Metode za uvođenje rekombinantne DNK u ćeliju. Nova metoda za isporuku DNK u embrionalne matične ćelije. Metode za isporuku DNK vakcina u ćelije
Jedna od najperspektivnijih opcija za sisteme isporuke gena u ćelije su polipleksi - kompleksi prenesene DNK i katjonskih polimera različite prirode. U ovom članku su opisana svojstva polipleksa na bazi nekoliko tipova kationskih polimera, njihov transport u jezgra ciljnih ćelija, kao i jedan od pristupa liječenju malignih neoplazmi korištenjem ovih konstrukta.
Uvod
Genska terapija je liječenje nasljednih, onkoloških i drugih bolesti unošenjem potrebnog genetskog materijala u ćelije pacijenta kako bi se specifično promijenili genski defekti ili dale nove funkcije stanicama [Gorbunova i sar., 1997.]. Za isporuku DNK ili RNK do ciljnih ćelija kreiraju se nosači (vektori) koji osiguravaju visok nivo transfekcije, tj. prijenos egzogene (strane) DNK ili RNK u određene vrste stanica. Osim toga, vektori moraju osigurati zaštitu genetskih informacija, jer U uslovima in vivo, strana DNK je nestabilna zbog brze razgradnje serumskim nukleazama, enzimima koji razgrađuju nukleinske kiseline.
Vrste transportera genetskog materijala
U prirodi postoje specijalizirane strukture za dostavljanje genetskih informacija u ćelije - virusi. Stoga su se počeli koristiti kao prenosioci gena. Istovremeno, upotreba virusnih vektora ima niz ograničenja. Prvo, to je mali kapacitet prenesenog genetskog materijala i inherentna stanična specifičnost virusa. Drugo, to je mogućnost da se virusi vrate u divlji tip kao rezultat rekombinacije tokom prolaska iste vrste infekcije. Treće, proteini virusnih čestica su visoko imunogeni, zbog čega njihova ponovljena primjena uzrokuje imunološki odgovor. Konačno, masovna proizvodnja virusnih vektora je još uvijek prilično problematična i skupa. Trenutno se aktivno razvijaju različite opcije za nevirusne nosače na bazi kationskih lipida i kationskih polimera. Ovi kationski molekuli su u stanju da spontano formiraju samosastavljene nanokomplekse sa negativno nabijenim DNK molekulom putem elektrostatičkih interakcija. Samosastavljeni kompleksi koji se sastoje od kationskih lipida i DNK nazivaju se lipopleksi; oni koji se sastoje od kationskih polimera i DNK nazivaju se polipleksi.
Kationski polimeri koji se koriste za stvaranje polipleksa
Za potrebe genske terapije i biotehnologije predložen je veliki broj kationskih polimera ili polikationa. Polikationi kondenzuju DNK u kompaktne nanokomplekse, obezbeđujući stabilnost DNK i zaštitu od nukleaza. Kao DNK-vezujući polimeri mogu poslužiti kationski proteini, sintetički homopolimeri aminokiselina (polilizini, poliarginini), hitozan polisaharid, polietilenimin, dendrimeri različitih sastava i drugi modificirani polimeri. Stupanj zbijenosti DNK određen je ukupnim nabojem kompleksa, koji zauzvrat ovisi o omjeru broja pozitivnih polimernih grupa i broja negativnih fosfatnih grupa DNK. Tipično, u sastavu polipleksa, polikation je prisutan u višku, zbog čega se formiraju kompleksi nano veličine (od nekoliko desetina do nekoliko stotina nm), koji su rastvorljivi u vodi i pozitivno naelektrisani (sl. 1, 2 ). U suprotnom, kompleksi će biti nestabilni.
Rice. 1. Shema formiranja polipleksa od kationskih polimera i kružnog DNK molekula (plazmida). Rice. 2. Slika polipleksa na supstratu dobijena transmisijskom elektronskom mikroskopom (podjela skale 200 nm).
Jedan od prvih polikationa koji se koristio za isporuku gena bio je poli-L-lizin (PL, sl. 3), koji je zbog svoje peptidne prirode biorazgradiv, što ga čini izuzetno pogodnim za upotrebu in vivo. Često, da bi se eliminisali neželjeni efekti povezani sa visokom površinskom gustinom naelektrisanja, koristi se kopolimer PL sa polietilen glikolom (PEG). Kao rezultat ove modifikacije, površinski naboj kompleksa se smanjuje, što sprječava nespecifičnu adsorpciju negativno nabijenih serumskih proteina na poliplekse, a također smanjuje citotoksičnost kompleksa.
Polietilenimin (PEI, sl. 3) smatra se jednom od najperspektivnijih opcija za polikatione za stvaranje polipleksa na njegovoj osnovi. PEI se sintetizira u dva oblika: linearni i razgranati. PEI ima veliki broj amino i imino grupa sposobnih za protonaciju, zbog čega pokazuje puferska svojstva u fiziološkim uslovima. Poliplekse na bazi PEI karakteriše efikasnija transfekcija i zaštita od delovanja nukleaza u odnosu na druge polikatione, što je povezano sa velikom gustinom naelektrisanja na PEI i kompaktnijim savijanjem DNK. Jak pozitivni naboj dovodi do toksičnosti PEI, što je, zajedno sa nedostatkom biološke degradacije PEI, ograničavajući faktor za upotrebu PEI in vivo. Kako bi se smanjila citotoksičnost, PEI je modificiran polietilen glikolom, koji ima nisku toksičnost i visoku hidrofilnost.
Rice. 3. Kationski polimeri koji se koriste za stvaranje polipleksa, i.
Drugi predstavnik polikationa koji se koristi za isporuku genetičkih informacija su poliamidoamini (PAMAM, sl. 3). Ova jedinjenja su visoko razgranati dendrimeri. Zahvaljujući grananju, PAMAM-ovi imaju veliku fleksibilnost, u većoj mjeri kompaktiraju DNK, a polipleksi bazirani na njima su stabilniji od svih ostalih. Njegova svojstva imaju mnogo zajedničkog sa PEI.
Hitozani (slika 3) su polisaharidi izgrađeni od D-glukozamina i N-acetil-D-glukozamina povezanih (1>4) glikozidnim vezama. U zavisnosti od molekularne težine i stepena deacetilacije, hitozani formiraju stabilne komplekse različitih veličina sa prenesenom DNK. Mali, ili obrnuto, preveliki polimeri hitozana dovode do smanjenja ekspresije prenesenog gena. Glavna prednost polipleksa na bazi hitozana je biorazgradivost.
Na efikasnost isporuke polipleksa utiču mnogi faktori: molekulska težina, stepen grananja, polimerizacija i vrsta polimera, veličina čestica, jonska jačina rastvora, površinski naboji kompleksa, kao i eksperimentalni uslovi. Optimalni pristup treba da uzme u obzir svaki od ovih faktora i njihov uticaj na svojstva kompleksa, unos kompleksa u ciljne ćelije i toksičnost.
Postoji nekoliko pristupa kojima se osigurava specifičnost djelovanja polipleksa na ciljne stanice. Jedan od njih uključuje ciljanu isporuku nanokompleksa određenim tipovima ćelija. Ovaj pristup je povezan sa dodatkom komponenata (liganda) polipleksima, receptori za koje su prisutni u velikim količinama na površini ciljnih ćelija. Kao specifični ligandi koriste se različiti proteini, šećeri, peptidi, antitijela itd. Druga strategija je korištenje prenosivih gena koji bi bili aktivni samo u određenim stanicama, dok se dostava kompleksa odvija nespecifično, odnosno u bilo koju ćeliju.
Penetracija polipleksa u ciljne ćelije
Proces isporuke genetskog materijala uključuje dvije faze: ekstracelularni (put od mjesta ubrizgavanja do ciljnih stanica) i intracelularni (interakcija sa ciljnim stanicama, endocitoza, izlazak iz endosoma, dostava u jezgro). Intracelularni transportni putevi polipleksa prikazani su na slici 4.
Prva barijera koju polipleks treba da savlada na svom putu do ciljne ćelije je krv i ekstracelularni matriks. Zbog toga je potrebno odabrati takve fizičko-hemijske parametre kompleksa kako bi se povećala njegova stabilnost, izbjegle nespecifične interakcije i mogućnost imunološkog odgovora. Prvo, DNK u polipleksu mora biti zaštićena od djelovanja ekstracelularnih nukleaza. Drugo, negativno nabijeni proteini krvnog seruma (albumin, fibrinogen, imunoglobulini, itd.), kao i proteini ekstracelularnog matriksa (kolageni) su u stanju da se adsorbiraju na površini nabijenih nanokompleksa, što dovodi do promjene površinskog naboja polipleksa. , što dovodi do povećanja veličine kompleksa i do njihove agregacije. Kada se polipleksi unesu u organizam, oni se djelimično akumuliraju u tkivima i podvrgavaju fagocitozi. Iz ovih razloga, lokalna primjena polipleksa (na primjer, u tumor kod raka) se često koristi na osnovu njihove nespecifične interakcije sa ćelijama tkiva.
Rice. 4. Intracelularni putevi za transport polipleksa.
Polipleksi se prvo adsorbiraju na plazma membranu, preuzimaju endocitozom, nakon čega moraju napustiti endolizozome i proći nuklearnu ovojnicu da bi ušli u jezgro. Postoje i alternativni transportni putevi koji ne dovode uvijek do isporuke kompleksa u nukleus. Osim toga, ekspresija prenesenog gena zahtijeva disocijaciju polipleksa na katjonski polimer i slobodnu DNK.
Sljedeća faza isporuke genetskog materijala ciljnim stanicama je njihova interakcija sa plazma membranom i apsorpcija od strane ćelije. Kao što je gore navedeno, vezivanje polipleksa za ćelije u odsustvu liganda javlja se nespecifično kao rezultat elektrostatičke interakcije sa negativno nabijenom plazma membranom. U većini slučajeva, takvi polipleksi se apsorbuju nespecifičnom adsorptivnom endocitozom. Ugrađivanjem liganda u kompleks, unos se može postići endocitozom posredovanom receptorom zavisnom od klatrina. Drugi putevi unosa zavise od tipa ćelije i uključuju fagocitozu i endocitozu zavisnu od kaveolina. Jedna strategija za poboljšanje ćelijske isporuke polipleksa uključuje upotrebu virusnih ulaznih peptida, kao što je TAT peptid, prvi izolovan iz virusa HIV-1. Upotreba ovih sekvenci osigurava da konstrukti uđu u ćeliju i isporuče poliplekse u ćelijsko jezgro.
Jedna od najvažnijih faza u transportnom putu polipleksa je njihov izlazak iz endosoma. Kao što je poznato, endosomi su sistem cijevi i vezikula, koji je neophodan za sortiranje apsorbiranih makromolekula. Endosomi za sortiranje nalaze se bliže plazma membrani. Zbog rada protonskih pumpi, njihov pH se smanjuje (oko 6,5 u sortiranju endosoma). Daljnji transport se može odvijati ili duž reciklažnog puta sa oslobađanjem apsorbovanih molekula u ekstramembranski prostor, ili duž litičkog puta, kada dolazi do daljeg zakiseljavanja sredine u kasnim endosomima, a makromolekule ulaze u lizosome. U lizosomima, sadržaj je zakiseljen do pH 5, a apsorbirani molekuli se razgrađuju hidrolitičkim enzimima koji se aktiviraju pri niskom pH. Produkti razgradnje uklanjaju se iz ćelije egzocitozom ili se prenose u citoplazmu, gdje se koriste kao građevinski materijal.
Vjeruje se da su polipleksi bazirani na PEI, zbog svojih svojstava, sposobni izaći iz endozoma zbog takozvanog “efekta protonskog spužve”. Ova hipoteza se temelji na činjenici da kationski polimeri, zbog prisustva neprotoniranih sekundarnih i tercijalnih amina, stvaraju efekat pufera, zbog čega H±ATPaza, koja pumpa protone u endosome, počinje aktivnije raditi. U ovom slučaju, anjoni hlora se akumuliraju unutar endosoma. Kao rezultat, dolazi do oticanja i lize zbog naglog povećanja osmotskog tlaka, što omogućava polipleksima da uđu u citosol netaknuti. Za poliplekse je predložen još jedan mehanizam za izlazak iz endosoma, koji uključuje destabilizaciju endosomalne membrane zbog velike površinske gustoće naboja nanokompleksa. Kompleksi na bazi PL i hitozana ne izazivaju efekat „protonskog sunđera“ i manje su sposobni da destabilizuju membranu endosoma, što dovodi do znatno niže efikasnosti transfekcije.
Napuštajući lizozome, polipleksi se nalaze u perinuklearnom prostoru, nakon čega se kompleks disocira u slobodni polikation i DNK. Vjeruje se da se to događa zbog nadmetanja za kationske grupe između fosfatnih grupa DNK i jedinjenja niske molekularne težine i anjona citoplazme. U nekim slučajevima dolazi do disocijacije kompleksa u jezgru. Glavna prepreka na putu plazmidne DNK u jezgro ćelije je dvostruka nuklearna ovojnica. Za isporuku makromolekula u jezgru, oni uključuju sekvencu nuklearne lokalizacije (NLS), koja će, u kombinaciji s α- i β-importinima, biti prepoznata od strane kompleksa nuklearnih pora (NPC) i aktivno prodrijeti u jezgro. Samo mali molekuli mogu proći kroz NPC pasivnom difuzijom (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.
Mehanizmi djelovanja terapijskih gena
Nakon što plazmid uđe u jezgro, počinje ekspresija terapeutskog gena. Da bi se dala specifičnost djelovanju polipleksa, terapeutski gen u plazmidu se stavlja pod kontrolu promotora (područje gena na koje RNA polimeraza slijeće prije transkripcije), koji je aktivan samo u tumorskim tkivima. Primjeri uključuju promotor gena za anti-apoptotički protein survivin ili gen za enzim telomerazu. Gen za timidin kinazu (HSVtk) virusa herpes simpleksa, koji ima sposobnost fosforilacije antiherpes jedinjenja aciklovir i ganciklovir, može se koristiti kao terapeutski gen. Ova jedinjenja se ubrizgavaju u tumor nakon nekog vremena. Zatim, ćelijske kinaze (fosforilirajući enzimi) pretvaraju fosforilirani aciklovir ili ganciklovir u trifosfate, koji su u stanju da se uključe u novosintetizovanu DNK tokom udvostručavanja tokom deobe ćelije i prekinu njenu sintezu. Kao rezultat toga, ćelije u čije jezgre je ušao gen timidin kinaze bivaju uništene u prisustvu ovih supstanci. U ovom slučaju umiru ćelije koje se dijele, a ne one u mirovanju, koje ne sintetiziraju DNK i ne uključuju ganciklovir ili aciklovir. Ovaj mehanizam djelovanja terapeutskog gena može se koristiti za gensku terapiju tumora raka čije se stanice brzo dijele.
