Metody wprowadzania rekombinowanego DNA do komórki. Nowa metoda dostarczania DNA do embrionalnych komórek macierzystych. Metody dostarczania szczepionek DNA do komórek

Jedną z najbardziej obiecujących opcji systemów dostarczania genów do komórek są polipleksy – kompleksy przeniesionego DNA i polimerów kationowych o różnym charakterze. W artykule opisano właściwości polipleksów na bazie kilku rodzajów polimerów kationowych, ich transport do jąder komórek docelowych, a także jedno z podejść do leczenia nowotworów złośliwych z wykorzystaniem tych konstruktów.

Wstęp

Terapia genowa to leczenie chorób dziedzicznych, onkologicznych i innych poprzez wprowadzenie niezbędnego materiału genetycznego do komórek pacjenta w celu specyficznej zmiany defektów genów lub nadania komórkom nowych funkcji [Gorbunova i in., 1997]. Aby dostarczyć DNA lub RNA do komórek docelowych, tworzone są nośniki (wektory), które zapewniają wysoki poziom transfekcji, tj. przeniesienie egzogennego (obcego) DNA lub RNA do określonych typów komórek. Ponadto wektory muszą zapewniać ochronę informacji genetycznej, ponieważ W warunkach in vivo obcy DNA jest niestabilny z powodu szybkiej degradacji przez nukleazy surowicy – ​​enzymy rozkładające kwasy nukleinowe.

Rodzaje transporterów materiału genetycznego

W przyrodzie istnieją wyspecjalizowane struktury dostarczające informację genetyczną do komórek - wirusy. Dlatego zaczęto je wykorzystywać jako transportery genów. Jednocześnie zastosowanie wektorów wirusowych ma szereg ograniczeń. Po pierwsze, jest to mała pojemność przenoszonego materiału genetycznego i wrodzona specyficzność komórkowa wirusów. Po drugie, jest to możliwość powrotu wirusów do typu dzikiego w wyniku rekombinacji podczas przejścia tego samego typu infekcji. Po trzecie, białka cząstek wirusa są wysoce immunogenne, w wyniku czego ich wielokrotne podanie powoduje odpowiedź immunologiczną. Wreszcie masowa produkcja wektorów wirusowych jest nadal dość problematyczna i kosztowna. Obecnie aktywnie rozwijane są różne opcje nośników niewirusowych na bazie lipidów kationowych i polimerów kationowych. Te cząsteczki kationowe są w stanie spontanicznie tworzyć samoorganizujące się nanokompleksy z ujemnie naładowaną cząsteczką DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Samoorganizujące się kompleksy składające się z lipidów kationowych i DNA nazywane są lipopleksami, natomiast kompleksy składające się z polimerów kationowych i DNA nazywane są polipleksami.

Polimery kationowe stosowane do tworzenia polipleksów

Do celów terapii genowej i biotechnologii zaproponowano dużą liczbę polimerów kationowych lub polikationów. Polikationy kondensują DNA w zwarte nanokompleksy, zapewniając stabilność DNA i ochronę przed nukleazami. Jako polimery wiążące DNA mogą służyć białka kationowe, syntetyczne homopolimery aminokwasów (polilizyny, poliargininy), polisacharyd chitozanu, polietylenoimina, dendrymery o różnym składzie i inne modyfikowane polimery. Stopień zagęszczenia DNA zależy od całkowitego ładunku kompleksu, który z kolei zależy od stosunku liczby dodatnich grup polimerowych do liczby ujemnych grup fosforanowych DNA. Zazwyczaj w składzie polipleksów polikation jest obecny w nadmiarze, w wyniku czego powstają nanokompleksy (od kilkudziesięciu do kilkuset nm), które są rozpuszczalne w wodzie i naładowane dodatnio (Rys. 1, 2). ). W przeciwnym razie kompleksy będą niestabilne.

Ryż. 1. Schemat tworzenia polipleksów z polimerów kationowych i kolistej cząsteczki DNA (plazmidu). Ryż. 2. Obraz polipleksów na podłożu uzyskany za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (podział skali 200 nm).

Jednym z pierwszych polikationów zastosowanych do dostarczania genów była poli-L-lizyna (PL, ryc. 3), która ze względu na swój peptydowy charakter ulega biodegradacji, co czyni ją niezwykle wygodną w stosowaniu in vivo. Często, aby wyeliminować niepożądane skutki związane z dużą gęstością ładunku powierzchniowego, stosuje się kopolimer PL z glikolem polietylenowym (PEG). W wyniku tej modyfikacji zmniejsza się ładunek powierzchniowy kompleksu, co zapobiega niespecyficznej adsorpcji ujemnie naładowanych białek surowicy na polipleksach, a także zmniejsza cytotoksyczność kompleksów.

Polietylenoimina (PEI, ryc. 3) jest uważana za jedną z najbardziej obiecujących opcji polikationów do tworzenia na jej bazie polipleksów. PEI jest syntetyzowany w dwóch postaciach: liniowej i rozgałęzionej. PEI posiada dużą liczbę grup aminowych i iminowych zdolnych do protonowania, dzięki czemu wykazuje właściwości buforujące w warunkach fizjologicznych. Polipleksy na bazie PEI charakteryzują się skuteczniejszą transfekcją i ochroną przed działaniem nukleaz w porównaniu do innych polikationów, co wiąże się z dużą gęstością ładunku na PEI i bardziej zwartym fałdowaniem DNA. Silny ładunek dodatni prowadzi do toksyczności PEI, co wraz z brakiem biologicznej degradacji PEI stanowi czynniki ograniczające stosowanie PEI in vivo. W celu zmniejszenia cytotoksyczności PEI modyfikuje się glikolem polietylenowym, który charakteryzuje się niską toksycznością i wysoką hydrofilowością.

Ryż. 3. Polimery kationowe stosowane do tworzenia polipleksów oraz.

Innym przedstawicielem polikationów stosowanych w przekazywaniu informacji genetycznej są poliamidoaminy (PAMAM, ryc. 3). Związki te są silnie rozgałęzionymi dendrymerami. Dzięki rozgałęzieniu PAMAM charakteryzują się dużą elastycznością, w większym stopniu zagęszczają DNA, a oparte na nich polipleksy są trwalsze niż wszystkie inne. Jego właściwości mają wiele wspólnego z PEI.

Chitozany (ryc. 3) to polisacharydy zbudowane z D-glukozaminy i N-acetylo-D-glukozaminy, połączonych wiązaniami (1>4) glikozydowymi. W zależności od masy cząsteczkowej i stopnia deacetylacji chitozany tworzą z przeniesionym DNA stabilne kompleksy o różnej wielkości. Małe lub odwrotnie, zbyt duże polimery chitozanu prowadzą do zmniejszenia ekspresji przenoszonego genu. Główną zaletą polipleksów na bazie chitozanu jest biodegradowalność.

Na skuteczność dostarczania polipleksów wpływa wiele czynników: masa cząsteczkowa, stopień rozgałęzienia, polimeryzacja i rodzaj polimeru, wielkość cząstek, siła jonowa roztworu, ładunki powierzchniowe kompleksów, a także warunki eksperymentalne. Optymalne podejście powinno uwzględniać każdy z tych czynników i ich wpływ na właściwości kompleksu, pobieranie kompleksów przez komórki docelowe oraz toksyczność.

Istnieje kilka podejść zapewniających specyficzność działania polipleksów na komórki docelowe. Jeden z nich polega na ukierunkowanym dostarczaniu nanokompleksów do określonych typów komórek. Podejście to wiąże się z dodawaniem składników (ligandów) do polipleksów, których receptory występują w dużych ilościach na powierzchni komórek docelowych. Jako specyficzne ligandy stosuje się różne białka, cukry, peptydy, przeciwciała itp. Inną strategią jest wykorzystanie przenośnych genów, które byłyby aktywne tylko w określonych komórkach, podczas gdy dostarczanie kompleksów zachodzi nieswoiście, to znaczy do dowolnych komórek.

Penetracja polipleksów do komórek docelowych

Proces dostarczania materiału genetycznego składa się z dwóch etapów: zewnątrzkomórkowego (droga od miejsca wstrzyknięcia do komórek docelowych) i wewnątrzkomórkowego (interakcja z komórkami docelowymi, endocytoza, wyjście z endosomów, dostarczenie do jądra). Wewnątrzkomórkowe szlaki transportu polipleksów przedstawiono na rycinie 4.

Pierwszą barierą, którą polipleks musi pokonać w drodze do komórki docelowej, jest krew i macierz zewnątrzkomórkowa. Dlatego konieczne jest dobranie takich parametrów fizykochemicznych kompleksu, aby zwiększyć jego stabilność, uniknąć interakcji nieswoistych i możliwości wystąpienia odpowiedzi immunologicznej. Po pierwsze, DNA w polipleksie musi być chronione przed działaniem nukleaz zewnątrzkomórkowych. Po drugie, ujemnie naładowane białka surowicy krwi (albuminy, fibrynogen, immunoglobuliny itp.), a także białka macierzy pozakomórkowej (kolageny) mają zdolność adsorbowania na powierzchni naładowanych nanokompleksów, co prowadzi do zmiany ładunku powierzchniowego polipleksów , co prowadzi do wzrostu wielkości kompleksów i ich agregacji. Po wprowadzeniu do organizmu polipleksy częściowo gromadzą się w tkankach i ulegają fagocytozie. Z tych powodów często stosuje się miejscowe podawanie polipleksów (na przykład do nowotworu nowotworowego) w oparciu o ich niespecyficzne oddziaływanie z komórkami tkankowymi.

Ryż. 4. Wewnątrzkomórkowe szlaki transportu polipleksów.

Polipleksy są najpierw adsorbowane na błonie komórkowej, wychwytywane przez endocytozę, po czym muszą opuścić endolizosomy i przejść przez otoczkę jądrową, aby dostać się do jądra. Istnieją także alternatywne drogi transportu, które nie zawsze prowadzą do dostarczenia kompleksów do jądra. Ponadto ekspresja przeniesionego genu wymaga dysocjacji polipleksu na polimer kationowy i wolny DNA.

Kolejnym etapem dostarczania materiału genetycznego do komórek docelowych jest ich oddziaływanie z błoną komórkową i wchłanianie przez komórkę. Jak zauważono powyżej, wiązanie polipleksów z komórkami przy braku ligandu zachodzi niespecyficznie w wyniku oddziaływania elektrostatycznego z ujemnie naładowaną błoną komórkową. W większości przypadków takie polipleksy są wchłaniane przez niespecyficzną endocytozę adsorpcyjną. Włączając ligand do kompleksu, wychwyt można osiągnąć poprzez endocytozę zależną od receptora klatryno-zależnego. Inne szlaki wychwytu zależą od typu komórki i obejmują fagocytozę i endocytozę zależną od kaweoliny. Jedna ze strategii poprawy dostarczania polipleksów do komórek obejmuje zastosowanie wirusowych peptydów wejściowych, takich jak peptyd TAT, wyizolowanych po raz pierwszy z wirusa HIV-1. Zastosowanie tych sekwencji gwarantuje, że konstrukty dostaną się do komórki i dostarczą polipleksy do jądra komórkowego.

Jednym z najważniejszych etapów szlaku transportu polipleksów jest ich wyjście z endosomów. Jak wiadomo, endosomy to układ rurek i pęcherzyków niezbędny do sortowania wchłoniętych makrocząsteczek. Endosomy sortujące znajdują się bliżej błony komórkowej. W wyniku pracy pomp protonowych spada ich pH (około 6,5 w endosomach sortujących). Dalszy transport może przebiegać albo drogą recyklingu z uwolnieniem zaabsorbowanych cząsteczek do przestrzeni pozabłonowej, albo drogą lityczną, gdy następuje dalsze zakwaszenie środowiska w późnych endosomach, a makrocząsteczki przedostają się do lizosomów. W lizosomach zawartość ulega zakwaszeniu do pH 5, a wchłonięte cząsteczki ulegają rozkładowi przez enzymy hydrolityczne, które są aktywowane przy niskim pH. Produkty degradacji są usuwane z komórki na drodze egzocytozy lub przenoszone do cytoplazmy, gdzie wykorzystywane są jako materiał budulcowy.

Uważa się, że polipleksy na bazie PEI ze względu na swoje właściwości mają zdolność opuszczania endosomów w wyniku tzw. „efektu gąbki protonowej”. Hipoteza ta opiera się na fakcie, że polimery kationowe, dzięki obecności nieprotonowanych amin drugo- i trzeciorzędowych, tworzą efekt buforowy, w wyniku czego H±ATPaza, pompująca protony do endosomów, zaczyna aktywniej działać. W tym przypadku aniony chloru gromadzą się wewnątrz endosomów. W rezultacie dochodzi do obrzęku i lizy z powodu gwałtownego wzrostu ciśnienia osmotycznego, co pozwala polipleksom przedostać się do cytozolu w stanie nienaruszonym. Dla polipleksów zaproponowano inny mechanizm wyjścia z endosomów, który polega na destabilizacji błony endosomalnej ze względu na dużą gęstość ładunku powierzchniowego nanokompleksów. Kompleksy na bazie PL i chitosanu nie powodują efektu „gąbki protonowej” i są mniej zdolne do destabilizacji błony endosomowej, co prowadzi do znacznie niższej efektywności transfekcji.

Po opuszczeniu lizosomów polipleksy trafiają do przestrzeni okołojądrowej, po czym kompleks dysocjuje na wolny polikation i DNA. Uważa się, że dzieje się to na skutek konkurencji o grupy kationowe pomiędzy grupami fosforanowymi DNA a związkami o niskiej masie cząsteczkowej i anionami cytoplazmy. W niektórych przypadkach dysocjacja kompleksu najwyraźniej zachodzi w jądrze. Główną barierą na drodze plazmidowego DNA do jądra komórkowego jest podwójna otoczka jądrowa. Aby dostarczyć makrocząsteczki do jądra, zawierają one sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS), która w połączeniu z α- i β-importyną zostanie rozpoznana przez kompleks porów jądrowych (NPC) i aktywnie wniknie do jądra. Tylko małe cząsteczki mogą przejść przez NPC poprzez dyfuzję pasywną (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Mechanizmy działania genów terapeutycznych

Po wejściu plazmidu do jądra rozpoczyna się ekspresja genu terapeutycznego. Aby nadać specyficzności działaniu polipleksów, gen terapeutyczny w plazmidzie umieszcza się pod kontrolą promotora (regionu genu, na którym ląduje polimeraza RNA przed transkrypcją), który jest aktywny tylko w tkankach nowotworowych. Przykłady obejmują promotor genu białka antyapoptotycznego surwiwiny lub gen enzymu telomerazy. Gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (HSVtk), który ma zdolność fosforylowania związków przeciw opryszczce, acyklowiru i gancyklowiru, można zastosować jako gen terapeutyczny. Związki te po pewnym czasie wstrzykuje się do guza. Następnie kinazy komórkowe (enzymy fosforylujące) przekształcają fosforylowany acyklowir lub gancyklowir w trifosforany, które mogą zostać włączone do nowo syntetyzowanego DNA podczas podwajania podczas podziału komórki i zakończyć jego syntezę. W rezultacie komórki, do których jądra wszedł gen kinazy tymidynowej, ulegają zniszczeniu w obecności tych substancji. W tym przypadku umierają komórki dzielące się, a nie komórki spoczynkowe, które nie syntetyzują DNA i nie zawierają gancyklowiru ani acyklowiru. Ten mechanizm działania genu terapeutycznego można zastosować w terapii genowej nowotworów nowotworowych, których komórki szybko się dzielą.

