Definicja reakcji aglutynacji. Reakcja aglutynacji, jej rodzaje, metody wytwarzania, zastosowanie. Reakcja neutralizacji. liza, reakcja opsonofagocytarna, reakcja nadwrażliwości

BADANIA IMMUNOMIKROBIOLOGICZNE

Metody immunologiczne stosuje się do rozwiązania wielu problemów:

1. Ocena stanu układu odpornościowego człowieka (stanu odporności) poprzez określenie cech ilościowych i funkcjonalnych komórek układu odpornościowego i ich wytworów.

2. Oznaczanie składu i cech tkanek ludzkich: grupy krwi, czynnik Rh, antygeny transplantacyjne.

3. Diagnostyka chorób zakaźnych i odporności na nie poprzez wykrywanie i oznaczanie mian przeciwciał (serodiagnoza), identyfikację antygenów patogenów w organizmie oraz określenie reakcji komórkowych na te antygeny.

4. Identyfikacja seroidowa kultur bakterii i wirusów izolowanych z organizmu ludzi i zwierząt.

5. Wykrywanie w organizmie człowieka i środowisku zewnętrznym wszelkich substancji mających właściwości antygenowe lub haptenowe (hormony, enzymy, trucizny, leki, narkotyki itp.).

6. Identyfikacja stanów immunopatologicznych, alergii, reakcji transplantacyjnych i przeciwnowotworowych.

Proces interakcji antygenu z przeciwciałem w reakcjach serologicznych przebiega w dwóch fazach:

1) konkretny- faza interakcji, w której następuje komplementarna kombinacja aktywnych centrów przeciwciał (paratopów) i epitopów antygenu. Zazwyczaj ta faza trwa kilka sekund lub minut;

2) niespecyficzny- faza manifestacji, charakteryzująca się zewnętrznymi oznakami tworzenia kompleksów immunologicznych. Faza ta może trwać od kilku minut do kilku godzin.

Optymalna specyficzna interakcja przeciwciał z antygenem zachodzi w roztworze izotonicznym o pH zbliżonym do obojętnego. Reakcji antygen-przeciwciało w układzie in vitro może towarzyszyć wystąpienie kilku zjawisk

· aglutynacja,

· opad atmosferyczny,

· Liza.

Zewnętrzne objawy reakcji zależą od właściwości fizykochemicznych antygenu (wielkość cząstek, stan skupienia), klasy i rodzaju przeciwciał (pełne i niekompletne), a także warunków doświadczenia (konsystencja medium, stężenie soli, pH, temperatura ).

Wielowartościowość antygenów i przeciwciał zapewnia powstawanie agregatów widocznych gołym okiem. Dzieje się to zgodnie z teorią tworzenia sieci, zgodnie z którą do powstałego kompleksu antygen-przeciwciało przyłączane są kolejno inne przeciwciała i cząsteczki antygenu. W efekcie powstają struktury sieciowe, które zamieniają się w wytrącające się agregaty. Charakter i nasilenie reakcji zależą od ilościowego stosunku antygenów i przeciwciał. Najbardziej intensywne reakcje zachodzą, gdy odczynniki są w równoważnych proporcjach.

Warunkiem koniecznym powstania siatki (sieci) jest obecność więcej niż trzech determinant antygenowych na każdą cząsteczkę antygenu i dwóch centrów aktywnych na każdą cząsteczkę przeciwciała. Cząsteczki antygenu są węzłami sieci, a cząsteczki przeciwciał są ogniwami łączącymi. Obszar optymalnych stosunków (strefa równoważności) stężeń antygenu i przeciwciał, gdy po utworzeniu osadu w supernatancie nie wykrywa się ani wolnych antygenów, ani wolnych przeciwciał.

Agregaty, które mogą wytrącać się, powstają, gdy antygeny łączą się z pełnymi przeciwciałami. Przeciwciała niekompletne (jednowartościowe) nie powodują powstawania struktur sieciowych i dużych agregatów. Do wykrywania takich przeciwciał stosuje się specjalne metody oparte na zastosowaniu antyglobulin (reakcja Coombsa).

Reakcje serologiczne, ze względu na swoją wysoką swoistość i czułość, służą do wykrywania i oznaczania ilościowego antygenów i przeciwciał. Ilość immunoodczynników w reakcjach wyraża się mianem miana – maksymalnego rozcieńczenia surowicy lub antygenu, przy którym nadal obserwuje się reakcję.

Reakcje serologiczne w laboratoriach mikrobiologicznych i immunologicznych wykorzystywane są do dwóch celów:

1) do seroidentyfikacji drobnoustrojów, toksyn, antygenów ogólnie przy użyciu znanego przeciwciała (immunologicznej surowicy diagnostycznej),

2) do serodiagnostyki - określenie charakteru przeciwciał w surowicy krwi pacjenta na choroby bakteryjne, wirusowe i rzadziej inne choroby zakaźne przy użyciu znanego antygenu (diagnosticum).

Aby określić rodzaj, gatunek i typ antygenu, wymagane są znane surowice do diagnostyki immunologicznej. Uzyskuje się je poprzez wielokrotne podawanie zwierzętom (najczęściej królikom) w rosnących dawkach zabitych lub żywych mikroorganizmów, produktów ich rozkładu, toksyn zneutralizowanych lub natywnych. Po pewnym cyklu immunizacji zwierząt przeprowadza się masowe upuszczanie krwi lub całkowite wykrwawienie zwierzęcia. Krew pobraną do sterylnego pojemnika umieszcza się najpierw w termostacie w temperaturze 37°C na 4 – 6 godzin w celu przyspieszenia krzepnięcia, a następnie na jeden dzień w lodówce. Powstałą przezroczystą surowicę zasysa się do sterylnego pojemnika, dodaje konserwanty, określa się miano przeciwciał, sprawdza pod kątem sterylności i rozlewa do ampułek.

Są używane nieadsorbowane I zaadsorbowany surowice diagnostyczne. Niezaadsorbowane surowice mają wysokie miano przeciwciał, ale mogą powodować reakcje grupowe (krzyżowe).

Zaadsorbowane surowice charakteryzują się ścisłą swoistością działania (reagują jedynie z antygenem homologicznym). Nazywa się surowice zawierające przeciwciała tylko przeciwko jednemu specyficznemu antygenowi monoreceptor.

Produkują także surowice znakowane fluorochromami, enzymami i radioizotopami, które umożliwiają wykrycie nawet śladów antygenu z dużą dokładnością.

Zawiesiny żywych lub zabitych bakterii, produktów ich rozkładu, toksyn i wirusów stosuje się jako antygeny (diagnosticums) w reakcjach serologicznych. W niektórych przypadkach stosuje się ekstrakty lub chemicznie izolowane antygeny z mikroorganizmów i tkanek zwierzęcych.

Wszystkie metody immunomikrobiologiczne można podzielić na 3 grupy:

1) na podstawie bezpośrednie oddziaływanie antygenu z przeciwciałem(zjawiska aglutynacji, wytrącania, hemaglutynacji, immobilizacji itp.);

2) na podstawie pośrednie oddziaływanie antygenu z przeciwciałem(reakcje hemaglutynacji pośredniej, koaglutynacji, aglutynacji lateksowej, aglomeracji węgla, aglutynacji bentonitu, wiązania dopełniacza itp.);

3) używanie znakowane przeciwciała lub antygeny(metoda fluorescencyjna, immunoenzymatyczna i radioimmunologiczna oraz inne metody).

REAKCJE Aglutynacji

Reakcje te obejmują antygeny w postaci cząstek (komórki drobnoustrojów, krwinki czerwone i inne antygeny korpuskularne), które są sklejane ze sobą przez przeciwciała i wytrącają się.

Aby przeprowadzić reakcję aglutynacji(RA) potrzebne są trzy składniki: 1) antygen (aglutynogen);

2) przeciwciało (aglutynina)

3) elektrolit (izotoniczny roztwór chlorku sodu).

Przybliżona reakcja aglutynacji (RA)

Wskaźnikowy lub płytkę RA umieszcza się na szkiełku w temperaturze pokojowej. W tym celu za pomocą pipety Pasteura nanieść na szybę kroplę surowicy w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:20 i oddzielnie kroplę kontrolną izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do obu pętli bakteriologicznych wprowadza się kolonie lub codzienną hodowlę bakterii (kropla Diagnostyka) i dokładnie miesza. Reakcje ocenia się wizualnie po kilku minutach, czasami przy użyciu szkła powiększającego (x5). W przypadku dodatniego RA obserwuje się pojawienie się dużych i małych płatków w kropli surowicy, w przypadku ujemnego RA surowica pozostaje jednolicie mętna.

Szczegółowa reakcja aglutynacji w celu określenia miana swoistych przeciwciał u pacjenta.