Bibliografija:
- Gorbunova V.N., Baranov V.S. Uvod u molekularnu dijagnostiku i gensku terapiju nasljednih bolesti. S.-Pb., “Specijalna literatura”, 1997, str.287.
- Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monako L. Nanoskopska struktura DNK kondenzirane za isporuku gena. //Nucl. Kiseline. Res., 1997, vol. 25, 3095–3101.
- Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Trenutni status polimernih sistema za isporuku gena. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, vol. 58, 467–486.
- Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. i Stayton P. S. Dizajn i razvoj polimera za isporuku gena. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4,581.
- Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. Intracelularno usmjeravanje plazmidne DNK tokom nevirusnog prijenosa gena. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, vol. 57, 755–767.
- Maxfield F.R. i McGraw T.E. Endocitno recikliranje. // Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 2004, knj. 5, 121–132.
- Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. i Topal M.D. Umetanje i proširenje acikličkih, dideoksi i ara nukleotida herpesviridae, humanim alfa i humanim beta polimerazama. // J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 3898–3904.
Durymanov Mikhail, student Biološkog fakulteta Moskovskog državnog univerziteta
Članak je dobitnik nagrade naučno-popularnog takmičenja na konferenciji Lomonosov 2009. (Biološki fakultet, sekcije „Nanobiotehnologija”, „Bioinženjering”, „Biofizika”.
Uvod
1 Glavne grupe genetski modifikovanih enzima
1.1 Restrikcijski enzimi
1.1.1 Mehanizam djelovanja restrikcijskih enzima
1.1.2 Izrada mapa ograničenja
1.3 Ligaze
2 Uvođenje novog gena u ćeliju
2.1 Regulacija ekspresije gena kod prokariota
2.2 Metode za direktno uvođenje gena u ćeliju
2.3 Uvođenje gena u ćelije sisara
2.4 Genetička transformacija somatskih ćelija sisara
2.5 Genska terapija
2.6 Proizvodnja transgenih životinja
Zaključak
Bibliografija
Uvod
Genetski inženjering je in vitro konstrukcija funkcionalno aktivnih genetskih struktura (rekombinantna DNK), ili drugim riječima, stvaranje umjetnih genetskih programa (Baev A. A.). Prema E. S. Piruzyanu, genetski inženjering je sistem eksperimentalnih tehnika koje omogućavaju konstruiranje umjetnih genetskih struktura u laboratoriji (in vitro) u obliku takozvanih rekombinantnih ili hibridnih DNK molekula.
Riječ je o usmjerenoj, po unaprijed određenom programu, izgradnji molekularno genetskih sistema izvan tijela sa njihovim naknadnim unošenjem u živi organizam. U tom slučaju, rekombinantna DNK postaje sastavni dio genetskog aparata organizma primatelja i daje mu nova jedinstvena genetska, biohemijska, a zatim i fiziološka svojstva.
Cilj primijenjenog genetskog inženjeringa je dizajnirati takve rekombinantne DNK molekule koji bi, kada se unesu u genetski aparat, dali tijelu svojstva korisna za ljude.
Rekombinantna DNK tehnologija koristi sljedeće metode:
Specifično cijepanje DNK restrikcijskim nukleazama, ubrzavajući izolaciju i manipulaciju pojedinačnih gena;
Brzo sekvenciranje svih nukleotida u pročišćenom fragmentu DNK, što omogućava određivanje granica gena i sekvence aminokiselina koju on kodira;
Konstrukcija rekombinantne DNK;
Hibridizacija nukleinske kiseline, koja omogućava detekciju specifičnih RNA ili DNK sekvenci sa većom preciznošću i osetljivošću, na osnovu njihove sposobnosti da vežu komplementarne sekvence nukleinskih kiselina;
Kloniranje DNK: in vitro amplifikacija lančanom reakcijom polimeraze ili uvođenjem fragmenta DNK u bakterijsku ćeliju, koja nakon takve transformacije ovaj fragment reproducira u milionima kopija;
Uvođenje rekombinantne DNK u ćelije ili organizme.
Istorija genetskog inženjeringa
Genetski inženjering se pojavio zahvaljujući radu mnogih istraživača u raznim granama biohemije i molekularne genetike. Dugi niz godina proteini su se smatrali glavnom klasom makromolekula. Postojala je čak i pretpostavka da su geni proteinske prirode. Tek 1944. godine Avery, McLeod i McCarthy su pokazali da je DNK nosilac nasljednih informacija. Od tada počinje intenzivno proučavanje nukleinskih kiselina. Deceniju kasnije, 1953. godine, J. Watson i F. Crick kreirali su model dvolančane DNK. Ova godina se smatra godinom rođenja molekularne biologije.
Na prijelazu iz 50-ih u 60-e godine razjašnjena su svojstva genetskog koda, a do kraja 60-ih njegova univerzalnost je eksperimentalno potvrđena. Došlo je do intenzivnog razvoja molekularne genetike, čiji su objekti bili E. coli, njeni virusi i plazmidi. Razvijene su metode za izolaciju visoko pročišćenih preparata intaktnih DNK molekula, plazmida i virusa. DNK virusa i plazmida uneta je u ćelije u biološki aktivnom obliku, obezbeđujući njenu replikaciju i ekspresiju odgovarajućih gena. 70-ih godina otkriven je niz enzima koji kataliziraju reakcije konverzije DNK. Posebnu ulogu u razvoju metoda genetskog inženjeringa imaju restrikcijski enzimi i DNK ligaze.
Istorija razvoja genetskog inženjeringa može se podijeliti u tri faze. Prva faza je povezana sa dokazivanjem fundamentalne mogućnosti dobijanja rekombinantnih DNK molekula in vitro. Ovi radovi se tiču proizvodnje hibrida između različitih plazmida. Dokazana je mogućnost stvaranja rekombinantnih molekula korištenjem početnih molekula DNK iz različitih vrsta i sojeva bakterija, njihova održivost, stabilnost i funkcioniranje.
Druga faza je povezana sa početkom rada na dobijanju rekombinantnih DNK molekula između hromozomskih gena prokariota i različitih plazmida, čime se dokazuje njihova stabilnost i održivost.
Treća faza je početak rada na uključivanju eukariotskih gena, uglavnom životinja, u vektorske molekule DNK (DNK koja se koristi za transfer gena i sposobna da se integriše u genetski aparat ćelije primaoca).
Formalno, datumom rođenja genetskog inženjeringa treba smatrati 1972. godinu, kada su na Univerzitetu Stanford P. Berg, S. Cohen, H. Boyer i saradnici stvorili prvu rekombinantnu DNK koja sadrži fragmente DNK virusa SV40, bakteriofaga i E. coli .
1 Glavne grupe genetski modifikovanih enzima
Genetski inženjering je potomak molekularne genetike, ali svoje rođenje duguje uspjesima genetske enzimologije i hemije nukleinskih kiselina, budući da su enzimi alati za molekularnu manipulaciju. Iako ponekad možemo raditi sa ćelijama i ćelijskim organelama koristeći mikromanipulatore, čak ni najmanji mikrohirurški instrumenti neće pomoći pri radu s DNK i RNK makromolekulama. sta da radim? Enzimi djeluju kao „skalpel“, „makaze“ i „konac za šivanje“.
Samo oni mogu pronaći određene nukleotidne sekvence, "isjeći" tamo molekul ili, obrnuto, "zakrpati" rupu u lancu DNK. Ovi enzimi već dugo rade u ćelijama, vršeći rad na replikaciji DNK (udvostručavanju) tokom ćelijske deobe, popravljanju oštećenja (vraćanje integriteta molekula), u procesima čitanja i prenosa genetskih informacija iz ćelije u ćeliju ili unutar ćelija. Zadatak genetskog inženjera je da odabere enzim koji bi ispunio postavljene zadatke, odnosno bio u stanju da radi sa određenim delom nukleinske kiseline.
Treba napomenuti da enzimima koji se koriste u genetskom inženjeringu nedostaje specifičnost vrste, tako da eksperimentator može kombinovati fragmente DNK bilo kojeg porijekla u sekvenci po svom izboru u jednu cjelinu. Ovo omogućava genetskom inženjeringu da prevaziđe barijere vrsta koje je uspostavila priroda i izvrši međuvrsto ukrštanje.
Enzimi koji se koriste u izgradnji rekombinantne DNK mogu se podijeliti u nekoliko grupa:
Enzimi koji proizvode DNK fragmente (restrikcijski enzimi);
Enzimi koji sintetiziraju DNK na DNK šablonu (polimeraze) ili RNK (reverzne transkriptaze);
Enzimi koji povezuju fragmente DNK (ligaze);
Enzimi koji dozvoljavaju promjene u strukturi krajeva fragmenata DNK.
1.1 Restrikcijski enzimi
Općenito je prihvaćeno da su pojmovi “restrikcioni enzim”, “restrikciona endonukleaza” i “endodeoksiribonukleaza specifična za mjesto” sinonimi.
Sve bakterijske restrikcijske endonukleaze prepoznaju specifične, prilično kratke sekvence DNK i vezuju se za njih. Ovaj proces je praćen rezanjem molekule DNK ili na samom mjestu prepoznavanja ili na nekom drugom mjestu, što je određeno vrstom enzima. Uz restrikcijsku aktivnost, bakterijski soj ima sposobnost metiliranja DNK; Ovaj proces karakterizira ista specifičnost DNK sekvence kao i restrikcija. Metilaza dodaje metilne grupe ostacima adenina ili citozina na istom mjestu gdje se veže restrikcijski enzim. Kao rezultat metilacije, mjesto postaje otporno na ograničenja. Stoga, metilacija štiti DNK od rezanja.
Postoje 3 glavne klase restrikcijskih enzima: 1, 2 i 3.
Svi restrikcijski enzimi prepoznaju striktno definirane sekvence na dvolančanoj DNK, ali restrikcijski enzimi klase 1 prave lomove na proizvoljnim mjestima u molekuli DNK, a restrikcijski enzimi klase 2 i 3 prepoznaju i cijepaju DNK na strogo određenim mjestima unutar mjesta prepoznavanja ili na lokacija fiksna od njih udaljenosti.
Enzimi tipa 1 i 3 imaju složenu strukturu podjedinica i imaju dvije vrste aktivnosti - modificiranje (metiliranje) i endonukleazu zavisnu od ATP.
Enzimi klase 2 sastoje se od 2 odvojena proteina: restrikcijske endonukleaze i modificirajuće metilaze; stoga se u genetskom inženjeringu koriste samo enzimi klase 2. Oni zahtevaju jone magnezijuma kao kofaktore.
Trenutno je izolovano više od 500 restrikcijskih enzima klase 2, ali među enzimima izoliranim iz različitih mikroorganizama postoje i oni koji prepoznaju iste sekvence na DNK. Takvi parovi ili grupe nazivaju se izošizomeri. Pravi se razlika između prave izošizomerije, kada enzimi prepoznaju istu sekvencu nukleotida i razbijaju DNK na istim tačkama, i lažne, kada enzimi, prepoznajući isto mjesto na DNK, proizvode lomove na različitim mjestima unutar istog mjesta.
Većina restrikcijskih enzima klase 2 prepoznaje sekvence koje sadrže od 4 do 6 parova nukleotida, stoga se restrikcijski enzimi dijele na male i velike. Mali restrikcijski enzimi prepoznaju tetranukleotide i uvode mnogo više prekida u molekule nego restrikcijski enzimi velikih rezova, koji prepoznaju sekvencu od šest nukleotidnih parova. To je zbog činjenice da je vjerovatnoća pojave određene sekvence od četiri nukleotida mnogo veća nego kod sekvence od šest nukleotida. Na primjer, DNK bakteriofaga T7, koji se sastoji od 40.000 parova baza, nema sekvencu koju prepoznaje restrikcijski enzim R1 iz E. coli.
Restrikcijski enzimi Hpa II i Alu (iz Arthrobacter luteus) su oni koji se malo cijepaju, a Eco R I (iz Escherichia coli) i Hind III su oni koji se cijepaju velikim. Ako pretpostavimo da su mjesta za prepoznavanje restrikcijskih enzima nasumično raspoređena duž lanca DNK, tada bi se meta za enzime koji prepoznaju sekvencu (mjesto) od četiri nukleotida trebala pojaviti u prosjeku jednom na svakih 256 baznih parova, a za enzime koji prepoznaju šest nukleotida - svakih 4096 baza. parovi. Ako je restrikcijsko mjesto unutar gena, tada će tretman s DNK restrikcijskim enzimom dovesti do njegove inaktivacije. Vjerovatnoća takvog događaja je vrlo visoka kada se liječi restrikcijskim enzimima s malim rezom, a beznačajna kada se koriste endonukleaze velikih rezova. Stoga, da bi se dobio intaktni gen, cijepanje se vrši naizmjenično s nekoliko restrikcijskih enzima velikih rezova, ili se koristi tehnika “podrestrikcije”, tj. restrikcija se provodi pod uslovima u kojima se cijepanje događa samo na jednom mjestu.
8860 0
Trenutno je poznato oko 40 različitih metoda isporuke rekombinantne DNK u ćelije, koje rješavaju problem prolaska kroz plazma membranu na različite načine. Još ne postoji jedinstvena klasifikacija metoda za isporuku rekombinantne DNK u ćelije. Svaki autor recenzije klasifikuje na svoj način, možda zato što za mnoge empirijski pronađene metode mehanizam prevladavanja membrane još uvijek nije jasan, na primjer, za transformaciju. Postoji i nesigurnost u pogledu terminologije, što nije iznenađujuće u brzom razvoju nove oblasti nauke i prakse.
