Direktne i indirektne virološke metode istraživanja. Virološke metode istraživanja u mikrobiologiji. Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija

Glavne metode koje se koriste u dijagnostici virusnih bolesti su uzgoj i identifikacija virusa.

Za dokazivanje virusne etiologije bolesti potrebno je: izolaciju virusa iz tijela bolesne ribe, prolazak na kulturu stanica ili osjetljivu ribu, reprodukciju bolesti kod zdravih riba iste ili srodne ribe. vrsta, ponovljena izolacija istog virusa iz eksperimentalnih životinja.

Za identifikaciju virusa koristi se nekoliko komplementarnih metoda: elektronska mikroskopija virusa, proučavanje njegovih fizičko-hemijskih svojstava, otkrivanje karakterističnih morfoloških promjena u inficiranim stanicama i simptoma kod zaraženih životinja, različite imunološke metode.

Virusi se izoluju uglavnom na jednoslojnim primarnim ili kontinuiranim kulturama ćelija, birajući u svakom slučaju kulture koje su osetljive na dati virus. Za dobivanje primarnih kultura ribljih stanica najčešće se koriste spolne žlijezde ženke ili karasa. Gonade treba da budu II ili II-III stepen zrelosti prema Kiselevičevoj skali. Takve gonade ne sadrže jajašca vidljiva golim okom. Inače će sadržaj jaja negativno utjecati na rast stanica. Ćelijske kulture iz spolnih žlijezda šarana i karasa pripremaju se prema odobrenoj metodi.

Sljedeće ćelijske linije se najčešće koriste kao kontinuirane kulture: FHM - iz tkiva kaudalne peteljke debeloglave goveđe; RTG - od gonada kalifornijske pastrmke; EPC - od izraslina velikih boginja na koži šarana. Ove linije se održavaju u specijalizovanim laboratorijama za proučavanje bolesti riba u veterinarskim i ribarskim istraživačkim institutima, gde se mogu naručiti i primiti.

Prilikom dijagnosticiranja dobro proučenih virusnih bolesti, ispituju se organi i tkiva u kojima je uzročnik koncentriran.

U slučaju bolesti riba, o kojima nema dovoljno podataka, virološki se ispituju najugroženiji organi. Struge sa kože i škrga, komadići ovih organa zajedno sa sluzi stavljaju se u sterilne bočice sa 2-3 ml sterilne fiziološke ili puferske otopine. Uzorci iz unutrašnjih organa uzimaju se u strogo aseptičnim uslovima.

U slučajevima kada je nemoguće brzo pregledati materijal, čuva se ne više od jednog dana u frižideru na temperaturi do 5°C. Zamrznuti materijal može se čuvati duže vrijeme.

Patološki materijal namijenjen za istraživanje usitnjava se u homogenizatoru ili melje u porculanskom malteru s kvarcnim pijeskom. 10% suspenzija se priprema od usitnjenog tkiva u Hanksu, Earleu, puferu ili fiziološkim rastvorima i centrifugira 10-15 minuta na 2000-3000 o/min, supernatant se odsisa pipetom i stavi u sterilne bočice. Ukoliko suspenzija nije sterilna, pripremljeni materijali se filtriraju kroz membranske filtere prečnika pora 0,2-0,45 μm ili tretiraju antibioticima (penicilin 1000 U/ml i streptomicin 1000 μg/ml).

Od crijevnog sadržaja u sterilnoj destilovanoj vodi priprema se 20% suspenzija i centrifugira 10-15 minuta na 2000 o/min. Supernatant se ponovo centrifugira na 4000-5000 o/min tokom 30 minuta. Supernatant se zatim aspirira u sterilnu bočicu i tretira antibioticima. Dodajte 1000 μg/ml streptomicina i 1000 U/ml penicilina na 1 ml. Smjesa se drži 2-3 sata na: sobnoj temperaturi. Svi materijali su testirani na bakterijsku sterilnost inokulacijom MPB i MPA. Pripremljeni materijali se odmah koriste za rad ili, u ekstremnim slučajevima, skladište zamrznuti (na temperaturi od minus 20°C).

Infekcija ćelijske kulture. Za infekciju se koriste epruvete s dobrim staničnim monoslojem ili zonom rasta oko eksplantata. Hranljivi medij se izvuče i u svaku epruvetu se doda 0,2-0,3 ml test suspenzije. Istovremeno se u epruvete dodaje 0,8-0,9 ml hranljive podloge sa 2-3% seruma.

Materijal pripremljen od svakog uzorka koristi se za inficiranje kulture tkiva u 4-6 epruveta. Iz svake serije studija ostavljen je isti broj epruveta kao kontrola, dodajući im 1 ml hranljive podloge. Epruvete se ostavljaju na sobnoj temperaturi 1-2 sata kako bi se virus adsorbirao na ćelije, zatim se supernatant odsisava pipetom i dodaje se hranljivi medij za održavanje do prvobitne zapremine.

Zaražene i kontrolne ćelijske kulture se inkubiraju na temperaturi od 22-26°C i svakodnevno se pregledavaju pod malim povećanjem mikroskopa kako bi se otkrile morfološke promjene u stanicama. U slučaju teške degeneracije ćelija, tečnost kulture se isisava i prave se pasaži, a u nedostatku citopatogenog efekta (CPE) izvode se dva uzastopna pasaža. Da bi se to postiglo, koristi se tečnost kulture zajedno sa frakcijom ćelija uništenom ponovljenim zamrzavanjem i odmrzavanjem. Za inficiranje svježih kultura koristite supernatant centrifugirane ćelijske mase. CPE nakon trećeg pasusa uzima se u obzir kao specifično dejstvo virusnog agensa.

Stepen oštećenja monosloja ćelije se procenjuje korišćenjem 4-križnog sistema; " + - oštećenje do 25%, " + + " - do 50%, "+ + +" - do 75% i " + + + + " - do 100% monosloja.