Bibliografia:

1. Gorbunova V.N., Baranov V.S. Wprowadzenie do diagnostyki molekularnej i terapii genowej chorób dziedzicznych. S.-Pb., „Literatura specjalna”, 1997, s.287.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoskopowa struktura DNA skondensowanego w celu dostarczenia genów. //Nukl. Kwasy. Res., 1997, tom. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Aktualny stan polimerowych systemów dostarczania genów. // Adw. Lek dostarczany. Rev., 2006, tom. 58, 467–486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. i Stayton P. S. Projektowanie i rozwój polimerów do dostarczania genów. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, tom. 4581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. Wewnątrzkomórkowy routing plazmidowego DNA podczas niewirusowego transferu genów. // Adw. Lek dostarczany. Rev., 2005, tom. 57, 755–767.
6. Maxfield FR i McGraw T.E. Recykling endocytarny. // Przyroda ks. Mol. Komórka. Biol., 2004, tom. 5, 121–132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. i Topal M.D. Insercja i wydłużanie nukleotydów acyklicznych, dideoksy i ara przez herpesviridae, ludzkie alfa i ludzkie beta polimerazy. // J. Biol. Chem., 1988, tom. 263, 3898–3904.

Durimanow Michaił, student Wydziału Biologii Uniwersytetu Moskiewskiego

Artykuł jest laureatem konkursu popularnonaukowego konferencji Łomonosow 2009 (Wydział Biologii, sekcje „Nanobiotechnologia”, „Bioinżynieria”, „Biofizyka”.

Wstęp

1 Główne grupy enzymów modyfikowanych genetycznie

1.1 Enzymy restrykcyjne

1.1.1 Mechanizm działania enzymów restrykcyjnych

1.1.2 Budowa map restrykcyjnych

1.3 Ligazy

2 Wprowadzenie nowego genu do komórki

2.1 Regulacja ekspresji genów u prokariotów

2.2 Metody bezpośredniego wprowadzenia genu do komórki

2.3 Wprowadzenie genów do komórek ssaków

2.4 Transformacja genetyczna komórek somatycznych ssaków

2.5 Terapia genowa

2.6 Produkcja zwierząt transgenicznych

Wniosek

Bibliografia

Wstęp

Inżynieria genetyczna to konstrukcja in vitro funkcjonalnie aktywnych struktur genetycznych (rekombinowanego DNA), czyli innymi słowy tworzenie sztucznych programów genetycznych (Baev A.A.). Według E. S. Piruzyana inżynieria genetyczna to system technik eksperymentalnych, które umożliwiają konstruowanie w laboratorium (in vitro) sztucznych struktur genetycznych w postaci tzw. rekombinowanych lub hybrydowych cząsteczek DNA.

Mówimy o ukierunkowanej, według z góry ustalonego programu, budowie molekularnych systemów genetycznych poza organizmem i ich późniejszym wprowadzeniu do żywego organizmu. W tym przypadku rekombinowany DNA staje się integralną częścią aparatu genetycznego organizmu biorcy i nadaje mu nowe unikalne właściwości genetyczne, biochemiczne, a następnie fizjologiczne.

Celem stosowanej inżynierii genetycznej jest zaprojektowanie takich rekombinowanych cząsteczek DNA, które po wprowadzeniu do aparatu genetycznego nadawałyby organizmowi właściwości przydatne dla człowieka.

Technologia rekombinacji DNA wykorzystuje następujące metody:

Specyficzne cięcie DNA przez nukleazy restrykcyjne, przyspieszające izolację i manipulację poszczególnymi genami;

Szybkie sekwencjonowanie wszystkich nukleotydów w oczyszczonym fragmencie DNA, co pozwala na określenie granic genu i kodowanej przez niego sekwencji aminokwasów;

Konstrukcja rekombinowanego DNA;

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, która umożliwia wykrywanie specyficznych sekwencji RNA lub DNA z większą dokładnością i czułością, w oparciu o ich zdolność do wiązania komplementarnych sekwencji kwasów nukleinowych;

Klonowanie DNA: amplifikacja in vitro z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy lub wprowadzenie fragmentu DNA do komórki bakteryjnej, która po takiej transformacji odtwarza ten fragment w milionach kopii;

Wprowadzenie rekombinowanego DNA do komórek lub organizmów.

Historia inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna pojawiła się dzięki pracy wielu badaczy z różnych dziedzin biochemii i genetyki molekularnej. Przez wiele lat za główną klasę makrocząsteczek uważano białka. Zakładano nawet, że geny mają charakter białkowy. Dopiero w 1944 roku Avery, McLeod i McCarthy wykazali, że DNA jest nośnikiem informacji dziedzicznej. Od tego czasu rozpoczęły się intensywne badania nad kwasami nukleinowymi. Dziesięć lat później, w 1953 r., J. Watson i F. Crick stworzyli model dwuniciowego DNA. Ten rok uważany jest za rok narodzin biologii molekularnej.

Na przełomie lat 50. i 60. wyjaśniono właściwości kodu genetycznego, a pod koniec lat 60. potwierdzono eksperymentalnie jego uniwersalność. Nastąpił intensywny rozwój genetyki molekularnej, której przedmiotem była E. coli, jej wirusy i plazmidy. Opracowano metody izolowania wysoce oczyszczonych preparatów nienaruszonych cząsteczek DNA, plazmidów i wirusów. DNA wirusów i plazmidów wprowadzono do komórek w formie biologicznie aktywnej, zapewniającej jego replikację i ekspresję odpowiednich genów. W latach 70. odkryto szereg enzymów katalizujących reakcje konwersji DNA. Szczególną rolę w rozwoju metod inżynierii genetycznej odgrywają enzymy restrykcyjne i ligazy DNA.

Historię rozwoju inżynierii genetycznej można podzielić na trzy etapy. Pierwszy etap wiąże się z udowodnieniem zasadniczej możliwości otrzymywania rekombinowanych cząsteczek DNA in vitro. Prace te dotyczą wytwarzania hybryd pomiędzy różnymi plazmidami. Udowodniono możliwość tworzenia cząsteczek rekombinowanych z wykorzystaniem wyjściowych cząsteczek DNA różnych gatunków i szczepów bakterii, ich żywotność, stabilność i funkcjonowanie.

Drugi etap wiąże się z rozpoczęciem prac nad otrzymaniem rekombinowanych cząsteczek DNA pomiędzy genami chromosomowymi prokariotów a różnymi plazmidami, potwierdzającymi ich stabilność i żywotność.

Trzeci etap to rozpoczęcie prac nad włączeniem genów eukariotycznych, głównie zwierzęcych, do cząsteczek DNA wektora (DNA służącego do transferu genów i zdolnego do integracji z aparatem genetycznym komórki biorcy).

Formalnie za datę narodzin inżynierii genetycznej należy uznać rok 1972, kiedy to na Uniwersytecie Stanforda P. Berg, S. Cohen, H. Boyer i współpracownicy stworzyli pierwszy rekombinowany DNA zawierający fragmenty DNA wirusa SV40, bakteriofaga i E. coli .

1 Główne grupy enzymów modyfikowanych genetycznie

Inżynieria genetyczna jest spadkobiercą genetyki molekularnej, jednak swoje narodziny zawdzięcza sukcesom enzymologii genetycznej i chemii kwasów nukleinowych, gdyż enzymy są narzędziami manipulacji molekularnej. Chociaż czasami możemy pracować z komórkami i organellami komórkowymi za pomocą mikromanipulatorów, nawet najmniejsze instrumenty mikrochirurgiczne nie pomogą w pracy z makrocząsteczkami DNA i RNA. Co robić? Enzymy działają jak „skalpel”, „nożyczki” i „nić do szycia”.

Tylko oni potrafią znaleźć określone sekwencje nukleotydów, „wyciąć” tam cząsteczkę lub odwrotnie, „załatać” dziurę w łańcuchu DNA. Enzymy te działają w komórkach od dawna, wykonując prace związane z replikacją (podwajaniem) DNA podczas podziału komórki, naprawy uszkodzeń (przywracanie integralności cząsteczki), w procesach odczytu i przenoszenia informacji genetycznej z komórki do komórki lub w obrębie komórki. komórka. Zadaniem inżyniera genetycznego jest wybranie enzymu, który spełniałby postawione mu zadania, czyli byłby w stanie pracować z określoną sekcją kwasu nukleinowego.

Należy zaznaczyć, że enzymom stosowanym w inżynierii genetycznej brakuje specyficzności gatunkowej, zatem eksperymentator może łączyć fragmenty DNA dowolnego pochodzenia w wybranej przez siebie sekwencji w jedną całość. Pozwala to inżynierii genetycznej pokonać bariery gatunkowe ustanowione przez naturę i przeprowadzić krzyżowanie międzygatunkowe.

Enzymy stosowane w konstrukcji rekombinowanego DNA można podzielić na kilka grup:

Enzymy wytwarzające fragmenty DNA (enzymy restrykcyjne);

Enzymy syntetyzujące DNA na matrycy DNA (polimerazy) lub RNA (odwrotne transkryptazy);

Enzymy łączące fragmenty DNA (ligazy);

Enzymy umożliwiające zmiany w strukturze końców fragmentów DNA.

1.1 Enzymy restrykcyjne

Ogólnie przyjmuje się, że terminy „enzym restrykcyjny”, „endonukleaza restrykcyjna” i „endodeoksyrybonukleaza specyficzna miejscowo” są synonimami.

Wszystkie bakteryjne endonukleazy restrykcyjne rozpoznają specyficzne, raczej krótkie sekwencje DNA i wiążą się z nimi. Procesowi temu towarzyszy odcięcie cząsteczki DNA albo w samym miejscu rozpoznania, albo w innym miejscu, zależnym od rodzaju enzymu. Oprócz działania restrykcyjnego szczep bakteryjny ma zdolność metylacji DNA; Proces ten charakteryzuje się taką samą specyficznością sekwencji DNA jak restrykcja. Metylaza dodaje grupy metylowe do reszt adeniny lub cytozyny w tym samym miejscu, w którym wiąże się enzym restrykcyjny. W wyniku metylacji miejsce staje się odporne na restrykcje. Dlatego metylacja chroni DNA przed przecięciem.

Istnieją 3 główne klasy enzymów restrykcyjnych: 1, 2 i 3.

Wszystkie enzymy restrykcyjne rozpoznają ściśle określone sekwencje dwuniciowego DNA, ale enzymy restrykcyjne klasy 1 dokonują przerw w dowolnych punktach cząsteczki DNA, natomiast enzymy restrykcyjne klasy 2 i 3 rozpoznają i przecinają DNA w ściśle określonych punktach w obrębie miejsc rozpoznawania lub w lokalizacja ustalona z ich odległości.

Enzymy typu 1 i 3 mają złożoną strukturę podjednostek i mają dwa rodzaje aktywności - endonukleazę modyfikującą (metylującą) i zależną od ATP.

Enzymy klasy 2 składają się z 2 oddzielnych białek: endonukleazy restrykcyjnej i metylazy modyfikującej, dlatego w inżynierii genetycznej stosuje się tylko enzymy klasy 2. Wymagają jonów magnezu jako kofaktorów.

Obecnie wyizolowano ponad 500 enzymów restrykcyjnych klasy 2, jednak wśród enzymów wyizolowanych z różnych mikroorganizmów znajdują się takie, które rozpoznają te same sekwencje w DNA. Takie pary lub grupy nazywane są izoschizomerami. Rozróżnia się prawdziwą izoschizomerię, gdy enzymy rozpoznają tę samą sekwencję nukleotydów i rozbijają DNA w tych samych punktach, oraz fałszywą, gdy enzymy rozpoznając to samo miejsce w DNA powodują pęknięcia w różnych punktach tego samego miejsca.

Większość enzymów restrykcyjnych klasy 2 rozpoznaje sekwencje zawierające od 4 do 6 par nukleotydów, dlatego enzymy restrykcyjne dzielą się na drobno- i duże. Enzymy restrykcyjne o małym przekroju rozpoznają tetranukleotydy i wprowadzają o wiele więcej pęknięć w cząsteczkach niż enzymy restrykcyjne o dużym przekroju, które rozpoznają sekwencję sześciu par nukleotydów. Wynika to z faktu, że prawdopodobieństwo wystąpienia określonej sekwencji czterech nukleotydów jest znacznie większe niż w przypadku sekwencji sześciu nukleotydów. Na przykład DNA bakteriofaga T7, składające się z 40 000 par zasad, nie ma sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny R1 z E. coli.

Enzymy restrykcyjne Hpa II i Alu (z Arthrobacter luteus) są enzymami słabo rozszczepiającymi, a Eco RI (z Escherichia coli) i Hind III – dużymi. Jeżeli przyjmiemy, że miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne są losowo rozmieszczone wzdłuż łańcucha DNA, to cel dla enzymów rozpoznających sekwencję (miejsce) czterech nukleotydów powinien pojawiać się średnio co 256 par zasad, a dla enzymów rozpoznających sześć nukleotydów – co 4096 par zasad pary. Jeśli miejsce restrykcyjne znajduje się wewnątrz genu, wówczas leczenie enzymem restrykcyjnym DNA doprowadzi do jego inaktywacji. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia jest bardzo wysokie w przypadku leczenia enzymami restrykcyjnymi o małych cięciach i nieistotne w przypadku stosowania endonukleaz o dużych cięciach. Dlatego w celu uzyskania nienaruszonego genu przeprowadza się cięcie naprzemiennie kilkoma enzymami restrykcyjnymi o dużym przekroju lub stosuje się technikę „niedostatecznej restrykcji”, tj. ograniczenie przeprowadza się w warunkach, w których rozszczepienie następuje tylko w jednym miejscu.

8860 0

Obecnie znanych jest około 40 różnych metod dostarczania rekombinowanego DNA do komórek, rozwiązujących na różne sposoby problem przenikania przez błonę komórkową. Nie ma jeszcze jednolitej klasyfikacji metod dostarczania rekombinowanego DNA do komórek. Każdy autor recenzji dokonuje klasyfikacji na swój sposób, być może dlatego, że dla wielu empirycznie stwierdzonych metod mechanizm pokonywania membrany jest wciąż niejasny, np. w przypadku transformacji. Istnieje także niepewność terminologiczna, co nie jest zaskakujące w szybko rozwijającej się nowej dziedzinie nauki i praktyki.

Każda metoda dostarczania obcego DNA do komórek ma swoją własną charakterystykę, zalety i wady w zakresie przeżycia komórek, wydajności podawania, wszechstronności i technicznych możliwości wdrożenia. Wybór metody zależy od rodzaju komórek gospodarza i rodzaju użytego wektora, a także osobistych preferencji i możliwości eksperymentatora. Niektóre z najbardziej znanych metod dostarczania DNA do komórek docelowych omówiono szczegółowo poniżej.

