Közvetlen és indirekt virológiai kutatási módszerek. Virológiai kutatási módszerek a mikrobiológiában. Vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája

A vírusos betegségek diagnosztizálásának fő módszerei a vírusok tenyésztése és azonosítása.

A betegség vírusos etiológiájának bizonyításához szükséges: a vírus izolálása egy beteg hal testéből, sejtkultúrán vagy érzékeny halon való átjuttatása, a betegség szaporodása azonos vagy rokon halban. fajok, ugyanazon vírus ismételt izolálása kísérleti állatokból.

A vírusok azonosítására számos kiegészítő módszert alkalmaznak: a vírus elektronmikroszkópos vizsgálatát, fizikai-kémiai tulajdonságainak vizsgálatát, a fertőzött sejtek jellegzetes morfológiai változásainak és a fertőzött állatok tüneteinek kimutatását, különféle immunológiai módszereket.

A vírusokat főként egyrétegű primer vagy folyamatos sejtkultúrákon izolálják, minden esetben kiválasztva az adott vírusra érzékeny tenyészeteket. A halsejtek primer tenyészeteinek előállításához leggyakrabban a nőstény ponty vagy kárász ivarmirigyét használják. Az ivarmirigyeknek a Kiselevich-skála szerint II. vagy II-III. Az ilyen ivarmirigyek nem tartalmaznak szabad szemmel látható tojásokat. Ellenkező esetben a tojások tartalma negatívan befolyásolja a sejtnövekedést. A pontyok és kárászok ivarmirigyéből származó sejttenyészeteket jóváhagyott módszerrel készítik el.

Folyamatos tenyészetként a következő sejtvonalakat használják legszélesebb körben: FHM - a kövér csücske farokszárának szöveteiből; RTG - szivárványos pisztráng ivarmirigyeiből; EPC - a pontyok bőrén kialakult himlő növedékekből. Ezeket a vonalakat az állat-egészségügyi és halászati ​​kutatóintézetek halbetegségek vizsgálatára szakosodott laboratóriumaiban tartják fenn, ahol megrendelhetők és átvehetők.

A jól tanulmányozott vírusos betegségek diagnosztizálása során azokat a szerveket és szöveteket vizsgálják, ahol a kórokozó koncentrálódik.

Halbetegségek esetén, amelyekről nem áll rendelkezésre elegendő információ, a leginkább érintett szerveket virológiai vizsgálatnak vetjük alá. A bőrről és a kopoltyúról lekapart, e szervek darabjait a nyálkahártyával együtt steril fiolákba helyezzük 2-3 ml steril fiziológiás vagy pufferoldattal. A belső szervekből származó mintákat szigorúan aszeptikus körülmények között veszik.

Azokban az esetekben, amikor lehetetlen az anyagot gyorsan megvizsgálni, legfeljebb egy napig tárolják hűtőszekrényben, 5 ° C-ot meg nem haladó hőmérsékleten. A fagyasztott anyag hosszabb ideig tárolható.

A kutatásra szánt kóros anyagot homogenizátorban zúzzák, vagy porcelánmozsárban kvarchomokkal őrlik. A zúzott szövetekből Hanks, Earle, puffer vagy sóoldatban 10%-os szuszpenziót készítünk, és 10-15 percig 2000-3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót pipettával leszívjuk és steril fiolákba helyezzük. Ha a szuszpenzió nem steril, az elkészített anyagokat 0,2-0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrőn átszűrjük, vagy antibiotikumokkal kezeljük (penicillin 1000 U/ml és streptomycin 1000 μg/ml).

A béltartalomból steril desztillált vízben 20%-os szuszpenziót készítünk, és 10-15 percig 2000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót ismét centrifugáljuk 4000-5000 fordulat/perc mellett 30 percig. A felülúszót ezután steril fiolába szívjuk, és antibiotikumokkal kezeljük. Adjunk hozzá 1000 μg/ml sztreptomicint és 1000 U/ml penicillint 1 ml-enként. Az elegyet 2-3 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Minden anyag bakteriális sterilitását tesztelték MPB-vel és MPA-val történő beoltással. Az elkészített anyagokat azonnal felhasználják a munkához, vagy extrém esetben fagyasztva (mínusz 20°C-on) tárolják.

A sejttenyészet fertőzése. Fertőzésre olyan csöveket használnak, amelyekben jó egyrétegű sejtréteg vagy növekedési zóna van az explantátum körül. A táptalajt kiszívjuk, és minden kémcsőbe 0,2-0,3 ml tesztszuszpenziót adunk. Ezzel egyidejűleg 0,8-0,9 ml 2-3% szérumot tartalmazó táptalajt adunk a kémcsövekbe.

Az egyes mintákból készített anyagot 4-6 kémcsőben szövettenyészet megfertőzésére használjuk. Minden vizsgálatsorozatból ugyanannyi kémcsövet hagyunk kontrollnak, 1 ml táptalajt adva hozzájuk. A csöveket 1-2 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk, hogy a vírus a sejteken adszorbeálódjon, majd pipettával leszívjuk a felülúszót és a fenntartó tápközeget az eredeti térfogatra adjuk.

A fertőzött és a kontroll sejttenyészeteket 22-26°C hőmérsékleten inkubáljuk, és kis nagyítású mikroszkóp alatt naponta megvizsgáljuk a sejtekben bekövetkező morfológiai változások kimutatására. Súlyos sejtdegeneráció esetén a tenyészfolyadékot kiszívják és passzálásokat végzünk, citopatogén hatás (CPE) hiányában pedig két egymást követő passzálást végzünk. Ehhez tenyészfolyadékot használnak az ismételt fagyasztással és felengedéssel elpusztult sejtfrakcióval együtt. Friss tenyészetek fertőzéséhez használja a centrifugált sejttömeg felülúszóját. A harmadik átoltás utáni CPE-t a vírus ágens specifikus hatásaként vesszük figyelembe.

Az egyrétegű sejt károsodásának mértékét a 4-keresztes rendszer segítségével értékeljük; " + - sérülés legfeljebb 25%, " + + " - legfeljebb 50%, "+ + +" - legfeljebb 75% és " + + + + " - az egyrétegű réteg 100% -áig.

A halak egyes vírusos betegségeiben zárványtestek jelennek meg a különböző szervek és szövetek sejtjeiben (citoplazmatikus sejtmagjában). A víruszárványok vizsgálatának anyaga fertőzött szövettenyészetek, szervekből és szövetekből származó kaparék és lenyomatkenetek, a festés előtt ezeket az anyagokat általánosan elfogadott módszerekkel rögzítik, Dubosc-Brazil-Buena, Buena, Carnoy folyadékokkal vagy 10%-os oldattal. semleges formaldehid.

A víruszárványokat különféle módszerekkel festik: Muromtsev, Rubina, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa stb.