Kod nekih virusnih bolesti riba, inkluzijska tijela se pojavljuju u stanicama (citoplazmatskom jezgru) različitih organa i tkiva. Materijal za proučavanje virusnih inkluzija su zaražene kulture tkiva, struganje i razmazi otiska sa organa i tkiva; prije bojenja ovi materijali se fiksiraju prema opšteprihvaćenim metodama, korištenjem Dubosc-Brazil-Buena, Buena, Carnoy tekućine ili 10% otopine neutralni formaldehid.

Virusne inkluzije se boje različitim metodama: Muromtsev, Rubina, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa, itd.

Titracija virusa- kvantitativno određivanje aktivnosti virusa. Titar virusa izražava se brojem infektivnih jedinica sadržanih u jedinici volumena suspenzije virusa. Infektivna jedinica virusa definira se kao doza koja uzrokuje infekciju u 50% osjetljivih objekata zaraženih njime. Ova doza virusa naziva se infektivnom i označena je ID 50.

Ćelijske kulture se uglavnom koriste kao osjetljivi objekti prilikom titriranja ribljih virusa. Titracija na ćelijskoj kulturi vrši se prema citopatogenom dejstvu virusa. U ovom slučaju, ID 50 se naziva tkivna citopatogena doza (TCD 50), a titar virusa se izražava količinom TCD 50 u 1 ml virusne suspenzije. Titar virusa se određuje metodom konačnog razrjeđivanja. Prema ovoj metodi, osjetljive stanične kulture ubrizgavaju određeni volumen virusne suspenzije u sukcesivno rastućim razrjeđenjima i, uzimajući u obzir rezultat svake injekcije kao pozitivan (ako postoji CPP) ili negativan ako nema CPP-a, titracija izračunava se krajnja tačka - 1 TCD 50.

Za titriranje virusa koji daju izraženu CPE koristi se i metoda plaka. U tom slučaju se monosloj ćelija inficiranih virusom prelije mješavinom hranjivog medija sa agarom kako bi se spriječio prijenos virusa na druge stanice koje su značajno udaljene od inicijalno zaraženih, te kako bi se inficirale početne stanice. žarišta infekcije plaka).

Svaki plak nastaje iz jedne infektivne jedinice, koja je označena kao PFU (plaque-forming unit), a titar virusa se izražava kao broj PFU po jedinici zapremine suspenzije.

Reakcija neutralizacije(RN) na ćelijsku kulturu.

Reakcija se zasniva na vezivanju antigena antitijelima homolognog antiseruma. Reakcija se koristi za identifikaciju patogena u dijagnozi bolesti virusne etiologije. Omogućava vam da odredite nepoznati virusni antigen prema poznatim antitijelima ili prema poznatom (standardnom) antigenu - nepoznata antitijela u serumu bolesnih ili oporavljenih riba.

Određivanje izolovanog virusa u reakciji neutralizacije provodi se pomoću seta dijagnostičkih hiperimunih antiseruma (antitijela) antigena (virusa) koji su im homologni.

Hiperimuni antiserumi se dobivaju inficiranjem laboratorijskih životinja (na primjer, zečeva) poznatim sojevima virusa koji uzrokuju bolesti riba. Određuju se titri specifičnih antitela u dobijenim antiserumima. Za rad uzmite antiserume koji sadrže antitijela u visokim titrima.

Redosled reakcije.

1. Inaktivacija normalnog i hiperimunog seruma zagrijavanjem na 56 o C u trajanju od 30 minuta.

2. Priprema razblaženja reakcionih sastojaka. Antigen i serum se razblažuju hranljivom podlogom bez seruma i antibiotika, počevši od 1:5, 1:50, 1:500 pa sve dok se ne dobije razblaživanje koje sadrži manje od 1 TCD 50 / 0,2 ml. Hiperimuni serum se razblaži 1:2 ili 1:5. Ako je titar nizak, serum se koristi nerazblažen. Normalni serum se razrjeđuje na isti način kao i hiperimuni serum.

3. Postavljanje reakcije. Tri reda sterilnih epruveta se stavljaju u stalak. U prvi red se sipa razblaženi hiperimuni serum, u drugi razblažen normalni serum, a u treći hranljivi medij. Svaki sastojak se dodaje u zapremini od 0,5 ml.

Pripremljena razblaženja virusa prenose se u količinama od 0,5 ml u odgovarajuće epruvete svakog od tri reda, a virus svakog razblaženja I prenosi se posebnom pipetom, počevši od najvećeg razblaženja. Tako se u svakom redu epruveta dobijaju uzastopna desetostruka razrjeđenja virusa: 10-1, 10-2, itd.

Za kontrolu toksičnosti seruma dodajte 0,5 ml pripremljenog razblaženja hiperimunog seruma u posebnu epruvetu, a zatim dodajte jednaku količinu hranljive podloge. Isto se radi i sa normalnim serumom.

Epruvete sa smjesama se dobro promućkaju i drže na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim se stanična kultura inficira svakim razblaženjem virusa (0,2 ml po epruveti) hiperimunim normalnim serumom i hranljivim medijumom, po 4 epruvete za ćelijske kulture. Istovremeno se postavljaju kontrole toksičnosti korištenih ćelija i kontrolni uzorci ćelijske kulture.

Epruvete sa ćelijskom kulturom inkubiraju se u termostatu na optimalnoj temperaturi za razmnožavanje određenog virusa i svakodnevno se pregledavaju pod mikroskopom malog povećanja kako bi se otkrio CPE virusa. Rezultati se unose u tabelu (Tabela 11).

Titar virusa izražava se brojem infektivnih jedinica sadržanih u jedinici zapremine virusne suspenzije. Pronađite indeks neutralizacije (IN). Odgovara maksimalnoj količini ID 50 koja se može neutralizirati hiperimunim serumom. IN se izračunava pomoću formule: logIN = logT 1 -lgT 2, gdje je T 1 titar virusa u prisustvu normalnog seruma; T 2 - titar virusa u prisustvu hiperimunog seruma. Vrijednost IN se nalazi iz tabele antilogaritama. Općenito je prihvaćeno da je IN vrijednost do 10 negativna, od 10 do 49 sumnjiva, a 50 ili više je pozitivan rezultat.