Pełnoobjawowe RZS do celów serodiagnostyki przeprowadza się w surowicy pacjentów. Rozcieńcza się go również w izotonicznym roztworze chlorku sodu od 1:50 - 1:100 do 1:800 lub 1:1600, ponieważ niższe miana w surowicy mogą zawierać normalne aglutyniny występujące u osób zdrowych lub pacjentów z inną diagnozą (miano diagnostyczne). Jako antygen w tej reakcji stosuje się środki diagnostyczne – znane zawiesiny, zwykle zabitych bakterii.

Do probówek aglutynacyjnych wlewa się najpierw 1 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do pierwszego z nich dodaje się 1 ml surowicy rozcieńczonej 1:100, po wymieszaniu 1 ml przenosi się do drugiego, z drugiego do trzeciego itd. Do otrzymanych dwukrotnych rozcieńczeń surowic (od 1:100 do 1:1600 lub więcej) dodaje się 1-2 krople zawiesiny bakteryjnej zawierającej 3 miliardy ciał drobnoustrojów w 1 ml. Probówki wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny, następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej na 24 godziny.

Szczegółową reakcję aglutynacji uwzględnia się oceniając kolejno każdą probówkę, zaczynając od kontrolnej, delikatnie potrząsając. W probówkach kontrolnych nie powinno występować aglutynacja. Intensywność reakcji aglutynacji oznacza się następującymi znakami: ++++ - aglutynacja całkowita (aglutynacja płatków w całkowicie przezroczystej cieczy); +++ - niepełna aglutynacja (płatki w lekko opalizującej cieczy); ++ - częściowa aglutynacja (płatki są wyraźnie widoczne, płyn jest lekko mętny); + - słaba, wątpliwa aglutynacja - ciecz jest bardzo mętna, zawarte w niej płatki są trudne do odróżnienia; - - brak aglutynacji (płyn jest jednolicie mętny).

Za miano surowicy przyjmuje się jej ostatnie rozcieńczenie, w którym intensywność aglutynacji ocenia się na co najmniej dwa plusy (++)

Aglutynacja to sklejanie i wytrącanie drobnoustrojów lub innych komórek pod wpływem przeciwciał w obecności elektrolitu (izotoniczny roztwór chlorku sodu). Grupy sklejonych bakterii (komórek) nazywane są aglutynatami. Do reakcji aglutynacji wymagane są następujące składniki:

1. Przeciwciała (aglutyniny) znajdujące się w surowicy chorego lub odpornego zwierzęcia.

2. Antygen – zawiesina żywych lub zabitych drobnoustrojów, czerwonych krwinek lub innych komórek.

3. Izotoniczny (0,9%) roztwór chlorku sodu.

Reakcję aglutynacji do serodiagnostyki stosuje się w przypadku duru brzusznego i duru brzusznego (reakcja Vidala), brucelozy (reakcja Wrighta i Heddlesona), tularemii itp. Przeciwciało to surowica pacjenta, a antygen to znany drobnoustrój. Podczas identyfikacji drobnoustrojów lub innych komórek ich zawiesinę stosuje się jako antygen, a znaną surowicę odpornościową stosuje się jako przeciwciało. Reakcja ta jest szeroko stosowana w diagnostyce infekcji jelitowych, krztuśca itp.

Metody oceny stopnia zaawansowania RZS

Przybliżone RA na szkle

Wdrożone RA

(metoda objętościowa)

Reakcja koaglutynacji

Rozłożony RA na szkle (seroidentyfikacja)

Reakcja aglutynacji na szkle. Na beztłuszczowe szkiełko szklane nanosi się dwie krople specyficznej (adsorbowanej) surowicy i kroplę izotonicznego roztworu chlorku sodu. Surowice nieadsorbowane są wstępnie rozcieńczane w stosunku 1:5 – 1:100. Krople należy nakładać na szybę, aby zachować między nimi odległość. Hodowlę dokładnie rozciera się ezą lub pipetą na szkle, a następnie dodaje do kropli izotonicznego roztworu chlorku sodu i jednej z kropli surowicy, mieszając aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Kontrolą surowicy jest kropla surowicy bez hodowli.

Uwaga! Nie można przenosić hodowli z surowicy do kropli izotonicznego roztworu chlorku sodu, który stanowi kontrolę antygenową. Reakcja zachodzi w temperaturze pokojowej przez 1-3 minuty. Jeżeli kontrola surowicy pozostaje przezroczysta, w kontroli antygenu obserwuje się równomierne zmętnienie, a w kropli w miejscu wymieszania hodowli z surowicą na tle klarownej cieczy pojawiają się płatki aglutynatu, wynik reakcji uważa się za pozytywny.

Diagnostyka fizjologiczna

surowica + roztwór kultury + kultura

Szczegółowa reakcja aglutynacji (metoda objętościowa). Przygotowuje się seryjne, najczęściej dwukrotne rozcieńczenia surowicy. Metodę tę nazywa się wolumetryczną. Aby oznaczyć miano przeciwciał w surowicy krwi, należy pobrać 6 probówek. Do pierwszej probówki wlej 1 ml pierwotnego rozcieńczenia surowicy 1:50 i za pomocą pipety z podziałką dodaj 1 ml roztworu soli do wszystkich 6 probówek. Pierwsza probówka będzie zawierać surowicę o rozcieńczeniu 1:100 o objętości 2 ml. Przenieść 1 ml z pierwszej probówki do drugiej probówki, gdzie rozcieńczenie wynosi 1:200. Zatem wykonaj serię seryjnych rozcieńczeń surowicy w pierwszych 5 probówkach (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Z piątej probówki wlej 1 ml do roztworu środka dezynfekującego. Dodaj 2 krople środka diagnostycznego do wszystkich 6 probówek. Szósta probówka to kontrola posiewu, gdyż zawiera wyłącznie roztwór soli fizjologicznej i diagnostykę.

Taka kontrola jest konieczna, aby wykluczyć samoistną aglutynację hodowli. Probówki wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny, a następnie pozostawia na dobę w temperaturze pokojowej, po czym rejestruje wyniki reakcji aglutynacji. Wykonując reakcję aglutynacji z surowicą dzieci w pierwszych miesiącach życia, ze względu na funkcjonalną niższość tworzenia przeciwciał, konieczne jest oznaczenie niższych mian przeciwciał, co uwzględnia się przy rozcieńczaniu surowicy. Początkowe rozcieńczenie surowicy wynosi 1:25. W pierwszej probówce uzyskuje się rozcieńczenie 1:50, następnie 1:100 itd.

Jeżeli wynik reakcji jest pozytywny, w probówkach widoczne są zaschnięte komórki w postaci ziaren lub płatków na tle przejrzystej cieczy. Aglutynat stopniowo osiada na dnie w postaci „parasolki”, a ciecz nad osadem staje się klarowna. Kontrola antygenowa jest równomiernie mętna.

W zależności od charakteru osadu wyróżnia się aglutynację drobnoziarnistą i gruboziarnistą (łuszczącą się). Podczas pracy z surowicą O uzyskuje się drobnoziarnistą aglutynację. Gruboziarnisty - gdy ruchliwe drobnoustroje wchodzą w interakcję z wiciowymi surowicami H. Występuje szybciej niż drobnoziarnisty, a powstały osad jest bardzo luźny i łatwo pękający.

Intensywność reakcji wyraża się w następujący sposób:

Wszystkie komórki osiadły, ciecz w probówce jest całkowicie przezroczysta. Wynik reakcji jest wyraźnie pozytywny;

Jest mniej osadu, ciecz nie klaruje się całkowicie. Wynik reakcji jest pozytywny;

Osadu jest jeszcze mniej, ciecz jest bardziej mętna. Wynik reakcji jest wątpliwy;

Na dnie probówki znajduje się niewielki osad, ciecz jest mętna. Wątpliwy wynik reakcji;

Nie ma osadu, ciecz jest równomiernie mętna, jak w kontroli antygenowej. Negatywny wynik reakcji

Reakcje te obejmują antygeny w postaci cząstek (komórki drobnoustrojów, krwinki czerwone i inne antygeny korpuskularne), które są sklejane ze sobą przez przeciwciała i wytrącają się.

Aby przeprowadzić reakcję aglutynacji(RA) potrzebne są trzy składniki: 1) antygen (aglutynogen);

2) przeciwciało (aglutynina)

3) elektrolit (izotoniczny roztwór chlorku sodu).

Przybliżona reakcja aglutynacji (RA)

Wskaźnikowy lub płytkę RA umieszcza się na szkiełku w temperaturze pokojowej. W tym celu za pomocą pipety Pasteura nanieść na szybę kroplę surowicy w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:20 i oddzielnie kroplę kontrolną izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do obu pętli bakteriologicznych wprowadza się kolonie lub codzienną hodowlę bakterii (kropla Diagnostyka) i dokładnie miesza. Reakcje ocenia się wizualnie po kilku minutach, czasami przy użyciu szkła powiększającego (x5). W przypadku dodatniego RA obserwuje się pojawienie się dużych i małych płatków w kropli surowicy, w przypadku ujemnego RA surowica pozostaje jednolicie mętna.