Vírustitrálás- a vírusaktivitás kvantitatív meghatározása. A vírustitert a vírusszuszpenzió egységnyi térfogatában lévő fertőző egységek számával fejezzük ki. A vírus fertőző egysége az a dózis, amely az általa fertőzött érzékeny objektumok 50%-ában fertőzést okoz. A vírusnak ezt a dózisát fertőzőnek nevezik, és ID 50-nek nevezik.

A sejttenyészeteket főként érzékeny tárgyként használják halvírusok titrálásakor. A sejttenyészeten a titrálást a vírusok citopatogén hatásának megfelelően végezzük. Ebben az esetben az ID 50-et szöveti citopatogén dózisnak (TCD 50) nevezik, és a vírustitert a TCD 50 mennyisége fejezi ki 1 ml vírusszuszpenzióban. A vírustitert a végső hígítási módszerrel határozzuk meg. E módszer szerint az érzékeny sejttenyészetek egy bizonyos térfogatú vírusszuszpenziót injektálnak be egymás után növekvő hígításokban, és figyelembe véve az egyes injekciók eredményét pozitívnak (ha van CPP) vagy negatívnak, ha nincs CPP, a titrálást. végpont kiszámítása - 1 TCD 50.

A kifejezett CPE-t adó vírusok titrálására a plakk módszert is alkalmazzák. Ebben az esetben a vírussal fertőzött sejt egyrétegű táptalajt agar keverékével öntjük, hogy megakadályozzuk a vírus átjutását más, az eredetileg fertőzött sejtektől jelentősen eltávolított sejtekbe, és meg tudjuk fertőzni a kezdeti sejteket. a plakk fertőzési gócai).

Minden plakk egyetlen fertőző egységből származik, amelyet PFU-nak (plack-forming unit) jelölnek, és a vírus titerét a szuszpenzió egységnyi térfogatára eső PFU-k számában fejezzük ki.

Semlegesítési reakció(RN) sejttenyészeten.

A reakció azon alapul, hogy az antigént egy homológ antiszérum antitestei kötik meg. A reakciót a kórokozók azonosítására használják a vírusos etiológiájú betegségek diagnosztizálásában. Lehetővé teszi egy ismeretlen vírusantigén meghatározását ismert antitestekkel vagy ismert (standard) antigénnel – ismeretlen antitestekkel beteg vagy felépült halak szérumában.

A semlegesítési reakcióban az izolált vírus meghatározását a velük homológ antigének (vírusok) diagnosztikai hiperimmun antiszérumai (antitestek) segítségével végezzük.

A hiperimmun antiszérumokat úgy nyerik, hogy laboratóriumi állatokat (például nyulakat) fertőznek ismert vírustörzsekkel, amelyek halbetegségeket okoznak. Meghatározzuk a kapott antiszérumban a specifikus antitestek titerét. Munkához vegyen magas titerű antitesteket tartalmazó antiszérumokat.

A reakció sorrendje.

1. Normál és hiperimmun szérum inaktiválása 56 o C-on 30 perces melegítéssel.

2. A reakció összetevőinek hígításainak elkészítése. Az antigént és a szérumot szérum és antibiotikumok nélküli tápközeggel hígítjuk, 1:5, 1:50, 1:500 aránytól kezdve, és addig, amíg 1-nél kevesebb TCD 50/0,2 ml-t tartalmazó hígítást nem kapunk. A hiperimmun szérumot 1:2-re vagy 1:5-re hígítják.Ha a titer alacsony, a szérumot hígítatlanul használjuk. A normál szérumot ugyanúgy hígítják, mint a hiperimmun szérumot.

3. A reakció beállítása. Három sor steril csövet helyezünk egy állványba. Az első sorba hígított hiperimmun szérumot, a másodikba hígított normál szérumot, a harmadikba pedig tápközeget öntünk. Mindegyik összetevőt 0,5 ml térfogatban adjuk hozzá.

A vírus elkészített hígításait 0,5 ml-es mennyiségben átvisszük mindhárom sor megfelelő kémcsövébe, és minden I. hígítás vírusát külön pipettával, a legnagyobb hígítástól kezdve. Így a kémcsövek minden sorában 10-szeres vírushígításokat kapunk: 10-1, 10-2 stb.

A szérumok toxicitásának ellenőrzésére adjon 0,5 ml-t a hiperimmun szérum elkészített hígításából egy külön kémcsőbe, majd adjon hozzá azonos mennyiségű táptalajt. Ugyanez történik a normál szérummal is.

A keverékkel ellátott kémcsöveket alaposan összerázzuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután a sejttenyészetet a vírus minden egyes hígításával (0,2 ml csőenként) fertőzzük hiperimmun normál szérummal és tápközeggel, mindegyik 4 sejttenyésztő csővel. Ezzel egyidejűleg kontrollokat helyeznek el a felhasznált sejtek toxicitására és a kontroll sejttenyészet-mintákat.

A sejttenyészetet tartalmazó csöveket termosztátban inkubáljuk az adott vírus szaporodásához optimális hőmérsékleten, és naponta vizsgáljuk alacsony nagyítású mikroszkóp alatt a vírus CPE-jének kimutatására. Az eredmények bekerülnek a táblázatba (11. táblázat).

A vírustitert a vírusszuszpenzió egységnyi térfogatában lévő fertőző egységek számával fejezzük ki. Keresse meg a semlegesítési indexet (IN). Megfelel a hiperimmun szérummal semlegesíthető ID 50 maximális mennyiségének. Az IN-t a következő képlettel számítjuk ki: logIN = logT 1 -lgT 2, ahol T 1 a vírus titere normál szérum jelenlétében; T 2 - vírustiter hiperimmun szérum jelenlétében. Az IN értéke az antilogaritmusok táblázatából található. Általánosan elfogadott, hogy az IN érték 10-ig negatív, 10-től 49-ig kétséges, és 50 vagy annál nagyobb pozitív eredmény.

A reakció eredményei csak akkor tekinthetők megbízhatónak, ha a hiperimmun szérum specifikus semlegesítő aktivitását vizsgálják. Ehhez először meg kell határozni a semlegesítő antitestek titerét ebben a szérumban vagy semlegesítési indexét egy homológ vírussal való reakcióban.

Rhabdovírusok izolálása plakk módszerrel. Ez a módszer specifikus, pontyok és pisztrángok rhabdovírusainak izolálására, előzetes tipizálására és szelekciójára használják specifikus immunszérum jelenlétében a vírus azonosítására.

Kerek telepek (plakkok) képződnek sejttenyészetekben agar bevonat alatt, vírus jelenlétében a vizsgált anyagban.

Aszeptikus körülmények között a vese, a máj, a lép szövetét és a hasüregből származó folyadékot Pasteur pipettával összegyűjtjük, és 1:10 arányban 500 NE (mcg)/ml antibiotikumot tartalmazó táptalajba töltjük. 60-90 percig 18-22 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 2-3 ezer fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 10 percig. A felülúszót tápközeggel 1:10 arányban hígítjuk (1:100 hígítás). A sejttenyészetek megfertőzésére mindkét hígítás felülúszó folyadékát használjuk.

