Test wiązania dopełniacza jest jednym z tradycyjnych testów serologicznych stosowanych w diagnostyce wielu chorób wirusowych, a także stanowi podstawę niektórych innych metod wykrywania przeciwciał przeciwwirusowych. Chociaż reakcja neutralizacji, hamowanie hemaglutynacji, hemaglutynacja pośrednia i test immunoenzymatyczny mają lepszą czułość niż reakcja wiązania dopełniacza, prostota techniki, wczesne wykrywanie przeciwciał, a także identyfikacja antygenów wirusowych, które nie mają właściwości hemaglutynujących, wyjaśniają jego szerokie zastosowanie w badaniach wirusologicznych.

Do jego produkcji nie jest wymagany tak wysoki stopień stężenia i czystości leków antygenowych, które są niezbędne w szeregu innych reakcji immunologicznych. Ponadto specyficzność grupowa antygenów wiążących dopełniacz wielu wirusów umożliwia zastosowanie reakcji wiązania dopełniacza w diagnostyce masowej: reakcja ta nie ujawnia różnic szczepowych i ma szczególną wartość w badaniu powiązań antygenowych między wirusami.

Sama nazwa w dużej mierze oddaje istotę metody, która składa się z dwóch odrębnych reakcji. W pierwszym etapie w reakcji biorą udział antygeny i przeciwciała (jeden z tych składników jest znany z góry) oraz dopełniacz w miareczkowanej ilości. Jeśli antygen i przeciwciała pasują, ich kompleks wiąże dopełniacz, który jest wykrywany w drugim etapie za pomocą systemu wskaźnikowego (mieszaniny czerwonych krwinek owiec i surowicy odpornościowej na nie). Jeśli dopełniacz jest związany przez interakcję antygenu i przeciwciał, wówczas nie następuje liza czerwonych krwinek owiec (dodatnia reakcja wiązania dopełniacza). W przypadku negatywnej reakcji wiązania dopełniacza, nieutrwalony dopełniacz sprzyja hemolizie, na podstawie której można ocenić wyniki reakcji.

Głównymi składnikami reakcji wiązania dopełniacza są antygeny (znane lub wykrywalne), przeciwciała (znane surowice odpornościowe lub surowice testowe), dopełniacz, surowica hemolityczna i czerwone krwinki owiec; Jako rozcieńczalnik stosuje się izotoniczny roztwór chlorku sodu (pH 7,2-7,4) lub różne roztwory buforowe. Antygeny i surowice mogą być antykomplementarne, tj. zdolność do adsorbowania dopełniacza, co opóźnia hemolizę i zniekształca wynik reakcji.

Antygeny dla CSC przygotowuje się z narządów zakażonych zwierząt, płynu omoczniowego lub owodniowego zakażonych zarodków kurzych, a także płynu hodowlanego po wyhodowaniu wirusów w hodowlach komórek tkankowych. Preparaty antygenowe zawsze zawierają dużo substancji balastowych pochodzących z komórek zwierzęcych lub kultur tkankowych, które również mogą zaburzać wynik reakcji.

Powstałe antygeny wirusowe inaktywuje się, określa się dawkę roboczą oraz właściwości antykomplementarne i hemolityczne. Następnie antygen miareczkuje się w obecności dopełniacza.

Drugim głównym składnikiem inscenizacji reakcji jest dopełniacz. Termin ten odnosi się do złożonego układu białek i czynników występujących we krwi zwierząt i ludzi. Zazwyczaj w reakcji wiązania dopełniacza stosuje się surowicę krwi świnki morskiej. Aktywność (miano) dopełniacza to jego najmniejsza ilość, w obecności której hemolizyna powoduje całkowitą hemolizę zastosowanego układu hemolitycznego.

Aby zidentyfikować przeciwciała wiążące dopełniacz przeciwko wirusom, wymagana jest inaktywacja surowicy w celu wyeliminowania dopełniacza w temperaturze 560°C przez 30 minut. Jako surowice referencyjne stosuje się zwykle surowice pochodzące od immunizowanych zwierząt. Ponadto do immunizacji stosuje się antygeny wirusowe, które są dokładnie oczyszczone z zanieczyszczeń tkankowych, ponieważ w przeciwnym razie następuje wyraźna niespecyficzna reakcja.

Obowiązkowym składnikiem reakcji wiązania dopełniacza jest układ hemolityczny, w skład którego wchodzą erytrocyty owiec oraz surowica hemolityczna otrzymywana w wyniku hiperimmunizacji królików erytrocytami owiec.

Do przeprowadzenia reakcji wiązania dopełniacza stosuje się następujące modyfikacje: mikrometoda reakcji wiązania dopełniacza w mikrotitratorze układu Takachi, reakcja długotrwałego wiązania dopełniacza, reakcja pośredniego wiązania dopełniacza, reakcja wiązania dopełniacza w żelu, mikrokropelka reakcja wiązania dopełniacza, reakcja wiązania dopełniacza na bazie ciała stałego.

