I slutet av artikeln, se
Polymeraskedjereaktion (PCR, PCR) uppfanns 1983 av Carey Mullis (amerikansk vetenskapsman). Därefter fick han Nobelpriset för denna uppfinning. För närvarande är PCR-diagnostik en av de mest exakta och känsliga metoderna för att diagnostisera infektionssjukdomar.
Polymeraskedjereaktion (PCR)- en experimentell metod för molekylärbiologi, en metod för att signifikant öka små koncentrationer av vissa fragment av nukleinsyra (DNA) i ett biologiskt material (prov).
PCR-metoden bygger på en upprepad fördubbling av en viss del av DNA med hjälp av enzymer under artificiella förhållanden (in vitro). Som ett resultat produceras tillräckliga mängder DNA för visuell detektion. I detta fall kopieras endast det område som uppfyller de angivna villkoren, och endast om det finns i provet som studeras.
Förutom att helt enkelt öka antalet DNA-kopior (denna process kallas amplifiering), tillåter PCR många andra manipulationer med genetiskt material (införande av mutationer, splitsning av DNA-fragment), och används i stor utsträckning i biologisk och medicinsk praxis, till exempel, att diagnostisera sjukdomar (ärftliga, smittsamma), att fastställa faderskap, att klona gener, införa mutationer, isolera nya gener.

Specificitet och tillämpning

Genomförande av PCR

För PCR krävs i det enklaste fallet följande komponenter:

• DNA-mall som innehåller sektionen av DNA som ska amplifieras;
• två primrar som är komplementära till ändarna av det önskade fragmentet;
• termostabilt DNA-polymeras;
• deoxinukleotidtrifosfater (A, G, C, T);
• Mg2+-joner nödvändiga för polymerasdrift;
• buffert-lösning.

PCR utförs i en förstärkare - en enhet som ger periodisk kylning och uppvärmning av provrör, vanligtvis med en noggrannhet på minst 0,1 ° C. För att undvika avdunstning av reaktionsblandningen tillsätts en högkokande olja, såsom vaselin, i provröret. Tillsatsen av specifika enzymer kan öka utbytet av PCR-reaktionen.
Reaktionens framsteg

Vanligtvis, när man utför PCR, utförs 20 - 35 cykler, som var och en består av tre steg. Den dubbelsträngade DNA-mallen upphettas till 94-96°C (eller 98°C om ett särskilt värmestabilt polymeras används) under 0,5-2 minuter för att tillåta DNA-strängarna att separera. Detta stadium kallas denaturering - vätebindningarna mellan de två kedjorna förstörs. Ibland, före den första cykeln, förvärms reaktionsblandningen i 2–5 minuter för att helt denaturera mallen och primrarna.
När strängarna separeras sänks temperaturen för att tillåta primrarna att binda till den enkelsträngade mallen. Detta stadium kallas glödgning. Glödgningstemperaturen beror på primrarna och väljs vanligtvis 4 - 5°C under deras smältpunkt. Scentid - 0,5 - 2 minuter.

DNA-polymeras replikerar mallsträngen med användning av primern som en primer. Detta är förlängningsstadiet. Töjningstemperaturen beror på polymeraset. Ofta använda polymeraser är mest aktiva vid 72°C. Förlängningstiden beror både på typen av DNA-polymeras och på längden av fragmentet som amplifieras. Typiskt tas förlängningstiden till en minut för varje tusen baspar. Efter slutet av alla cykler utförs ofta ett ytterligare steg av slutlig förlängning för att fullborda alla enkelsträngade fragment. Detta steg varar 10 - 15 minuter.
Beredning av material för forskning och transport till laboratoriet

För en framgångsrik analys är det viktigt att korrekt samla in materialet från patienten och förbereda det korrekt. Det är känt att i laboratoriediagnostik görs majoriteten av felen (upp till 70%) vid provberedningsstadiet. För att ta blod i INVITRO-laboratoriet används idag vakuumsystem, som å ena sidan minimalt skadar patienten, och å andra sidan tillåter att materialet tas på ett sådant sätt att det inte kommer i kontakt med antingen personalen eller miljön. Detta undviker kontaminering (kontamination) av materialet och säkerställer objektiviteten i PCR-analysen.

DNA - deoxiribonukleinsyra - en biologisk polymer, en av två typer av nukleinsyror som tillhandahåller lagring, överföring från generation till generation och implementering av det genetiska programmet för utveckling och funktion av levande organismer. Den huvudsakliga rollen för DNA i celler är långtidslagring av information om strukturen hos RNA och proteiner.