Ryż. 2. Przybliżona reakcja aglutynacji.

Szczegółowa reakcja aglutynacji w celu określenia miana swoistych przeciwciał u pacjenta.

Pełnoobjawowe RZS do celów serodiagnostyki przeprowadza się w surowicy pacjentów. Rozcieńcza się go również w izotonicznym roztworze chlorku sodu od 1:50 - 1:100 do 1:800 lub 1:1600, ponieważ niższe miana w surowicy mogą zawierać normalne aglutyniny występujące u osób zdrowych lub pacjentów z inną diagnozą (miano diagnostyczne). Jako antygen w tej reakcji stosuje się środki diagnostyczne – znane zawiesiny, zwykle zabitych bakterii.

Do probówek aglutynacyjnych wlewa się najpierw 1 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do pierwszego z nich dodaje się 1 ml surowicy rozcieńczonej 1:100, po wymieszaniu 1 ml przenosi się do drugiego, z drugiego do trzeciego itd. Do otrzymanych dwukrotnych rozcieńczeń surowic (od 1:100 do 1:1600 lub więcej) dodaje się 1-2 krople zawiesiny bakteryjnej zawierającej 3 miliardy ciał drobnoustrojów w 1 ml. Probówki wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny, następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej na 24 godziny.

Szczegółową reakcję aglutynacji uwzględnia się oceniając kolejno każdą probówkę, zaczynając od kontrolnej, delikatnie potrząsając. W probówkach kontrolnych nie powinno występować aglutynacja. Intensywność reakcji aglutynacji oznacza się następującymi znakami: ++++ - aglutynacja całkowita (aglutynacja płatków w całkowicie przezroczystej cieczy); +++ - niepełna aglutynacja (płatki w lekko opalizującej cieczy); ++ - częściowa aglutynacja (płatki są wyraźnie widoczne, płyn jest lekko mętny); + - słaba, wątpliwa aglutynacja - ciecz jest bardzo mętna, zawarte w niej płatki są trudne do odróżnienia; - - brak aglutynacji (płyn jest jednolicie mętny).

Za miano surowicy przyjmuje się jej ostatnie rozcieńczenie, w którym intensywność aglutynacji ocenia się na co najmniej dwa plusy (++)

Ryż. 7. Szczegółowa reakcja aglutynacji.

Pośrednia (bierna) reakcja hemaglutynacji (IRHA, RPHA)

Podana jest reakcja:

1) do wykrywania polisacharydów, białek, ekstraktów bakteryjnych i innych substancji silnie rozproszonych, riketsj i wirusów, których kompleksów z aglutyninami nie widać w konwencjonalnych RA,

2) do wykrywania przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko tym silnie rozproszonym substancjom i drobnym mikroorganizmom.

Przez aglutynację pośrednią, czyli pasywną, rozumie się reakcję, w której przeciwciała oddziałują z antygenami wstępnie zaadsorbowanymi na cząstkach obojętnych (lateks, celuloza, polistyren, tlenek baru itp. lub czerwone krwinki owcy, I(0) – grupa krwi ludzkiej).

W biernej reakcji hemaglutynacji (RPHA) Czerwone krwinki. Czerwone krwinki obciążone antygenem sklejają się w obecności specyficznych przeciwciał przeciwko temu antygenowi i wytrącają się. Erytrocyty uwrażliwione na antygen są stosowane w RPGA jako narzędzie diagnostyczne erytrocytów do wykrywania przeciwciał (serodiagnoza). Jeśli czerwone krwinki są obciążone przeciwciałami (diagnostyka przeciwciał erytrocytowych), można je wykorzystać do wykrycia antygenów.

Ryż. 3. Schemat RPGA: czerwone krwinki (1), obciążone antygenem (3), są wiązane przez specyficzne przeciwciała (4).

Inscenizacja. W dołkach płytek polistyrenowych przygotowuje się serię seryjnych rozcieńczeń surowicy. Do przedostatniego dołka dodać 0,5 ml surowicy wyraźnie dodatniej, a do ostatniego dołka 0,5 ml roztworu fizjologicznego (kontrola). Następnie do wszystkich dołków dodaje się 0,1 ml rozcieńczonego erytrocytu diagnostycznego, wytrząsa i umieszcza w termostacie na 2 godziny.

Księgowość. W przypadku pozytywnym czerwone krwinki osiadają na dnie otworu w postaci równej warstwy komórek o złożonej lub postrzępionej krawędzi (odwrócony parasol), w przypadku negatywnym osiadają w postaci guzika lub pierścienia .

Ryc.4. Rachunkowość dla RNGA (RPGA).

Uwzględnienie wyników RNGA wykonanych w celu wykrycia toksyny botulinowej.

Czynnik wywołujący zatrucie jadem kiełbasianym, Clostridium botulinum, wytwarza toksyny siedmiu serotypów (A, B, C, D, E, F, G), ale częściej występują serotypy A, B i E. Wszystkie toksyny różnią się właściwościami antygenowymi i mogą różnicować w reakcjach przy użyciu surowicy specyficznej dla typu. W tym celu można przeprowadzić reakcję hemaglutynacji biernej (pośredniej) z surowicą pacjenta, w której zakłada się obecność toksyny i krwinek czerwonych obciążonych przeciwciałami antytoksycznych surowic antybotulinowych typu A, B, E. Normalny surowica służy jako kontrola.

Ryż. 3. Oświadczenie i wynik RNGA.

Księgowość. W przypadku pozytywnym czerwone krwinki osiadają na dnie otworu w postaci równej warstwy komórek o złożonej lub postrzępionej krawędzi (odwrócony parasol), w przypadku negatywnym osiadają w postaci guzika lub pierścienia .

Wnioski: W surowicy pacjentki wykryto toksynę botulinową typu E.

Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI).

Ryż. 8. Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI) (schemat).

Zasada reakcji opiera się na zdolności AT do wiązania różnych wirusów i neutralizowania ich, uniemożliwiając aglutynację czerwonych krwinek. Wizualnie efekt ten objawia się „hamowaniem” hemaglutynacji. RTGA stosuje się w diagnostyce infekcji wirusowych w celu identyfikacji specyficznych antyhemaglutynin i identyfikacji różnych wirusów na podstawie ich hemaglutynin, które wykazują właściwości Ag.

Typowanie wirusa przeprowadza się w reakcji RTGA z zestawem surowic specyficznych dla danego typu wirusa. Wyniki reakcji uwzględnia się przy braku hemaglutynacji. Podtypy wirusa typu A z antygenami H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 i innymi można różnicować w RTGA za pomocą zestawu homologicznych, specyficznych dla typu surowic

Ryż. 9. Wyniki RTGA typowania wirusa grypy

Legenda: - hamowanie hemaglutynacji (przycisk); - hemaglutynacja (parasol).

Wnioski: Badany materiał zawiera wirusa grypy typu A z antygenem H3N2

Reakcje immunologiczne. Zastosowanie reakcji immunologicznych w diagnostyce chorób zakaźnych.

PLAN:

Rodzaje reakcji immunologicznych.

Warunki prowadzenia reakcji serologicznych.

Wymagania dotyczące surowicy.

Pojęcie wyników pozytywnych i negatywnych.

GŁÓWNA TREŚĆ:

Rodzaje reakcji immunologicznych.

Reakcja immunologiczna – Jest to interakcja antygenu z przeciwciałem, która jest określona przez specyficzną interakcję aktywnych centrów przeciwciała (paratopu) z epitopami antygenów.

Ogólna klasyfikacja reakcji immunologicznych:

reakcje serologiczne – reakcje pomiędzy antygenami (Ag) i przeciwciałami (Ig)

in vitro ;

reakcje komórkowe z udziałem komórek immunokompetentnych;

testy alergiczne – wykrycie nadwrażliwości.

Reakcje serologiczne: 1) definicja, 2) fazy, 3) cele, 4) ogólna klasyfikacja.

1) Definicja

Serologiczne metody badań (z łac. Serum - surowica i logos - badanie) z wykorzystaniem reakcji antygen-przeciwciało.

2) Fazy

2 fazy interakcji:

I. Konkretny (widoczne) – następuje szybko, przeciwciała łączą się z odpowiadającymi im antygenami. Podczas tej fazy oddziałują determinujące grupy antygenów (AG) i aktywne centra przeciwciał (AT).

Siły zaangażowane w tworzenie kompleksu AG + AT to:

wisiorek;

van der Waalsa

Wiązania wodorowe.

Na tym etapie nie widać żadnych widocznych zmian. Mikroskopia elektronowa pokazuje kompleks AG+AT w postaci siatki.