Chociaż czułość reakcji wiązania dopełniacza jest niska, ma ona wysoką swoistość. W związku z tym jest szeroko stosowany w diagnostyce wirusowego zapalenia płuc i jelit u młodego bydła.

Szczególną zaletą RSC jest to, że charakter zawartego w nim antygenu (korpuskularny czy rozpuszczalny) nie ma znaczenia, ponieważ dopełniacz wiąże się z fragmentem Fc dowolnego przeciwciała spokrewnionego z IgG i IgM, niezależnie od jego specyficzności przeciwciała. Ponadto RSA jest bardzo czuły: pozwala wykryć ilość przeciwciał 10 razy mniejszą niż np. w reakcji strącania. RSC został zaproponowany w 1901 roku przez J. Bordeta i O. Zhanga. Opiera się na dwóch właściwościach dopełniacza:

1) zdolność wiązania się z kompleksem „antygen + przeciwciało”;

2) liza czerwonych krwinek wykorzystywanych do otrzymania surowicy hemolitycznej.

RSK odbywa się w dwóch etapach i zaangażowane są odpowiednio dwa systemy - eksperymentalny lub diagnostyczny i wskaźnikowy. System diagnostyczny składa się z surowicy testowej (lub diagnostycznej), którą przed wykonaniem reakcji podgrzewa się w temperaturze 56°C przez 30 minut w celu inaktywacji obecnego w niej dopełniacza i antygenu.

Do tego systemu dodawane jest standardowe uzupełnienie. Jego źródłem jest świeża lub suszona serwatka świnki morskiej. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Jeśli surowica testowa zawiera przeciwciała, będą one oddziaływać z dodanym antygenem, a powstałe kompleksy „antygen + przeciwciało” zwiążą dodany dopełniacz. Jeśli w surowicy nie będzie przeciwciał, nie nastąpi utworzenie kompleksu antygen + przeciwciało, a dopełniacz pozostanie wolny.

Na tym etapie reakcji zwykle nie występują widoczne objawy wiązania dopełniacza. Dlatego też, aby wyjaśnić kwestię, czy nastąpiło wiązanie dopełniacza, czy nie, dodaje się drugi system wskaźnikowy (inaktywowana surowica hemolityczna + owcze czerwone krwinki) i mieszaninę wszystkich składników RSC ponownie inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30–60 minut , po czym ocenia się wyniki reakcji. Za pomocą smartfona (takiego jak ten) możesz obliczyć dokładny czas reakcji. Jeżeli w pierwszym etapie w systemie diagnostycznym dopełniacz zostanie związany, czyli w surowicy pacjenta znajdują się przeciwciała, a dopełniacz zostanie związany kompleksem „przeciwciało + antygen”, nie dojdzie do lizy krwinek czerwonych – RBC jest dodatni: płyn jest bezbarwny, na dnie probówki znajduje się osad czerwonych krwinek

Jeżeli w surowicy nie ma swoistych przeciwciał i w systemie diagnostycznym nie następuje wiązanie dopełniacza, czyli RSC jest ujemne, wówczas niewykorzystany w systemie diagnostycznym dopełniacz wiąże się z kompleksem „erytrocyty + przeciwciała” układu wskaźnikowego i następuje hemoliza: w probówce „lakierowanej krwi” nie ma osadu czerwonych krwinek. Intensywność RSC ocenia się za pomocą układu czterokrzyżowego, w zależności od stopnia opóźnienia hemolizy i obecności osadu krwinek czerwonych. Reakcji towarzyszą odpowiednie kontrole: kontrola surowicy (bez antygenu) i kontrola antygenu (bez surowicy), ponieważ niektóre surowice i niektóre antygeny mają działanie antykomplementarne. Przed wykonaniem RSC wszystkie składniki biorące w nim udział, z wyjątkiem surowicy testowej lub antygenu, poddawane są dokładnemu miareczkowaniu.

Szczególnie ważne jest wprowadzenie do reakcji dokładnej dawki dopełniacza, gdyż jego brak lub nadmiar może prowadzić do fałszywych wyników. Miano dopełniacza to minimalna ilość, która w obecności dawki roboczej surowicy hemolitycznej zapewnia całkowite rozpuszczenie czerwonych krwinek. Do wykonania głównego doświadczenia należy przyjąć dawkę dopełniacza zwiększoną o 20-25% w stosunku do ustalonego miana. Miano surowicy hemolitycznej to jej maksymalne rozcieńczenie, które po zmieszaniu z równą objętością 10% roztworu dopełniacza całkowicie hemolizuje odpowiednią dawkę czerwonych krwinek w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.

