Direkta och indirekta virologiska forskningsmetoder. Virologiska forskningsmetoder inom mikrobiologi. Laboratoriediagnostik av virusinfektioner

De huvudsakliga metoderna som används vid diagnos av virussjukdomar är odling och identifiering av virus.

För att bevisa sjukdomens virala etiologi är det nödvändigt att isolera viruset från kroppen av en sjuk fisk, skicka det vidare till en cellkultur eller känslig fisk, reproducera sjukdomen i friska fiskar av samma eller besläktade arter och återisolera samma virus från försöksdjur.

Flera kompletterande metoder används för att identifiera virus: elektronmikroskopi av viruset, studie av dess fysikalisk-kemiska egenskaper, upptäckt av karakteristiska morfologiska förändringar i infekterade celler och symtom hos infekterade djur, olika immunologiska metoder.

Virus isoleras huvudsakligen på enskikts primära eller transplanterade cellkulturer, välj kulturer som är känsliga för ett visst virus i varje enskilt fall. För att erhålla primära kulturer av fiskceller används oftast könskörtlarna hos karphonor eller crucian karp. Gonader bör vara II- eller II-III-stadier av mognad enligt Kiselevich-skalan. Sådana gonader innehåller inte ägg som är synliga för blotta ögat. Annars kommer innehållet i äggen att påverka celltillväxten negativt. Cellkulturer från karp och crucian karp bereds enligt den godkända metoden.

Som kontinuerliga odlingar är följande cellinjer mest använda: FHM - från vävnaderna i den kaudala pedunkeln av fathead minnow; RTG - från regnbågsforell gonader; EPC - från smittkoppor på huden på karp. Dessa linjer upprätthålls i specialiserade laboratorier för studier av fisksjukdomar vid veterinär- och fiskeforskningsinstitut, där de kan beställas och ta emot.

Vid diagnostisering av väl studerade virussjukdomar undersöks de organ och vävnader där patogenen är koncentrerad.

Vid fisksjukdomar, information om vilka som är otillräcklig, utsätts de mest drabbade organen för virologisk undersökning. Avskrapningar från huden och gälarna, bitar av dessa organ, tillsammans med slem, placeras i sterila flaskor med 2-3 ml steril saltlösning eller buffertlösning. Prover från de inre organen tas under strikt aseptiska förhållanden.

I fall där det är omöjligt att snabbt undersöka materialet, lagras det i högst en dag i kylskåp vid en temperatur som inte överstiger 5 ° C. Det frusna materialet kan lagras under längre tid.

Det patologiska materialet som är avsett för forskning krossas i en homogenisator eller mals i en porslinsmortel med kvartssand. En 10% suspension bereds av de krossade vävnaderna i Hank's, Earls lösningar, buffert eller fysiologisk koksaltlösning och centrifugeras i 10-15 minuter vid 2000-3000 rpm, supernatanten sugs av med en pipett och placeras i sterila flaskor. Om suspensionen inte är steril filtreras de preparerade materialen genom membranfilter med en pordiameter på 0,2-0,45 µm eller behandlas med antibiotika (penicillin 1000 IE/ml och streptomycin 1000 µg/ml).

En 20% suspension bereds av tarminnehållet i sterilt destillerat vatten och centrifugeras i 10-15 minuter vid 2000 rpm. Supernatanten centrifugeras igen vid 4000-5000 rpm under 30 minuter. Supernatanten sugs sedan in i en steril flaska och behandlas med antibiotika. För 1 ml tillsätt 1000 µg/ml streptomycin och 1000 IE/ml penicillin. Blandningen hålls i 2-3 timmar vid: rumstemperatur. Alla material testas för bakteriesterilitet genom inokulering på BCH och MPA. De förberedda materialen används omedelbart för arbete eller, i extrema fall, lagras i fruset tillstånd (vid en temperatur på minus 20 ° C).

Cellkulturinfektion. Rör med ett bra cellmonoskikt eller tillväxtzon runt explantatet används för infektion. Näringsmediet sugs av och 0,2-0,3 ml av testsuspensionen tillsätts i varje provrör. Samtidigt tillsätts 0,8-0,9 ml näringsmedium med 2-3% serum till provrören.

Material framställt från varje prov infekteras med vävnadskultur i 4-6 provrör. Från varje serie studier lämnas samma antal provrör som kontroller, och tillsätter 1 ml näringsmedium till dem. Rören lämnas i rumstemperatur i 1-2 timmar för adsorption av viruset på cellerna, sedan sugs supernatantvätskan av med en pipett och ett stödjande näringsmedium tillsätts till den ursprungliga volymen.

Infekterade cellkulturer och kontrollcellkulturer inkuberas vid en temperatur av 22-26°C och undersöks dagligen under ett lågförstoringsmikroskop för att detektera framträdande morfologiska förändringar i cellerna. Vid allvarlig celldegeneration aspireras odlingsvätskan och passager görs, och i frånvaro av en cytopatogen effekt (CPE) genomförs två på varandra följande passager. För att göra detta, använd odlingsvätskan tillsammans med den cellfraktion som förstörs genom upprepad frysning och upptining. Supernatanten av den centrifugerade cellmassan används för att infektera färska kulturer. CPP efter den tredje passagen beaktas som en specifik verkan av det virala medlet.

Graden av skada på cellmonoskiktet bedöms enligt 4-korssystemet; "+" - skada upp till 25%, "+ +" - upp till 50%, "+ + +" - upp till 75% och "+ + + +" - upp till 100% av monoskiktet.

I vissa virussjukdomar hos fisk uppträder inklusionskroppar i cellerna (cytoplasma i kärnan) i olika organ och vävnader. Materialet för studien av virala inneslutningar är infekterade vävnadskulturer, skrapningar och utstryk-avtryck från organ och vävnader, de angivna materialen fixeras före färgning enligt allmänt accepterade metoder, med Dubosque-Brazil-Bouena, Bouena, Carnoy-vätskor eller 10% lösning av neutralt formalin.

Virala inneslutningar färgas med olika metoder: enligt Muromtsev, rubin, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa, etc.