II. Niespecyficzne – zachodzi powoli, powstały kompleks antygen-przeciwciało reaguje z dodatkowym nieswoistym czynnikiem środowiskowym, w którym zachodzi reakcja i jest to widoczne dla oka – sklejanie, rozpuszczanie, wytrącanie płatków itp. W obecności elektrolitu ładunek maleje rozpuszczalność maleje, tworzą się widoczne konglomeraty, wytrącające się (aglutynujące).

3) Wyznaczanie celów :

a) w celu identyfikacji antygenu (znanej surowicy diagnostycznej przeciwciał):

• w materiale patologicznym (szybka diagnostyka);

  w czystej kulturze:

  1. identyfikacja serologiczna (identyfikacja gatunku);

     serotypowanie (oznaczenie serotypu) – określenie szczepu;

b) w celu wykrycia przeciwciał (Ig) (antygen jest znany-diagnosticum):

• obecność (reakcje jakościowe);

  ilościach (wzrost miana – metoda „sparowanej surowicy”).

4) Klasyfikacja ogólna reakcje serologiczne :

a) proste (2-składnikowe: Ag+Ig):

Reakcje aglutynacji RA (z antygenem korpuskularnym);

Reakcje strącania PR (z rozpuszczalnym antygenem);

b) kompleksowy (3-składnikowy: Ag+Ig+C);

c) użycie tagu.

Warianty reakcji aglutynacji i strącania

Reakcja aglutynacji :

Reakcja aglutynacji (RA) jest reakcją immunologiczną polegającą na oddziaływaniu zawiesiny antygenów (erytrocytów, bakterii) z antygenami w roztworze fizjologicznym.

Podczas aglutynacji cząsteczki AT sklejają się, tworząc kłaczkowaty osad.

Reakcja pasywnej hemaglutynacji (RPHA) to rodzaj reakcji aglutynacji, w której wykorzystuje się przeciwciało lub antygen erytrocytów diagnostycznych (erytrocyty z AT lub AG zaadsorbowanym na ich powierzchni).

W tej reakcji czerwone krwinki pełnią rolę biernych nośników.

Ocena wyników RPGA przeprowadzana jest w następujący sposób:

- Na pozytywna reakcja biernie przylegające czerwone krwinki pokrywają dno otworu w kształcie litery U lub V równą warstwą o ząbkowanych krawędziach („parasol”);

- Na reakcja negatywna (przy braku aglutynacji) czerwone krwinki gromadzą się w centralnym zagłębieniu otworu, tworząc zwarty „guzik” o ostro określonych krawędziach.

Test hamowania hemaglutynacji (HAI) stosowany jest w diagnostyce infekcji wirusowych. Niektóre wirusy zawierają na swojej powierzchni białko zwane hemaglutyniną, które skleja ze sobą czerwone krwinki. Dodatek specyficznych przeciwciał przeciwwirusowych blokuje hemaglutyninę wirusa – nie dochodzi do hemaglutynacji.

Do określenia niekompletnych przeciwciał stosuje się pośrednią reakcję hemaglutynacji (IRHA) lub reakcję Coombsa. Dodatek surowicy antyglobulinowej (AT przeciwko ludzkiej Ig) poprawia wyniki reakcji. RNGA służy do określenia współczynnika Rh.

Do przeprowadzenia reakcji aglutynacji (RA) wymagane są trzy składniki:

1) antygen (aglutynogen) AG;

2) przeciwciało(aglutynina) AT;

3) elektrolit (izotoniczny roztwór chlorku sodu).
Ag + AT + elektrolit = aglutynacja

Aglutynacja (od łac. aglutinatio - sklejanie) - sklejanie ciałek (bakterii, czerwonych krwinek itp.) z przeciwciałami w obecności elektrolitów - chlorku sodu.

RZS objawia się w postaci płatków lub osadu składającego się z ciałek (na przykład bakterii, czerwonych krwinek) „sklejonych” przez przeciwciała.

RA służy do:

Reakcja bezpośredniej aglutynacji drobnoustrojów (RA).

W tej reakcji przeciwciała (aglutyniny) bezpośrednio aglutynują antygeny korpuskularne (aglutynogeny).

Zwykle są one reprezentowane przez zawiesinę inaktywowanych mikroorganizmów (reakcja aglutynacji drobnoustrojów).

Aby określić rodzaj mikroorganizmów, użyjstandardowa aglutynacja diagnostyczna surowica ( słynny AT ).

Najczęściej spotykane są RZS płytkowe (przybliżone) i rozszerzone.

Płytkę RA umieszcza się na szkle. Stosowana jest jako przyspieszona metoda wykrywania przeciwciał lub identyfikacji mikroorganizmów.

Składniki:

1. standardowe diagnostyczne surowice aglutynujące (AT);

2. czysta kultura badana od pacjenta;

3. roztwór soli.

W badanej czystej hodowli antygeny (AG) występują w postaci cząstek (komórek drobnoustrojów, erytrocytów i innych antygenów korpuskularnych), które są sklejane ze sobą za pomocą przeciwciał i wytrącają się.

Przykład:

Inscenizacja orientacyjny reakcje aglutynacji (RA ) na szkle w celu identyfikacji bakterii z grupy coli.

Nałóż krople na szkiełko:

1 czerwonka ;
2 -ta kropla: - surowica aglutynująca przeciwko patogenomdur brzuszny ;

(1-2 surowice diagnostyczne)
3 -ta kropla: - roztwór soli (kontrola).
Do każdej kropli dodaj testowaną czystą kulturę bakteryjną. Zamieszać.

Wynik : pozytywny - obecność płatków zlepionych,
negatywny - brak zlepionych płatków
Wniosek:Badane bakterie są czynnikiem wywołującym dur brzuszny (oznaczono antygeny).

Oznaczenie AT w surowicy pacjenta (diagnostyka serologiczna), standardowy test bakteryjnydiagnostyka , zawierający zawiesinęsłynny drobnoustroje lub ich antygenyAG .

Oznaczanie grup krwi ABO (reakcja hemaglutynacji (HRA)) – aglutynacja czerwonych krwinek.

Składniki reakcji:

1. AG (czerwone krwinki) bada krew

2. AT (erytrotesty – zolikony)

Zestaw zoliclonów:

Odczynnik anty-A Coliclone (różowy)

Odczynnik anty-B Coliclone (niebieski)

Odczynnik Tsoliklon anty-AV (bezbarwny)

3. elektrolit (roztwór soli)

Technika oznaczania:

1 .

Do dołków tabletki nanoszono jedną kroplę (0,1 ml) zolikonu anty-A, anty-B i anty-AB (w celu kontroli).

2.

Do każdej kropli odczynnika nanosi się niewielką (0,05-0,01 ml) kroplę badanej krwi.

Następnie kroplę zoliclonu miesza się z kroplą krwi za pomocą osobnego, czystego szklanego pręta.

3.

Reakcja aglutynacji rozwija się w ciągu pierwszych 3-5 sekund delikatnego kołysania płytki.

Wyniki reakcji uwzględnia się po 2,5 - 3 minutach od wymieszania kropli. Od lewej do prawej w studzienkach znajdują się anty-A, anty-B, anty-AB.

Pozytywnym wynikiem jest pojawienie się ziarnistego osadu (aglutynatu).

dodatni RA (+)

Wynik negatywny – brak osadu.

ujemny RA(-)

4.

Analiza wyników.

O(I) α β – brak aglutynacji

A(II) β – aglutynacja z anty-A

B(III) α – aglutynacja z anty-B

AB(IV)O – aglutynacja z anty-A, z anty-B

Schematyczne przedstawienie aglutynacji.

Antygeny Ag na erytrocytach (wykrywalne) + przeciwciałoNA(zoliklon) surowica diagnostyczna

Uwzględnianie aglutynacji w tabletkach

Reakcja wytrącania:

Reakcja strącania jest reakcją immunologiczną polegającą na oddziaływaniu antygenu w stanie rozpuszczalnym z antygenem w roztworze fizjologicznym.

Podczas wytrącania tworzy się wielkocząsteczkowy kompleks immunologiczny, który objawia się przejściem przezroczystego roztworu koloidalnego w nieprzezroczystą zawiesinę lub osad.

Ilość obu odczynników musi być w ściśle określonych proporcjach, gdyż nadmiar jednego z nich zaniża wynik.

Reakcję strącania można przeprowadzić na różne sposoby.

1. Reakcję wytrącania pierścieniowego przeprowadza się w rurach wytrącających o małej średnicy. Do probówki dodaje się surowicę odpornościową i ostrożnie nakłada się rozpuszczalny antygen. AG i AT mieszają się ze względu na termiczny ruch cząsteczek i wchodzą w interakcję. Jeżeli wynik jest dodatni, na styku obu roztworów tworzy się pierścień nieprzezroczystego osadu.