Reakcję pośredniej hemolizy stosuje się jako przyspieszoną metodę wykrywania swoistych przeciwciał. Czerwone krwinki służą jako nośnik antygenów. Jeżeli w surowicy pacjenta znajdują się specyficzne przeciwciała, uczulone krwinki czerwone ulegają lizie w obecności dopełniacza.

Nie znalazłeś odpowiednich informacji? Bez problemu! Skorzystaj z wyszukiwania na stronie w prawym górnym rogu.

61. Reakcje z udziałem dopełniacza. Reakcja wiązania dopełniacza. Mechanizm, elementy, sposoby montażu, zastosowanie. Reakcja hemolizy radialnej

Reakcje z udziałem dopełniacza

Reakcje z udziałem dopełniaczaopierają się na aktywacji dopełniacza przez kompleks antygen-przeciwciało (reakcja wiązania dopełniacza, hemoliza promieniowa itp.).

Reakcja wiązania dopełniacza (RSK) polega na tym, że gdy antygeny i przeciwciała odpowiadają sobie, tworzą kompleks immunologiczny, do którego poprzez Fc -fragment przeciwciała jest przyłączony do dopełniacza (C), tj. dopełniacz jest wiązany przez kompleks antygen-przeciwciało. Jeśli kompleks antygen-przeciwciało nie zostanie utworzony, dopełniacz pozostaje wolny (ryc. 13.8). RSK przeprowadza się w dwóch fazach: I faza – inkubacja mieszaniny zawierającej trzy składniki: antygen + przeciwciało + dopełniacz; II faza (wskaźnik) - wykrywanie wolnego dopełniacza w mieszaninie poprzez dodanie do niej układu hemolitycznego składającego się z erytrocytów owiec i surowicy hemolitycznej zawierającej przeciwko nim przeciwciała. W I fazie reakcji, gdy tworzy się kompleks antygen-przeciwciało, wiąże się dopełniacz, a następnie w II fazie nie dochodzi do hemolizy erytrocytów uwrażliwionych przez przeciwciała; reakcja jest pozytywna. Jeżeli antygen i przeciwciało nie pasują do siebie (w badanej próbce nie ma antygenu ani przeciwciała), dopełniacz pozostaje wolny i w II fazie połączy się z kompleksem erytrocyt – przeciwciało antyerytrocytowe, powodując hemolizę; reakcja jest negatywna.

RSC służy do diagnostyki wielu chorób zakaźnych, w szczególności kiły (reakcja Wassermanna).

Reakcja ta służy do wykrywania przeciwciał w surowicy krwi pacjentów z infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi, pierwotniakowymi, a także do identyfikacji i typu wirusów wyizolowanych od pacjentów. RSC odnosi się do złożonych reakcji serologicznych, w których oprócz antygenu, przeciwciała i dopełniacza uczestniczy także układ hemolityczny, ujawniając skutki reakcji. RSC przebiega dwuetapowo: pierwsza to oddziaływanie antygenu z przeciwciałem przy udziale dopełniacza, druga to identyfikacja stopnia wiązania dopełniacza za pomocą układu hemolitycznego. System ten składa się z czerwonych krwinek owiec i surowicy hemolitycznej otrzymanej w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych czerwonymi krwinkami. Erytrocyty poddaje się obróbce – uwrażliwianiu poprzez dodanie do nich surowicy w temperaturze 37°C na 30 minut. Liza uczulonych erytrocytów owiec następuje tylko wtedy, gdy przyłączają się do hemolitycznego układu dopełniacza. W przypadku jego braku czerwone krwinki nie ulegają zmianie. Wyniki RSC zależą od obecności przeciwciał w badanej surowicy. Jeśli surowica zawiera przeciwciała homologiczne do antygenu użytego w reakcji, wówczas powstały kompleks antygen-przeciwciało wiąże się i wiąże dopełniacz. W tym przypadku po dodaniu układu hemolitycznego hemoliza nie nastąpi, ponieważ całe uzupełnienie zostanie wydane na specyficzne połączenie kompleksu antygen-przeciwciało. Czerwone krwinki pozostają niezmienione, więc brak hemolizy w probówce jest rejestrowany jako dodatni wynik RBC. W przypadku braku przeciwciał odpowiadających antygenowi w surowicy, nie tworzy się specyficzny kompleks antygen-przeciwciało, a dopełniacz pozostaje wolny. Po dodaniu układu hemolitycznego dopełniacz przyłącza się do niego i powoduje hemolizę czerwonych krwinek. Zniszczenie czerwonych krwinek i ich hemoliza charakteryzuje się reakcją negatywną.