A vizsgálathoz egy jól körülhatárolható egyrétegű matracokban növesztett 3 napos folyamatos sejttenyészetet választunk ki 2 matrac arányban a kóros anyag minden hígítására és 2 matracra a kontrollra. A táptalajt eltávolítjuk a palackokból, és 2 ml magzati szérum nélküli táptalajt adunk hozzá. Ezután 0,2 ml tesztanyagot adunk hozzá, és a halakat fertőző vírusok számára optimális hőmérsékleten (pontyvírusok esetén - 24-26 °C, pisztrángvírusok esetén - 16-18 °C) hagyjuk a vírust 60 percig adszorbeálni.

A kontrollt 2 matracba helyezzük, egyenként 0,2 ml-es sejttenyészetekkel, amelyek 100 TCD 50/ml ismert vírust tartalmaznak, és 2-0,2 ml vírus nélküli tápközegbe.

60 perc elteltével a folyadékot eltávolítjuk az injekciós üvegekből. Az egyrétegű réteggel szemközti fal mentén adjunk hozzá 5 ml 40-42 °C-ra melegített agar bevonatot egy 50 ml-es, 40-42 °C-ra melegített palackba (HCV vírus izolálása esetén - legfeljebb 38 °C). A matracok egyrétegűre vannak fordítva, és fekete papírral borítják. 15-20 perc elteltével a matracokat a vizsgált vírusok számára optimális hőmérsékleten inkubálják. A matracokat az agar bevonattal felfelé helyezzük el. Ha a vírus ismeretlen, a tenyészeteket két hőmérsékleti körülmények között tartják - 14-18 és 22-24 °C között.

A fertőzött sejttenyészeteket fehér háttér előtt nézzük. Ha a vizsgált sejttenyészetben vírus található, először átlátszó pöttyök jelennek meg a tenyészet rózsaszínes-matt hátterén. Ezt követően megnő a méret, kerek átlátszó telepeket - plakkokat képezve, amelyek jelenléte a rhabdovírusok jelenlétét jelzi a kóros anyagban.

Pasteur pipettával vegyen ki egy darabot a lepedékből az érintett és nem érintett részek határán, hogy ne csak az agarréteg, hanem a sejtréteg is benne legyen. A kiválasztott darabot 1 ml táptalajt tartalmazó kémcsőbe helyezzük, mínusz 20 °C-on lefagyasztjuk és 60 percig tartjuk. Nagyszámú plakk esetén (a teljes sejtréteg átlátszó) a vizsgálatokat 10 -3 és 10 -4 hígításban megismételjük.

Folyamatos EPC és FHM tenyészeten, 24-26°C-on inkubált 3-8 mm átmérőjű ponty rhabdovírus plakkok a 4-7. napon jelennek meg.

Plakkok hiányában és a sejttenyészetekben a CPD jelenléte esetén további vizsgálatokat végeznek vírustartalmú tenyészfolyadékon 10-2-10-3 hígításban (2-3 passzázs). További módszerek a vírusok azonosítására: fluoreszcens antitest módszer; a vírus kloroformra, éterre, pH-értékre, melegítésre való érzékenységének meghatározása; A vírusok morfológiájának elektronmikroszkópos vizsgálata.

Kutatás vírusos eredetű betegségek diagnosztizálására. Ez szükséges a vírus azonosításához, biológiájának, valamint az állati és emberi sejtek befolyásoló képességének tanulmányozásához. Így lehetővé válik a vírusos betegségek patogenezisének megértése, és ennek megfelelően a megfelelő kezelési módszer kiválasztása.

Mi a diagnózis?

Élő sejtekben. Tanulmányozásához kísérleti szervezet szintjén kell tenyészteni vagy Ehhez az orvosi gyakorlatban és általában a mikrobiológiában virológiai kutatási módszereket végeznek, amelyek a következő fő megközelítésekkel rendelkeznek:

• egyenes;
• közvetett;
• szerológiai.

Az anyag közvetlenül vizsgálható nukleinsavak, vírusantigén jelenlétére, vagy például a vírus izolálható és azonosítható klinikai anyagból.

A betegség etiológiájának megállapítása és a terápiás hatás nyomon követése mellett a virológiai kutatási módszerek fontos szerepet játszanak a járványellenes intézkedésekben. Az izoláláshoz csirkeembriókat, laboratóriumi állatokat vagy sejttenyészeteket használnak.

Hogyan kutatják?

A leggyorsabb a közvetlen módszer. Lehetővé teszi egy vírus, antigén vagy NA (nukleinsav) kimutatását magában a klinikai anyagban. Két órától egy napig tart.

1. EM - elektronmikroszkópia. Közvetlenül észleli a vírust.
2. IEM - immunelektronmikroszkópia. Vírusok elleni specifikus antitesteket használ.
3. RIF - immunfluoreszcens reakció. Festékhez kötött antitesteket használ. Az ilyen virológiai kutatási módszereket széles körben használják az ARVI (akut légúti vírusfertőzések) etiológiájának gyors megfejtésére, amikor ujjlenyomat-kenetet vesznek a felső légúti nyálkahártyáról.
4. ELISA - enzim-linked immunosorbent assay - vírus antigének meghatározása, hasonló a RIF-hez, de az antitestek enzimekkel történő jelölésén alapul.
5. RIA - radioimmunoassay. Az antitestek radioaktív jelölését alkalmazza, hogy nagy érzékenységet biztosítson a vírusantigén kimutatásában.
6. Molekuláris - NK hibridizáció vagy vírusgenomok izolálása PCR-rel (polimeráz láncreakció).
7. A citológiát ritkán alkalmazzák, de bizonyos fertőzések esetében ezek a virológiai kutatási módszerek nagyon hatékonyak. A festéshez és mikroszkóp alatti elemzéshez feldolgozott biopsziás anyagokat, boncolásokat és keneteket vizsgálják.

Mi a kutatás lényege?

A vírusok sikeres izolálása érdekében a klinikai anyagot a patogenezisnek megfelelően és a lehető legkorábban veszik. Ez a folyamat gyakran több átjárást igényel bizonyos virológiai kutatási módszerek alkalmazása előtt.

A mikrobiológia a mikroszkopikus lények tanulmányozása. És az ő területe nem csak az orvoslás. Alapvető tudomány a mezőgazdaság, az állatgyógyászat, az űr- és műszaki ipar, valamint a geológia számára.

De természetesen minden az embernek és az ő fejlődésének lett teremtve ezen a gyönyörű bolygón. Ezért nagyon fontos, hogy a veszélyt időben észleljük és semlegesítsük. A vírusok különböznek a baktériumoktól. Ezek olyan struktúrák, amelyek bejutnak a szervezetbe, és egy új generáció kialakulását idézik elő. Úgy néznek ki, mint a kristályok, és célja a szaporodási folyamat szabályozása, bár maguk nem táplálkoznak, nem nőnek és nem választanak ki anyagcseretermékeket.

A vírus bármely élő szervezetben, amelybe bejut, súlyos megbetegedést okozhat. Ráadásul fejlődhet. Ezért kell fejleszteni és javítani a mikrobiológiai virológiai kutatási módszereket, mivel az emberi civilizáció egésze veszélyben lehet.

