Gatunek – zbiór mikroorganizmów, które mają wspólne pochodzenie ewolucyjne, podobny genotyp (wysoki stopień homologii genetycznej, zwykle powyżej 60%) i możliwie najbliższe cechy fenotypowe. Szczep to wyizolowana kultura danego rodzaju bakterii („konkretna próbka danego gatunku”). Kolonia to widoczna dla oka izolowana struktura, powstała w wyniku rozmnażania i gromadzenia się mikroorganizmów przez określony okres inkubacji oraz z z jednej komórki macierzystej lub z kilku identycznych komórek.

Metody diagnostyki laboratoryjnej Ø Mikroskopowe – wykrywanie m/o bezpośrednio w materiale klinicznym Ø Bakteriologiczne – wykrywanie m/o poprzez zaszczepienie materiału na pożywce Ø Biologiczne – izolacja m/o od wcześniej zakażonego zwierzęcia laboratoryjnego Ø Serologiczne – wykrywanie swoiste przeciwciała odpornościowe w surowicy krwi pacjenta Ø Alergiczny – wykonywanie alergicznych testów skórnych (wysokospecyficznych – gruźlica, tularemia itp.)

Ø Kulturowy - charakter wzrostu mikroorganizmu na pożywkach. Ø Biochemiczny - zdolność do fermentacji różnych substratów (węglowodanów, białek i aminokwasów itp.), W celu tworzenia różnych produktów biochemicznych w procesie życia ze względu na aktywność różnych układów enzymatycznych i cechy metaboliczne. Ø Antygenowe - zależą głównie od składu chemicznego i struktury ściany komórkowej, obecność wici, kapsułek, rozpoznawane są na podstawie zdolności makroorganizmu (żywiciela) do wytwarzania przeciwciał i innych form odpowiedzi immunologicznej, wykrywane są w reakcjach immunologicznych.

Fizjologiczne - sposoby odżywiania się węglowodanami (autotrofy, heterotrofy), azotem (aminoautotrofy, aminoheterotrofy) i innymi rodzajami odżywiania, rodzaje oddychania (tlenowce, mikroaerofile, fakultatywne beztlenowce, ścisłe beztlenowce). Ø Mobilność i rodzaje ruchu. Ø Zdolność do tworzenia zarodników, natura zarodników. Ø Wrażliwość na bakteriofagi, typowanie fagowe. Ø Skład chemiczny ścian komórkowych – podstawowe cukry i aminokwasy, skład lipidów i kwasów tłuszczowych. Ø Widmo białek (profil polipeptydowy). Ø Ø Wrażliwość na antybiotyki i inne leki. Ø Genotypowe (stosowanie metod genosystemowych).

Metoda bakteriologiczna polega na posianiu materiału klinicznego na sztuczne pożywki, wyizolowaniu czystych kultur drobnoustrojów i ich późniejszej identyfikacji.

Metody bakteriologiczne stosuje się: w diagnostyce chorób zakaźnych; Ш Podczas badań profilaktycznych na obecność bakterii jelitowych, prątków błonicy itp.; Ш przy badaniu stanu sanitarno-higienicznego obiektów środowiska (woda, powietrze, gleba, żywność itp.) i badaniu ich według wskazań epidemiologicznych pod kątem skażenia patogennymi gatunkami mikroorganizmów. Cii

Charakterystyka fizjologiczna Zależność od temperatury Oddychanie Odżywianie Enzymy Metabolizm białek i aminokwasów (żelatynaza, kolagenaza, dekarboksylaza, ureaza) Inne enzymy (hemolizyny, lipazy, lecytynaza, DNaza) Końcowe produkty metabolizmu (chromatografia) Oporność/wrażliwość na AMP

Pierwiastki, które są przede wszystkim niezbędne do wzrostu mikroorganizmów i które muszą znajdować się w pożywce, określa się na podstawie składu chemicznego komórek drobnoustrojów, który w zasadzie jest taki sam we wszystkich organizmach żywych. Większość całkowitej masy komórek stanowi woda (80–90%), a tylko 10–20% to sucha masa. Na podstawie ich ilościowej zawartości w suchej masie wyróżnia się makro- i mikroelementy. Do tych pierwszych zaliczamy: węgiel, tlen, azot, wodór, siarkę, fosfor, potas, sód, magnez, wapń, żelazo. Do mikroelementów zalicza się mangan, molibden, cynk, miedź, kobalt itp., z których większość jest potrzebna w śladowych ilościach. Z tego powodu mikroelementy nie są dodawane do składu wielu pożywek, gdyż zapotrzebowanie na nie można zaspokoić dzięki zanieczyszczeniom w solach makroelementów. Ponadto nie wszystkie mikroorganizmy wymagają mikroelementów. 14

W przeciwieństwie do organizmów zwierzęcych i roślinnych, mikroorganizmy charakteryzują się różnorodnością typów składników odżywczych, które rozróżnia się według trzech głównych kryteriów – źródła węgla, źródła energii i donora elektronów (wodoru). W zależności od charakteru źródła węgla wszystkie mikroorganizmy dzielą się na 2 duże grupy – autotrofy, które wykorzystują dwutlenek węgla i heterotrofy, które do wzrostu i rozmnażania potrzebują gotowych substancji organicznych. Biorąc pod uwagę różnorodność źródeł energii i donorów elektronów, grupy te dzieli się na podgrupy, co daje 8 rodzajów odżywiania się mikroorganizmów. Każdy rodzaj żywienia jest charakterystyczny dla określonych mikroorganizmów i odzwierciedla ich właściwości fizjologiczne i biochemiczne. Większość mikroorganizmów, w tym patogennych, prowadzi taki sposób odżywiania, w którym substancje organiczne są źródłem węgla, energii i donorów elektronów. 16

Zapotrzebowanie mikroorganizmów na źródła węgla organicznego jest bardzo zróżnicowane. Niektóre gatunki są „wszystkożerne” i mogą spożywać substancje o różnym charakterze chemicznym, inne zaś są bardziej selektywne i korzystają tylko z niektórych z nich. Specyfika zespołu związków organicznych charakterystycznych dla każdego rodzaju mikroorganizmów uwzględniana jest przy tworzeniu selektywnych i różnicujących podłoży diagnostycznych, szeroko stosowanych w mikrobiologii sanitarnej i klinicznej do szybkiej identyfikacji określonych grup mikroorganizmów. Wybierając podłoże zawierające węgiel, należy wziąć pod uwagę, że strawność substancji organicznych w dużej mierze zależy od ich właściwości - rozpuszczalności, stopnia utlenienia atomów węgla, konfiguracji przestrzennej i polimeryzacji ich cząsteczek. Mikroorganizmy zazwyczaj asymilują pewne izomery optyczne – cukry należące do serii D, aminokwasy – do serii L. Bardzo niewiele mikroorganizmów posiada enzymy przekształcające jeden izomer optyczny w inny. Biopolimery takie jak skrobia, polisacharydy, białka, tłuszcze mogą być wykorzystywane jedynie przez mikroorganizmy syntetyzujące określone enzymy hydrolityczne – amylazy, proteazy, lipazy w postaci egzoenzymów, czyli enzymów wydzielanych przez komórkę do środowiska. 17

Dla zdecydowanej większości mikroorganizmów heterotroficznych głównymi, łatwo dostępnymi źródłami węgla i energii są węglowodany, aminokwasy, białka i kwasy organiczne. Charakteryzując zapotrzebowanie mikroorganizmów na źródła węgla organicznego, należy zauważyć, że największy stopień heterotrofii jest nieodłączny od mikroorganizmów chorobotwórczych, które przystosowały się do życia w organizmie ludzi i zwierząt. Skład pożywek do ich uprawy jest szczególnie złożony. Zawierają białka lub produkty ich płytkiej hydrolizy (peptydy), witaminy, fragmenty kwasów nukleinowych itp. Do przygotowania takich pożywek wykorzystuje się różnego rodzaju hydrolizaty i ekstrakty mięsa, krwi lub surowicy, drożdże, ekstrakty roślinne i wiele innych. . Podłoża te nadają się do hodowli szerokiej gamy gatunków i są szczególnie przydatne w przypadkach, gdy zapotrzebowanie drobnoustroju na czynniki wzrostu nie jest znane lub gdy wymaga jednoczesnego stosowania wielu czynników wzrostu. Wadą takich mediów jest złożoność lub niemożność uzyskania ich standaryzacji ze względu na niestandardowy charakter i ograniczoną możliwość kontroli składu i właściwości surowca. 18