2. Reakcję podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony'ego przeprowadza się w żelu agarowym, do którego dołków dodaje się roztwór AG lub roztwór AT zgodnie ze schematem. AG i AT dyfundują do żelu ku sobie i jeśli reakcja jest dodatnia, tworzą kompleksy immunologiczne widoczne w postaci linii strącania.

Reakcja wytrącania -to jest formacjai wytrącanie rozpuszczalnego kompleksu molekularnego antygen-przeciwciało w postaci chmury zwanej osadem. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach.

Komponenty RA:

surowica wytrącająca (znana AT-precypityna);

surowica testowa (nieznany antygen precypitynogenu);

fizyczny Rozwiązanie.

Reakcję wytrącania prowadzi się albo w specjalnych wąskich probówkach (reakcja wytrącania pierścieniowego), albo na szalkach Petriego w żelach, pożywkach itp.

Reakcja wytrącania pierścienia

Zestawienie i rejestracja wyników reakcjiopady pierścieniowew celu wykrycia czynnika wywołującego wąglika (reakcja Ascoli).

Inscenizacja .

1. Badany materiał (skóra, wełna, filc, szczecina, tkanina, mięso, ziemia, odchody zwierzęce itp.) gotuje się w roztworze soli przez 5-45 minut. w celu uzyskania ekstraktu izotonicznego (ekstraktu). Przefiltrowany.

2. Do probówki wlewa się wytrącającą się surowicę przeciw wąglikowi.

3. Ostrożnie nałóż na niego materiał testowy (ekstrakt).

Księgowość .

W ciągu najbliższych 10 minut. W pozytywnych przypadkach na styku surowicy i ekstraktu pojawia się pierścień zmętnienia (wytrącanie pierścienia). Reakcja Ascoli jest bardzo czuła i specyficzna

Za jego pomocą można szybko zidentyfikować materiały zakażone wąglikiem.

Reakcja wytrącania na agarze

Ogłoszenie i zapisanie wynikówreakcje strącania na agarzew celu określenia toksyczności maczugowców (czynników wywołujących błonicę)

Inscenizacja

Umieszczono na agarze fosforanowo-peptonowym na szalce Petriego.

1. Umieść pasek sterylnej bibuły filtracyjnej zwilżonej na środku kubka.serum antytoksyczne.

2. Po wyschnięciu w odległości 1 cm od krawędzi paska wysiewa się płytki o średnicy 10 mmwybrane uprawy.

W jednej filiżance można zasiać od 3 do 10 roślin, w tym jednąkontrola, trzeba wiedziećtoksyczny.

Uprawy umieszcza się w termostacie.

Księgowość

Analizę przeprowadza się po 24-48-72 godzinach.

Wynik pozytywny - (kulturatoksyczny) - w pewnej odległości od paska papieru pojawiają sięlinie osadu, « strzałki wąsów", które są wyraźnie widoczne w świetle przechodzącym.

Rysunek przedstawia reakcję wytrącania na agarze w celu określenia toksyczności prątków błonicy. Hodowle średnie nie utworzyły „wąsów strzałek”, nie są to patogeny toksyczne.

Szczepy czynnika wywołującego błonicę mogą być toksyczne (wytwarzające egzotoksynę) i nietoksyczne. Tworzenie egzotoksyny zależy od obecności w bakteriach profaga niosącego gen toksyny kodujący tworzenie egzotoksyny.

W przypadku choroby wszystkie patogeny błonicy są badane pod kątem toksyczności - wytwarzanie egzotoksyny błoniczej w wyniku reakcji wytrącania na agarze

Złożone reakcje serologiczne ( 3-składnikowy: Ag+Ig+C):

Reakcja wiązania dopełniacza (CFR).

Reakcję prowadzi się w dwóch etapach.

W pierwszym etapie AT oddziałuje z antygenem i dopełniaczem, w drugim etapie dodaje się wskaźnik - układ hemolityczny (mieszanina erytrocytów i surowicy antyerytrocytowej).

Jeżeli wynik jest pozytywny, w pierwszym etapie przeciwciała tworzą z antygenami kompleks immunologiczny, który wiąże dopełnienie mieszaniny reakcyjnej.

W tym przypadku czerwone krwinki układu hemolitycznego dodane w drugim etapie nie ulegają zniszczeniu.

W przeciwnym razie niezwiązany dopełniacz powoduje lizę wskaźnikowych czerwonych krwinek.

Do jej przeprowadzenia potrzebnych jest pięć składników: AG, AT i dopełniacz (pierwszy układ), erytrocyty owcze oraz surowica hemolityczna (drugi układ) (ryc. 1).

Reakcja przebiega w dwóch fazach (ryc. 3).

Pierwsza faza - oddziaływanie antygenu i przeciwciał z obowiązkowym udziałem dopełniacza.

Drugi - identyfikacja wyników reakcji za pomocą wskaźnikowego układu hemolitycznego (erytrocyty owiec i surowica hemolityczna). Zniszczenie czerwonych krwinek przez surowicę hemolityczną następuje tylko wtedy, gdy do układu hemolitycznego zostanie dodany dopełniacz. Jeżeli dopełniacz był wcześniej zaadsorbowany na kompleksie antygen-przeciwciało, wówczas nie dochodzi do hemolizy erytrocytów (ryc.).

Wynik doświadczenia oceniano (ryc. 2), odnotowując obecność lub brak hemolizy we wszystkich probówkach. Reakcję uważa się za pozytywną, gdy hemoliza jest całkowicie opóźniona, gdy ciecz w probówce jest bezbarwna, a czerwone krwinki osiadają na dnie, ujemna - gdy czerwone krwinki ulegają całkowitej lizie, gdy ciecz jest intensywnie zabarwiona („lakierowa” krew ).

Stopień opóźnienia hemolizy ocenia się w zależności od intensywności zabarwienia płynu i wielkości osadu czerwonych krwinek na dnie (++++, +++, ++, +).

Ryż. 4. Oświadczenie i wynik RSC.

Wniosek:W surowicy testowej wykryto przeciwciała.

RSK umożliwia wykrycie przeciwciał przeciwko dowolnemu szczepowi tego samego serotypu wirusa.

Wartość diagnostyczna ma:

czterokrotny wzrost miana przeciwciał w sparowanych surowicach (w czasie epidemii grypy);

dwukrotny wzrost surowicy krwi u pacjentów z charakterystycznym obrazem klinicznym.

Reakcje za pomocą tagu :

Metody te są bardzo czułe. Barwniki, izotopy promieniotwórcze, enzymy itp. stosuje się jako znaczniki antygenów lub przeciwciał.

RIF – reakcja immunofluorescencyjna

Reakcja immunofluorescencyjna opiera się na świetlnym wskazaniu kompleksu antygen-przeciwciało

Połączony test immunoabsorpcyjny.

Nowoczesne badanie laboratoryjne, które wyszukuje we krwi specyficznych przeciwciał lub antygenów określonych chorób, w celu ustalenia nie tylko etiologii, ale także stadium choroby.

Wyniki testu ELISA można podawać jakościowo i ilościowo.

Obecnie test ELISA stosuje się w następujących sytuacjach:

1) szukać specyficznych przeciwciał przeciwko jakiejkolwiek chorobie zakaźnej;

2) szukać antygenów wszelkich chorób (zakaźnych, wenerycznych);

3) badanie stanu hormonalnego pacjentki;

4) badanie markerów nowotworowych;

5) badanie na obecność chorób autoimmunologicznych.

Na rysunku test ELISA w fazie stałej pokazuje znane antygeny (po lewej) zaadsorbowane na dołku płytki, (po prawej) na dołkach płytki znane antygeny

Zalety metody ELISA:

1) Wysoka swoistość i czułość metody ELISA (ponad 90%).

2) Możliwość określenia choroby i prześledzenia dynamiki procesu, czyli porównania liczby przeciwciał w różnych okresach czasu.

3) Dostępność diagnostyki ELISA w każdej placówce medycznej.

Względna wada: wykrywanie odpowiedzi immunologicznej (przeciwciał), ale nie samego patogenu, sprzężonego z enzymem znacznikowym.

Test ELISA (mechanizm ogólny):

Podstawą immunotestu enzymatycznego jest reakcja immunologiczna antygenu i przeciwciała polegająca na utworzeniu kompleksu immunologicznego: antygen-przeciwciało, w wyniku czego następuje zmiana aktywności enzymatycznej specyficznych śladów na powierzchni przeciwciał.

Składniki reakcji:

1. Znany AG(AT) - na zagłębieniu tabletu.

2. Studiuje się AT (AG).

3. AT z enzymem specyficznym dla kompleksu AT(AG)-AG(AT).

4. substrat chromogenny oddziałujący z enzymem

5. zatrzymaj rozwiązanie

Główne etapy testu ELISA

1. Na powierzchni dołków płytki znajduje się oczyszczony antygen określonego patogenu. Dodaje się do nich materiał biologiczny pacjenta i zachodzi specyficzna reakcja pomiędzy tym antygenem a pożądanym przeciwciałem (immunoglobuliną). Tworzy się kompleks.