Anyagok

A vírusok kimutatására és azonosítására az orvostudományban általában a következőket kell tenni:

• nasopharyngealis mosás (légúti fertőzések);
• kipirulás és széklet (enterovírusfertőzések);
• kaparék, hólyagok tartalma (bőrsérülések, nyálkahártyák, például herpesz, bárányhimlő);
• kipirulások (exantémális fertőzések, például kanyaró, rubeola);
• vér, cerebrospinális folyadék (arbovírus fertőzések).

Fázisok

A virológiai kutatási módszer minden szakasza magában foglalja:

• anyaggyűjtés;
• kiválasztás, tesztrendszer beszerzése, életképességének meghatározása;
• a tesztrendszer fertőzése;
• vírusjelzés;
• a vírus típusának meghatározása.

Alapvetően a patogén vírusok különböznek a szövetek jelenlétében és a típusspecifitásban. Vegyük például a poliovírust, amely csak főemlősökben (sejtjeikben) szaporodik. Ennek megfelelően egy specifikus szövettenyészetet használnak egy adott vírus izolálására. Ha ismeretlen kórokozóról beszélünk, akkor célszerű három, de még jobb esetben négy sejttenyészetet egyszerre megfertőzni.

Így talán egyikük érzékeny lesz. A vírus fertőzött tenyészetekben való jelenlétének meghatározásához specifikus sejtdegeneráció kialakulását, intracelluláris zárványokat, specifikus antigén azonosítását, pozitív hemagglutinációs és hemadszorpciós reakciókat vizsgálnak.

Minden virológiai kutatási módszert (közvetlen és közvetett, szerológiai) úgy kell kiválasztani, mint a legmegfelelőbbet az adott fertőzésgyanús esetre.

A közvetett módszerek a vírus izolálásán és azonosításán alapulnak. Munkaigényesek, időigényesek, de pontosak.

Serodiagnosis

Ez a diagnózis az antigén-antitest reakción alapuló módszerre vonatkozik. Leggyakrabban párosított vérszérumot használnak, amelyet néhány hetes időközönként vesznek. Ha az antitesttiter 4-szeresére vagy többre nő, a reakció pozitívnak tekinthető. A vírus típusspecifitásának meghatározásához vírussemlegesítési reakciót alkalmaznak. A csoportspecifitás meghatározásához komplementkötési reakciót kell elérni.

Az enzim immunoassay, a hemagglutinációs gátlási reakció, a passzív hemagglutináció, a fordított passzív hemagglutináció és a RIF különféle változatait széles körben használják. Még a génsebészetben is kidolgoztak egy módszert monoklonális antitestek előállítására. A monoklónok szűk specifitása leküzdhető több, különböző vírusdeterminánsok elleni monoklonális antitest alkalmazásával. Így az antigén kimutatási teszt specificitása és szenzitivitása nőtt.

Néhány funkció

Manapság számos különböző tesztrendszert hoztak létre a vírus élő szervezetbe való bejutása következtében fellépő fertőzések immunológiai diagnosztizálására.

A virológiai kutatási módszerek tehát a vírusok izolálására, tulajdonságaik tanulmányozására és bizonyos betegségekkel való etiológiai kapcsolatuk megállapítására szolgáló módszerek.

Tanfolyami munka

"A klinikai virológia módszerei"

Bevezetés

A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája elsősorban elektronmikroszkóppal, érzékeny sejttenyészetekkel és immunológiai módszerekkel történik. A vírusfertőzés stádiumától függően általában egy módszert választanak a diagnózis felállítására. Például mindhárom megközelítés hasznos lehet a varicella diagnosztizálásában, de a mikroszkópos és sejttenyésztési technikák sikeres alkalmazása attól függ, hogy a betegség viszonylag korai szakaszában sikerül-e kielégítő mintát venni.

A vírusdiagnosztika sikere nagymértékben függ a kapott minták minőségétől. Emiatt maguknak a laboratóriumi személyzetnek is közvetlenül részt kell venniük a szükséges minták gyűjtésében. A minták jellemzőit, valamint a laboratóriumba szállításukra vonatkozó módszereket Lennett, Schmidt, Christ et al.

A legtöbb laboratóriumi diagnosztikában használt reagens és műszer különböző cégektől megvásárolható. A legtöbb esetben ugyanazt a reagenst egyszerre több vállalat is gyártja. Emiatt nem jelöltünk meg egyedi vállalatokat, kivéve, ha a reagenst csak egy cég szállítja. Minden egyéb esetben a táblázatban feltüntetett általános beszállítói listára kell hivatkozni. 1.

Nem törekedtünk arra, hogy átfogó leírást adjunk az emberi vírusfertőzések diagnosztizálására jelenleg rendelkezésre álló összes módszerről. Mindenekelőtt a főbb módszereket jellemeztük. Az önálló munka során szerzett tapasztalatok megszerzésével ezek az alapvető technikák összetettebb problémák megoldására is használhatók.

1. Elektronmikroszkópia

A vírusfertőzések elektronmikroszkópos diagnosztizálására az érintett szövet vékony metszete használható. Az elektronmikroszkópiához leggyakrabban használt anyag széklet vagy folyadék.

1. táblázat A reagenseket és berendezéseket szállító cégek listája

Flow Laboratories: Gibco Europe: Szövettenyésztési Szolgáltatások: Wellcome Diagnosztika: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, DAIford UK Temple Hill, DAI UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 B Broad Street, Teddington, Middlesex Hillright TW11, Parasex Hill TW11 Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, Egyesült Királyság

vezikulák, amelyek bizonyos betegségekre, például bárányhimlőre jellemzőek. Az ilyen anyagok elemzésekor a vírusokat negatív festéssel lehet kimutatni, aminek eredményeként elektronsűrű anyag jelöli ki a virion komponenseit. A módszer akkor hatékony, ha a víruskoncentráció magas a vizsgálati mintákban, például a székletben vagy a hólyagos folyadékban. Azokban az esetekben, amikor a mintákban alacsony a vírusrészecskék tartalma, a vírus kimutatásának valószínűsége növelhető a vírus ultracentrifugálással történő koncentrálásával vagy specifikus antitestekkel történő aggregálásával. Ez utóbbi módszer a vírusok azonosítására is alkalmas. Itt ismertetjük a rotavírus fertőzés diagnosztizálásának elektronmikroszkópos módszerét és az immunelektronmikroszkópos módszert a parvovírusok elleni specifikus antitestek kimutatásának példáján. Az elektronmikroszkópos módszereket Field írja le részletesebben.

2.1 A széklet közvetlen elektronmikroszkópos vizsgálata

1. Merítse a Pasteur pipetta hegyét a székletbe, és szívjon fel annyi anyagot, hogy 1 cm-es kenetet kapjon.

2. Szuszpendálja újra a székletkenetet elektronmikroszkópos negatív kontrasztfestékben, amíg áttetsző szuszpenziót nem kap. A negatív kontrasztfesték foszfovolfrámsav 2%-os oldata desztillált vízben.

