Pozytywna bezpośrednia reakcja Coombsa. Test antyglobulinowy. Bezpośrednia i pośrednia reakcja Coombsa. Jak przeprowadzana jest analiza?

Test Coombsa to badanie krwi przeprowadzane w celu wykrycia, czy krew zawiera określone przeciwciała, które mogą być niebezpieczne. Przeciwciała te przyczepiają się do czerwonych krwinek i mogą zaatakować układ odpornościowy i wyrządzić szkody w inny sposób. W terminologii medycznej badanie to nazywane jest również testem antyglobulinowym (AGT).

Rodzaje próbek Coombsa

Istnieją dwa rodzaje testów Coombsa – bezpośredni i pośredni.

Bezpośredni test Coombsa, znany również jako bezpośredni (DAT), wykrywa autoprzeciwciała, które przyczepiają się do powierzchni czerwonych krwinek. Przeciwciała te są czasami wytwarzane w organizmie w wyniku pewnych chorób lub podczas przyjmowania niektórych leków, takich jak prokainamid, metylodopa lub chinidyna.

Przeciwciała te są niebezpieczne, ponieważ czasami powodują anemię poprzez niszczenie czerwonych krwinek.

Badanie to zleca się czasami w celu zdiagnozowania przyczyny żółtaczki lub anemii.

Zwykle reakcja Coombsa jest ujemna.

Pozytywne dla:

• choroba hemolityczna noworodków;
• hemoliza autoimmunologiczna;
• hemolityczne reakcje transfuzyjne;
• polekowa niedokrwistość hemolityczna immunologiczna.

Pośredni test Coombsa, znany również jako , służy do wykrywania przeciwciał przeciwko czerwonych krwinek znajdujących się w surowicy krwi (surowica to przezroczysty żółty płyn krwi, który pozostaje po wyeliminowaniu czerwonych krwinek i koagulantu).

Pośredni test Coombsa jest stosowany podczas transfuzji krwi w celu ustalenia, czy krew dawcy odpowiada krwi biorcy. Nazywa się to testem zgodności i pomaga zapobiegać wszelkim niepożądanym reakcjom na krew dawcy. Badanie to zalecane jest także kobietom w ciąży. Niektóre kobiety mają przeciwciała IgG, które mogą przenikać przez łożysko do krwi płodu i szkodzić noworodkowi, powodując chorobę hemolityczną zwaną niedokrwistością hemolityczną.

Procedura

Krew pobiera się za pomocą strzykawki z żyły, zwykle z grzbietu dłoni lub zgięcia łokcia. Wcześniej miejsce nakłucia należy dokładnie zdezynfekować, a po pobraniu krwi nałożyć czysty gazik lub watę.

Powstałą krew oczyszcza się w laboratorium, a czerwone krwinki oddziela się. Próbkę następnie bada się sekwencyjnie, stosując różne surowice i odczynniki Coombsa, które są kontrastowane. Jeśli nie ma aglutynacji (zlepiania się czerwonych krwinek), oznacza to wynik pozytywny.

Jeśli jednak wynik testu jest negatywny, oznacza to, że we krwi znajdują się przeciwciała, które działają przeciwko czerwonym krwinkom. Może to wskazywać na różne choroby, takie jak anemia (zarówno naturalna, jak i spowodowana lekami), kiła czy zakażenie mykoplazmą. Po otrzymaniu wyników lekarz prowadzący zaleci odpowiednie leczenie.

Wideo

Nałożyć 1 dużą kroplę surowicy O(I), A(II), B(III) na płytkę lub szkiełko za pomocą pipet (różne!). Po zanotowaniu czasu za pomocą czystego szklanego pręta lub czystego rogu szkiełka połącz krople serum z kroplami krwi. Oznaczanie trwa 5 minut, potrząsając płytką, następnie do każdej mieszaniny kropli dodaje się 1 kroplę roztworu soli i ocenia wyniki. Lepiej, jeśli serum występuje w 2 różnych seriach. Wyniki grup krwi muszą być zgodne w obu seriach surowicy.