2. Dodano koniugant – AT z enzymem. Koniugant jest specyficzny dla kompleksu AT-AG pierwszego etapu. Enzym jest aktywowany.

3. Dodaje się substrat i aktywny enzym reaguje z nim, zmieniając bezbarwną barwę roztworu.

4. Dodaje się roztwór zatrzymujący, aby zatrzymać interakcję enzym-substrat.

Księgowość.

Pozytywnym efektem jest zmiana koloru, na zdjęciu żółty.

Analiza immunochromatograficzna

Metoda analizy immunochromatograficznej (ICA, szybkie testy) to wysokiej jakości metoda wstępnego przesiewu, która pozwala szybko, w ciągu kilku minut, przeprowadzić analizę w każdych warunkach, m.in. "pole".

Zalety ICA obejmują:

Szybkość i łatwość obsługi;

Małe objętości próbek, brak przygotowania próbki;

Taniość dla producenta i konsumenta;

Możliwość produkcji testów w dużych ilościach;

Łatwość odczytu i interpretacji wyniku;

Wysoka czułość i powtarzalność;

Możliwość oznaczania ilościowego;

Możliwość korzystania z przenośnych czytników kompatybilnych z komputerem;

Możliwość wielokrotnej analizy.

Składniki (nałożone na pasek testowy):

1. Koniugat ze znacznikiem ze złota koloidalnego jest specyficzny dla wykrytego antygenu.

2. Linia testowa AT – specyficzna dla kompleksu AT-AG

3. Abs linii kontrolnej są specyficzne dla koniugatu.

Ustawienie ICA:

1. Nałóż próbkę na wyznaczony obszar początkowy paska.

2. Uzyskanie wyniku w postaci pojawienia się kolorowych pasków w miejscu linii testowej i kontrolnej.

Księgowość

Dodatni – gdy linia testowa jest zabarwiona.

Ujemny - jeśli nie ma zabarwienia linii testowej.

Nieprawidłowy – jeśli linia kontrolna nie jest zabarwiona.

Ogólny mechanizm ICA:

1. Próbkę wprowadza się na pole startowe (podkładkę próbki) i wiąże z koniugatem (konkretnym korpusem z kolorową etykietą), które znajdują się na podkładce koniugatu. W rezultacie powstaje kolorowy kompleks.

2. Powstały kolorowy kompleks immunologiczny przemieszcza się pod działaniem sił kapilarnych wzdłuż błony nitrocelulozowej I wchodzi w interakcjęz linią testową AT.Rezultatem jest jednokolorowy różowo-czerwony pasek.

3. AT (koniugat) niezwiązany z badanym prążkiemporusza się dalej i dociera do linii sterującej, komunikuje się z AT linii sterującej.W rezultacie pojawia się drugi kolorowy pasek.Jeżeli analiza zostanie przeprowadzona prawidłowo, linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu testowego (przeciwciała) w próbce płynu biologicznego.

2. Warunki prowadzenia reakcji serologicznych.

1. Obecność homologicznego – odpowiadającego sobie antygenu i przeciwciała.

2. Czyste i suche naczynia.

3. Pewien stosunek leków (najczęściej równy).

4. Obowiązkowa obecność elektrolitu (izotoniczny roztwór NaCl).

5. pH neutralne lub zbliżone do lekko zasadowego.

6. Temperatura +37°C lub temperatura pokojowa (koniecznie dodatnia).

7. Przeprowadza się kontrolę antygenową i kontrolę surowicy (przeciwciał).

3 Wymagania dotyczące surowicy

Surowica powinna być całkowicie przezroczysta, bez domieszki komórek.

Zwykle otrzymują ją w 2. tygodniu choroby, kiedy przeciwciała są już dostępne.

Krew pobiera się w ilości 3-5 ml na czczo lub 6 godzin po posiłku.

W celu uzyskania surowicy krew pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub odwirowuje. Serum odsysa się bardzo ostrożnie, aby nie złapać powstałych elementów.

Surowice odpornościowe uzyskuje się z krwi ludzi lub zwierząt (najczęściej królików i koni), immunizowanych według określonego schematu odpowiednim antygenem (szczepionką). Sera są zwykle przygotowywane w produkcji.

4. Pojęcie skutków pozytywnych i negatywnych.

RA.

Przy pozytywnej reakcji biernie sklejone czerwone krwinki pokrywają dno otworu równą warstwą z ząbkowanymi krawędziami („parasol”); przy braku aglutynacji czerwone krwinki gromadzą się w centralnym zagłębieniu otworu, tworząc zwarty „guzik” o ostro określonych krawędziach (patrz zdjęcia powyżej).

RP.

Jeśli wynik jest pozytywny, na styku obu roztworów tworzy się mleczny pierścień (patrz zdjęcia powyżej).

ELISA.

Zmiana koloru roztworu następuje w przypadku reakcji pozytywnej.

RSK.

Opóźniona hemoliza - reakcja jest pozytywna; jeśli dopełniacz jest wolny, obserwuje się hemolizę - reakcja jest ujemna(patrz zdjęcia powyżej).

Wyniki reakcji Wassermana:

a - całkowite opóźnienie hemolizy (+ + ++);

b - wyraźne opóźnienie hemolizy (+ ++);

c - częściowe opóźnienie hemolizy (++);

d - niewielkie opóźnienie hemolizy (+);

d - całkowita hemoliza (-).

Reakcja jest dodatnia z częściowym, wyraźnym i całkowitym opóźnieniem hemolizy, określonym przez stopień zabarwienia zawartości probówek od jasnoróżowego do jaskrawoczerwonego; niezhemolizowane erytrocyty tworzą następnie czerwony osad.

Praca domowa:

1. Przestudiuj materiał

Zrób 3 notatki do filmu

13.1. Reakcje antygen-przeciwciało i ich zastosowania

Po wprowadzeniu antygenu w organizmie powstają przeciwciała. Przeciwciała są komplementarne do antygenu, który spowodował ich syntezę i są w stanie się z nim wiązać. Wiązanie antygenów z przeciwciałami składa się z dwóch faz. Pierwsza faza jest specyficzna, w której następuje szybkie wiązanie determinanty antygenowej z centrum aktywnym fragmentu Fab przeciwciał. Należy zauważyć, że wiązanie wynika z sił van der Waalsa, wodoru i oddziaływań hydrofobowych. Siła wiązania zależy od stopnia zgodności przestrzennej pomiędzy miejscem aktywnym przeciwciała i epitopem antygenu. Po fazie specyficznej rozpoczyna się faza wolniejsza – niespecyficzna, która objawia się widocznym zjawiskiem fizycznym (np. tworzeniem się płatków podczas aglutynacji itp.).

Reakcje immunologiczne to interakcje między przeciwciałami i antygenami, a reakcje te są specyficzne i bardzo czułe. Są szeroko stosowane w praktyce lekarskiej. Za pomocą reakcji immunologicznych można rozwiązać następujące problemy:

Oznaczanie nieznanych przeciwciał za pomocą znanych antygenów (antigenic Diagnosticum). Zadanie to ma miejsce, gdy konieczne jest oznaczenie przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta (serodiagnoza). Znalezienie przeciwciał pozwala potwierdzić diagnozę;

Oznaczanie nieznanych antygenów przy użyciu znanych przeciwciał (surowica diagnostyczna). Badanie to przeprowadza się przy identyfikacji kultury patogenu wyizolowanej z materiału pacjenta (serotypowanie), a także przy wykrywaniu

antygeny drobnoustrojów i ich toksyny we krwi i innych płynach biologicznych. Istnieje wiele rodzajów reakcji immunologicznych, różniących się techniką inscenizacji i zarejestrowanym efektem. Są to reakcje aglutynacji (RA), reakcje strącania (RP), reakcje z udziałem dopełniacza (RSC), reakcje z wykorzystaniem znakowanych składników (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reakcja aglutynacji

Reakcja aglutynacji (RA) jest reakcją immunologiczną polegającą na oddziaływaniu antygenu z przeciwciałami w obecności elektrolitów, a antygen znajduje się w stanie korpuskularnym (erytrocyty, bakterie, cząsteczki lateksu z zaadsorbowanymi antygenami). Podczas aglutynacji antygeny korpuskularne sklejają się ze sobą za pomocą przeciwciał, co objawia się tworzeniem kłaczkowatego osadu. Tworzenie się płatków wynika z faktu, że przeciwciała mają dwa centra aktywne, a antygeny są wielowartościowe, tj. mają kilka determinantów antygenowych. RZS służy do identyfikacji patogenu wyizolowanego z materiału pacjenta, a także do wykrycia przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta (np. reakcja Wrighta i Heddlesona na brucelozę, reakcja Widala na dur brzuszny i dur brzuszny).