RNA - ribonukleinsyra är en biologisk polymer som i sin kemiska struktur liknar DNA. RNA-molekylen är byggd av samma monomerenheter - nukleotider som DNA. I naturen existerar RNA vanligtvis som en enda sträng. I vissa virus är RNA bärare av genetisk information. I cellen spelar den en viktig roll i överföringen av information från DNA till protein. RNA syntetiseras på en DNA-mall. Denna process kallas transkription. Det finns avsnitt i DNA som innehåller information som är ansvarig för syntesen av tre typer av RNA, som skiljer sig åt i sina funktioner: budbärar- eller budbärar-RNA (mRNA), ribosomalt (rRNA) och transport (tRNA). Alla tre typerna av RNA är involverade i proteinsyntesen på ett eller annat sätt. Information om proteinsyntes finns dock endast i mRNA.

Nukleotider är den grundläggande repeterande enheten i nukleinsyramolekyler, produkten av en kemisk förening av en kvävebas, ett socker med fem kolatomer (pentos) och en eller flera fosfatgrupper. Nukleotider som finns i nukleinsyror innehåller en fosfatgrupp. De är namngivna efter den kvävehaltiga bas de innehåller - adenin (A) innehållande adenin, guanin (G) - guanin, cytosin (C) - cytosin, tymin (T) - tymin, uracil (U) - uracil. DNA består av 4 typer av nukleotider - A, T, G, C, RNA har också 4 typer - A, U, G, C. Sockret i sammansättningen av alla DNA-nukleotider är deoxiribos, RNA är ribos. Under bildningen av nukleinsyror bildar nukleotider, genom bindning, en sockerfosfatryggrad i molekylen, på vars ena sida det finns baser.

En primer är ett kort DNA som används för att replikera mallsträngen. Var och en av primrarna är komplementära till en av kedjorna i den dubbelsträngade mallen, som ramar in början och slutet av den amplifierade regionen.

Litteratur

1. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principer och tillämpning. Per. från engelska. - M.: Mir, 2002. - 589 s., illustration. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Genteknik - Novosibirsk: Sib. univ. förlag, 2004. - 496 s.; sjuk. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Artificiella genetiska system - M .: Nauka, 2005 - I 2 volymer - ISBN 5-02-033278-X

VIKTIG!

Informationen i detta avsnitt ska inte användas för självdiagnos eller självbehandling. Vid smärta eller annan exacerbation av sjukdomen bör endast den behandlande läkaren ordinera diagnostiska tester. För diagnos och korrekt behandling bör du kontakta din läkare.

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en högprecisionsmetod inom området för att diagnostisera ärftliga patologier, infektioner, virussjukdomar i vilket skede som helst (akut eller kronisk), och även - i ett tidigt skede - före uppenbara manifestationer av sjukdomen genom att identifiera patogener baserat på deras DNA, RNA , som är genetiskt material, i prover som erhålls från patienten. Och idag kommer vi att prata om essensen, diagnostiska stadier och principer för polymeraskedjereaktion (PCR) metoder, såväl som dess kostnad.

Vad är polymeraskedjereaktion

Grunden för analysen är amplifiering (fördubbling) - skapandet av många kopior från en kort del av DNA (deoxiribonukleinsyra), som representerar det mänskliga genetiska komplexet. Studien kräver en mycket liten mängd fysiologiska ämnen (sputum, avföring, epitelavskrapning, prostatajuice, blod, sperma, fostervatten, slem, moderkakavävnad, urin, saliv, pleuravätska, cerebrospinalvätska). I det här fallet kan till exempel till och med en enda skadlig mikrob upptäckas i en patients urogenitalkanal.

PCR-tekniken (polymeraskedjereaktion) utvecklades av den amerikanske vetenskapsmannen K. Mullis, som fick Nobelpriset 1993.

Används aktivt:

• vid tidig diagnos av infektioner, genetiska;
• vid rättsmedicinsk undersökning i närvaro av en extremt liten mängd DNA för forskning;
• inom veterinärmedicin, läkemedel, biologi, molekylär genetik;
• för identifiering av en person genom DNA, bekräftelse av faderskap;
• i paleontologi, antropologi, ekologi (vid spårning av produkters kvalitet, miljöfaktorer).