Ocena wyników izohemaglutynacji:

izohemaglutynacja. Jeśli reakcja jest pozytywna, w mieszaninie pojawiają się maleńkie czerwone ziarenka adhezyjnych czerwonych krwinek. Ziarna łączą się w większe ziarna, a te ostatnie w płatki. Serum jest prawie odbarwione;

jeżeli reakcja jest ujemna, mieszanina pozostaje jednolicie różowa przez 5 minut i nie stwierdza się żadnych ziaren;

Podczas pracy z 3 surowicami z grup O(I), A(II), B(III) możliwe są 4 kombinacje reakcji:

1. jeśli wszystkie 3 surowice dały reakcję ujemną, czyli mieszanina ma jednolity kolor różowy – jest to grupa krwi O(I);

   gdyby tylko surowica grupy A(II) dała reakcję ujemną, a surowice O(I) i B(III) dały reakcję dodatnią, czyli pojawiły się ziarna - to jest grupa krwi A(II);

   surowica grupy B(II) dała reakcję ujemną, a surowice grupy O(I) i A(II) dały reakcję dodatnią – jest to grupa krwi B(III).

wszystkie 3 surowice dały reakcję pozytywną - badana krew należała do grupy AB(IV). W tym przypadku badanie przeprowadza się z surowicą grupy AB(IV).

Notatka! Krople badanej krwi powinny być 5-10 razy mniejsze niż krople surowicy.

Błędy izohemaglutynacji.

Brak aglutynacji tam, gdzie powinna być i obecność aglutynacji tam, gdzie nie powinna. Może to być spowodowane słabym mianem surowicy i słabą aglutynacją czerwonych krwinek.

Obecność aglutynacji tam, gdzie jej nie powinno być- Jest to pseudoaglutynacja, podczas której stosy czerwonych krwinek tworzą „kolumny monet”. Potrząsanie płytką lub dodanie soli fizjologicznej niszczy je.

Panaglutynacja, gdy surowica skleja ze sobą wszystkie czerwone krwinki, łącznie z krwinkami należącymi do jej własnej grupy krwi. W piątej minucie znikają oznaki aglutynacji.

Występuje również tzw. zimna panaglutynacja, kiedy to czerwone krwinki sklejają się ze sobą na skutek niskiej temperatury powietrza (poniżej 15°C) w pomieszczeniu.

We wszystkich tych przypadkach przeprowadza się albo powtarzaną reakcję, albo przy użyciu standardowych czerwonych krwinek.

Oznaczanie krwi Rh

Do określenia statusu Rh, czyli wykrycia obecności lub braku antygenów układu Rh we krwi człowieka, wykorzystuje się standardowe surowice (odczynniki) anty-Rh, różniące się swoistością, czyli zawierające przeciwciała przeciwko różnym antygenom tego układu. Do oznaczenia antygenu Rh 0 (D) najczęściej stosuje się surowicę anty-Rhesus z dodatkiem 10% roztworu żelatyny lub stosuje się standardowy odczynnik anty-Rhesus przygotowany wcześniej z 33% roztworem poliglucyny. W celu uzyskania dokładniejszych wyników badań, a także identyfikacji antygenów innych układów serologicznych, wykorzystuje się test Coombsa (jest on także bardzo czuły w określaniu zgodności przetoczonej krwi). Do badań wykorzystuje się krew natywną lub krew przygotowaną z dodatkiem środka konserwującego. W takim przypadku należy zmyć krew z konserwantu dziesięciokrotną objętością izotonicznego roztworu chlorku sodu. Przy określaniu statusu Rh- Rh 0 (D) należy użyć dwóch próbek surowicy lub odczynnika anty-Rhesus z dwóch różnych serii i jednocześnie wzorcowych czerwonych krwinek uzyskanych z krwi Rh dodatniej (Rh +) i Rh ujemnej (Rh -) Do kontroli należy wykorzystywać pojedyncze osoby. Przy oznaczaniu innych izoantygenów należy odpowiednio zastosować kontrolne krwinki czerwone, które zawierają lub nie zawierają antygenu, przeciwko któremu skierowane są przeciwciała w surowicy standardowej.

Aglutyniny częściowego ciepła są najczęstszym rodzajem przeciwciał, które mogą powodować rozwój autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej. Przeciwciała te należą do klasy IgG, rzadziej do IgM, IgA.

TEST COOMBSA

Test Coombsa: wprowadzenie. Test Coombsa jest laboratoryjną metodą diagnostyczną opartą na reakcji hemaglutynacji.

Główną metodą diagnozowania autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej jest test Coombsa. Opiera się na zdolności przeciwciał specyficznych dla immunoglobulin (zwłaszcza IgG) lub składników dopełniacza (zwłaszcza S3) do aglutynacji erytrocytów opłaszczonych IgG lub S3.