Konstruktywny metabolizm mikroorganizmów w ogóle ma na celu syntezę czterech głównych typów biopolimerów – białek, kwasów nukleinowych, polisacharydów i lipidów. W biosyntezie białek i kwasów nukleinowych najważniejszym pierwiastkiem, obok węgla, jest azot. Najbardziej dostępnym źródłem azotu dla większości mikroorganizmów są jony amonowe, które mogą one pozyskać z soli kwasów organicznych i nieorganicznych, aminokwasów, białek i innych substancji zawierających azot. Duża grupa bakterii, głównie chorobotwórczych, jako źródła azotu wymaga substancji organicznych zawierających azot. Jeżeli aminokwasy są takim źródłem azotu, mikroorganizmy mogą je wykorzystać bezpośrednio do syntezy białek lub mogą je najpierw zdeaminować, a uwolnione w procesie grupy aminowe wykorzystać do syntezy własnych aminokwasów i białek. 19

Jednakże wzrost niektórych mikroorganizmów wymaga pewnych aminokwasów, których same nie są w stanie syntetyzować. Do mikroorganizmów wymagających takich „niezbędnych” aminokwasów zalicza się Staphylococcus aureus, paciorkowce hemolityczne, bakterie kwasu mlekowego i kilka innych. W zależności od cech fizjologicznych drobnoustrojów liczba „niezbędnych” aminokwasów jest różna – w przypadku Staphylococcus aureus w pożywce wymagany jest jedynie tryptofan i cystyna, a w przypadku paciorkowców hemolizujących – 17 aminokwasów. Białka, jako źródła azotu, są dostępne tylko dla tych mikroorganizmów, które tworzą enzymy proteolityczne uwalniane do pożywki (tj. w formie egzo). Pod wpływem tych enzymów białka rozkładają się na substancje o mniejszej masie cząsteczkowej – peptony i aminokwasy. 20

Metabolizm energetyczny mikroorganizmów, podobnie jak metabolizm konstruktywny, charakteryzuje się różnorodnymi mechanizmami biochemicznymi. Istnieją trzy główne typy tego metabolizmu - oddychanie tlenowe, oddychanie beztlenowe i fermentacja, z których najczęstszym jest oddychanie tlenowe. W procesie tym materia organiczna utlenia się do dwutlenku węgla i wody przy maksymalnym uwolnieniu energii zawartej w tej substancji. Wiele mikroorganizmów oddychających tlenowo to tlenowce ścisłe, ale niektóre z nich to tlenowce fakultatywne, ponieważ mogą tworzyć ATP w warunkach beztlenowych - poprzez fermentację. Niektóre mikroorganizmy, głównie bakterie, pozyskują energię poprzez oddychanie beztlenowe, czyli w wyniku utleniania substancji, gdzie akceptorami elektronów pełnią związki nieorganiczne, a nie tlen. Zatem niektóre gatunki z rodzaju Bacillus i E. coli przeprowadzają oddychanie beztlenowe, podczas którego azotany (NO 3) są redukowane do amoniaku; Clostridium aceticum utlenia wodór cząsteczkowy przy użyciu dwutlenku węgla jako akceptora elektronów. 21

Najprostszym rodzajem metabolizmu energetycznego jest fermentacja. Procesy fermentacji zachodzą w warunkach beztlenowych i towarzyszy im wydzielanie energii. Głównym substratem fermentacji są węglowodany, ale bakterie mogą fermentować kwasy organiczne, w tym aminokwasy, a także puryny i pirymidyny. Istnieje wiele rodzajów fermentacji, z których każda jest wywoływana przez specjalną grupę mikroorganizmów i zgodnie z mechanizmem towarzyszy jej powstawanie określonych produktów końcowych. Końcowymi produktami fermentacji są zazwyczaj różne kwasy organiczne - mlekowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy itp., a także alkohole (etylowy, butylowy, propylowy), dwutlenek węgla i wodór. Na podstawie wydajności głównego produktu końcowego wyróżnia się odpowiednie rodzaje fermentacji. Ze względu na to, że podczas fermentacji nie następuje całkowite utlenienie substratu, a do środowiska uwalniane są częściowo utlenione substancje, które nadal zawierają energię – kwasy organiczne, alkohole itp., całkowity uzysk ATP w tym procesie z 1 mola przefermentowanego substrat jest znaczny (~30 razy) jest niższy niż podczas metabolizmu tego samego substratu w procesach oddychania. 22

Szczególna rola przypada Robertowi Kocha. Postulując potrzebę wyizolowania czystej kultury drobnoustroju, określił tym samym potrzebę stworzenia warunków do rozwiązania tego problemu. Najważniejszym z nich była pożywka, na której mikroorganizm mógł rosnąć. Nazwa Kocha związana jest z wprowadzeniem pożywek stałych do praktyki mikrobiologicznej w 1881 roku. Sam pomysł ich zastosowania zrodził się już wcześniej i należy do niemieckiego badacza Bredfelda. Co więcej, już w 1877 roku Schröter hodował bakterie na plasterkach ziemniaków, co również można interpretować jako wykorzystanie pożywki. Zasługą Kocha jest jego głębokie naukowe podejście do problemu i szerokie wykorzystanie pożywek we własnych badaniach. Zaproponował także pierwszy utwardzacz – żelatynę, jako składnik gęstego medium. 25

Agar-agar, znany współczesnym mikrobiologom, został wprowadzony do codziennej praktyki przez Frosta znacznie później, w 1919 r., choć warto przypomnieć, że już w 1881 r. niemiecki badacz Hesse zaproponował agar-agar. Co więcej, w 1913 roku rosyjski mikrobiolog V.L. Omelyansky, składając hołd pożywkom z żelatyną, zauważył, że pożywki agarowe są preferowane w przypadkach, gdy drobnoustrój upłynnia żelatynę. Idee i działania praktyczne Kocha uległy intensywnemu rozwojowi pod koniec XIX i pierwszej ćwierci XX wieku. To właśnie w tym okresie badacze z wielu krajów zaproponowali pożywki o różnym przeznaczeniu, których rola w mikrobiologii praktycznej była i pozostaje bardzo znacząca. Współczesny mikrobiolog w swojej pracy na co dzień pamięta ich imiona. W ciągu tych kilku lat Japończyk z pochodzenia Sh. Endo zaproponował swój agar do różnicowania enterobakterii, Austriak E. Lowenstein zaproponował podłoże dla prątków, a Anglik A. Mak. Konki – selektywne i różnicujące podłoże do diagnostyki mikroorganizmów jelitowych, niemiecki T. Kitt i włoski D. Tarozzi – podłoże dla bezwzględnych bakterii beztlenowych, Francuz R. Sabouraud, Czech F. Chapek i Amerykanin A. Dox – podłoże dla grzybów, Brazylijczyk R. Hottinger – pożywki ogólnego przeznaczenia na bazie trawienia mięsa itp. 26

Wymagania ogólne Skład wszystkich elementów budowy komórki drobnoustroju Wystarczająca wilgotność Zapewnienie izotonii Określone stężenie jonów wodorowych Potencjał oksydacyjno-redukcyjny Sterylność

Główne fazy wzrostu kultury okresowej: początkowa (opóźnienie) - 1, wykładnicza (lub logarytmiczna) - 2, stacjonarna - 3, umierająca - 4 (ryc. 12) Ryc. 12. Główne fazy wzrostu populacji drobnoustrojów na płynnych pożywkach.

Charakter wzrostu mikroorganizmów na płynnych pożywkach Ø Ø Ø Wzrost bakterii przy równomiernym zmętnieniu pożywki, której kolor nie zmienia się lub zmienia się zgodnie z barwą rozpuszczalnego w wodzie pigmentu powstałego w kulturze drobnoustrojów; Rozrost bakterii na dnie – tworzenie się osadu (skąpego lub obfitego, kruchego, jednorodnego, włóknistego itp.); Wzrost ciemieniowy przy zachowaniu przezroczystości pożywki; Powierzchowny rozwój bakterii – film na powierzchni podłoża (cienki, delikatny, bezbarwny lub wilgotny, gruby, dobrze widoczny gołym okiem, gęsty, suchy, z pomarszczoną, czasem brodawkowatą powierzchnią); Kolor błony, podobnie jak pożywki, zależy od pigmentu wytwarzanego przez rosnącą kulturę drobnoustrojów.

