava njegov titar - maksimalno razrjeđenje koje osigurava potpunu lizu 3% suspenzije ovčijih eritrocita u prisustvu komplementa sat vremena na 37°C. Za RSC se koristi razrjeđenje seruma povećano za 3 puta u odnosu na titar.

3% suspenzija ovčijih eritrocita dobija se iz defibrinirane ovčje krvi ispiranjem izotoničnom otopinom NaCl.

Komplement - svježi ili osušeni krvni serum zamorca - titrira se prije eksperimenta: sukcesivno opadajuće doze (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + hemolitički sistema (ovčiji eritrociti i hemolitički serum). Nakon inkubacije u termostatu na 37°C, određuje se titar komplementa - najveće razrjeđenje koje uzrokuje potpunu lizu crvenih krvnih stanica u prisustvu hemolitičkog seruma. Radna doza komplementa treba da bude 25% veća od titra, jer aktivnost komplementa u eksperimentu može biti donekle potisnuta drugim reakcionim komplementima (antigen, serum).

Antigen - suspenzija ubijenih mikroorganizama, njihovih lizata, kompletnih antigena, haptena, ekstrakta tkivnih lipida - ponekad se veže za komplement čak i u nedostatku imunološkog seruma, pa ga je potrebno i titrirati. Uzimaju se konstantno opadajuće doze antigena + radna doza komplementa + hemolitički sistem. Titar antigena je njegova najmanja doza pri kojoj dolazi do jasne hemolize. Za RSC se uzima doza antigena koja se prepolovi u odnosu na titar kako bi se izbjegla fiksacija komplementa.

Prije eksperimenta, test serum se inaktivira na 56°C 30 minuta. Da inaktivira svoj vlastiti komplement.

Sve komponente reakcije fiksacije komplementa uzimaju se u jednakim količinama.

Postavljanje glavnog eksperimenta.

Nakon utvrđivanja titra i radnih doza svih sastojaka, izvodi se glavni eksperiment RSC-a. U reakciji učestvuju i titrirani serumi: oni za koje se zna da su zdravi i oni za koje se zna da su bolesni (negativni i pozitivni serumi). Kao i testni serum, kontrolni serum se također inaktivira na 56°C na 30 minuta.

RSC se izvodi u dvije faze:

Faza I – specifična – inkubacija mješavine antigena, antitijela i komplementa u termostatu na 37°C u trajanju od 30 minuta.

Faza II – indikator – određivanje prisustva slobodnog komplementa u smeši dodavanjem hemolitičkog sistema (prethodno postavljenog u termostat na 30 minuta) i inkubacijom u termostatu na 37°C 20-30 minuta.

Rezultati eksperimenta se procjenjuju primjenom prisustva ili odsustva hemolize u svim epruvetama (vidi tabelu). Reakcija se smatra pozitivnom kada je hemoliza potpuno odgođena, kada je tekućina u epruveti bezbojna i crvena krvna zrnca se talože na dno, negativnom kada je tekućina intenzivno obojena („lakirana krv“). Stepen intenziteta hemolize se procjenjuje ovisno o intenzitetu boje tekućine i veličini sedimenta crvenih krvnih zrnaca na dnu (+ + + +, + + +, + +, +).

Računovodstvo rezultata RSK.

Rezultati eksperimenta (test serum) mogu se uzeti u obzir samo ako su sve kontrole pravilno izvedene.

U epruveti broj 2 sa pozitivnim serumom (koji sadrži antitela na ovaj antigen) ne bi trebalo biti hemolize, jer komplement se vezuje u prvom specifičnom sistemu, a hemolitički sistem ostaje bez komplementa - crvena krvna zrnca se talože na dno, supernatantna tečnost je providna.

U epruveti br.3 sa negativnim serumom, serumom zdrave osobe koja ne sadrži antitela na dati antigen, trebalo bi da dođe do hemolize, jer u prvoj fazi reakcije nije došlo do formiranja kompleksa antigen-antitelo. (zbog odsustva antitijela na ovaj antigen) i komplement su ostali slobodni. Kada je hemosistem dodat u fazi II reakcije, komplement je adsorbovan na gotov imuni kompleks crvenih krvnih zrnaca ovaca plus antitela na njih; došlo je do lize crvenih krvnih zrnaca ovaca (hemoliza).