Wiązanie IgG i C3b z erytrocytami obserwuje się w autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej i immunologicznej niedokrwistości hemolitycznej polekowej. Bezpośredni test Coombsa. Bezpośredni test Coombsa służy do wykrywania przeciwciał lub składników dopełniacza osadzonych na powierzchni czerwonych krwinek. Przeprowadza się to w następujący sposób:

W celu uzyskania przeciwciał przeciwko ludzkim immunoglobulinom (surowica antyglobulinowa) lub dopełniaczowi (surowica antydopełniacza), zwierzę immunizuje się ludzką surowicą, immunoglobulinami lub dopełniaczem ludzkim. Surowicę uzyskaną od zwierzęcia oczyszcza się z przeciwciał przeciwko innym białkom.

Czerwone krwinki pacjenta przemywa się solą fizjologiczną w celu całkowitego usunięcia surowicy, która neutralizuje przeciwciała przeciwko immunoglobulinom i dopełniaczowi, co może powodować fałszywie ujemny wynik.

Jeśli przeciwciała lub składniki dopełniacza są utrwalone na powierzchni czerwonych krwinek, dodatek antyglobuliny lub surowicy przeciw dopełniaczowi powoduje aglutynację czerwonych krwinek.

Bezpośredni test Coombsa stosuje się w następujących przypadkach:

Hemoliza autoimmunologiczna.

Choroba hemolityczna noworodków.

Niedokrwistość hemolityczna polekowa.

Reakcje hemolityczne na transfuzję. Pośredni test Coombsa. Pośredni test Coombsa wykrywa przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom w surowicy. W tym celu surowicę pacjenta inkubuje się z krwinkami czerwonymi dawcy grupy 0, a następnie wykonuje się bezpośredni test Coombsa.

Pośredni test Coombsa stosuje się w następujących przypadkach:

Określanie indywidualnej zgodności krwi dawcy i biorcy.

Wykrywanie alloprzeciwciał, w tym przeciwciał wywołujących hemolityczne reakcje transfuzyjne.

Oznaczanie antygenów powierzchniowych erytrocytów w genetyce medycznej i medycynie sądowej.

Potwierdzenie identycznych bliźniąt podczas przeszczepiania szpiku kostnego.

Aby przeprowadzić test biologiczny, krew zaczyna być przetaczana tak szybko, jak to możliwe (najlepiej w strumieniu). Po przetoczeniu 25 ml krwi rurkę systemową zaciska się zaciskiem. Następnie następuje 3-minutowa przerwa, podczas której monitorowany jest stan odbiorcy. Aby wykonać test biologiczny, trzykrotnie wstrzykuje się 25 ml krwi. Na koniec badania (po przetoczeniu pierwszych 75 ml krwi w ułamkowych dawkach po 25 ml w odstępach co 3 minuty) system zostaje dostosowany do wymaganej szybkości transfuzji. W przypadku przetaczania pacjentowi więcej niż jednej butelki krwi konieczne jest usunięcie igły z żyły. W takim przypadku igłę wyjmuje się z probówki fiolki, z której wyciekła krew i wprowadza do następnej fiolki. Rurę systemową (gumową lub plastikową) mocujemy w tym momencie za pomocą obejmy. Jeżeli podczas transfuzji krwi zaistnieje konieczność dożylnego podania biorcy innego leku, dokonuje się tego poprzez przekłucie gumowej rurki systemu. Przebicia plastikowej rurki są niedopuszczalne, ponieważ nie odpadają. Po każdej transfuzji krwi należy monitorować pacjenta, aby zidentyfikować i szybko wyeliminować możliwe powikłania, w tym reakcje alergiczne. Po 2 godzinach od zakończenia transfuzji krwi należy zmierzyć temperaturę ciała. Jeżeli wzrośnie, pomiar należy powtarzać co godzinę przez kolejne 4 godziny. Równie ważne jest monitorowanie oddawania moczu i składu moczu, co pozwala stwierdzić obecność toksycznej reakcji potransfuzyjnej. Pojawienie się skąpomoczu i bezmoczu po przetoczeniu krwi, obecność krwinek i białka w moczu są bezpośrednią oznaką rozwoju hemolizy potransfuzyjnej.

Niedokrwistość hemolityczna, spowodowane przez ciała autoimmunologiczne, które są skierowane przeciwko ich własnym czerwonym krwinkom, nie są dokładnie poznane. Zakłada się jednak, że pewne czynniki (np. wirus, nieprawidłowe białko) zmieniają krwinki czerwone w taki sposób, że organizm postrzega je „jako coś obcego” i zwalcza je za pomocą przeciwciał. Według innej teorii, przeciwciała skierowane przeciwko krwinkom czerwonym powstają niemal przypadkowo podczas tworzenia się nieprawidłowych ciał białkowych osocza w niektórych chorobach. Takie ciała białkowe, równie „losowo”, mogą dawać reakcje, które można wykorzystać do postawienia diagnozy (na przykład wirusowe zapalenie płuc, jak wiadomo, daje dodatnią reakcję Wassermana, dodatnią reakcję Paula-Bunnela i reakcję zimnej aglutynacji). .