Den här videon kommer att berätta vad en polymeraskedjereaktion är:

Vem är det tilldelat

Polymeraskedjereaktion vid diagnos av infektionssjukdomar är en av de mest pålitliga metoderna för hög noggrannhet och tillförlitlighet. Till exempel närmar sig tillförlitligheten för PCR-analysen för klamydia och många andra patogener 100 % (absolut). Oftast ordineras ptill patienter som vid diagnosen har svårt att identifiera en specifik patogen.

Laboratorie-PCR-test används:

• att upptäcka patogener som orsakar infektion i urin- och könsorganen, vilka är svåra att identifiera med hjälp av grödor eller immunologiska metoder;
• för återdiagnostik av HIV i det inledande skedet i fallet med ett positivt, men tveksamt resultat av den initiala analysen (till exempel hos nyfödda från föräldrar infekterade med AIDS);
• att etablera en onkologisk sjukdom i ett tidigt skede (studie av onkogenmutationer) och individuell korrigering av behandlingsregimen för en viss patient;
• för tidig upptäckt och potentiell behandling av ärftliga patologier.

Så framtida föräldrar testas för att ta reda på om de är bärare av en genetisk patologi; hos barn bestämmer PCR sannolikheten för exponering för en ärftlig sjukdom.

• för att upptäcka fosterpatologier i ett tidigt skede av graviditeten (individuella celler av ett växande embryo undersöks för möjliga mutationer);
• hos patienter före organtransplantation - för "vävnadstypning" (bestämma vävnadskompatibilitet);
• att upptäcka farliga patogena organismer i donerat blod;
• hos nyfödda barn - för att upptäcka latenta infektioner;
• att utvärdera resultaten av antiviral och antimikrobiell behandling.

Varför gå igenom denna procedur?

Eftersom PCR är en mycket effektiv diagnostisk metod som ger ett nästan 100% resultat, används proceduren:

• för att bekräfta eller utesluta den slutliga diagnosen;
• snabb bedömning av behandlingens effektivitet.

I många fall är PCR det enda möjliga testet för att upptäcka en utvecklande sjukdom om andra bakteriologiska, immunologiska och virologiska diagnostiska metoder är värdelösa.

• Virus upptäcks med PCR direkt efter infektion och innan tecken på sjukdom uppträder. Tidig upptäckt av viruset möjliggör snabb behandling.
• Den så kallade "virala belastningen" (eller antalet virus i kroppen) bestäms också genom kvantitativ DNA-analys.
• Specifika patogener (som Kochs tuberkelbacill) är svåra och tar för lång tid att odla. PCR-analys gör att du snabbt kan identifiera det minsta antalet patogener (levande och döda) i prover som är lämpliga för forskning.

Detaljerad patogen DNA-analys används:

• för att bestämma dess känslighet för specifika typer av antibiotika, vilket gör att du omedelbart kan börja behandlingen;
• att kontrollera spridningen av epidemier bland tama, vilda djur;
• att identifiera och övervaka nya smittsamma mikrobiella arter och patogensubtyper som har underblåst tidigare epidemier.

Typer av diagnostik

Standardmetod

Analys av polymeraskedjereaktionen utförs på basis av multipel amplifiering (fördubbling) av ett specifikt DNA- och RNA-fragment med hjälp av speciella primer-enzymer. Som ett resultat av kopieringskedjan erhålls en mängd material som är tillräcklig för forskning.

Under proceduren kopieras endast det önskade fragmentet (motsvarande de specificerade specifika förhållandena) även om det faktiskt finns i provet.

Denna detaljerade video med användbara diagram berättar hur PCR fungerar:

Andra metoder

• PCR i realtid. I denna typ av studier startar processen att identifiera ett givet DNA-fragment efter varje cykel, och inte efter att hela kedjan på 30-40 cykler har avslutats. Denna typ av studie låter dig få information om mängden av en patogen (virus eller mikrob) i kroppen, det vill säga att utföra en kvantitativ analys.
• RT-PCR (omvänt transkriptionsläge). Denna analys används för att hitta enkelsträngat RNA för att detektera virus vars genetiska bas är RNA (till exempel hepatit C-virus, immunbristvirus). I en sådan studie används ett speciellt enzym - omvänt transkriptas och en viss primer, och enkelsträngat DNA byggs på basis av RNA. Sedan återställs en andra DNA-sträng från denna sträng och standardproceduren utförs.

Indikationer för att hålla

PCR-förfarandet används i kliniken för infektionssjukdomar, neonatologi, obstetrik, pediatrik, urologi, gynekologi, venerologi, neurologi, nefrologi, oftalmologi.