Najprostszym sposobem zdiagnozowania RZS jest reakcja na szkło; jest to przybliżony RZS, na podstawie którego określa się patogen wyizolowany od pacjenta. Po ustaleniu reakcji na szkiełko nakłada się diagnostyczną surowicę aglutynującą (w rozcieńczeniu 1:10 lub 1:20), a następnie dodaje się hodowlę pobraną od pacjenta. Reakcja jest dodatnia, jeśli w kropli pojawi się kłaczkowaty osad. W pobliżu umieszcza się kontrolę: zamiast surowicy dodaje się kroplę roztworu chlorku sodu. Jeżeli diagnostyczna surowica aglutynująca nie jest zaadsorbowana 1, to należy ją rozcieńczyć (do miana – takiego rozcieńczenia, do jakiego powinna nastąpić aglutynacja), tj. umieszczaj ekspandowany RA w probówkach ze wzrostem

1 Niezaadsorbowana surowica aglutynująca może aglutynować spokrewnione bakterie, które mają wspólne (reagujące krzyżowo) antygeny. Dlatego używajązaadsorbowane surowice aglutynujące, z których usunięto reagujące krzyżowo przeciwciała poprzez adsorpcję na pokrewnych bakteriach. Surowice takie zachowują przeciwciała specyficzne tylko dla danej bakterii.

rozcieńczenia surowicy aglutynującej, do których dodaje się 2-3 krople zawiesiny patogenu wyizolowanego od pacjenta. Aglutynację uwzględnia się na podstawie ilości osadu i stopnia oczyszczenia cieczy w probówkach. Reakcję uznaje się za pozytywną, jeżeli w rozcieńczeniu zbliżonym do miana surowicy diagnostycznej obserwuje się aglutynację. Reakcji towarzyszą kontrole: surowica rozcieńczona izotonicznym roztworem chlorku sodu powinna być przezroczysta, zawiesina drobnoustrojów w tym samym roztworze powinna być jednolicie mętna, bez osadu.

Aby oznaczyć przeciwciała przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta, stosuje się RZS na pełną skalę. Podczas jego przygotowania surowicę krwi pacjenta rozcieńcza się w probówkach i do probówek dodaje się równą ilość zawiesiny diagnostycznej (zawiesiny zabitych drobnoustrojów). Po inkubacji określa się najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym wystąpiła aglutynacja, tj. utworzył się osad (miano surowicy). W tym przypadku reakcja aglutynacji z O-diagnosticum (bakterie zabite przez ogrzewanie, zachowujące termostabilny antygen O) zachodzi w postaci aglutynacji drobnoziarnistej. Reakcja aglutynacji z H-diagnosticum (bakterie zabite przez formaldehyd, zatrzymujące termolabilny antygen wici H) jest szorstka i przebiega szybciej.

Pośrednia (bierna) reakcja hemaglutynacji(RNGA lub RPGA) to rodzaj RZS. Metoda ta jest bardzo czuła. Za pomocą RNGA można rozwiązać dwa problemy: oznaczenie przeciwciał w surowicy krwi pacjenta, do której dodawany jest antygenowy diagnostyka erytrocytów, czyli erytrocytów, na których adsorbowane są znane antygeny; określić obecność antygenów w materiale testowym. W tym przypadku reakcję nazywa się czasem odwrotną pośrednią reakcją hemaglutynacji (RONHA). W trakcie zabiegu do materiału badawczego dodaje się przeciwciało erythrocyte Diagnosticum (erytrocyty z przeciwciałami zaadsorbowanymi na ich powierzchni). W tej reakcji czerwone krwinki pełnią rolę nośników i biorą bierny udział w tworzeniu agregatów odpornościowych. Przy pozytywnej reakcji biernie sklejone czerwone krwinki pokrywają dno otworu równą warstwą z ząbkowanymi krawędziami („parasol”); przy braku aglutynacji czerwone krwinki gromadzą się w centralnym wgłębieniu otworu, tworząc zwarty „guzik” o ostro określonych krawędziach.

Reakcja koaglutynacji służy do oznaczania komórek patogenów (antygenów) przy użyciu zaadsorbowanych na nich przeciwciał Staphylococcus aureus, zawierające białko A. Białko A ma powinowactwo do fragmentu Fc immunoglobulin. Dzięki temu przeciwciała wiążą się ze gronkowcami pośrednio poprzez fragment Fc, a fragmenty Fab są zorientowane na zewnątrz i są w stanie oddziaływać z odpowiednimi drobnoustrojami wyizolowanymi od pacjentów. W tym przypadku powstają płatki.

Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI) stosowane w diagnostyce infekcji wirusowych, a jedynie infekcje wywołane przez wirusy hemaglutynujące. Wirusy te zawierają na swojej powierzchni białko – hemaglutyninę, która jest odpowiedzialna za reakcję hemaglutynacji (HRA), gdy do wirusów dodawane są czerwone krwinki. RTGA polega na blokowaniu antygenów wirusowych przeciwciałami, w wyniku czego wirusy tracą zdolność do aglutynacji czerwonych krwinek.

Reakcja Coombsa - RA do oznaczania niekompletnych przeciwciał. W przypadku niektórych chorób zakaźnych, takich jak bruceloza, w surowicy krwi pacjenta krążą niekompletne przeciwciała przeciwko patogenowi. Niekompletne przeciwciała nazywane są przeciwciałami blokującymi, ponieważ mają jedno miejsce wiązania antygenu, a nie dwa, jak pełne przeciwciała. Dlatego po dodaniu diagnostyki antygenowej niekompletne przeciwciała wiążą się z antygenami, ale nie sklejają ich ze sobą. Aby zamanifestować reakcję, dodaje się surowicę antyglobulinową (przeciwciała przeciwko immunoglobulinom ludzkim), co doprowadzi do aglutynacji kompleksów immunologicznych (diagnostyka antygenowa + niekompletne przeciwciała) powstałych w pierwszym etapie reakcji.

Pośrednią reakcję Coombsa stosuje się u pacjentów z hemolizą wewnątrznaczyniową. U niektórych z tych pacjentów wykryto niekompletne monowalentne przeciwciała przeciwko rezusowi. W szczególności oddziałują z erytrocytami Rh-dodatnimi, ale nie powodują ich aglutynacji. Dlatego do układu przeciwciał anty-Rh + erytrocyty Rh-dodatnie dodawana jest surowica antyglobulinowa, co powoduje aglutynację erytrocytów. Za pomocą reakcji Coombsa diagnozuje się stany patologiczne związane z wewnątrznaczyniową lizą erytrocytów pochodzenia immunologicznego, na przykład chorobę hemolityczną noworodka spowodowaną konfliktem Rh.

RA do oznaczania grup krwi opiera się na aglutynacji erytrocytów przez przeciwciała surowicy odpornościowej przeciwko antygenom grup krwi A(II), B(III). Kontrolę stanowi surowica niezawierająca przeciwciał, tj. grupa krwi AB(IV) i antygeny erytrocytów grupy A(P) i B(III). Jako kontrolę ujemną stosuje się krwinki czerwone grupy 0(I), ponieważ nie zawierają one antygenów.

Do określenia czynnika Rh stosuje się surowice anty-Rh (co najmniej dwie różne serie). Jeśli na błonie badanych erytrocytów znajduje się antygen Rh, następuje aglutynacja tych komórek.

13.3. Reakcja wytrącania

RP jest reakcją immunologiczną polegającą na oddziaływaniu przeciwciał z antygenami w obecności elektrolitów, a antygen jest w stanie rozpuszczalnym. Podczas wytrącania rozpuszczalne antygeny wytrącają się przez przeciwciała, co objawia się zmętnieniem w postaci pasm wytrącania. Gdy obydwa odczynniki zmiesza się w równoważnych proporcjach, obserwuje się powstawanie widocznego osadu. Nadmiar jednego z nich zmniejsza ilość wytrąconych kompleksów immunologicznych. Reakcję strącania można przeprowadzić na różne sposoby.

Reakcja wytrącania pierścienia umieszczone w rurkach opadowych o małej średnicy. Do probówki dodaje się surowicę odpornościową i ostrożnie nakłada się rozpuszczalny antygen. Jeśli wynik jest pozytywny, na styku obu roztworów tworzy się mleczny pierścień. Reakcja wytrącania pierścienia, która służy do oznaczania obecności antygenów w narządach i tkankach, których ekstrakty gotuje się i filtruje, nazywa się reakcją termoprecypitacji (reakcja Ascoliego służąca do oznaczania termostabilnego antygenu wąglika).