Do stopnia zaawansowania RSC potrzebne są: surowica pacjenta, dopełniacz, układ hemolityczny składający się z erytrocytów owczych i surowicy hemolitycznej oraz izotoniczny roztwór chlorku sodu. Reakcję prowadzi się w probówkach serologicznych. Czerwone krwinki owiec uzyskuje się z odwłóknionej krwi owczej poprzez trzykrotne przemycie ich izotonicznym roztworem chlorku sodu. Surowica hemolityczna produkowana jest w postaci gotowej w ampułkach, na której etykiecie wskazano jej miano, czyli maksymalne rozcieńczenie surowicy, które po dodaniu do czerwonych krwinek w obecności dopełniacza nadal powoduje hemolizę. Surowicę hemolityczną otrzymuje się poprzez immunizację zwierząt, takich jak króliki, czerwonymi krwinkami owiec. Podczas ustalania reakcji surowicę stosuje się w potrójnym mianowaniu. Na przykład miano surowicy hemolitycznej wynosi 1:1200, a rozcieńczenie robocze wynosi 1:400. Jako uzupełnienie stosuje się świeżą surowicę krwi świnki morskiej (w ciągu 24-48 godzin) lub suchy dopełniacz w ampułkach. Przed wykonaniem RSC dopełniacz rozcieńcza się w stosunku 1:10 i miareczkuje w celu ustalenia miana – najmniejszej ilości dopełniacza powstałego w wyniku hemolizy czerwonych krwinek w połączeniu z układem hemolitycznym stosowanym w tej reakcji. Biorąc pod uwagę możliwe antykomplementarne właściwości antygenu, podczas inscenizacji reakcji zwiększa się o 20-30% ustalone robocze miano dopełniacza.
Antygenem RSC są zawiesiny zabitych bakterii, przygotowane z tych zawiesin ekstrakty oraz poszczególne frakcje chemiczne drobnoustrojów. Głównym wymaganiem dla antygenu jest brak hamowania aktywności dopełniacza. Nie powinien mieć właściwości antykomplementarnych. Aby zidentyfikować te właściwości antygenu, dopełniacz miareczkuje się dodatkowo w obecności antygenu użytego w reakcji. Istnieją pewne schematy inscenizacji RSC. Wyniki reakcji uwzględnia się na podstawie obecności lub braku hemolizy czerwonych krwinek w układzie hemolitycznym. RSC wykorzystuje się w diagnostyce kiły (reakcja Wassermanna), rzeżączki (reakcja Bordeta-Gengou), toksoplazmozy, riketsj i chorób wirusowych.

Reakcja hemolizy radialnej (RRH) ) umieszcza się w dołkach żelu agarowego zawierającego czerwone krwinki owiec i dopełniacz. Po wprowadzeniu surowicy hemolitycznej (przeciwciał przeciwko czerwonym krwinkom owcy) do dołków żelu tworzy się wokół nich strefa hemolizy (w wyniku promieniowej dyfuzji przeciwciał). W ten sposób można określić aktywność surowicy dopełniacza, hemolitycznej i przeciwciał w surowicy krwi chorych na grypę, różyczkę i kleszczowe zapalenie mózgu. W tym celu na erytrocytach adsorbuje się odpowiednie antygeny wirusa, a do dołków żelu zawierającego te erytrocyty dodaje się surowicę krwi pacjenta. Przeciwciała przeciwwirusowe oddziałują z antygenami wirusowymi zaadsorbowanymi na erytrocytach, po czym składniki dopełniacza przyłączają się do tego kompleksu, powodując hemolizę.

Reakcję opracowali J. Bordet i O. Zhangou w 1901 roku. Ustalili, że gdy tworzy się kompleks antygen-przeciwciało, wiąże się on z dopełniaczem.

Powstały związek jest drobno zdyspergowany i nie można go wykryć wizualnie. Do wykrycia adsorpcji (wiązania) dopełniacza autorzy zastosowali system wskaźników hemolitycznych: erytrocyty owcze i surowicę hemolityczną. Jeśli w układzie testowym antygen nie pasuje do przeciwciała, kompleks immunologiczny nie tworzy się, a dopełniacz pozostaje wolny. Dopełniacz jest adsorbowany tylko na kompleksie antygen-przeciwciało, nie jest adsorbowany oddzielnie na antygenie lub przeciwciele. Dlatego po dodaniu do układu testowego układu hemolitycznego składającego się z gotowego kompleksu antygen-przeciwciało (erytrocyty owcy i przeciwciała przeciwko nim) dopełniacz przyłącza się do tego kompleksu, powodując hemolizę erytrocytów - widoczny efekt .

Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) jest bardzo czuła i specyficzna. RSC stosuje się w serodiagnostyce rzeżączki, kiły, krztuśca, wszystkich riketsjoz i wielu chorób wirusowych. Podobnie jak inne reakcje serologiczne, RSC można również wykorzystać do serotypowania.

RSC to złożona reakcja serologiczna. Obejmuje dwa układy antygenowe – przeciwciało i dopełniacz.