Istnieją dwa główne typy autoprzeciwciał na anemię hemolityczną, czyli: przeciwciała ciepłe (reagują w temperaturze 37°C) i przeciwciała zimne (którego reaktywność wzrasta wraz ze zbliżaniem się temperatury do zera). Ciepłe przeciwciała są częstsze niż zimne przeciwciała. Dacie odkrył, że ciepłe hemolizyny występują 2 razy częściej niż zimne. Hemolizyny i aglutyniny nie są zasadniczo różnymi przeciwciałami: różnią się jedynie charakterem działania. Aglutyniny aglutynują czerwone krwinki, a hemolizyny czynią je bardziej podatnymi na złożony proces hemolizy (uzupełniacz!). Autoprzeciwciała przyczepiające się do erytrocytów tworzą kompleks erytrocyt-globina. Kompleks ten wykrywa się za pomocą testu antyglobinowego Coombsa.

Test Coombsa przeprowadzono z surowicą Coombsa, na przygotowanie której królika uczula się surowicą ludzką, przeciwko której w surowicy królika powstają przeciwciała. Kiedy taka uczulona surowica działa na ludzkie erytrocyty, następuje ich aglutynacja, jeśli receptory erytrocytów są zajęte przez przeciwciała blokujące. Ponieważ te przeciwciała blokujące pochodzą z surowicy ludzkiej, aglutynują z surowicą króliczą uczuloną na osocze ludzkie i zawierającą precypityny. Reakcja ta nazywana jest testem Coombsa; w przypadku niedokrwistości hemolitycznej wywołanej przez ciała autoimmunologiczne (Lo tit) jest to prawie specyficzne (szczegóły patrz Maier).

Ogólnie w przypadku niedokrwistości hemolitycznej w przypadku pierwotnego zaburzenia erytrocytów test Coombsa jest ujemny, a w przypadku nabytych - dodatni. Istnieją jednak wyjątki od tej reguły: fałszywie dodatni odczyn Coombsa stwierdzano w okresach kryzysów konstytucjonalnej niedokrwistości hemolitycznej, a w słabym stopniu także czasami po splenektomii, przy reumatycznym zapaleniu stawów, sarkoidozie, po częstych transfuzjach krwi i przy toczniu układowym rumieniowaty. Naturalnie, w nabytej niedokrwistości hemolitycznej bez powstawania ciał autoimmunologicznych, jest ona ujemna.

Niedokrwistość hemolityczna wywołane przez organizmy autoimmunologiczne można podzielić na:
a) formy ostre, podostre i przewlekłe, a także
b) idiopatyczny o nieznanej etiologii oraz c) objawowy [wirusowe zapalenie płuc (tylko aglutyniny zimne), przewlekła białaczka limfatyczna, mięsak siatkowaty, mięsak limfatyczny, toczeń rumieniowaty układowy (głównie ciepłe, rzadziej zimne aglutyniny), kiła (zimne aglutyniny), nowotwory jajnika (Mieschera) z pracownikami)).
c) objawowe [wirusowe zapalenie płuc (tylko aglutyniny zimne), przewlekła białaczka limfatyczna, mięsak siatkowaty, mięsak limfatyczny, toczeń rumieniowaty układowy (głównie aglutyniny ciepłe, rzadziej aglutyniny zimne), kiła (aglutyniny zimne), guzy jajnika (Miescher i wsp.)).

Klinika niedokrwistości hemolitycznej, rozwijające się pod wpływem ciał autoimmunologicznych, jest bardzo zróżnicowane, dlatego prawie niemożliwe jest nakreślenie ich ogólnego obrazu klinicznego. Chorują w równym stopniu osoby w każdym wieku i obu płci. Jednak postacie idiopatyczne wydają się być częściej obserwowane u kobiet (Sacks i Workman).