Indikationer för analysens syfte:

• klargörande av risken för att utveckla genetiska abnormiteter hos ett barn med sannolikheten för ärftliga patologier;
• diagnostisera båda föräldrarna när man planerar en graviditet eller ett allvarligt tillstånd hos modern under en pågående graviditet;
• svårigheter med befruktning, identifiering av orsakerna till infertilitet;
• misstanke om sexuella infektioner i det akuta skedet och med symtom på deras övergång till kronisk;
• upptäckt av orsaker till inflammatoriska processer av oklart ursprung;
• oskyddade tillfälliga och konstanta sexuella kontakter;
• bestämning av känsligheten hos en patogen mikroorganism för specifika antibiotika;
• patienter med misstänkt latent infektion för att upptäcka patogener innan uppenbara symtom utvecklas (preklinisk diagnos);
• patienter för att bekräfta återhämtning efter sjukdom (retrospektiv diagnos);

Diagnostik används också om det är nödvändigt att exakt identifiera följande patogener:

• hepatitvirus (ABC G), human immunbrist, cytomegalovirus;
• vibriokolera;
• herpes simplex-virus, herpetiforma arter;
• retro - adeno - och rhinovirus;
• röda hundvirus, Epstein-Barr, varicella (Zoster - virus);
• parvo- och picornavirus;
• bakterie Helicobacter pylori;
• legionella, patogena typer av Escherichia coli;
• Staphylococcus aureus;
• patogen;
• Clostridia, difteri och Haemophilus influenzae;

Det används också för att fastställa infektioner:

• Körtelfeber;
• borrelios, listerios, fästingburen encefalit;
• candidiasis orsakad av Candida-svampar;
• sexuella infektioner - trichomoniasis, ureaplasmos, blekt treponema, gardnerellos, gonorré, mykoplasmos, klamydia;
• tuberkulos.

Kontraindikationer för att hålla

Eftersom proceduren inte utförs med patienten, utan någon effekt på kroppen, utan med biologiskt material som tas för forskning, finns det inga kontraindikationer för PCR på grund av frånvaron av potentiell fara.

Biomaterialprovtagning från livmoderns livmoderhalskanal utförs dock inte efter kolposkopi. Leverans av utstryk, skrapning för analys är tillåten endast 4 till 6 dagar efter slutet av menstruationen och fullständigt upphörande av utsläpp.

Är metoden säker

Ingen negativ påverkan på patienten i en isolerad studie av hans biomaterial i laboratoriet är möjlig.

Förberedelse för proceduren (leverans av biologiska ämnen för analys)

Som ett prov för PCR-analys, där DNA från en främmande patogen detekteras, används alla biologiska vätskor, vävnader, kroppssekret. Provtagningen av testämnet utförs i form av att ta blod från en ven, skrapning från struphuvudet, näshålan, urinröret, pleurahålan, livmoderhalsen.

Före det diagnostiska förfarandet förklarar läkaren för patienten vilket material som kommer att tas:

1. Vid undersökning av sexuella infektioner tas sekret från könsorganen, urin och ett utstryk från urinröret.
2. När man analyserar för herpetiska infektioner, cytomegalovirus, mononukleos - tar de urin, en svalgpinne för analys, för hepatit, toxoplasmos - blod från en ven.
3. För att diagnostisera olika typer tas cerebrospinalvätska.
4. Inom pulmonologi är prover för analys sputum och pleuravätska.
5. När man gör en studie av möjliga intrauterina infektioner under graviditeten används fostervatten och placentaceller för analys.

Analysens tillförlitlighet och noggrannhet beror på steriliteten hos förhållandena när materialet tas. Eftersom PCR-testet är mycket känsligt kan varje kontaminering av testämnet förvränga resultatet.

Kompetent förberedelse för leverans av biomaterial innebär inga svårigheter för patienterna. Det finns vissa rekommendationer:

• vid analys av sexuella infektioner:
  • utesluta intima kontakter 72 timmar före leverans av materialet;
  • sluta använda några vaginala produkter i 3 dagar;
  • sedan kvällen föregående dag, utför inte hygienen i området som studeras;
  • utesluta urinering i 3-4 timmar när du tar ett prov från urinröret;
• sluta ta antibiotika en månad innan du testar för infektioner;
• donera blod på morgonen innan du äter och dricker;
• Uppsamlingen av den första morgonportionen av urin utförs i en steril behållare efter en noggrann intim toalett.

Läs mer om hur diagnostik går till med polymeraskedjereaktionsmetoden.