Transformacja w najogólniejszym znaczeniu to proces wprowadzania wolnego DNA do komórki. W węższym znaczeniu termin ten odnosi się głównie do bakterii i oznacza proces pobierania rekombinowanego DNA przez kompetentne komórki, indukowany temperaturowym przejściem fazowym błony komórkowej. E. coli jest najpowszechniejszym organizmem podczas pracy z rekombinowanym DNA i aby zapewnić wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek, komórki inkubuje się z lodowatym roztworem CaCl2 i DNA, a następnie poddaje szokowi cieplnemu w temperaturze 42°C przez ~1 min .

Podobno w wyniku takiego leczenia dochodzi do miejscowego zniszczenia ściany komórkowej. Wydajność transformacji, którą definiuje się jako liczbę transformantów na 1 µg dodanego DNA,
w tym przypadku jest to około 10 000 - 10 000 000. Wydajność tej metody jest niska, transformacji ulega około 0,1% komórek, ale tę wadę rekompensuje zastosowanie schematów selekcji, które pozwalają na szybką identyfikację pożądanych klonów.

Komórki, które potrafią wchłonąć obcy DNA, nazywane są kompetentnymi. Proporcja tych komórek w populacji jest zwykle bardzo mała, ale można ją zwiększyć stosując specjalną pożywkę, warunki hodowli i kompetencje chemiczne (z reguły dobierane empirycznie). Często stosowanym etapem przygotowania kompetentnych komórek jest produkcja sferoplastów – komórek częściowo lub całkowicie (protoplastów) pozbawionych zewnętrznej sztywnej ściany komórkowej.

Na przykład jest to jedyny sposób na skuteczną transformację wielu bakterii Gram-dodatnich z rodzaju Bacillus, Listeria, Streptommyces itp. Niektóre metody transformacji drożdży obejmują również etapy enzymatycznego usuwania ściany komórkowej drożdży przy użyciu glukozydaz. W przypadku organizmów odpornych na chemiczne induktory kompetencji lub pozbawionych naturalnej kompetencji stosuje się inne systemy dostarczania DNA.

Koniugacja. Istnieją plazmidy bakteryjne (plazmidy koniugacyjne), które mają zdolność tworzenia kontaktów międzykomórkowych, przez które przechodzą z jednej komórki do drugiej. Tworzenie kontaktów między komórkami dawcy i biorcy zapewniają właściwości koniugacyjne plazmidów, a sam transfer DNA zapewniają właściwości mobilizacyjne. W tym przypadku plazmid koniugacyjny może nieść ze sobą regularny wektor plazmidowy zlokalizowany w tej samej komórce.

W ten sposób możliwa jest transformacja komórek biorców, które są trudne do transformacji innymi sposobami. Na przykład wykazano transfer mobilizacyjny wektora wahadłowego pAT187 z szeroką gamą gospodarzy z E. coli do różnych bakterii Gram-dodatnich (rodzaj Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus itp.), chociaż ze znacznie niższą wydajnością niż w przypadku przenoszenia pomiędzy różne szczepy E. coli.

Ponadto ostatnio wykazano możliwość koniugacyjnego transferu DNA z komórek bakteryjnych do hodowanych komórek zwierzęcych. W procesie koniugacji przenoszona jest tylko jedna nić plazmidu dawcy, na której następnie syntetyzowana jest druga nić. Powoduje to, że plazmid przeniesiony koniugacyjnie nie jest atakowany przez enzymy restrykcyjne gospodarza. Skuteczność tej metody w przypadku bakterii jest porównywalna z transformacją.

Infekcja wirusowa. Aby wprowadzić wektory wirusowe, powszechnie stosuje się naturalną zakaźną drogę zakażenia komórki gospodarza, która zależy od rodzaju wirusa.

Metody perforacji. Jedną z popularnych metod wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek docelowych jest elektroporacja – tymczasowe utworzenie porów w dwuwarstwowej błonie lipidowej pod krótkotrwałym wpływem pola elektrycznego. Jest to uniwersalna fizyczna metoda transformacji, której technika została opracowana dla prawie wszystkich typów komórek.

Podczas pracy z E. coli przygotowaną zawiesinę komórek (~50 μl) i DNA umieszcza się pomiędzy elektrodami i przykłada pojedynczy impuls prądowy o czasie trwania ~4,5 ms przy napięciu 1,8 kV, odległość między elektrodami wynosi 1 mm. Po takiej obróbce wydajność transformacji wzrasta do 109-1011 dla małych plazmidów (~3-6 kb) i do 106 dla dużych (~135 kb). Podobne warunki stosuje się do wprowadzenia wektora BAC do E. coli.

Wydaje się, że efekt elektroporacji wyładowania wysokiego napięcia na dwuwarstwowej membranie lipidowej zależy od jej promienia krzywizny. Dlatego małe komórki bakteryjne skutecznie absorbują DNA przy znacznie większym natężeniu pola (12-18 kV/cm) niż duże komórki zwierzęce i roślinne, które skutecznie absorbują DNA przy natężeniu pola 1-2 kV/cm. Elektroporacja jest najprostszą, najskuteczniejszą i powtarzalną metodą wprowadzania cząsteczek DNA do komórek, która jednak wymaga specjalnego urządzenia do elektroporacji.

Inne metody perforacji dostarczania DNA do komórek: ultradźwięki komórek, zdrapywanie komórek z podłoża w obecności materiału egzogennego, wirowanie komórek w podłożu z DNA w połączeniu z elektroporacją, perforacja osmotyczna błony komórkowej, rozpad komórek za pomocą lasera mikrowiązka, zastosowanie streptolizyny-O, toksyny tworzącej pory.

Transfekcja. Początkowo termin ten oznaczał wprowadzenie wirusowego DNA do komórek, obecnie jego znaczenie rozszerzyło się i obejmuje wprowadzenie dowolnego obcego DNA do komórek eukariotycznych. Termin „transformacja”, który odnosi się do procesu wprowadzania DNA do komórki dla prokariotów i drożdży, okazał się niewygodny w użyciu, gdyż w odniesieniu do komórek zwierzęcych transformacja oznacza przekształcenie komórek normalnych w nowotworowe. W wąskim znaczeniu transfekcja odnosi się głównie do wprowadzenia DNA do komórek eukariotycznych przy użyciu różnych odczynników chemicznych.

Jedną z pierwszych opracowanych metod skutecznej transfekcji była inkubacja DNA z DEAE-dekstranem. Uzyskana wydajność była porównywalna z transformacją bakteryjną i osiągnęła 106 transfektantów na µg DNA.

Mechanizm działania DEAE-dekstranu nie został do końca poznany, wiadomo jednak, że wiąże się on z DNA i błoną komórkową, stymulując pinocytozę (ryc. 2.8), chociaż nie jest wychwytywany przez komórki. Do wad metody należy zaliczyć toksyczność DEAE-dekstranu dla niektórych typów komórek, zależność skuteczności od jakości leku oraz bardzo małą częstotliwość otrzymywania stabilnych transfektantów.

Ryż. 2.8. Schemat wprowadzania DNA w ramach różnych kompleksów do komórki na drodze endocytozy: fagocytoza i pinocytoza (a). Schematyczne przedstawienie cząstki nielipidowego polikationu w dendroformie ze związanym DNA, którego ładunek ujemny jest kompensowany przez polimer kationowy (b)

Wydajność transfekcji zwiększono 10-100 razy przez inkubację komórek z DNA wytrąconym fosforanem wapnia. Gęste cząstki osadu DNA wapnia są wchłaniane przez komórkę na drodze fagocytozy (ryc. 2.8), ale tylko niewielka część penetrowanych cząsteczek dociera do jądra i integruje się z chromosomalnym DNA. Metoda z fosforanem wapnia jest skuteczniejsza i tańsza, ale powoduje rozbicie cząsteczek DNA, co powoduje przekształcenie cząsteczek kolistych w postać liniową, czasami niezakaźną w przypadku transfekcji wirusowej. Ponadto warunki transfekcji fosforanem wapnia należy dobrać indywidualnie dla każdej komórki docelowej.

W trakcie poszukiwań innych odczynników do transfekcji odkryto, że cząsteczki polimeru niosące nadmiar ładunku kationowego mogą znacząco zwiększyć efektywność transfekcji. Kationy polimeru tworzą stabilne kompleksy ze zneutralizowanymi ładunkami z kwasami nukleinowymi, które z dużą wydajnością mogą transportować DNA i RNA do komórki, chroniąc je przed działaniem endonukleaz na drodze do jądra (ryc. 2.9).

Ryż. 2. 9. Schemat transportu DNA do jądra komórkowego jako część kompleksu polikation-DNA związanego ze specyficznym ligandem na drodze endocytozy za pośrednictwem ligandu

Syntetyczne kationy polimerów nielipidowych o konformacji liniowej lub rozgałęzionej (postać dendrytyczna) mogą kondensować DNA i RNA w stosunkowo małe cząstki, które następnie wiążą się z błoną komórkową i przedostają się do komórki na drodze niespecyficznej endocytozy. Obecnie do transfekcji z grupy polikationów nielipidowych, polietylenoiminy, poliamidoamin i opartych na nich dendrymerów, wykorzystuje się głównie białka kationowe, takie jak polilizyna, protamina i histony, a także różne produkty komercyjne, takie jak PAMAM.

Rewolucją było wprowadzenie do praktyki pierwszego niskotoksycznego lipidu kationowego DOTMA (1,2-diolelo-3-N,N,N-trimetyloaminopropan), zsyntetyzowanego przez Feignera (1987) i in. Wydajność transfekcji przy użyciu lipidu kationowego (ryc. 2.10) była około 100 razy większa niż w przypadku jakiegokolwiek innego odczynnika chemicznego, przy wysokim odsetku stabilnych komórek transgenicznych.

Ryż. 2. 10. Struktura kompleksu z DNA (a) i ogólna budowa kationowego polimeru lipidowego (b). Kationowe polimery lipidowe (liniowe i rozgałęzione), podobne pod względem struktury i właściwości do fosfolipidów błon komórkowych, tworzą kompleksy z DNA w postaci wielowarstwowych liposomów kationowych (a) poprzez proste zmieszanie odczynników. Takie kompleksy dostają się do komórki poprzez endocytozę lub fuzję z błoną komórkową poprzez część lipidową

Jednocześnie wprowadzono do praktyki nowy termin „lipofekcja”, podkreślający wysoką skuteczność transformacji genetycznej komórek, przybliżającej kompleksy lipidowo-kationowe do zakaźnych cząstek wirusa.

Bazując na tym sukcesie, opracowano liczne odmiany tych związków (lipofektyna, lipofektamina, cellfektyna itp.).

Równolegle opracowano nośniki dostarczające oparte na liposomach fosfolipidowych wypełnionych DNA lub RNA.

Małe kulki sztucznych błon mogą łączyć się z błonami plazmatycznymi komórek lub są wchłaniane przez endocytozę, uwalniając zawartość do komórki. Niską skuteczność transfekcji liposomów zwiększało wprowadzenie do struktury liposomów fosfolipidów, np. kardiolipiny i fosfatydyloetanoloaminy, które wraz z błonami dwuwarstwowymi tworzą także odwrócone struktury micelarne, zwane fazami sześciennymi i heksagonalnymi, zdolnymi do inicjowania błony. połączenie.

Metoda liposomowa jest dość kapryśna i wymaga starannego doboru wszystkich warunków skutecznej transfekcji konkretnych komórek. Ponadto procedura kapsułkowania, zwykle sonikacja, często uszkadza duże cząsteczki DNA.

Nowym etapem rozwoju odczynników do transfekcji było opracowanie skuteczniejszego i bardziej ukierunkowanego dostarczania kwasów nukleinowych do konkretnych komórek docelowych poprzez wprowadzenie różnych ligandów do struktury syntetycznych odczynników do transfekcji oraz liposomów wiążących się z białkami receptorów błonowych. Obecność takich grup docelowych (ligandów), rozpoznawanych przez receptory komórkowe, pozwala na wykorzystanie mechanizmów endocytozy za pośrednictwem ligandów (patrz ryc. 2.9).

Jako takie ligandy stosuje się białka i peptydy rozpoznawane przez receptory; oligosacharydy, ponieważ na powierzchni wielu komórek zwierzęcych znajdują się lektyny - białka receptorowe, które specyficznie je wiążą; polisacharydy. Procesy interakcji z komórkami takich docelowych kompleksów odczynników do transfekcji DNA (RNA) są podobne do przenikania cząstek wirusa do komórki.

Obecnie firmy biotechnologiczne oferują szeroką gamę różnych odczynników do transfekcji – od najprostszych i najtańszych po najnowsze rozwiązania, wyspecjalizowane dla różnych typów komórek i zadań. Intensywnie trwają także prace nad nowymi, jeszcze skuteczniejszymi odczynnikami do transfekcji.

Mikroiniekcja - błonę komórkową nakłuwa się mikroigłą i roztwór zawierający DNA wstrzykuje się do cytoplazmy komórki lub bezpośrednio do jądra, jeżeli jądro jest wystarczająco duże (np. jądro jaja). Mikroiniekcja DNA do komórek ssaków stała się możliwa wraz z pojawieniem się urządzenia do wytwarzania mikropipet o średnicy 0,1-0,5 µm oraz mikromanipulatora. Metoda jest bardzo skuteczna, odsetek komórek ze stabilną integracją i ekspresją wstrzykniętych genów może sięgać 50%. Zaletą opisywanej metody jest również to, że pozwala ona na wprowadzenie dowolnego DNA do dowolnych komórek i nie wymaga presji selekcyjnej, aby utrzymać wprowadzony gen w komórkach.

Transfekcja balistyczna, biobalistyka lub biolistika (bombardowanie mikrocząstkami) polega na bombardowaniu komórek mikrosferami o wielkości około 1-2 mikronów pokrytymi DNA. Wykorzystuje się mikrocząstki złota, wolframu (czasami fitotoksycznego), silikonu i różnych syntetycznych nanosfer. Mikrocząstki pokryte DNA przechodzą przez warstwy komórkowe i przenoszą konstrukt genetyczny bezpośrednio do organelli i jąder komórkowych. Stworzony w tym celu „pistolet genowy” lub „pistolet genowy”, opracowany przez J. Sanforda w 1987 r. w celu wprowadzenia DNA do ziaren zbóż, ma konstrukcję podobną do wiatrówek (ryc. 2.11).