Titrering av viruset- kvantitativ bestämning av viral aktivitet. Virustitern uttrycks som antalet infektiösa enheter som ingår i en volymenhet av virussuspension. Virusets infektiösa enhet anses vara en sådan dos som orsakar infektion i 50% av mottagliga föremål som är infekterade med det. Denna dos av virus kallas infektiös och betecknas ID 50 .

Cellkulturer används främst som känsliga föremål vid titrering av fiskvirus. Titrering i cellkultur utförs enligt den cytopatogena effekten av virus. I detta fall kallas ID 50 för den cytopatogena dosen i vävnaden (TCD 50), och virustitern uttrycks som mängden TCD 50 i 1 ml virussuspension. Virustitern bestäms genom den slutliga spädningsmetoden. Enligt denna metod injicerar känsliga cellkulturer en viss volym virussuspension i successivt ökande utspädningar och, med hänsyn till resultatet för varje injektion som positivt (om CPE finns) eller negativt om CPE saknas), beräknas slutpunkten för titreringen - 1 TCD 50 .

För titrering av virus som ger en uttalad CPP används även plackmetoden. I det här fallet hälls ett monolager av celler infekterade med viruset med en blandning av näringsmedium med agar för att förhindra överföringen av viruset till andra celler som är betydligt avlägsna från de initialt infekterade och för att kunna infektera de initiala infektionshärdarna av placket).

Varje plack härrör från en infektiös enhet, som betecknas PFU (plackbildande enhet), och virustitern uttrycks som antalet PFU per volymenhet av suspensionen.

Neutraliseringsreaktion(RN) i cellkultur.

Reaktionen är baserad på bindningen av ett antigen med antikroppar av ett homologt antiserum. Reaktionen används för att identifiera patogener vid diagnos av sjukdomar av viral etiologi. Det låter dig bestämma med kända antikroppar ett okänt viralt antigen eller av ett känt (standard) antigen - okända antikroppar i sera från sjuka eller återhämtade fiskar.

Bestämningen av det isolerade viruset i neutraliseringsreaktionen utförs med användning av en uppsättning diagnostiska hyperimmuna antisera (antikroppar) av antigener (virus) homologa med dem.

Hyperimmuna antisera erhålls genom att infektera laboratoriedjur (till exempel kaniner) med kända virusstammar som orsakar fisksjukdomar. De erhållna antisera bestämmer titrarna för specifika antikroppar. För arbete tas antisera som innehåller antikroppar i höga titrar.

Reaktionsordningen.

1. Inaktivering av normalt och hyperimmunt serum genom uppvärmning till 56°C i 30 minuter.

2. Framställning av utspädningar av reaktionsingredienserna. Antigenet och serumet späds med ett näringsmedium utan serum och antibiotika, med början från 1: 5, 1: 50, 1: 500 och tills en utspädning erhålls med en halt på mindre än 1 TCD 50 / 0,2 ml. Hyperimmunserum späds 1:2 eller 1:5. Med en låg titer används serumet outspätt. Normalt serum späds ut på samma sätt som hyperimmunserum.

3. Redogörelse för reaktionen. Tre rader sterila provrör placeras i ett ställ. Utspätt hyperimmunserum hälls i den första raden, utspätt normalt serum i den andra och näringsmedium i den tredje. Varje ingrediens tillsätts i en volym av 0,5 ml.

De beredda spädningarna av viruset överförs i 0,5 ml till lämpliga provrör i var och en av de tre raderna, och viruset för varje spädning I överförs med en separat pipett, med början med den högsta spädningen. Således erhålls seriella 10-faldiga spädningar av viruset i varje rad av rör: 10-1, 10-2, etc.

För att kontrollera toxiciteten hos sera tillsätts 0,5 ml av den beredda spädningen av hyperimmunserum till ett separat rör och sedan tillsätts en lika stor mängd näringsmedium. Samma sak görs med vanligt serum.

Skaka rören med blandningar noggrant och inkubera i rumstemperatur i 1 timme. Infektera sedan cellkulturen med varje spädning av viruset (0,2 ml per rör) med hyperimmuna normala sera och näringsmedium, 4 rör cellodling. Parallellt, sätt kontroller på toxiciteten hos de använda cellerna och kontrollprover av cellodling.

Rör med cellkultur inkuberas i en termostat vid den optimala temperaturen för reproduktion av detta virus och undersöks dagligen under ett mikroskop med låg förstoring för att detektera virusets CPE. Resultaten förs in i tabellen (tabell 11).

Virustitern uttrycks som antalet infektiösa enheter i en volymenhet av virussuspensionen. Hitta neutralisationsindex (IN). Det motsvarar den maximala mängden ID 50 som kan neutraliseras av hyperimmunserum. Beräkning IN ledd av formeln: lgIN = lgT 1 - lgT 2 där T 1 - titer av viruset i närvaro av normalt serum; T2 - virustiter i närvaro av hyperimmunserum. Värdet på IN hittas från tabellen över antilogaritmer. Det är vanligt att betrakta värdet av IN upp till 10 som negativt, från 10 till 49 - tveksamt, 50 eller mer - ett positivt resultat.

Resultaten av reaktionen kan endast anses tillförlitliga om det hyperimmuna serumet testas för specifik neutraliserande aktivitet. För att göra detta, förutbestäm titern för neutraliserande antikroppar i detta serum eller dess neutraliseringsindex i reaktion med ett homologt virus.

Plackisolering av rhabdovirus. Denna metod är specifik, den används för isolering, preliminär typning och urval av karp- och öringsrhabdovirus i närvaro av specifika immunsera för virusidentifiering.

Rundade kolonier (plack) bildas i cellkulturer under agarbeläggning i närvaro av virus i testmaterialet.

Under aseptiska förhållanden samlas vävnad från njurarna, levern, mjälten och vätskan från bukhålan med en Pasteurpipett, överförs till en injektionsflaska med ett medium innehållande 500 IE (mcg) / ml antibiotika i förhållandet 1:10. De förvaras i 60-90 minuter vid centrifugering till 2 000 °C och sedan vid en temperatur på 2 000 °C. 0 minuter. Supernatanten späds med näringsmedium 1:10 (spädning 1:100). Båda spädningarna av supernatanterna används för att infektera cellkulturer.

