Vrste - skup mikroorganizama koji imaju zajedničko evolutivno porijeklo, sličan genotip (visok stepen genetske homologije, obično više od 60%) i najbliže moguće fenotipske karakteristike. Soj je izolovana kultura određene vrste bakterija („specifičan uzorak date vrste“) Kolonija je izolirana struktura vidljiva oku, nastala kao rezultat razmnožavanja i nakupljanja mikroorganizama tokom određenog perioda inkubacije i od jedne roditeljske ćelije ili iz više identičnih ćelija.

Metode laboratorijske dijagnostike Ø Mikroskopska - detekcija m/o direktno u kliničkom materijalu Ø Bakteriološka - detekcija m/o inokulacijom materijala na hranljive podloge Ø Biološka - izolacija m/o iz prethodno zaražene laboratorijske životinje Ø Serološka - detekcija specifična imunološka antitijela u krvnom serumu pacijenta Ø Alergična – izvođenje alergijskih kožnih testova (visoko specifičnih – tuberkuloza, tularemija itd.)

Ø Kulturni - priroda rasta mikroorganizma na hranljivim podlogama. Ø Biohemijska - sposobnost fermentacije različitih supstrata (ugljenih hidrata, proteina i aminokiselina, itd.), formiranja različitih biohemijskih proizvoda u procesu života usled delovanja različitih enzimskih sistema i metaboličkih karakteristika. Ø Antigene – zavise uglavnom od hemijskog sastava i strukture ćelijskog zida, prisustvo flagela, kapsula, prepoznaju se po sposobnosti makroorganizma (domaćina) da proizvodi antitela i drugim oblicima imunog odgovora, otkrivaju se u imunološkim reakcijama.

Fiziološki - metode ugljikohidratne (autotrofi, heterotrofi), azotne (aminoautotrofi, aminoheterotrofi) i druge vrste ishrane, tip disanja (aerobi, mikroaerofili, fakultativni anaerobi, strogi anaerobi). Ø Mobilnost i vrste kretanja. Ø Sposobnost formiranja spora, priroda spora. Ø Osetljivost na bakteriofage, tipizacija faga. Ø Hemijski sastav ćelijskih zidova - osnovni šećeri i aminokiseline, sastav lipida i masnih kiselina. Ø Proteinski spektar (polipeptidni profil). Ø Ø Preosjetljivost na antibiotike i druge lijekove. Ø Genotipski (upotreba genosistemskih metoda).

Bakteriološka metoda uključuje inokulaciju kliničkog materijala na umjetne hranjive podloge, izolaciju čistih kultura mikroba i njihovu naknadnu identifikaciju.

Bakteriološke metode se koriste: u dijagnostici zaraznih bolesti; Š Prilikom preventivnih pregleda na prenosivost crijevnih bakterija, bacila difterije i dr.; Š prilikom proučavanja sanitarno-higijenskog stanja objekata životne sredine (vode, vazduha, zemljišta, hrane i dr.) i njihovog ispitivanja prema epidemiološkim indikacijama na kontaminaciju patogenim vrstama mikroorganizama. Sh

Fiziološke karakteristike Odnos sa temperaturom Respiracija Ishrana Enzimi Metabolizam proteina i aminokiselina (želatinaza, kolagenaza, dekarboksilaza, ureaza) Ostali enzimi (hemolizini, lipaze, lecitinaza, Dnaza) Krajnji proizvodi metabolizma (hromatografija) Otpornost/osetljivost na AMP

Elementi koji su prvenstveno neophodni za rast mikroorganizama i moraju biti uključeni u hranljivu podlogu određuju se iz hemijskog sastava mikrobnih ćelija, koji je u principu isti u svim živim organizmima. Najveći dio ukupne ćelijske mase predstavlja voda (80-90%), a samo 10-20% je suha tvar. Na osnovu njihovog kvantitativnog sadržaja u suvoj materiji razlikuju se makro- i mikroelementi. Prvi uključuju: ugljenik, kiseonik, azot, vodonik, sumpor, fosfor, kalijum, natrijum, magnezijum, kalcijum, gvožđe. Mikroelementi uključuju mangan, molibden, cink, bakar, kobalt itd., od kojih je većina potrebna u tragovima. Zbog toga se u sastav mnogih medija ne dodaju mikroelementi, jer se potreba za njima može zadovoljiti zbog nečistoća u solima makronutrijenata. Osim toga, nisu svi mikroorganizmi potrebni mikroelementi. 14

Za razliku od životinjskih i biljnih organizama, mikroorganizme karakteriziraju različiti nutritivni tipovi, koji se razlikuju prema tri glavna kriterija – izvor ugljika, izvor energije i donor elektrona (vodika). Ovisno o prirodi izvora ugljika, svi mikroorganizmi se dijele u 2 velike grupe – autotrofi, koji koriste ugljični dioksid, i heterotrofi, kojima su za rast i razmnožavanje potrebne gotove organske tvari. Uzimajući u obzir raznolikost izvora energije i donora elektrona, ove grupe su podijeljene u podgrupe, što rezultira 8 vrsta ishrane mikroorganizama. Svaka vrsta ishrane je karakteristična za određene mikroorganizme i odražava njihova fiziološka i biohemijska svojstva. Većina mikroorganizama, uključujući i one patogene, imaju vrstu ishrane u kojoj su organske supstance izvor ugljika, energije i donora elektrona. 16

Potrebe mikroorganizama za organskim izvorima ugljika su vrlo raznolike. Neke vrste su “svejedi” i mogu konzumirati tvari različite kemijske prirode, druge su selektivnije i koriste samo neke od njih. Specifičnost skupa organskih spojeva karakterističnih za svaku vrstu mikroorganizma uzima se u obzir prilikom stvaranja selektivnih i diferencijalnih dijagnostičkih medija, koji se široko koriste u sanitarnoj i kliničkoj mikrobiologiji za brzu identifikaciju određenih grupa mikroorganizama. Prilikom odabira supstrata koji sadrži ugljik, potrebno je uzeti u obzir da probavljivost organskih tvari uvelike ovisi o njihovim svojstvima - topljivosti, stupnju oksidacije atoma ugljika, prostornoj konfiguraciji i polimerizaciji njihovih molekula. Mikroorganizmi obično asimiliraju određene optičke izomere - šećere koji pripadaju D-seriji, aminokiseline - u L-seriju. Vrlo mali broj mikroorganizama posjeduje enzime koji pretvaraju jedan optički izomer u drugi. Biopolimere poput škroba, polisaharida, proteina, masti mogu koristiti samo mikroorganizmi koji sintetiziraju određene hidrolitičke enzime - amilaze, proteaze, lipaze u obliku egzoenzima, odnosno enzima koje stanica luči u okoliš. 17

Za ogromnu većinu heterotrofnih mikroorganizama, glavni, lako dostupni izvori ugljika i energije su ugljikohidrati, aminokiseline, proteini i organske kiseline. Karakterizirajući potrebu mikroorganizama za organskim izvorima ugljika, treba napomenuti da je najveći stepen heterotrofije svojstven patogenim mikroorganizmima koji su se prilagodili životu u tijelu ljudi i životinja. Posebno je složen sastav hranljivih podloga za njihov uzgoj. Sadrže proteine ​​ili produkte njihove plitke hidrolize (peptide), vitamine, fragmente nukleinskih kiselina itd. Za pripremu takvih podloga koriste se različite vrste hidrolizata i mesnih ekstrakata, krv ili serum, ekstrakti kvasca i biljaka i još mnogo toga. Ove podloge su pogodne za uzgoj širokog spektra vrsta i posebno su korisne u slučajevima kada je potreba mikroba za faktorima rasta nepoznata ili gdje je potrebno više faktora rasta u isto vrijeme. Nedostatak takvih medija je složenost ili nemogućnost postizanja njihove standardizacije zbog nestandardne prirode i ograničene kontrole sastava i svojstava sirovine. 18