Ryż. 2.11. Wprowadzenie rekombinowanego DNA do liści roślin przy użyciu „pistoletu genowego” wielokrotnego użytku firmy Bio-Rad (a) i jego ogólny schemat (b). Impuls helu wyrzuca mikrocząstki pokryte DNA lub RNA z kapsułki próbki. Mikrocząstki przenoszące DNA są przyspieszane i skupiane w celu maksymalnej penetracji komórek, przemieszczając się wzdłuż kanału przyspieszania i wzdłuż lufy pistoletu, podczas gdy przy szerokim wylocie strumień helu rozchodzi się dyfuzyjnie na boki. Filtr dystansowy utrzymuje optymalną odległość oddziaływania celu, maksymalizując usuwanie helu i minimalizując szkodliwy wpływ na powierzchnie komórek

Głębokość penetracji mikrocząstek jest z reguły niewielka - do 1 mm, jednak w specjalnych warunkach wypalania mikrocząstki mogą wnikać w tkankę na głębokość 4-5 mm i przenosić geny na przykład do włókien mięśni poprzecznie prążkowanych . Transfekcja balistyczna jest bardzo skuteczna nawet tam, gdzie grube ściany komórkowe (drożdże, rośliny) stanowią przeszkodę w wielu innych metodach dostarczania i jest stosowana w przypadku tkanek, narządów, a nawet całych organizmów. Obecnie szeroko stosowane w terapii genowej do produkcji transgenicznych zwierząt i roślin.

Ta różnorodność narzędzi i metod transfekcji wynika z różnych zadań, szerokiego zakresu stosowanych komórek docelowych i rodzajów kwasów nukleinowych dostarczanych do komórek, a także potrzeby społeczeństwa w zakresie uzyskiwania coraz bardziej skutecznych sposobów dostarczania informacji genetycznej do komórek, tkanek i tkanek całe organizmy. Szczególną uwagę zwraca się na rozwój odczynników i metod transfekcji w związku z niesamowitymi perspektywami terapii genowej człowieka, która wymaga ukierunkowanych, wysoce skutecznych i bezpiecznych środków dostarczania genów.

Stabilne i przejściowe wprowadzenie obcego DNA do komórki. Po wprowadzeniu rekombinowanego DNA do komórki eukariotycznej tylko niewielka jego część trafia do jądra, gdyż błona jądrowa stanowi trudną barierę dla obcego DNA. W jądrze rekombinowany DNA może zostać zintegrowany z chromosomem lub istnieć przez pewien czas w stanie pozachromosomalnym.

W związku z tym rozróżnia się transfekcję stabilną, gdy rekombinowany DNA integruje się z chromosomami komórek biorcy i staje się ich integralną częścią, oraz transfekcję tymczasową lub przejściową, podczas której istnieją cząsteczki rekombinowanego DNA i są transkrybowane w jądrach w stan pozachromosomalny przez krótki czas. Stabilne dziedziczenie wprowadzonego obcego DNA jest głównym warunkiem uzyskania organizmów transgenicznych do celów gospodarczych.

Dlatego też szczególną uwagę zwraca się na rozwój metod wprowadzania DNA do komórek prowadzących do wytworzenia większej części stabilnych transformantów. Dodatkowo duży odsetek stabilnych transformantów umożliwia także rezygnację z genów selektywnych i markerowych, które stanowią balast w tworzeniu organizmów transgenicznych.

NA. Voinov, T.G. Volova

Wynalazek dotyczy dziedziny biotechnologii, w szczególności sposobu ukierunkowanego dostarczania DNA do komórek nowotworowych i macierzystych wykazujących ekspresję receptora CXCR4. Prezentowany wynalazek można zastosować do ukierunkowanego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek macierzystych i nowotworów złośliwych w celu korygowania defektów genów i zapobiegania chorobom. Metoda polega na przygotowaniu nośników konstruktów genetycznych poprzez włączenie do składu cząsteczek nośnika, czyli wiążącej DNA sekwencji ośmiu aminokwasów lizyny – KKKKKKKK, sekwencji sygnałowych. Połączenie sekwencji sygnałowej z sekwencją wiążącą DNA przeprowadza się za pomocą regionu łącznikowego dwóch cząsteczek kwasu ε-aminoheksanowego. Następnie tworzą się kompleksy DNA/nośnik. Następnie przeprowadza się transfekcję in vitro. Proponowany wynalazek umożliwia zwiększenie efektywności dostarczania interesującego genu do komórek nowotworowych i macierzystych. 2 wynagrodzenie f-ly, 4 chory.

Wynalazek dotyczy medycyny genowej, terapii genowej, biotechnologii i farmaceutyki i może być stosowany do ukierunkowanego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek macierzystych i komórek nowotworu złośliwego w celu korygowania defektów genów i zapobiegania chorobom. Swoistość tkankowa dostarczania konstruktów genowych jest zapewniona poprzez zastosowanie sekwencji sygnałowych dla receptora CXCR4, który ulega ekspresji w komórkach tego typu.

Tym, co odróżnia terapię genową od podejść medycyny tradycyjnej, jest skupienie się na zwalczaniu przyczyny choroby, a nie jej objawów i konsekwencji. Obecnie opracowywane są podejścia do terapii genowej w celu leczenia lub zapobiegania szerokiemu zakresowi chorób ludzkich. Podejścia te mogą mieć zastosowanie w terapii in vivo i ex vivo. Terapia in vivo opiera się na bezpośrednim wprowadzeniu konstruktów genetycznych bezpośrednio do tkanek organizmu. Podawanie może odbywać się dożylnie za pomocą nebulizatorów w aerozolu lub zastrzyków do określonych tkanek. Terapia genowa ex vivo polega na izolacji określonego rodzaju komórek z organizmu, wprowadzeniu do nich „terapeutycznego” konstruktu genowego, selekcji transfekowanych komórek i późniejszej reimplantacji pacjentowi.

Obecnie opracowywane są trzy główne kierunki podejścia do dostarczania konstruktów genetycznych:

1) klonowanie jako część wektorów wirusowych;

2) stosowanie metod transfekcji fizycznej;

3) zastosowanie kompleksów plazmidowych wektorów ekspresyjnych i niewirusowych cząsteczek nośnikowych.

Transfer za pośrednictwem wirusa jest wysoce skuteczną metodą dostarczania DNA do komórek docelowych, ponieważ penetracja zmodyfikowanego wektora wirusowego jest podobna do procesu, który zachodzi naturalnie, gdy genom wirusa jest przenoszony do komórek gospodarza. Najbardziej badane są wektory utworzone na bazie wirusów retro-, adeno- i adeno-asocjowanych. Do zalet wirusów należy przede wszystkim połączenie właściwości wektora ekspresyjnego i nośnika, możliwość specyficznego dostarczania, zdolność do transfekcji komórek dzielących się i niedzielących się oraz zdolność do integracji DNA z chromosomem w celu zapewniają długoterminową ekspresję. Ze względu na te zalety podejście to jest nadal szeroko stosowane w badaniach nad dostarczaniem genów, chociaż ma pewne wady. Wirusy związane z retro i adenowirusami mają ograniczoną wielkość sklonowanego fragmentu DNA i ryzyko mutagenezy insercyjnej, gdy wirus integruje się z genomem gospodarza. Poważną wadą wektorów adenowirusowych jest wyraźna odpowiedź immunologiczna przy dużych dawkach i wielokrotnym podawaniu konstruktów adenowirusowych (Walther W., Stein U. Viral wektory do transferu genów: przegląd ich zastosowania w leczeniu chorób ludzkich // Narkotyki. - 2000. - v.60. - P.249-271, patent RF nr 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, publ. 2005.05.20).

Wstrzyknięcie nagich konstruktów plazmidowego DNA było jednym z pierwszych podejść w rozwoju strategii leczenia terapią genową. Niska skuteczność transfekcji przy użyciu nagiego DNA skłoniła do opracowania nowych metod dostarczania konstruktów genetycznych. Badano różne fizyczne metody dostarczania DNA do komórek organizmu. Najpopularniejsze z nich to metoda transfekcji balistycznej oraz elektroporacja, które są powszechnie stosowane do transfekcji komórek skóry i mięśni. Metoda transfekcji balistycznej polega na wnikaniu do komórki DNA osadzonego na mikrocząsteczkach złota lub wolframu. Transfekcja następuje pod ciśnieniem strumienia sprężonego gazu lub cieczy. Metoda elektroporacji opiera się na lokalnej zmianie potencjału elektrycznego błony komórkowej pod wpływem działania prądu elektrycznego. Impulsy elektryczne powodują powstawanie porów w błonie komórkowej, czyniąc ją przepuszczalną dla biomolekuł. Aby przezwyciężyć niską skuteczność transfekcji nagiego DNA in vivo, stosuje się również metodę szoku hydrodynamicznego - dożylne lub dotętnicze podanie wektora plazmidowego w dużej objętości roztworu. Głównymi wadami istniejących metod transfekcji fizycznej jest niska wydajność i lokalizacja efektu dostarczania DNA. Pozwalają one plazmidowi pokonać błonę komórkową i uniknąć włączenia do endosomów, zapobiegając w ten sposób degradacji enzymatycznej, ale z reguły nie zapewniają długotrwałej trwałości wprowadzonych konstruktów genetycznych (Wells D.J. Postęp i perspektywy terapii genowej: elektroporacja i inne metody fizyczne // Gene Ther. - 2004. - v.11, nr 18. - P.1363-1369, Wang S., Joshi S, Lu S. Dostarczanie DNA do skóry poprzez bombardowanie cząsteczkami // Metody Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196. Herweijer H., Wolff J.A. Postęp i perspektywy: transfer genów nagiego DNA i terapia // Terapia genowa - 2003. - v.10, nr 6. - P 0,453-458).

Nośniki niewirusowe stanowią alternatywę dla przenoszenia konstruktów genetycznych za pośrednictwem wirusów do komórek ssaków. Nośniki niewirusowe można łatwo syntetyzować, a łatwość ich modyfikacji pozwala na wprowadzenie zmian w strukturze i składzie cząsteczek, poprawiając w ten sposób nośniki dostarczające. W przypadku stosowania nośników niewirusowych nie ma ograniczeń co do wielkości dostarczonego wektora ekspresyjnego. Ponadto są mniej toksyczne, w większości przypadków nie powodują specyficznej odpowiedzi immunologicznej i są bezpieczniejsze w stosowaniu in vivo w porównaniu z wektorami wirusowymi. Dlatego też można powtórzyć wprowadzenie konstruktu genetycznego zapakowanego w nośniki niewirusowe. Badania nad nośnikami niewirusowymi rozwijają się w kierunku poprawy właściwości transfekcyjnych plazmidowego DNA poprzez tworzenie kompleksów DNA z różnymi związkami syntetycznymi (lipidami, oligo- i polipeptydami, polimerami itp.) (np. Patent RF nr 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, wyd. 20.10.2008). Udoskonalanie niewirusowych nośników dostarczania w dużej mierze zależy od szczegółowego zrozumienia barier utrudniających przenikanie DNA do komórek organizmu (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid Vectors in human gen Therapy: an aktualizacja // Trendy Mol Med. - 2003. - v.9, nr 2. - P.67-72;Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Wektory i systemy dostarczania w terapii genowej // Med Sci Monit. - 2005. - v.11, nr 4. - P.110-121;Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to nonviral gen dostarczanie // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, nr 2. - s. 203-217).

Uważa się, że nosiciel niewirusowy musi mieć następujące cechy:

1) być nietoksyczne, zwarte i chronić plazmidowy DNA przed degradacją enzymatyczną, a po użyciu być wydalane z organizmu;

2) zapewnić przenikanie plazmidu do komórki poprzez specyficzne wiązanie z błoną komórkową komórki:

3) mają zdolność uwalniania DNA z przedziału endosomalnego;

zapewniają dysocjację DNA z kompleksu w celu późniejszego transportu plazmidu do jądra.

Na potrzeby terapii genowej najbardziej preferowaną metodą dostarczania konstruktów genetycznych jest ich tkankowo-specyficzny transfer do komórek i tkanek organizmu.

Pierwszą barierą dla wewnątrzkomórkowego przenikania kompleksów jest błona plazmatyczna. Większość kompleksów oddziałuje z powierzchnią komórki za pomocą sił elektrostatycznych. Możliwym mechanizmem wiązania kompleksów z komórką jest ich oddziaływanie z białkami powierzchniowymi komórki – glikozaminoglikanami. Jednakże przy takim mechanizmie penetracji kompleksów nie dochodzi do specyficznego tkankowo transferu konstruktów genowych. Jednocześnie problem specyficznego tkankowo dostarczania konstruktów genetycznych jest istotny w terapii genowej wielu chorób. W celu specyficznego oddziaływania z powierzchnią komórki kompleksy zawierają ligandy receptorów na powierzchni komórki. Obecnie scharakteryzowano wiele ligandów peptydów integrynowych. Należą do nich w szczególności fragment tripeptydowy RGD (integryny występują na powierzchni wielu komórek), transferyna (jej receptor ma zwiększoną ekspresję w komórkach proliferujących), asialorosomukoid (receptor azjaloglikoproteiny wykazuje specyficzną ekspresję w hepatocytach wątroby).

W celu specyficznego dostarczania materiału genetycznego do komórek nerwowych Zeng i współpracownicy zaproponowali zastosowanie nośnika składającego się z regionu sygnałowego dla receptora TrkA (80–108 aminokwasów z czynnika wzrostu nerwów) i sekwencji wiążącej DNA składającej się z 10 reszt aminokwasowych lizyny. Nośnik ten, w obecności środka endosomolitycznego, chlorochiny, który sprzyja uwalnianiu kompleksów z przedziału endosomalnego komórki, był w stanie specyficznie tkankowo dostarczyć gen markerowy tylko do komórek z ekspresją receptora TrkA. Nośnik ten może znaleźć zastosowanie w terapii genowej w leczeniu różnych chorób neurologicznych, takich jak epilepsja, choroba Parkinsona i Alzheimera. Jednakże nie nadaje się do dostarczania materiału genetycznego do innych typów komórek (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S. Syntetyczny peptyd zawierający pętlę 4 czynnika wzrostu nerwów do ukierunkowanego dostarczania genów // J Gene Med 2004; 6: 1247-1256).

Ludzkie komórki macierzyste uważa się za obiecujące środki w terapii komórkowej i genowej różnych chorób człowieka. Jednocześnie są jednym z najtrudniejszych do transfekcji typów komórek. W leczeniu nowotworów metodą terapii genowej konieczne jest zapewnienie dostarczenia genów bezpośrednio do komórek nowotworowych.

CXCR4 jest receptorem dla chemokiny czynnika migracji komórek macierzystych SDF-1α. CXCR4 ulega ekspresji w komórkach krwiotwórczych, śródbłonku naczyń i komórkach satelitarnych mięśni. Wysoki poziom ekspresji tego genu odnotowano w ponad 20 typach nowotworów nowotworowych (rak piersi, rak prostaty itp.), a także w migrujących komórkach macierzystych. Receptor CXCR4 jest także zdolny do wiązania się z wirusową chemokiną vMIP-II (wirus mięsaka Kaposiego). Zatem włączenie sekwencji sygnałowych do cząsteczek nośnikowych w celu wiązania z receptorem CXCR4 jest obiecującym sposobem na stworzenie systemów ukierunkowanego dostarczania genów do komórek nowotworowych i macierzystych.