För studien väljs en 3-dagars kontinuerlig cellkultur odlad i madrasser med ett väldefinierat monolager med en hastighet av 2 madrasser för varje utspädning av det patologiska materialet och 2 madrasser för kontroll. Näringsmediet avlägsnas från flaskorna och 2 ml av mediet utan fosterserum tillsätts. Sedan tillsätts 0,2 ml av det studerade patologiska materialet och lämnas för adsorption av viruset i 60 minuter vid en optimal temperatur för virus som infekterar fisk (för karpvirus - 24-26 ° C och för öringvirus - 16-18 ° C).

Kontroll läggs i 2 madrasser med cellkulturer på 0,2 ml, innehållande 100 TCD 50 /ml känt virus, och 2 - 0,2 ml näringsmedium utan virus.

Efter 60 minuter avlägsnas vätskan från flaskorna. På väggen mittemot monoskiktet införs 5 ml agarbeläggning uppvärmd till 40-42°C (vid isolering av HCV-viruset - inte mer än 38°C) i en 50 ml flaska. Madrasserna är nedsvängda i ett lager, täckta med svart papper. Efter 15-20 minuter överförs madrasserna för inkubation vid den optimala temperaturen för de studerade virusen. Madrasserna läggs med agarbelagda sidan uppåt. Med ett okänt virus hålls kulturerna vid två temperaturförhållanden - 14-18 och 22-24°C.

Infekterade cellkulturer ses mot en vit bakgrund. Om det finns ett virus i det studerade materialet i cellkulturen uppträder först genomskinliga prickar på kulturens rosa-matta bakgrund. I framtiden ökar de i storlek och bildar runda transparenta kolonier - plack, vars närvaro indikerar närvaron av rhabdovirus i det patologiska materialet.

Med en Pasteurpipett samlas en bit plack på gränsen till de drabbade och opåverkade delarna på ett sådant sätt att inte bara agaren utan även cellskiktet kommer in i den. Den valda biten placeras i ett provrör med 1 ml av tillväxtmediet, fryses vid minus 20°C och inkuberas i 60 min. Vid ett stort antal plack (hela cellskiktet är genomskinligt) upprepas studierna i spädningar på 10 -3 och 10 -4.

Plack med en diameter av 3-8 mm av karp-rhabdovirus på en kontinuerlig odling av EPC och FHM, inkuberade vid en temperatur av 24-26°C, uppträder på den 4-7:e dagen.

I frånvaro av plack och närvaro av CPD i cellkulturer utförs ytterligare studier av den virusinnehållande odlingsvätskan i spädningar om 10 -2 -10 -3 (2-3 passager). Som ytterligare metoder för att identifiera virus används följande: metoden för fluorescerande antikroppar; bestämning av virusets känslighet för kloroform, eter, pH-värde, uppvärmning; elektronmikroskopisk studie av virusmorfologi.

Forskning för diagnos av sjukdomar med viral natur. Detta är nödvändigt för att identifiera viruset, för att studera dess biologi och förmåga att påverka djur- och mänskliga celler. Således blir det möjligt att förstå patogenesen av virussjukdomar och följaktligen att välja rätt behandlingsmetod.

Vad är diagnosen?

i levande celler. För att undersöka det är det nödvändigt att odla det på nivån av en experimentell organism eller För detta utförs virologiska forskningsmetoder i medicinsk praxis och mikrobiologi i allmänhet, som har följande huvudmetoder:

• hetero;
• indirekt;
• serologiska.

Materialet kan undersökas direkt med avseende på närvaro av nukleinsyror, viralt antigen, eller till exempel för att isolera och identifiera viruset från kliniskt material.

Förutom förmågan att fastställa sjukdomens etiologi, övervaka den terapeutiska effekten, spelar virologiska forskningsmetoder en viktig roll i anti-epidemiåtgärder. För isolering och användning av kycklingembryon, laboratoriedjur eller cellkulturer.

Hur undersöks de?

Den snabbaste är den direkta metoden. Den låter dig upptäcka ett virus, antigen eller NA (nukleinsyra) i själva det kliniska materialet. Det tar från två timmar till en dag.

1. EM - elektronmikroskopi. Upptäcker viruset direkt.
2. IEM - immunelektronmikroskopi. Använder specifika antikroppar mot virus.
3. RIF - immunfluorescensreaktion. Använder färgämnesbundna antikroppar. Sådana virologiska forskningsmetoder används i stor utsträckning som en snabb avkodning av etiologin för SARS (akuta luftvägsvirusinfektioner), när svabbar tas från slemhinnan i de övre luftvägarna.
4. ELISA - enzymimmunoassay - bestämning av virala antigener, liknande RIF, men baserat på enzymmärkning av antikroppar.
5. RIA - radioimmunoanalys. Använder radioisotopmärkning av antikroppar för att ge hög känslighet vid virusantigendetektion.
6. Molekylär - NK-hybridisering eller isolering av virusgenom med hjälp av PCR (polymeraskedjereaktion).
7. Cytologi - används sällan, men för vissa infektioner är dessa virologiska metoder för forskning mycket effektiva. Biopsimaterial, obduktioner och utstryk som bearbetats för färgning och analys i mikroskop undersöks.

Vad är poängen med forskning?

För framgångsrik isolering av virus tas kliniskt material i enlighet med patogenesen och så tidigt som möjligt. Ofta kräver denna process flera passager innan vissa virologiska analyser tillämpas.

Mikrobiologi är studiet av mikroskopiska varelser. Och hennes område är inte bara medicin. Det är en grundläggande vetenskap för jordbruk, veterinärmedicin, rymd- och teknisk industri och geologi.

Men naturligtvis är allt skapat för människan och hennes utveckling på denna vackra planet. Därför är det mycket viktigt att upptäcka faran i tid och neutralisera den. Virus skiljer sig från bakterier. Dessa är strukturer som kommer in i kroppen och orsakar bildandet av en ny generation. De ser ut som kristaller och syftar till att kontrollera processen för deras reproduktion, även om de själva inte matar, växer inte och utsöndrar inte metaboliska produkter.