Obraz kliniczny postaci idiopatycznej różni się w zależności od ciężkości choroby. W przypadkach przewlekłych początek jest stopniowy, choroba ciągnie się przez wiele lat z częstymi zaostrzeniami. Nasilenie niedokrwistości różni się w zależności od stopnia hemolizy. Obserwuje się spadki poziomu hemoglobiny do 10%; w innych przypadkach hemoglobina utrzymuje się na poziomie 50-60% przez długi czas. Intensywność retikulocytozy i żółtaczkowego zabarwienia skóry i surowicy odpowiada stopniowi hemolizy. Bilirubina bardzo rzadko występuje w moczu, ponieważ nie przechodzi przez nerki, ale obserwuje się hemoglobinurię. W przypadkach przewlekłych śledziona jest często powiększona i może osiągnąć nawet bardzo duże rozmiary, ale w innych przypadkach nadal można ją wyczuć palpacyjnie. Wątroba rzadko nie jest powiększona.

W większości przypadków we krwi obserwuje się makrocytozę, w ostrych stadiach jest również wiele mikrocytów, normoblastoza i polichromazja są rzadko nieobecne, leukocytoza może osiągnąć 30 000, płytki krwi są w normie. W niektórych przypadkach występuje jednak ciężka trombocytopenia. Evans tłumaczy te przypadki jednoczesną obecnością przeciwciał przeciwko płytkom krwi, tak że występuje zarówno niedokrwistość hemolityczna, jak i małopłytkowość z powodu działania ciał autoimmunologicznych - zespół Evansa. Oporność osmotyczna jest nieznacznie zmniejszona, ale nie w takim stopniu i nie tak trwale, jak w przypadku konstytucjonalnej niedokrwistości kulistokomórkowej. Test odporności na ciepło (Hegglin-Maier) po 6 godzinach może również dać lekką hemolizę (obserwacja własna), ale w mniejszym stopniu niż w przypadku niedokrwistości Marchiafavy. Hemosyderyna występuje także w moczu (obserwacja własna).

Przeciwciała, znajdujący się na powierzchni czerwonych krwinek, może być w stanie statycznym lub wolnym osocze krwi. W zależności od stanu przeciwciał przeprowadza się bezpośrednią lub pośrednią reakcję Coombsa. Jeśli istnieją podstawy, aby sądzić, że przeciwciała są utrwalone na powierzchni czerwonych krwinek, przeprowadza się bezpośredni test Coombsa. W tym przypadku test odbywa się jednoetapowo – dodawanie surowica antyglobulinowa. Jeżeli na powierzchni czerwonych krwinek obecne są niekompletne przeciwciała, aglutynacja Czerwone krwinki

Reakcja pośrednia

Pośrednia reakcja Coombsa przebiega w 2 etapach. Najpierw musisz sztucznie wdrożyć uczulenie Czerwone krwinki W tym celu inkubuje się badane krwinki czerwone i surowicę krwi, co powoduje osadzanie się przeciwciał na powierzchni czerwonych krwinek. Następnie przeprowadza się drugi etap testu Coombsa – dodanie surowicy antyglobulinowej.

Reakcja wytrącania - RP (od łac. praecipilo do wytrącania) to tworzenie i wytrącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci zmętnienia zwanego Osad. Powstaje w wyniku zmieszania antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach; nadmiar jednego z nich zmniejsza poziom tworzenia kompleksu immunologicznego. Reakcję wytrącania przeprowadza się w probówkach (reakcja wytrącania pierścieniowego), w żelach, pożywkach itp. Odmiany reakcji wytrącania w półpłynnym agarze lub żelu agarozowym, podwójna immunodyfuzja przez Ouchterlony, immunodyfuzja radiacyjna, immunoepektroforeza itd.

Typowanie HLA- badanie głównego kompleksu zgodności tkankowej człowieka - kompleksu HLA. Formacja ta obejmuje region genów na chromosomie 6, który koduje antygeny HLA zaangażowane w różne odpowiedzi immunologiczne.

Zadania dla Typowanie HLA może być bardzo różny – identyfikacja biologiczna (typ HLA dziedziczony jest wraz z genami rodzicielskimi), określenie predyspozycji do różnych chorób, selekcja dawców do przeszczepienia narządów – w tym przypadku porównywane są wyniki typowania HLA tkanek dawcy i biorcy. Za pomocą typowania HLA określa się, jak podobni lub różni są małżonkowie pod względem antygenów zgodności tkankowej w celu diagnozowania przypadków niepłodności.

Sugeruje typowanie HLA Analiza polimorfizmu HLA i przeprowadza się dwiema metodami – serologiczną i genetyką molekularną. Klasyczna metoda serologiczna typowania HLA opiera się na teście mikrolimfocytotoksyczności, a metoda molekularna wykorzystuje PCR (reakcję łańcuchową polimerazy).