Hur är proceduren

När man utför en PCR-studie om och om igen i reaktorn (förstärkare eller termisk cykler), upprepas vissa cykler:

1. Det första steget är denaturering. Saliv, blod, biopsi, gynekologiska prover, sputum, där man misstänker förekomst av DNA (eller RNA) från patogenen, placeras i en förstärkare, där materialet värms upp och DNA:t delas upp i två separata kedjor.
2. Det andra steget är glödgning eller lätt kylning av materialet. och lägga till primers till den som kan känna igen de önskade sektionerna i DNA-molekylen och binda till dem.
3. Det tredje steget är förlängning- inträffar efter tillsats av 2 primers till var och en av DNA-strängarna. Under processen fullbordas patogenens DNA-fragment och dess kopia bildas.

Dessa cykler upprepas som en "kedjereaktion", vilket varje gång leder till en fördubbling av kopior av ett specifikt DNA-fragment (till exempel ett segment där ett visst virus är programmerat). På några timmar bildas många kopior av DNA-fragmentet och deras närvaro i provet detekteras. Därefter analyseras resultaten och jämförs med databasen över olika typer av patogener för att fastställa typen av infektion.

Läs om tolkningen av resultaten och slutsatsen utifrån PCR-reaktionen nedan.

Dechiffrera resultaten

Det slutliga resultatet av studien utfärdas 1-2 dagar efter leverans av biologiskt material. Ofta - redan första dagen efter analysen.

Kvalitativ analys

• Negativ resultatet innebär att inga spår av smittämnen hittades i ämnet som lämnats in för forskning.
• Positiv ett resultat innebär upptäckt av patogena virus eller bakterier i ett biologiskt prov med en mycket hög grad av noggrannhet vid tidpunkten för inlämning.

Om resultatet är positivt, men det inte finns några tecken på aktivering av infektionen, kallas detta tillstånd av kroppen asymtomatisk "hälsosam transport". Oftast observeras när man tar biomaterial från en viss plats (cervikal kanal, urinrör, munhåla) vid virussjukdomar. Behandling i detta fall krävs inte, men konstant medicinsk övervakning är nödvändig, eftersom det finns en möjlighet:

• spridning av viruset från bärare och infektion av friska människor;
• aktivering av processen och övergången av sjukdomen till en kronisk form.

Men om blodprovet är positivt indikerar detta att infektionen har påverkat kroppen, och detta är inte längre ett bärartillstånd, utan en patologi som kräver omedelbar specifik terapi.

Kvantitativ analys

Det kvantitativa resultatet bestäms av specialisten specifikt för en viss typ av infektion. På grundval av det är det möjligt att bedöma graden av utveckling, sjukdomsstadiet, vilket gör det möjligt att snabbt ordinera rätt behandling.

genomsnittlig kostnad

Priserna för att genomföra en polymeraskedjereaktion bestäms av: typen av studie, komplexiteten för att identifiera patogenen, svårigheten att samla in biologiskt material, typen av analys (kvalitativ eller kvantitativ), prisnivån i laboratoriet.

Å andra sidan, i studien av PCR kan flera patogener upptäckas samtidigt när man tar en typ av material för analys. Detta sparar på andra laboratorietester.

Ungefär kostnaden för PCR-analys i rubel:

• gonokocker, gardnerella, trichomonas vaginalis - från 180
• chlamydia trachomatis - från 190
• papillomvirus - från 380 till 500
• biocenos av urogenitalkanalen hos kvinnor (kvantitativ och kvalitativ bedömning av mikroflora) - från 800.

För mer användbar information om PCR-studien, se videon nedan:

Bakteriell genetik. Information till andra lektionen.

polymeraskedjereaktion

Polymeraskedjereaktion är en metod som möjliggör en multipel ökning (amplifiering) av antalet vissa DNA-molekyler i det analyserade provet (inklusive biologiskt material eller renkultur).

De främsta fördelarna med PCR som diagnostisk metod inom mikrobiologi är dess mycket höga känslighet, vilket möjliggör detektering av extremt låga koncentrationer av patogener i prover, samt justerbar specificitet, vilket gör det möjligt att detektera eller identifiera patogener hos den generiska arten. , eller underartnivå. Den största nackdelen med PCR beror på dess extremt höga känslighet - det är mycket lätt för bilder att kontaminera DNA från en positiv kontroll, ett annat prov eller en PCR-produkt, vilket leder till en falsk positiv reaktion. Detta medför stränga restriktioner för de förhållanden under vilka PCR blandas och bearbetas med färdiga PCR-produkter.