Aby skonfigurować RSC, potrzebujesz:

O złożoności reakcji decyduje liczba składników, a przede wszystkim konieczność ustalenia ich dokładnych proporcji ilościowych. Dlatego też główne doświadczenie poprzedza miareczkowanie jego składników.

Surowicę hemolityczną przygotowuje się w warunkach produkcyjnych poprzez 3-4-krotną dożylną immunizację królika 50% zawiesiną erytrocytów owczych i inaktywuje się w temperaturze 56°C przez 30 minut. W celu jej miareczkowania pobiera się sukcesywnie malejące dawki (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% zawiesinę czerwonych krwinek, uzupełnienie 1:10 w równych objętościach (ale 0,5 ml ). Na etykiecie ampułek z surowicą hemolityczną podane jest jej miano – maksymalne rozcieńczenie zapewniające całkowitą lizę 3% zawiesiny erytrocytów owczych w obecności dopełniacza przez godzinę w temperaturze 37°C. W przypadku RSC stosuje się rozcieńczenie surowicy zwiększone 3-krotnie w stosunku do miana.

Z odwłóknionej krwi owczej otrzymuje się 3% zawiesinę erytrocytów owczych poprzez przemycie izotonicznym roztworem NaCl.

Dopełniacz - surowica krwi świnki morskiej świeża lub suszona - miareczkuje się przed doświadczeniem: stopniowo malejące dawki (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + hemolityczne układ (erytrocyty owiec i surowica hemolityczna). Po inkubacji w termostacie w temperaturze 37°C oznacza się miano dopełniacza – najwyższe rozcieńczenie powodujące całkowitą lizę czerwonych krwinek w obecności surowicy hemolitycznej. Dawka robocza dopełniacza powinna być o 25% wyższa od miana, ponieważ aktywność dopełniacza w eksperymencie może być nieco tłumiona przez inne dopełniacze reakcji (antygen, surowica).

Antygen – zawiesina zabitych mikroorganizmów, ich lizaty, kompletne antygeny, hapteny, ekstrakty lipidów tkankowych – czasami wiąże dopełniacz nawet przy braku surowicy odpornościowej, dlatego też należy go miareczkować. Przyjmuje się stale malejące dawki antygenu + robocza dawka dopełniacza + układ hemolityczny. Miano antygenu to jego najmniejsza dawka, przy której następuje wyraźna hemoliza. W przypadku RSC przyjmuje się dawkę antygenu zmniejszoną o połowę w stosunku do miana, aby uniknąć wiązania dopełniacza.

Przed doświadczeniem surowicę testową inaktywuje się w temperaturze 56°C przez 30 minut. Aby dezaktywować własne uzupełnienie.

Wszystkie składniki reakcji wiązania dopełniacza pobiera się w równych objętościach.

Przygotowanie głównego eksperymentu.

Po ustaleniu miana i dawek roboczych wszystkich składników przeprowadza się główne doświadczenie RSC. W reakcji uczestniczą również miareczkowane surowice: te, o których wiadomo, że są zdrowe i te, o których wiadomo, że są chore (odpowiednio surowice ujemne i dodatnie). Podobnie jak surowica testowa, surowica kontrolna jest również inaktywowana w temperaturze 56°C przez 30 minut.

RSC odbywa się w dwóch fazach:

Faza I – specyficzna – inkubacja mieszaniny antygenu, przeciwciała i dopełniacza w termostacie w temperaturze 37°C przez 30 minut.

Faza II – wskaźnik – określenie obecności wolnego dopełniacza w mieszaninie poprzez dodanie układu hemolitycznego (wcześniej umieszczonego w termostacie na 30 minut) i inkubację w termostacie w temperaturze 37°C przez 20 – 30 minut.

Wyniki doświadczenia ocenia się poprzez odnotowanie obecności lub braku hemolizy we wszystkich probówkach (patrz tabela). Reakcję uważa się za pozytywną, gdy hemoliza jest całkowicie opóźniona, gdy ciecz w probówce jest bezbarwna, a czerwone krwinki osiadają na dnie, ujemna, gdy ciecz jest intensywnie zabarwiona („lakierowana krew”). Stopień nasilenia hemolizy ocenia się w zależności od intensywności zabarwienia cieczy oraz wielkości osadu czerwonych krwinek na dnie (+ + + +, + + +, + +, +).

Rozliczanie wyników RSK.

Wyniki doświadczenia (surowica testowa) można uwzględnić tylko wtedy, gdy wszystkie kontrole zostały przeprowadzone prawidłowo.

W probówce nr 2 z surowicą dodatnią (zawierającą przeciwciała przeciwko temu antygenowi) nie powinno dojść do hemolizy, gdyż dopełniacz wiąże się w pierwszym specyficznym układzie, a układ hemolityczny pozostaje bez dopełniacza – czerwone krwinki osiadają na dnie, supernatant jest przezroczysty.