Aby dostarczyć materiał genetyczny do komórek wykazujących ekspresję receptora CXCR4, Le Bon i współpracownicy zastosowali syntetyczny ligand dla tego receptora – AMD3100, który połączono z polietylenoiminą lub lipidami kationowymi. Kompleksy materiału genetycznego z tymi związkami nie prowadziły do ​​istotnego wzrostu efektywności dostarczania genu markerowego do komórek CXCR4+ w porównaniu ze związkami bez sygnałów. Nośniki stosowane przez Le Bona nie okazały się skuteczne, ponieważ specyficzne dostarczenie za ich pomocą możliwe jest jedynie po dodaniu substancji promującej internalizację receptora CXCR4 (ester forbolu) do pożywki transfekcyjnej. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. Koniugaty AMD3100 jako składniki ukierunkowanych niewirusowych systemów dostarczania genów: synteza i skuteczność transfekcji in vitro komórek wykazujących ekspresję CXCR4. // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).

Zatem istnieje potrzeba stworzenia nośnika konstruktów genetycznych, który będzie w stanie zapewnić specyficzne dostarczanie do komórek CXCR4(+) i nie wpływać na pobliskie tkanki. Taki sposób zapewnia niniejszy wynalazek.

Wynalazek opiera się na zadaniu opracowania sposobu specyficznego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek wykazujących ekspresję receptora CXCR4, w którym poprzez zastosowanie nośników konstruktów genetycznych zawierających sekwencje sygnałowe dla receptora CXCR4, zwiększenie efektywności osiąga się dostarczenie genu będącego przedmiotem zainteresowania. Należy zauważyć, że syntezę zastrzeganych nośników można przeprowadzić stosując dowolną ze znanych metod syntezy peptydów w fazie stałej.

Rozwiązanie postawionego problemu technicznego zapewnia fakt, że w sposobie ukierunkowanego dostarczania DNA do komórek nowotworowych i macierzystych wykazujących ekspresję receptora CXCR4, obejmującym przygotowanie nośników konstruktów genetycznych poprzez włączenie do składu cząsteczek nośnikowych, które to sekwencja wiążąca DNA ośmiu reszt aminokwasowych lizyny - KKKKKKKK, sekwencje sygnałowe, tworzenie kompleksów DNA/nośnik, transfekcja in vitro, sekwencja sygnałowa jest wybrana z grupy: fragment od 1 do 8 aminokwasów N-końca sekwencja białka SDF-1α – KPVSLSYR; fragment od 1 do 17 aminokwasów N-końcowej sekwencji białka SDF-1α – KPVSLSYRCPCRFFESH, gdzie aminokwasy 9 i 11 zastąpiono seryną; lub fragment od 1 do 10 aminokwasów N-końcowej sekwencji chemokiny wirusowej vMIP-II - LGASWHRPDK; Połączenie sekwencji sygnałowej z sekwencją wiążącą DNA przeprowadza się za pomocą regionu łącznikowego dwóch cząsteczek kwasu ε-aminoheksanowego.

W tym przypadku sekwencją sygnałową może być fragment składający się z aminokwasów 1 do 8 N-końcowej sekwencji białka SDF-1α-KPVSLSYR.

Lub sekwencją sygnałową może być fragment z aminokwasów 1 do 17 N-końcowej sekwencji białka SDF-1α - KPVLSSYRCPCRFFESH, gdzie aminokwasy 9 i 11 zastąpiono seryną.

Jako region sygnałowy można również zastosować fragment aminokwasów 1 do 10 N-końcowej sekwencji wirusowej chemokiny vMIP-II - LGASWHRPDK, syntetyzowany z D-aminokwasów.

Jako składnik zapewniający wyjście z endosomów kompleksów składających się z nośników i materiału genetycznego można zastosować glicerol lub chlorochinę.

Plazmidowy DNA można wykorzystać jako materiał genetyczny dla nosicieli.

Określony wynik techniczny w niniejszym wynalazku uzyskano poprzez zastosowanie cząsteczek oligolizyny – KKKKKKKK (K8) jako nośnika, sprzężonego z sekwencjami sygnałowymi do receptora CXCR4 z białek SDF-1 lub vMIP-II, czyli sekwencją N-końcową chemokiny SDF-1 (c 1 do 8 aa) lub N-końcowa sekwencja chemokiny SDF-1 (od 1 do 17 aa, z zastąpieniem 9 i 11 aa przez serynę) lub N-końcowa sekwencja chemokiny SDF-1 chemokina wirusowa vMIP-II (od 1 do 10 aa w konformacji D). Obecność oligolizyny KKKKKKKK w kompozycji nośnika umożliwia tworzenie przez koniugaty kompleksów z kwasami nukleinowymi, w szczególności z plazmidowym DNA, w wyniku oddziaływania elektrostatycznego.

Podany wynik techniczny osiągają trzy warianty reklamowanego przewoźnika.

Określony wynik techniczny w pierwszym wykonaniu osiąga się przez to, że w krótkim nośniku CDP opartym na syntetycznych analogach chemokiny SDF-1, zawierającym składnik kationowy, jakim jest oligolizyna K8, stosowany do kondensacji plazmidowego DNA oraz składnik ligandowy do oddziaływania z receptorem CXCR4, zgodnie z Zastrzeżonym wynalazkiem wykorzystuje się fragment (1-8 aa) N-końcowej sekwencji białka SDF-1, który ma strukturę KPVSLSYR i wykazuje aktywność agonistów Receptor CXCR4, jako składnik ligandowy, oraz składnik kationowy koniugatu ma strukturę KKKKKKKK i jest przyłączony do składnika ligandowego poprzez przerywnik – dwie cząsteczki kwasu ε-aminoheksanowego (Ahx).

Określony wynik techniczny w drugim wariancie uzyskuje się poprzez to, że w nośniku (długim CDP) opartym na syntetycznych analogach chemokiny SDF-1, zawierającym składnik kationowy, jakim jest oligolizyna K8, stosowanym do kondensacji plazmidowego DNA, oraz składnik ligandowy do oddziaływania z receptorem CXCR4, według zastrzeżonego wynalazku, fragment (1-17 aa; aa9 i aa11 zastąpiono seryną) N-końcowej sekwencji białka SDF-1, który ma struktura KPVSLSYRSPSRFFESH i wykazuje aktywność agonistów receptora CXCR4, stosowana jest jako składnik ligandowy, a składnik kationowy koniugatu ma strukturę KKKKKKKK i jest przyłączony do składnika ligandowego poprzez przerywnik – dwie cząsteczki kwasu ε-aminoheksanowego.

Określony wynik techniczny w trzeciej postaci osiąga się poprzez to, że w nośniku (wirusowym CDP) opartym na syntetycznych analogach białka wirusa mięsaka Kaposiego vMIP-II, zawierającym składnik kationowy, jakim jest oligolizyna K8, stosowanym do kondensacji plazmidowy DNA i składnik ligandowy do oddziaływania z receptorem CXCR4, według zastrzeżonego wynalazku, fragment (1-10 Daa - syntetyzowany z D-aminokwasów) N-końcowej sekwencji białka vMIP-II, posiadający jako składnik ligandowy zastosowano strukturę LGASWHRPDK i wykazujący aktywność antagonistów receptora CXCR4, natomiast składnik kationowy koniugatu ma strukturę KKKKKKKK i jest przyłączony do składnika ligandowego poprzez przerywnik – dwie cząsteczki kwasu ε-aminoheksanowego .

Wszystkie trzy warianty zastrzeganego nośnika można zsyntetyzować znanymi metodami syntezy peptydów, na przykład metodą Boc na fazie stałej (Merrifield, R.B. Synteza peptydów na fazie stałej. I. Synteza tetrapeptydu // Journal of the American Chemical Society 1963. V.85 (14), s. 2149-2154).

Przykłady konkretnych realizacji

Wynalazek zilustrowano za pomocą fig. 1, która przedstawia zmianę intensywności fluorescencji bromku etydyny wraz ze wzrostem stosunku ładunku nośnik/DNA w krótkich kompleksach CDP/DNA, długich CDP/DNA i wirusowych kompleksach CDP/DNA. Spadek intensywności fluorescencji wskazuje na wzrost gęstości powstających kompleksów. Krzywe fluorescencji osiągające plateau wskazują, że kompleksy osiągnęły gęstość wystarczającą do wygaszenia fluorescencji bromku etydyny.

Figura 2 przedstawia zależność aktywności lucyferazy w komórkach HeLa (CXCR4+) po transfekcji krótkimi kompleksami CDP/DNA, długimi CDP/DNA i wirusowymi CDP/DNA w obecności glicerolu, środka endosomolitycznego. W tym przypadku zastosowano kompleksy utworzone przy następujących proporcjach nośnik/ładunek DNA: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Kontrolami doświadczalnymi były nienaruszona cząsteczka, DNA, kompleksy PEI/DNA 1/8 (dodatnią kontrolą eksperymentalną była dostępna w handlu polietylenoimina o rozgałęzionym łańcuchu 25 kDa - PEI) oraz kompleksy zawierające DNA i peptyd kontrolny (CP). CP różni się od nośników według niniejszego wynalazku brakiem sygnału wiązania z receptorem CXCR4 i strukturalnie jest oligolizyną KKKKKKKK. Skuteczność dostarczania genu markerowego przez nośniki krótkiego CDP, długiego CDP i wirusowego CDP była 10-100 razy większa niż przez kontrolę CP.

Figura 3 przedstawia zależność aktywności lucyferazy w komórkach A172 (CXCR4+) po transfekcji krótkimi kompleksami CDP/DNA, długimi CDP/DNA i wirusowymi CDP/DNA w obecności glicerolu, środka endosomolitycznego. Tutaj użyliśmy kompleksów utworzonych przy następujących stosunkach ładunku nośnik/DNA: 9/1, 12/1. Nienaruszona cząsteczka DNA, kompleksy PEI/DNA 1/8 oraz kompleksy zawierające DNA i peptyd CP służyły jako kontrole eksperymentalne. Skuteczność dostarczania genu markerowego przez nośniki krótkiego CDP, długiego CDP i wirusowego CDP była 10-krotnie wyższa niż przez kontrolę CP.

Wyniki na Figurze 2 i Figurze 3 potwierdzają specyficzność nośników według niniejszego wynalazku dla receptora CXCR4.

Figura 4 przedstawia zależność aktywności lucyferazy w komórkach CHO (CXCR4-) po transfekcji krótkimi kompleksami CDP/DNA, długimi CDP/DNA i wirusowymi CDP/DNA w obecności glicerolu, środka endosomolitycznego. Zastosowano kompleksy utworzone przy następujących stosunkach ładunku nośnik/DNA: 9/1, 12/1. Nienaruszona cząsteczka DNA, kompleksy PEI/DNA 1/8 oraz kompleksy zawierające DNA i peptyd CP służyły jako kontrole eksperymentalne. Skuteczność dostarczania genu markerowego przez krótkie CDP, długie CDP i wirusowe nośniki CDP była prawie taka sama jak przy użyciu kontroli CP.

Nośniki posiadające sygnał nie są w stanie zapewnić istotnie wyższego poziomu dostarczania materiału genetycznego w komórkach pozbawionych ekspresji receptora w porównaniu z kontrolą.

Realizację wynalazku można wyjaśnić w następujący sposób. Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie ukierunkowanego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek wyrażających receptor CXCR4 przy użyciu nośników materiału genetycznego zawierającego sekwencje sygnałowe dla tego receptora.

W pierwszym etapie przeprowadza się tworzenie kompleksów jednego z wykonań nośnika z konstruktem genetycznym zawierającym „interesujący gen”. Powstałe kompleksy służą do dostarczenia materiału genetycznego do odpowiednich komórek docelowych. Analizę efektywności penetracji komórek ocenia się metodami enzymatycznymi lub immunohistochemicznymi.

Tworzenie kompleksów odbywa się w roztworze izotonicznym. Korzystny jest mannitol buforowany Hepes (mannitol buforowany Hepes). Wielkość powstałych kompleksów wynosi 170-230 nm.

W jednym wykonaniu jako konstrukty genetyczne stosuje się plazmidowy DNA.

Plazmidowy DNA zawiera marker (luc, lacZ) lub gen terapeutyczny (w zależności od choroby), pod kontrolą odpowiednich promotorów i wzmacniaczy (CMV, SV40 itp.) oraz inne elementy niezbędne np. do replikacji w komórce gospodarza lub integrację z genomem. W terapii genowej raka można zastosować geny HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, kinazę tymidynową itp.

W innym wykonaniu oligonukleotydy składające się z małego DNA lub RNA, komplementarne do określonej sekwencji w mRNA lub jego prekursorze, stosuje się jako konstrukt genetyczny w celu zahamowania syntezy produktu białkowego lub usunięcia eksonu niosącego mutację z mRNA. Powstałe kompleksy służą do dostarczenia materiału genetycznego do komórek wykazujących ekspresję receptora CXCR4. Wejście kompleksów nośnikowych według niniejszego wynalazku następuje głównie poprzez transport za pośrednictwem receptora poprzez wiązanie z domenami zewnątrzkomórkowymi receptora CXCR4 i późniejszą internalizację receptora.

Dawka nośników i materiału genetycznego ustalana jest indywidualnie i zależy od rodzaju komórek, ilości receptora CXCR4 na ich powierzchni oraz złożoności transfekcji tych komórek.

Aby zwiększyć skuteczność tych nośników, transfekcję komórek korzystnie przeprowadza się przy użyciu środka endosomolitycznego. Należą do nich glicerol, chlorochina itp. Substancje te dodaje się do pożywki transfekcyjnej bezpośrednio przed dodaniem kompleksów do komórek. Pozostają niezwiązane z kompleksami i dlatego nie wpływają na ich strukturę.

Jako część nośnika wiążącą DNA można zastosować peptydy, inne związki polimerowe i liposomy zdolne do zagęszczania kwasów nukleinowych. Ponadto mogą mieć właściwości endosomolityczne (nie ma konieczności stosowania dodatkowego środka endosomolitycznego) i w razie potrzeby (np. w celu dostarczenia genów terapeutycznych lub markerowych) dostarczać materiał genetyczny do jądra.

Przy wyborze warunków transfekcji tworzone są one tak, aby zapewnić jak największą efektywność dostarczania. Zaleca się inkubację kompleksów z komórkami przez 4 godziny. Można jednak zmieniać ten czas od 3 do 6 godzin. Po czasie inkubacji zmienia się pożywkę i komórki pozostawia się na 24-48 godzin (w zależności od rodzaju komórki i materiału genetycznego) w celu ekspresji wprowadzonych konstruktów z genem będącym przedmiotem zainteresowania lub ujawnienia efektu terapeutycznego oligonukleotydów.

Analizę efektywności dostarczania przeprowadza się metodami enzymatycznymi lub immunohistochemicznymi, w zależności od rodzaju wprowadzonego konstruktu genowego.

Przykład 1. Tworzenie kompleksów DNA/nośnik i badanie procesu tworzenia kompleksu.

Plazmid pCLUC4, zawierający gen lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii, wykorzystano jako materiał genetyczny do ukierunkowanego dostarczania genów do komórek. Zastosowano jeden przykład wykonania nośnika.