Viruset kan orsaka allvarlig sjukdom i alla levande organismer som det har kommit in i. Dessutom kan det utvecklas. Därför måste virologiska forskningsmetoder inom mikrobiologi utvecklas och förbättras, eftersom den mänskliga civilisationen som helhet kan vara hotad.

material

För att upptäcka och identifiera virus i medicin tar de som regel:

• nasofaryngeal sköljning (luftvägsinfektioner);
• rodnad och avföring (enterovirusinfektioner);
• skrapningar, innehållet i vesiklarna (hudskador, slemhinnor, som herpes, vattkoppor);
• rodnad (exantemiska infektioner som mässling, röda hund);
• blod, cerebrospinalvätska (arbovirusinfektioner).

Faser

Alla stadier av den virologiska forskningsmetoden inkluderar:

• insamling av material;
• urval, erhållande av ett testsystem, bestämning av dess livskraft;
• infektion av testsystemet;
• virusindikation;
• bestämma typen av virus.

I grund och botten skiljer sig patogena virus i närvaro av vävnad och typspecificitet. Ta till exempel poliovirus, som bara reproducerar i primater (i deras celler). Följaktligen används en specifik vävnadskultur för att isolera ett specifikt virus. Om vi ​​talar om en okänd patogen, skulle det vara tillrådligt att samtidigt infektera tre, och helst fyra cellkulturer.

Därför kanske någon av dem är känslig. För att bestämma närvaron av viruset i infekterade kulturer, titta på utvecklingen av specifik celldegeneration, intracellulära inneslutningar, detektion av ett specifikt antigen, positiv hemagglutination och hemadsorptionstest.

Alla virologiska undersökningsmetoder (direkta och indirekta, serologiska) bör väljas som de mest lämpliga för ett särskilt fall av misstänkt infektion.

Indirekta metoder är baserade på isolering och identifiering av viruset. De är mödosamma, långa, men exakta.

Serodiagnostik

Denna diagnos avser en metod baserad på antigen-antikroppsreaktionen. Oftast används parade blodserum som tas med flera veckors intervall. Om ökningen av antikroppstiter är 4 eller fler gånger anses reaktionen vara positiv. För att bestämma typspecificiteten för ett virus används ett virusneutraliseringstest. För att bestämma gruppspecificitet måste du få komplementfixeringsreaktionen.

Olika varianter av enzymimmunanalys, hemagglutinationshämningsreaktion, passiv hemagglutination, omvänd passiv hemagglutination, RIF används ofta. Även inom genteknik utvecklades en metod för att erhålla monoklonala antikroppar. Den snäva specificiteten hos monokloner kan övervinnas genom att använda flera monoklonala antikroppar mot olika virala determinanter. Sålunda har specificiteten och känsligheten hos analysen med bestämning av antigener ökats.

Vissa funktioner

Idag har många olika testsystem skapats för den immunologiska diagnosen av infektioner som är ett resultat av att ett virus tränger in i en levande organism.

Sålunda är virologiska forskningsmetoder metoder för att isolera virus, studera deras egenskaper och fastställa deras etiologiska samband med vissa sjukdomar.

Kursarbete

"Metoder för klinisk virologi"

Introduktion

Laboratoriediagnostik av virusinfektioner utförs huvudsakligen med hjälp av elektronmikroskopi, känsliga cellkulturer och immunologiska metoder. Som regel väljs vilken metod som helst för diagnosen, beroende på stadium av virusinfektionen. Således kan till exempel alla tre tillvägagångssätten vara användbara vid diagnos av vattkoppor, men framgångsrik användning av mikroskopi och cellodlingsmetoder beror på förmågan att samla in tillfredsställande prover i ett relativt tidigt stadium av sjukdomen.

Till stor del beror framgången för viral diagnostik också på kvaliteten på de erhållna proverna. Av denna anledning bör laboratoriepersonalen själva vara direkt involverade i insamlingen av de nödvändiga proverna. Egenskaperna hos proverna, såväl som metoderna för deras leverans till laboratoriet, beskrivs av Lennett, Schmidt, Krist et al.

De flesta av de reagenser och instrument som används i laboratoriediagnostik är tillgängliga från olika företag. I de flesta fall produceras samma reagens samtidigt av flera företag. Av denna anledning listade vi inte enskilda företag, såvida inte reagenset levereras av endast ett företag. I alla andra fall bör du hänvisa till den allmänna listan över leverantörer som anges i tabellen. 1.

Vi syftade inte till en heltäckande beskrivning av alla för närvarande tillgängliga metoder för att diagnostisera humana virusinfektioner. Först och främst har vi beskrivit huvudmetoderna. I takt med att du får erfarenhet av självständigt arbete kan dessa grundläggande metoder användas för att lösa mer komplexa problem.

1. Elektronmikroskopi

För elektronmikroskopisk diagnostik av virusinfektioner kan tunna sektioner av den drabbade vävnaden användas. Det vanligaste materialet för elektronmikroskopi är avföring eller vätska.

Tabell 1. Förteckning över företag som levererar reagenser och utrustning

Flödeslaboratorier: Gibco Europa: Vävnadskulturtjänster: Välkommen Diagnostik: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, Storbritannien Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, Storbritannien Southern Waiington 5BR, Craberml South Road, Craberml South Road, Craberml South , Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, Storbritannien Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, Storbritannien 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, Storbritannien Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, Storbritannien

blåsor som kännetecknar vissa sjukdomar, såsom vattkoppor. Vid analys av sådant material kan virus detekteras med hjälp av negativ färgning, vilket leder till avgränsning av virionens komponenter med elektrontätt material. Metoden är effektiv vid höga koncentrationer av virus i testprover, såsom i avföring eller vesikulär vätska. I de fall halten av viruspartiklar i proverna är låg kan sannolikheten för att upptäcka viruset ökas genom att koncentrera viruset genom ultracentrifugering eller genom att aggregera det med specifika antikroppar. Den senare metoden är också bekväm för att identifiera virus. Här beskriver vi den elektronmikroskopiska metoden för att diagnostisera rotavirusinfektion och metoden för immunelektronmikroskopi med hjälp av exemplet på detektion av specifika antikroppar mot parvovirus. Metoderna för elektronmikroskopi beskrivs mer i detalj av Field.

2.1 Direkt elektronmikroskopi av avföring

1. Änden av Pasteurpipetten sänks ned i avföringen och tillräckligt med material samlas upp för att få ett 1 cm utstryk.