Konstruktivni metabolizam mikroorganizama općenito usmjeren je na sintezu četiri glavna tipa biopolimera – proteina, nukleinskih kiselina, polisaharida i lipida. Za biosintezu proteina i nukleinskih kiselina najvažniji element, pored ugljika, je dušik. Najpristupačniji izvor dušika za većinu mikroorganizama su amonijevi ioni, koje oni mogu dobiti iz soli organskih i neorganskih kiselina, aminokiselina, proteina i drugih tvari koje sadrže dušik. Velika grupa bakterija, uglavnom patogenih, zahtijeva organske tvari koje sadrže dušik kao izvore dušika. Ako su aminokiseline takav izvor dušika, mikroorganizmi ih mogu direktno koristiti za sintezu proteina, ili ih prvo mogu deaminirati, a amino grupe koje se oslobađaju u procesu iskoristiti za sintezu vlastitih aminokiselina i proteina. 19

Međutim, za rast nekih mikroorganizama potrebne su određene aminokiseline koje sami ne mogu sintetizirati. Mikroorganizmi koji zahtijevaju takve "esencijalne" aminokiseline uključuju Staphylococcus aureus, hemolitički streptokok, bakterije mliječne kiseline i neke druge. Ovisno o fiziološkim karakteristikama mikroba, broj "esencijalnih" aminokiselina je različit - za Staphylococcus aureus potrebni su samo triptofan i cistin u hranljivom mediju, a za hemolitički streptokok - 17 aminokiselina. Proteini, kao izvori dušika, dostupni su samo onim mikroorganizmima koji formiraju proteolitičke enzime koji se oslobađaju u mediju (tj. u egzo obliku). Pod utjecajem ovih enzima, proteini se razgrađuju na tvari niže molekularne težine - peptone i aminokiseline. 20

Energetski metabolizam mikroorganizama, kao i konstruktivni metabolizam, karakteriziraju različiti biohemijski mehanizmi. Postoje tri glavna tipa ovog metabolizma - aerobno disanje, anaerobno disanje i fermentacija, od kojih je najčešće aerobno disanje. U ovom procesu organska tvar se oksidira do ugljičnog dioksida i vode uz maksimalno oslobađanje energije sadržane u ovoj tvari. Mnogi mikroorganizmi sa aerobnim disanjem su strogi aerobni, ali neki od njih su fakultativni aerobni, jer mogu formirati ATP u anaerobnim uslovima – fermentacijom. Neki mikroorganizmi, uglavnom bakterije, dobijaju energiju anaerobnim disanjem, odnosno kao rezultat oksidacije supstanci, pri čemu anorganska jedinjenja, a ne kiseonik, deluju kao akceptori elektrona. Tako određene vrste iz roda Bacillus i E. coli vrše anaerobno disanje, pri čemu se nitrat (NO 3) redukuje u amonijak; Clostridium aceticum oksidira molekularni vodonik koristeći ugljični dioksid kao akceptor elektrona. 21

Najjednostavniji tip energetskog metabolizma je fermentacija. Procesi fermentacije odvijaju se u anaerobnim uslovima i praćeni su oslobađanjem energije. Glavni supstrat za fermentaciju su ugljikohidrati, ali bakterije mogu fermentirati organske kiseline, uključujući aminokiseline, kao i purine i pirimidine. Postoji mnogo vrsta fermentacije, od kojih je svaka uzrokovana posebnom grupom mikroorganizama i, u skladu sa mehanizmom, praćena je stvaranjem specifičnih krajnjih proizvoda. Krajnji produkti fermentacije su najčešće različite organske kiseline – mliječna, octena, jantarna, limunska itd., kao i alkoholi (etil, butil, propil), ugljični dioksid i vodonik. Na osnovu prinosa glavnog finalnog proizvoda razlikuju se odgovarajuće vrste fermentacije. Zbog činjenice da tokom fermentacije ne dolazi do potpune oksidacije supstrata i da se u okolinu oslobađaju djelomično oksidirane tvari koje još sadrže energiju – organske kiseline, alkoholi itd., ukupan prinos ATP-a u ovom procesu po 1 molu fermentisanog supstrata je značajan (~ 30 puta) manji nego tokom metabolizma istog supstrata u procesima disanja. 22

Posebna uloga pripada Robertu Kochu. Postulirajući potrebu za izolacijom čiste kulture mikroba, on je time utvrdio potrebu za stvaranjem uslova za rješavanje ovog problema. Najvažniji od njih bio je hranljivi medij na kojem bi mikroorganizam mogao rasti. Ime Koch vezuje se za uvođenje čvrstih hranjivih podloga u mikrobiološku praksu 1881. Sama ideja o njihovoj upotrebi nastala je ranije i pripada njemačkom istraživaču Bredfeldu. Štaviše, davne 1877. godine, Schröter je uzgajao bakterije na kriškama krompira, što se takođe može protumačiti kao upotreba hranljive podloge. Kochova zasluga leži u njegovom dubokom naučnom pristupu problemu i širokoj upotrebi hranljivih podloga u njegovom sopstvenom istraživanju. Predložio je i prvi učvršćivač – želatin, kao komponentu gustog medijuma. 25

Agar-agar, poznat modernim mikrobiolozima, Frost je uveo u svakodnevnu praksu mnogo kasnije, 1919. godine, iako bi bilo pošteno podsjetiti da je još 1881. njemački istraživač Hesse predložio agar-agar. Štaviše, 1913. godine ruski mikrobiolog V. L. Omelyansky, odajući počast hranljivim podlogama sa želatinom, primetio je da su hranljivi mediji sa agarom poželjniji u slučajevima kada mikrob ukapljuje želatinu. Kochove ideje i praktične aktivnosti dobile su intenzivan razvoj krajem 19. i u prvoj četvrtini 20. vijeka. U tom periodu istraživači iz brojnih zemalja predložili su hranljive podloge za različite namene, čija je uloga za praktičnu mikrobiologiju bila i ostala veoma značajna. Savremeni mikrobiolog svaki dan pamti njihova imena u svom radu. U ovih nekoliko godina Japanac porijeklom Sh. Endo je predložio svoj agar za diferencijaciju enterobakterija, Austrijanac E. Lowenstein je predložio medij za mikobakterije, a Englez A. Mak. Konki - selektivna i diferencijalna dijagnostička podloga za crijevne mikroorganizme, Nijemac T. Kitt i talijanski D. Tarozzi - medij za obavezne anaerobne bakterije, Francuz R. Sabouraud, Čeh F. Chapek i Amerikanac A. Dox - medij za gljivice, Brazilac R. Hottinger – mediji opšte namene zasnovani na digestiji mesa itd. 26

Opšti zahtjevi Sadržaj svih elemenata za izgradnju mikrobne ćelije Dovoljna vlažnost Osiguravanje izotonije Određena koncentracija vodonikovih jona Oksidacijsko-redukcioni potencijal Sterilnost

Glavne faze rasta periodične kulture: početna (lag) - 1, eksponencijalna (ili logaritamska) - 2, stacionarna - 3, umiranje - 4 (Sl. 12) Sl. 12. Glavne faze rasta mikrobne populacije na tečnim hranljivim podlogama.

Priroda rasta mikroorganizama na tekućim hranjivim podlogama Ø Ø Ø Rast bakterija s ujednačenom zamućenošću podloge, čija se boja ne mijenja ili mijenja u skladu s bojom pigmenta rastvorljivog u vodi formiranog u mikrobnoj kulturi; Donji rast bakterija – stvaranje sedimenta (oskudan ili obilan, mrvičast, homogen, vlaknast, itd.); Parietalni rast uz održavanje transparentnosti hranjivog medija; Površinski rast bakterija - film na površini podloge (tanak, osjetljiv, bezbojan ili vlažan, gust, jasno vidljiv golim okom, gust, suh sa naboranom i ponekad bradavičastom površinom); Boja filma, kao i hranjivog medija, ovisi o pigmentu koji proizvodi rastuća mikrobna kultura.