Serologiczne Typowanie HLA przeprowadzono na izolowanych populacjach komórek. Antygeny głównego układu zgodności tkankowej przenoszone są głównie przez limfocyty. Dlatego zawiesinę limfocytów T stosuje się jako głównych nośników antygenów klasy I, a zawiesinę limfocytów B do oznaczania antygenów HLA klasy II. Aby wyizolować wymagane populacje komórek z krwi pełnej, stosuje się wirowanie lub separację immunomagnetyczną. Uważa się, że pierwsza metoda może prowadzić do fałszywie dodatnich danych, ponieważ powoduje to śmierć niektórych komórek. Druga metoda jest uznawana za bardziej specyficzną - ponad 95% komórek pozostaje żywych.

Ale podstawą do wykonania testu limfocytotoksycznego Typowanie HLA to specyficzna surowica zawierająca przeciwciała przeciwko różnym wariantom allelicznym antygenów HLA klasy I i II. Test serologiczny może określić typ HLA, badając, które surowice reagują z limfocytami, a które nie.

Jeśli między komórkami a surowicą zachodzi reakcja, w jej wyniku tworzy się kompleks antygen-przeciwciało na powierzchni komórki. Po dodaniu roztworu zawierającego dopełniacz następuje liza i śmierć komórek. Serologiczny test typowania HLA ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny reakcji pozytywnych (czerwona fluorescencja) i negatywnych (zielona fluorescencja) lub mikroskopii z kontrastem fazowym w celu wybarwienia jąder martwych komórek. Wynik typowania HLA wyprowadza się biorąc pod uwagę specyficzność przereagowanych surowic i reagujących krzyżowo grup antygenów oraz intensywność reakcji cytotoksyczności.

Wady serologiczne Typowanie HLA to obecność reakcji krzyżowych, słabe powinowactwo przeciwciał lub niska ekspresja antygenów HLA, brak produktów białkowych w wielu genach HLA.

Bardziej nowoczesne metody molekularne Typowanie HLA wykorzystują już wystandaryzowane próbki syntetyczne, które reagują nie z antygenami na powierzchni leukocytów, ale z DNA i bezpośrednio wskazują, jakie antygeny są obecne w próbce. Metody molekularne nie wymagają żywych białych krwinek, można badać każdą ludzką komórkę, a do pracy wystarczy kilka mikrolitrów krwi, można też ograniczyć się do zeskrobania błony śluzowej jamy ustnej.

Genetyka molekularna Typowanie HLA wykorzystuje metodę PCR, której pierwszym krokiem jest uzyskanie czystego genomowego DNA (z krwi pełnej, zawiesiny leukocytów, tkanek).

Próbkę DNA następnie kopiuje się i amplifikuje in vitro przy użyciu starterów (krótkiego jednoniciowego DNA) specyficznych dla określonego locus HLA. Końce każdej pary starterów muszą być ściśle komplementarne z unikalną sekwencją odpowiadającą konkretnemu allelowi, w przeciwnym razie amplifikacja nie nastąpi.

Po PCR, podczas wielokrotnego kopiowania, uzyskuje się dużą liczbę fragmentów DNA, które można ocenić wizualnie. W tym celu mieszaniny reakcyjne poddaje się elektrolizie lub hybrydyzacji i za pomocą programu lub tabeli określa się, czy nastąpiła specyficzna amplifikacja. Wynik typowania HLA przedstawiany jest w formie kompleksowego raportu na poziomie genu i alleli. Ze względu na standaryzację stosowanych próbek molekularnych Typowanie HLA dokładniej serologiczne. Ponadto dostarcza więcej informacji (więcej nowych alleli DNA) i wyższy poziom szczegółowości, ponieważ pozwala zidentyfikować nie tylko antygeny, ale także same allele, które określają, który antygen jest obecny w komórce.

Reakcja lizy immunologicznej. Reakcja opiera się na zdolności swoistych przeciwciał do tworzenia kompleksów immunologicznych z komórkami, w tym erytrocytami i bakteriami, co prowadzi do aktywacji układu dopełniacza na drodze klasycznej i lizy komórek. Spośród reakcji lizy immunologicznej najczęściej stosuje się reakcję hemolizy, a rzadko reakcję bakteriolizy (głównie w różnicowaniu cholery i wibracji choleropodobnych).

Reakcja hemolizy. Pod wpływem reakcji z przeciwciałami w obecności dopełniacza mętna zawiesina czerwonych krwinek zamienia się w jasnoczerwoną przezroczystą ciecz - „lakierową krew” w wyniku uwolnienia hemoglobiny. Przy ustalaniu diagnostycznej reakcji wiązania dopełniacza (FFR) reakcję hemolizy wykorzystuje się jako wskaźnik: w celu sprawdzenia obecności lub braku (wiązania) wolnego dopełniacza.