2. Återsuspendera det fekala utstryket i negativ elektronmikroskopfärg tills en genomskinlig suspension erhålls. Den negativa kontrastfärgen är en 2% lösning av fosfovolframsyra i destillerat vatten.

3. För att erhålla ett elektronmikroskopiskt preparat placeras en suspensionsdroppe på ett elektronmikroskopiskt galler belagt med en kol-formvar-film. Under denna operation hålls nätet med en fin pincett.

4. Läkemedlet lämnas i luften i 30 sekunder.

5. Överflödig vätska avlägsnas genom att röra vid kanten av glaset med filterpapper.

6. Läkemedlet torkas i luft.

7. Vid behov inaktiveras det livskraftiga viruset genom att bestråla båda sidor av gallret med ultraviolett ljus med en intensitet av 440 000 μW-s/cm 2 . I det här fallet används en kortvågig ultraviolett lampa med ett filter. Lampan ska vara på ett avstånd av 15 cm från gallret; bestrålningstid för varje sida - 5 min.

8. Rotavirusvirioner kan karakteriseras under ett transmissionselektronmikroskop med en förstoring på 30 000 till 50 000.

2.2 Immunelektronmikroskopi

Metoden för immunelektronmikroskopi som beskrivs nedan är bara en av många liknande immunologiska metoder. För att studera virusspecifika antikroppar används dessutom en metod som innebär bindning till ett mikroskopiskt nätverk av protein A. Arbetskoncentrationen av antivirala antikroppar bestäms genom försök och fel i intervallet från 1/10 till 1/1000. Koncentrationen som anges av oss används som regel i rutinarbete. För att erhålla optimala resultat av interaktionen av antikroppar med viruset titreras serum som innehåller parvovirus på samma sätt.

1. 10 µl humant parvovirus-antiserum utspätt 100 gånger med PBS. Lösningen upphettas i ett vattenbad till 56°C.

2. Smält 10 ml 2% agaros i PBS på vanligt sätt och kyl till 56°C i ett vattenbad.

3. Vid 56°C, blanda 1 ml utspätt antiserum med 1 ml 2% agaros.

4. Överför 200 µl av den resulterande blandningen till två brunnar på en mikrotiterplatta med 96 brunnar.

5. Låt agarosen stelna vid rumstemperatur. Plattan kan förvaras vid 4°C i flera veckor om den förseglas med tejp.

6. Tillsätt 10 µl serum som innehåller parvovirus till brunnen som innehåller blandningen av agaros och antiserum.

7. Ett elektronmikroskopinät med en förberedd kol-formvar-beläggning placeras med den mindre glänsande sidan på en droppe serum.

8. Gallret förvaras i 2 timmar vid 37 °C i en fuktkammare.

9. Med en tunn pincett tas nätet ut och en droppe 2% fosfovolframsyra appliceras på ytan av nätet som var i kontakt med serumet.

10. Efter 30 s tvättas överskottsfärgen bort, preparatet torkas och viruset inaktiveras.

Aggregerade virala partiklar undersöks under ett transmissionselektronmikroskop med en förstoring av 30 000 till 50 000.

3. Identifiering av virala antigener

Virus i vävnader eller vävnadsvätskor kan identifieras av virusspecifika proteiner med hjälp av antigen-antikroppsreaktionen. Produkten av antigen-antikroppsreaktionen testas för en märkning, som införs antingen direkt i antivirala antikroppar eller i antikroppar riktade mot virusspecifika antikroppar. Antikroppar kan märkas med fluorescein, radioaktivt jod eller ett enzym som klyver substratet med en färgförändring. Dessutom används en hemagglutinationsreaktion för att identifiera viruset. I den dagliga praktiken används de beskrivna metoderna främst för att upptäcka hepatit B-virusantigener i blodet och för att söka efter antigener av olika virus som orsakar olika luftvägssjukdomar.

För närvarande producerar många företag erytrocyter, radioaktiva och enzymatiska diagnostikum, inklusive de för detektering av viruset hepatit B. Vi anser inte att det är lämpligt att beskriva metoderna för att arbeta med dessa diagnostikum: det räcker med att följa de bifogade instruktionerna. Nedan kommer vi att fokusera på immunfluorescensmetoden för identifiering av respiratoriskt syncytialvirus i nasofaryngeala sekret.

3.1 Identifiering av respiratoriskt syncytialvirus i nasofaryngeala sekret genom immunfluorescens

Metoden för att erhålla preparat av nasofaryngeala sekret beskrivs av Gardner och McQuilin. Under laboratorieförhållanden utförs denna operation i två steg. Först framställs ett utstryk från nasofaryngealt slem på en glasskiva. De erhållna pinnproverna kan förvaras i fixerat tillstånd vid -20°C i många månader. I det andra steget färgas utstryk för att detektera antigenet från det respiratoriska syncytialviruset. För detta ändamål används metoden för indirekt immunfluorescens.

3.1.1 Beredning av nasofarynxsekret

1. Slem från speciell pincett tvättas bort med 1-2 ml PBS och överförs till ett centrifugrör.

2. Centrifugera i 10 minuter vid 1500 rpm i en bordscentrifug.

3. Supernatanten kasseras.

4. Cellpelleten återsuspenderas försiktigt i 2-3 ml PBS tills en homogen suspension erhålls. För att göra detta, använd en Pasteurpipett med bred mun.

5. Den resulterande suspensionen överförs till ett provrör.

6. Tillsätt ytterligare 2-4 ml PBS till suspensionen och blanda genom pipettering. Stora slemproppar tas bort.

7. Centrifugera i 10 minuter vid 1500 rpm i en bordscentrifug.

8. Supernatanten dräneras, fällningen återsuspenderas i en sådan volym PBS att den resulterande suspensionen lätt kan separeras från provrörets väggar.

9. Den resulterande suspensionen appliceras på det markerade objektglaset.

10. Glaset torkas i luft.

Fixera i aceton i 10 min vid 4°C.