Priroda rasta mikroorganizama na polutečnim hranljivim podlogama Ispitna kultura se sije u kolonu od 0,2 - 0,5% polutečnog agara. Utvrđuje se sposobnost mikroorganizma da se kreće – širenjem sa mesta inokulacije (injekcije) u okolinu injekcijom u neposrednoj blizini zida epruvete.

Endo Differential Dijagnostički medij Sastav: Baza – nutritivni agar Diferencijal. faktor - laktoza Indikator - osnovni fuksin, obezbojen natrijum sulfitom Rast laktoze + kolonije crvene boje sa metalnim sjajem

Ploskirev medij Selektivni, diferencijalno dijagnostički Sastav: Baza – hranjivi agar Selektivni faktor – žučne soli, briljantno zeleno, jod Diferencijal. faktor – laktoza Indikator – neutralno crveno Rast kolonija laktoze + boje brusnice

Slani agar Selektivna podloga Sastav: Baza – hranljivi agar Selektivni faktor – so 10% Indikator – nema Rast kolonija otpornih na so

Agar od žumanceta i soli (Chistovich) Elektivni, dijagnostički Sastav: Baza – nutritivni agar Elektivni faktor – sol 10% Dif. faktor – žumanjak Indikator – nema Rast kolonija otpornih na sol + zamućenje oko kolonija zbog aktivnosti lecitovitelaze

Mueller-Kaufmann tetrationatna podloga Podloga je namijenjena za selektivno obogaćivanje za detekciju bakterija roda Salmonella Sastav: Baza - hranljiva juha Selektivni faktor - sol selenske kiseline Indikator - nema Rast bakterija otpornih na natrijum-selicijsku kiselinu

Slana juha Elektivni medij Sastav: Baza – hranljiva juha Elektivni faktor – 6,5% Na. Cl indikator – nema rasta mikroorganizama otpornih na sol

Priroda rasta mikroorganizama na čvrstim hranjivim podlogama. Glavne karakteristike: ü Veličina – tačna (≤ 1 mm) – velika (4 – 6 mm ili više); ü Oblik - pravilan (okrugli); nepravilni (u obliku amebe), rizoidni; ü Konture rubova - glatke ili neravne (urezane, valovite, itd.) ü Reljef kolonije (kupolast, ravno-konveksan, kolonije sa udubljenim centrom itd. ü Površina kolonije (mat ili sjajna (S-R- oblici); ü Kolonija boja (formiranje pigmenta); ü Struktura kolonije (fino ili krupno zrnasto); ü Konzistencija (viskozna, sluzava, pastasta, itd.

Pigmentacija bakterija Crveno-smeđa (prodigiosin) Serratia marcessens Žuto-narandžasta, (karotenoidi) Staphylococcus, Sarcina, M. tuberculosis rodovi Crna, smeđa (melanin) B. cubtilis, Gljive iz roda Candida Blue (pyocianin) P. aeruginosa Flu -zelena (pyoverdine) Rod Vibrio

Izolacija čistih kultura: inokulacija na selektivnoj podlozi Bade-Parker selektivna podloga za stafilokoke. Rast mikroorganizama otpornih na kalijum telurit. Pretvore ga u metalni telurij, a kolonija postaje crna

Izolacija čistih kultura: filtracija kroz membranske filtere Mikroorganizmi na filteru Metalni kavezi za nuklearne filtere

Bakteriološka metoda proučavanja patološkog materijala za izolaciju i identifikaciju mikobakterija uključuje 3 metode: bakterioskopsku, kulturalnu i biološku / R.V. Tkzova, 1983; I.I.Rumačik, 1987,1993; A.S. Dončenko, 1989; Yu.Ya. Kassica, 1990; A.Kh.Naimanov, 1993; L.P.Khodun, 1997/. Period bakteriološkog pregleda ne bi trebao biti duži od 3 mjeseca.

S obzirom da su makroskopske tuberkulozne promjene u organima i tkivima goveda uzrokovane uzročnikom tuberkuloze goveda, nema smisla takav materijal proučavati bakteriološki. Ako se takav materijal dostavi u laboratorij na istraživanje, onda se vrši komisijski pregled i sastavlja se zapisnik. Materijal je bezopasan.

Bakterioskopski (mikroskopski) pregled materijala sastoji se od pripreme 2 brisa otiska prsta iz svakog organa (ili komada organa sa promjenama sumnjivim na tuberkulozu) i limfnog čvora koji se predaju na pregled, suše na zraku, fiksiraju iznad plamena alkoholne lampe. , bojenje prema Zil-Nielsenu i pregled obojenih mrlja pod mikroskopom, sa najmanje 50 vidnih polja u svakom razmazu. Potrebno je pripremiti najmanje 20 mrlja otiska prsta od materijala od jednog mastila. Osim toga, razmazi za mikroskopiju se pripremaju i od suspenzije materijala posijanog na hranljive podloge.

Ziehl-Neelsenovo bojenje razmaza je selektivno za detekciju mikobakterija: na plavoj pozadini obojenog tkiva ili strane mikroflore, mikobakterije su vidljive kao crvene, ružičaste ili rubin-crvene šipke. Najbolje je pregledati razmaze pod binokularnim mikroskopom pri uvećanju od 1,5 (priključak) x 7 (okular) x 90 ili 100 (sočivo).

Metoda se koristi kao signalna metoda, budući da prisustvo ili odsustvo mikobakterija u brisevima apsolutno ne utiče na tok daljih istraživanja, a čak ni pozitivan bakterioskopski zaključak nema pravni značaj (osim za ptice). Materijal treba dalje ispitati.

Laboratorijska dijagnoza tuberkuloze kod ptica smatra se utvrđenom ako se iz testnog materijala izoluje kultura mikobakterija ptičje vrste (od papagaja - ljudske ili ptičje vrste), dobije se pozitivan rezultat biotesta, kao i ako se otkriju mikobakterije u razmazima iz patološkog materijala tokom mikroskopskog pregleda (tačka 7.3 .2. uputstva).

Potrebno je obratiti pažnju i na činjenicu da je potrebno dosta vremena za pripremu razmaza otisaka prstiju, njihovo fiksiranje i pregled, te je vrlo rijetko u njima otkriti mikobakterije, čak i u brisevima iz zasijane suspenzije materijala. Stoga, kako bismo uštedjeli radno vrijeme i novac pri ispitivanju materijala od životinja koje nisu imale promjene tokom klanja, preporučljivo je ograničiti se na pripremu i pregled mrlja samo od suspenzije materijala posijanog na hranljive podloge. To neće dovesti do oštećenja u dijagnozi tuberkuloze, jer se proučavanje materijala nastavlja dalje.

Osim konvencionalne svjetlosne mikroskopije, može se koristiti i fluorescentna mikroskopija. Razmazi se pripremaju na sličan način, fiksiraju i boje se mješavinom fluorohroma. Obojeni razmazi se posmatraju pod fluorescentnim mikroskopom. Metoda je osjetljivija, ali manje specifična, pa samim tim i manje prihvatljiva, posebno u praktičnim laboratorijama.