W probówce nr 3 z surowicą ujemną, surowicą osoby zdrowej, która nie zawiera przeciwciał przeciwko danemu antygenowi, powinna nastąpić hemoliza, gdyż w pierwszej fazie reakcji nie doszło do powstania kompleksu antygen-przeciwciało (ze względu na brak przeciwciał przeciwko temu antygenowi) i dopełniacz pozostały wolne. Kiedy w fazie II reakcji dodano hemosystem, dopełniacz został zaadsorbowany na gotowym kompleksie immunologicznym czerwonych krwinek owiec wraz z przeciwciałami przeciwko nim; nastąpiła liza czerwonych krwinek owiec (hemoliza).

Obecność hemolizy w kontrolach surowicy i antygenu (probówki nr 4 i 5) wskazuje, że ich dawki zostały dobrane prawidłowo i że ani surowica, ani sam antygen nie wiążą dopełniacza. Dopełniacz, który pozostaje wolny w określonym układzie, jest adsorbowany przez kompleks immunologiczny układu hemolitycznego i następuje hemoliza.

Hemoliza w kontroli dopełniacza (probówka nr 6) wskazuje na działanie dopełniacza i właściwy dobór jego dawki roboczej.

W kontroli układu hemolitycznego (probówka nr 7), jeśli układ ten funkcjonuje prawidłowo, nie powinno być nawet śladów hemolizy, gdyż brakuje mu uzupełnienia.

Jeżeli wyniki kontroli są doskonałe, można uwzględnić doświadczenie (probówka nr 1). Brak hemolizy uznaje się za wynik pozytywny. Oznacza to, że w surowicy badanej wykryto przeciwciała przeciwko danemu antygenowi (osoba jest chora). Kiedy antygen pasuje do przeciwciała, tworzy się kompleks antygen-przeciwciało, który wiąże dopełniacz (faza I). Po dodaniu układu hemolitycznego nie będzie hemolizy czerwonych krwinek w fazie II. Obecność hemolizy jest wynikiem ujemnym, wskazującym na brak przeciwciał przeciwko temu antygenowi (osoba jest zdrowa). Dopełniacz pozostaje wolny, a po dodaniu układu hemolitycznego łączy się z kompleksem erytrocyt-hemolizyna, powodując hemolizę.

Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) i długoterminowa reakcja wiązania dopełniacza (LCR)

Reakcja wiązania dopełniacza (reakcja wiązania dopełniacza)

REAKCJA wiązania dopełniacza, RSK, reakcja Bordeta-Zhangu [nazwana na cześć bakteriologów J. Bordeta i O. Gengou, 1901], wysoce specyficzna i bardzo czuła serologiczna. reakcja oparta na właściwości kompleksu antygen-przeciwciało polegającej na wiązaniu wolnego dopełniacza.

Dopełniacz (układ dopełniacza) (od łac. complexum - dodatek), grupa białek kulistych występujących w surowicy krwi zwierząt i ludzi, wchodzących w skład układu odpornościowego organizmu. Podczas zakażania bakterii lub wirusów do organizmu dostają się pewne toksyny lub pojawienie się własnych transformowanych komórek, następuje aktywacja dopełniacza, w wyniku czego komórki docelowe ulegają lizie (zniszczeniu), a toksyny i wirusy zostają zneutralizowane. Dlatego uważa się, że układ dopełniacza, wraz z makrofagami, stanowi pierwszą linię obrony immunologicznej organizmu.

Reakcja ta znajduje szerokie zastosowanie w identyfikacji antygenów oraz w serodiagnostyce zakażeń, zwłaszcza chorób wywoływanych przez krętki (reakcja Wassermanna), riketsje i wirusy.

RSC to złożona reakcja serologiczna. Obejmuje dopełniacz i dwa układy antygen-przeciwciało. Zasadniczo są to dwie reakcje serologiczne.

Układ pierwszy - główny składa się z antygenu i przeciwciała (jeden jest znany, drugi nie). Dodaje się do niego pewną ilość dopełniacza. Jeśli antygen i przeciwciało tego układu pasują, połączą się i zwiążą dopełniacz. Powstały kompleks jest drobno zdyspergowany i niewidoczny.

serodiagnostyka reakcji wiązania dopełniacza

Tworzenie się tego kompleksu wykrywa się za pomocą drugiego układu hemolitycznego lub wskaźnikowego. Obejmuje czerwone krwinki owiec (antygen) i odpowiednią surowicę hemolityczną (przeciwciało), tj. gotowy kompleks immunologiczny. W tym układzie liza czerwonych krwinek może nastąpić jedynie w obecności dopełniacza. Jeśli dopełniacz jest związany przez pierwszy układ (jeśli antygen i przeciwciało w nim odpowiadają), wówczas w drugim układzie nie będzie hemolizy - ponieważ nie ma wolnego dopełniacza. Brak hemolizy (zawartość probówki jest mętna lub na dnie znajduje się osad erytrocytów) uznaje się za wynik dodatni RSC.