Rezultati reakcije mogu se smatrati pouzdanim samo ako se hiperimuni serum testira na specifičnu neutralizirajuću aktivnost. Da bi se to postiglo, prvo se određuje titar neutralizirajućih antitijela u ovom serumu ili njegov indeks neutralizacije u reakciji s homolognim virusom.

Izolacija rabdovirusa metodom plaka. Ova metoda je specifična, koristi se za izolaciju, preliminarnu tipizaciju i selekciju rabdovirusa šarana i pastrmke u prisustvu specifičnih imunoloških seruma za identifikaciju virusa.

Okrugle kolonije (plakovi) se formiraju u ćelijskim kulturama pod agar oblogom u prisustvu virusa u test materijalu.

U aseptičnim uslovima, tkivo bubrega, jetre, slezine i tečnosti iz trbušne duplje sakupljaju se Pasteurom pipetom, prebacuju u bocu sa medijumom koji sadrži 500 IU (mcg)/ml antibiotika u omjeru 1:10. Inkubirati 60-90 minuta na temperaturi od 18-22 °C, zatim centrifugirati na 2-3 hiljade o/min 10 minuta. Supernatant se razblaži hranljivim medijumom 1:10 (razblaživanje 1:100). Za inficiranje ćelijskih kultura koriste se supernatantne tekućine oba razrjeđenja.

Za studiju, 3-dnevna kontinuirana ćelijska kultura uzgajana u madracima s dobro definiranim monoslojem je odabrana po stopi od 2 dušeka za svako razrjeđivanje patološkog materijala i 2 dušeka za kontrolu. Hranljivi medij se uklanja iz boca i dodaje se 2 ml podloge bez fetalnog seruma. Zatim se doda 0,2 ml test materijala i ostavi da se virus adsorbuje 60 minuta na optimalnoj temperaturi za viruse koji inficiraju ribu (za viruse šarana - 24-26°C i za viruse pastrmke - 16-18°C).

Kontrola se stavlja u 2 madraca sa ćelijskim kulturama od po 0,2 ml, koje sadrže 100 TCD 50/ml poznatog virusa, iu 2 - 0,2 ml hranljive podloge bez virusa.

Nakon 60 minuta, tečnost se uklanja iz bočica. Uz zid nasuprot monosloju dodati 5 ml agar premaza zagrijanog na 40-42°C u bocu od 50 ml, zagrijanu na 40-42°C (pri izolaciji HCV virusa - ne više od 38°C). Dušeci su jednoslojno okrenuti prema dolje i obloženi crnim papirom. Nakon 15-20 minuta, dušeci se prenose na inkubaciju na optimalnoj temperaturi za viruse koji se proučavaju. Dušeci se postavljaju tako da je agar premaz okrenut prema gore. Ako je virus nepoznat, kulture se čuvaju na dva temperaturna uslova - 14-18 i 22-24°C.

Zaražene ćelijske kulture se gledaju na bijeloj pozadini. Ako postoji virus u ćelijskoj kulturi koja se proučava, prozirne tačke se prvo pojavljuju na ružičasto-mat pozadini kulture. Nakon toga se povećavaju u veličini, formirajući okrugle prozirne kolonije - plakove, čije prisustvo ukazuje na prisutnost rabdovirusa u patološkom materijalu.

Uz pomoć Pasteurove pipete, uzmite komad plaka na granici zahvaćenog i nezahvaćenog dijela, tako da se uključi ne samo sloj agara, već i sloj ćelija. Odabrani komad se stavlja u epruvetu sa 1 ml medijuma za rast, zamrzava na minus 20°C i drži 60 minuta. U slučaju velikog broja plakova (cijeli ćelijski sloj je providan), studije se ponavljaju u razrjeđenjima od 10 -3 i 10 -4.

Plakovi prečnika 3-8 mm rabdovirusa šarana na kontinuiranoj kulturi EPC i FHM, inkubirani na temperaturi od 24-26°C, pojavljuju se 4-7.

U odsustvu plakova i prisutnosti CPD-a u ćelijskim kulturama, provode se dodatne studije na tečnosti kulture koja sadrži virus u razblaženjima od 10 -2 -10 -3 (2-3 pasaža). Dodatne metode za identifikaciju virusa uključuju: metodu fluorescentnih antitijela; određivanje osjetljivosti virusa na hloroform, eter, pH vrijednost, zagrijavanje; elektronsko mikroskopsko proučavanje morfologije virusa.

Istraživanje za dijagnostiku bolesti virusne prirode. Ovo je neophodno za identifikaciju virusa, proučavanje njegove biologije i sposobnosti da utiče na životinjske i ljudske ćelije. Tako postaje moguće razumjeti patogenezu virusnih bolesti i, shodno tome, odabrati pravu metodu liječenja.

Šta je dijagnoza?

U živim ćelijama. Za njegovo proučavanje potrebno ga je uzgajati na nivou eksperimentalnog organizma ili Za to se u medicinskoj praksi i mikrobiologiji općenito provode virološke metode istraživanja koje imaju sljedeće glavne pristupe:

• ravno;
• indirektno;
• serološki.

Materijal se može direktno ispitati na prisustvo nukleinskih kiselina, virusnog antigena ili, na primjer, virus se može izolirati i identificirati iz kliničkog materijala.

Pored mogućnosti utvrđivanja etiologije bolesti i praćenja terapijskog efekta, značajnu ulogu u antiepidemijskim mjerama imaju i virološke metode istraživanja. Za izolaciju se koriste pileći embriji, laboratorijske životinje ili ćelijske kulture.

Kako se istražuje?

Najbrža je direktna metoda. Omogućava vam da otkrijete virus, antigen ili NA (nukleinsku kiselinu) u samom kliničkom materijalu. Traje od dva sata do jednog dana.