Kulturna izolacija mikobakterija na hranjivim podlogama jedna je od važnih karika u laboratorijskoj dijagnostici tuberkuloze u sadašnjoj fazi. Međutim, hranljive podloge na koje je posijan materijal (za 5-10 epruveta prema uputstvu) imaju delimičnu ili potpunu klijavost u prve 2-3 nedelje, po pravilu, zbog narušavanja sterilnosti pri setvi. materijal. Usjevi se odbacuju upravo u vrijeme kada je najvjerovatnije da će nastupiti početni rast atipičnih mikobakterija (da ne spominjemo početni rast patogena tuberkuloze, koji pokazuje rast i kasnije). U takvim slučajevima, metoda kulture izolacije mikobakterija na hranljivim podlogama se mehanički eliminiše. Ovo je jedan od glavnih razloga za dobijanje negativnih rezultata pri bakteriološkom ispitivanju materijala. Kao rezultat toga, nakon što nisu primile rast kolonija mikobakterija na hranljivim podlogama nakon inokulacije materijala, a laboratorijske životinje su ostale žive 3 mjeseca, slijedi standardni odgovor laboratorija: “Uzročnik tuberkuloze nije izolovan” ili “ Pregled materijala na tuberkulozu je negativan.” Na osnovu rezultata istraživanja nije utvrđen razlog reakcije goveda na tuberkulin, što dovodi do daljeg nerazumnog klanja značajnog broja životinja koje reaguju na tuberkulin u farmama slobodnim od tuberkuloze goveda, što uzrokuje velike ekonomske štete. , remeti promet i reprodukciju stada.

S obzirom na navedeno, potrebno je prioritetnu pažnju posvetiti kulturološkoj metodi izolacije mikobakterija iz materijala na hranljivim podlogama, kao najslabijoj karici u bakteriološkoj dijagnostici tuberkuloze u regionalnim veterinarskim laboratorijama.

Pozitivni rezultati kulturološke metode izolacije mikobakterija uglavnom zavise od dvije okolnosti: povećanja pouzdanosti sjemenja mikobakterija iz materijala i održavanja uvjeta sterilnosti pri radu u kutiji.

Povećanje pouzdanosti inokulacije mikobakterija iz materijala uzetog za istraživanje ovisi prije svega o njegovom kvalitetnom odabiru, predsjetvenom tretmanu i povećanju broja epruveta podloge na kojoj se vrši inokulacija.

Osnovni uvjeti čije poštivanje pri sjetvi materijala na hranljive podloge jamči rast kolonija mikobakterija:

a) odabrati materijal za bakteriološko istraživanje od ubijenih životinja koje nisu imale promjene tokom klanja, odvojeno od svakog trupa i inokulirati svaki uzorak (materijal od svake životinje) u 10-20 epruveta podloge prema sljedećoj shemi:

Limfni čvorovi glave (submandibularni, retrofaringealni);

Bronhijalni i medijastinalni limfni čvorovi;

Mezenterični (mezenterični) limfni čvorovi;

Ostali limfni čvorovi (ako postoje sumnjiva područja);

Organi (također ako je potrebno).

Rezultat je inokulacija materijala jedne životinje u 30-50 epruveta sa podlogom. Time se postiže povećanje pouzdanosti sjetve mikobakterija za 3-5 puta, jer se bez odvajanja uzoraka (prema uputama) preporučuje sejanje materijala na samo 5-10 epruveta podloge sa dva grla jedne farme.

b) Neposredno prilikom bakteriološkog zasijavanja materijala izrezati komade sa poremećenom morfološkom strukturom limfnog čvora ili organa (hiperplazija, zbijenost, tačkasta i prugasta krvarenja i sl.). Štaviše, potrebno je izrezati sva promijenjena područja. Ako u jednom malteru ima puno materijala u zapremini, onda se može podijeliti na dva.

c) Striktno se pridržavati usvojene metodologije rada, ne narušavajući način obrade i sjetve materijala.

d) Prilikom homogenizacije materijala, posebno limfnih čvorova, potrebno je koristiti sterilni pijesak ili fino razbijeno sterilno staklo. Samljeti materijal što je više moguće (do kremaste konzistencije) radi bolje ekstrakcije mikobakterija iz ispitivanog materijala

e) homogenizovanom materijalu u malteru dodati fiziološki rastvor u količini potrebnoj za setvu suspenzije materijala na hranljive podloge i za biotest (u proseku do 0,5 cm3 u jednoj epruveti i 1-2 cm3 za potkožnu infekciju jedne gvineje svinja). Ova količina slane otopine može se unaprijed izračunati.

f) Pregledajte usjeve materijala nakon 3, 5, 7, 10, 15 dana, a zatim jednom sedmično.

g) Svaka kolonija mikroorganizama uzgojena na podlozi (tipična ili atipična, pigmentirana ili nepigmentirana, sluzava ili suha, itd.) mora biti podvrgnuta mikroskopiji korištenjem selektivnog bojanja po Ziehl-Neelsenu.

Treba obratiti pažnju na stepen ispiranja materijala od kiseline (ili lužine) koji se koristi za tretiranje materijala od kontaminacije stranom mikroflorom. Preostala količina kiseline će uvijek biti prisutna u suspenziji od materijala koji se sije, ali bi trebao biti minimalan. Pokazatelj toga je vraćanje izvorne boje podloge 2-4 dana nakon sjetve materijala. Ako se boja medija ne vrati, to ukazuje na povećanu količinu preostale kiseline. Boja medija poprima plavičastu nijansu različitog intenziteta. Rast (pretpostavljenih) mikobakterija u ovom slučaju usporava ili se uopšte neće desiti, posebno uzročnika tuberkuloze jer je zahtevniji za režim uzgoja. Preostala količina kiseline djeluje na mikobakterije u određenoj mjeri bakteriostatski.

Za zatvaranje epruveta nakon inokulacije materijala, možete koristiti pamučne i pamučno-gazne čepove nakon čega ih napunite parafinom, gumom bez i gumom sa izrezanim kosim žljebom, plutenim i metalnim čepovima (zatvaračima).

Prilikom utvrđivanja vrsnog identiteta izolovane kulture mikobakterija poznato je mnogo (oko 300) različitih testova: kulturno-morfološki, biološki, biohemijski, serološki, određivanje rezistencije na lekove itd. Međutim, u veterinarskoj praksi se koristi minimum njih (vidi priručnik). Za laboratorije je dovoljno odrediti izolovanu kulturu mikobakterija sljedećih tipova: goveđe, ljudske i ptičje, koja se utvrđuje biološkim testom, i atipične mikobakterije - podijeljene u grupe prema Runyonu (1959): I - fotohromogene (formiraju pigment pod uticajem svetlosti), II - skotohromogeni (formira pigment bez obzira na izlaganje svetlosti - i u mraku i na svetlu), III - nehromogen (ne stvara pigment) ili se nazivaju i bez pigmenta (uzročnik uzročnik tuberkuloze ptica je također uključen ovdje), IV - brzorastuće mikobakterije i saprofiti otporni na kiseline.

U tu svrhu je prilično efikasno i ekonomski opravdano proučavati svojstva izolirane kulture prema skraćenoj shemi, u kojoj se glavna pažnja posvećuje vremenu pojave primarnog rasta kolonija, formiranju pigmenta, kulturno-morfološkom i tinktorijalna svojstva kada se boje prema Ziehl-Neelsenu. Posebno je značajan test za formiranje pupčane vrpce u primarnoj ili čak subkulturi u kombinaciji s rezultatima biološke analize. Za pripremu razmaza iz uzgojenih kolonija preporučljivo je istovremeno ih napraviti i od kolonija i od ostataka suspenzije i kondenzata, tj. iz tečnog dijela na dnu epruvete.

Osim toga, osoblje laboratorije ima mogućnost ne samo da izvrši kontrolno klanje životinja koje su reagovale na tuberkulin i uzmu uzorke materijala za istraživanje, već i da selektuju za bakteriološko istraživanje dok su životinje žive (bronhijalna ili nazalna sluz, mlijeko, izmet, mokraća, eksudat, krv itd.) itd.), kao i uzorci hrane, vode i objekata iz okoline za izolaciju mikobakterija i time posredno dokazuju razlog reakcije stoke na tuberkulin. Prilikom inokulacije dodatnog materijala i uzoraka sa objekata životne sredine koriste se poznate metode koncentriranja mikobakterija: taloženje, flotacija, flotacija-sedimentacija i druge.