Miejscowa reakcja hemolizy w żelu(reakcja Erne’a) jest jednym z wariantów reakcji hemolizy. Pozwala określić liczbę komórek tworzących przeciwciała. Liczbę komórek wydzielających przeciwciała - hemolizyny - określa liczba płytek hemolizy, które pojawiają się w żelu agarowym zawierającym erytrocyty, zawiesinę komórek badanej tkanki limfatycznej i dopełniacz.

Metoda immunofluorescencyjna

(RIF, reakcja immunofluorescencyjna) to metoda wykrywania specyficznych Ag (Abs) przy użyciu Ab (Ags) sprzężonego z fluorochromem. Charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością. Służy do ekspresowej diagnostyki infekcji. chorób (identyfikacja patogenu w materiale badawczym), a także do oznaczania receptorów Ab i powierzchniowych oraz markerów leukocytów (immunofenotypowanie) i innych komórek. Bezpośrednio I. m. polega na obróbce wycinka tkanki lub wymazu z materiału patologicznego lub skorupy drobnoustrojów zawierających specyficzne Abs sprzężone z fluorochromem; preparat przemywa się w celu uwolnienia od niezwiązanego Ab i bada pod mikroskopem fluorescencyjnym. W pozytywnych przypadkach wokół obwodu obiektu pojawia się świecący kompleks immunologiczny. Kontrola jest konieczna, aby wykluczyć nieswoistą luminescencję. Na pośredni. Ich. w pierwszym etapie wycinek tkanki lub rozmaz poddaje się działaniu specyficznego środka niefluorescencyjnego, w drugim – środka luminescencyjnego przeciwko -globulinom zwierzęcia, który był stosowany w pierwszym etapie. W przypadku dodatnim tworzy się kompleks świetlny składający się z Ar, At do niego i At przeciwko At (metoda kanapkowa). Oprócz mikroskopu fluorescencyjnego, RIF służy do uwzględnienia fenotypowania komórek. laserowy sortownik komórek .

Cytometrii przepływowej- metoda optycznego pomiaru parametrów komórki, jej organelli i procesów w niej zachodzących.

Technika ta polega na wykrywaniu rozpraszania światła wiązki laserowej, gdy komórka przechodzi przez nią w strumieniu cieczy, a stopień rozproszenia światła pozwala zorientować się w wielkości i strukturze komórki. Dodatkowo w analizie uwzględnia się poziom fluorescencji związków chemicznych wchodzących w skład komórki (autofluorescencja) lub dodanych do próbki przed cytometrią przepływową.

Zawiesina komórek, wstępnie wyznakowana fluorescencyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi lub barwnikami fluorescencyjnymi, wchodzi do strumienia płynu przechodzącego przez kuwetę przepływową. Warunki dobierane są w taki sposób, aby komórki układały się jedna za drugą ze względu na tzw. hydrodynamiczne skupianie strumienia w strumieniu. W momencie, gdy komórka przecina wiązkę lasera, detektory rejestrują:

rozpraszanie światła pod małymi kątami (od 1° do 10°) (ta cecha służy do określania wielkości komórek).

rozpraszanie światła pod kątem 90° (pozwala ocenić stosunek jądro/cytoplazma, a także niejednorodność i ziarnistość komórek).

intensywność fluorescencji poprzez kilka kanałów fluorescencji (od 2 do 18-20) - pozwala określić skład subpopulacji zawiesiny komórkowej itp.

- badanie pomagające określić zawartość niepełnych przeciwciał przeciw erytrocytom we krwi. Ten test antyglobulinowy pozwala wykryć przeciwciała u kobiet w ciąży.

Ponadto umożliwia zdiagnozowanie niedokrwistości hemolitycznej u noworodków z konfliktem Rh na początkowych etapach. Pomaga to zapobiegać niszczeniu czerwonych krwinek niezbędnych do prawidłowego tworzenia krwi. Test ten został stworzony w 1945 roku przez Roberta Coombsa i dlatego otrzymał swoją nazwę.

Test Coombsa jest wszechstronnym testem, pozwalającym na szybkie rozpoznanie zaburzeń układu krwiotwórczego zarówno u dorosłych, jak i u dzieci.