1. EM - elektronska mikroskopija. Direktno detektuje virus.
2. IEM - imunološka elektronska mikroskopija. Koristi specifična antitijela na viruse.
3. RIF - reakcija imunofluorescencije. Koristi antitijela vezana za boju. Takve virološke metode istraživanja naširoko se koriste za brzo dešifriranje etiologije ARVI (akutne respiratorne virusne infekcije), kada se uzimaju brisovi otiska prsta sa sluznice gornjih dišnih puteva.
4. ELISA - enzimski imunosorbentni test - određivanje virusnih antigena, slično RIF-u, ali zasnovano na obilježavanju antitijela enzimima.
5. RIA - radioimunotest. Koristi radioaktivno označavanje antitela da obezbedi visoku osetljivost u otkrivanju virusnog antigena.
6. Molekularna - NK hibridizacija ili izolacija virusnih genoma korištenjem PCR (lančana reakcija polimeraze).
7. Citologija se rijetko koristi, ali za određene infekcije ove virološke metode istraživanja su vrlo učinkovite. Ispituju se biopsijski materijali, obdukcije i razmazi obrađeni za bojenje i analizu pod mikroskopom.

Koja je svrha istraživanja?

Za uspješnu izolaciju virusa uzima se klinički materijal u skladu s patogenezom i što je ranije moguće. Često ovaj proces zahtijeva nekoliko pasusa prije primjene određenih viroloških istraživačkih metoda.

Mikrobiologija je nauka o mikroskopskim stvorenjima. A njeno polje nije samo medicina. To je fundamentalna nauka za poljoprivredu, veterinu, svemirsku i tehničku industriju i geologiju.

Ali naravno sve je stvoreno za čovjeka i njegov razvoj na ovoj prekrasnoj planeti. Stoga je vrlo važno na vrijeme otkriti opasnost i neutralizirati je. Virusi se razlikuju od bakterija. To su strukture koje ulaze u tijelo i uzrokuju formiranje nove generacije. Izgledaju kao kristali i imaju za cilj kontrolu procesa njihove reprodukcije, iako se sami ne hrane, ne rastu i ne luče metaboličke proizvode.

Virus je sposoban da izazove tešku bolest u bilo kom živom organizmu u koji uđe. Osim toga, može evoluirati. Zato se virološke metode istraživanja u mikrobiologiji moraju razvijati i usavršavati, jer ljudska civilizacija u cjelini može biti ugrožena.

Materijali

Za otkrivanje i identifikaciju virusa u medicini, u pravilu se uzimaju sljedeće:

• ispiranje nazofarinksa (respiratorne infekcije);
• crvenilo i izmet (enterovirusne infekcije);
• strugotine, sadržaj plikova (lezije kože, sluzokože, kao što su herpes, vodene kozice);
• crvenilo (egzantemske infekcije kao što su boginje, rubeola);
• krv, cerebrospinalna tečnost (arbovirusne infekcije).

Faze

Sve faze virološke metode istraživanja uključuju:

• prikupljanje materijala;
• izbor, dobijanje test sistema, utvrđivanje njegove održivosti;
• infekcija test sistema;
• indikacija virusa;
• određivanje vrste virusa.

U osnovi, patogeni virusi se razlikuju po prisutnosti tkiva i specifičnosti tipa. Uzmimo, na primjer, poliovirus, koji se razmnožava samo kod primata (u njihovim stanicama). U skladu s tim, za izolaciju specifičnog virusa koristi se posebna kultura tkiva. Ako je riječ o nepoznatom patogenu, onda bi bilo preporučljivo istovremeno inficirati tri, ili još bolje, četiri ćelijske kulture.

Stoga će možda jedan od njih biti osjetljiv. Da bi se utvrdilo prisustvo virusa u zaraženim kulturama, posmatraju razvoj specifične degeneracije ćelija, intracelularne inkluzije, identifikaciju specifičnog antigena, pozitivne hemaglutinacijske i hemadsorpcione reakcije.

Sve virološke metode istraživanja (direktne i indirektne, serološke) treba odabrati kao najprikladnije za konkretan slučaj sumnje na infekciju.

Indirektne metode se zasnivaju na izolaciji i identifikaciji virusa. Oni su radno intenzivni, dugotrajni, ali tačni.

Serodijagnostika

Ova dijagnoza se odnosi na metodu zasnovanu na reakciji antigen-antitijelo. Najčešće se koriste upareni krvni serumi, uzimani u intervalima od nekoliko sedmica. Ako se titar antitijela poveća 4 puta ili više, reakcija se smatra pozitivnom. Za određivanje tipske specifičnosti virusa koristi se reakcija neutralizacije virusa. Da bi se odredila specifičnost grupe, potrebno je dobiti reakciju fiksacije komplementa.

Široko se koriste različite varijante enzimskog imunoeseja, reakcije inhibicije hemaglutinacije, pasivne hemaglutinacije, reverzne pasivne hemaglutinacije i RIF-a. Čak je i u genetskom inženjeringu razvijena metoda za proizvodnju monoklonskih antitijela. Uska specifičnost monoklona može se prevladati upotrebom nekoliko monoklonskih antitijela na različite virusne determinante. Time je povećana specifičnost i osjetljivost testa za detekciju antigena.

Neke karakteristike

Danas je stvoreno mnogo različitih test sistema za imunološku dijagnostiku infekcija koje nastaju ulaskom virusa u živi organizam.

Dakle, virološke metode istraživanja su metode za izolaciju virusa, proučavanje njihovih svojstava i utvrđivanje njihove etiološke veze s određenim bolestima.

Rad na kursu

"Metode kliničke virologije"

Uvod

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija provodi se uglavnom pomoću elektronske mikroskopije, osjetljivih ćelijskih kultura i imunoloških metoda. U pravilu se bira jedna metoda za postavljanje dijagnoze ovisno o stadiju virusne infekcije. Na primjer, sva tri pristupa mogu biti korisna u dijagnostici varičele, ali uspješna upotreba mikroskopije i tehnika ćelijske kulture ovisi o sposobnosti prikupljanja zadovoljavajućih uzoraka relativno rano u bolesti.