Svaki metod unošenja strane DNK u ćelije ima svoje karakteristike, prednosti i nedostatke u smislu opstanka ćelije, efikasnosti administracije, svestranosti i mogućnosti tehničke implementacije. Izbor metode zavisi od vrste ćelija domaćina i tipa korišćenog vektora, kao i od ličnih preferencija i mogućnosti eksperimentatora. Neke od najpoznatijih metoda isporuke DNK ciljnim stanicama detaljno su razmotrene u nastavku.
Transformacija u svom najopštijem smislu je proces uvođenja slobodne DNK u ćeliju. U užem smislu, termin se uglavnom primjenjuje na bakterije, označavajući proces preuzimanja rekombinantne DNK od strane kompetentnih stanica, induciran temperaturnom faznom tranzicijom stanične membrane. E. coli je najčešći organizam kada se radi sa rekombinantnom DNK, a da bi se osiguralo uvođenje plazmidne DNK u ćelije, ćelije se inkubiraju sa ledeno hladnim rastvorom CaCl2 i DNK, a zatim toplotnim šokom na 42°C u trajanju od ~1 min. .
Očigledno, kao rezultat takvog tretmana dolazi do lokalnog uništenja stanične stijenke. Efikasnost transformacije, koja se definiše kao broj transformanata po 1 μg dodane DNK,
u ovom slučaju to je otprilike 10.000 - 10.000.000. Efikasnost ove metode je niska, približno manje od 0,1% ćelija se transformiše, ali se ovaj nedostatak nadoknađuje korišćenjem šema selekcije koje omogućavaju da se željeni klonovi brzo identifikuju.
Ćelije koje mogu apsorbirati strani DNK nazivaju se kompetentnim. Udio ovih ćelija u populaciji je obično vrlo mali, ali se može povećati upotrebom posebnog hranljivog medijuma, uslova kulture i hemijskih induktora kompetencije (odabranih, po pravilu, empirijski). Često korištena faza u pripremi kompetentnih stanica je proizvodnja sferoplasta - ćelija djelomično ili potpuno (protoplasti) bez vanjskog krutog ćelijskog zida.
Na primjer, ovo je jedini način za efikasnu transformaciju mnogih gram-pozitivnih bakterija iz rodova Bacillus, Listeria, Streptommyces, itd. Neke metode transformacije kvasca uključuju i faze enzimskog uklanjanja ćelijskog zida kvasca pomoću glukozidaza. Za organizme koji su otporni na hemijske induktore sposobnosti ili nemaju prirodnu kompetenciju, koriste se drugi sistemi za isporuku DNK.
Konjugacija. Postoje bakterijski plazmidi (konjugativni plazmidi) koji imaju sposobnost stvaranja međustaničnih kontakata, kroz koje prelaze iz jedne ćelije u drugu. Formiranje kontakata između stanica donora i primaoca osigurano je konjugativnim svojstvima plazmida, a sam prijenos DNK osiguran je mobilizacijskim svojstvima. U ovom slučaju, konjugativni plazmid može sa sobom nositi regularni plazmidni vektor koji se nalazi u istoj ćeliji.
Na ovaj način moguće je transformisati ćelije primaoca koje je teško transformisati drugim sredstvima. Na primjer, prikazan je mobilizacijski prijenos šatl vektora pAT187 sa širokim spektrom domaćina iz E. coli u različite gram-pozitivne bakterije (rod Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus, itd.), iako sa mnogo manjom efikasnošću nego za prijenos između različiti sojevi E. coli.
Štoviše, nedavno je dokazana mogućnost konjugativnog prijenosa DNK iz bakterijskih stanica u kultivirane životinjske stanice. Tokom procesa konjugacije, prenosi se samo jedan lanac donorskog plazmida, na kojem se zatim sintetiše drugi lanac. Ovo rezultira time da konjugativno preneseni plazmid nije napadnut restrikcijskim enzimima domaćina. Efikasnost ove metode za bakterije je uporediva sa transformacijom.
Virusna infekcija. Za uvođenje vektora baziranih na virusima, naširoko se koristi prirodni infektivni put infekcije ćelije domaćina, koji ovisi o vrsti virusa.
Metode perforacije. Jedna od popularnih metoda za uvođenje nukleinskih kiselina u ciljne ćelije je elektroporacija - privremeno stvaranje pora u dvoslojnoj lipidnoj membrani pod kratkim utjecajem električnog polja. To je univerzalna fizička metoda transformacije, čija je tehnika razvijena za gotovo sve vrste stanica.
Prilikom rada sa E. coli, pripremljena ćelijska suspenzija (~50 μl) i DNK se stavljaju između elektroda i primjenjuje se jednostruki strujni impuls u trajanju od ~4,5 ms na naponu od 1,8 kV, razmak između elektroda je 1 mm. Nakon takvog tretmana, efikasnost transformacije se povećava na 109-1011 za male plazmide (~3-6 kb) i na 106 za velike (~135 kb). Slični uslovi se koriste za uvođenje BAC vektora u E. coli.
Čini se da elektroporacijski efekat visokonaponskog pražnjenja na dvoslojnu lipidnu membranu zavisi od njenog radijusa zakrivljenosti. Prema tome, male bakterijske ćelije efikasno apsorbuju DNK pri mnogo većoj jačini polja (12-18 kV/cm) od velikih životinjskih i biljnih ćelija, koje efikasno apsorbuju DNK pri jačini polja od 1-2 kV/cm. Elektroporacija je najjednostavniji, najefikasniji i ponovljiviji način uvođenja DNK molekula u ćelije, za koji je, međutim, potreban poseban elektroporator.
Ostale metode perforacije za unošenje DNK u ćelije: ultrazvuk ćelija, struganje ćelija sa supstrata u prisustvu egzogenog materijala, centrifugiranje ćelija u medijumu sa DNK u kombinaciji sa elektroporacijom, osmotska perforacija plazma membrane, razbijanje ćelije laserom microbeam, upotreba toksina koji stvara pore streptolizin-O.
Transfekcija. U početku je ovaj izraz značio uvođenje virusne DNK u ćelije, a sada se njegovo značenje proširilo na uvođenje bilo koje strane DNK u eukariotske ćelije. Izraz "transformacija", koji se odnosi na proces uvođenja DNK u ćeliju za prokariote i kvasac, pokazao se nezgodnim za korištenje, jer je u odnosu na životinjske stanice transformacija normalnih stanica u kancerogene. U užem smislu, transfekcija se uglavnom odnosi na uvođenje DNK u eukariotske ćelije upotrebom različitih hemijskih reagensa.
Jedna od prvih razvijenih metoda za efikasnu transfekciju bila je inkubacija DNK sa DEAE-dekstranom. Dobivena efikasnost bila je uporediva sa bakterijskom transformacijom i dostigla je 106 transfektanata po μg DNK.
Mehanizam djelovanja DEAE-dekstrana nije u potpunosti utvrđen, ali je poznato da se veže za DNK i ćelijsku membranu, stimulirajući pinocitozu (slika 2.8), iako ga ćelije ne preuzimaju. Nedostaci metode uključuju toksičnost DEAE-dekstrana za neke vrste ćelija, ovisnost djelotvornosti o kvaliteti lijeka i vrlo nisku učestalost dobivanja stabilnih transfektanata.
Rice. 2.8. Šema uvođenja DNK kao dijela različitih kompleksa u ćeliju endocitozom: fagocitoza i pinocitoza (a). Šematski prikaz čestice nelipidnog polikationa u dendroformu sa vezanom DNK, čiji je negativni naboj kompenziran kationskim polimerom (b)
Efikasnost transfekcije je povećana 10-100 puta inkubacijom ćelija sa DNK precipitiranom kalcijum fosfatom. Guste čestice precipitata kalcijumove DNK ćelija apsorbuje fagocitozom (slika 2.8), ali samo mali deo penetriranih molekula dospeva u jezgro i integriše se u hromozomsku DNK. Metoda kalcijum fosfata je efikasnija i jeftinija, ali uzrokuje lomljenje DNK molekula, što pretvara kružne molekule u linearni oblik, ponekad neinfektivan u slučaju virusne transfekcije. Osim toga, uslovi za transfekciju kalcijum fosfata moraju se odabrati pojedinačno za svaku ciljnu ćeliju.
Tokom potrage za drugim reagensima za transfekciju, otkriveno je da molekuli polimera koji nose višak katjonskog naboja mogu značajno povećati efikasnost transfekcije. Polimerni kationi formiraju stabilne komplekse sa neutralizovanim nabojem sa nukleinskim kiselinama, koje mogu sa visokom efikasnošću transportovati DNK i RNK u ćeliju, štiteći ih od delovanja endonukleaza na putu do jezgra (slika 2.9).
Rice. 2. 9. Šema transporta DNK u ćelijsko jezgro kao dio polikation-DNK kompleksa vezanog za specifični ligand endocitozom posredovanom ligandom
Sintetički nelipidni polimerni kationi u linearnim ili razgranatim konformacijama (dendritski oblik) mogu kondenzirati DNK i RNK u relativno male čestice, koje se zatim vežu za staničnu membranu i ulaze u ćeliju nespecifičnom endocitozom. Trenutno se za transfekciju iz grupe nelipidnih polikationa uglavnom koriste polietilenimin, poliamidoamini i dendrimeri na njihovoj osnovi, kationski proteini kao što su polilizin, protamin i histoni, kao i razni komercijalni proizvodi, poput PAMAM-a.
Revolucija je bila uvođenje u praksu prvog niskotoksičnog kationskog lipida DOTMA (1,2-dioleil-3-N,N,N-trimetilaminopropan), koji su sintetizirali Feigner (1987) i sar. Efikasnost transfekcije upotrebom katjonskog lipida (slika 2.10) bila je približno 100 puta veća od bilo kojeg drugog hemijskog reagensa, sa visokim udjelom stabilnih transgenih ćelija.
Rice. 2. 10. Struktura kompleksa sa DNK (a) i opšta struktura katjonskog lipidnog polimera (b). Kationski lipidni polimeri (linearni i razgranati), slični po strukturi i svojstvima fosfolipidima stanične membrane, formiraju komplekse sa DNK u obliku višeslojnih kationskih liposoma (a) jednostavnim miješanjem reagensa. Takvi kompleksi ulaze u ćeliju endocitozom ili fuzijom sa ćelijskom membranom kroz lipidni dio
Istovremeno, u praksu je uveden novi termin „lipofekcija“, koji naglašava visoku efikasnost genetske transformacije ćelija, približavajući komplekse lipid-kationa infektivnim virusnim česticama.
Nadovezujući se na ovaj uspjeh, razvijene su brojne varijacije ovih spojeva (lipofectin, lipofectamine, cellfectin, itd.).
Paralelno, razvijena su sredstva za isporuku na bazi fosfolipidnih liposoma ispunjenih DNK ili RNK.
Male sfere umjetnih membrana mogu se stopiti sa plazma membranama stanica ili se preuzimaju endocitozom, oslobađajući sadržaj u ćeliju. Niska efikasnost transfekcije liposoma povećana je uvođenjem fosfolipida u strukturu liposoma, na primjer, kardiolipina i fosfatidiletanolamina, koji uz dvoslojne membrane formiraju i obrnute micelarne strukture, poznate kao kubične i heksagonalne faze, sposobne inicirati membrane. fuzija.
Metoda liposoma je prilično hirovita i zahtijeva pažljiv odabir svih uslova za efikasnu transfekciju specifičnih ćelija. Osim toga, postupak inkapsulacije, obično ultrazvuk, često oštećuje velike molekule DNK.
Nova faza u razvoju transfekcionih reagensa bio je razvoj efikasnije i ciljanije isporuke nukleinskih kiselina specifičnim ciljnim ćelijama uvođenjem različitih liganda u strukturu sintetičkih transfekcionih reagensa i liposoma za vezivanje za proteine membranskog receptora. Prisustvo takvih ciljanih grupa (liganda), koje prepoznaju ćelijski receptori, omogućava upotrebu mehanizama endocitoze posredovanih ligandom (vidi sliku 2.9).
Proteini i peptidi koje prepoznaju receptori koriste se kao takvi ligandi; oligosaharidi, budući da se na površini mnogih životinjskih stanica nalaze lektini - receptorski proteini koji ih specifično vežu; polisaharidi. Procesi interakcije sa ćelijama takvih ciljanih DNK (RNA)-transfekcionih kompleksa reagensa su slični prodiranju virusnih čestica u ćeliju.
Trenutno, biotehnološke kompanije nude širok spektar različitih transfekcionih reagensa - od najjednostavnijih i najjeftinijih do najnovijih dostignuća, specijalizovanih za različite tipove ćelija i zadatke. Intenzivno je u toku i stvaranje novih, još efikasnijih reagensa za transfekciju.
Mikroinjekcija - ćelijska membrana se probuši mikroiglom i otopina koja sadrži DNK se ubrizgava u citoplazmu ćelije ili direktno u jezgro ako je jezgro dovoljno veliko (na primjer, jezgro jajeta). Mikroinjekcija DNK u stanice sisara postala je moguća pojavom uređaja za proizvodnju mikropipeta promjera 0,1-0,5 μm i mikromanipulatora. Metoda je vrlo efikasna, udio ćelija sa stabilnom integracijom i ekspresijom ubrizganih gena može dostići 50%. Prednost opisane metode je i to što vam omogućava da unesete bilo koju DNK u bilo koju ćeliju i nije potreban selektivni pritisak za održavanje unesenog gena u ćelije.
Balistička transfekcija, biobalistika ili biolistika (bombardiranje mikročesticama), zasniva se na bombardovanju ćelija mikrosferama veličine oko 1-2 mikrona prekrivenim DNK. Koriste se mikročestice zlata, volframa (ponekad fitotoksične), silikona i razne sintetičke nanosfere. Mikročestice obložene DNK prolaze kroz ćelijske slojeve i prenose genetski konstrukt direktno u organele i ćelijska jezgra. „Genski pištolj“ ili „genski pištolj“ kreiran za ovu svrhu, koji je razvio J. Sanford 1987. godine za uvođenje DNK u zrna žitarica, po dizajnu je sličan vazdušnim puškama (slika 2.11).