Prisustvo hemolize u serumu i kontrolama antigena (epruvete br. 4 i 5) ukazuje da su njihove doze pravilno odabrane i da ni serum ni antigen sami po sebi ne vezuju komplement. Komplement koji ostane slobodan u specifičnom sistemu adsorbuje se imunim kompleksom hemolitičkog sistema i dolazi do hemolize.

Hemoliza u kontroli komplementa (epruveta br. 6) ukazuje na aktivnost komplementa i pravilan izbor njegove radne doze.

U kontroli hemolitičkog sistema (epruveta br. 7), ako ovaj sistem ispravno funkcioniše, ne bi trebalo da bude ni tragova hemolize, jer nedostaje mu dopuna.

Ako su rezultati kontrole savršeni, iskustvo se može uzeti u obzir (epruveta br. 1). Odsustvo hemolize smatra se pozitivnim rezultatom. Ukazuje na to da su u test serumu otkrivena antitijela na dati antigen (osoba je bolesna). Kada se antigen poklopi sa antitijelom, formira se kompleks antigen-antitijelo, koji vezuje komplement (faza I). Prilikom dodavanja hemolitičkog sistema neće doći do hemolize crvenih krvnih zrnaca u fazi II. Prisustvo hemolize je negativan rezultat, što ukazuje na odsustvo antitijela na ovaj antigen (osoba je zdrava). Komplement ostaje slobodan i, kada se doda hemolitički sistem, pridružuje se kompleksu eritrocit-hemolizin, izazivajući hemolizu.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) i reakcija dugotrajne fiksacije komplementa (LCR)

Reakcija fiksacije komplementa (reakcija fiksacije komplementa)

REAKCIJA FIKSIRANJA KOMPLEMENTA, RSK, Bordet-Zhangu reakcija [nazvana po bakteriolozima J. Bordetu i O. Gengou, 1901], visoko specifična i vrlo osjetljiva serološka. reakcija zasnovana na svojstvu kompleksa antigen-antitijelo da fiksira slobodni komplement.

Komplement (sistem komplementa) (od latinskog compplementum - dodatak), grupa globularnih proteina u krvnom serumu životinja i ljudi, koji su dio imunološkog sistema organizma. Prilikom zaraze bakterijama ili virusima, pojedinim toksinima ili pojavom vlastitih transformiranih stanica u tijelo dolazi do aktivacije komplementa, uslijed čega se ciljne stanice liziraju (uništavaju), a toksini i virusi neutraliziraju. Stoga se sistem komplementa, zajedno sa makrofagima, smatra prednjom linijom imunološke odbrane organizma.

Ova reakcija se široko koristi u identifikaciji antigena i u serodijagnostici infekcija, posebno bolesti uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.

RSC je složena serološka reakcija. Uključuje komplement i dva sistema antigen-antitijelo. U suštini, to su dvije serološke reakcije.

Prvi sistem - glavni se sastoji od antigena i antitela (jedan je poznat, drugi nije). Dodata mu je određena količina komplementa. Ako se antigen i antitijelo ovog sistema poklapaju, oni će se povezati i vezati komplement. Dobijeni kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.

reakcija fiksacije komplementa serodijagnostika

Formiranje ovog kompleksa se otkriva pomoću drugog hemolitičkog ili indikatorskog sistema. Uključuje ovčije crvena krvna zrnca (antigen) i odgovarajući hemolitički serum (antitijela), tj. gotov imuni kompleks. U ovom sistemu do lize crvenih krvnih zrnaca može doći samo u prisustvu komplementa. Ako je komplement vezan prvim sistemom (ako u njemu odgovaraju antigen i antitelo), onda u drugom sistemu neće doći do hemolize - pošto nema slobodnog komplementa. Odsustvo hemolize (sadržaj epruvete je zamućen ili se na dnu nalazi sediment eritrocita) evidentira se kao pozitivan rezultat RSC.

Ako u prvom sistemu antigen ne odgovara antitelu, tada se imunološki kompleks neće formirati i komplement će ostati slobodan. Ostajući slobodan, komplement učestvuje u drugom sistemu, izazivajući hemolizu - RSC rezultat je negativan (sadržaj epruveta je providan - „lakirana krv“).