3. Elektronmikroszkópos minta készítéséhez a szuszpenzió egy cseppjét szénforma-filmmel bevont elektronmikroszkópos rácsra helyezzük. A művelet során a hálót egy vékony csipesszel tartják.

4. A gyógyszert 30 másodpercig levegőn hagyjuk.

5. A felesleges folyadékot az üveg szélének szűrőpapírral történő megérintésével távolítsuk el.

6. A drogot levegőn szárítjuk.

7. Ha szükséges, az életképes vírust a rács mindkét oldalának 440 000 μW-s/cm2 intenzitású ultraibolya fénnyel történő besugárzásával inaktiváljuk. Ebben az esetben szűrővel ellátott rövidhullámú ultraibolya lámpát használnak. A lámpának 15 cm távolságra kell lennie a rácstól; A besugárzási idő mindkét oldalon 5 perc.

8. A rotavírus virionok transzmissziós elektronmikroszkóp alatt jellemezhetők 30 000-50 000-es nagyítással.

2.2 Immunelektronmikroszkópia

Az alábbiakban ismertetett immunelektronmikroszkópos módszer csak egy a sok hasonló immunológiai módszer közül. A vírusspecifikus antitestek tanulmányozására ezen túlmenően olyan módszert is alkalmaznak, amely az A fehérje mikroszkopikus hálózatához kötődik. Az antivirális antitestek munkakoncentrációját próba és hiba alapján határozzák meg 1/10 és 1/1000 között. Az általunk jelzett koncentrációt általában a rutinmunkában használják. Az antitestek és a vírus közötti kölcsönhatás optimális eredményének elérése érdekében a parvovírust tartalmazó szérumot ugyanúgy titráljuk.

1. 10 µl humán parvovírus elleni antiszérumot 100-szorosra hígítunk PBS-sel. Az oldatot vízfürdőben 56 °C-ra melegítjük.

2. Olvasszunk fel 10 ml 2%-os agarózt PBS-ben a szokásos módon, és hűtsük le 56 °C-ra vízfürdőben.

3. 56 °C-on keverjen össze 1 ml hígított antiszérumot 1 ml 2%-os agarózzal.

4. Vigyen át 200 µl-t a kapott keverékből egy 96 lyukú mikrotiterlemez két mérőhelyébe.

5. Az agarózt hagyjuk szobahőmérsékleten megdermedni. A tabletta 4°C-on több hétig is eltartható, ha ragasztószalaggal le van zárva.

6. Adjon 10 µl parvovírust tartalmazó szérumot egy agaróz és antiszérum keverékét tartalmazó lyukba.

7. Egy csepp szérum kevésbé fényes oldalára egy elektronmikroszkópos rácsot helyezünk előre elkészített szén-formvar bevonattal.

8. A hálót 2 órán át 37 °C-on, nedves kamrában tartjuk.

9. Vékony csipesszel vegye ki a hálót, és csepegtessen egy csepp 2%-os foszfor-volfrámsavat a háló felületére, amely érintkezett a szérummal.

10. 30 másodperc elteltével a festékfelesleget lemossuk, a készítményt megszárítjuk és a vírust inaktiváljuk.

Az aggregált vírusrészecskéket transzmissziós elektronmikroszkóp alatt vizsgálják 30 000-50 000-es nagyítással.

3. Vírusantigének azonosítása

A szövetekben vagy szövetnedvekben található vírusok vírusspecifikus fehérjékkel azonosíthatók az antigén-antitest reakció segítségével. Az antigén-antitest reakció termékét olyan címkével szemben tesztelik, amelyet vagy közvetlenül vírusellenes antitestekbe, vagy vírusspecifikus antitestek elleni antitestekbe juttatnak be. Az antitestek jelölhetők fluoreszceinnel, radioaktív jóddal vagy olyan enzimmel, amely a szubsztrátot hasítja, ami színváltozást okoz. Ezenkívül a hemagglutinációs reakciót használják a vírus azonosítására. A mindennapi gyakorlatban az ismertetett módszereket elsősorban a hepatitis B vírus antigének vérből történő kimutatására, valamint a különböző légúti betegségeket okozó vírusok antigénjeinek felkutatására alkalmazzák.

Jelenleg számos cég készít vörösvérsejt-, radioaktív és enzimatikus diagnosztikát, köztük a hepatitis B vírus kimutatására szolgálókat is, amelyekkel végzett munkamódszereket nem tartjuk tanácsosnak felvázolni: elég betartani a mellékelt utasításokat. Az alábbiakban a nasopharyngealis váladékban lévő légúti syncytialis vírus azonosítására szolgáló immunfluoreszcens módszerre fogunk összpontosítani.

3.1 Légúti syncytialis vírus azonosítása nasopharyngealis váladékban immunfluoreszcenciával

A nasopharyngealis váladékkészítmények előállításának módszerét Gardner és McQuillin ismerteti. Laboratóriumi körülmények között ezt a műveletet két szakaszban hajtják végre. Először a nasopharyngealis nyálkahártya kenetét készítik elő egy üveglemezen. Az így kapott keneteket -20°C-on fixen több hónapig tárolhatjuk. A második szakaszban kenetet festenek a légúti syncytialis vírus antigénjének kimutatására. Erre a célra az indirekt immunfluoreszcencia módszerét alkalmazzák.

3.1.1 Orrgarat-váladék készítmények készítése

1. A speciális csipeszről származó nyálkát 1-2 ml PBS-sel lemossuk, és egy centrifugacsőbe visszük át.

2. Centrifugálja 10 percig 1500 fordulat/perc sebességgel asztali centrifugában.

3. A felülúszót lecsepegtetjük.

4. A sejtüledéket óvatosan újraszuszpendáljuk 2-3 ml PBS-ben, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ehhez használjon széles nyakú Pasteur pipettát.

5. A kapott szuszpenziót kémcsőbe visszük.

6. Adjon még 2-4 ml PBS-t a szuszpenzióhoz, és pipettázással keverje össze. A nagy nyálkahártya-rögöket eltávolítják.

7. Centrifugálja 10 percig 1500 fordulat/perc sebességgel asztali centrifugában.

8. A felülúszót elöntjük, az üledéket olyan térfogatú PBS-ben újraszuszpendáljuk, hogy a kapott szuszpenzió könnyen elválik a cső falától.

9. A kapott szuszpenziót egy megjelölt tárgylemezre visszük fel.

10. Az üveget levegőn szárítjuk.

Rögzítse acetonban 10 percig 4 °C-on.