12. Efter fixering torkas glaset igen i luft.

13. De resulterande preparaten färgas omedelbart eller förvaras vid -20 °C.

3.1.2. Färgningsteknik

1. Skriv ut och späd kommersiellt antiserum mot RSV i PBS till den rekommenderade arbetskoncentrationen.

2. Applicera en droppe antiserum på det förberedda preparatet med en Pasteurpipett.

3. Läkemedlet placeras i en fuktkammare.

4. Beredningen inkuberas i 30 minuter vid 37 °C.

5. Proverna tvättas noggrant med PBS för att avlägsna överskott av antikroppar i en speciell tank.

6. Proverna tvättas i tre skift av PBS under 10 min vardera.

7. Torka proverna, ta bort överskott av PBS med filterpapper och lufttorka.

Virologiska forskningsmetoder— Metoder för att studera virusens biologi och deras identifiering. Inom virologi används metoder för molekylärbiologi i stor utsträckning, med hjälp av vilka det var möjligt att fastställa den molekylära strukturen hos virala partiklar, hur de tränger in i cellen och egenskaperna hos reproduktionen av virus, den primära strukturen av virala nukleinsyror och proteiner. Metoder för att bestämma sekvensen av beståndsdelar i virala nukleinsyror och proteinaminosyror håller på att utvecklas. Det blir möjligt att koppla funktionerna hos nukleinsyror och proteinerna som kodas av dem med nukleotidsekvensen och att fastställa orsakerna till intracellulära processer som spelar en viktig roll i patogenesen av en virusinfektion.

Virologiska forskningsmetoder är också baserade på immunologiska processer (interaktion av ett antigen med antikroppar), virusets biologiska egenskaper (förmågan att hemagglutinera, hemolys, enzymatisk aktivitet), egenskaperna hos virusets interaktion med värdcellen (naturen hos den cytopatiska effekten, bildandet av intracellulära inneslutningar, etc.).

Vid diagnos av virusinfektioner, vid odling, isolering och identifiering av virus, såväl som vid framställning av vaccinpreparat, används metoden för vävnad och cellodling i stor utsträckning. Primära, sekundära, stabila kontinuerliga och diploida cellkulturer används. Primära kulturer erhålls genom att dispergera vävnad med proteolytiska enzymer (trypsin, kollagenas). Cellkällan kan vara vävnader och organ (oftast njurar) från mänskliga och djur embryon. En suspension av celler i ett näringsmedium placeras i de så kallade madrasserna, flaskorna eller petriskålarna, där cellerna börjar föröka sig efter att de har fästs på kärlets yta. För virusinfektion används vanligtvis ett cellmonolager. Näringsvätskan dräneras, virussuspensionen införs i vissa spädningar och efter kontakt med cellerna tillsätts färskt näringsmedium, vanligtvis utan serum.

Celler från de flesta primärkulturer kan subodlas och kallas sekundära kulturer. Med ytterligare passage av celler bildas en population av fibroblastliknande celler, kapabla till snabb reproduktion, av vilka de flesta behåller den ursprungliga uppsättningen kromosomer. Dessa är de så kallade diploida cellerna. Vid serieodling av celler erhålls stabila kontinuerliga cellkulturer. Under passager uppstår snabbt delande homogena celler med en heteroploid uppsättning kromosomer. Stabila cellinjer kan vara monolager och suspension. Enskiktskulturer växer i form av ett kontinuerligt lager på glasytan, suspensionskulturer växer i form av suspensioner i olika kärl med hjälp av omrörare. Det finns över 400 cellinjer som kommer från 40 olika djurarter (inklusive primater, fåglar, reptiler, amfibier, fiskar, insekter) och människor.

Bitar av enskilda organ och vävnader (organkulturer) kan odlas i konstgjorda näringsmedia. Dessa typer av kulturer bevarar vävnadsstruktur, vilket är särskilt viktigt för isolering och passage av virus som inte reproducerar sig i odifferentierade vävnadskulturer (till exempel coronavirus).

I infekterade cellkulturer kan virus detekteras genom en förändring i cellmorfologi, cytopatisk verkan, som kan vara specifik, uppkomsten av inneslutningar, genom att bestämma virala antigener i cellen och i odlingsvätskan; bestämning av de biologiska egenskaperna hos viral avkomma i odlingsvätska och titrering av virus i vävnadsodlingar, kycklingembryon eller känsliga djur; genom att detektera individuella virala nukleinsyror i celler genom molekylär hybridisering eller kluster av nukleinsyror genom cytokemisk metod med användning av fluorescerande mikroskopi.

Isolering av virus är en mödosam och långvarig process. Det utförs för att bestämma typen eller varianten av viruset som cirkulerar bland befolkningen (till exempel för att identifiera serovarianten av influensaviruset, vild- eller vaccinstam av polioviruset, etc.); i de fall det är nödvändigt att vidta akuta epidemiologiska åtgärder; när nya typer eller varianter av virus dyker upp; vid behov, bekräfta den preliminära diagnosen; för indikering av virus i miljöobjekt. Vid isolering av virus beaktas möjligheten för deras uthållighet i människokroppen, liksom förekomsten av en blandad infektion orsakad av två eller flera virus. En genetiskt homogen population av ett virus som erhållits från en enda virion kallas en viral klon, och processen för att erhålla den kallas kloning.

För att isolera virus, infektion av mottagliga försöksdjur, används kycklingembryon, men vävnadskultur används oftast. Närvaron av ett virus bestäms vanligtvis av specifik celldegeneration (cytopatisk effekt), bildandet av symplaster och syncytier, detektering av intracellulära inneslutningar, såväl som ett specifikt antigen som detekteras med hjälp av immunfluorescens, hemadsorption, hemagglutination (i hemagglutinerande virus), etc. Dessa tecken kan upptäckas först efter 2-3 passager av viruset.

För isolering av ett antal virus, såsom influensavirus, används kycklingembryon, för isolering av vissa Coxsackie-virus och ett antal arbovirus används nyfödda möss. Identifiering av isolerade virus utförs med serologiska tester och andra metoder.