Skraćena shema za diferencijaciju mikobakterija pomoću biološke analize

Glavna metoda mikrobiološke dijagnostike i „zlatni standard“ mikrobiologije je bakteriološka metoda.

Svrha bakteriološke metode sastoji se u izolaciji čiste kulture patogena iz ispitivanog materijala, akumulaciji čiste kulture i identifikaciji ove kulture po nizu svojstava: morfološkim, tinktorijalnim, kulturnim, biohemijskim, antigenskim, prisustvom faktora patogenosti, toksičnosti i određivanjem njene osjetljivosti na antimikrobne lijekove i bakteriofage.

Metoda bakteriološkog istraživanja uključuje:

1. inokulacija ispitnog materijala u hranljive podloge

2. izolacija čiste kulture

3. identifikacija mikroorganizama (određivanje vrsta).

Izolacija i identifikacija čistih kultura aerobnih i anaerobnih bakterija uključuje sljedeće studije:

I faza (rad sa izvornim materijalom)

Cilj: dobivanje izoliranih kolonija

1. Preliminarna mikroskopija daje približnu predstavu o mikroflori

2. Priprema materijala za istraživanje

3. Setva na čvrste hranljive podloge za dobijanje izolovanih kolonija

4. Inkubacija na optimalnoj temperaturi, najčešće 37°C, 18-24 sata

Faza II

Cilj: sticanje čiste kulture

1. Makroskopsko proučavanje kolonija u propuštenoj i reflektovanoj svjetlosti (karakteristike veličine, oblika, boje, prozirnosti, konzistencije, strukture, konture, površine kolonija).

2. Mikroskopski pregled izolovanih kolonija

3. Testiranje aerotolerancije (da bi se potvrdilo prisustvo strogih anaeroba u materijalu za ispitivanje).

4. Setva kolonija karakterističnih za određenu vrstu na čiste akumulacione medije ili selektivne podloge i inkubacija u optimalnim uslovima.

Faza III

Cilj: identifikacija izolirane čiste kulture

1. Za identifikaciju odabrane kulture na osnovu skupa bioloških svojstava, proučava se sljedeće:

· morfologija i tinktorijalna svojstva

· kulturna svojstva (karakter rasta na hranljivim podlogama)

· biohemijska svojstva (enzimska aktivnost mikroorganizama)

Serološka svojstva (antigena)

· virulentna svojstva (sposobnost stvaranja faktora patogenosti: toksina, enzima, faktora odbrane i agresije)

patogenost za životinje

· fagolizacija (osetljivost na dijagnostičke bakteriofage)

preosjetljivost na antibiotike

· druga pojedinačna svojstva

Faza IV (Zaključak)

Na osnovu proučavanih svojstava donosi se zaključak o odabranoj kulturi.

Prva faza istraživanja. Pregled patološkog materijala počinje mikroskopijom. Mikroskopijom obojenog nativnog materijala moguće je približno utvrditi sastav mikrobnog pejzaža posmatranog objekta i neke morfološke karakteristike mikroorganizama. Rezultati mikroskopije nativnog materijala u velikoj mjeri određuju tok daljnjih istraživanja, a zatim se uspoređuju sa podacima dobivenim inokulacijom na hranljive podloge.

Ako u uzorku postoji dovoljan sadržaj patogenih mikroorganizama, inokulacija se vrši na čvrste hranljive podloge (da bi se dobile izolovane kolonije). Ako u ispitivanom materijalu ima malo bakterija, onda se inokulacija vrši na tekućim obogaćenim hranjivim podlogama. Hranljive podloge se biraju prema zahtevima mikroorganizama.

Uzgoj mikroorganizama je moguć samo ako se stvore optimalni uslovi za njihov život i poštuju pravila koja isključuju kontaminaciju (slučajnu kontaminaciju stranim mikrobima) materijala koji se proučava. U epruveti, tikvici ili Petrijevoj posudi mogu se stvoriti umjetni uvjeti koji bi spriječili kontaminaciju kulture drugim vrstama. Sva staklena posuda i podloge za uzgoj moraju biti sterilni i, nakon inokulacije mikrobnog materijala, zaštićeni od vanjske kontaminacije, što se postiže čepovima ili metalnim čepovima i poklopcima. Manipulacije sa ispitnim materijalom treba obavljati u zoni plamena alkoholne lampe kako bi se spriječila kontaminacija materijala iz vanjskog okruženja, kao i radi poštivanja sigurnosnih propisa.

Inokulacija materijala na hranljive podloge mora se obaviti najkasnije 2 sata od trenutka sakupljanja.

Druga faza istraživanja. Proučavanje kolonija i izolacija čistih kultura. Nakon jednog dana inkubacije, kolonije rastu na posudama, pri čemu je u prvom potezu rast kontinuiran, a u sljedećim potezima - izolirane kolonije. Kolonija je skup mikroba iste vrste koji rastu iz jedne ćelije. Budući da je materijal najčešće mješavina mikroba, raste nekoliko vrsta kolonija. Različite kolonije su označene olovkom, ocrtavajući ih u krug odozdo i proučavaju se (tabela 11). Prije svega, kolonije se proučavaju golim okom: makroskopski znakovi. Čaša se gleda (bez otvaranja) s dna u prolaznom svjetlu, uočava se prozirnost kolonija (providna, ako ne blokira svjetlost; prozirna, ako djelimično blokira svjetlost; neprozirna, ako svjetlost ne prolazi kroz kolonija), a mjeri se veličina kolonija (u mm). Zatim proučavaju kolonije sa strane poklopca, zapažaju oblik (pravilan okrugao, nepravilan, ravan, konveksan), prirodu površine (glatka, sjajna, mutna, hrapava, naborana, mokra, suha, sluzava), boju (bezbojno, obojeno).

Tabela 11. Šema za proučavanje kolonija

№	Potpiši	Moguće karakteristike kolonija
1.	Forma	Ravni, konveksni, kupolasti, udubljeni, okrugli, rozeta, zvijezda
2.	Veličina, mm	Veliki (4-5 mm), srednji (2-4 mm), mali (1-2 mm), patuljasti (< 1 мм)
3.	Površinski karakter	Glatko (S-oblik), hrapavo (R-oblik), ljigavo (M-oblik), prugasto, kvrgavo, mat, sjajno
4.	Boja	Bezbojna, obojena
5.	Transparentnost	Proziran, neproziran, proziran
6.	Karakter ivica	Glatka, nazubljena, sa resama, vlaknasta, nazubljena
7.	Unutrašnja struktura	Homogena, zrnasta, heterogena
8.	Dosljednost	Viskozna, ljigava, mrvljiva
9.	Emulzifikacija u kapi vode	Dobro loše

Napomena: tačke 5-7 se proučavaju pri malom uvećanju mikroskopa.

Možete još bolje uočiti razlike između kolonija kada ih gledate s povećanjem. Da biste to učinili, postavite zatvorenu čašu s dnom prema gore na pozornicu, malo spustite kondenzator, upotrijebite lagano povećanje sočiva (x8), pomjerite čašu, proučite mikroskopske karakteristike kolonija: prirodu ruba ( glatka, valovita, nazubljena, nazubljena), struktura (homogena, zrnasta, vlaknasta, homogena ili različita u centru i periferiji).