Komponente reakcije fiksacije komplementa:

1. Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten; rjeđe suspenzija mikroorganizama

2. Antitijelo - serum pacijenta

3. Komplement - serum zamorca

4. Antigen – crvena krvna zrnca ovaca Hemolitički sistem

5. Antitijelo - hemolizin na crvena krvna zrnca ovaca

6. Izotonični rastvor

Priprema sastojaka

1. Serum je razrijeđen 3 puta manje od njegovog titra. Pripremite opće razrjeđenje seruma za cijeli eksperiment, čija se zapremina određuje množenjem volumena seruma u jednoj epruveti (na primjer, 0,5 ml) s brojem epruveta, neznatno većim od broja u eksperimentu. Višak tečnosti je neophodan za pripremu svih komponenti reakcije: deo ostaje na zidovima epruveta, tikvica i pipeta. Zapremine razrijeđenog hemolizina i suspenzije eritrocita, uz dodavanje seruma eritrocitima, temeljito se pomiješaju i inkubiraju 30 minuta na 37°C (senzibilizirano).

2. Crvena krvna zrnca ovaca. Za cijeli broj epruveta u eksperimentu pripremiti 3% suspenziju opranih ovčijih eritrocita. Za pripremu hemolitičkog sistema, 30 minuta pre uvođenja u eksperiment, jednake količine ovčijih eritrocita se pomešaju sa antitelom na njih.

3. Komplement se obično razblaži 1:10. Mora se titrirati prije svakog eksperimenta. Titar komplementa je njegova najmanja količina, kada se doda u hemolitički sistem, potpuna hemoliza se javlja u roku od 1 sata na 37°C.

4. Antigen se obično dobija gotov sa naznačenim titrom, tj. količina koju nakon razblaživanja antigena treba da sadrži 1 ml. Na primjer, s titrom od 0,4, razrijeđen je u 0,96 ml izotonične otopine. U eksperiment se uzima količina antigena jednaka polovini titra (0,5 ml). Ovo je njegova radna doza. Pripremite opšte razblaživanje antigena za ceo eksperiment, množeći 0,5 ml sa brojem epruveta u eksperimentu.

5. Antitijelo - serum pacijenta. Svježi serum se inaktivira prije eksperimenta kako bi se uništio komplement prisutan u njemu. Da biste to učinili, zagrijava se 30 minuta na 56°C u vodenoj kupelji ili u inaktivatoru s termostatom. Potonji način je poželjniji: eliminira mogućnost pregrijavanja

Postavljanje reakcije fiksacije komplementa (CFR).

Reakcija se izvodi u zapremini od 1 kubnog metra. cm (0,2 cc svake komponente).

Test serumi se ispituju u razblaženju 1:5 i 1:10 (doza seruma od 0,04 cc i 0,02 cc sa specifičnim antigenom, u razblaženju 1:5 sa kontrolnim antigenom (za specifičnost) i bez antigena (za antikomplementarnost) .

Test i kontrolni serumi se inaktiviraju na dan reakcije u razblaženom obliku na 56-65°C (u zavisnosti od vrste životinje) u trajanju od 30 minuta. (takođe u RDSC).

Oba stupnja reakcije se izvode u vodenom kupatilu na 37-38°C, bakteriolitički sistem se drži 60 minuta, druga faza reakcije (sa hemolitičkim sistemom) se drži 20 minuta.

Kontrole glavnog iskustva RSK:

pozitivan serum razrijeđen 1:5 bez antigena i sa kontrolnim antigenom; u razrjeđenjima od 1:5 do njegovog titra sa specifičnim antigenom;

negativan serum u razrjeđenjima 1:5 i 1:10 sa specifičnim antigenom, u razrjeđenju 1:5 sa kontrolnim antigenom i bez antigena - specifični i kontrolni antigeni u dvostrukoj dozi - za antikomplementarnost (komplement +) i za hemotoksičnost (komplement);

hemolitički sistem za hemotoksičnost (komplement).

Obračun rezultata. U kontrolama ne bi smjelo biti ni tragova hemolize, jer jedna ne sadrži komplement, a druga - hemolizin. Kontrole pokazuju da komponente reakcije nemaju hemotoksičnost (sposobnost spontane lize crvenih krvnih zrnaca).