När man arbetar med virus bestäms deras titer. Titrering av virus utförs vanligtvis i vävnadsodling, vilket bestämmer den högsta utspädningen av den virusinnehållande vätskan, vid vilken vävnadsdegenerering sker, inneslutningar och virusspecifika antigener bildas. Plackmetoden kan användas för att titrera ett antal virus. Plack, eller negativa kolonier av virus, är foci av virusförstörda celler i en enskiktsvävnadskultur under agarbeläggning. Koloniräkning tillåter en kvantitativ analys av virusens infektiösa aktivitet på basis av att en infektiös viruspartikel bildar en plack. Plack identifieras genom att färga kulturen med vitala färgämnen, vanligtvis neutralröda; plack adsorberar inte färgämnet och är därför synliga som ljusa fläckar mot bakgrund av färgade levande celler. Titern på viruset uttrycks som antalet plackbildande enheter i 1 ml.

Rening och koncentrering av virus utförs vanligtvis genom differentiell ultracentrifugering följt av centrifugering i koncentrations- eller densitetsgradienter. För att rena virus används immunologiska metoder, jonbyteskromatografi, immunosorbenter etc.

Laboratoriediagnostik av virala infektioner inkluderar detektering av patogenen eller dess komponenter i kliniskt material; virusisolering från detta material; serodiagnos. Valet av laboratoriediagnostisk metod i varje enskilt fall beror på sjukdomens natur, sjukdomsperioden och laboratoriets kapacitet. Modern diagnostik av virusinfektioner är baserad på uttryckliga metoder som gör det möjligt att få ett svar några timmar efter att ha tagit kliniskt material i de tidiga stadierna efter sjukdomen. Dessa inkluderar elektron- och immunelektronmikroskopi, såväl som immunfluorescens, metoden för molekylär hybridisering, detektering av antikroppar av lgM-klassen, etc.

Elektronmikroskopi av negativt färgade virus möjliggör differentiering av virus och bestämning av deras koncentration. Användningen av elektronmikroskopi vid diagnos av virusinfektioner är begränsad till de fall där koncentrationen av viruspartiklar i det kliniska materialet är tillräckligt hög (10 5 av 1) ml och högre). Nackdelen med metoden är oförmågan att skilja mellan virus som tillhör samma taxonomiska grupp. Denna nackdel elimineras genom att använda immunelektronmikroskopi. Metoden bygger på bildandet av immunkomplex när specifikt serum tillsätts viruspartiklar, samtidigt som den samtidiga koncentrationen av viruspartiklar sker, vilket gör det möjligt att identifiera dem. Metoden används även för att detektera antikroppar. För uttrycklig diagnostik utförs en elektronmikroskopisk undersökning av vävnadsextrakt, avföring, vätska från vesikler och hemligheter från nasofarynx. Elektronmikroskopi används i stor utsträckning för att studera morfogenesen av viruset; dess kapacitet utökas med användning av märkta antikroppar.

Metoden för molekylär hybridisering, baserad på detektering av virusspecifika nukleinsyror, gör det möjligt att detektera enstaka kopior av gener och har ingen motsvarighet när det gäller känslighet. Reaktionen är baserad på hybridisering av komplementära strängar av DNA eller RNA (sonder) och bildandet av dubbelsträngade strukturer. Den billigaste sonden är klonat rekombinant DNA. Sonden är märkt med radioaktiva prekursorer (vanligtvis radioaktiv fosfor). Användningen av kolorimetriska reaktioner är lovande. Det finns flera varianter av molekylär hybridisering: punkthybridisering, blothybridisering, sandwichhybridisering, in situ hybridisering, etc.

Antikroppar av klass lgM uppträder tidigare än klass G-antikroppar (den 3-5:e sjukdomsdagen) och försvinner efter några veckor, så deras upptäckt tyder på en nyligen genomförd infektion. Antikroppar av IgM-klassen detekteras genom immunfluorescens eller enzymimmunanalys med användning av anti-m antisera (anti-IgM tungkedjesera).

Serologiska metoder inom virologi är baserade på klassiska immunologiska reaktioner (se. Immunologiska forskningsmetoder ): komplementfixeringsreaktioner, hemagglutinationshämning, biologisk neutralisering, immundiffusion, indirekt hemagglutination, radiell hemolys, immunfluorescens, enzymimmunanalys, radioimmunoanalys. Mikrometoder för många reaktioner har utvecklats och deras tekniker förbättras kontinuerligt. Dessa metoder används för att identifiera virus med hjälp av en uppsättning kända sera och för serodiagnos för att bestämma ökningen av antikroppar i det andra serumet jämfört med det första (det första serumet tas de första dagarna efter sjukdomen, det andra - efter 2-3 veckor). Diagnostiskt värde är inte mindre än en fyrfaldig ökning av antikroppar i det andra serumet. Om upptäckten av antikroppar av lgM-klassen indikerar en nyligen genomförd infektion, kvarstår antikropparna i lgC-klassen i flera år, och ibland livet ut.

För att identifiera individuella antigener av virus och antikroppar mot dem i komplexa blandningar utan föregående proteinrening, används immunblotting. Metoden kombinerar proteinfraktionering med polyakrylamidgelelektrofores med efterföljande immunanalys av proteiner genom enzymimmunanalys. Separationen av proteiner minskar kraven på antigenets kemiska renhet och gör det möjligt att identifiera individuella antigen-antikroppspar. Denna uppgift är till exempel relevant vid serodiagnos av HIV-infektion, där falskt positiva enzymimmunoanalysreaktioner beror på närvaron av antikroppar mot cellantigener, som är närvarande som ett resultat av otillräcklig rening av virala proteiner. Identifiering av antikroppar i patienters sera mot interna och externa virala antigener gör det möjligt att bestämma sjukdomsstadiet, och vid analys av populationer, variationen av virala proteiner. Immunblotting vid HIV-infektion används som ett bekräftande test för att upptäcka individuella virala antigener och antikroppar mot dem. Vid analys av populationer används metoden för att bestämma variabiliteten hos virala proteiner. Metodens stora värde ligger i möjligheten att analysera antigener syntetiserade med rekombinant DNA-teknik, fastställa deras storlek och närvaron av antigena determinanter.