Rice. 2.11. Uvođenje rekombinantne DNK u listove biljaka korištenjem "genskog pištolja" kompanije Bio-Rad (a) i njegove opće sheme (b). Impuls helijuma izbacuje mikročestice obložene DNK ili RNK iz kapsule uzorka. Mikročestice koje nose DNK se ubrzavaju i fokusiraju radi maksimalnog prodora u ćelije, krećući se duž kanala za ubrzanje i duž cijevi pištolja, dok na širokom izlazu tok helija difuzno divergira u strane. Razmakni filter održava optimalnu udaljenost cilja dok maksimizira uklanjanje helija kako bi se minimizirali štetni efekti na površini ćelija
Dubina prodiranja mikročestica je u pravilu mala - do 1 mm, međutim, pod posebnim uvjetima pečenja, mikročestice mogu prodrijeti u tkivo do dubine od 4-5 mm i prenijeti gene, na primjer, u vlakna prugasto-prugastih mišića. . Balistička transfekcija je vrlo efikasna čak i tamo gdje su debeli ćelijski zidovi (kvasac, biljke) prepreka mnogim drugim metodama isporuke, a koristi se uključujući tkiva, organe, pa čak i cijele organizme. Trenutno se široko koristi u genskoj terapiji za proizvodnju transgenih životinja i biljaka.
Ova raznolikost transfekcionih alata i metoda uzrokovana je različitim zadacima, širokim spektrom korišćenih ciljnih ćelija i vrstama nukleinskih kiselina koje se isporučuju u ćelije, kao i potrebama društva za dobijanjem sve efikasnijih sredstava za isporuku genetskih informacija ćelijama, tkivima i čitavih organizama. Posebna pažnja posvećena je razvoju transfekcionih reagensa i metoda u vezi sa zadivljujućim izgledima humane genske terapije, koja zahteva ciljana, visokoefikasna i sigurna sredstva za isporuku gena.
Stabilno i prolazno unošenje strane DNK u ćeliju. Nakon unošenja rekombinantne DNK u eukariotsku ćeliju, samo mali dio iste završava u jezgri, budući da je nuklearna membrana teška barijera stranoj DNK. U jezgri se rekombinantna DNK može integrirati u hromozom ili postojati neko vrijeme u ekstrahromozomskom stanju.
Shodno tome, razlikuje se između stabilne transfekcije, kada se rekombinantna DNK integriše u hromozome ćelija primaoca i postaje njihov sastavni deo, kao i privremene, ili prolazne transfekcije, u kojoj rekombinantni molekuli DNK postoje i transkribiraju se u jezgrima u ekstrahromozomsko stanje za kratko vreme. Stabilno nasljeđivanje unesene strane DNK je glavni uslov za dobijanje transgenih organizama u ekonomske svrhe.
Stoga se posebna pažnja poklanja razvoju metoda za uvođenje DNK u ćelije koje dovode do proizvodnje većeg udjela stabilnih transformanata. Osim toga, veliki postotak stabilnih transformanata omogućava i napuštanje selektivnih i markerskih gena, koji su balast u stvaranju transgenih organizama.
NA. Voinov, T.G. Volova
Pronalazak se odnosi na oblast biotehnologije, posebno na metodu za ciljanu isporuku DNK u tumorske i matične ćelije koje eksprimiraju CXCR4 receptor. Predloženi pronalazak može se koristiti za ciljanu isporuku genetskih konstrukata u matične i maligne tumorske ćelije u svrhu korekcije genskih defekata i prevencije bolesti. Metoda uključuje pripremu nosača genetskih konstrukata uključivanjem u sastav molekula nosača, a to je sekvenca koja se vezuje za DNK od osam aminokiselinskih ostataka lizina - KKKKKKKK, signalne sekvence. Povezivanje signalne sekvence sa sekvencom koja se vezuje za DNK se vrši korišćenjem regiona linkera od dva molekula ε-aminoheksanoične kiseline. Zatim se formiraju kompleksi DNK/nosač. Transfekcija se zatim provodi in vitro. Predloženi pronalazak omogućava povećanje efikasnosti isporuke gena od interesa u tumorske i matične ćelije. 2 plate f-ly, 4 il.
Pronalazak se odnosi na gensku medicinu, gensku terapiju, biotehnologiju i farmaceutske proizvode i može se koristiti za ciljanu dostavu genetskih konstrukata u matične i maligne tumorske ćelije u svrhu korekcije genskih defekata i prevencije bolesti. Tkivna specifičnost isporuke genskih konstrukata je obezbeđena upotrebom signalnih sekvenci za CXCR4 receptor, koji se eksprimuje u ćelijama ovog tipa.
Ono po čemu se genska terapija razlikuje od pristupa tradicionalne medicine je njen fokus na suzbijanje uzroka bolesti, a ne na simptome i posljedice. Trenutno se razvijaju pristupi genskoj terapiji za liječenje ili prevenciju širokog spektra ljudskih bolesti. Ovi pristupi mogu biti primjenjivi za in vivo i ex vivo terapiju. Terapija in vivo se zasniva na direktnom uvođenju genetskih konstrukata direktno u tjelesna tkiva. Isporuka može biti intravenska pomoću aerosolnih nebulizatora ili injekcija u određena tkiva. Ex vivo genska terapija temelji se na izolaciji određene vrste ćelija iz tijela, uvođenju „terapijskog“ genskog konstrukta u njih, selekciji transficiranih stanica i naknadnoj reimplantaciji u pacijenta.
Postoje tri glavna pravca u pristupima isporuci genetskih konstrukata koji se trenutno razvijaju:
1) kloniranje kao deo virusnih vektora;
2) korišćenje metoda fizičke transfekcije;
3) upotreba kompleksa vektora ekspresije plazmida i nevirusnih molekula nosača.
Prenos posredovan virusom je visoko efikasna metoda isporuke DNK ciljnim ćelijama, budući da je penetracija modifikovanog virusnog vektora slična procesu koji se dešava prirodno kada se virusni genom prenese u ćelije domaćina. Najviše proučavani su vektori stvoreni na bazi retro-, adeno- i adeno-asociranih virusa. Prednosti virusa uključuju, prije svega, kombinaciju svojstava ekspresijskog vektora i nosača, mogućnost specifične isporuke, sposobnost transfekcije ćelija koje se dijele i koje se ne dijele, te sposobnost integracije DNK u hromozom za osigurati dugotrajno izražavanje. Zbog ovih prednosti, ovaj pristup se još uvijek široko koristi u istraživanju isporuke gena, iako ima neke nedostatke. Retro- i adeno-povezani virusi imaju ograničenu veličinu kloniranog DNK fragmenta i rizik od insercione mutageneze kada je virus integriran u genom domaćina. Ozbiljan nedostatak adenovirusnih vektora je izražen imuni odgovor na visoke doze i ponovljena primjena adenovirusnih konstrukta (Walther W., Stein U. Virusni vektori za prijenos gena: pregled njihove upotrebe u liječenju ljudskih bolesti // Drugs. - 2000. - v.60 - P.249-271, RF patent br. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, objavljeno 20. 05. 2005.).
Injekcija golih plazmidnih DNK konstrukata bio je jedan od prvih pristupa u razvoju strategija liječenja genskom terapijom. Niska efikasnost transfekcije upotrebom gole DNK potaknula je razvoj novih metoda za isporuku genetskih konstrukata. Proučavane su različite fizičke metode isporuke DNK u tjelesne ćelije. Najpopularnije među njima su balistička metoda transfekcije i elektroporacija, koje se široko koriste za transfekciju stanica kože i mišića. Metoda balističke transfekcije zasniva se na prodiranju u ćeliju DNK nanijete na mikročestice zlata ili volframa. Transfekcija se dešava pod pritiskom struje komprimovanog gasa ili tečnosti. Metoda elektroporacije temelji se na lokalnoj promjeni električnog potencijala stanične membrane uslijed izlaganja električnoj struji. Električni impulsi dovode do stvaranja pora u ćelijskoj membrani, čineći je propusnom za biomolekule. Da bi se prevazišla niska efikasnost transfekcije gole DNK in vivo, takođe se koristi metoda hidrodinamičkog šoka - intravenska ili intraarterijska primena vektora plazmida u rastvoru velike zapremine. Glavni nedostaci postojećih metoda fizičke transfekcije su niska efikasnost i lokalnost efekta isporuke DNK. Oni omogućavaju plazmidu da prevlada staničnu membranu i izbjegne uključivanje u endozome, čime se sprječava enzimska degradacija, ali, po pravilu, ne osiguravaju dugotrajnu perzistenciju uvedenih genetskih konstrukata (Wels D.J. napredak i izgledi genske terapije: elektroporacija i dr. fizičke metode // Gene Ther. - 2004. - v.11, br. 18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. Dostava DNK na kožu bombardiranjem česticama // Metode Mol Biol. - 2004. - v. 245. - P.185-196;Herweijer H., Wolff J.A. Napredak i izgledi: transfer gena i terapija gole DNK // Genska terapija - 2003. - v.10, br. 6. - P .453-458).
Nosioci koji nisu virusi su alternativa virusom posredovanom prijenosu genetskih konstrukata u stanice sisara. Nosioci koji nisu virusi se lako sintetiziraju, a lakoća njihove modifikacije omogućava promjenu strukture i sastava molekula, čime se poboljšavaju transportni nosači. Kada se koriste nevirusni nosači, ne postoje ograničenja u pogledu veličine isporučenog ekspresijskog vektora. Osim toga, manje su toksični, u većini slučajeva ne izazivaju specifičan imunološki odgovor i sigurniji su za upotrebu in vivo u odnosu na virusne vektore. Stoga se uvođenje genetskog konstrukta upakovanog u nevirusne nosače može ponoviti. Proučavanje nevirusnih nosilaca razvija se u pravcu poboljšanja transfekcionih svojstava plazmidne DNK formiranjem DNK kompleksa sa različitim sintetičkim jedinjenjima (lipidima, oligo- i polipeptidima, polimeri, itd.) (npr. RF patent br. 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, objavljeno 20. 10. 2008.). Poboljšanje nevirusnih sredstava za isporuku u velikoj mjeri zavisi od detaljnog razumijevanja barijera za prodiranje DNK u ćelije tijela (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Nevirusni i hibridni vektori u humanoj genskoj terapiji: an ažuriranje // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, br. 2. - P.67-72 Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vektori i sistemi isporuke u genskoj terapiji // Med Sci Monit. - 2005. - v .11, br. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barijere za nevirusnu isporuku gena // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, br. 2. - P.203-217).
Smatra se da ne-virusni nosilac mora imati sljedeće karakteristike:
1) da budu netoksični, kompaktni i da štite plazmidnu DNK od enzimske degradacije, te da se nakon upotrebe izlučuju iz organizma;
2) osigurati prodor plazmida u ćeliju specifičnim vezivanjem za plazma membranu ćelije:
3) imaju sposobnost oslobađanja DNK iz endosomalnog kompartmenta;
osigurati disocijaciju DNK iz kompleksa za naknadni transport plazmida u jezgro.
Za potrebe genske terapije, najpoželjnija metoda isporuke genetskih konstrukata je njihov tkivno-specifičan prijenos u ćelije i tkiva tijela.
Prva prepreka intracelularnom prodiranju kompleksa je plazma membrana. Većina kompleksa stupa u interakciju sa površinom ćelije pomoću elektrostatičkih sila. Mogući mehanizam za vezivanje kompleksa za ćeliju je njihova interakcija sa proteinima površine ćelije - glikozaminoglikanima. Međutim, kod ovog mehanizma prodiranja u komplekse nema tkivno specifičnog transfera genskih konstrukata. Istovremeno, problem tkivno-specifične isporuke genetskih konstrukata je relevantan za gensku terapiju niza bolesti. Za specifičnu interakciju sa površinom ćelije, kompleksi uključuju ligande za receptore na površini ćelije. Određeni broj integrinskih peptidnih liganada je sada okarakterisan. To uključuje, posebno, tripeptidni fragment RGD (integrini su prisutni na površini mnogih ćelija), transferin (njegov receptor ima povećanu ekspresiju u proliferirajućim ćelijama), asialorosomucoid (asialoglikoproteinski receptor ima specifičnu ekspresiju u hepatocitima jetre).
Za specifičnu dostavu genetskog materijala nervnim ćelijama, Zeng i kolege su predložili korišćenje nosača koji se sastoji od signalnog regiona za TrkA receptor (80-108 aminokiselina iz nervnog faktora rasta) i sekvence od 10 lizinskih aminokiselinskih ostataka koja se vezuje za DNK. Ovaj nosač je, u prisustvu endosomolitičkog agensa hlorokina, koji pospešuje oslobađanje kompleksa iz endosomalnog kompartmenta ćelije, bio u stanju da tkivno specifično isporuči marker gen samo u ćelije sa ekspresijom TrkA receptora. Ovaj nosač se može koristiti za gensko terapijsko liječenje različitih neuroloških bolesti, kao što su epilepsija, Parkinsonova i Alchajmerova bolest. Međutim, nije pogodan za isporuku genetskog materijala drugim tipovima ćelija (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S A sintetički peptid koji sadrži petlju 4 faktora nervnog rasta za ciljanu isporuku gena // J Gene Med 2004; 6: 1247 -1256).
Ljudske matične ćelije smatraju se obećavajućim agensima za ćelijsku i gensku terapiju različitih ljudskih bolesti. Istovremeno, one su jedna od najtežih vrsta ćelija za transfekciju. U liječenju karcinoma genskom terapijom potrebno je osigurati isporuku gena direktno u tumorske ćelije.
CXCR4 je receptor za faktor migracije matičnih ćelija hemokin SDF-1α. CXCR4 se eksprimira u hematopoetskim ćelijama, vaskularnom endotelu i mišićnim satelitskim ćelijama. Visok nivo ekspresije ovog gena zabeležen je kod više od 20 tipova tumora raka (rak dojke, rak prostate, itd.), kao i kod migrirajućih matičnih ćelija. CXCR4 receptor je takođe sposoban da se veže za virusni hemokin vMIP-II (Kaposijev sarkom virus). Stoga je uključivanje signalnih sekvenci u molekule nosača za vezivanje za CXCR4 receptor obećavajući način za stvaranje sistema za ciljanu isporuku gena tumorskim i matičnim ćelijama.