Charakter wzrostu mikroorganizmów na półpłynnej pożywce. Hodowlę testową wysiewa się w kolumnie zawierającej 0,2 - 0,5% półpłynnego agaru. Określa się zdolność drobnoustroju do przemieszczania się – rozprzestrzeniania się z miejsca zaszczepienia (wstrzyknięcia) do środowiska poprzez wstrzyknięcie w bezpośrednie sąsiedztwo ścianki probówki.

Podłoże diagnostyczne Endo Differential Skład: Baza – agar odżywczy Differential. czynnik – laktoza Wskaźnik – fuksyna zasadowa, odbarwiona siarczynem sodu Wzrost laktozy + kolonie koloru czerwonego z metalicznym połyskiem

Pożywka Ploskireva Selektywna, diagnostyka różnicowa Skład: Baza – agar odżywczy Czynnik selektywny – sole żółciowe, zieleń brylantowa, jod Dyferencjał. czynnik – laktoza Wskaźnik – czerwień neutralna Wzrost laktozy + kolonie w kolorze borówki brusznicy

Agar solny Podłoże selektywne Skład: Baza – agar odżywczy Czynnik selektywny – sól 10% Wskaźnik – brak Wzrost kolonii odpornych na sól

Agar żółtkowo-solny (Chistovich) Elekcyjny, diagnostyczny Skład: Baza – agar odżywczy Czynnik wybieralny – sól 10% Różn. czynnik – żółtko jaja Wskaźnik – nie Wzrost kolonii odpornych na sól + zmętnienie wokół kolonii na skutek działania lecytowitellazy

Podłoże tetrationianowe Muellera-Kaufmanna Podłoże przeznaczone jest do selektywnego wzbogacania w detekcję bakterii z rodzaju Salmonella Skład: Baza - bulion pożywny Czynnik selektywny - sól kwasu selenowego Wskaźnik - brak Wzrost bakterii opornych na kwas selenowy sodu

Bulion solny Podłoże do wyboru Skład: Baza – bulion odżywczy Czynnik do wyboru – 6,5% Na. Wskaźnik Cl – brak. Wzrost mikroorganizmów odpornych na sól

Charakter wzrostu mikroorganizmów na pożywkach stałych. Główne cechy: ü Rozmiar – punktowy (≤ 1 mm) – duży (4 – 6 mm i więcej); ü Kształt - regularny (okrągły); nieregularny (w kształcie ameby), ryzoidalny; ü Kontury krawędzi - gładkie lub nierówne (karbowane, faliste itp.) ü Relief kolonii (w kształcie kopuły, płasko wypukły, kolonie z obniżonym środkiem itp. ü Powierzchnia kolonii (matowa lub błyszcząca (formy S-R); ü Kolonia kolor (tworzenie pigmentu); ü Struktura kolonii (drobna lub gruboziarnista); ü Konsystencja (lepka, śluzowata, pastowata itp.).

Pigmentacja bakterii Czerwono-brązowa (prodigiozyna) Serratia marcessens Żółto-pomarańczowa (karotenoidy) Staphylococcus, Sarcina, rodzaje M. tuberculosis Czarny, brązowy (melanina) B. cubtilis, Grzyby z rodzaju Candida Niebieski (pirocyjanina) P. aeruginosa Fluorescencyjny żółty -zielony (pyoverdyna) Rodzaj Vibrio

Izolacja czystych kultur: inokulacja na podłożach selektywnych. Podłoże selektywne Bade-Parkera dla gronkowców. Wzrost mikroorganizmów odpornych na telluryn potasu. Zamieniają go w metaliczny tellur, a kolonia staje się czarna

Izolacja czystych kultur: filtracja przez filtry membranowe Mikroorganizmy na filtrze Metalowe klatki na filtry nuklearne

Bakteriologiczna metoda badania materiału patologicznego w celu izolacji i identyfikacji prątków obejmuje 3 metody: bakterioskopową, kulturową i biologiczną / R.V. Tkzova, 1983; I.I.Rumachik, 1987,1993; JAK. Donczenko, 1989; Yu.Ya. Kassica, 1990; A.Ch.Naimanov, 1993; L.P.Khodun, 1997/. Okres badania bakteriologicznego nie powinien przekraczać 3 miesięcy.

Biorąc pod uwagę, że makroskopowe zmiany gruźlicze w narządach i tkankach bydła są spowodowane przez czynnik sprawczy gruźlicy bydła, nie ma sensu badanie takiego materiału bakteriologicznie. Jeżeli taki materiał zostanie dostarczony do laboratorium w celu badań, przeprowadzana jest kontrola komisji i sporządzany jest raport. Materiał staje się nieszkodliwy.

Badanie bakterioskopowe (mikroskopowe) materiału polega na pobraniu po 2 rozmazy linii papilarnych z każdego narządu (lub fragmentów narządu ze zmianami podejrzanymi o gruźlicę) i węzłach chłonnych dostarczonych do badania, wysuszeniu ich na powietrzu, utrwaleniu nad płomieniem lampy alkoholowej , barwienie według Zil-Nielsena i oglądanie wybarwionych rozmazów pod mikroskopem, z co najmniej 50 polami widzenia w każdym rozmazie. Należy przygotować co najmniej 20 rozmazów linii papilarnych z materiału z jednej farby. Ponadto rozmazy do mikroskopii przygotowuje się również z zawiesiny materiału wysianego na pożywce.

Barwienie rozmazów metodą Ziehl-Neelsena jest selektywne w celu identyfikacji prątków: na niebieskim tle wybarwionych tkanek lub obcej mikroflory prątki są widoczne w postaci czerwonych, różowych lub rubinowoczerwonych pręcików. Rozmazy najlepiej oglądać pod mikroskopem obuocznym przy powiększeniu 1,5 (nasadka) x 7 (okular) x 90 lub 100 (soczewka).

Metodę tę stosuje się jako metodę sygnałową, gdyż obecność lub brak prątków w rozmazach nie ma absolutnie żadnego wpływu na przebieg dalszych badań, a nawet pozytywny wynik bakterioskopii nie ma znaczenia prawnego (z wyjątkiem ptaków). Materiał wymaga dalszej analizy.

Rozpoznanie laboratoryjne gruźlicy u ptaków uznaje się za ustalone, jeżeli z materiału badawczego wyizoluje się kulturę prątków gatunku ptasiego (od papug – człowieka lub ptaka), uzyska się pozytywny wynik testu biologicznego, a także w przypadku wykrycia prątków w rozmazach materiału patologicznego podczas badania mikroskopowego (pkt 7.3.2. instrukcji).

Należy także zwrócić uwagę na fakt, że przygotowanie rozmazów linii papilarnych, ich utrwalenie i obejrzenie zajmuje dużo czasu, a wykrycie w nich prątków jest bardzo rzadkie, nawet w rozmazach z wysianej zawiesiny materiału. Dlatego też, chcąc zaoszczędzić czas i pieniądze przy badaniu materiału pochodzącego od zwierząt, które nie uległy zmianom podczas uboju, zaleca się ograniczyć się do przygotowania i oglądania rozmazów wyłącznie z zawiesiny materiału wysianego na pożywkach. Nie doprowadzi to do szkód w diagnostyce gruźlicy, ponieważ badanie materiału trwa dalej.

Oprócz konwencjonalnej mikroskopii świetlnej można zastosować mikroskopię fluorescencyjną. W podobny sposób przygotowuje się rozmazy, utrwala je i barwi mieszaniną fluorochromów. Zabarwione rozmazy ogląda się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Metoda jest bardziej czuła, ale mniej specyficzna, a zatem mniej akceptowalna, zwłaszcza w praktycznych laboratoriach.