Virologiska studier på kliniken för infektionssjukdomar blir allt viktigare, vilket främst beror på ökningen av andelen infektioner av viral natur, vars klinik inte alltid är typisk. Samtidigt har snabba och pålitliga metoder för virologisk diagnostik inte utvecklats för alla infektionssjukdomar, många av dem är mödosamma, de kräver speciella förhållanden, försöksdjur, näringsmedia och utbildad personal. För närvarande används tre huvudtyper av forskning för att diagnostisera virusinfektioner.
1. Mikroskopisk undersökning av infektiöst material för att upptäcka viralt antigen eller patognomoniska förändringar i vävnader. För diagnostiska ändamål används direkt mikroskopisk undersökning av smittsamt material från patienter för ett begränsat antal virusinfektioner (rabies, vattkoppor, gul feber, herpes etc.). En metod baserad på detektering av viralt antigen med hjälp av fluorescerande antikroppar har fått bredare tillämpning. Metoden för immunfluorescens kan vara tillförlitlig endast om alla tekniska krav är strikt uppfyllda.
2. Virologiska metoder.
3. Serologiska studier för att fastställa ökningen av antikroppstiter under sjukdomsförloppet. Serologiska forskningsmetoder är mer tillgängliga i laboratoriet.
För dessa studier är det nödvändigt att ta blodserum under sjukdomens akuta period och under konvalescensperioden (parade sera). Blodprover för serologiska studier tas sterila utan antikoagulantia och konserveringsmedel.
Huvudstadierna i virologisk forskning är isoleringen av virus, deras identifiering och karakteriseringen av de viktigaste biologiska egenskaperna. Det finns för närvarande ingen enskild metod för att isolera olika grupper av virus. Detta beror främst på mångfalden av deras egenskaper och egenskaper vid odling utanför värdorganismen. För studien används biosubstrat (tvättningar från slemhinnor, blod och dess komponenter, cerebrospinalvätska, urin och avföring, biopsiprover av organ och vävnader eller deras bitar tagna under obduktion), som utsätts för speciell bearbetning följt av passage av materialet. Materialet som tas för forskning bör förvaras vid en temperatur från -20 °C till -70 °C. Beroende på den preliminära diagnosen har bearbetningen av materialet sina egna egenskaper, men i alla fall är det tänkt att det ska erhållas ett substrat som är maximalt renat från föroreningar av slem, celler från organ och vävnader eller deras fragment, bakterier. Detta uppnås genom att homogenisera testmaterialet i en speciell apparat eller mala i en porslinsmortel i kyla med kvartsglas (bitar av organ och vävnader) med tillsats av steril kyld (+4 C) 0,9 %

natriumkloridlösning för att erhålla en 10-30% suspension och efterföljande centrifugering vid 1500-3000 rpm under 10-15 minuter. Den sålunda erhållna supernatanten används för ytterligare studier.
Innan den intensiva utvecklingen och introduktionen av metoden för vävnads- och cellodling i bred tillämpning, användes infektion av försöksdjur eller kycklingembryon. Dessa metoder används fortfarande idag. Detektering av virus med hjälp av djur är mest lämplig i de fall där det är möjligt att i experimentet återge en typisk bild av en infektionssjukdom eller dess individuella manifestationer. Således kan patogener från arbovirus- och Coxsackie-grupperna detekteras genom infektion i hjärnan hos diande möss, influensa - genom infektion av kycklingembryon eller intranasal administrering av testmaterialet till möss. Under de senaste åren har virologiska laboratorier mest använt metoden för cell- och vävnadsodling, vilket gör det möjligt att isolera adenovirus, herpesvirus, respiratoriskt syncytialvirus, myxovirus och andra, och att utföra etiologisk diagnos av sjukdomen redan i de första stadierna av studien. Grunden för detta är de väl studerade cytologiska egenskaperna hos interaktionen mellan de flesta virus och celler. Således leder infektion av HeLa, Hep-2-celler med ett material innehållande adenovirus typ 2 redan på den 3:e dagen till en förändring av cellmonoskiktets tillväxtmönster och till uppkomsten av typiska celler i form av vindruvor etc., väldefinierade i ett konventionellt ljusmikroskop vid låg förstoring.
Av exceptionell betydelse för den etiologiska diagnosen av en infektionssjukdom är standardiseringen av virusisolering från testmaterialet, som i detta skede av arbetet innebär användning av genetiskt rena linjära djur, med hänsyn tagen till deras fenotypiska (främst ålder) egenskaper. Detta beror främst på att försöksdjur av olika genetiska linjer och åldrar är mottagliga för virus i varierande grad. Under intracerebral infektion av möss med den neurotropa WSN-stammen av influensaviruset visade BALB/c, A, CBA och utavlade djurlinjer den högsta känsligheten, samma mönster etablerades i fall av intranasal administrering av testmaterialet. Väsentligt för de slutliga resultaten av virusisolering är en preliminär undersökning av djur, kycklingembryon, cell- och vävnadskulturer för latenta virusbärare. Mycket allmänt använt i laboratoriepraxis, kan kycklingembryon infekteras med fågelleukemivirus, fågelencefalomyelit, infektiös bihåleinflammation, psittacos, Newcastlesjuka, patogener av vissa bakterieinfektioner (paratyfoid, etc.), såväl som mykoplasma. Ett ännu större antal bakteriella och speciellt virala medel kan spontant infektera cell- och vävnadskulturer och överleva i dem. Deras närvaro påverkar avsevärt bedömningen av materialet som studeras. Vissa typer av mykoplasma i cellkultur
kan orsaka hemagglutination och hemadsorption och till och med bilda plack under agarbeläggningen, liknande de virus som bildas. Lika viktigt är det också att förorena cellkulturer av en typ av typ av andra, detta är oftast förknippat med HELA-celler och observeras när man arbetar med olika typer av kulturer i ett rum, med dålig bearbetning av laboratorierätter, etc. Närvaron av kontaminering av cellgrödor eller infektion av djur med bakteriella medel, som regel, manifesterar sig ganska tydligt i cellens natur, cellens växtegenskaper, en förändring av cellens kulturell miljö (en förändring av cellens växtmiljö, växtmiljön). s Mabienes eller djur med vissa symtom, etc.) och representerar inte mycket svårigheter när man utvärderar resultaten. Situationen är mer komplicerad med latenta former av infektion, där användning av serologiska och andra metoder krävs. Dessa instruktioner bör beaktas i en virologs arbete, särskilt när man utför en etiologisk diagnos av oklara fall av sjukdomen.