Jeśli w pierwszym układzie antygen nie pasuje do przeciwciała, wówczas kompleks immunologiczny nie powstanie, a dopełniacz pozostanie wolny. Pozostając wolnym, dopełniacz bierze udział w drugim układzie, powodując hemolizę - wynik RSC jest ujemny (zawartość probówek jest przezroczysta - „lakierowana krew”).

Składniki reakcji wiązania dopełniacza:

1. Antygen - zwykle lizat, ekstrakt, hapten; rzadziej zawiesina mikroorganizmów

2. Przeciwciało – surowica pacjenta

3. Uzupełnienie - surowica świnki morskiej

4. Antygen – czerwone krwinki owcy Układ hemolityczny

5. Przeciwciało - hemolizyna wobec czerwonych krwinek owiec

6. Roztwór izotoniczny

Przygotowanie składników

1. Surowicę rozcieńcza się 3 razy mniej niż jej miano. Przygotować ogólne rozcieńczenie surowicy na całe doświadczenie, którego objętość określa się poprzez pomnożenie objętości surowicy w jednej probówce (np. 0,5 ml) przez liczbę probówek nieznacznie przekraczającą liczbę w doświadczeniu. Nadmiar płynu jest niezbędny przy przygotowaniu wszystkich składników reakcji: jego część pozostaje na ściankach probówek, kolb i pipet. Objętości rozcieńczonej hemolizyny i zawiesiny erytrocytów, dodając surowicę do erytrocytów, dokładnie miesza się i inkubuje przez 30 minut w temperaturze 37°C (uczulony).

2. Czerwone krwinki owiec. Przygotować 3% zawiesinę przemytych erytrocytów owczych z całej liczby probówek objętych doświadczeniem. Aby przygotować układ hemolityczny, na 30 minut przed wprowadzeniem go do doświadczenia, miesza się równe objętości erytrocytów owiec z przeciwciałem przeciwko nim.

3. Dodatek zazwyczaj rozcieńcza się w stosunku 1:10. Należy go miareczkować przed każdym doświadczeniem. Miano dopełniacza to jego najmniejsza ilość, po dodaniu do układu hemolitycznego całkowita hemoliza następuje w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.

4. Antygen zazwyczaj otrzymuje się w postaci gotowej, z podanym miano, tj. ilość, która po rozcieńczeniu antygenu powinna zawierać się w 1 ml. Na przykład przy mianie 0,4 rozcieńcza się go w 0,96 ml roztworu izotonicznego. Do doświadczenia wprowadza się ilość antygenu równą połowie miana (0,5 ml). To jest jego dawka robocza. Przygotować ogólne rozcieńczenie antygenu na całe doświadczenie, mnożąc 0,5 ml przez liczbę probówek w doświadczeniu.

5. Przeciwciało - surowica pacjenta. Świeża surowica jest przed eksperymentem inaktywowana, aby zniszczyć obecny w niej dopełniacz. W tym celu ogrzewa się go przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub w inaktywatorze z termostatem. Ta ostatnia metoda jest preferowana: eliminuje możliwość przegrzania

Ustawianie reakcji wiązania dopełniacza (CFR).

Reakcję prowadzi się w objętości 1 metra sześciennego. cm (0,2 cm3 każdego składnika).

Surowice testowe bada się w rozcieńczeniu 1:5 i 1:10 (dawka surowicy 0,04 cc i 0,02 cc z antygenem specyficznym, w rozcieńczeniu 1:5 z antygenem kontrolnym (dla specyficzności) i bez antygenu (dla antykomplementarności) .

Surowice testowe i kontrolne inaktywuje się w dniu reakcji w postaci rozcieńczonej w temperaturze 56-65°C (w zależności od rodzaju zwierzęcia) przez 30 minut. (również w RDSC).

Obydwa etapy reakcji prowadzi się w łaźni wodnej o temperaturze 37-38°C, układ bakteriolityczny utrzymuje się przez 60 minut, drugi etap reakcji (z układem hemolitycznym) utrzymuje się przez 20 minut.

Sterowanie głównym doświadczeniem RSK:

surowica dodatnia rozcieńczona 1:5 bez antygenu i z antygenem kontrolnym; w rozcieńczeniach od 1:5 do miana z określonym antygenem;

surowica ujemna w rozcieńczeniach 1:5 i 1:10 z antygenem specyficznym, w rozcieńczeniu 1:5 z antygenem kontrolnym i bez antygenu - antygeny specyficzne i kontrolne w podwójnej dawce - dla antykomplementarności (dopełniacz +) i dla hemotoksyczność (dopełniacz);

układ hemolityczny pod kątem hemotoksyczności (uzupełniacz).