Zatim se proučava morfologija mikrobnih ćelija iz kolonija. Da bi se to učinilo, od dijela svake od označenih kolonija se prave brisevi i boje se Gramom. Prilikom uzimanja kolonija obratite pažnju na konzistenciju (suvo, ako se kolonija mrvi i teško se skuplja; mekana, ako se lako uzima omčom; sluzava, ako se kolonija vuče omčom; tvrda, ako je dio kolonija se ne uzima petljom, možete samo ukloniti cijelu koloniju) .

Prilikom pregleda razmaza utvrđuje se da koloniju predstavlja jedna vrsta mikroba, pa se mogu izolirati čiste kulture bakterija. Da bi se to postiglo, proučavane kolonije se ponovo zasijavaju na kosi agar. Prilikom ponovnog zasijavanja iz kolonija, mora se voditi računa da se uzmu tačno predviđene kolonije, bez dodirivanja obližnjih kolonija petljom. Epruvete su označene i inkubirane u termostatu na 37°C tokom 24 sata.

Treća faza istraživanja. Identifikacija izolovane kulture. Identifikacija mikroba - određivanje sistematskog položaja kulture izolovane od materijala do vrste i varijante. Prvi uslov za pouzdanu identifikaciju je bezuslovna čistoća kulture. Za identifikaciju mikroba koristi se skup karakteristika: morfološki (oblik, veličina, prisustvo flagela, kapsula, spora, relativni položaj u razmazu), tinktorijalni (odnos prema Gramu ili drugim metodama), hemijski (omjer gvanina + citozin in molekula DNK), kulturološki (nutritivne potrebe, uvjeti uzgoja, brzina i priroda rasta na različitim hranljivim podlogama), enzimski (cijepanje različitih supstanci sa stvaranjem međuprodukta i finalnih proizvoda), serološki (antigenska struktura, specifičnost), biološki (virulencija za životinje, toksičnost, alergenost, uticaj antibiotika itd.).

Za biohemijsku diferencijaciju, sposobnost bakterija da fermentiraju ugljikohidrate sa stvaranjem međuprodukta i krajnji proizvodi, sposobnost razgradnje proteina i peptona i proučavanje redoks enzima.

Za proučavanje saharolitičkih enzima, izolirane kulture se inokuliraju u epruvete s polutečnim podlogama koje sadrže laktozu, glukozu i druge ugljikohidrate i polihidrične alkohole. Za polutečne podloge, inokulacija se vrši ubrizgavanjem u dubinu medijuma. Prilikom injektiranja epruveta sa podlogom se drži pod uglom, uklanja se čep, a rub epruvete se spaljuje. Materijal se uzima sterilnom petljom i njome se probuši stupac hranljive podloge skoro do dna.

Za određivanje proteolitičkih enzima, izolirana kultura se inokulira na peptonsku vodu ili MPB. Da biste to učinili, uzmite epruvetu sa inokulacijom bliže sebi u ruku, a epruvetu sa podlogom dalje od vas. Obe epruvete se otvaraju istovremeno, hvatajući njihove čepove malim prstom i ivicom dlana, spaljuju ivice epruveta, kalciniranom ohlađenom omčom zahvate malo kulture i prenesu je u drugu epruvetu, samljeti ga u tečnom mediju na zidu epruvete i isprati medijumom.

Prilikom sjetve i ponovnog zasijavanja treba obratiti pažnju na poštivanje pravila sterilnosti, kako ne bi kontaminirali svoje usjeve stranom mikroflorom, a također i da ne zagađuju okoliš. Epruvete su označene i stavljene u termostat za inkubaciju na 37°C tokom 24 sata.

Zaključak

Obračun rezultata. Zaključak studije. Rezultati identifikacije se uzimaju u obzir i na osnovu ukupno dobijenih podataka, na osnovu klasifikacije i karakteristika tipičnih sojeva opisanih u priručniku (Burgee's key, 1994-1996), određuje se vrsta izolovanih useva.

3. Vrste mikroskopskih preparata. Faze pripreme fiksnog razmaza. Jednostavne metode slikanja.

4. Diferencijalne dijagnostičke metode za bojenje mikroba. Bojenje po Gramu, mehanizam i tehnika bojenja.

5. Morfologija bakterija. Razlike između prokariota i eukariota. Osnovni oblici bakterija.

6. Struktura i funkcije površinskih formacija bakterijske ćelije. Kapsula. Metode detekcije.

7. Struktura i funkcije ćelijskog zida gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija. Oblici bakterija sa defektima ćelijskog zida.

8. Citopazmatske strukture bakterija, funkcije, metode detekcije. Mikrobi otporni na kiseline. Metoda bojenja.

9. Odmarajući oblici mikroba. Sporulacija u bakterijama, stadiji, metode identifikacije spora.

10. Pokretljivost bakterija, metode detekcije pokretljivosti.

11. Principi taksonomije mikroba. Sistematski položaj mikroba. Taksonomske kategorije. Pojam i kriterijumi tipa.

12-16. Sistematski položaj i morfologija spiroheta, aktinomiceta, mikoplazme, rikecija, klamidije. Metode proučavanja.

18. Respiratorni aparat bakterija. Putevi biološke oksidacije. Klasifikacija mikroba prema ovom kriteriju

19 Metode mikrobne reprodukcije. Mehanizam i faze ćelijske diobe.

20. Karakteristike metode bakteriološkog istraživanja

21. Hranjive podloge za aerobe i anaerobe. Zahtjevi za hranljive podloge, klasifikacija.

22. Metode izolacije čistih kultura aerobnih biljaka.

23. Metode za izolaciju čistih kultura anaerobnih.

24. Identifikacija mikroorganizama morfološki, kulturološki, serološki, biološki, genetski.

26. Genetski aparat bakterija (hromozomi, plazmidi) karakteristike bakterijskih transpozona. Biološka uloga plazmida.

27. Vrste varijabilnosti bakterija. Fenotipska i genotipska varijabilnost. Koncept varijabilnosti populacije.

28. Mutacijska varijabilnost. Genetske rekombinacije. Praktični značaj varijabilnosti mikroorganizama. Koncept genetskog inženjeringa i biotehnologije.

29. Molekularna dijagnostika. Target. Zadaci. Metode.

30. Molekularna hibridizacija. Lančana reakcija polimeraze.

31. Doktrina infekcije. Uslovi za nastanak infektivnog procesa. Prepoznatljivi znaci zaraznih bolesti. Vrste infekcija.

32. Uloga mikroorganizama u infektivnom procesu. Patogenost i virulencija Faktori patogenosti.

33. Uloga makroorganizma, fizičkog i socijalnog okruženja u infektivnom procesu.

34. Biološka metoda istraživanja problema, faze procjene.

35. Hemoterapija i hemoprofilaksa. Klasifikacija definicija antibiotika.

36. Mehanizam djelovanja antibiotika.

37. Neželjeni efekti antibiotika.

38. Otpornost mikroorganizama na antibiotike.

39 Metode za proučavanje osjetljivosti mikroba na antibiotike.

40. Ekologija mikroorganizama. Vrste ekoloških veza.

41. Karakteristike normalne ljudske mikroflore i njena biološka uloga. Metode proučavanja. Gnotobiology. Disbakterioza. Uzroci razvoja, principi korekcije.

42 Sterilizacija, dezinfekcija. Definicija pojmova, metode implementacije.

43. Aseptika, antiseptici. Definicija pojmova. Metode izvođenja.

20. Karakteristike metode bakteriološkog istraživanja

Kulturološki (bakteriološki) metod istraživanja je skup metoda usmjerenih na izolaciju i identifikaciju čistih kultura mikroorganizama (bakterija) uz pomoć uzgoja na hranljivim podlogama.

Čista kultura je skup mikroorganizama iste vrste. Najčešće se čista kultura dobiva odabirom i uzgojem izolirane kolonije (potomak jedne mikrobne ćelije).