Uspeh virusne dijagnostike u velikoj meri zavisi od kvaliteta dobijenih uzoraka. Iz tog razloga, samo laboratorijsko osoblje mora biti direktno uključeno u prikupljanje potrebnih uzoraka. Karakteristike uzoraka, kao i metode za njihovu dostavu u laboratorij, opisali su Lennett, Schmidt, Christ, et al.

Većina reagensa i instrumenata koji se koriste u laboratorijskoj dijagnostici mogu se kupiti od raznih kompanija. U većini slučajeva, isti reagens istovremeno proizvodi nekoliko kompanija. Iz tog razloga nismo naveli pojedinačne kompanije, osim ako reagens isporučuje samo jedna kompanija. U svim ostalim slučajevima treba se obratiti na opštu listu dobavljača navedenu u tabeli. 1.

Nismo imali za cilj da pružimo sveobuhvatan opis svih trenutno dostupnih metoda za dijagnostiku ljudskih virusnih infekcija. Prije svega, okarakterizirali smo glavne metode. Kako steknete iskustvo samostalnog rada, ove osnovne tehnike se mogu koristiti za rješavanje složenijih problema.

1. Elektronska mikroskopija

Za elektronsko mikroskopsku dijagnozu virusnih infekcija mogu se koristiti tanki rezovi zahvaćenog tkiva. Najčešći materijal koji se koristi za elektronsku mikroskopiju je izmet ili tekućina.

Tabela 1. Spisak kompanija koje isporučuju reagense i opremu

Flow Laboratories: Gibco Europe: Usluge kulture tkiva: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Jedinica 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, Dart5 UK Temple Hill, DAI UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, B8right Hill TWZ11, UK Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK

vezikule koje karakterišu neke bolesti, kao što su vodene kozice. Kada se analizira takav materijal, virusi se mogu detektovati korištenjem negativnog bojenja, što rezultira materijalom gustim elektronima koji ocrtava komponente viriona. Metoda je efikasna kada je koncentracija virusa visoka u uzorcima za testiranje, kao što su feces ili vezikularna tekućina. U slučajevima kada je sadržaj virusnih čestica u uzorcima nizak, vjerovatnoća otkrivanja virusa može se povećati koncentriranjem virusa ultracentrifugiranjem ili agregacijom sa specifičnim antitijelima. Posljednja metoda je također pogodna za identifikaciju virusa. Ovdje ćemo opisati elektronsko mikroskopsku metodu za dijagnosticiranje rotavirusne infekcije i metodu imunoelektronske mikroskopije na primjeru detekcije specifičnih antitijela na parvoviruse. Metode elektronske mikroskopije detaljnije opisuje Field.

2.1 Direktan elektronski mikroskopski pregled fecesa

1. Umočite vrh Pasteurove pipete u izmet i izvucite dovoljno materijala da dobijete mrlju od 1 cm.

2. Resuspendirajte fekalni razmaz u elektronsko mikroskopskoj negativnoj kontrastnoj boji dok se ne dobije prozirna suspenzija. Negativna kontrastna boja je 2% rastvor fosfovolframske kiseline u destilovanoj vodi.

3. Da bi se dobio elektronski mikroskopski uzorak, kap suspenzije se stavlja na rešetku za elektronsku mikroskopiju obloženu filmom u obliku ugljenika. Tokom ove operacije, mrežica se drži parom tankih pinceta.

4. Lijek se ostavi na zraku 30 s.

5. Višak tečnosti se uklanja dodirivanjem ivice čaše filter papirom.

6. Lijek se suši na zraku.

7. Ako je potrebno, održivi virus se inaktivira zračenjem obje strane mreže ultraljubičastim svjetlom intenziteta od 440.000 μW-s/cm2. U ovom slučaju koristi se kratkotalasna ultraljubičasta lampa sa filterom. Svjetiljka treba biti na udaljenosti od 15 cm od mreže; Vrijeme zračenja za svaku stranu je 5 minuta.

8. Virioni rotavirusa mogu se okarakterisati pod transmisijskim elektronskim mikroskopom sa uvećanjem od 30.000 do 50.000.

2.2 Imunoelektronska mikroskopija

Metoda imunoelektronske mikroskopije opisana u nastavku samo je jedna od mnogih sličnih imunoloških metoda. Za proučavanje virus-specifičnih antitijela, osim toga, koristi se metoda koja uključuje vezivanje za mikroskopsku mrežu proteina A. Radna koncentracija antivirusnih antitijela se određuje metodom pokušaja i grešaka u rasponu od 1/10 do 1/1000. Koncentracija koju naznačimo obično se koristi u rutinskom radu. Za postizanje optimalnih rezultata za interakciju antitijela sa virusom, serum koji sadrži parvovirus titrira se na isti način.

1. 10 µl antiseruma za humani parvovirus razrijeđeno je 100 puta sa PBS. Rastvor se zagreva u vodenom kupatilu do 56°C.

2. Rastopite 10 ml 2% agaroze u PBS na uobičajeni način i ohladite na 56 °C u vodenom kupatilu.

3. Na 56 °C pomiješajte 1 ml razrijeđenog antiseruma sa 1 ml 2% agaroze.

4. Prenesite 200 µl rezultujuće smjese u dvije jažice mikrotitarske ploče sa 96 jažica.

5. Agarozu se ostavi da se stegne na sobnoj temperaturi. Tableta se može čuvati na 4°C nekoliko sedmica ako je zalijepljena ljepljivom trakom.

6. Dodajte 10 µl seruma koji sadrži parvovirus u jažicu koja sadrži mješavinu agaroze i antiseruma.

7. Na manje sjajnu stranu na kapi seruma postavlja se mreža za elektronsku mikroskopiju sa prethodno pripremljenim premazom od ugljika.

8. Mrežica se drži 2 sata na 37 °C u vlažnoj komori.

9. Tankom pincetom izvadite mrežicu i nanesite kap 2% fosfovolframske kiseline na površinu mrežice koja je bila u kontaktu sa serumom.

10. Nakon 30 s, višak boje se ispere, preparat se osuši i virus se inaktivira.

Agregirane virusne čestice se ispituju pod transmisijskim elektronskim mikroskopom pri uvećanju od 30.000 do 50.000.