Rozliczanie wyników. W kontrolach nie powinno być nawet śladów hemolizy, ponieważ jeden z nich nie zawiera dopełniacza, drugi - hemolizynę. Kontrole wskazują, że składniki reakcji nie wykazują hemotoksyczności (zdolności do spontanicznej lizy czerwonych krwinek).

W eksperymencie aktywność dopełniacza może spaść z powodu jego niespecyficznej adsorpcji przez inne składniki reakcji, dlatego w eksperymencie zwiększa się ilość dopełniacza: przyjmuje się dawkę zgodnie z mianem. To jest dawka robocza.

Istnieją różne opcje inscenizacji RSK: klasyczny. metoda formułowania w postaci makro- i mikrowariantów, długoterminowa reakcja wiązania dopełniacza (LDSC) na zimno, metoda ilościowa. RSC opiera się na 50% hemolizie uczulonych erytrocytów itp. Do diagnozowania wielu chorób stosuje się bardziej czułą metodę - RDS.

Ustalenie długotrwałej reakcji wiązania dopełniacza (LDSC).

Pierwszą fazę reakcji prowadzi się w lodówce w temperaturze 2-6°C przez 16-18 godzin, drugą fazę w łaźni wodnej przez 20 minut w temperaturze 37-38°C.

Dopełniacz stosuje się w rozcieńczeniu roboczym 1:25 lub 1:30 (przy ustalaniu jego rozcieńczenia roboczego).

Pierwszego dnia surowica i antygen są butelkowane na potrzeby głównego doświadczenia. Reakcję prowadzi się w objętości 1 metra sześciennego. cm (0,2 cm3 każdego składnika). Sterowanie RDSC jest takie samo jak przy konfigurowaniu RSK.

Następnie do wszystkich probówek głównego doświadczenia i odpowiednich kontroli wlewa się 0,2 cm3 dopełniacza. cm w zależności od rozcieńczenia roboczego probówki wstrząsa się i umieszcza w lodówce na 16-18 godzin. w temperaturze 2-6°C.

Następnego dnia stojaki z pierwszą fazą wyjmujemy z lodówki i po odstawieniu na 20-30 minut. w temperaturze pokojowej układ hemolityczny wlewa się do wszystkich probówek w dawce (w podanym przykładzie - 0,6 cm sześciennych). Statywy wytrząsa się i umieszcza w łaźni wodnej na 20 minut. w temperaturze 37-38°C.

Schemat głównego eksperymentu RDSC przedstawiono w tabeli 3.

Wyniki RSC i RDSK uwzględnia się dwukrotnie: za pierwszym razem – bezpośrednio po kąpieli wodnej, za drugim razem – po opadnięciu czerwonych krwinek na dno probówki (3-4 godziny po kąpieli wodnej) lub następnego dnia, jeśli jest przechowywany w lodówce w temperaturze od 2° do 6°C.

Aby obiektywnie określić wyniki reakcji, zaleca się ocenę procentu hemolizy. W tym celu z reakcji wybiera się 5 probówek z całkowitą (100%) hemolizą i ciecz z nich wlewa się do jednej probówki. Z niego sporządza się rozcieńczenia o niższym procencie hemolizy, tzw. skalę „standardową”.

Stopień hemolizy w probówkach z surowicą określa się poprzez porównanie stopnia hemolizy w probówkach „standardowych” i procent hemolizy wyraża się w krzyżykach.

Stopień opóźnienia jest odwrotnie proporcjonalny do procentu hemolizy czerwonych krwinek:

++++ (4 krzyżyki) - brak hemolizy, płyn supernatantu jest przezroczysty, bezbarwny;

+++ (3 krzyżyki) - hemoliza 25% czerwonych krwinek;

++ (2 krzyże) - hemoliza 50% erytrocytów;

+ (1 krzyż) - hemoliza 75% czerwonych krwinek;

(minus) - całkowita hemoliza erytrocytów, brak osadu, ciecz jest intensywnie zabarwiona hemoglobiną.

Ocena wyników RSK, RDSC.

Surowice testowe ocenia się w rozcieńczeniach 1:5 i 1:10 (0,04 cm3, 0,02 cm3) z całkowitą hemolizą erytrocytów w surowicy kontrolnej bez antygenu i z antygenem kontrolnym.

Reakcję pozytywną ocenia się, gdy hemoliza krwinek czerwonych jest opóźniona o 3-4 krzyże przy rozcieńczeniu 1:10.

Wątpliwe - gdy hemoliza erytrocytów jest opóźniona o 1 krzyż w rozcieńczeniu surowicy 1: 10 i od 2 do 4 krzyżyków w rozcieńczeniu 1: 5.

Ujemny - z całkowitą hemolizą erytrocytów w rozcieńczeniach surowicy 1: 5 i 1: 10.