Faze metode:

1. Zbirka materijala za istraživanje.

2. Izolacija čiste kulture i njena identifikacija.

3. Zaključak.

Zbirka materijala za istraživanje. Vrsta materijala koji se proučava zavisi od svrhe studije (dijagnoza - od pacijenta; epidemiološka analiza - iz spoljašnje sredine, hrane, pacijenta i (ili) nosioca bakterija).

Izolacija čiste kulture. Uključuje 3 ili 4 faze:

1. Inokulacija materijala (nakon preliminarne mikroskopije) na posudu sa čvrstim hranljivim medijumom (po mogućnosti diferencijalno dijagnostičkom ili selektivnom) kako bi se dobile izolovane kolonije. Najčešće se proizvodi mehaničkim odvajanjem. U nekim slučajevima (na primjer, krv), materijal se prethodno inokulira u tekući medij za obogaćivanje, a zatim se prenosi na ploču s podlogom za agar. Ponekad se prije sjetve provodi selektivna obrada materijala (uzimajući u obzir svojstva izoliranog mikroorganizma; na primjer, tretiranje kiselinom ili alkalijom za izolaciju rezistentnih bakterija). Kultivisati na temperaturi od 37°C 18-24 sata. Vrijeme uzgoja može varirati za različite vrste bakterija.

2(3):a) proučavanje kolonija na agar ploči (kulturne karakteristike), odabir najtipičnijih; b) pripremanje razmaza iz ovih kolonija bojenjem (po Gramu ili drugim metodama); a) izdvajanje ostatka proučavane kolonije na akumulacijski medij i uzgoj u termostatu na optimalnoj temperaturi.

3(4). Ispitivanje čistoće kulture dobijene na akumulacionom mediju. S ovim

priprema se bris, boji se (obično Gramom) i pregleda se mikroskopski

morfološka i tinktorijalna homogenost (u različitim vidnim poljima).

4(5). Identifikacija čiste kulture.

Zaključak. Na osnovu skupa karakteristika u poređenju sa svojstvima referentnih (tipskih) sojeva, ukazuje se na vrstu mikroorganizma izolovanog iz materijala.

Metoda evaluacije:

prednosti: relativno visoka osjetljivost i tačnost, sposobnost određivanja broja mikroba u ispitivanom materijalu, kao i osjetljivost na antibiotike; nedostaci: relativnog trajanja, metoda je skupa.

21. Hranjive podloge za aerobe i anaerobe. Zahtjevi za hranljive podloge, klasifikacija.

Zahtjevi:

mediji moraju biti hranljivi

mora imati određeni pH

mora biti izotoničan, tj. Osmotski pritisak u okolini mora biti isti kao u ćeliji.

treba biti vlažan i ne previše tekući

mora imati određeni redoks potencijal

mora biti sterilna

moraju biti ujedinjeni, tj. sadrže konstantne količine pojedinačnih sastojaka.

Hranljive podloge se mogu podijeliti na:

A) Po poreklu:

1) prirodno - prirodni prehrambeni proizvodi (meso, mleko, krompir);

2) umjetni - pripremljeni posebno za uzgoj mikroba: - podloge od prirodnih proizvoda (mesna voda, čorba s ekstraktom mesa (MPB), agar s ekstraktom mesa (MPA), - bez stalnog sastava; - sintetičke hranljive podloge - rastvori strogo određene količine soli, aminokiselina, azotnih baza, vitamina u destilovanoj vodi - imaju konstantan sastav, koriste se za uzgoj mikroorganizama i ćelijskih kultura za dobijanje vakcina, imunoloških seruma i antibiotika;

B) Po namjeni:

1) opšte namene (MPB, MPA) - većina mikroba raste na njima;

2) selektivno - selektivno pospješuje rast jedne vrste mikroba iz mješavine (na primjer, žumance-solni agar za stafilokoke);

3) diferencijalna dijagnostika - omogućavaju da se jedna vrsta mikroba razlikuje od drugih po izgledu medija (na primjer, Endo, Levinove sredine za crijevnu grupu mikroba).

Štaviše, u zavisnosti od svrhe upotrebe U shemi za izolaciju čistih kultura, prema namjeni se mogu razlikovati sljedeći mediji:

1) obogaćivanje - suzbijanje rasta mikroba koji prate patogen;

2) dobijanje izolovanih kolonija;

3) akumulacija čiste kulture;

B) Po konzistentnosti:

1) tečnost;

2) polutečni (sa dodatkom agar-agara u koncentraciji 0,5-0,7%);

3) gusta - iznad 1%.

Glavna metoda mikrobiološke dijagnostike i „zlatni standard“ mikrobiologije je bakteriološka metoda.

Svrha bakteriološke metode sastoji se u izolaciji čiste kulture patogena iz ispitivanog materijala, akumulaciji čiste kulture i identifikaciji ove kulture po nizu svojstava: morfološkim, tinktorijalnim, kulturnim, biohemijskim, antigenskim, prisustvom faktora patogenosti, toksičnosti i određivanjem njene osjetljivosti na antimikrobne lijekove i bakteriofage.

Metoda bakteriološkog istraživanja uključuje:

1. inokulacija ispitnog materijala u hranljive podloge

2. izolacija čiste kulture

3. identifikacija mikroorganizama (određivanje vrsta).

Izolacija i identifikacija čistih kultura aerobnih i anaerobnih bakterija uključuje sljedeće studije:

I faza (rad sa izvornim materijalom)

Cilj: dobivanje izoliranih kolonija

1. Preliminarna mikroskopija daje približnu predstavu o mikroflori

2. Priprema materijala za istraživanje (razblaživanje izotoničnim rastvorom NaCl i sl.)

3. Setva na čvrste hranljive podloge za dobijanje izolovanih kolonija

4. Inkubacija na optimalnoj temperaturi, najčešće 37°C, 18-24 sata

Faza II

Cilj: sticanje čiste kulture

1. Makroskopska studija kolonije u propuštenoj i reflektovanoj svjetlosti (karakteristike veličine, oblika, boje, prozirnosti, konzistencije, strukture, konture, površine kolonija).

2. Mikroskopski pregled izolovanih kolonija

3. Testiranje aerotolerancije (da bi se potvrdilo prisustvo strogih anaeroba u materijalu za ispitivanje).

4. Setva kolonija karakterističnih za određenu vrstu na čiste akumulacione medije ili selektivne podloge i inkubacija u optimalnim uslovima.

Faza III

Cilj: identifikacija izolirane čiste kulture

1. Za identifikaciju odabrane kulture na osnovu skupa bioloških svojstava, proučava se sljedeće:

· morfologija i tinktorijalna svojstva

· kulturna svojstva (karakter rasta na hranljivim podlogama)

· biohemijska svojstva (enzimska aktivnost mikroorganizama, glikolitička, proteolitička i druge aktivnosti)

Serološka svojstva (antigena)

· virulentna svojstva (sposobnost stvaranja faktora patogenosti: toksina, enzima, faktora odbrane i agresije)

patogenost za životinje

· fagolizacija (osetljivost na dijagnostičke bakteriofage)

preosjetljivost na antibiotike

· druga pojedinačna svojstva

Faza IV (Zaključak)

Na osnovu proučavanih svojstava donosi se zaključak o odabranoj kulturi.

Prva faza istraživanja. Pregled patološkog materijala počinje mikroskopijom. Mikroskopijom obojenog nativnog materijala moguće je približno utvrditi sastav mikrobnog pejzaža posmatranog objekta i neke morfološke karakteristike mikroorganizama. Rezultati mikroskopije nativnog materijala u velikoj mjeri određuju tok daljnjih istraživanja, a zatim se uspoređuju sa podacima dobivenim inokulacijom na hranljive podloge.

Ako u uzorku postoji dovoljan sadržaj patogenih mikroorganizama, inokulacija se vrši na čvrste hranljive podloge (da bi se dobile izolovane kolonije). Ako u ispitivanom materijalu ima malo bakterija, onda se inokulacija vrši na tekućim obogaćenim hranjivim podlogama. Hranljive podloge se biraju prema zahtevima mikroorganizama.