Roztwory 1 μg DNA w 40 μl 1X buforu HBM (5% w/v mannitolu, 5 mM Hepes, pH 7,5) i roztwory nośników odpowiadające różnym stosunkom ładunku DNA/nośnik przygotowano w równej objętości buforu. Roztwór nośnika stopniowo dodawano do probówki Eppendorfa zawierającej roztwór DNA i mieszano energicznie przez 20 sekund. Powstałą mieszaninę pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zakończenia procesu tworzenia kompleksu.

Wyniki kompleksowania analizuje się metodą wypierania bromku etydyny. Fluorescencję bromku etydyny mierzy się za pomocą wielomodowego czytnika skanującego widmo Varioscan Flash (Thermo, Finlandia). Wypieranie bromku etydyny obserwowano przy emisji 590 nm (wzbudzenie przy 544 nm) po dodaniu nośnika do DNA (20 µg/ml) wstępnie inkubowanego ze środkiem interkalującym, bromkiem etydyny (400 ng/ml). Przemieszczenie obliczono ze wzoru (F-Ff)/(Fb-Ff), gdzie Ff i Fb to intensywności fluorescencji bromku etydyny, odpowiednio w nieobecności i obecności DNA, Wyniki przedstawiono na rys. 1.

Przykład 2. Przeprowadzanie transfekcji in vitro.

Komórki HeLa, A172 i CHO wysiano do 48-dołkowych płytek hodowlanych (Nunc) 24 godziny przed transfekcją w ilości 50 000 komórek na dołek, zawierającej 500 µl standardowej mieszaniny hodowlanej składającej się z pożywki hodowlanej DMEM (GIBCO), 10% płodu bydlęcego surowica (GIBCO), 2 mM glutamina z dodatkiem penicyliny (50 U/ml), streptomycyna (50 µg/ml) i 1 mM pirogronian sodu. Zawiesinę kompleksów przygotowano sposobem opisanym w przykładzie 1 w ilości 2 µg DNA na studzienkę płytki hodowlanej. 10 minut przed dodaniem zawiesiny kompleksów DNA/nośnik komórki przemyto kilka razy DMEM i do każdej studzienki dodano 500 µl pożywki zawierającej 15% glicerol i 1,5% etanol. Transfekcję przeprowadzono poprzez dodanie do pożywki zawiesiny kompleksów DNA/nośnik. Po dodaniu kompleksów płytki z komórkami umieszczono w termostacie o temperaturze 37°C i 5% CO2 na 4 godziny. Po czasie inkubacji komórki przemyto DMEM i do każdej studzienki dodano 500 µl standardowej mieszaniny kulturowej. Płytkę hodowlaną inkubowano w termostacie w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 48 godzin, po czym wykrywano ekspresję genu markerowego.

Przykład 3: Wykrywanie ekspresji genu lucyferazy po transfekcji in vitro.

Pożywkę usunięto z płytek hodowlanych i komórki przemyto 1x PBS (pH 7,2). Do każdej studzienki dodano 80 µl buforu do lizy (25 MM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8). 50 µl lizatu przeniesiono na płytki polistyrenowe o nieprzezroczystych ściankach w celu zmierzenia aktywności lucyferazy. Pomiar przeprowadzono przy użyciu wielomodowego czytnika skanującego widmo Varioscan Flash (Thermo, Finlandia). Pomiar przeprowadzono stosując roztwór mieszaniny typu flash lucyferazy (20 mM Tricine, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2,67 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 µM ATP, 270 µM acetylokoenzym A, 470 µM lucyferyna). Każdy pomiar wykonywano przez 10 sekund. Odczyty przyrządu uzyskano we względnych jednostkach światła (RLU). Wyniki eksperymentów oceniano we względnych jednostkach światła na 1 mg całkowitego białka z ekstraktów komórkowych w studzience płytki hodowlanej. Całkowitą ilość białka w każdym dołku mierzono przy użyciu zestawu do oznaczania białka (Bio-Rad) w odniesieniu do krzywej kalibracyjnej albuminy surowicy bydlęcej. Wyniki przedstawiono na rysunkach 2, 3, 4.

Szczepionka DNA(Również szczepionka genowa, szczepionka zawierająca kwas nukleinowy)- genetycznie zmodyfikowany konstrukt, który po wprowadzeniu do komórki zapewnia produkcję białek patogenu lub antygenów nowotworowych i wywołuje odpowiedź immunologiczną. Wprowadzenie szczepionki DNA do organizmu nazywa się immunizacją genetyczną. Szczepienie DNA ma kilka zalet w porównaniu ze szczepionkami konwencjonalnymi. W szczególności wykazano, że szczepionki takie zapewniają nie tylko produkcję przeciwciał (odporność humoralna), ale także specyficzną odpowiedź cytotoksyczną (odporność komórkowa), co wcześniej było możliwe do osiągnięcia jedynie przy pomocy żywych szczepionek. Obecnie szczepionek DNA nie stosuje się w leczeniu ludzi, ale przewiduje się, że immunizacja genetyczna pomoże przezwyciężyć wiele chorób.

Historia stworzenia

Pomysł wykorzystania fragmentów DNA do szczepień pojawił się w latach 50. i 60. XX wieku. Po serii eksperymentów stwierdzono, że informacja genetyczna DNA zachowuje zdolność do transkrypcji i translacji po przeniesieniu do innej komórki. W tym samym roku odkryto, że wstrzyknięcie zwierzętom genomu wirusa polio stymuluje produkcję przeciwciał. Później wykazano aktywację odporności humoralnej dla cząsteczek DNA uzyskanych z czynników niezakaźnych. Od lat 90. laboratoria naukowe zaczęły coraz częściej badać immunostymulujące właściwości DNA. W 1992 roku Tang i jego współpracownicy wykazali, że gen ludzkiego hormonu wzrostu osadzony w plazmidzie ulega stabilnej ekspresji w organizmie myszy, a syntetyzowany hormon jest rozpoznawany przez układ odpornościowy jako antygen i stymuluje produkcję przeciwciał. Proces wprowadzania plazmidowego DNA w celu stymulacji odporności humoralnej nazwano Tango „immunizacją genetyczną”. Jednak w następnym roku inna grupa naukowców ogłosiła, że ​​wprowadzenie plazmidu kodującego białka wirusa grypy wywołało zarówno odpowiedź humoralną, jak i komórkową. Indukcję obu gałęzi odporności w tym samym roku stwierdzono także w przypadku plazmidu zawierającego geny HIV. Od 1995 r. zaczęły pojawiać się dowody na to, że szczepienie DNA może aktywować układ odpornościowy w walce z nowotworem. Około 20 lat temu odbyły się pierwsze badania kliniczne szczepionek DNA, które miały przede wszystkim wykazać bezpieczeństwo nowej metody. Pacjentom wstrzyknięto geny wirusa HIV, wirusa grypy, opryszczki, zapalenia wątroby typu B i czynnika wywołującego malarię. Wyniki wszystkich testów okazały się dość zachęcające: szczepionki DNA konsekwentnie ulegały ekspresji, wywoływały odpowiedź immunologiczną i nie powodowały poważnych skutków ubocznych, co stało się impulsem do dalszych badań.

Projekt szczepionki DNA

Strukturalnie szczepionka DNA to sekwencja nukleotydów osadzona w wektorze kodującym specyficzny antygen lub antygeny. W inżynierii genetycznej wektor to cząsteczka kwasu nukleinowego, która służy do dostarczania materiału genetycznego do komórek i zapewnienia jego replikacji lub ekspresji. Wcześniej do transportu genów do komórek wykorzystywano wektory na bazie wirusów: zmodyfikowanego (osłabionego) wirusa ospy wietrznej, adenowirusów i retrowirusów. Wektory wirusowe są dość skuteczne, ale istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia działań niepożądanych ze względu na stosunkowo wysoką immunogenność samego wektora. Dlatego obecnie jako wektor coraz częściej stosuje się plazmid bakteryjny, małą stabilną, kolistą cząsteczkę DNA zdolną do autonomicznej replikacji. Sam plazmid nie wywołuje pożądanej specyficznej odpowiedzi immunologicznej, w tym celu wprowadza się do niego geny białek immunogennych. Ponadto szczepionka DNA musi zawierać sekwencje regulatorowe niezbędne do ekspresji genów w komórkach eukariotycznych. Gotowy konstrukt DNA dostarczany jest do komórki bakteryjnej, gdzie zwiększa się liczba jego kopii. Następnie izoluje się i oczyszcza plazmidy niosące pożądaną wstawkę.

Projekt wektora plazmidu

Ważnym etapem tworzenia szczepionek DNA jest zaprojektowanie (konstrukcja) wektora. Obowiązkowymi strukturami wektora plazmidowego są miejsca restrykcyjne, marker selekcyjny i początek replikacji szczepionki DNA w komórce bakteryjnej. Aby mogła nastąpić synteza antygenu, szczepionka DNA musi zawierać promotor i sygnał poliadenylacji. Promotor jest ważnym czynnikiem wpływającym na skuteczność szczepionki, ponieważ decyduje o sile odpowiedzi immunologicznej: im większa ekspresja genu kodującego antygen wirusowy lub nowotworowy, tym silniejsza jest odpowiedź immunologiczna. Najczęściej stosowanym promotorem jest SV40 lub wirus cytomegalii (CMV). Aby ustabilizować transkrypty mRNA, do plazmidu wprowadza się sygnał poliadenylacji, najczęściej uzyskiwany z genu bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) lub wirus SV40. Jako markery selektywne wybiera się geny oporności bakterii na antybiotyki, często jest to gen oporności na kanamycynę. Przy projektowaniu szczepionek DNA najpopularniejszym źródłem replikacji jest Escherichia coli.

Wybór genu do immunizacji

Wektor jest ważnym składnikiem szczepionki DNA, ale o jego immunogenności decyduje wstawka – sekwencja DNA kodująca antygen. Spośród antygenów wirusowych do immunizacji najlepiej nadają się białka fuzyjne – są to białka stosunkowo konserwatywne, zapewniające wnikanie wirusa do wnętrza komórki. W celu zaszczepienia przeciwko bakteriom Gram-dodatnim zaleca się wprowadzenie do wektora plazmidowego genów białek bakteryjnych, które determinują patogenezę choroby. Spośród białek bakterii Gram-ujemnych charakteryzują się one wysoką immunogennością. W terapeutycznych przeciwnowotworowych szczepionkach DNA stosuje się białka markerowe komórek nowotworowych.

Metody dostarczania szczepionek DNA do komórek

Gotowa szczepionka musi zostać dostarczona do organizmu człowieka lub zwierzęcia, gdzie jej przeznaczeniem są komórki prezentujące antygen (APC) – makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B. Tutaj nastąpi synteza i potranslacyjna modyfikacja antygenu, po czym zostanie on osadzony w błonie komórkowej, aby przyciągnąć uwagę układu odpornościowego. Głównym problemem jest dostarczenie wystarczającej ilości plazmidu do APC. Metody dostarczania materiału genetycznego do komórek dzieli się zazwyczaj na 2 grupy: wirusowe i niewirusowe. Ponieważ wektory wirusowe mają wiele istotnych wad, w tej sekcji przedstawiono jedynie niewirusowe metody dostarczania szczepionek DNA.

Mikroiniekcja

Na początku lat 90. XX wieku mikroiniekcje domięśniowe były najpowszechniejszą metodą wprowadzania DNA do komórek ze względu na prostotę metody. W tym celu DNA rozpuszcza się w wodzie lub roztworze izotonicznym i, jeśli to konieczne, dodaje się adiuwant (substancję wzmacniającą odpowiedź immunologiczną). Następnie za pomocą cienkiej szklanej rurki roztwór wstrzykiwany jest do tkanki mięśniowej, gdzie rolę APC pełnią komórki dendrytyczne. Po dostaniu się do jądra komórki dendrytycznej szczepionka zaczyna ulegać ekspresji i następuje synteza białek antygenowych. Za pomocą mikroiniekcji DNA można wstrzykiwać podskórnie do grasicy, wątroby i tkanki nowotworowej, jednak to w tkance mięśniowej obserwuje się najdłużej (do roku) ekspresję szczepionki DNA. Ze względu na dużą koncentrację komórek Langerhansa (podtypu komórek dendrytycznych) skóra jest atrakcyjnym celem szczepień DNA. Do podawania śródskórnego (podskórnego) stosuje się szereg mikroigieł, których długość wynosi kilkaset mikronów. Istnieją różne możliwości szczepienia śródskórnego. Łatwiej poprzez rozluźnienie warstwy rogowej naskórka (zewnętrznej warstwy skóry, zwykle 10-20 mikronów) za pomocą szeregu mikroigieł w celu zwiększenia jej przepuszczalności dla dalszego miejscowego wstrzyknięcia roztworu DNA. Bardziej skuteczne jest zastosowanie mikroigieł pokrytych suchą szczepionką, która rozpuszcza się pod skórą. Skuteczność tej metody jest zwykle niska, ponieważ DNA najpierw przedostaje się do przestrzeni międzykomórkowej, a dopiero potem zostaje wchłonięty do komórek.

Elektroporacja

Elektroporacja to tradycyjna metoda dostarczania DNA do komórek bakteryjnych i hodowli komórkowych, oparta na zastosowaniu impulsu elektrycznego. Impuls ten tworzy pory w błonie komórkowej, co ułatwia wejście ujemnie naładowanemu DNA. Metodę tę zapożyczono do podawania szczepionek DNA zwierzętom i ludziom i może ona znacznie zwiększyć skuteczność konwencjonalnego zastrzyku. Urządzenie do elektroporacji zawiera źródło prądu elektrycznego oraz jednorazową siatkę, która składa się ze strzykawki i igieł elektrodowych. Strzykawka wstrzykuje szczepionkę do tkanki mięśniowej, a elektrody wytwarzają pole elektryczne, które ułatwia wejście DNA do miocytów i komórek dendrytycznych. Dziś opracowano urządzenia, które mogą zwiększyć skuteczność szczepienia 1000 razy w porównaniu z konwencjonalnym zastrzykiem. Elektroporację można stosować zarówno do domięśniowego, jak i podskórnego podawania szczepionek DNA. Wadą jest niewielki ból w miejscu wstrzyknięcia oraz konieczność stosowania specjalistycznych urządzeń. Zamiast pola elektrycznego można zastosować pole magnetyczne. Urządzenia takie działają na tej samej zasadzie, jednak w tym przypadku zabieg jest całkowicie bezbolesny i powoduje mniejsze uszkodzenia komórek.

Działanie pola elektrycznego nie tylko zwiększa wchłanianie szczepionki DNA przez komórki, ale także stymuluje wytwarzanie odpowiedzi immunologicznej. Zastosowanie elektroporacji prowadzi do niewielkich uszkodzeń tkanek – rozwija się miejscowy proces zapalny. Uszkodzone komórki uwalniają chemokiny, dzięki czemu wysyłane są do nich makrofagi, limfocyty i komórki dendrytyczne. Zwiększenie stężenia komórek odpornościowych w miejscu podania szczepionki zwiększa jej skuteczność.