Za isporuku genetskog materijala u ćelije koje eksprimiraju CXCR4 receptor, Le Bon i kolege su koristili sintetički ligand za ovaj receptor - AMD3100, koji je kombinovan sa polietileniminom ili kationskim lipidima. Kompleksi genetskog materijala sa ovim jedinjenjima nisu doveli do značajnog povećanja efikasnosti isporuke marker gena u CXCR4+ ćelije u poređenju sa jedinjenjima bez signala. Nosači koje je koristio Le Bon nisu bili efikasni jer je specifična isporuka uz njihovu pomoć moguća samo uz dodatak supstance koja promoviše internalizaciju CXCR4 receptora (forbol ester) u medijum za transfekciju. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. Konjugati AMD3100 kao komponente ciljanih nevirusnih sistema za isporuku gena: Sinteza i efikasnost in vitro transfekcije ćelija koje eksprimiraju CXCR4 // Bioconjugate Chem. , 15: 413-423).
Dakle, postoji potreba za stvaranjem nosioca genetskih konstrukata koji mogu pružiti specifičnu isporuku CXCR4(+) ćelijama i ne utiču na obližnja tkiva. Ovakav metod je obezbeđen ovim pronalaskom.
Pronalazak se zasniva na zadatku razvoja metode za specifičnu isporuku genetskih konstrukata u ćelije koje eksprimiraju CXCR4 receptor, u kojoj se korišćenjem nosača genetskih konstrukata koji sadrže signalne sekvence za CXCR4 receptor povećava efikasnost postiže se isporuka gena od interesa. Važno je napomenuti da se sinteza nosilaca za koje se traži da se izvede korišćenjem bilo koje od poznatih metoda sinteze peptida u čvrstoj fazi.
Rješenje navedenog tehničkog problema osigurano je činjenicom da u metodi ciljane isporuke DNK u tumorske i matične ćelije koje eksprimiraju CXCR4 receptor, uključujući i pripremu nosača genetskih konstrukta uključivanjem u sastav molekula nosača, koji je sekvenca koja se vezuje za DNK od osam lizinskih aminokiselinskih ostataka - KKKKKKKK, signalne sekvence, formiranje kompleksa DNK/nosač, transfekcija in vitro, signalna sekvenca se bira iz grupe: fragment od 1 do 8 aminokiselina N-terminala sekvenca proteina SDF-1α - KPVSLSYR; fragment od 1 do 17 aminokiselina N-terminalne sekvence proteina SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, gdje su aminokiseline 9 i 11 zamijenjene serinom; ili fragment od 1 do 10 aminokiselina N-terminalne sekvence virusnog hemokina vMIP-II - LGASWHRPDK; Povezivanje signalne sekvence sa sekvencom koja se vezuje za DNK se vrši korišćenjem regiona linkera od dva molekula ε-aminoheksanoične kiseline.
U ovom slučaju, signalna sekvenca može biti fragment od 1 do 8 aminokiselina N-terminalne sekvence proteina SDF-1α-KPVSLSYR.
Ili signalna sekvenca može biti fragment aminokiselina 1 do 17 N-terminalne sekvence proteina SDF-1α - KPVLSSYRCPCRFFESH, gdje su aminokiseline 9 i 11 zamijenjene serinom.
Kao signalna regija može se koristiti i fragment aminokiselina 1 do 10 N-terminalne sekvence virusnog hemokina vMIP-II - LGASWHRPDK, sintetiziran iz D-aminokiselina.
Glicerol ili hlorokin se mogu koristiti kao komponenta koja osigurava izlazak kompleksa koji se sastoje od nosača i genetskog materijala iz endosoma.
Plazmidna DNK se može koristiti kao genetski materijal za nosioce.
Specificirani tehnički rezultat u ovom pronalasku postiže se upotrebom molekula oligolizina - KKKKKKKK (K8) kao nosača, konjugiranih signalnim sekvencama na CXCR4 receptor iz proteina SDF-1 ili vMIP-II, odnosno N-terminalne sekvence. hemokina SDF-1 (c 1 do 8 aa) ili N-terminalne sekvence hemokina SDF-1 (od 1 do 17 aa, sa zamjenom 9 i 11 aa serinom) ili N-terminalne sekvence virusni hemokin vMIP-II (od 1 do 10 aa u D-konformaciji). Prisustvo oligolizina KKKKKKKK u sastavu nosača omogućava konjugatima da formiraju komplekse sa nukleinskim kiselinama, posebno sa plazmidnom DNK, zbog elektrostatičke interakcije.
Navedeni tehnički rezultat je postignut sa tri varijante zagarantovanog nosača.
Navedeni tehnički rezultat u prvom ostvarenju postignut je činjenicom da u kratkom CDP nosaču na bazi sintetičkih analoga hemokina SDF-1, uključujući kationsku komponentu, a to je oligolizin K8, koji se koristi za kondenzaciju plazmidne DNK, i komponenta liganda za interakciju sa CXCR4 receptorom, u skladu sa Predloženim pronalaskom koristi se fragment (1-8 aa) N-terminalne sekvence proteina SDF-1, koji ima strukturu KPVSLSYR i ima aktivnost agonista CXCR4 receptor, kao ligand komponenta, i katjonska komponenta konjugata ima strukturu KKKKKKKK i vezan je za ligandnu komponentu preko razmaknice - dva molekula ε-aminoheksanske kiseline (Ahx).
Navedeni tehnički rezultat u drugoj varijanti postignut je činjenicom da je u nosaču (dugi CDP) na bazi sintetičkih analoga hemokina SDF-1, uključujući katjonsku komponentu, a to je oligolizin K8, koji se koristi za kondenzaciju plazmidne DNK, i komponentu liganda za interakciju sa CXCR4 receptorom, u skladu sa traženim izumom, fragment (1-17 aa; aa9 i aa11 su zamijenjeni serinom) N-terminalne sekvence proteina SDF-1, koji ima strukture KPVSLSYRSPSRFFESH i ima aktivnost agonista CXCR4 receptora, koristi se kao ligand komponenta, a katjonska komponenta konjugata ima strukturu KKKKKKKK i vezana je za ligandnu komponentu preko razmaknice - dva molekula ε-aminoheksanoične kiseline.
Navedeni tehnički rezultat u trećem ostvarenju postignut je činjenicom da se u nosaču (virusni CDP) na bazi sintetičkih analoga proteina Kaposijevog sarkoma virusa vMIP-II, uključujući kationsku komponentu, a to je oligolizin K8, koristi za kondenzaciju plazmid DNK, i komponenta liganda za interakciju sa receptorom CXCR4, u skladu sa traženim pronalaskom, fragment (1-10 Daa - sintetiziran iz D-amino kiselina) N-terminalne sekvence vMIP-II proteina, koji ima strukture LGASWHRPDK i koji ima aktivnost antagonista CXCR4 receptora, koristi se kao ligand komponenta, a katjonska komponenta konjugata ima strukturu KKKKKKKK i vezana je za ligandnu komponentu preko razmaknice - dva molekula ε-aminoheksanoične kiseline .
Sve tri varijante navedenog nosača mogu se sintetizirati korištenjem poznatih metoda sinteze peptida, na primjer, Boc metoda čvrste faze (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society 1963. V.85 (14), str.2149-2154).
Primjeri specifične implementacije
Pronalazak je ilustrovan uz pomoć slike 1, koja prikazuje promjenu intenziteta fluorescencije etidijum bromida sa povećanjem omjera naboja nosilac/DNK u kratkim CDP/DNK, dugim CDP/DNK i virusnim CDP/DNK kompleksima. Smanjenje intenziteta fluorescencije ukazuje na povećanje gustine formiranih kompleksa. Krive fluorescencije koje dostižu plato ukazuju na to da su kompleksi dostigli gustinu dovoljnu da ugase fluorescenciju etidijum bromida.
Na slici 2 prikazana je zavisnost aktivnosti luciferaze u HeLa ćelijama (CXCR4+) nakon transfekcije kratkim CDP/DNK, dugim CDP/DNK i virusnim CDP/DNK kompleksima u prisustvu endosomolitičkog agensa glicerola. U ovom slučaju korišteni su kompleksi formirani u sljedećim omjerima naboja nosilac/DNK: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Eksperimentalne kontrole su bili intaktni molekuli, DNK, PEI/DNA 1/8 kompleksi (pozitivna eksperimentalna kontrola je bio komercijalni nosač razgranati polietilenimin 25 kDa - PEI) i kompleksi koji sadrže DNK i kontrolni peptid (CP). CP se razlikuje od nosača u ovom pronalasku u odsustvu signala vezivanja za CXCR4 receptor i strukturno je oligolizin KKKKKKKK. Efikasnost isporuke gena markera kod nosilaca kratkog CDP, dugog CDP i virusnog CDP bila je 10-100 puta veća nego kod CP kontrole.
Slika 3 prikazuje zavisnost aktivnosti luciferaze u A172 ćelijama (CXCR4+) nakon transfekcije kratkim CDP/DNK, dugim CDP/DNK i virusnim CDP/DNK kompleksima u prisustvu endosomolitika glicerola. Ovdje smo koristili komplekse formirane u sljedećim omjerima naboja nosilac/DNK: 9/1, 12/1. Intaktni DNK molekul, PEI/DNA 1/8 kompleksi i kompleksi koji sadrže DNK i CP peptid služili su kao eksperimentalne kontrole. Efikasnost isporuke gena markera kod nosilaca kratkog CDP, dugog CDP i virusnog CDP bila je 10 puta veća nego kod CP kontrole.
Rezultati na Slici 2 i Slici 3 podržavaju specifičnost nosača u ovom pronalasku za CXCR4 receptor.
Slika 4 prikazuje zavisnost aktivnosti luciferaze u CHO ćelijama (CXCR4-) nakon transfekcije kratkim CDP/DNK, dugim CDP/DNK i virusnim CDP/DNK kompleksima u prisustvu endosomolitika glicerola. Korišteni su kompleksi formirani u sljedećim omjerima naboja nosilac/DNK: 9/1, 12/1. Intaktni DNK molekul, PEI/DNA 1/8 kompleksi i kompleksi koji sadrže DNK i CP peptid služili su kao eksperimentalne kontrole. Efikasnost isporuke marker gena kratkim CDP, dugim CDP i virusnim CDP nosiocima bila je skoro ista kao i korišćenjem CP kontrole.
Nosioci sa signalom nisu u stanju da obezbede značajno veći nivo isporuke genetskog materijala u ćelije bez ekspresije receptora u odnosu na kontrolu.
Implementacija pronalaska može se objasniti na sljedeći način. Cilj ovog pronalaska je da obezbedi ciljanu isporuku genetskih konstrukata u ćelije koje eksprimiraju CXCR4 receptor koristeći nosače genetskog materijala koji sadrži signalne sekvence za ovaj receptor.
U prvoj fazi vrši se formiranje kompleksa jedne od varijanti nosioca sa genetskim konstruktom koji sadrži gen od "interesa". Formirani kompleksi se koriste za isporuku genetskog materijala do odgovarajućih ciljnih ćelija. Analiza efikasnosti ćelijske penetracije se procjenjuje primjenom enzimskih ili imunohistohemijskih metoda.
Formiranje kompleksa se vrši u izotoničnom rastvoru. Poželjan je manitol puferiran s Hepesom (Hepes-puferirani manitol). Veličina nastalih kompleksa je 170-230 nm.
Plazmidna DNK se koristi kao genetski konstrukt u jednom aspektu.
Plazmidna DNK sadrži marker (luc, lacZ) ili terapeutski gen (u zavisnosti od bolesti), pod kontrolom odgovarajućih promotora i pojačivača (CMV, SV40, itd.) i drugih elemenata neophodnih, na primjer, za replikaciju u ćeliji domaćinu ili integraciju u genom. U genskoj terapiji kancera mogu se koristiti geni HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, timidin kinaza itd.
U drugom ostvarenju, oligonukleotidi koji se sastoje od male DNK ili RNK, komplementarni specifičnoj sekvenci u mRNA ili njenom prekursora, koriste se kao genetski konstrukt za suzbijanje sinteze proteinskog proizvoda ili uklanjanje egzona koji nosi mutaciju iz mRNA. Formirani kompleksi se koriste za isporuku genetskog materijala u ćelije koje eksprimiraju CXCR4 receptor. Ulazak kompleksa nosača iz ovog pronalaska odvija se pretežno putem receptora posredovanog transporta vezivanjem za ekstracelularne domene CXCR4 receptora i naknadnom internalizacijom receptora.
Doza nosača i genetskog materijala određuje se pojedinačno i zavisi od vrste ćelija, količine CXCR4 receptora na njihovoj površini i složenosti transfekcije ovih ćelija.
Da bi se povećala efikasnost ovih nosača, poželjno je da se transfekcija ćelija izvede korišćenjem endosomolitičkog sredstva. To uključuje glicerol, hlorokin, itd. Ove supstance se dodaju u medijum za transfekciju neposredno pre dodavanja kompleksa ćelijama. Oni ostaju nepovezani sa kompleksima i stoga ne utiču na njihovu strukturu.
Peptidi, druga polimerna jedinjenja i liposomi koji su sposobni da zbijaju nukleinske kiseline mogu se koristiti kao deo nosača koji se vezuje za DNK. Osim toga, mogu imati endosomolitička svojstva (nema potrebe za korištenjem dodatnog endosomolitika) i, kada je potrebno (na primjer, za isporuku terapeutskih ili markerskih gena), isporučuju genetski materijal u jezgro.
Prilikom odabira uslova transfekcije, oni su kreirani da osiguraju najveću efikasnost isporuke. Poželjno je inkubirati komplekse sa ćelijama 4 sata. Međutim, ovo vrijeme možete varirati od 3 do 6 sati. Nakon vremena inkubacije, podloga se menja i ćelije se ostavljaju 24-48 sati (u zavisnosti od tipa ćelije i genetskog materijala) za ekspresiju uvedenih konstrukta sa genom od interesa ili ispoljavanje terapeutskog dejstva oligonukleotida.
Analiza efikasnosti isporuke vrši se enzimskim ili imunohistohemijskim metodama, u zavisnosti od vrste unesenog genskog konstrukta.