Uzgoj mikroorganizama je moguć samo ako se stvore optimalni uslovi za njihov život i poštuju pravila koja isključuju kontaminaciju (slučajnu kontaminaciju stranim mikrobima) materijala koji se proučava. U epruveti, tikvici ili Petrijevoj posudi mogu se stvoriti umjetni uvjeti koji bi spriječili kontaminaciju kulture drugim vrstama. Sva staklena posuda i podloge za uzgoj moraju biti sterilni i, nakon inokulacije mikrobnog materijala, zaštićeni od vanjske kontaminacije, što se postiže čepovima ili metalnim čepovima i poklopcima. Manipulacije sa ispitnim materijalom treba obavljati u zoni plamena alkoholne lampe kako bi se spriječila kontaminacija materijala iz vanjskog okruženja, kao i radi poštivanja sigurnosnih propisa.

Inokulacija materijala na hranljive podloge mora se obaviti najkasnije 2 sata od trenutka sakupljanja.

Druga faza istraživanja. Proučavanje kolonija i izolacija čistih kultura. Nakon jednog dana inkubacije, kolonije rastu na posudama, pri čemu je u prvom potezu rast kontinuiran, a u sljedećim potezima - izolirane kolonije. Kolonija je skup mikroba iste vrste koji rastu iz jedne ćelije. Budući da je materijal najčešće mješavina mikroba, raste nekoliko vrsta kolonija. Olovkom označite različite kolonije, ocrtavajući ih krugom odozdo i proučite ih (tablica 12). Prije svega, kolonije se proučavaju golim okom: makroskopski znakovi. Čaša se gleda (bez otvaranja) s dna u prolaznom svjetlu, uočava se prozirnost kolonija (providna, ako ne blokira svjetlost; prozirna, ako djelimično blokira svjetlost; neprozirna, ako svjetlost ne prolazi kroz kolonija), a mjeri se veličina kolonija (u mm). Zatim proučavaju kolonije sa strane poklopca, zapažaju oblik (pravilan okrugao, nepravilan, ravan, konveksan), prirodu površine (glatka, sjajna, mutna, hrapava, naborana, mokra, suha, sluzava), boju (bezbojno, obojeno).

Tabela 12. Šema proučavanja kolonija

№	Potpiši	Moguće karakteristike kolonija
1.	Forma	Ravni, konveksni, kupolasti, udubljeni, okrugli, rozeta, zvijezda
2.	Veličina, mm	Veliki (4-5 mm), srednji (2-4 mm), mali (1-2 mm), patuljasti (< 1 мм)
3.	Površinski karakter	Glatko (S-oblik), hrapavo (R-oblik), ljigavo (M-oblik), prugasto, kvrgavo, mat, sjajno
4.	Boja	Bezbojna, obojena... boja
5.	Transparentnost	Proziran, neproziran, proziran
6.	Karakter ivica	Glatka, nazubljena, sa resama, vlaknasta, nazubljena
7.	Unutrašnja struktura	Homogena, zrnasta, heterogena
8.	Dosljednost	Viskozna, ljigava, mrvljiva
9.	Emulzifikacija u kapi vode	Dobro loše

Napomena: tačke 5-7 se proučavaju pri malom povećanju mikroskopa ili pod lupom.

Možete još bolje uočiti razlike između kolonija kada ih gledate s povećanjem. Da biste to učinili, postavite zatvorenu čašu s dnom prema gore na pozornicu, malo spustite kondenzator, upotrijebite lagano povećanje sočiva (x8), pomjerite čašu, proučite mikroskopske karakteristike kolonija: prirodu ruba ( glatka, valovita, nazubljena, nazubljena), struktura (homogena, zrnasta, vlaknasta, homogena ili različita u centru i periferiji).

Zatim se proučava morfologija mikrobnih ćelija iz kolonija. Da bi se to učinilo, od dijela svake od označenih kolonija se prave brisevi i boje se Gramom. Prilikom uzimanja kolonija obratite pažnju na konzistenciju (suvo, ako se kolonija mrvi i teško se skuplja; mekana, ako se lako uzima omčom; sluzava, ako se kolonija vuče omčom; tvrda, ako je dio kolonija se ne uzima petljom, možete samo ukloniti cijelu koloniju) .

Prilikom pregleda razmaza utvrđuje se da koloniju predstavlja jedna vrsta mikroba, pa se mogu izolirati čiste kulture bakterija. Da bi se to postiglo, proučavane kolonije se ponovo zasijavaju na kosi agar. Prilikom ponovnog zasijavanja iz kolonija, mora se voditi računa da se uzmu tačno predviđene kolonije, bez dodirivanja obližnjih kolonija petljom. Epruvete su označene i inkubirane u termostatu na 37°C tokom 24 sata.

Treća faza istraživanja. Identifikacija izolovane kulture. Identifikacija mikroba - određivanje sistematskog položaja kulture izolovane od materijala do vrste i varijante. Prvi uslov za pouzdanu identifikaciju je bezuslovna čistoća kulture. Za identifikaciju mikroba koristi se skup karakteristika: morfološki (oblik, veličina, prisustvo flagela, kapsula, spora, relativni položaj u razmazu), tinktorijalni (odnos prema Gramu ili drugim metodama), hemijski (omjer gvanina + citozin u molekuli DNK), kulturološki (nutritivne potrebe, uslovi uzgoja, brzina i priroda rasta na različitim hranljivim podlogama), enzimski (razlaganje različitih supstanci sa stvaranjem međuprodukta i finalnih proizvoda), serološki (antigenska struktura, specifičnost), biološki (virulencija za životinje, toksičnost, alergenost, dejstvo antibiotika itd.).

Za biohemijsku diferencijaciju proučavaju sposobnost bakterija da fermentiraju ugljikohidrate sa stvaranjem međukonačnih proizvoda, sposobnost razlaganja proteina i peptona, te proučavaju redoks enzime.

Za proučavanje saharolitičkih enzima izolovane kulture se inokuliraju u epruvete sa polutečnim podlogama koje sadrže laktozu, glukozu i druge ugljikohidrate i polihidrične alkohole. Za polutečne podloge, inokulacija se vrši ubrizgavanjem u dubinu medijuma. Prilikom injektiranja epruveta sa podlogom se drži pod uglom, uklanja se čep, a rub epruvete se spaljuje. Materijal se uzima sterilnom petljom i njome se probuši stupac hranljive podloge skoro do dna.

Za određivanje proteolitičkih enzima Izolovana kultura se sije na peptonsku vodu ili MPB. Da biste to učinili, uzmite epruvetu sa inokulacijom bliže sebi u ruku, a epruvetu sa podlogom dalje od vas. Obe epruvete se otvaraju istovremeno, hvatajući njihove čepove malim prstom i ivicom dlana, spaljuju ivice epruveta, kalciniranom ohlađenom omčom zahvate malo kulture i prenesu je u drugu epruvetu, samljeti ga u tečnom mediju na zidu epruvete i isprati medijumom.

Prilikom sjetve i ponovnog zasijavanja treba obratiti pažnju na poštivanje pravila sterilnosti, kako ne bi kontaminirali svoje usjeve stranom mikroflorom, a također i da ne zagađuju okoliš. Epruvete su označene i stavljene u termostat za inkubaciju na 37°C tokom 24 sata.

Zaključak

Obračun rezultata. Zaključak studije. Rezultati identifikacije se uzimaju u obzir i na osnovu ukupno dobijenih podataka, na osnovu klasifikacije i karakteristika tipičnih sojeva opisanih u priručniku (Burgee's key, 1994-1996), određuje se vrsta izolovanih useva.