Reakcja podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony’ego. Reakcję tę prowadzi się w żelu agarowym. W warstwie żelu o jednakowej grubości wycina się w pewnej odległości od siebie studzienki i wypełnia je odpowiednio antygenem i surowicą immunologiczną. Następnie antygeny i przeciwciała dyfundują do żelu, spotykają się ze sobą i tworzą kompleksy immunologiczne, które wytrącają się w żelu i stają się widoczne w postaci precyzyjnych linii.

odżywianie. Reakcję tę można wykorzystać do identyfikacji nieznanych antygenów lub przeciwciał, a także do sprawdzenia podobieństwa między różnymi antygenami: jeśli antygeny są identyczne, linie precypitacji łączą się, jeśli antygeny nie są identyczne, linie precypitacji przecinają się, jeśli antygeny są częściowo identyczne, powstaje ostroga.

Reakcja promienistej immunodyfuzji. Do roztopionego żelu agarowego dodaje się przeciwciała i żel nakłada się równą warstwą na szkło. W żelu wycina się dołki i dodaje do nich standardową objętość roztworów antygenów o różnych stężeniach. Podczas inkubacji antygeny dyfundują promieniowo ze dołka i spotykając przeciwciała, tworzą pierścień strącający. Dopóki w dołku pozostaje nadmiar antygenu, następuje stopniowy wzrost średnicy pierścienia wytrącającego. Metodę tę stosuje się do oznaczania antygenów lub przeciwciał w roztworze testowym (np. do oznaczania stężenia immunoglobulin różnych klas w surowicy krwi).

Immunoelektroforeza. Mieszaninę antygenów rozdziela się najpierw elektroforetycznie, a następnie do rowka biegnącego wzdłuż kierunku ruchu białka dodaje się wytrącającą surowicę odpornościową. Antygeny i przeciwciała dyfundują do żelu ku sobie; oddziałując ze sobą, tworzą łukowate linie opadów.

Reakcja flokulacji(według Ramona) – rodzaj reakcji strącania, która służy do określenia aktywności antytoksycznej surowicy lub toksoidu. Reakcję prowadzi się w probówkach. W probówce, w której toksoid i antytoksyna znajdują się w równoważnym stosunku, obserwuje się zmętnienie.

13.4. Reakcja wiązania dopełniacza

Przeciwciała, oddziałując z odpowiednim antygenem, wiążą dodany dopełniacz (1. system). Wskaźnikiem wiązania dopełniacza są erytrocyty uwrażliwione surowicą hemolityczną, tj. przeciwciała przeciwko krwinkom czerwonym (2. system). Jeśli uzupełnienie nie jest ustalone w pierwszym systemie, tj. Jeśli nie nastąpi reakcja antygen-przeciwciało, uczulone krwinki czerwone ulegają całkowitej lizie (reakcja ujemna). Kiedy dopełniacz jest wiązany przez kompleksy immunologiczne pierwszego układu po dodaniu uczulonych erytrocytów, dochodzi do hemolizy z

nieobecny (reakcja pozytywna). Reakcję wiązania dopełniacza stosuje się w diagnostyce chorób zakaźnych (rzeżączka, kiła, grypa itp.).

13,5. Reakcja neutralizacji

Drobnoustroje i ich toksyny mają szkodliwy wpływ na narządy i tkanki ludzkiego ciała. Przeciwciała są w stanie wiązać się z tymi szkodliwymi czynnikami i blokować je, tj. zneutralizować. Na tej cesze przeciwciał opiera się diagnostyczna reakcja neutralizacji. Przeprowadza się ją poprzez wprowadzenie mieszaniny antygen-przeciwciało do zwierząt lub do wrażliwych obiektów badawczych (hodowla komórkowa, zarodki). Na przykład, aby wykryć toksyny w materiale pacjenta, zwierzętom z 1. grupy wstrzykuje się materiał od pacjenta. Zwierzętom drugiej grupy wstrzykuje się podobny materiał, wstępnie traktowany odpowiednią surowicą odpornościową. Zwierzęta pierwszej grupy umierają, jeśli w materiale znajduje się toksyna. Druga grupa zwierząt przeżywa, szkodliwe działanie toksyny nie objawia się, ponieważ zostaje zneutralizowane.

13.6. Reakcje z użyciem znakowanych przeciwciał lub antygenów

13.6.1. Reakcja immunofluorescencyjna (RIF, metoda Koonsa)

Metodę tę stosuje się do ekspresowej diagnostyki. Można go stosować do wykrywania zarówno antygenów, jak i przeciwciał drobnoustrojów.

Metoda bezpośrednia RIF- reakcja immunologiczna interakcji przeciwciał z antygenami, a przeciwciała są znakowane fluorochromem - substancją zdolną do emitowania kwantów światła o określonej długości fali pod wpływem światła o określonej długości fali. Osobliwością tej metody jest konieczność usunięcia nieprzereagowanych składników, aby wykluczyć wykrycie niespecyficznej luminescencji. Aby to zrobić, zmyj nieprzereagowane przeciwciała. Wyniki ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Bakterie w rozmazie potraktowanym takim luminescencyjnym serum świecą na ciemnym tle wzdłuż obwodu komórki.

Pośrednia metoda RIF jest używany częściej niż poprzedni. Reakcję tę przeprowadza się w dwóch etapach. W pierwszym etapie antygeny wzajemnie

oddziałują z odpowiednimi przeciwciałami, tworząc kompleksy immunologiczne. Wszystkie składniki, które nie przereagowały (tj. nie wchodzą w skład kompleksów immunologicznych) należy usunąć poprzez wypłukanie. W drugim etapie powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się za pomocą fluorochromizowanej surowicy antyglobulinowej. W rezultacie powstaje kompleks drobnoustroju + przeciwdrobnoustrojowe przeciwciała królicze + przeciwciała przeciwko immunoglobulinom króliczym, znakowane fluorochromem. Wyniki ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

13.6.2. Metoda lub test immunoenzymatyczny

Test ELISA jest najczęstszą nowoczesną metodą stosowaną w diagnostyce zakażeń wirusowych, bakteryjnych, pierwotniakowych, w szczególności w diagnostyce zakażenia wirusem HIV, wirusowego zapalenia wątroby itp.

Istnieje wiele modyfikacji testu ELISA. Powszechnie stosuje się niekonkurencyjny test ELISA na fazie stałej. Przeprowadza się je w 96-studzienkowych płytkach polistyrenowych (faza stała). Podczas przeprowadzania reakcji konieczne jest zmycie nieprzereagowanych składników na każdym etapie. Przy oznaczaniu przeciwciał do dołków, na których sorpowane są antygeny, dodaje się badaną surowicę krwi, a następnie znakowaną enzymem surowicę antyglobulinową. Reakcję prowadzi się przez dodanie substratu dla enzymu. W obecności enzymu następuje zmiana substratu, a kompleks enzym-substrat dobiera się tak, aby powstały w reakcji produkt był zabarwiony. Zatem przy pozytywnej reakcji obserwuje się zmianę koloru roztworu. W celu oznaczenia antygenów nośnik fazy stałej uwrażliwia się przeciwciałami, następnie do antygenów dodaje się kolejno materiał testowy (antygeny) i surowicę znakowaną enzymem. Aby reakcja zaszła, dodaje się substrat dla enzymu. Zmiana koloru roztworu następuje w przypadku reakcji pozytywnej.

13.6.3. Immunoblot

Metoda ta opiera się na połączeniu elektroforezy i testu ELISA. Podczas wykonywania immunoblottingu (blotting z języka angielskiego. plama- plamka) złożoną mieszaninę antygenów poddaje się najpierw elektroforezie w żelu poliakryloamidowym. Powstały frakcjonowany anty-

peptydy genowe są przenoszone na membranę nitrocelulozową. Następnie bloty traktuje się znakowanymi enzymami przeciwciałami skierowanymi przeciwko specyficznemu antygenowi, tj. przeprowadzić blot ELISA. Immunoblotting stosuje się w diagnostyce infekcji, takich jak HIV.

13.6.4. Immunologiczna mikroskopia elektronowa

Metoda polega na mikroskopowaniu wirusów (rzadziej innych drobnoustrojów) pod mikroskopem elektronowym, poddawanych wstępnemu działaniu odpowiedniej surowicy odpornościowej znakowanej preparatami gęstymi elektronowo-optycznie, na przykład ferrytyną, białkiem zawierającym żelazo.

13,7. Cytometrii przepływowej

Komórki krwi różnicuje się na podstawie cytofluorometrii laserowej. W tym celu pożądane komórki barwi się fluorescencyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenom CD. Próbka krwi po potraktowaniu znakowanymi przeciwciałami przepuszczana jest przez cienką rurkę, przez którą przechodzi wiązka lasera, która wzbudza fluorochrom do świecenia. Intensywność fluorescencji koreluje z gęstością antygenów na powierzchni komórki i można ją zmierzyć ilościowo za pomocą fotopowielacza. Uzyskane wyniki przekształcane są w histogram.

Cytometria przepływowa służy do określenia stanu odporności (zawartość głównych populacji limfocytów, zawartość cytokin wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, aktywność funkcjonalna komórek NK, aktywność fagocytozy itp.).