Primjer 1. Formiranje kompleksa DNK/nosač i proučavanje procesa formiranja kompleksa.
Plazmid pCLUC4, koji sadrži gen luciferaze krijesnice pod kontrolom promotora citomegalovirusa, korišten je kao genetski materijal za ciljanu isporuku gena u stanice. Korištena je jedna varijanta nosača.
Rastvori od 1 μg DNK u 40 μl 1X HBM pufera (5% w/v manitola, 5 mM Hepes, pH 7,5) i rastvori nosača koji odgovaraju različitim omjerima naboja DNK/nosač pripremljeni su u jednakoj zapremini pufera. Otopina nosača je postepeno dodavana u Eppendorfovu epruvetu koja je sadržavala otopinu DNK i snažno miješana 20 sekundi. Dobivena smjesa je ostavljena 30 minuta na sobnoj temperaturi da se završi proces formiranja kompleksa.
Rezultati kompleksiranja analizirani su metodom istiskivanja etidij bromida. Fluorescencija etidijum bromida se meri korišćenjem Varioscan Flash spektralnog skenirajućeg multimodnog čitača (Thermo, Finska). Pomicanje etidijum bromida je uočeno pri emisiji od 590 nm (ekscitacija na 544 nm) nakon dodavanja nosača u DNK (20 μg/ml) prethodno inkubiran sa interkalirajućim agensom etidijum bromidom (400 ng/ml). Pomak je izračunat pomoću formule (F-Ff)/(Fb-Ff), gdje su Ff i Fb intenziteti fluorescencije etidij bromida u odsustvu odnosno prisustvu DNK. Rezultati su prikazani na slici 1.
Primjer 2. Izvođenje transfekcije in vitro.
HeLa, A172 i CHO ćelije su zasijane u ploče za kulturu sa 48 jažica (Nunc) 24 sata prije transfekcije brzinom od 50.000 ćelija po jažici koja sadrži 500 μl standardne mješavine kulture koja se sastoji od DMEM medija za kulturu (GIBCO), 10% fetalnog goveda serum (GIBCO), 2 mM glutamina, uz dodatak penicilina (50 U/ml), streptomicina (50 μg/ml) i 1 mM natrijum piruvata. Suspenzija kompleksa pripremljena je prema metodi opisanoj u primjeru 1 pri brzini od 2 μg DNK po jažici ploče za kulturu. 10 minuta pre dodavanja suspenzije kompleksa DNK/nosač, ćelije su isprane nekoliko puta sa DMEM i u svaku jažicu je dodato 500 μl medijuma koji sadrži 15% glicerola i 1,5% etanola. Transfekcija je izvedena dodavanjem suspenzije kompleksa DNK/nosač u medijum. Nakon dodavanja kompleksa, ploče sa ćelijama su stavljene u termostat sa temperaturom od 37°C i 5% CO 2 na 4 sata. Nakon vremena inkubacije, ćelije su isprane sa DMEM i u svaku jažicu je dodato 500 μl standardne mešavine kulture. Ploča za kulturu je inkubirana u termostatu na 37°C i 5% CO 2 48 sati, nakon čega je otkrivena ekspresija marker gena.
Primjer 3: Detekcija ekspresije gena luciferaze nakon transfekcije in vitro.
Medijum je uklonjen sa ploča za kulturu, a ćelije su isprane u 1x PBS (pH 7,2). 80 μl pufera za lizu (25 MM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8) je dodato u svaku jažicu. 50 μl lizata je prebačeno u polistirenske ploče s neprozirnim zidovima radi mjerenja aktivnosti luciferaze. Mjerenje je izvršeno pomoću Varioscan Flash spektralnog skenirajućeg multimodnog čitača (Thermo, Finska). Mjerenje je izvršeno pomoću otopine luciferazne flash mješavine (20 mM Tricine, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2,67 mM MgSO 4, 0 1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 µM ATP, 270 µM acetil koenzim A, 470 µM luciferin). Svako mjerenje je vršeno 10 sekundi. Očitavanja instrumenta su dobijena u relativnim svjetlosnim jedinicama (RLU). Eksperimentalni rezultati su procijenjeni u relativnim svjetlosnim jedinicama po 1 mg ukupnog proteina iz ćelijskih ekstrakata u jažici ploče za kulturu. Ukupna količina proteina u svakoj jažici izmjerena je korištenjem kompleta za analizu proteina (Bio-Rad), u odnosu na krivulju kalibracije albumina goveđeg seruma. Rezultati su prikazani na slikama 2, 3, 4.
DNK vakcina(Takođe genska vakcina, vakcina nukleinske kiseline)- genetski modificirana konstrukcija koja nakon uvođenja u ćeliju osigurava proizvodnju proteina patogena ili tumorskih antigena i izaziva imunološki odgovor. Unošenje DNK vakcina u organizam naziva se genetska imunizacija. DNK vakcinacija ima nekoliko prednosti u odnosu na konvencionalne vakcine. Konkretno, pokazalo se da takve vakcine obezbeđuju ne samo proizvodnju antitela (humoralni imunitet), već i specifičan citotoksični odgovor (ćelijski imunitet), koji je ranije bio ostvariv samo uz pomoć živih vakcina. Danas se DNK vakcine ne koriste za liječenje ljudi, ali se predviđa da će genetska imunizacija pomoći u prevladavanju brojnih bolesti.
Istorija stvaranja
Ideja o korištenju fragmenata DNK za vakcinaciju pojavila se 50-ih i 60-ih godina. Nakon niza eksperimenata, otkriveno je da genetske informacije DNK zadržavaju sposobnost transkripcije i translacije nakon prijenosa u drugu ćeliju. Iste godine je otkriveno da ubrizgavanje životinjama genoma polio virusa stimulira proizvodnju antitijela. Kasnije je prikazana aktivacija humoralnog imuniteta za molekule DNK dobijene od neinfektivnih agenasa. Od 90-ih, naučne laboratorije počele su sve više istraživati imunostimulirajuća svojstva DNK. Godine 1992. Tang i njegove kolege su pokazali da je gen za ljudski hormon rasta, ugrađen u plazmid, stabilno eksprimiran u tijelu miša, a sintetizirani hormon imuni sistem prepoznaje kao antigen i stimulira proizvodnju antitijela. Proces uvođenja plazmidne DNK za stimulaciju humoralnog imuniteta nazvan je Tango "genetska imunizacija". Međutim, sljedeće godine, druga grupa naučnika objavila je da je uvođenje plazmida koji kodira proteine virusa influence izazvalo humoralni i ćelijski odgovor. Indukcija obe grane imuniteta u istoj godini je takođe pronađena za plazmid koji sadrži HIV gene. Od 1995. godine počeli su da se pojavljuju dokazi da DNK vakcinacija može aktivirati imuni sistem protiv raka. Prije 20-ak godina održana su prva klinička ispitivanja DNK vakcina, koja su prvenstveno trebala pokazati sigurnost nove metode. Pacijentima su ubrizgani geni za HIV, virus gripa, herpes, hepatitis B i uzročnika malarije. Rezultati svih testova pokazali su se prilično ohrabrujućima: DNK vakcine su bile dosljedno izražene, izazivale su imunološki odgovor i nisu izazivale ozbiljne nuspojave, što je poslužilo kao poticaj za njihova daljnja istraživanja.
Dizajn DNK vakcine
Strukturno, DNK vakcina je nukleotidna sekvenca ugrađena u vektor koji kodira specifični antigen ili antigene. U genetskom inženjeringu, vektor je molekul nukleinske kiseline koji služi za isporuku genetskog materijala u ćelije i osigurava njegovu replikaciju ili ekspresiju. Ranije su vektori bazirani na virusima korišćeni za transport gena u ćelije: modifikovani (oslabljeni) virus variole, adenovirusi i retrovirusi. Virusni vektori su prilično efikasni, ali imaju značajnu vjerovatnoću razvoja nuspojava zbog relativno visoke imunogenosti samog vektora. Stoga se danas bakterijski plazmid, mala stabilna kružna DNK molekula sposobna za autonomnu replikaciju, češće koristi kao vektor. Sam plazmid ne izaziva željeni specifični imunološki odgovor, u tu svrhu se u njega ubacuju geni imunogenih proteina. Takođe, DNK vakcina mora da sadrži regulatorne sekvence neophodne za ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Gotov DNK konstrukt se isporučuje u bakterijsku ćeliju, gdje se povećava broj njenih kopija. Nakon toga se izoluju i pročišćavaju plazmidi koji nose željeni umetak.
Dizajn plazmidnog vektora
Važna faza u stvaranju DNK vakcina je dizajn (konstrukcija) vektora. Obavezne strukture plazmidnog vektora su restrikcijska mjesta, selektivni marker i porijeklo replikacije DNK vakcine u bakterijskoj ćeliji. Da bi došlo do sinteze antigena, DNK vakcina mora sadržavati promotor i signal poliadenilacije. Promotor je važan faktor u efikasnosti vakcine, jer određuje snagu imunog odgovora: što je veća ekspresija gena koji kodira virusni ili tumorski antigen, to je jači imuni odgovor. Najčešće korišteni promotor je SV40 ili citomegalovirus (CMV). Da bi se stabilizirali transkripti mRNA, signal poliadenilacije, najčešće dobiven od gena goveđeg hormona rasta, se ubacuje u plazmid (BGH) ili SV40 virus. Kao selektivni markeri biraju se geni otpornosti na antibiotike bakterija, često gen rezistencije na kanamicin. Prilikom dizajniranja DNK vakcina, najpopularniji izvor replikacije je Escherichia coli.
Odabir gena za imunizaciju
Vektor je važna komponenta DNK vakcine, ali je njegova imunogenost određena umetkom – sekvencom DNK koja kodira antigen. Među virusnim antigenima, fuzioni proteini su najpogodniji za imunizaciju - to su relativno konzervativni proteini koji osiguravaju prodor virusa u ćeliju. Za vakcinaciju protiv Gram-pozitivnih bakterija, preporučljivo je ubaciti u plazmid vektor gene onih bakterijskih proteina koji određuju patogenezu bolesti. Među proteinima gram-negativnih bakterija imaju visoku imunogenost. Za terapijske antitumorske DNK vakcine koriste se proteini markeri ćelija raka.
Metode za isporuku DNK vakcina u ćelije
Gotova vakcina mora biti dostavljena ljudskom ili životinjskom telu, gde su njeno odredište ćelije koje predstavljaju antigen (APC) - makrofagi, dendritične ćelije, B-limfociti. Ovdje će se dogoditi sinteza i posttranslacijska modifikacija antigena, nakon čega će se on ugraditi u ćelijsku membranu kako bi privukao pažnju imunološkog sistema. Glavni problem je isporuka dovoljne količine plazmida u APC. Metode za isporuku genetskog materijala u ćelije obično se dijele u 2 grupe: virusne i nevirusne. Budući da virusni vektori imaju niz značajnih nedostataka, ovaj odjeljak predstavlja samo nevirusne metode za isporuku DNK vakcina.
Mikroinjekcija
Početkom 1990-ih, intramuskularne mikroinjekcije bile su najčešća metoda za uvođenje DNK u ćelije zbog jednostavnosti metode. Da bi se to postiglo, DNK se otopi u vodi ili izotoničnoj otopini, a po potrebi se dodaje pomoćno sredstvo (tvar koja pojačava imunološki odgovor). Zatim se pomoću tanke staklene cijevi otopina ubrizgava u mišićno tkivo, gdje ulogu APC-a obavljaju dendritske stanice. Jednom u jezgru dendritske ćelije, vakcina počinje da se eksprimira i dolazi do sinteze antigenskih proteina. Mikroinjekcijama DNK se može ubrizgati potkožno u timus, jetru i tumorsko tkivo, ali se u mišićnom tkivu uočava najdugotrajnija (do godinu dana) ekspresija DNK vakcine. Zbog visoke koncentracije Langerhansovih stanica (podtip dendritskih stanica), koža je privlačna meta za DNK vakcinaciju. Za intradermalnu (supkutanu) primjenu koristi se niz mikroiglica čija je dužina nekoliko stotina mikrona. Postoje različite mogućnosti intradermalne vakcinacije. Lakše otpuštanjem stratum corneuma (vanjski sloj kože, obično 10-20 mikrona) nizom mikroiglica kako bi se povećala njegova permeabilnost za daljnje lokalno ubrizgavanje otopine DNK. Efikasnija je upotreba mikroiglica obloženih suvom vakcinom, koja se rastvara pod kožom. Efikasnost ove metode je obično niska, jer DNK prvo ulazi u međućelijski prostor, a tek onda se ugrađuje u ćelije.
Elektroporacija
Elektroporacija je tradicionalni pristup za isporuku DNK u bakterijske ćelije i ćelijske kulture, zasnovan na primeni električnog impulsa. Ovaj impuls stvara pore u ćelijskoj membrani, što olakšava ulazak negativno nabijene DNK. Ova metoda je posuđena za isporuku DNK vakcina životinjama i ljudima i može značajno povećati efikasnost konvencionalne injekcije. Uređaj za elektroporaciju sadrži izvor električne struje i jednokratnu mrežicu, koja se sastoji od šprica i elektrodnih igala. Špric ubrizgava vakcinu u mišićno tkivo, a elektrode stvaraju električno polje koje olakšava ulazak DNK u miocite i dendritske ćelije. Danas su razvijeni uređaji koji mogu povećati efikasnost vakcinacije 1000 puta u odnosu na konvencionalnu injekciju. Elektroporacija se može koristiti i za intramuskularnu i za subkutanu primjenu DNK vakcina. Nedostaci uključuju manji bol na mjestu uboda i potrebu za specijaliziranim uređajima. Umjesto električnog polja može se koristiti magnetno polje. Takvi uređaji rade na istom principu, ali je u ovom slučaju postupak potpuno bezbolan i manje oštećuje stanice.
Djelovanje električnog polja ne samo da pojačava apsorpciju DNK vakcine u stanicama, već i stimulira proizvodnju imunološkog odgovora. Primjena elektroporacije dovodi do manjeg oštećenja tkiva - razvija se lokalni upalni proces. Oštećene ćelije oslobađaju hemokine, pa im se šalju makrofagi, limfociti i dendritične ćelije. Povećanje koncentracije imunih ćelija na mestu primene vakcine povećava njenu efikasnost.