3. Identifikacija virusnih antigena

Virusi koji se nalaze u tkivima ili tkivnim tečnostima mogu se identificirati pomoću proteina specifičnih za virus korištenjem reakcije antigen-antitijelo. Produkt reakcije antigen-antitijelo se testira na oznaku koja se uvodi ili direktno u antivirusna antitijela ili u antitijela usmjerena protiv virus-specifičnih antitijela. Antitijela se mogu označiti fluoresceinom, radioaktivnim jodom ili enzimom koji cijepa supstrat uzrokujući promjenu boje. Osim toga, reakcija hemaglutinacije se koristi za identifikaciju virusa. U svakodnevnoj praksi opisane metode koriste se uglavnom za otkrivanje antigena virusa hepatitisa B u krvi i traženje antigena različitih virusa koji uzrokuju različite respiratorne bolesti.

Trenutno mnoge kompanije proizvode eritrocitnu, radioaktivnu i enzimsku dijagnostiku, uključujući i onu za otkrivanje virusa hepatitisa B. Ne smatramo preporučljivim iznositi metode za rad sa ovom dijagnostikom: dovoljno je pratiti uputstva u prilogu. U nastavku ćemo se fokusirati na metodu imunofluorescencije za identifikaciju respiratornog sincicijalnog virusa u nazofaringealnim sekretima.

3.1 Identifikacija respiratornog sincicijalnog virusa u nazofaringealnim sekretima imunofluorescencijom

Metodu za dobijanje preparata nazofaringealnog sekreta opisali su Gardner i McQuillin. U laboratorijskim uslovima ova operacija se izvodi u dvije faze. Prvo se priprema razmaz nazofaringealne sluzi na predmetnom predmetu. Dobijeni razmazi mogu se čuvati fiksirani na -20°C više mjeseci. U drugoj fazi, brisevi se boje kako bi se otkrio antigen respiratornog sincicijalnog virusa. U tu svrhu koristi se metoda indirektne imunofluorescencije.

3.1.1 Priprema preparata nazofaringealnog sekreta

1. Sluz iz specijalnih pinceta se ispere sa 1-2 ml PBS-a i prenese u epruvetu za centrifugiranje.

2. Centrifugirajte 10 minuta na 1500 o/min u stolnoj centrifugi.

3. Supernatant se ocijedi.

4. Peleta ćelija se pažljivo resuspenduje u 2-3 ml PBS-a dok se ne dobije homogena suspenzija. Da biste to učinili, koristite Pasteurovu pipetu širokog grla.

5. Dobivena suspenzija se prebacuje u epruvetu.

6. Dodati još 2-4 ml PBS u suspenziju i promiješati pipetiranjem. Veliki ugrušci sluzi se uklanjaju.

7. Centrifugirajte 10 minuta na 1500 o/min u stolnoj centrifugi.

8. Supernatant se odbacuje, sediment se resuspendira u takvoj količini PBS-a da se nastala suspenzija lako odvaja od zidova epruvete.

9. Dobivena suspenzija se nanosi na označeno staklo.

10. Staklo se suši na vazduhu.

Fiksirati u acetonu 10 min na 4°C.

12. Nakon fiksiranja, staklo se ponovo suši na vazduhu.

13. Dobijeni preparati se odmah boje ili čuvaju na -20 °C.

3.1.2. Tehnika bojenja

1. Odštampajte i razblažite komercijalni RSV antiserum u PBS do preporučene radne koncentracije.

2. Pasterovom pipetom naneti jednu kap antiseruma na pripremljeni preparat.

3. Lijek se stavlja u vlažnu komoru.

4. Lijek se inkubira 30 minuta na 37 °C.

5. Uzorci se pažljivo ispiru PBS-om kako bi se uklonila višak antitijela u posebnom rezervoaru.

6. Uzorci se peru u tri smjene PBS-a, po 10 minuta.

7. Osušite uzorke, uklonite višak PBS filter papirom i osušite na zraku.

Virološke metode istraživanja— metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se široko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, metode njihovog prodiranja u ćeliju i karakteristike virusne reprodukcije, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina i proteina. Razvijaju se metode za određivanje redoslijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje oni kodiraju sa nukleotidnom sekvencom i utvrditi uzroke intracelularnih procesa koji imaju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s antitijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, enzimska aktivnost), karakteristikama interakcije virusa sa ćelijom domaćinom (priroda citopatskog efekta). , formiranje intracelularnih inkluzija itd.) .

U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao i u proizvodnji vakcinalnih preparata, široko se koristi metoda kulture tkiva i ćelija. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne ćelijske kulture. Primarne kulture se dobijaju raspršivanjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor ćelija mogu biti tkiva i organi (obično bubrezi) ljudskih i životinjskih embriona. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u takozvane madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje, nakon što se pričvrste za površinu posude, stanice počinju da se razmnožavaju. Za infekciju virusom obično se koristi stanični monosloj. Hranljiva tečnost se ocijedi, virusna suspenzija se dodaje u određenim razblaženjima, a nakon kontakta sa ćelijama dodaje se sveža hranljiva podloga, obično bez seruma.

Ćelije većine primarnih kultura mogu se subkulturisati; takva kultura se naziva sekundarna kultura. Daljnjim prolaskom ćelija formira se populacija ćelija sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava originalni skup hromozoma. To su takozvane diploidne ćelije. Serijskim kultivisanjem ćelija dobijaju se stabilne kontinuirane ćelijske kulture. Tokom pasaža pojavljuju se brzo dijeleće se homogene ćelije sa heteroploidnim skupom hromozoma. Stabilne ćelijske linije mogu biti jednoslojne ili suspenzije. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, dok suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u različitim posudama pomoću uređaja za miješanje. Postoji više od 400 ćelijskih linija koje potiču od 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, insekte) i ljudi.

Komadići pojedinačnih organa i tkiva (kulture organa) mogu se uzgajati u vještačkim hranljivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (na primjer, koronavirusi).