Istnieją następujące rodzaje takich testów:

1. Bezpośredni test Coombsa– pozwala na oznaczenie przeciwciał znajdujących się na powierzchni czerwonych krwinek. Zazwyczaj takie badanie jest przepisywane w przypadku podejrzenia hemolizy, autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej lub innych chorób autoimmunologicznych. Ponadto przeprowadza się go po terapii lekowej lekami na bazie chininy, penicyliny lub metyldopy lub po transfuzji krwi. Aby uzyskać dokładniejsze wyniki należy całkowicie odstawić leki przynajmniej na 1 tydzień przed badaniem.
2. Pośredni test Coombsa– test umożliwiający wykrycie w osoczu przeciwciał przeciwko erytrocytom. Zwykle wykonuje się je w czasie ciąży i przed transfuzją krwi. Przeciwciała przeciwko erytrocytom pojawiają się we krwi danej osoby podczas reaktywnego układu odpornościowego lub jako reakcja na niektóre leki. W celu dokładniejszego badania przeprowadza się kilka próbek jednocześnie w odstępie 2 godzin.

Wskazania do stosowania

Test Coombsa wykonuje się tylko w przypadku poważnych wskazań. To drogie i czasochłonne badanie, które jest swoistym badaniem.

Zazwyczaj za wskazania do jego wdrożenia uznaje się następujące sytuacje:

1. Podczas transfuzji krwi. Badanie pozwala określić, czy krew biorcy zakorzeni się w organizmie człowieka, a także czy możliwe jest jej oddanie. W takim przypadku konieczne jest zbadanie materiału zarówno dawcy, jak i biorcy. Ważne jest określenie charakteru przeciwciał, ponieważ jeśli są one niezgodne w organizmie na tle konfliktu Rh, układ odpornościowy ulega zniszczeniu. Prowadzi to do rozwoju poważnych chorób, a w rzadkich przypadkach nawet śmierci.
2. Przed operacją, gdy istnieje ryzyko utraty krwi. Odbywa się to tak, aby lekarz mógł natychmiast wprowadzić odpowiednią krew w celu przywrócenia organizmu.
3. Aby wykryć uczulenie na Rh. Rezus to specyficzny antygen, który pojawia się w organizmie każdej kobiety w czasie ciąży. Jeżeli matka ma dodatni czynnik Rh, a ojciec ujemny lub odwrotnie, dziecko nie jest zależne – może ono odziedziczyć każdego. Jeśli dziecko otrzyma od matki rezus przeciwny, istnieje duże ryzyko uczulenia. Zjawisko to charakteryzuje się mieszaniem się krwi matki i dziecka. Może się to zdarzyć zarówno w czasie ciąży, jak i podczas porodu.

Jeśli w ciele kobiety w ciąży wystąpi konflikt Rh, układ odpornościowy matki zaczyna postrzegać płód jako ciało obce. Z tego powodu istnieje duże ryzyko, że zacznie go atakować.

W wyniku takich działań u dziecka mogą rozwinąć się poważne patologie. Najczęściej występuje erytroblastoza - zjawisko, w którym organizm dziecka nie jest w stanie wytworzyć wystarczającej liczby czerwonych krwinek.

Ponadto, z powodu konfliktu Rh, śmierć płodu może nastąpić w łonie matki lub bezpośrednio po urodzeniu. Przy właściwym podejściu do leczenia można łatwo uniknąć tak poważnych konsekwencji.

Odchylenia od normy

Jeżeli wynik testu Coombsa jest pozytywny, lekarz stwierdza, że ​​w surowicy krwi znajdują się przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Oznacza to, że krew dawcy może nie być zgodna z krwią pacjenta.

Jeśli w ciele kobiety w ciąży z krwią Rh ujemną zostanie zdiagnozowany pozytywny wynik, wówczas jej ciało zawiera przeciwciała przeciwko krwi płodu.

Wskazuje to na konflikt Rh, który wymaga od lekarza niezwykle ostrożnego podejścia do prowadzenia ciąży, a także przestrzegania wszystkich instrukcji i zaleceń kobiety.

Jeśli we krwi dziecka obecne są przeciwciała, rozpoznaje się chorobę hemolityczną noworodka. W takim przypadku przeprowadza się powtórne badanie w celu ustalenia, czy występuje wzrost poziomu przeciwciał we krwi przyszłej matki, czy nie.

Możliwe powikłania testu Coombsa

Test Coombsa jest dość bezpiecznym testem, który pozwala zdiagnozować szereg chorób autoimmunologicznych we wczesnych stadiach. Rzadko powoduje powikłania, zwykle wiąże się z negatywnymi konsekwencjami pobierania krwi.

Oni są:

• Krwawienie lub krwotoki pod skórą
• Zawroty głowy i omdlenia
• Infekcja zakaźna

7 295