Izolacja kulturowa prątków na pożywce jest na obecnym etapie jednym z ważnych ogniw laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy. Jednak pożywki, na których wysiewano materiał (na 5-10 probówek zgodnie z instrukcją), z reguły wykazują częściowe lub całkowite kiełkowanie w ciągu pierwszych 2-3 tygodni z powodu naruszenia sterylności podczas siewu materiał. Uprawy odrzuca się dokładnie w momencie, gdy jest najbardziej prawdopodobne wystąpienie początkowego wzrostu atypowych prątków (nie wspominając o początkowym rozwoju patogenu gruźlicy, który wykazuje wzrost jeszcze później). W takich przypadkach kulturowa metoda izolacji prątków na pożywce jest eliminowana mechanicznie. Jest to jedna z głównych przyczyn uzyskiwania negatywnych wyników podczas badania bakteriologicznego materiału. W rezultacie, w przypadku braku wzrostu kolonii prątków na pożywce po zaszczepieniu materiału, a zwierzęta laboratoryjne pozostały przy życiu przez 3 miesiące, standardowa odpowiedź laboratoriów jest następująca: „Nie wyizolowano czynnika wywołującego gruźlicę” lub „ Badanie materiału na gruźlicę daje wynik negatywny.” Na podstawie wyników badań nie ustalono przyczyny reakcji bydła na tuberkulinę, co prowadzi do dalszego bezsensownego uboju znacznej liczby zwierząt reagujących na tuberkulinę w gospodarstwach wolnych od gruźlicy bydła, co powoduje ogromne straty ekonomiczne , zakłóca rotację i reprodukcję stada.

Mając na uwadze powyższe, należy zwrócić szczególną uwagę na kulturową metodę izolacji prątków z materiału na pożywkach, jako najsłabszego ogniwa w diagnostyce bakteriologicznej gruźlicy w okręgowych laboratoriach weterynaryjnych.

Pozytywne wyniki kulturowej metody izolacji prątków zależą głównie od dwóch okoliczności: zwiększenia wiarygodności wysiewu prątków z materiału oraz utrzymania warunków sterylności podczas pracy w pudełku.

Zwiększenie wiarygodności zaszczepienia prątków z materiału pobranego do badań zależy przede wszystkim od jego doboru jakościowego, zabiegu przedsiewnego oraz zwiększenia liczby probówek z pożywką, na której przeprowadza się inokulację.

Podstawowe warunki, których przestrzeganie przy wysiewie materiału na pożywki gwarantuje rozwój kolonii prątków:

a) wybrać materiał do badań bakteriologicznych z uśmierconych zwierząt, które nie uległy zmianom w trakcie uboju, oddzielnie z każdej tuszy i każdą próbkę (materiał od każdego zwierzęcia) zaszczepić do 10-20 probówek z pożywką według następującego schematu:

Węzły chłonne głowy (podżuchwowe, zagardłowe);

Węzły chłonne oskrzelowe i śródpiersia;

Węzły chłonne krezkowe (krezkowe);

Inne węzły chłonne (jeśli występują podejrzane obszary);

Narządy (również jeśli to konieczne).

Rezultatem jest zaszczepienie materiału od jednego zwierzęcia do 30-50 probówek z pożywką. Zapewnia to 3-5-krotny wzrost wiarygodności wysiewu prątków, ponieważ bez rozdzielania próbek (zgodnie z instrukcją) zaleca się wysiewanie materiału tylko na 5-10 probówkach pożywki z dwóch głowic jednego gospodarstwa.

b) Bezpośrednio podczas posiewu bakteriologicznego materiału wyciąć kawałki z zaburzoną budową morfologiczną węzła lub narządu (przerost, zagęszczenie, krwotoki punktowe i pasiaste itp.). Ponadto konieczne jest wycięcie wszystkich zmienionych obszarów. Jeśli w jednej zaprawie znajduje się dużo materiału, można go podzielić na dwie części.

c) Ściśle przestrzegać przyjętej metodologii pracy, nie naruszając sposobu przetwarzania i siewu materiału.

d) Do homogenizacji materiału, szczególnie węzłów chłonnych, należy użyć sterylnego piasku lub drobno potłuczonego sterylnego szkła. Maksymalnie zmiel materiał (do kremowej konsystencji) w celu lepszej ekstrakcji prątków z badanego materiału

e) Do homogenizowanego materiału w moździerzu dodać roztwór soli fizjologicznej w ilości niezbędnej do wysiewu zawiesiny materiału na pożywki i do analizy biologicznej (średnio do 0,5 cm3 w jednej probówce i 1-2 cm3 w przypadku zakażenia podskórnego jednej gwinei świnia). Tę ilość roztworu soli można obliczyć z wyprzedzeniem.

f) Oglądaj plony materiału po 3, 5, 7, 10, 15 dniach, a następnie raz w tygodniu.

g) Każda kolonia mikroorganizmów wyhodowana na podłożu (typowa lub atypowa, zabarwiona lub niepigmentowana, śluzowata lub sucha itp.) musi zostać poddana mikroskopii przy użyciu selektywnego barwienia Ziehl-Neelsena.

Należy zwrócić uwagę na stopień wymycia materiału z kwasu (lub zasady) użytego do oczyszczenia materiału z zanieczyszczeń obcą mikroflorą. W zawiesinie wysiewanego materiału zawsze będzie znajdować się resztkowa ilość kwasu, ale powinna ona być minimalna. Wskaźnikiem tego jest przywrócenie pierwotnego koloru podłoża w 2-4 dniu po wysiewie materiału. Jeśli kolor podłoża nie zostanie przywrócony, oznacza to zwiększoną ilość kwasu resztkowego. Kolor podłoża nabiera niebieskawego odcienia o różnej intensywności. Wzrost (domniemanych) prątków w tym przypadku spowalnia lub w ogóle nie występuje, zwłaszcza czynnika wywołującego gruźlicę, ponieważ jest on bardziej wymagający pod względem reżimu uprawy. Pozostała ilość kwasu działa na prątki w pewnym stopniu bakteriostatycznie.

Do uszczelnienia probówek po zaszczepieniu materiału można zastosować zatyczki bawełniane i gazikowe, a następnie wypełnić je parafiną, gumą bez i gumą z wyciętym ukośnym rowkiem, korkiem i zatyczkami metalowymi (zamkami).

Przy określaniu tożsamości gatunkowej izolowanej kultury prątków znanych jest wiele (około 300) różnych testów: kulturowo-morfologiczne, biologiczne, biochemiczne, serologiczne, określanie oporności na leki itp. Jednak w praktyce weterynaryjnej stosuje się ich minimum (patrz instrukcja). Dla laboratoriów wystarczy oznaczenie wyizolowanej kultury prątków: bydlęcej, ludzkiej i ptasiej, co oznacza się w drodze testu biologicznego, oraz prątków atypowych – podzielonych na grupy według Runyona (1959): I – fotochromogenne (tworzące pigment pod wpływem światła), II - skotochromogenne (tworzą pigment niezależnie od ekspozycji na światło - zarówno w ciemności, jak i na świetle), III - niechromogenne (nie tworzą pigmentu) lub nazywane są także bezpigmentowymi (sprawczymi zalicza się tu także czynnik wywołujący gruźlicę ptaków), IV – szybko rosnące prątki i kwasoodporne saprofity.

W tym celu dość skuteczne i ekonomicznie uzasadnione jest badanie właściwości izolowanej kultury według skróconego schematu, w którym główną uwagę zwraca się na czas pojawienia się pierwotnego wzrostu kolonii, tworzenie pigmentu, kulturowo-morfologiczne i właściwości barwiące po wybarwieniu według Ziehl-Neelsena. Test na tworzenie nici w hodowli pierwotnej lub nawet subkulturze w połączeniu z wynikami testu biologicznego jest szczególnie istotny. Aby przygotować rozmazy z wyhodowanych rodzin, zaleca się jednoczesne wykonanie ich zarówno z kolonii, jak i z resztek zawiesiny i kondensatu, tj. z części płynnej znajdującej się na dnie probówki.