U inficiranim ćelijskim kulturama virusi se mogu otkriti promjenama u ćelijskoj morfologiji, citopatskim efektima, koji mogu biti specifični, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u ćeliji i u tečnosti kulture; utvrđivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tečnosti kulture i titriranje virusa u kulturi tkiva, pilećih embriona ili osetljivih životinja; identifikacijom pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u ćelijama molekularnom hibridizacijom ili akumulacijom nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je radno intenzivan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se odredio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među populacijom (na primjer, za identifikaciju serovarijante virusa gripe, divljeg ili vakcinalnog soja virusa dječje paralize, itd.); u slučajevima kada je potrebno sprovesti hitne epidemiološke mere; kada se pojave novi tipovi ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoline. Prilikom izolacije virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane sa dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobijena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a proces njegovog dobijanja naziva se kloniranje.

Za izolaciju virusa koristi se infekcija osjetljivih laboratorijskih životinja i pilećih embrija, ali najčešće se koristi kultura tkiva. Prisustvo virusa se obično utvrđuje specifičnom degeneracijom ćelije (citopatski efekat), formiranjem simplasta i sincicija, detekcijom intracelularnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom otkrivenim imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (za hemaglutinirajuće viruse) itd. . Ovi znakovi se mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Pileći embriji se koriste za izolaciju brojnih virusa, kao što su virusi gripe, a novorođeni miševi se koriste za izolaciju nekih Coxsackie virusa i brojnih arbovirusa. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim reakcijama i drugim metodama.

Prilikom rada s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa se obično provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i virusa specifičnih antigena. Metoda plaka može se koristiti za titriranje brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa su žarišta ćelija koje je virus uništio u jednoslojnoj kulturi tkiva ispod agar premaza. Brojanje kolonija omogućava kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na osnovu toga da jedna čestica infektivnog virusa formira jedan plak. Plakovi se otkrivaju bojenjem kulture intravitalnim bojama, obično neutralno crvenom; plakovi ne adsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svjetlosne mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa se izražava kao broj jedinica koje formiraju plak po 1 ml.

Pročišćavanje i koncentracija virusa obično se postiže diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje s gradijentom koncentracije ili gustine. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, jonoizmenjivačka hromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje patogena ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinačnom slučaju ovisi o prirodi bolesti, periodu bolesti i mogućnostima laboratorije. Savremena dijagnostika virusnih infekcija bazira se na ekspresnim metodama koje omogućavaju dobijanje odgovora nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim stadijumima bolesti, uključujući elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije. , otkrivanje antitela IgM klase itd.

Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućava razlikovanje virusa i određivanje njihove koncentracije. Upotreba elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve kada je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu prilično visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj grupi. Ovaj nedostatak se prevazilazi upotrebom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se zasniva na formiranju imunoloških kompleksa dodavanjem specifičnog seruma virusnim česticama, uz istovremeno koncentriranje virusnih čestica, omogućavajući njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U ekspresne dijagnostičke svrhe vrši se elektronski mikroskopski pregled ekstrakata tkiva, fecesa, tečnosti iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se široko koristi za proučavanje morfogeneze virusa; njene mogućnosti se proširuju upotrebom obilježenih antitijela.

Metoda molekularne hibridizacije, zasnovana na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućava otkrivanje pojedinačnih kopija gena i nema ravne po osjetljivosti. Reakcija se zasniva na hibridizaciji komplementarnih DNK ili RNK lanaca (sonda) i formiranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Upotreba kolorimetrijskih reakcija je obećavajuća. Postoji nekoliko opcija za molekularnu hibridizaciju: spot hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija, itd.

Antitijela IgM klase se pojavljuju ranije od antitijela G klase (3.-5. dana bolesti) i nestaju nakon nekoliko sedmica, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Antitela klase lgM detektuju se imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom korišćenjem anti-m antiseruma (serumi protiv teških lanaca lgM).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanja ): reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove tehnike se stalno usavršavaju. Ove metode se koriste za identifikaciju virusa korištenjem skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku za određivanje porasta antitijela u drugom serumu u odnosu na prvi (prvi serum se uzima u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2- 3 sedmice). Dijagnostička vrijednost je čak četiri puta povećanje antitijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela klase IgM ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela klase IgC perzistiraju nekoliko godina, a ponekad i doživotno.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i antitijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina, koristi se imunoblotiranje. Metoda kombinuje frakcionisanje proteina pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu sa naknadnom imunoindikacijom proteina primenom metode enzimskog imunoeseja. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za hemijskom čistoćom antigena i omogućava identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije imunoenzimskog testa uzrokovane prisustvom antitijela na ćelijske antigene, koja su prisutna kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija antitijela u serumu pacijenata na unutrašnje i vanjske virusne antigene omogućava određivanje stadijuma bolesti, a pri analizi populacija i varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting za HIV infekciju koristi se kao potvrdni test za identifikaciju pojedinačnih virusnih antigena i antitijela na njih. Prilikom analize populacija, metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode je u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNK, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