Sonoporacja

Sonoporacja to metoda przenoszenia obcego DNA do komórek za pomocą ultradźwięków. Ultradźwięki zwiększają przepuszczalność błony komórkowej, w wyniku czego egzogenny DNA łatwiej wnika do wnętrza komórki. Sonoporację po raz pierwszy zastosowano do przeniesienia genów do komórek w 1986 roku. Metoda ta stosowana jest do wprowadzania cząsteczek DNA do komórek rogówki, mózgu, tkanki kostnej, nerek, trzustki, tkanki embrionalnej, mięśni szkieletowych i sercowych. W porównaniu z innymi metodami sonoporacja jest mało zbadana, potrzeba jeszcze wiele wysiłku, aby zwiększyć jej skuteczność, zwłaszcza na poziomie całego organizmu.

Transfekcja balistyczna

Transfekcja balistyczna polega na ołuszczaniu (bombardowaniu) narządów i tkanek mikrocząsteczkami metali ciężkich (złota, wolframu) o średnicy 1-3 mikronów pokrytymi cząsteczkami DNA. Wprowadzona w ten sposób szczepionka DNA ulega ekspresji w komórkach docelowych, a jej produkty przedostają się do krwi. Aby zapewnić przyspieszenie cząstek, stosuje się urządzenie podobne do broni strzeleckiej - pistolet genowy lub działo genowe. Mikrocząstki przechodzą przez błony komórkowe i przenoszą konstrukt genetyczny bezpośrednio do jądra komórkowego. Głębokość penetracji mikrocząstek jest zwykle niewielka – do 1 mm, dlatego metodę tę stosuje się głównie do transfekcji skóry lub sąsiadującej tkanki chrzęstnej. Specjalne warunki wypalania pozwalają mikrocząstkom wniknąć na głębokość 4-5 mm i przenieść konstrukty genowe do włókien mięśni poprzecznie prążkowanych. Zazwyczaj komórki znajdujące się bezpośrednio w środku strzału giną, natomiast w strefie 0,6-1 cm od środka zlokalizowane są komórki najskuteczniej transformowane. Technologia ta nazywana jest również biobalistyką lub biolistyką.

Pierwszy pistolet genowy został stworzony przez grupę naukowców w latach 1983–1986 w celu transformacji komórek roślinnych. Był to pistolet zaprojektowany w oparciu o urządzenie do automatycznego wbijania gwoździ. DNA z genu reporterowego (markerowego) naniesiono na kulkę wolframową i wrzucono na szalkę Petriego. Ekspresja genu reporterowego wskazywała na skuteczność immunizacji. Obecnie do dostarczania DNA wykorzystuje się cząstki złota lub srebra, ponieważ nie są one toksyczne dla komórek, w przeciwieństwie do wolframu.

Pod wysokim ciśnieniem

W 1999 roku opracowano urządzenia do wstrzykiwania, które umożliwiają podanie szczepionki DNA bez użycia igły. Urządzenia takie działają dzięki sile Lorentza: mały, mocny magnes wytwarza znaczne ciśnienie i uruchamia tłok, który wyrzuca lek z prędkością dźwięku. Zmieniając aktualną moc, możesz wybrać głębokość wstrzyknięcia i dawkować leki. Zabieg jest całkowicie bezbolesny i był już stosowany przy podawaniu insuliny pacjentom z cukrzycą oraz podczas masowych szczepień. Istotną wadą tej metody jest to, że wysokie ciśnienie może teoretycznie zmienić strukturę wstrzykiwanych cząsteczek. Jednak ta technologia wstrzykiwania jest wciąż udoskonalana i obecnie opracowano urządzenia, które mogą wprowadzić DNA na głębokość do 16 mm.

Zawiera żywy wektor bakteryjny

Żywe wektory bakteryjne to szczepy Salmonela, Shigella Lub Listeria, które niosą mutację w genach biosyntezy lub inwazji, które eliminują patogenność i zdolność do utrzymania ich żywotności w żywicielu lub środowisku. Jednak niezbędne geny białek immunogennych są wstawiane do genomu bakterii. Osłabiona bakteria wprowadzana jest do organizmu drogą pokarmową (doustnie, połknięciem) lub donosowo (wtryskiem do nosa), dlatego ta metoda szczepienia nie wymaga żadnego sprzętu. Ponadto takie podanie stymuluje odpowiedź immunologiczną błony śluzowej, co jest istotne, ponieważ większość patogenów przedostaje się do organizmu przez otwory ustne i nosowe. Omijając żołądek, osłabione bakterie przedostają się do jelita cienkiego. Następnie bakteria przenika do płytek Peera - jelitowych węzłów chłonnych. Gdy bakterie znajdą się w środku kępek Peyera, stają się celem dla makrofagów i ulegają fagocytozie. W cytoplazmie makrofaga bakteria uwalnia szczepionkę DNA, po czym DNA dostaje się do jądra, a bakteria zostaje zneutralizowana przez układ odpornościowy.

Pakowanie w liposomach

Liposomy to formacje kuliste (o średnicy około 100 nm) składające się z dwuwarstwy lipidowej. Liposomy są puste w środku, które zwykle jest wypełnione rozpuszczalnikiem, ale można nimi dostarczać różne substancje, w tym szczepionki DNA. Ich hydrofobowa otoczka pozwala im łączyć się z błonami komórkowymi i przenosić ich zawartość do komórki. Stosowanie liposomów zaczęto stosować w 1965 roku i stało się to potężnym motorem rozwoju bionanotechnologii.

Obiecującą metodą bezpośredniego wprowadzenia konstruktu DNA do komórek docelowych jest dostarczenie konstruktu genetycznego jako części kationowych liposomów zbudowanych z dodatnio naładowanych lipidów. Kationowe liposomy z ujemnie naładowaną cząsteczką DNA tworzą kompleks DNA-lipid - lipopleks. Zaletami stosowania takich kompleksów jest możliwość przenoszenia dużej ilości informacji, niezakaźność, ponadto są proste i niedrogie w produkcji. W 2003 roku stworzono niezwykle małe – milimikronowe liposomy pokryte polimerem glikolu polietylenowego, które są w stanie przenosić terapeutyczny DNA przez barierę krew-mózg i dostarczać go do neuronów w mózgu, co wcześniej było niemożliwe.

Złożony z polipleksu

Aby wprowadzić do komórki duże konstrukty DNA (> 10 kb), stosuje się polipleksy – układy składające się z dodatnio naładowanych polimerów (polikationów) i ujemnie naładowanych cząsteczek DNA. Wielkość takich kompleksów jest mniejsza niż 100 nm, co z jednej strony naraża je na trawienie przez makrofagi (w ten sposób reagują na cząstki większe niż 200 nm), z drugiej strony są na tyle duże, że nie być filtrowane w nerkach.

Polikationy kondensują cząsteczkę DNA w kompleksy, zapewniając w ten sposób jej stabilność i ochronę przed działaniem nukleaz. Jako polimery wiążące DNA mogą służyć białka kationowe, syntetyczne homopolimery aminokwasów (polilizyny, poliargininy), polisacharyd chitozanu i polietylenoamina. Zwykle w polipleksie polikation jest obecny w nadmiarze, w wyniku czego kompleks jest rozpuszczalny i naładowany dodatnio. Jeśli ligand jest przyłączony do polipleksu do określonego receptora komórkowego, wówczas szczepionkę DNA można skierować na określony typ komórki. Proces dostarczania materiału genetycznego w ramach polipleksu obejmuje dwa etapy: zewnątrzkomórkowy (droga od miejsca wstrzyknięcia do komórek docelowych) i wewnątrzkomórkowy (interakcja z komórkami docelowymi, endocytoza, wyjście z endosomów, dostarczenie do jądra). Pierwszą barierą, którą kompleks musi pokonać, jest krew i macierz pozakomórkowa. Dlatego też takie parametry fizykochemiczne polipleksu dobiera się tak, aby zwiększyć jego stabilność, uniknąć niepożądanych interakcji z białkami krwi oraz reakcji immunologicznych wywołanych chemicznym charakterem polikationu. Po dotarciu do komórek docelowych polipleks jest wchłaniany przez błonę plazmatyczną, wychwytywany przez endocytozę, po czym musi opuścić endosom i zdysocjować na polimer kationowy i cząsteczkę DNA. Wolne DNA jest wysyłane do jądra, a kationy polimeru opuszczają komórkę i są wydalane z organizmu.

Charakterystyka najpopularniejszych metod podawania szczepionek DNA
metoda	Zalety	Wady
Zastrzyki domięśniowe lub podskórne	Nie wymaga specjalnego sprzętu Ekspresja trwała lub długoterminowa DNA jest przenoszone do sąsiednich tkanek	Słaba efektywność Wymaga stosunkowo dużej ilości DNA
Elektroporacja	Wysoka wydajność	Uszkodzenie tkanek
Pistolet genowy	Wysoka celność Wymagana niewielka ilość DNA	Wymaga obecności obojętnych mikrocząstek Uszkodzenie komórek w miejscu strzału
Wtrysk pod wysokim ciśnieniem	Stosunkowo prosta metoda Nie ma potrzeby stosowania mikrocząstek DNA może wnikać na głębokość od kilku mm do 1,5 cm	Wpływa na strukturę DNA Niska skuteczność szczepień Wymaga dużej ilości DNA (do 300 μg)
Pakowanie w liposomach	Wysoka wydajność in vitro Łatwość produkcji Duża pojemność Można łączyć z innymi metodami Szczepionka podana dożylnie może potencjalnie dotrzeć do wszystkich tkanek Podanie donosowe zapewnia ekspresję szczepionki w błonie śluzowej nosa i produkcję immunoglobulin klasy A (IgA)	Możliwa toksyczność Słaba efektywność na żywo

Mechanizm rozwoju odpowiedzi immunologicznej

Antygen syntetyzowany w komórce poddawany jest obróbce, po czym jest prezentowany komórkom immunokompetentnym. Przetwarzanie polega na rozszczepieniu białka antygenowego na immunogenne fragmenty peptydowe. Prezentacja oznacza prezentację fragmentu antygenu połączonego z cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) komórek immunokompetentnych. Istnieją dwie najważniejsze klasy tych cząsteczek: MHC klasy I (MHC-I) i MHC klasy II (MHC-II). Aby związać się z cząsteczkami każdej klasy, antygen przygotowuje się w wyspecjalizowanych przedziałach komórki. Endogenne białka antygenowe kierowane są do degradacji do proteasomu, po czym prezentowane są w kompleksie z MHC-I na powierzchni komórki. Tutaj, gdy się spotykają, są rozpoznawane przez limfocyty T CD8+ (komórki T zabójcze), które realizują cytotoksyczną odpowiedź immunologiczną. Białka egzogenne są rozszczepiane przez proteazy lizomnimowe, zawarte w MHC-II i rozpoznawane przez receptory komórek T CD4+ (pomocników T). Te ostatnie powodują zarówno reakcje komórkowe, jak i humoralne.

Prezentacja antygenu poprzez szlak MHC-I

Szczepienie DNA obejmuje endogenną syntezę antygenu, więc ta droga jest dominująca. Przetwarzanie antygenu na szlaku MHC-I przebiega w kilku etapach. Białko syntetyzowane w jądrze transportowane jest do cytoplazmy, gdzie zostaje rozszczepione przez Proteasom na krótkie peptydy – epitopy, które przenoszone są do retikulum endoplazmatycznego (ER) za pomocą specjalnych białek transportujących antygen (TAP, transporter związany z przetwarzaniem antygenu). W ER każdy epitop łączy się z cząsteczką MHC-I, po czym powstały kompleks przesyłany jest do aparatu Golgiego (AG) w celu glikozylacji. Stamtąd kompleks w pęcherzyku ma tendencję do błony komórkowej. Po połączeniu pęcherzyka z plazmalemmą kompleks pojawia się na powierzchni komórki, gdzie jest rozpoznawany przez receptory T-kill, które wykazują działanie cytotoksyczne.

Prezentacja antygenu poprzez szlak MHC-II

Głównym źródłem peptydów wiążących się z MES-II są białka egzogenne, które dostają się do komórki poprzez endocytozę. Wykazano jednak, że niektóre białka wewnątrzkomórkowe mogą występować także w kompleksach z MChS-II. W tym przypadku nowo zsyntetyzowane białka po wejściu do cytoplazmy przenoszone są do lizosomów, gdzie antygen ulega rozszczepieniu pod działaniem kwaśnych proteaz. Następnie lizosom zawierający epitopy łączy się z pęcherzykiem, w którym znajduje się cząsteczka MES-II. Wewnątrz zjednoczonego pęcherzyka tworzy się kompleks epitop-MCS-II, który po fuzji pęcherzyka z plazmalemmą jest transportowany na powierzchnię komórki. Tutaj kompleks ten jest rozpoznawany przez receptory pomocnicze T, co powoduje ich aktywację. Prowadzi to do stymulacji zarówno odporności komórkowej (aktywacja limfocytów T zabójczych), jak i humoralnej (aktywacja limfocytów B).

Tradycyjne szczepienie rozpuszczalnymi antygenami białkowymi ma na celu mobilizację pomocniczych komórek T. Jedną z wad szczepionek DNA jest stosunkowo niska odpowiedź pomocniczych komórek T. Ponadto obecna generacja szczepionek DNA nie jest w stanie wywołać wytwarzania wysokich mian przeciwciał. Aby zwiększyć aktywację komórek pomocniczych T, antygen musi zostać przekierowany na szlak MES-II. W tym celu w szczepionkę DNA wbudowany jest sygnał lokalizacji lizosomów; zsyntetyzowany antygen zostanie wysłany do lizosomów, co oznacza, że ​​przejdzie ścieżką MES-II

Strategie poprawy skuteczności szczepionki DNA

Głównym pytaniem dotyczącym przyszłości szczepionek DNA jest zwiększenie ich skuteczności. Obecnie prowadzonych jest wiele badań mających na celu optymalizację opracowywanych szczepionek DNA. Poszukiwanie rozwiązania prowadzi się w dwóch kierunkach: zwiększenie ekspresji szczepionki oraz zwiększenie immunogenności kodowanego antygenu.

Optymalizacja elementów transkrypcyjnych

Ważnym składnikiem szczepionki DNA jest promotor. Promotory bakteryjne nie nadają się do ekspresji antygenu w komórkach ssaków, dlatego zamiast nich zastosowano promotory wirusów onkogennych. Obecnie, aby poprawić bezpieczeństwo szczepionek, zastąpiono je promotorami z obiektów nierakotwórczych, np. ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV). W przypadku większości szczepionek DNA ten promotor jest optymalnym wyborem: ulega on silnej ekspresji w szerokim zakresie komórek. W przypadku ekspresji genów w określonych tkankach obiecujące jest zastosowanie promotorów specyficznych dla tego typu tkanki. Na przykład, zastosowanie mięśniowego promotora CPK po podaniu prowadzi do dziesięciokrotnego wzrostu syntezy przeciwciał i indukcji odpowiedzi komórek T w porównaniu do zastosowania podobnej szczepionki DNA z promotorem CMV. Promotor genu desminy, kodującego jedno z białek cytoszkieletu, również wykazał wysoką skuteczność w miocytach. Aby zwiększyć ekspresję szczepionki DNA w keratynocytach (komórkach tkanki nabłonkowej), stosuje się promotory genu metalotioneiny (białka wiążącego metale ciężkie) lub genu 3 hydroksylazy witaminy D.