Ponadto pracownicy laboratorium mają możliwość nie tylko przeprowadzenia uboju kontrolnego zwierząt, które zareagowały na tuberkulinę i pobrania próbek materiału do badań, ale także selekcji do badań bakteriologicznych za życia zwierząt (śluz oskrzelowy lub nosowy, mleko, kał, mocz, wysięk, krew itp.) itp.), a także próbki paszy, wody i przedmiotów środowiskowych do izolacji prątków i tym samym pośrednio ustalają przyczynę reakcji zwierząt gospodarskich na tuberkulinę. Przy zaszczepianiu dodatkowego materiału i próbek z obiektów środowiskowych stosuje się dobrze znane metody zagęszczania prątków: sedymentację, flotację, flotację-sedymentację i inne.

Skrócony schemat różnicowania prątków za pomocą testu biologicznego

Główną metodą diagnostyki mikrobiologicznej i „złotym standardem” mikrobiologii jest metoda bakteriologiczna.

Cel metody bakteriologicznej polega na wyizolowaniu czystej kultury patogenu z materiału badawczego, zgromadzeniu czystej kultury i identyfikacji tej kultury po zespole właściwości: morfologicznych, nalewkowych, kulturowych, biochemicznych, antygenowych, po obecności czynników patogeniczności, toksyczności i określeniu jej wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe i bakteriofagi.

Metoda badań bakteriologicznych obejmuje:

1. inokulacja materiału badawczego w pożywce

2. izolacja czystej kultury

3. identyfikacja mikroorganizmów (określanie gatunku).

Izolacja i identyfikacja czystych kultur bakterii tlenowych i beztlenowych obejmuje następujące badania:

Etap I (praca z materiałem rodzimym)

Cel: zdobycie izolowanych kolonii

1. Wstępna mikroskopia daje przybliżone pojęcie o mikroflorze

2. Przygotowanie materiału do badań

3. Wysiew na stałe pożywki w celu uzyskania izolowanych rodzin

4. Inkubacja w optymalnej temperaturze, najczęściej 37°C, przez 18-24 godziny

Etap II

Cel: uzyskanie czystej kultury

1. Badanie makroskopowe kolonii w świetle przechodzącym i odbitym (charakterystyka wielkości, kształtu, koloru, przezroczystości, konsystencji, struktury, konturu, powierzchni kolonii).

2. Badanie mikroskopowe izolowanych kolonii

3. Badanie aerotolerancji (w celu potwierdzenia obecności ścisłych beztlenowców w badanym materiale).

4. Wysiew kolonii charakterystycznych dla danego gatunku na podłoża akumulacyjne czystej kultury lub podłoża selektywne i inkubacja w optymalnych warunkach.

Etap III

Cel: identyfikacja izolowanej czystej kultury

1. Aby zidentyfikować wybraną kulturę na podstawie zestawu właściwości biologicznych, bada się:

· Morfologia i właściwości barwiące

· właściwości kulturowe (charakter wzrostu na pożywkach)

· właściwości biochemiczne (aktywność enzymatyczna mikroorganizmów)

Właściwości serologiczne (antygenowe)

· właściwości zjadliwe (zdolność do wytwarzania czynników chorobotwórczych: toksyn, enzymów, czynników obronnych i agresywnych)

patogeniczność dla zwierząt

· fagolizowalność (wrażliwość na bakteriofagi diagnostyczne)

wrażliwość na antybiotyki

· inne indywidualne właściwości

Etap IV (Zakończenie)

Na podstawie zbadanych właściwości wyciąga się wniosek na temat wybranej kultury.

Pierwszy etap badań. Badanie materiału patologicznego rozpoczyna się od mikroskopii. Mikroskopia wybarwionego materiału rodzimego pozwala w przybliżeniu ustalić skład krajobrazu mikrobiologicznego badanego obiektu oraz niektóre cechy morfologiczne mikroorganizmów. Wyniki mikroskopii materiału natywnego w dużej mierze determinują przebieg dalszych badań i są następnie porównywane z danymi uzyskanymi w wyniku zaszczepienia na pożywkach.

Jeżeli w próbce znajduje się wystarczająca zawartość mikroorganizmów chorobotwórczych, inokulację przeprowadza się na pożywce stałej (w celu uzyskania izolowanych kolonii). Jeżeli w materiale testowym znajduje się niewiele bakterii, inokulację przeprowadza się na płynnej pożywce wzbogacającej. Pożywki dobierane są w zależności od potrzeb mikroorganizmów.

Hodowla mikroorganizmów jest możliwa tylko pod warunkiem stworzenia optymalnych warunków dla ich życia i przestrzegania zasad wykluczających skażenie (przypadkowe skażenie obcymi drobnoustrojami) badanego materiału. W probówce, kolbie lub szalce Petriego można stworzyć sztuczne warunki, które zapobiegną zanieczyszczeniu hodowli innymi gatunkami. Wszystkie naczynia szklane i podłoża hodowlane muszą być sterylne i po zaszczepieniu materiału mikrobiologicznego zabezpieczone przed zanieczyszczeniem zewnętrznym, co osiąga się za pomocą korków lub metalowych nakrętek i pokrywek. Manipulacje z badanym materiałem należy przeprowadzać w strefie płomienia lampy alkoholowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu materiału ze środowiska zewnętrznego, a także w celu zachowania zgodności z przepisami bezpieczeństwa.

Zaszczepianie materiału na pożywki należy wykonać nie później niż 2 godziny od momentu pobrania.

Drugi etap badań. Badanie kolonii i izolacja czystych kultur. Po dniu inkubacji na płytkach wyrastają kolonie, przy czym przy pierwszym pociągnięciu wzrost jest ciągły, a przy kolejnych - pojedyncze kolonie. Kolonia to zbiór drobnoustrojów tego samego gatunku wyrastających z jednej komórki. Ponieważ materiał jest najczęściej mieszaniną drobnoustrojów, rośnie kilka rodzajów kolonii. Różne kolonie zaznacza się ołówkiem, obrysowując je kółkiem od dołu i bada (Tabela 11). Przede wszystkim kolonie bada się gołym okiem: znaki makroskopowe. Kubek ogląda się (bez otwierania) od dołu w świetle przechodzącym, stwierdza się przezroczystość kolonii (przezroczystą, jeśli nie blokuje światła; półprzezroczystą, jeśli częściowo blokuje światło; nieprzezroczystą, jeśli światło nie przechodzi przez kolonii) i mierzy się wielkość kolonii (w mm). Następnie oglądają kolonie od strony wieczka, zwracają uwagę na ich kształt (regularny okrągły, nieregularny, płaski, wypukły), charakter powierzchni (gładka, błyszcząca, matowa, szorstka, pomarszczona, mokra, sucha, śluzowata), kolor (bezbarwny, kolorowy).

Tabela 11. Schemat badania kolonii

№	Podpisać	Możliwe cechy kolonii
1.	Formularz	Płaskie, wypukłe, kopulaste, wgłębione, okrągłe, rozetowe, gwiazdowe
2.	Rozmiar, mm	Duży (4-5 mm), średni (2-4 mm), mały (1-2 mm), karzeł (< 1 мм)
3.	Charakter powierzchni	Gładki (kształt S), szorstki (kształt R), śluzowaty (kształt M), prążkowany, nierówny, matowy, błyszczący
4.	Kolor	Bezbarwny, kolorowy
5.	Przezroczystość	Przezroczysty, nieprzezroczysty, półprzezroczysty
6.	Charakter krawędzi	Gładkie, postrzępione, frędzlowe, włókniste, ząbkowane
7.	Struktura wewnętrzna	Jednorodne, ziarniste, niejednorodne
8.	Konsystencja	Lepki, śluzowaty, kruchy
9.	Emulgacja w kropli wody	Dobry zły

Uwaga: punkty 5-7 są badane przy małym powiększeniu mikroskopu.

Jeszcze lepiej widać różnice pomiędzy koloniami, oglądając je w powiększeniu. W tym celu należy ustawić zamkniętą miskę dnem do góry na stoliku, nieco obniżyć kondensor, zastosować niewielkie powiększenie soczewki (x8), przesuwając miskę, zbadać cechy mikroskopowe kolonii: charakter krawędzi ( gładka, falista, postrzępiona, ząbkowana), struktura (jednorodna, ziarnista, włóknista, jednorodna lub różna w środku i na obrzeżach).