12. Rögzítés után az üveget ismét levegőn szárítjuk.

13. A kapott készítményeket azonnal megfestik, vagy -20 °C-on tárolják.

3.1.2. Festési technika

1. Nyomtassa ki és hígítsa fel a kereskedelemben kapható RSV antiszérumot PBS-ben az ajánlott munkakoncentrációra.

2. Pasteur pipettával vigyen fel egy csepp antiszérumot az elkészített készítményre.

3. A gyógyszert nedves kamrába helyezzük.

4. A gyógyszert 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.

5. A mintákat óvatosan mossuk PBS-sel, hogy eltávolítsuk a felesleges antitesteket egy speciális tartályban.

6. A mintákat három műszakban PBS-sel mossuk, mindegyik 10 percig.

7. Szárítsa meg a mintákat, távolítsa el a felesleges PBS-t szűrőpapírral és szárítsa meg levegőn.

Virológiai kutatási módszerek— módszerek a vírusok biológiájának tanulmányozására és azonosítására. A virológiában széles körben alkalmazzák a molekuláris biológiai módszereket, amelyek segítségével sikerült megállapítani a vírusrészecskék molekuláris szerkezetét, a sejtbe való behatolásuk módszereit és a vírusszaporodás jellemzőit, a vírusos nukleinsavak és fehérjék elsődleges szerkezetét. Módszereket dolgoznak ki a virális nukleinsavak és fehérje aminosavak alkotóelemeinek szekvenciájának meghatározására. Lehetővé válik a nukleinsavak és az általuk kódolt fehérjék funkcióinak összekapcsolása a nukleotidszekvenciával, valamint a vírusfertőzés patogenezisében fontos szerepet játszó intracelluláris folyamatok okainak feltárása.

A virológiai kutatási módszerek ezenkívül immunológiai folyamatokon (antigén kölcsönhatása antitestekkel), a vírus biológiai tulajdonságain (hemagglutinációs képesség, hemolízis, enzimaktivitás), a vírus és a gazdasejt kölcsönhatásának sajátosságain (a citopátiás hatás jellege) is alapulnak. , intracelluláris zárványok kialakulása stb.) .

A vírusfertőzések diagnosztizálásában, a vírusok tenyésztésében, izolálásában és azonosításában, valamint vakcinakészítmények előállításában széles körben alkalmazzák a szövet- és sejttenyésztési módszert. Primer, másodlagos, stabil folyamatos és diploid sejttenyészeteket használnak. Az elsődleges tenyészeteket a szövet proteolitikus enzimekkel (tripszin, kollagenáz) történő diszpergálásával nyerik. A sejtek forrása emberi és állati embriók szövetei és szervei (általában veséi) lehetnek. A tápközegben lévő sejtszuszpenziót úgynevezett matracokba, palackokba vagy Petri-csészékbe helyezik, ahol az ér felszínéhez tapadva a sejtek szaporodni kezdenek. Vírusfertőzéshez általában sejt monoréteget használnak. A tápfolyadékot lecsepegtetjük, bizonyos hígításokban hozzáadjuk a vírusszuszpenziót, majd a sejtekkel való érintkezés után friss, általában szérum nélküli táptalajt adunk hozzá.

A legtöbb elsődleges tenyészet sejtjei továbbtenyészthetők, az ilyen tenyészetet másodlagos tenyészetnek nevezzük. A sejtek további áthaladásával a fibroblaszt-szerű sejtek populációja képződik, amely képes a gyors szaporodásra, amelyek többsége megtartja az eredeti kromoszómakészletet. Ezek úgynevezett diploid sejtek. A sejtek sorozatos tenyésztésével stabil, folyamatos sejttenyészeteket kapunk. A passzálások során heteroploid kromoszómakészlettel rendelkező, gyorsan osztódó homogén sejtek jelennek meg. A stabil sejtvonalak lehetnek egyrétegűek vagy szuszpenziósak. Az egyrétegű tenyészetek folyamatos réteg formájában nőnek az üvegfelületen, míg a szuszpenziós kultúrák különböző edényekben keverőeszközök segítségével szuszpenzió formájában. Több mint 400 sejtvonal létezik, amelyek 40 különböző állatfajból (beleértve a főemlősöket, madarakat, hüllőket, kétéltűeket, halakat, rovarokat) és az emberből származnak.

Az egyes szervek és szövetek darabjai (szervtenyészetek) mesterséges tápközegben tenyészthetők. Az ilyen típusú tenyészetek megőrzik a szöveti szerkezetet, ami különösen fontos a differenciálatlan szövettenyészetekben nem szaporodó vírusok (például koronavírusok) izolálásához és passzálásához.

A fertőzött sejttenyészetekben a vírusok kimutathatók a sejtmorfológiai változásokkal, a citopatikus hatásokkal, amelyek specifikusak lehetnek, a zárványok megjelenésével, a sejtben és a tenyésztőfolyadékban található vírusantigének meghatározásával; a vírusutódok biológiai tulajdonságainak megállapítása tenyészfolyadékban és a vírusok titrálása szövettenyészetben, csirkeembriókban vagy érzékeny állatokban; a sejtekben lévő egyedi virális nukleinsavak azonosításával molekuláris hibridizációval vagy nukleinsavak felhalmozódásával citokémiai módszerrel, fluoreszcens mikroszkóppal.

A vírusok izolálása munka- és időigényes folyamat. Ezt a lakosság körében keringő vírus típusának vagy változatának meghatározására végzik (például az influenzavírus szerovariánsának, a poliovírus vad vagy vakcinatörzsének azonosítására stb.); olyan esetekben, amikor sürgős járványügyi intézkedéseket kell tenni; amikor a vírusok új típusai vagy változatai jelennek meg; ha szükséges, erősítse meg az előzetes diagnózist; vírusok jelzésére a környezeti objektumokban. A vírusok izolálásakor figyelembe veszik az emberi szervezetben való fennmaradásuk lehetőségét, valamint két vagy több vírus által okozott vegyes fertőzés előfordulását. Az egy virionból nyert, genetikailag homogén víruspopulációt vírusklónnak, a megszerzésének folyamatát pedig klónozásnak nevezzük.

A vírusok izolálására fogékony laboratóriumi állatok és csirkeembriók fertőzését, de leggyakrabban szövettenyészetet alkalmaznak. A vírus jelenlétét általában specifikus sejtdegeneráció (citopátiás hatás), szimplasztok és syncytia képződése, intracelluláris zárványok kimutatása, valamint immunfluoreszcenciával, hemadszorpcióval, hemagglutinációval (hemagglutináló vírusoknál) stb. kimutatott specifikus antigén határozza meg. . Ezeket a tüneteket csak a vírus 2-3 átjutása után lehet észlelni.

Csirkeembriókat használnak számos vírus, például influenzavírusok izolálására, újszülött egereket pedig néhány Coxsackie vírus és számos arbovírus izolálására. Az izolált vírusok azonosítása szerológiai reakciókkal és egyéb módszerekkel történik.