Virološke studije u klinici zaraznih bolesti postaju sve značajnije, prvenstveno zbog sve većeg udjela infekcija virusne prirode, čija klinička slika nije uvijek tipična. Istovremeno, za sve zarazne bolesti nisu razvijene brze i pouzdane metode virološke dijagnostike, mnoge od njih su radno intenzivne i zahtijevaju posebne uvjete, eksperimentalne životinje, podloge za uzgoj i obučeno osoblje. Trenutno se koriste 3 glavne vrste istraživanja za dijagnosticiranje virusnih infekcija.
1. Mikroskopski pregled infektivnog materijala radi identifikacije virusnog antigena ili patognomoničnih promjena u tkivima. U dijagnostičke svrhe koristi se direktan mikroskopski pregled infektivnog materijala pacijenata kod ograničenog broja virusnih infekcija (bjesnilo, vodene kozice, žuta groznica, herpes itd.). Metoda zasnovana na detekciji virusnog antigena korištenjem fluorescentnih antitijela postala je sve više korištena. Metoda imunofluorescencije može biti pouzdana samo ako su svi tehnički zahtjevi strogo ispunjeni.
2. Virološke metode.
3. Serološke studije za određivanje porasta titra antitela tokom bolesti. Serološke metode istraživanja su pristupačnije u laboratorijskim uslovima.
Za ove studije potrebno je uzimanje krvnog seruma u akutnom periodu bolesti iu periodu rekonvalescencije (parni serumi). Uzorci krvi za serološke studije uzimaju se sterilni bez antikoagulansa ili konzervansa.
Glavne faze viroloških istraživanja su izolacija virusa, njihova identifikacija i karakterizacija osnovnih bioloških svojstava. Trenutno ne postoji jedinstvena metoda za izolaciju različitih grupa virusa. To je prvenstveno zbog raznolikosti njihovih svojstava i posebnosti uzgoja izvan organizma domaćina. Za istraživanje se koriste biosupstrati (ispiranje sa sluzokože, krvi i njenih komponenti, likvora, urina i fecesa, biopsije organa i tkiva ili njihovih dijelova uzetih prilikom obdukcije), koji se podvrgavaju posebnoj obradi nakon čega slijedi pasiranje materijala. Materijal uzet za istraživanje treba čuvati na temperaturi od -20 °C do -70 °C. U zavisnosti od preliminarne dijagnoze, obrada materijala ima svoje karakteristike, ali se u svim slučajevima pretpostavlja da se dobije supstrat koji je maksimalno pročišćen od nečistoća sluzi, ćelija organa i tkiva ili njihovih fragmenata i bakterija. To se postiže homogenizacijom materijala koji se proučava u posebnoj aparaturi ili mljevenjem u porculanskom malteru na hladnom sa kvarcnim staklom (komadići organa i tkiva) uz dodatak sterilno ohlađenog (+4 C) 0,9 %

rastvor natrijum hlorida dok se ne dobije 10-30% suspenzija i naknadno centrifugiranje na 1500-3000 o/min u trajanju od 10-15 minuta. Tako dobijena supernatantna tečnost se koristi za dalja istraživanja.
Prije intenzivnog razvoja i uvođenja u širu praksu metode kulture tkiva i stanica korištena je infekcija eksperimentalnih životinja ili pilećih embrija. Ove metode se i danas koriste. Detekcija virusa pomoću životinja najprikladnija je u slučajevima kada je u eksperimentu moguće reproducirati tipičnu sliku zarazne bolesti ili njenih pojedinačnih manifestacija. Dakle, patogeni grupe arbovirusa i Coxsackie mogu se otkriti infekcijom u mozgu miševa sisača, gripa infekcijom pilećih embrija ili intranazalnim davanjem test materijala miševima. Posljednjih godina virusološki laboratoriji najviše koriste metodu kulture stanica i tkiva, koja omogućava izolaciju adenovirusa, virusa herpesa, respiratornog sincicijalnog virusa, miksovirusa i drugih, te postavljanje etiološke dijagnoze bolesti na prvom mjestu. faze studije. Osnova za to su dobro proučene citološke karakteristike interakcije većine virusa i ćelija. Dakle, infekcija HeLa, Hep-2 ćelija materijalom koji sadrži adenovirus tipa 2, već trećeg dana dovodi do promjene obrasca rasta staničnog monosloja i do pojave tipičnih ćelija u obliku grozdova itd. , dobro definisan u uobičajenom svetlosnom mikroskopu pri malom uvećanju.
Od izuzetne važnosti za etiološku dijagnostiku zarazne bolesti je standardizacija izolacije virusa iz test materijala, koja u ovoj fazi rada podrazumijeva korištenje genetski čistih linearnih životinja, uzimajući u obzir njihove fenotipske (prije svega starosne) karakteristike. To je prvenstveno zbog činjenice da su eksperimentalne životinje različitih genetskih linija i starosti osjetljive na viruse u različitom stupnju. Tako je kod intracerebralne infekcije miševa neurotropnim sojem WSN virusa gripe osjetljivost životinja BALB/c, A, CBA i vanbrednih linija bila najveća, a isti obrazac je ustanovljen i u slučajevima intranazalne primjene testa. materijal. Za konačne rezultate izolacije virusa bitno je preliminarno ispitivanje životinja, pilećih embrija, ćelijskih i tkivnih kultura na latentni prijenos virusa. Pileći embriji, koji se vrlo široko koriste u laboratorijskoj praksi, mogu biti zaraženi virusima ptičje leukemije, encefalomijelitisa ptica, infektivnog sinusitisa, psitakoze, Newcastleske bolesti, uzročnicima određenih bakterijskih infekcija (paratifusne groznice i dr.), kao i mikoplasmama . Još veći broj bakterijskih, a posebno virusnih agenasa sposoban je spontano inficirati kulture stanica i tkiva i preživjeti u njima. Njihovo prisustvo značajno utiče na ocjenu materijala koji se proučava. Neke vrste mikoplazmi u ćelijskoj kulturi
može izazvati hemaglutinaciju i hemadsorpciju, pa čak i formirati plakove slične onima koje stvaraju virusi ispod agar prevlake. Kontaminacija ćelijskih kultura jedne vrste drugima takođe nije od male važnosti, najčešće je povezana sa HeLa ćelijama i uočava se pri radu sa različitim vrstama kultura u istoj prostoriji, kada je laboratorijsko stakleno posuđe loše obrađeno itd. kontaminacije ćelijskih kultura ili infekcije životinja bakterijskim agensima, kao što je U pravilu se manifestira prilično jasno (promjene u obrascu rasta monosloja stanica, svojstva podloge za kulturu, smrt pilećih embrija ili životinja sa određenim simptomima itd.) i ne predstavlja posebne poteškoće u procjeni rezultata. Situacija je složenija kod latentnih oblika infekcije, gdje je potrebna upotreba seroloških i drugih metoda. Ove upute treba uzeti u obzir u radu virologa, posebno pri provođenju etiološke dijagnoze nejasnih slučajeva bolesti.