U eksperimentu se aktivnost komplementa može smanjiti zbog njegove nespecifične adsorpcije drugim komponentama reakcije, pa se za eksperiment povećava količina komplementa: uzima se doza koja slijedi titar. Ovo je radna doza.

Postoje različite opcije za postavljanje RSK-a: klasična. metoda formulacije u obliku makro- i mikrovarijanti, reakcija dugotrajne fiksacije komplementa (LDSC) na hladnom, metoda količina. RSC na bazi 50% hemolize senzibiliziranih eritrocita itd. Za dijagnosticiranje niza bolesti koristi se osjetljivija metoda - RDS.

Uspostavljanje reakcije dugotrajne fiksacije komplementa (LDSC).

Prva faza reakcije se izvodi u frižideru na 2-6°C 16-18 sati, druga faza u vodenom kupatilu 20 minuta na 37-38°C.

Komplement se koristi u radnom razrjeđenju 1:25 ili 1:30 (prilikom određivanja njegovog radnog razrjeđenja).

Prvog dana se serum i antigen flaširaju za glavni eksperiment. Reakcija se izvodi u zapremini od 1 kubnog metra. cm (0,2 cc svake komponente). Kontrole za RDSC su iste kao kod postavljanja RSK-a.

Zatim se 0,2 cc komplementa ulije u sve epruvete glavnog eksperimenta i odgovarajućih kontrola. cm u zavisnosti od njegovog radnog razblaženja, epruvete se promućkaju i stavljaju u frižider na 16-18 sati. na 2-6°C.

Sledećeg dana, rešetke sa prvom fazom se vade iz frižidera i nakon stajanja 20-30 minuta. na sobnoj temperaturi, hemolitički sistem se sipa u sve epruvete u dozi (u datom primeru - 0,6 kubnih cm). Police se protresu i stave u vodeno kupatilo na 20 minuta. na 37-38°C.

Šema glavnog eksperimenta RDSC prikazana je u tabeli 3.

Rezultati RSC i RDSK se uzimaju u obzir dva puta: prvi put - odmah nakon vodenog kupatila, drugi put - nakon što se crvena krvna zrnca talože na dno epruvete (3-4 sata nakon vodenog kupatila) ili sutradan kada se čuva u frižideru od 2° do 6°C.

Da bi se objektivno odredili rezultati reakcije, preporučuje se procijeniti postotak hemolize. Da bi se to učinilo, iz reakcije se bira 5 epruveta sa potpunom (100%) hemolizom i tečnost iz njih se sipa u jednu epruvetu. Od njega se pripremaju razrjeđenja s nižim postotkom hemolize, takozvana "Standard" skala.

Stepen hemolize u epruvetama sa test serumima određuje se poređenjem sa stepenom hemolize u „standardnim“ epruvetama, a procenat hemolize se izražava ukrštanjem.

Stepen kašnjenja je obrnuto proporcionalan procentu hemolize crvenih krvnih zrnaca:

++++ (4 krsta) - odsustvo hemolize, supernatantna tečnost je providna, bezbojna;

+++ (3 križa) - hemoliza 25% crvenih krvnih zrnaca;

++ (2 križa) - hemoliza 50% eritrocita;

+ (1 križ) - hemoliza 75% crvenih krvnih zrnaca;

(minus) - potpuna hemoliza eritrocita, nema sedimenta, tečnost je intenzivno obojena hemoglobinom.

Evaluacija rezultata RSK, RDSC.

Test serumi se procjenjuju u razrjeđenjima 1:5 i 1:10 (0,04 cc, 0,02 cc) uz potpunu hemolizu eritrocita u kontrolnom serumu bez antigena i sa kontrolnim antigenom.

Pozitivna reakcija se procjenjuje kada se hemoliza crvenih krvnih stanica odgodi za 3-4 križanja u razrjeđenju 1:10.

Sumnjivo - kada je hemoliza eritrocita odgođena za 1 križanje u razrijeđenju seruma 1:10 i od 2 do 4 križanja u razrjeđenju 1:5.

Negativno - s potpunom hemolizom eritrocita u razrjeđenjima seruma 1: 5 i 1: 10.