Następnie badana jest morfologia komórek drobnoustrojów z kolonii. W tym celu z części każdej zaznaczonej kolonii wykonuje się rozmazy i barwi je metodą Grama. Przy pobieraniu rodzin należy zwrócić uwagę na ich konsystencję (sucha, jeśli kolonia kruszy się i trudno ją podnieść; miękka, jeśli można ją łatwo wyjąć za pomocą pętelki; śluzowata, jeśli kolonia jest ciągnięta za pętelkę; twarda, jeśli jest częścią kolonia nie jest pobierana za pomocą pętli, można jedynie usunąć całą kolonię).

Oglądając rozmazy, ustalono, że kolonia jest reprezentowana przez jeden rodzaj drobnoustroju, dlatego można wyizolować czyste kultury bakterii. W tym celu badane kolonie ponownie wysiewa się na skośny agar. Podczas ponownego wysiewania z rodzin należy zachować ostrożność, aby pobrać dokładnie te kolonie, które są przeznaczone, bez dotykania pętlą pobliskich kolonii. Probówki są oznakowane i inkubowane w termostacie w temperaturze 37°C przez 24 godziny.

Trzeci etap badań. Identyfikacja izolowanej kultury. Identyfikacja drobnoustrojów - określenie pozycji systematycznej kultury wyizolowanej z materiału na gatunek i odmianę. Pierwszym warunkiem wiarygodnej identyfikacji jest bezwarunkowa czystość kultury. Do identyfikacji drobnoustrojów wykorzystuje się zestaw cech: morfologicznych (kształt, wielkość, obecność wici, torebek, zarodników, względne położenie w rozmazie), barwiących (w odniesieniu do barwienia Grama lub innymi metodami), chemicznych (stosunek guanina + cytozyna W cząsteczka DNA), kulturowa (potrzeby żywieniowe, warunki uprawy, tempo i charakter wzrostu na różnych pożywkach), enzymatyczna (rozszczepienie różnych substancji z utworzeniem produktów pośrednich i końcowych), serologiczna (struktura antygenowa, specyficzność), biologiczna (zjadliwość dla zwierząt, toksyczność, alergenność, wpływ antybiotyków itp.).

W celu zróżnicowania biochemicznego zdolność bakterii do fermentacji węglowodanów z tworzeniem związków pośrednich i produkty końcowe, zdolność do degradacji białek i peptonów oraz badanie enzymów redoks.

W celu zbadania enzymów sacharylitycznych wyizolowane kultury zaszczepia się do probówek z półpłynnym podłożem zawierającym laktozę, glukozę i inne węglowodany oraz alkohole wielowodorotlenowe. W przypadku pożywek półpłynnych inokulację przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie w głębokość pożywki. Podczas siewu metodą wtrysku probówkę z pożywką trzyma się pod kątem, korek usuwa się, a krawędź probówki wypala. Materiał pobiera się sterylną pętlą i przebija się nim kolumnę pożywki niemal do samego dna.

W celu oznaczenia enzymów proteolitycznych wyizolowaną hodowlę zaszczepia się wodą peptonową lub MPB. W tym celu należy wziąć do ręki probówkę z zaszczepieniem bliżej siebie, a probówkę z pożywką dalej od siebie. Obie probówki otwiera się jednocześnie, chwytając za korki małym palcem i krawędzią dłoni, przypalając krawędzie probówek, za pomocą kalcynowanej, schłodzonej ezy pobrać odrobinę hodowli i przenieść ją do drugiej probówki rozetrzeć w płynnym podłożu na ściankach probówki i zmyć pożywką.

Podczas siewu i dosiewu należy zwrócić uwagę na przestrzeganie zasad sterylności, aby nie skazić swoich upraw obcą mikroflorą, a także nie zanieczyszczać środowiska. Probówki etykietuje się i umieszcza w termostacie w celu inkubacji w temperaturze 37°C na 24 godziny.

Wniosek

Rozliczanie wyników. Podsumowanie badania. Wyniki identyfikacji są brane pod uwagę i na podstawie całości uzyskanych danych, w oparciu o klasyfikację i charakterystykę typowych szczepów opisanych w podręczniku (klucz Burgee'ego, 1994-1996), określa się rodzaj izolowanych upraw.

3. Rodzaje preparatów mikroskopowych. Etapy przygotowania utrwalonego rozmazu. Proste metody malowania.

4. Różnicowe metody diagnostyki barwienia drobnoustrojów. Barwienie metodą Grama, mechanizm i technika barwienia.

5. Morfologia bakterii. Różnice między prokariotami i eukariontami. Podstawowe formy bakterii.

6. Budowa i funkcje formacji powierzchniowych komórki bakteryjnej. Kapsuła. Metody wykrywania.

7. Budowa i funkcje ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Formy bakterii z defektami ściany komórkowej.

8. Struktury cytopasmatyczne bakterii, funkcje, metody wykrywania. Mikroorganizmy kwasoodporne. Metoda kolorowania.

9. Formy spoczynkowe drobnoustrojów. Sporulacja u bakterii, etapy, metody identyfikacji przetrwalników.

10. Ruchliwość bakterii, metody wykrywania ruchliwości.

11. Zasady taksonomii drobnoustrojów. Systematyczne położenie drobnoustrojów. Kategorie taksonomiczne. Pojęcie i kryteria typu.

12-16. Pozycja systematyczna i morfologia krętków, promieniowców, mykoplazm, riketsjów, chlamydii. Metody badania.

18. Aparat oddechowy bakterii. Drogi utleniania biologicznego. Klasyfikacja drobnoustrojów według tego kryterium

19 Metody rozmnażania drobnoustrojów. Mechanizm i fazy podziału komórki.

20. Charakterystyka metody badań bakteriologicznych

21. Pożywki dla tlenowców i beztlenowców. Wymagania dotyczące pożywek, klasyfikacja.

22. Metody izolacji czystych kultur tlenowców.

23. Metody izolacji czystych kultur beztlenowców.

24. Identyfikacja drobnoustrojów pod względem morfologicznym, kulturowym, serologicznym, biologicznym, genetycznym.

26. Aparat genetyczny bakterii (chromosomy, plazmidy), charakterystyka transpozonów bakteryjnych. Biologiczna rola plazmidów.

27. Rodzaje zmienności bakterii. Zmienność fenotypowa i genotypowa. Pojęcie zmienności populacji.

28. Zmienność mutacyjna. Rekombinacje genetyczne. Praktyczne znaczenie zmienności mikroorganizmów. Pojęcie inżynierii genetycznej i biotechnologii.

29. Diagnostyka molekularna. Cel. Zadania. Metody.

30. Hybrydyzacja molekularna. Reakcja łańcuchowa polimerazy.

31. Doktryna infekcji. Warunki wystąpienia procesu zakaźnego. Charakterystyczne objawy chorób zakaźnych. Rodzaje infekcji.

32. Rola mikroorganizmów w procesie zakaźnym. Patogeniczność i zjadliwość Czynniki patogeniczności.

33. Rola makroorganizmu, środowiska fizycznego i społecznego w procesie zakaźnym.

34. Biologiczna metoda badania problemu, etapy oceny.

35. Chemioterapia i chemioprofilaktyka. Klasyfikacja definicji antybiotyków.

36. Mechanizm działania antybiotyków.

37. Skutki uboczne antybiotyków.

38. Oporność drobnoustrojów na antybiotyki.

39 Metody badania wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki.

40. Ekologia mikroorganizmów. Rodzaje powiązań środowiskowych.

41. Charakterystyka prawidłowej mikroflory człowieka i jej rola biologiczna. Metody badania. Gnotobiologia. Dysbakterioza. Przyczyny rozwoju, zasady korygowania.

42 Sterylizacja, dezynfekcja. Definicja pojęć, sposoby realizacji.

43. Aseptyka, środki antyseptyczne. Definicja pojęć. Metody przeprowadzania.

20. Charakterystyka metody badań bakteriologicznych

Kulturowa (bakteriologiczna) metoda badawcza to zespół metod mających na celu izolację i identyfikację czystych kultur mikroorganizmów (bakterii) poprzez hodowlę na pożywkach.

Czysta kultura to zbiór mikroorganizmów tego samego gatunku. Najczęściej czystą kulturę uzyskuje się poprzez selekcję i hodowlę izolowanej kolonii (potomka pojedynczej komórki drobnoustroju).