Sonoporacija
Sonoporacija je metoda prijenosa strane DNK u stanice pomoću ultrazvuka. Ultrazvuk povećava propusnost stanične membrane, zbog čega egzogena DNK lakše prodire u ćeliju. Sonoporacija je prvi put korištena za prijenos gena u ćelije 1986. godine. Ova metoda se koristi za uvođenje DNK molekula u ćelije rožnice, mozga, koštanog tkiva, bubrega, gušterače, embrionalnog tkiva, skeletnih i srčanih mišića. U poređenju sa drugim metodama, sonoporacija je malo proučavana, potrebno je još mnogo truda da se poveća njena efikasnost, posebno na nivou celog organizma.
Balistička transfekcija
Balistička transfekcija se zasniva na granatiranju (bombardiranju) organa i tkiva mikročesticama teških metala (zlato, volfram) prečnika 1-3 mikrona obloženih molekulima DNK. Ovako uvedena DNK vakcina se eksprimira u ciljnim ćelijama, a njihovi produkti ulaze u krv. Da bi se omogućilo ubrzanje čestica, koristi se uređaj sličan malokalibarskom oružju - genski pištolj ili genski top. Mikročestice prolaze kroz ćelijske membrane i prenose genetski konstrukt direktno u ćelijsku jezgru. Dubina prodiranja mikročestica je obično mala - do 1 mm, pa se metoda koristi uglavnom za transfekciju kože ili susjednog tkiva hrskavice. Posebni uslovi pečenja omogućavaju mikročesticama da prodru do dubine od 4-5 mm i prenose genske konstrukcije u vlakna prugasto-prugastih mišića. Tipično, ćelije koje se nalaze direktno u centru metka umiru, dok se u zoni 0,6-1 cm od centra nalaze najuspješnije transformirane ćelije. Ova tehnologija se naziva i biobalistika ili biolistika.
Prvi genski pištolj kreirala je grupa naučnika između 1983. i 1986. godine u svrhu transformacije biljnih ćelija. Bio je to pištolj dizajniran oko uređaja za automatsko zabijanje eksera. DNK iz reporterskog (markerskog) gena nanesena je na volframovu kuglu i ubačena u Petrijevu posudu. Ekspresija reporter gena ukazuje na efikasnost imunizacije. Danas se za isporuku DNK koriste čestice napravljene od zlata ili srebra, jer nisu toksične za ćelije, za razliku od volframa.
Pod visokim pritiskom
Godine 1999. razvijeni su uređaji za injekcije koji su u stanju da daju DNK vakcinu bez upotrebe igle. Takvi uređaji rade zahvaljujući Lorentzovoj sili: mali, moćni magnet stvara značajan pritisak i aktivira klip, koji izbacuje lijek brzinom zvuka. Promjenom jačine struje možete odabrati dubinu ubrizgavanja i dozirati lijekove. Postupak je potpuno bezbolan i ranije se koristio za davanje inzulina dijabetičarima i tokom velikih vakcinacija. Značajan nedostatak ove metode je što visoki pritisak teoretski može promijeniti strukturu molekula koji se ubrizgavaju. Međutim, ova tehnologija ubrizgavanja se i dalje usavršava, a danas su razvijeni uređaji koji mogu isporučiti DNK do dubine do 16 mm.
Sadrži živi bakterijski vektor
Živi bakterijski vektori su sojevi salmonela, Shigella ili listerija, koji nose mutaciju u genima biosinteze ili invazije koji eliminišu patogenost i sposobnost da održe svoju održivost u domaćinu ili okolini. Ali neophodni geni za imunogene proteine ubacuju se u genom bakterije. Oslabljena bakterija se u organizam unosi oralno (na usta, gutanjem) ili intranazalno (prskanjem u nos), tako da ova metoda vakcinacije ne zahtijeva nikakvu opremu. Osim toga, ovakva primjena stimulira imuni odgovor sluznice, što je važno jer većina patogena ulazi u tijelo kroz oralne i nazalne otvore. Zaobilazeći želudac, oslabljene bakterije ulaze u tanko crijevo. Zatim, bakterija prodire u Peer plakove - crijevne limfne čvorove. Jednom u sredini Peyerovih zakrpa, bakterije postaju meta za makrofage i prolaze kroz fagocitozu. U citoplazmi makrofaga, bakterija oslobađa DNK vakcinu, nakon čega DNK ulazi u jezgro, a bakteriju neutrališe imuni sistem.
Pakovanje u liposomima
Liposomi su sferne formacije (prečnika oko 100 nm) koje se sastoje od lipidnog dvosloja. Liposomi su šuplji iznutra, koji su obično ispunjeni rastvaračem, ali se mogu koristiti za isporuku različitih supstanci, uključujući DNK vakcine. Njihova hidrofobna ljuska omogućava im da se stapaju sa ćelijskim membranama i prenose svoj sadržaj u ćeliju. Upotreba liposoma počela je 1965. godine i to je postalo snažan pokretač razvoja bionanotehnologije.
Obećavajući metod za direktno uvođenje DNK konstrukta u ciljne ćelije je isporuka genetskog konstrukta kao dijela kationskih liposoma konstruiranih od pozitivno nabijenih lipida. Kationski liposomi sa negativno nabijenom DNK molekulom formiraju DNK-lipidni kompleks - lipoplex. Prednosti korištenja takvih kompleksa su mogućnost nošenja velike količine informacija, nezaraznost, osim toga, jednostavni su i jeftini za proizvodnju. Godine 2003. stvoreni su izuzetno mali — milimikronski liposomi obloženi polimer polietilen glikolom — koji su sposobni da prenesu terapeutsku DNK kroz krvno-moždanu barijeru i isporuče je neuronima u mozgu, što je ranije bilo nemoguće.
Sastoji se od polipleksa
Za uvođenje velikih DNK konstrukata (> 10 kb) u ćeliju koriste se polipleksi - sistemi koji se sastoje od pozitivno nabijenih polimera (polikationa) i negativno nabijenih molekula DNK. Veličina takvih kompleksa je manja od 100 nm, što ih, s jedne strane, izlaže probavljanju makrofaga (tako reaguju na čestice veće od 200 nm), a s druge strane dovoljno su veliki da ne mogu se filtrira u bubrezima.
Polikationi kondenziraju molekulu DNK u komplekse, čime se osigurava njena stabilnost i zaštita od djelovanja nukleaza. Kationski proteini, sintetički homopolimeri aminokiselina (polilizini, poliarginini), hitozan polisaharid i polietilenamin mogu poslužiti kao polimeri koji vežu DNK. Tipično, u polipleksu, polikation je prisutan u višku, zbog čega je kompleks rastvorljiv i pozitivno nabijen. Ako je ligand vezan za polipleks na specifični ćelijski receptor, tada se DNK vakcina može usmjeriti na određeni tip ćelije. Proces isporuke genetskog materijala kao dijela polipleksa uključuje dvije faze: ekstracelularni (put od mjesta ubrizgavanja do ciljnih stanica) i intracelularni (interakcija sa ciljnim stanicama, endocitoza, izlazak iz endosoma, dostava u jezgro). Prva barijera koju kompleks mora savladati je krv i ekstracelularni matriks. Stoga se takvi fizičko-hemijski parametri polipleksa biraju kako bi se povećala njegova stabilnost, izbjegle neželjene interakcije s proteinima krvi i imunološke reakcije uzrokovane kemijskom prirodom polikationa. Jednom u ciljnim stanicama, polipleks se apsorbira na plazma membrani, preuzima endocitoza, nakon čega mora napustiti endosom i disociirati u kationski polimer i molekulu DNK. Slobodna DNK se šalje u jezgro, a polimerni kationi napuštaju ćeliju i izlučuju se iz tijela.
| Karakteristike najčešćih metoda isporuke DNK vakcina | ||
| Metoda | Prednosti | Nedostaci |
| Intramuskularne ili potkožne injekcije |
|
|
| Elektroporacija |
|
|
| Gene gun |
|
|
| Ubrizgavanje pod visokim pritiskom |
|
|
| Pakovanje u liposomima |
|
|
Mehanizam razvoja imunog odgovora
Antigen sintetiziran u ćeliji prolazi kroz obradu, nakon čega se predstavlja imunokompetentnim stanicama. Procesiranje je cijepanje antigenskog proteina na imunogene peptidne fragmente. Prezentacija znači predstavljanje fragmenta antigena u kombinaciji sa molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) imunokompetentnih ćelija. Postoje dvije najznačajnije klase ovih molekula: MHC klasa I (MHC-I) i MHC klasa II (MHC-II). Da bi se vezao za molekule svake klase, antigen se priprema u specijalizovanim odjeljcima ćelije. Proteini endogenog antigena se šalju na razgradnju do proteazoma, nakon čega se predstavljaju u kompleksu sa MHC-I na površini ćelije. Ovdje, kada se sretnu, prepoznaju ih CD8 + T ćelije (T ćelije ubice), koje implementiraju citotoksični imuni odgovor. Egzogeni proteini se cijepaju lizomnim proteazama, uključeni su u MHC-II i prepoznati od strane CD4 + T-ćelija (T-helper) receptora. Potonji uzrokuju i ćelijske i humoralne odgovore.
Prezentacija antigena putem MHC-I puta
DNK vakcinacija uključuje sintezu endogenog antigena, tako da je ovaj put dominantan. Procesiranje antigena putem MHC-I puta odvija se u nekoliko faza. Protein sintetizovan u jezgru transportuje se u citoplazmu, a proteasom ga cijepa na kratke peptide - epitope, koji se posebnim proteinima transporterom antigena (TAP, transporter povezan sa procesiranjem antigena) prenose u endoplazmatski retikulum (ER). U ER, svaki epitop se kombinuje sa MHC-I molekulom, nakon čega se formirani kompleks šalje u Golgijev aparat (AG) na glikozilaciju. Odatle kompleks unutar vezikule teži plazma membrani. Nakon što se vezikula spoji sa plazmalemom, kompleks se pojavljuje na površini ćelije, gdje ga prepoznaju T-killer receptori, koji imaju citotoksičnu aktivnost.
Prezentacija antigena putem MHC-II puta
Glavni izvor peptida koji se vezuju za MES-II su egzogeni proteini koji ulaze u ćeliju putem endocitoze. Međutim, pokazalo se da neki intracelularni proteini također mogu biti prisutni u kompleksu s MChS-II. U ovom slučaju, novosintetizirani proteini se nakon ulaska u citoplazmu prenose u lizozome, gdje se antigen cijepa pod djelovanjem kiselih proteaza. Nakon toga, lizozom koji sadrži epitope spaja se s vezikulom koja nosi molekulu MES-II. Unutar ujedinjene vezikule formira se kompleks epitop-MCS-II koji se nakon fuzije vezikule sa plazmalemom transportuje na površinu ćelije. Ovdje ovaj kompleks prepoznaju T-helper receptori, što rezultira njihovom aktivacijom. Ovo dovodi do stimulacije i ćelijskog (aktivacija T ćelija ubica) i humoralnog imuniteta (aktivacija B limfocita).
Tradicionalna vakcinacija rastvorljivim proteinskim antigenima ima za cilj mobilizaciju T pomoćnih ćelija. Relativno nizak odgovor T pomoćnih ćelija je jedan od nedostataka DNK vakcina. Takođe, trenutna generacija DNK vakcina nije sposobna da izazove proizvodnju visokih titara antitela. Da bi se povećala aktivacija T pomoćnih ćelija, antigen se mora preusmjeriti na MES-II put. Da bi se to postiglo, lizosomski lokalizacijski signal je ugrađen u DNK vakcinu; sintetizirani antigen će biti poslan u lizozome, što znači da će krenuti putem MES-II
Strategije za poboljšanje efikasnosti DNK vakcine
Glavno pitanje u vezi sa budućnošću DNK vakcina tiče se povećanja njihove efikasnosti. Trenutno se provodi veliki broj studija za optimizaciju razvijenih DNK vakcina. Potraga za rješenjem se odvija u dva smjera: povećanje ekspresije vakcine i povećanje imunogenosti kodiranog antigena.
Optimizacija elemenata transkripcije
Važna komponenta DNK vakcine je promotor. Bakterijski promotori nisu pogodni za ekspresiju antigena u stanicama sisara, pa su umjesto njih korišteni promotori onkogenih virusa. Sada, kako bi se poboljšala sigurnost vakcina, one su zamijenjene promotorima iz nekancerogenih objekata, na primjer, ljudskim citomegalovirusom (CMV). Za većinu DNK vakcina, ovaj promotor je optimalan izbor: visoko je eksprimiran u širokom spektru ćelija. Za ekspresiju gena u specifičnim tkivima, obećavajuće je korištenje promotora specifičnih za ovaj tip tkiva. Na primjer, upotreba mišićnog CPK promotora kada se primjenjuje dovodi do desetostrukog povećanja sinteze antitijela i indukcije T-ćelijskog odgovora nego upotreba slične DNK vakcine sa CMV promotorom. Promotor desmin gena, koji kodira jedan od proteina citoskeleta, također je pokazao visoku efikasnost u miocitima. Za povećanje ekspresije DNK vakcine u keratinocitima (ćelije epitelnog tkiva), koriste se promotori gena za metalotionein (protein koji vezuje teške metale) ili gena 3 za hidroksilazu vitamina D.
Nivo inicijacije transkripcije se obično povećava iza korisnički račun snažan promotor i pojačivač, a karakteristike završetka mogu postati ograničavajući faktor. Efikasnost poliadenilacije i obrade primarnog RNK transkripta varira u zavisnosti od sekvence poliA signala. Odnosno, sekvenca poliadenilacije utiče na sintezu antigena. Na primjer, široko korišteni poliA signal virusa SV40 ima nižu efikasnost od signala poliadenilacije gena za β-globin zeca ili gena za goveđi hormon rasta.
Za efikasno prevođenje, mRNA sisara mora proći tzv Kozakova sekvenca. Umetanje ove sekvence u DNK konstrukt može značajno povećati nivo sinteze antigena. Da bi se spriječilo da RNA polimeraza preskoči stop kodon gena i da dođe do sinteze izduženog proteina, koji tada neće moći steći ispravan nabor, gen se može prekinuti dvostruka stop linija.