A vírusokkal végzett munka során meghatározzák a titerüket. A vírusok titrálását általában szövettenyészetben végzik, meghatározva a vírustartalmú folyadék legmagasabb hígítását, amelynél szöveti degeneráció következik be, zárványok és vírusspecifikus antigének képződnek. A plakk módszer számos vírus titrálására használható. A plakkok vagy negatív vírustelepek a vírus által egyrétegű szövettenyészetben agar bevonat alatt elpusztított sejtek gócai. A telepszámlálás lehetővé teszi a vírusok fertőző aktivitásának kvantitatív elemzését azon az alapon, hogy egy fertőző vírusrészecske egy plakkot képez. A plakkokat a tenyészet intravitális színezékekkel, általában semleges vörössel való megfestésével mutatják ki; a plakkok nem adszorbeálják a festéket, ezért világos foltokként láthatók a megfestett élő sejtek hátterében. A vírustitert a plakkképző egységek 1-re jutó számában fejezzük ki ml.

A vírusok tisztítását és koncentrálását általában differenciált ultracentrifugálással, majd koncentrálási vagy sűrűséggradiens centrifugálással hajtják végre. A vírusok tisztítására immunológiai módszereket, ioncserélő kromatográfiát, immunszorbenseket stb.

A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája magában foglalja a kórokozó vagy összetevőinek kimutatását a klinikai anyagokban; a vírus izolálása ebből az anyagból; szerodiagnózis. A laboratóriumi diagnosztikai módszer kiválasztása minden esetben a betegség természetétől, a betegség időtartamától és a laboratórium képességeitől függ. A vírusfertőzések korszerű diagnosztikája olyan expressz módszerekre épül, amelyek a betegséget követő korai stádiumban a klinikai anyag felvétele után több órával választ adnak, ide tartozik az elektron- és immunelektron-mikroszkópia, valamint az immunfluoreszcencia, a molekuláris hibridizációs módszer. , IgM osztályú antitestek kimutatása stb.

A negatívan festett vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vírusok megkülönböztetését és koncentrációjuk meghatározását. Az elektronmikroszkópia alkalmazása a vírusfertőzések diagnosztizálásában azokra az esetekre korlátozódik, amikor a vírusrészecskék koncentrációja a klinikai anyagban meglehetősen magas (10 5: 1 mlés magasabb). A módszer hátránya, hogy nem lehet megkülönböztetni az azonos taxonómiai csoportba tartozó vírusokat. Ezt a hiányosságot immunelektronmikroszkóppal orvosolják. A módszer immunkomplexek képzésén alapul, specifikus szérum hozzáadásával a vírusrészecskékhez, miközben a vírusrészecskéket egyidejűleg koncentrálják, lehetővé téve azok azonosítását. A módszert antitestek kimutatására is használják. Expressz diagnosztikai célokra szövetkivonatok, széklet, hólyagokból származó folyadék és a nasopharynx váladékának elektronmikroszkópos vizsgálatát végzik. Az elektronmikroszkópiát széles körben használják a vírus morfogenezisének tanulmányozására, képességeit jelölt antitestek használatával bővítik.

A vírusspecifikus nukleinsavak kimutatásán alapuló molekuláris hibridizációs módszer lehetővé teszi a gének egyetlen kópiájának kimutatását, és érzékenységében nincs egyenlő. A reakció a komplementer DNS vagy RNS szálak (próbák) hibridizációján és kétszálú struktúrák kialakításán alapul. A legolcsóbb próba a klónozott rekombináns DNS. A szondát radioaktív prekurzorokkal (általában radioaktív foszforral) jelölték. A kolorimetriás reakciók alkalmazása ígéretes. A molekuláris hibridizációnak több lehetősége van: spot hibridizáció, blot hibridizáció, szendvics hibridizáció, in situ hibridizáció stb.

Az IgM osztályú antitestek korábban megjelennek, mint a G osztályúak (a betegség 3-5. napján), és néhány hét múlva eltűnnek, így kimutatásuk friss fertőzésre utal. Az lgM osztályba tartozó antitesteket immunfluoreszcenciával vagy enzim immunoassay-vel mutatják ki anti-m antiszérum (az lgM nehéz láncai elleni szérum) felhasználásával.

A virológia szerológiai módszerei a klasszikus immunológiai reakciókon alapulnak (lásd. Immunológiai kutatási módszerek ): komplement rögzítési reakciók, hemagglutináció gátlás, biológiai neutralizáció, immundiffúzió, indirekt hemagglutináció, radiális hemolízis, immunfluoreszcencia, enzim immunoassay, radioimmunoassay. Számos reakcióhoz kifejlesztettek mikromódszereket, és technikáikat folyamatosan fejlesztik. Ezeket a módszereket a vírusok azonosítására használják ismert szérumok segítségével, valamint szerodiagnosztikára, hogy meghatározzák az antitestek növekedését a második szérumban az elsőhöz képest (az első szérumot a betegség utáni első napokban, a másodikat 2 3 hét). A diagnosztikai érték nem kevesebb, mint az antitestek négyszeres növekedése a második szérumban. Ha az IgM osztályba tartozó antitestek kimutatása a közelmúltban történt fertőzésre utal, akkor az IgC osztályú antitestek több évig, sőt néha élethosszig is fennmaradnak.

A vírusok egyedi antigénjeinek és az ellenük lévő antitesteknek komplex keverékekben történő azonosítására a fehérjék előzetes tisztítása nélkül immunoblotot alkalmaznak. A módszer a fehérje frakcionálást poliakrilamid gélelektroforézissel kombinálja a fehérjék ezt követő immunindikációjával az enzim immunoassay módszerrel. A fehérje elválasztás csökkenti az antigén kémiai tisztaságára vonatkozó követelményeket, és lehetővé teszi az egyedi antigén-antitest párok azonosítását. Ez a feladat például a HIV-fertőzés szerodiagnózisában releváns, ahol az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati reakciókat a sejtes antigének elleni antitestek jelenléte okozza, amelyek a vírusfehérjék elégtelen tisztítása következtében jelennek meg. A páciens szérumában a belső és külső vírusantigénekkel szembeni antitestek azonosítása lehetővé teszi a betegség stádiumának, a populációk elemzésekor pedig a vírusfehérjék variabilitásának meghatározását. A HIV-fertőzés immunoblot-vizsgálatát megerősítő tesztként használják az egyes vírusantigének és az azokkal szembeni antitestek azonosítására. A populációk elemzésekor a módszert a vírusfehérjék variabilitásának meghatározására használják. A módszer nagy értéke abban rejlik, hogy lehetőség nyílik a rekombináns DNS technológiával szintetizált antigének elemzésére, méretük és antigéndeterminánsok jelenlétének megállapítására.