Etapy metody:

1. Gromadzenie materiału do badań.

2. Izolacja czystej kultury i jej identyfikacja.

3. Wniosek.

Gromadzenie materiału do badań. Rodzaj badanego materiału zależy od celu badania (diagnoza – od pacjenta; analiza epidemiologiczna – ze środowiska zewnętrznego, pożywienia, pacjenta i (lub) nosiciela bakterii).

Izolacja czystej kultury. Obejmuje 3 lub 4 etapy:

1. Posiew materiału (po wstępnej mikroskopii) na szalkę z pożywką stałą (najlepiej diagnostyczną różnicową lub selektywną) w celu uzyskania izolowanych kolonii. Najczęściej wytwarza się go poprzez separację mechaniczną. W niektórych przypadkach (na przykład krew) materiał wstępnie zaszczepia się w płynnej pożywce wzbogacającej, a następnie przenosi na płytkę z pożywką agarową. Czasami przed siewem przeprowadza się selektywną obróbkę materiału (biorąc pod uwagę właściwości izolowanego mikroorganizmu, na przykład obróbkę kwasem lub zasadą w celu wyizolowania opornych bakterii). Hodować w temperaturze 37°C przez 18-24 godziny. Czas hodowli może być różny dla różnych typów bakterii.

2 ust. 3:a) badanie kolonii na płytce agarowej (cechy kulturowe), wybór najbardziej typowych; b) przygotowanie rozmazów z tych kolonii z barwieniem (metodą Grama lub inną); a) przesiać pozostałą część badanej kolonii na pożywkę akumulacyjną i hodować ją w termostacie w optymalnej temperaturze.

3(4). Badanie czystości hodowli uzyskanej na podłożu akumulacyjnym. Z tym

przygotowuje się rozmaz, barwi go (zwykle metodą Grama) i bada pod mikroskopem

jednorodność morfologiczna i barwna (w różnych polach widzenia).

4(5). Identyfikacja czystej kultury.

Wniosek. Na podstawie zestawu cech w porównaniu z właściwościami szczepów referencyjnych (typu) wskazuje się rodzaj mikroorganizmu wyizolowanego z materiału.

Ocena metody:

zalety: stosunkowo wysoka czułość i dokładność, możliwość określenia liczby drobnoustrojów w badanym materiale, a także wrażliwość na antybiotyki; wady: względny czas trwania, metoda jest kosztowna.

21. Pożywki dla tlenowców i beztlenowców. Wymagania dotyczące pożywek, klasyfikacja.

Wymagania:

media muszą być pożywne

musi mieć określone pH

musi być izotoniczny, tj. Ciśnienie osmotyczne w środowisku musi być takie samo jak w komórce.

powinno być wilgotne i niezbyt rzadkie

musi mieć określony potencjał redoks

musi być sterylny

muszą być ujednolicone, tj. zawierają stałe ilości poszczególnych składników.

Pożywki można podzielić:

A) Według pochodzenia:

1) naturalne – naturalne produkty spożywcze (mięso, mleko, ziemniaki);

2) sztuczne – przygotowane specjalnie do hodowli drobnoustrojów: - pożywki z produktów naturalnych (woda mięsna, bulion mięsny (MPB), agar z ekstraktem mięsnym (MPA), - nie posiadające stałego składu, - pożywki syntetyczne - roztwory ściśle określone ilości soli, aminokwasów, zasad azotowych, witamin w wodzie destylowanej - mają stały skład, służą do hodowli mikroorganizmów i kultur komórkowych w celu uzyskania szczepionek, surowic odpornościowych i antybiotyków;

B) Według celu:

1) ogólnego przeznaczenia (MPB, MPA) - rośnie na nich większość drobnoustrojów;

2) selektywne - selektywnie promują wzrost jednego rodzaju drobnoustroju z mieszaniny (na przykład agar żółtkowo-solny dla gronkowców);

3) diagnostyka różnicowa - pozwalają odróżnić jeden typ drobnoustroju od innych na podstawie wyglądu pożywki (np. Endo, środowiska Levina dla jelitowej grupy drobnoustrojów).

Co więcej, w zależności od celów użytkowania W schemacie izolacji czystych kultur można wyróżnić następujące podłoża według przeznaczenia:

1) wzbogacanie – hamują rozwój drobnoustrojów towarzyszących patogenowi;

2) uzyskanie izolowanych kolonii;

3) akumulacja czystej kultury;

B) Według konsystencji:

1) ciecz;

2) półpłynny (z dodatkiem agaru-agaru w stężeniu 0,5-0,7%);

3) gęsty - powyżej 1%.

Główną metodą diagnostyki mikrobiologicznej i „złotym standardem” mikrobiologii jest metoda bakteriologiczna.

Cel metody bakteriologicznej polega na wyizolowaniu czystej kultury patogenu z materiału badawczego, zgromadzeniu czystej kultury i identyfikacji tej kultury po zespole właściwości: morfologicznych, nalewkowych, kulturowych, biochemicznych, antygenowych, po obecności czynników patogeniczności, toksyczności i określeniu jej wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe i bakteriofagi.

Metoda badań bakteriologicznych obejmuje:

1. inokulacja materiału badawczego w pożywce

2. izolacja czystej kultury

3. identyfikacja mikroorganizmów (określanie gatunku).

Izolacja i identyfikacja czystych kultur bakterii tlenowych i beztlenowych obejmuje następujące badania:

Etap I (praca z materiałem rodzimym)

Cel: zdobycie izolowanych kolonii

1. Wstępna mikroskopia daje przybliżone pojęcie o mikroflorze

2. Przygotowanie materiału do badań (rozcieńczenie izotonicznym roztworem NaCl itp.)

3. Wysiew na stałe pożywki w celu uzyskania izolowanych rodzin

4. Inkubacja w optymalnej temperaturze, najczęściej 37°C, przez 18-24 godziny

Etap II

Cel: uzyskanie czystej kultury

1. Badanie makroskopowe kolonie w świetle przechodzącym i odbitym (charakterystyka wielkości, kształtu, koloru, przezroczystości, konsystencji, struktury, konturu, powierzchni kolonii).

2. Badanie mikroskopowe izolowanych kolonii

3. Badanie aerotolerancji (w celu potwierdzenia obecności ścisłych beztlenowców w badanym materiale).

4. Wysiew kolonii charakterystycznych dla danego gatunku na podłoża akumulacyjne czystej kultury lub podłoża selektywne i inkubacja w optymalnych warunkach.

Etap III

Cel: identyfikacja izolowanej czystej kultury

1. Aby zidentyfikować wybraną kulturę na podstawie zestawu właściwości biologicznych, bada się:

· Morfologia i właściwości barwiące

· właściwości kulturowe (charakter wzrostu na pożywkach)

· właściwości biochemiczne (aktywność enzymatyczna mikroorganizmów, aktywność glikolityczna, proteolityczna i inne)

Właściwości serologiczne (antygenowe)

· właściwości zjadliwe (zdolność do wytwarzania czynników chorobotwórczych: toksyn, enzymów, czynników obronnych i agresywnych)

patogeniczność dla zwierząt

· fagolizowalność (wrażliwość na bakteriofagi diagnostyczne)

wrażliwość na antybiotyki

· inne indywidualne właściwości

Etap IV (Zakończenie)

Na podstawie zbadanych właściwości wyciąga się wniosek na temat wybranej kultury.

Pierwszy etap badań. Badanie materiału patologicznego rozpoczyna się od mikroskopii. Mikroskopia wybarwionego materiału rodzimego pozwala w przybliżeniu ustalić skład krajobrazu mikrobiologicznego badanego obiektu oraz niektóre cechy morfologiczne mikroorganizmów. Wyniki mikroskopii materiału natywnego w dużej mierze determinują przebieg dalszych badań i są następnie porównywane z danymi uzyskanymi w wyniku zaszczepienia na pożywkach.

Jeżeli w próbce znajduje się wystarczająca zawartość mikroorganizmów chorobotwórczych, inokulację przeprowadza się na pożywce stałej (w celu uzyskania izolowanych kolonii). Jeżeli w materiale testowym znajduje się niewiele bakterii, inokulację przeprowadza się na płynnej pożywce wzbogacającej. Pożywki dobierane są w zależności od potrzeb mikroorganizmów.