Prilikom dizajniranja DNK vakcine, oni takođe pokušavaju optimizirati njegove kodone. Postupak optimizacije podrazumijeva zamjenu kodona u sekvenci gena na način da sekvenca aminokiselina proteina ostane nepromijenjena, ali se povećava efikasnost translacije njegove mRNA. Razlog je taj što je većina aminokiselina kodirana s više od jedne granice. Svaki kodon ima svoju tRNA i zastupljenost različitih tRNK u ćeliji nije ista, a takođe varira u zavisnosti od vrste organizma. Kodoni se biraju na način da prisustvo željene tRNA ne postane ograničavajući faktor tokom sinteze antigena.
Optimizacija antigena
Iako je snaga imunog odgovora u korelaciji sa nivoom ekspresije DNK vakcine, za svaki antigen postoji određeni plato, nakon čega povećanje količine antigenskog proteina povećava proizvodnju antitela. U isto vrijeme, jači imunološki odgovor može se postići optimizacijom antigena. Na primjer, by kombinovanje antigena sa ligandom do specifičnog receptora na ćeliji koja predstavlja antigen. Takav ligand može biti markerski protein CD40, ekstracelularni domen tirozin kinaze-3 slične Fms ili antigena T-ubice-4. Zbog interakcije ligand-receptor povećava se efikasnost preuzimanja antigenskog proteina od strane APC.
Olakšati razgradnju antigena u proteasom ili lizozom takođe stimulišu imuni odgovor. Da bi se poboljšalo proteliotsko cijepanje antigena, signal ubikvitinacije se ubacuje u njegovu sekvencu Greška citata: Netačan poziv: Neimenovana ref oznaka mora imati ulaz. Upotreba DNK vakcina koje kodiraju umjesto cijelog antigena nekoliko epitopa različitog porijekla, omogućava vam da značajno proširite spektar imunološkog odgovora.
Kombinacija je efikasna za antitumorske DNK vakcine "tumorski antigen + virusni ili bakterijski antigen." Na primjer, kombinacija tumorskog antigena s epitopom toksina tetanusa značajno povećava aktivaciju T stanica ubica protiv stanica raka.
Uključivanje pomoćnih sredstava
Kada se koriste tradicionalne vakcine, dodaju se adjuvansi za poboljšanje imunološkog odgovora. DNK vakcina je bakterijskog porekla, pa je i sama imunostimulans. Da bi se pojačao imunološki odgovor, adjuvantni geni se ubacuju u DNK vakcinu ili se koristi dodatni plazmid koji kodira imunostimulirajuće proteine.
Imunostimulirajuće djelovanje bakterijskih CpG dinukleotida
Funkcija plazmida nije ograničena na isporuku gena u ćelije. Još 1893. godine otkriveno je da mješavina bakterijskih lizata smanjuje progresiju kancerogenih tumora, ali je tek 1983. ustanovljeno da su imunostimulirajuća svojstva lizata posljedica bakterijskih DNK molekula. Godine 1995. pokazano je da je imunološka stimulacija uzrokovana CpG motivima u bakterijskoj DNK. Kod bakterija, kao i kod DNK virusa, ovi motivi su nemetilirani. U ljudskom tijelu i višim primatima, naprotiv, citozin u većini CpG dinukleotida sadrži metilnu grupu. Stoga ljudsko tijelo percipira nemetilirane CpG motive kao molekularne obrasce povezane s patogenom (PAMP). Rumry spojeve prepoznaju receptori slični Tollu, koji se, ovisno o vrsti liganda, dijele na nekoliko tipova. Nemetilirane CpG motive prepoznaje TLR-9 receptor, koji se nalazi na membranama endoplazmatskog retikuluma B limfocita, dendritskih ćelija i prirodnih ćelija ubica. Vezivanje receptora za nemetilirane CpG motive pokreće kaskadu reakcija, kao rezultat kojih se inducira sinteza proinflamatornih citokina – interferona-1 i IL-12.
Ekspresija citokina i drugih imunomodulatora
Za DNK vakcinaciju, geni citokina najčešće se koriste kao pomoćna sredstva. Citokini su klasa proteinskih molekula koji regulišu međućelijske i međusistemske interakcije u tijelu, posebno funkcionisanje imunološkog sistema. Svi citokini, a poznato ih je više od 30, mogu modulirati imunološki odgovor. Citokini IL2, IL-12, interferon γ, IL-15, IL-18 i IL-23 imaju stimulativni efekat na ćelije pomoćnice klase 1 T. Citokini koji moduliraju djelovanje T-pomoćnih ćelija druge klase uključuju: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Tip citokina se bira prema tipu imunološkog odgovora koji želi da pojača.
Povećanje imunološkog odgovora može se postići upotrebom hemokina. Hemokini su porodica citokina koji su sposobni inducirati kemotaksiju stanica osjetljivih na njih, uključujući i imunološke stanice. Konkretno, receptori za hemokine nalaze se na antigen-receptivnim ćelijama za hemokine. Vezivanje hemokina za njegov receptor dovodi do endocitoze kompleksa antigen-hemokin u APC. Ova strategija se efikasno koristi i u razvoju antivirusnih DNK vakcina i antitumorskih vakcina.
Pomoćnu funkciju također može obavljati protein HSP70 (proteini toplotnog šoka). Imunostimulativni efekat HSP70 zasniva se na njegovoj sposobnosti da uđe u ekstracelularni prostor i veže se za APC receptore. Mehanizam transporta HSP70 prema van još nije u potpunosti razjašnjen, ali najvjerovatnije postoji nekoliko puteva: egzocitoza, izlučivanje prema van ili izlazak kroz kanal. Vezivanje HSP70 za njegov receptor dovodi do aktivacije dendritskih ćelija, posreduje u prezentaciji antigena i stimuliše proizvodnju hemokina. Pošto je antigen fuzionisan sa HSP70, on takođe ulazi u ekstracelularni prostor i stoga se može predstaviti putem MES-II puta i aktivirati B ćelije. Da bi se izbjegle autoimune reakcije, DNK vakcine koriste bakterijski gen HSP70.
Prednosti i nedostaci DNK vakcina
Metoda DNK vakcinacije ima niz prednosti, od kojih je najvažnija pokretanje humoralnog i ćelijskog imunološkog odgovora. Vakcine zasnovane na DNK pružaju dugotrajnu ekspresiju antigena i stoga trajni imuni odgovor. Dodatni faktori koji doprinose razvoju DNK imunizacije uključuju jednostavnost i nisku cijenu proizvodnje vakcine.
| Prednosti | Nedostaci |
|---|---|
|
|
Primjena DNK vakcina
Prve kliničke studije DNK vakcina, uz sigurnost nove metode, pokazale su njenu nisku efikasnost. Shvativši obećanje DNK imunizacije, naučne laboratorije, zajedno sa biotehnološkim kompanijama, usmjerile su napore na optimizaciju nove metode i za nekoliko godina postignut je značajan napredak. Godine 2005. prva DNK vakcina je dobila odobrenje FDA. Administracija hrane i droge) za upotrebu na životinjama. Od 2013. godine, više od sto DNK vakcina je u kliničkim ispitivanjima, a četiri DNK vakcine su licencirane za upotrebu u stočarstvu.
DNK vakcine u veterinarskoj medicini
Sve četiri vakcine koje je odobrila FDA baziraju se na plazmidu. Za tri od njih, proizvođač je preporučio način primjene intramuskularno; za LifeTide® vakcinu, to je injekcija u kombinaciji s elektroporacijom. Ako druge vakcine imaju za cilj aktiviranje imunološkog sistema, onda je za LifeTide® vakcinu imunostimulirajući efekat dodatni. Proizvod vakcine je somatoliberin, hormon koji stimuliše hipofizu da oslobađa hormon rasta i prolaktin. Djelovanje posljednja dva hormona kod svinja dovodi do povećanja težine životinja i povećanja broja legla. Istovremeno, uvođenje plazmida koji kodira somatoliberin životinjama stimulira proizvodnju T-limfocita, prirodnih stanica ubojica, te stoga povećava imunološku otpornost tijela.
| Trgovački naziv vakcine | Godina licenciranja | Target | Životinja | Proizvod vakcine | Svrha stvaranja vakcine |
|---|---|---|---|---|---|
| West Nile-Innovator® (SAD) | 2005 | Virus Zapadnog Nila | Konji | Strukturni protein virusa PreM-E | Zaštita od virusa |
| Apex-IHN® (Kanada) | 2005 | Uzročnik infektivne nekroze hematopoetskog tkiva | Riba iz porodice lososa | Virusni glikoprotein | Povećanje količine i kvaliteta riblje hrane |
| LifeTide® SW 5 (Australija) | 2008 | Hormon rasta | Svinje i druga stoka | Svinjski somatoliberin | Povećana veličina legla kod krmača; značajno smanjuje smanjenje perinatalnog mortaliteta i morbiditeta |
| ONCEPT® (SAD) | 2010 | Melanom | Psi | Ljudske tirozinaze | Kao alternativa zračenju i operaciji u liječenju melanoma |
Izgledi za DNK vakcinaciju
Antitumorske DNK vakcine
Dok je indukcija ćelijskog i humoralnog imunološkog odgovora uvjerljivo dokazana za strane antigene povezane sa zaraznim bolestima, upotreba DNK vakcina za liječenje raka do sada je bila manje uspješna. Izazov je izazivanje efikasnog antitumorskog imuniteta. Kliničke studije su potvrdile opću sigurnost i nisku toksičnost antitumorskih DNK vakcina, ali je djelotvornost imunološkog odgovora koje izazivaju slaba, a antitumorska aktivnost, u nekim slučajevima, općenito upitna.
DNK vakcine protiv virusnih i bakterijskih patogena
DNK vakcina protiv karijesa
Uzrok karijesa je lokalna promjena pH vrijednosti kao rezultat fermentacije (glikolize) ugljikohidrata koju provode bakterije. Naučnici sa Instituta za virusologiju u Wuhanu (Kina) razvili su DNK vakcinu protiv jednog od uzročnika karijesa - Streptococcus mutans. Vakcina je bazirana na plazmidu i kodira dva proteina: površinski protein St. mutans PAc i flagelin, izveden iz bakterija salmonela, koji deluje kao pomoćno sredstvo. U fazi pretkliničkih ispitivanja, vakcina je laboratorijskim glodarima davana kroz nos, nakon čega je kod životinja provjeren nivo imunoglobulina G u krvnom serumu i sekretornog imunoglobulina A u pljuvački. Nakon studija, naučnici su otkrili da je povećan nivo imunih proteina u krvi i pljuvački, ali, što je još važnije, rast kolonija je inhibiran. Streptococcus mutans na zubnoj caklini. Odnosno, zubi vakcinisanih životinja bili su bolje zaštićeni od karijesa.
DNK vakcine i tretmani za autoimune bolesti
DNK vakcina protiv dijabetesa tipa 1
Dijabetes tipa 1 karakterizira gubitak beta stanica koje proizvode inzulin smještenih u Langerhansovim otočićima gušterače. Glavni uzrok gubitka beta ćelija je autoimuno oštećenje od strane T ćelija ubica. Kako bi zaštitili beta ćelije od preaktivnog imunološkog sistema, naučnici sa univerziteta Stanford (SAD) i Leiden (Holandija) razvili su DNK vakcinu BHT-3021. Vakcina je bazirana na plazmidu i kodira prethodnik inzulina, proinzulin. Ovo je retroaktivna vakcina: ako konvencionalne vakcine treba da aktiviraju imune odgovore, onda BHT-3021, naprotiv, neutrališe citotoksični efekat T ćelija ubica usmerenih protiv Langerhansovih ostrvaca.
U prvoj fazi kliničkih ispitivanja, BHT-3021 je pokazao svoju efikasnost u grupi od 80 ljudi. Polovina njih je primala intramuskularne injekcije BHT-3021 svakih sedam dana tokom 12 sedmica, a druga polovina je primala placebo. Nakon ovog perioda, grupa koja je primila vakcinu pokazala je povećanje nivoa C-peptida u krvi, što ukazuje na obnovu funkcije beta ćelija. Ni kod jednog učesnika nisu zabilježene ozbiljne nuspojave. Efekat vakcine je trajao 2 meseca.
Slični članci
-
Teorijske osnove selekcije Proučavanje novog gradiva
Predmet – biologija Čas – 9 „A“ i „B“ Trajanje – 40 minuta Nastavnik – Želovnikova Oksana Viktorovna Tema časa: „Genetičke osnove selekcije organizama“ Oblik nastavnog procesa: čas u učionici. Vrsta lekcije: lekcija o komuniciranju novih...
-
Divni Krai mlečni slatkiši "kremasti hir"
Svi znaju kravlje bombone - proizvode se skoro stotinu godina. Njihova domovina je Poljska. Originalni kravlji je mekani karamela sa filom od fudža. Naravno, vremenom je originalna receptura pretrpjela promjene, a svaki proizvođač ima svoje...
-
Fenotip i faktori koji određuju njegovo formiranje
Danas stručnjaci posebnu pažnju posvećuju fenotipologiji. Oni su u stanju da za nekoliko minuta “dođu do dna” osobe i ispričaju mnogo korisnih i zanimljivih informacija o njoj Osobitosti fenotipa Fenotip su sve karakteristike u cjelini,...
-
Genitiv množine bez završetka
I. Glavni završetak imenica muškog roda je -ov/(-ov)-ev: pečurke, teret, direktori, rubovi, muzeji itd. Neke riječi imaju završetak -ey (stanovnici, učitelji, noževi) i nulti završetak (čizme, građani). 1. Kraj...
-
Crni kavijar: kako ga pravilno servirati i ukusno jesti
Sastojci: Crni kavijar, prema vašim mogućnostima i budžetu (beluga, jesetra, jesetra ili drugi riblji kavijar falsifikovan kao crni) krekeri, beli hleb meki puter kuvana jaja svež krastavac Način pripreme: Dobar dan,...
-
Kako odrediti vrstu participa
Značenje participa, njegove morfološke osobine i sintaktička funkcija Particip je poseban (nekonjugirani) oblik glagola, koji radnjom označava svojstvo objekta, odgovara na pitanje koji? (šta?) i kombinuje osobine.. .