Egyre fontosabbak a virológiai vizsgálatok a fertőző betegségek klinikáján, ami elsősorban a vírusos jellegű fertőzések növekvő arányának köszönhető, amelyek klinikai képe nem mindig jellemző. Ugyanakkor nem minden fertőző betegségre dolgoztak ki gyors és megbízható virológiai diagnosztikai módszereket, sokuk munkaigényes, speciális körülményeket, kísérleti állatokat, táptalajt és képzett személyzetet igényel. Jelenleg 3 fő kutatási típust alkalmaznak a vírusfertőzések diagnosztizálására.
1. Fertőző anyag mikroszkópos vizsgálata a vírusantigén vagy a szövetekben bekövetkező patognomonikus változások azonosítására. Diagnosztikai célból a betegek fertőző anyagának közvetlen mikroszkópos vizsgálatát korlátozott számú vírusfertőzés esetén (veszettség, bárányhimlő, sárgaláz, herpesz stb.) alkalmazzák. Elterjedtebbé vált a vírusantigén fluoreszcens antitestek segítségével történő kimutatásán alapuló módszer. Az immunfluoreszcens módszer csak akkor lehet megbízható, ha minden műszaki követelményt szigorúan betartanak.
2. Virológiai módszerek.
3. Szerológiai vizsgálatok az antitesttiter növekedésének meghatározására a betegség során. A szerológiai kutatási módszerek jobban hozzáférhetők laboratóriumi körülmények között.
Ezekhez a vizsgálatokhoz vérszérum vétele szükséges a betegség akut periódusában és a lábadozás időszakában (páros szérum). A szerológiai vizsgálatokhoz szükséges vérmintákat sterilen, antikoagulánsok és tartósítószerek nélkül veszik.
A virológiai kutatások fő állomásai a vírusok izolálása, azonosítása, valamint az alapvető biológiai tulajdonságok jellemzése. Jelenleg nincs egységes módszer a vírusok különböző csoportjainak izolálására. Ennek oka elsősorban tulajdonságaik sokfélesége és a gazdaszervezeten kívüli termesztés sajátosságai. A kutatáshoz bioszubsztrátokat használnak (nyálkahártyák lemosása, vér és alkotórészei, agy-gerincvelői folyadék, vizelet és széklet, boncolás során vett szervek és szövetek biopsziái vagy azok darabjai), amelyeket speciális feldolgozásnak vetnek alá, majd az anyagot átengedik. A kutatásra vett anyagot -20 °C és -70 °C közötti hőmérsékleten kell tárolni. Az előzetes diagnózistól függően az anyag feldolgozásának megvannak a maga sajátosságai, de minden esetben azt feltételezik, hogy a nyálkaszennyeződésektől, a szervek és szövetek sejtjeitől vagy azok töredékeitől, baktériumoktól maximálisan megtisztított szubsztrátot kapnak. Ezt úgy érik el, hogy a vizsgált anyagot speciális berendezésben homogenizálják, vagy porcelánmozsárban hidegen kvarcüveggel (szervek és szövetek darabjai) sterilre hűtött (+4 C) 0,9 hozzáadásával őrlik. %

nátrium-klorid oldatot, amíg 10-30%-os szuszpenziót nem kapunk, majd centrifugáljuk 1500-3000 fordulat/perc mellett 10-15 percig. Az így kapott felülúszó folyadékot további kutatásokhoz használjuk fel.
A szövet- és sejttenyésztési módszer intenzív fejlesztése és elterjedt gyakorlatba való bevezetése előtt kísérleti állatok vagy csirkeembriók fertőzését alkalmazták. Ezeket a módszereket ma is alkalmazzák. A vírusok állatok felhasználásával történő kimutatása a legmegfelelőbb olyan esetekben, amikor egy kísérlet során lehetőség nyílik egy fertőző betegség tipikus képének vagy egyedi megnyilvánulásainak reprodukálására. Így az arbovírusok és a Coxsackie csoportjába tartozó kórokozók kimutathatók szopós egerek agyának fertőzésével, az influenza csirkeembriók fertőzésével vagy a vizsgálati anyag egereknek történő intranazális beadásával. Az elmúlt években a virológiai laboratóriumok a legszélesebb körben alkalmazták a sejt- és szövettenyésztési módszert, amely lehetővé teszi adenovírusok, herpeszvírusok, légúti syncytialis vírusok, myxovírusok és mások izolálását, valamint a betegség etiológiai diagnózisának első lépésben történő elvégzését. a tanulmány szakaszai. Ennek alapja a legtöbb vírus és sejt kölcsönhatásának jól tanulmányozott citológiai jellemzői. Így a HeLa, Hep-2 sejtek 2-es típusú adenovírust tartalmazó anyaggal való fertőzése már a 3. napon az egyrétegű sejt növekedési mintázatának megváltozásához, tipikus sejtek szőlőfürt formájában stb. , jól meghatározható a szokásos fénymikroszkópban kis nagyítás mellett.
A fertőző betegségek etiológiai diagnózisa szempontjából kivételes jelentőségű a vizsgált anyagból történő vírusizolálás szabványosítása, amely a munka ezen szakaszában genetikailag tiszta lineáris állatok felhasználásával jár, figyelembe véve azok fenotípusos (elsősorban életkori) jellemzőit. Ez elsősorban annak köszönhető, hogy a különböző genetikai vonalú és korú kísérleti állatok különböző mértékben érzékenyek a vírusokra. Így egerek intracerebrális fertőzése során az influenzavírus neurotróp WSN törzsével a BALB/c, A, CBA és outbred vonal állatok érzékenysége volt a legnagyobb, ugyanez a minta alakult ki a teszt intranazális beadása esetén is. anyag. A vírusizolálás végeredménye szempontjából elengedhetetlen az állatok, csirkeembriók, sejt- és szövettenyészetek előzetes vizsgálata látens vírushordozás szempontjából. A laboratóriumi gyakorlatban igen elterjedt csirkeembriók fertőződhetnek madárleukémia, madárencephalomyelitis, fertőző arcüreggyulladás, psittacosis, Newcastle-kór, bizonyos bakteriális fertőzések (paratífusz láz stb.) vírusaival, valamint mycoplasmával. . Még több bakteriális és különösen vírusos ágens képes spontán módon megfertőzni sejt- és szövettenyészeteket, és túlélni azokban. Jelenlétük jelentősen befolyásolja a vizsgált anyag értékelését. A mikoplazmák bizonyos típusai a sejttenyészetben
hemagglutinációt és hemadszorpciót okozhat, sőt az agar bevonata alatt a vírusok által képzett plakkokhoz hasonló plakkokat is képezhet. Szintén nem kis jelentőségű az egyik típusú sejttenyészetek másokkal való szennyeződése, ez leggyakrabban a HeLa sejtekhez kötődik, és akkor figyelhető meg, ha különböző típusú kultúrákkal dolgozunk ugyanabban a helyiségben, amikor a laboratóriumi üvegedényeket rosszul dolgozzák fel, stb. a sejttenyészetek szennyeződése vagy az állatok bakteriális ágensekkel való fertőzése, mint például Általában elég egyértelműen megnyilvánul (egy sejtréteg növekedési mintájának megváltozása, a táptalaj tulajdonságai, csirkeembriók vagy állatok elhullása bizonyos tünetekkel stb.), és nem okoz különösebb nehézséget az eredmények értékelésében. Bonyolultabb a helyzet a fertőzés látens formáival, ahol szerológiai és egyéb módszerek alkalmazása szükséges. Ezeket az utasításokat figyelembe kell venni a virológus munkájában, különösen a betegség tisztázatlan eseteinek etiológiai diagnózisa során.