Hodowla mikroorganizmów jest możliwa tylko pod warunkiem stworzenia optymalnych warunków dla ich życia i przestrzegania zasad wykluczających skażenie (przypadkowe skażenie obcymi drobnoustrojami) badanego materiału. W probówce, kolbie lub szalce Petriego można stworzyć sztuczne warunki, które zapobiegną zanieczyszczeniu hodowli innymi gatunkami. Wszystkie naczynia szklane i podłoża hodowlane muszą być sterylne i po zaszczepieniu materiału mikrobiologicznego zabezpieczone przed zanieczyszczeniem zewnętrznym, co osiąga się za pomocą korków lub metalowych nakrętek i pokrywek. Manipulacje z badanym materiałem należy przeprowadzać w strefie płomienia lampy alkoholowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu materiału ze środowiska zewnętrznego, a także w celu zachowania zgodności z przepisami bezpieczeństwa.

Zaszczepianie materiału na pożywki należy wykonać nie później niż 2 godziny od momentu pobrania.

Drugi etap badań. Badanie kolonii i izolacja czystych kultur. Po dniu inkubacji na płytkach wyrastają kolonie, przy czym przy pierwszym pociągnięciu wzrost jest ciągły, a przy kolejnych - pojedyncze kolonie. Kolonia to zbiór drobnoustrojów tego samego gatunku wyrastających z jednej komórki. Ponieważ materiał jest najczęściej mieszaniną drobnoustrojów, rośnie kilka rodzajów kolonii. Zaznacz ołówkiem różne kolonie, obrysowując je kółkiem od dołu i przeanalizuj je (Tabela 12). Przede wszystkim kolonie bada się gołym okiem: znaki makroskopowe. Kubek ogląda się (bez otwierania) od dołu w świetle przechodzącym, stwierdza się przezroczystość kolonii (przezroczystą, jeśli nie blokuje światła; półprzezroczystą, jeśli częściowo blokuje światło; nieprzezroczystą, jeśli światło nie przechodzi przez kolonii) i mierzy się wielkość kolonii (w mm). Następnie oglądają kolonie od strony wieczka, zwracają uwagę na ich kształt (regularny okrągły, nieregularny, płaski, wypukły), charakter powierzchni (gładka, błyszcząca, matowa, szorstka, pomarszczona, mokra, sucha, śluzowata), kolor (bezbarwny, kolorowy).

Tabela 12. Schemat badania kolonii

№	Podpisać	Możliwe cechy kolonii
1.	Formularz	Płaskie, wypukłe, kopulaste, wgłębione, okrągłe, rozetowe, gwiazdowe
2.	Rozmiar, mm	Duży (4-5 mm), średni (2-4 mm), mały (1-2 mm), karzeł (< 1 мм)
3.	Charakter powierzchni	Gładki (kształt S), szorstki (kształt R), śluzowaty (kształt M), prążkowany, nierówny, matowy, błyszczący
4.	Kolor	Bezbarwny, kolorowy... kolor
5.	Przezroczystość	Przezroczysty, nieprzezroczysty, półprzezroczysty
6.	Charakter krawędzi	Gładkie, postrzępione, frędzlowe, włókniste, ząbkowane
7.	Struktura wewnętrzna	Jednorodne, ziarniste, niejednorodne
8.	Konsystencja	Lepki, śluzowaty, kruchy
9.	Emulgacja w kropli wody	Dobry zły

Uwaga: punkty 5-7 bada się przy małym powiększeniu mikroskopu lub pod lupą.

Jeszcze lepiej widać różnice pomiędzy koloniami, oglądając je w powiększeniu. W tym celu należy ustawić zamkniętą miskę dnem do góry na stoliku, nieco obniżyć kondensor, zastosować niewielkie powiększenie soczewki (x8), przesuwając miskę, zbadać cechy mikroskopowe kolonii: charakter krawędzi ( gładka, falista, postrzępiona, ząbkowana), struktura (jednorodna, ziarnista, włóknista, jednorodna lub różna w środku i na obrzeżach).

Następnie badana jest morfologia komórek drobnoustrojów z kolonii. W tym celu z części każdej zaznaczonej kolonii wykonuje się rozmazy i barwi je metodą Grama. Przy pobieraniu rodzin należy zwrócić uwagę na ich konsystencję (sucha, jeśli kolonia kruszy się i trudno ją podnieść; miękka, jeśli można ją łatwo wyjąć za pomocą pętelki; śluzowata, jeśli kolonia jest ciągnięta za pętelkę; twarda, jeśli jest częścią kolonia nie jest pobierana za pomocą pętli, można jedynie usunąć całą kolonię).

Oglądając rozmazy, ustalono, że kolonia jest reprezentowana przez jeden rodzaj drobnoustroju, dlatego można wyizolować czyste kultury bakterii. W tym celu badane kolonie ponownie wysiewa się na skośny agar. Podczas ponownego wysiewania z rodzin należy zachować ostrożność, aby pobrać dokładnie te kolonie, które są przeznaczone, bez dotykania pętlą pobliskich kolonii. Probówki są oznakowane i inkubowane w termostacie w temperaturze 37°C przez 24 godziny.

Trzeci etap badań. Identyfikacja izolowanej kultury. Identyfikacja drobnoustrojów - określenie pozycji systematycznej kultury wyizolowanej z materiału na gatunek i odmianę. Pierwszym warunkiem wiarygodnej identyfikacji jest bezwarunkowa czystość kultury. Do identyfikacji drobnoustrojów wykorzystuje się zestaw cech: morfologicznych (kształt, wielkość, obecność wici, torebek, zarodników, względne położenie w rozmazie), barwiących (w odniesieniu do barwienia Grama lub innymi metodami), chemicznych (stosunek guanina + cytozyna w cząsteczce DNA), kulturowe (potrzeby żywieniowe, warunki uprawy, tempo i charakter wzrostu na różnych pożywkach), enzymatyczne (rozkład różnych substancji z utworzeniem produktów pośrednich i końcowych), serologiczne (struktura antygenowa, specyficzność), biologiczne (zjadliwość dla zwierząt, toksyczność, alergenność, działanie antybiotyków itp.).

W celu różnicowania biochemicznego badają zdolność bakterii do fermentacji węglowodanów z tworzeniem pośrednich produktów końcowych, zdolność rozkładania białek i peptonów oraz badanie enzymów redoks.

Badanie enzymów sacharylitycznych wyizolowane kultury zaszczepia się do probówek z półpłynnym podłożem zawierającym laktozę, glukozę i inne węglowodany oraz alkohole wielowodorotlenowe. W przypadku pożywek półpłynnych inokulację przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie w głębokość pożywki. Podczas siewu metodą wtrysku probówkę z pożywką trzyma się pod kątem, korek usuwa się, a krawędź probówki wypala. Materiał pobiera się sterylną pętlą i przebija się nim kolumnę pożywki niemal do samego dna.

Do oznaczania enzymów proteolitycznych wyizolowaną kulturę wysiewa się na wodzie peptonowej lub MPB. W tym celu należy wziąć do ręki probówkę z zaszczepieniem bliżej siebie, a probówkę z pożywką dalej od siebie. Obie probówki otwiera się jednocześnie, chwytając za korki małym palcem i krawędzią dłoni, przypalając krawędzie probówek, za pomocą kalcynowanej, schłodzonej ezy pobrać odrobinę hodowli i przenieść ją do drugiej probówki rozetrzeć w płynnym podłożu na ściankach probówki i zmyć pożywką.

Podczas siewu i dosiewu należy zwrócić uwagę na przestrzeganie zasad sterylności, aby nie skazić swoich upraw obcą mikroflorą, a także nie zanieczyszczać środowiska. Probówki etykietuje się i umieszcza w termostacie w celu inkubacji w temperaturze 37°C na 24 godziny.

Wniosek

Rozliczanie wyników. Podsumowanie badania. Wyniki identyfikacji są brane pod uwagę i na podstawie całości uzyskanych danych, w oparciu o klasyfikację i charakterystykę typowych szczepów opisanych w podręczniku (klucz Burgee'ego, 1994-1996), określa się rodzaj izolowanych upraw.