Poziom inicjacji transkrypcji zwykle wzrasta za konto użytkowania potężny promotor i wzmacniacz, i funkcje zakończenia mogą stać się czynnikiem ograniczającym. Wydajność poliadenylacji i przetwarzania pierwotnego transkryptu RNA zmienia się w zależności od sekwencji sygnału poliA. Oznacza to, że sekwencja poliadenylacji wpływa na syntezę antygenu. Na przykład szeroko stosowany sygnał poliA wirusa SV40 ma niższą skuteczność niż sygnał poliadenylacji króliczego genu β-globiny lub genu bydlęcego hormonu wzrostu.

Aby translacja była skuteczna, ssacze mRNA musi przejść tzw Sekwencja Kozaka. Wstawienie tej sekwencji do konstruktu DNA może znacząco zwiększyć poziom syntezy antygenu. Aby zapobiec pominięciu kodonu stop genu przez polimerazę RNA i syntezie wydłużonego białka, które nie będzie w stanie uzyskać prawidłowego fałdu, gen może zostać poddany terminacji linia podwójnego przystanku.

Projektując szczepionkę DNA, również próbują optymalizować swoje kodony. Procedura optymalizacji polega na zastąpieniu kodonów w sekwencji genu w taki sposób, aby sekwencja aminokwasów białka pozostała niezmieniona, ale wzrosła efektywność translacji jego mRNA. Powodem jest to, że większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jedną granicę. Każdy kodon ma swój własny tRNA, a reprezentacja różnych tRNA w komórce nie jest taka sama, a także różni się w zależności od rodzaju organizmu. Kodony dobiera się w taki sposób, aby obecność pożądanego tRNA nie stała się czynnikiem ograniczającym syntezę antygenu.

Optymalizacja antygenu

Chociaż siła odpowiedzi immunologicznej koreluje z poziomem ekspresji szczepionki DNA, dla każdego antygenu następuje pewne plateau, po którym zwiększenie ilości białka antygenowego zwiększa produkcję przeciwciał. Jednocześnie silniejszą odpowiedź immunologiczną można osiągnąć poprzez optymalizację antygenu. Na przykład przez łączenie antygenu z ligandem ze specyficznym receptorem na komórce prezentującej antygen. Takim ligandem może być białko markerowe CD40, domena zewnątrzkomórkowa kinazy tyrozynowej typu Fms-3 lub antygen zabójcy T-4. Dzięki interakcji ligand-receptor zwiększa się efektywność wychwytu białka antygenowego przez APC.

Ułatwiają degradację antygenu do proteasomu lub lizosomu stymulują także odpowiedź immunologiczną. Aby wzmocnić proteliotyczne rozszczepienie antygenu, do jego sekwencji wstawia się sygnał ubikwitynacji Błąd w cudzysłowie: Nieprawidłowe wywołanie: znacznik ref bez tytułu musi zawierać dane wejściowe. Stosowanie szczepionek DNA, które kodują zamiast całego antygenu kilka epitopów różnego pochodzenia, pozwala znacznie poszerzyć spektrum odpowiedzi immunologicznej.

Połączenie to jest skuteczne w przypadku przeciwnowotworowych szczepionek DNA „antygen nowotworowy + antygen wirusowy lub bakteryjny.” Na przykład połączenie antygenu nowotworowego z epitopem toksyny tężca znacząco zwiększa aktywację limfocytów T zabójców przeciwko komórkom nowotworowym.

Włączenie adiuwantów

W przypadku stosowania tradycyjnych szczepionek dodaje się adiuwanty w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Szczepionka DNA jest pochodzenia bakteryjnego, zatem sama w sobie jest środkiem immunostymulującym. Aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną, do szczepionki DNA wprowadza się geny adiuwanta lub stosuje się dodatkowy plazmid kodujący białka immunostymulujące.

Immunostymulujące działanie bakteryjnych dinukleotydów CpG

Funkcja plazmidu nie ogranicza się do dostarczania genów do komórek. Już w 1893 roku odkryto, że mieszanina lizatów bakteryjnych hamuje rozwój nowotworów nowotworowych, jednak dopiero w 1983 roku ustalono, że właściwości immunostymulujące lizatu zawdzięczają cząsteczkom bakteryjnego DNA. W 1995 roku wykazano, że stymulacja immunologiczna jest wywoływana przez motywy CpG w bakteryjnym DNA. U bakterii, a także wirusów DNA motywy te są niemetylowane. Przeciwnie, w organizmie człowieka i wyższych naczelnych cytozyna w większości dinukleotydów CpG zawiera grupę metylową. Dlatego niemetylowane motywy CpG są postrzegane przez organizm ludzki jako wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP). Związki rumry rozpoznawane są przez receptory Toll-podobne, które w zależności od rodzaju ligandu dzielą się na kilka typów. Niemetylowane motywy CpG rozpoznawane są przez receptor TLR-9, zlokalizowany na błonach siateczki śródplazmatycznej limfocytów B, komórek dendrytycznych i komórek NK. Związanie receptora z niemetylowanymi motywami CpG uruchamia kaskadę reakcji, w wyniku której indukowana jest synteza cytokin prozapalnych – interferonu-1 i IL-12.

Ekspresja cytokin i innych immunomodulatorów

W przypadku szczepień DNA jako adiuwanty najczęściej stosuje się geny cytokin. Cytokiny to klasa cząsteczek białek, które regulują interakcje międzykomórkowe i międzyukładowe w organizmie, w szczególności funkcjonowanie układu odpornościowego. Wszystkie cytokiny, a znanych jest ponad 30 z nich, mogą modulować odpowiedź immunologiczną. Cytokiny IL2, IL-12, interferon γ, IL-15, IL-18 i IL-23 działają stymulująco na komórki pomocnicze T klasy 1. Cytokiny modulujące działanie komórek pomocniczych T drugiej klasy obejmują: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i IL-13. Rodzaj cytokin dobiera się w zależności od rodzaju odpowiedzi immunologicznej, którą chcą wzmocnić.

Zwiększenie odpowiedzi immunologicznej można osiągnąć za pomocą chemokin. Chemokiny to rodzina cytokin zdolnych do indukowania chemotaksji wrażliwych na nie komórek, w tym komórek układu odpornościowego. W szczególności receptory chemokin znajdują się na komórkach wrażliwych na antygeny chemokin. Wiązanie chemokiny z jej receptorem prowadzi do endocytozy kompleksu antygen-chemokina w APC. Strategia ta jest skutecznie stosowana zarówno przy opracowywaniu przeciwwirusowych szczepionek DNA, jak i szczepionek przeciwnowotworowych.

Funkcję adiuwanta może pełnić także białko HSP70 (białka szoku cieplnego). Działanie immunostymulujące HSP70 opiera się na jego zdolności do wnikania do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wiązania się z receptorami APC. Mechanizm transportu HSP70 na zewnątrz nie został jeszcze w pełni wyjaśniony, ale najprawdopodobniej istnieje kilka dróg: egzocytoza, wydzielanie na zewnątrz lub wyjście przez kanał. Wiązanie HSP70 z jego receptorem prowadzi do aktywacji komórek dendrytycznych, pośredniczy w prezentacji antygenu i stymuluje produkcję chemokin. Ponieważ antygen jest połączony z HSP70, przedostaje się on również do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i dlatego może być prezentowany szlakiem MES-II i aktywować limfocyty B. Aby uniknąć reakcji autoimmunologicznych, szczepionki DNA wykorzystują gen bakteryjny HSP70.

Zalety i wady szczepionek DNA

Metoda szczepienia DNA ma wiele zalet, z których najważniejszą jest wywołanie zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Szczepionki oparte na DNA zapewniają długotrwałą ekspresję antygenu, a tym samym trwałą odpowiedź immunologiczną. Dodatkowe czynniki przyczyniające się do rozwoju immunizacji DNA obejmują prostotę i niski koszt produkcji szczepionki.

Zalety

Wady

Antygen uzyskuje swoją natywną konformację Aktywacja obu gałęzi odporności: humoralnej i komórkowej Zsyntetyzowany antygen może być selektywnie kierowany na szlak MES-I lub MES-II Może działać selektywnie na różne populacje komórek pomocniczych T Zapewniają długoterminową ekspresję antygenu Prosty i szybki w produkcji Niski koszt produkcji Nie wymaga specjalnych warunków przechowywania Można go stosować zarówno w profilaktyce, jak i leczeniu chorób Potencjalnie skuteczny przeciwko szerokiemu zakresowi chorób: bakteryjnych, wirusowych, autoimmunologicznych i nowotworowych

Słaba immunogenność W przypadku wektorów wirusowych istnieje niebezpieczeństwo integracji obcego DNA z genomem komórki Możliwy rozwój reakcji autoimmunologicznych Wektory plazmidowe i wirusowe mogą indukować nieswoistą odpowiedź immunologiczną

Zastosowanie szczepionek DNA

Pierwsze badania kliniczne szczepionek DNA oraz bezpieczeństwo nowej metody wykazały jej niską skuteczność. Realizując obietnicę immunizacji DNA, laboratoria naukowe wraz z firmami biotechnologicznymi skupiły swoje wysiłki na optymalizacji nowej metody iw ciągu kilku lat osiągnięto znaczny postęp. W 2005 roku pierwsza szczepionka DNA uzyskała zgodę FDA. Administracja Jedzenia i Leków) do stosowania u zwierząt. Od 2013 r. ponad sto szczepionek DNA jest w fazie badań klinicznych, a cztery szczepionki DNA są dopuszczone do stosowania u zwierząt gospodarskich.

Szczepionki DNA w weterynarii

Wszystkie cztery szczepionki zatwierdzone przez FDA są oparte na plazmidach. W przypadku trzech z nich zalecaną przez producenta metodą podania jest podanie domięśniowe, w przypadku szczepionki LifeTide® jest to zastrzyk połączony z elektroporacją. Jeżeli inne szczepionki mają na celu aktywację układu odpornościowego, wówczas w przypadku szczepionki LifeTide® działanie immunostymulujące jest dodatkowe. Szczepionką jest Somatoliberyna, hormon stymulujący przysadkę mózgową do uwalniania hormonu wzrostu i prolaktyny. Działanie dwóch ostatnich hormonów u świń prowadzi do wzrostu masy ciała zwierząt i zwiększenia liczby miotów. Jednocześnie wprowadzenie do zwierząt plazmidu kodującego Somatoliberynę stymuluje produkcję limfocytów T, komórek NK, a tym samym zwiększa odporność immunologiczną organizmu.

Nazwa handlowa szczepionki	Rok licencji	Cel	Zwierzę	Produkt szczepionkowy	Cel stworzenia szczepionki
Innowator Zachodniego Nilu® (USA)	2005	wirus Zachodniego Nilu	Konie	Białko strukturalne wirusa PreM-E	Ochrona przed wirusem
Apex-IHN® (Kanada)	2005	Czynnik wywołujący zakaźną martwicę tkanki krwiotwórczej	Ryby z rodziny łososiowatych	Wirusowa glikoproteina	Zwiększanie ilości i jakości pokarmu dla ryb
LifeTide® SW 5 (Australia)	2008	Hormon wzrostu	Świnie i inne zwierzęta gospodarskie	Somatoliberyna wieprzowa	Zwiększona wielkość miotu u loch; znacząco zmniejsza zmniejszenie śmiertelności i zachorowalności okołoporodowej
ONCEPT® (USA)	2010	Czerniak	Psy	Tyrozynazy ludzkie	Jako alternatywa dla radioterapii i chirurgii w leczeniu czerniaka

Perspektywy szczepień DNA

Przeciwnowotworowe szczepionki DNA

Chociaż w przekonujący sposób wykazano indukcję komórkowej i humoralnej odpowiedzi immunologicznej w przypadku obcych antygenów związanych z chorobami zakaźnymi, stosowanie szczepionek DNA w leczeniu raka było jak dotąd mniej skuteczne. Wywołanie skutecznej odporności przeciwnowotworowej jest wyzwaniem. Badania kliniczne potwierdziły ogólne bezpieczeństwo i niską toksyczność przeciwnowotworowych szczepionek DNA, jednak skuteczność wywoływanej przez nie odpowiedzi immunologicznej jest słaba, a działanie przeciwnowotworowe w niektórych przypadkach jest ogólnie wątpliwe.

Szczepionki DNA przeciwko patogenom wirusowym i bakteryjnym

Szczepionka DNA przeciwko próchnicy

Przyczyną próchnicy jest lokalna zmiana pH w wyniku fermentacji (glikolizy) węglowodanów prowadzonej przez bakterie. Naukowcy z Instytutu Wirusologii w Wuhan (Chiny) opracowali szczepionkę DNA skierowaną przeciwko jednemu z czynników wywołujących próchnicę - Streptococcus mutans. Szczepionka oparta jest na plazmidzie i koduje dwa białka: białko powierzchniowe Św. mutans PAc i flagelina pochodząca z bakterii Salmonella, który działa jako adiuwant. Na etapie badań przedklinicznych szczepionkę podawano gryzoniom laboratoryjnym donosowo, po czym u zwierząt sprawdzano poziom immunoglobuliny G w surowicy krwi i immunoglobuliny wydzielniczej A w ślinie. Po badaniach naukowcy odkryli, że zarówno we krwi, jak i ślinie wzrósł poziom białek odpornościowych, ale co ważniejsze, zahamowany został wzrost kolonii Streptococcus mutans na szkliwie zębów. Oznacza to, że zęby zaszczepionych zwierząt były lepiej chronione przed próchnicą.

Szczepionki DNA i metody leczenia chorób autoimmunologicznych

Szczepionka DNA przeciwko cukrzycy typu 1

Cukrzyca typu 1 charakteryzuje się utratą komórek beta wytwarzających insulinę, zlokalizowanych w wysepkach Langerhansa trzustki. Główną przyczyną utraty komórek beta jest uszkodzenie autoimmunologiczne przez zabójcze limfocyty T. Aby chronić komórki beta przed nadaktywnością układu odpornościowego, naukowcy z uniwersytetów w Stanford (USA) i Leiden (Holandia) opracowali szczepionkę DNA BHT-3021. Szczepionka oparta jest na plazmidzie i koduje prekursor insuliny, proinsulinę. Jest to szczepionka działająca wstecz: jeśli konwencjonalne szczepionki mają aktywować odpowiedź immunologiczną, to BHT-3021 wręcz przeciwnie, neutralizuje cytotoksyczne działanie limfocytów T zabójców skierowanych przeciwko wysepkom Langerhansa.

W pierwszej fazie badań klinicznych BHT-3021 wykazał swoją skuteczność w grupie 80 osób. Połowa z nich otrzymywała domięśniowe zastrzyki BHT-3021 co siedem dni przez 12 tygodni, a druga połowa otrzymywała placebo. Po tym okresie u grupy, która otrzymała szczepionkę, zaobserwowano wzrost poziomu peptydu C we krwi, co wskazuje na przywrócenie funkcji komórek beta. U żadnego z uczestników nie zgłoszono żadnych poważnych skutków ubocznych. Efekt szczepionki utrzymywał się przez 2 miesiące.