Genomföra PCR. En reaktionsblandning framställs innehållande följande komponenter:

isolerat DNA från testprovet,

buffert-lösning,

Mg2+ joner (krävs för att enzymet ska fungera),

Två primrar är enkelsträngade korta DNA-molekyler (oftast 18 till 24 nukleotider långa) som är komplementära till ändarna av olika strängar av DNA-sekvensen som ska detekteras.

En blandning av deoxinukleotidtrifosfater.

Värmebeständigt DNA-polymeras (vanligast använda är Taq-polymeras, ett polymeras isolerat från Thermus aquaticus).

Därefter placeras denna reaktionsblandning i cyklern, som egentligen är en programmerbar termostat. I cyklern utförs 30-40 cykler av temperaturförändringar. Var och en av dessa cykler består av tre steg (se fig. 1):

Denaturering (temperatur 94 ° C) - vätekedjor bryts och DNA-kedjor divergerar.

Primer-annealing (temperaturen är vanligtvis i området 50-60 ° C) - primers fästs vid ändarna av DNA-kedjorna. I allmänhet, när temperaturen sänks, är det mer energimässigt fördelaktigt att återförena de ursprungliga DNA-strängarna från provet som studeras (renaturering), men koncentrationen av primers i reaktionsblandningen är många storleksordningar högre än koncentrationen av DNA från provet (åtminstone i de initiala PCR-cyklerna), så att primer-annealingsreaktionen fortskrider snabbare än renaturering. Glödgningstemperaturen väljs beroende på smälttemperaturen (denaturerings-) för primrarna.

Förlängning (temperaturen är vanligtvis 72 ° C) - DNA-polymeras kompletterar primrarna längs mallen av långa DNA-kedjor. Temperaturen motsvarar den optimala driftstemperaturen för det använda DNA-polymeraset.

Detektion av resultat skiljer sig åt i olika PCR-formuleringar och beskrivs i avsnittet "PCR-varianter".

Dynamik för PCR

I tidiga PCR-cykler fördubblas antalet dubbelsträngade DNA-molekyler, vars storlek bestäms av avståndet mellan primerställena, med varje cykel. Ett litet antal längre DNA-molekyler bildas också, som kan försummas (se figur 2).

Sålunda, i de tidiga cyklerna, beskrivs mängden av PCR-produkten av formeln m*2n, där m är den initiala mängden av det önskade DNA:t i provet, n är antalet cykler. Sedan når reaktionen en platå. Detta beror på ackumuleringen av reaktionsprodukten, en minskning av koncentrationen av primers och deoxinukleotidtrifosfater, och även på en ökning av koncentrationen av pyrofosfat (se fig. 3).

Varianter av PCR

Konventionell PCR

I denna version av PCR-inställningen pågår reaktionen i ett förutbestämt antal cykler (30-40), varefter det analyseras om ansamlingen av dubbelsträngade DNA-molekyler i reaktionsblandningen har skett.

Denna variant av PCR, när den används som en diagnostisk metod, är en kvalitativ metod. En positiv reaktion indikerar närvaron av åtminstone spårmängder av de önskade DNA-molekylerna i provet. En negativ reaktion indikerar deras frånvaro. En kvantitativ bedömning av innehållet av de initiala DNA-molekylerna i provet är omöjlig på grund av att reaktionen når en platå.

Huvudmetoden för att detektera närvaron av produkten är elektrofores i agaros eller polyakrylamidgel. PCR-produkterna separeras i gelén under inverkan av ett elektriskt fält enligt deras molekylvikt. Ett interkalerande färgämne läggs till gelén (fluorescerande i det tillstånd som är associerat med dubbelsträngat DNA - oftast etidiumbromid). Sålunda, när den exponeras för ultraviolett ljus, kommer det att vara möjligt att se närvaron eller frånvaron av en remsa som motsvarar DNA med den erforderliga molekylvikten. Vid PCR i diagnostiska syften placeras alltid positiva och negativa reaktionskontroller, med vilka proverna jämförs (se fig. 4).

realtids PCR

I denna version av PCR-uppställningen registreras mängden PCR-produkt i reaktionsblandningen konstant under reaktionens gång. Detta gör att du kan bygga en reaktionskurva (se fig. 3) och utifrån den beräkna antalet önskade DNA-molekyler i proverna.

En typ av realtids-PCR är att använda ett interkalerande färgämne som tillsätts direkt till reaktionsblandningen (SYBRGreen används oftast). En annan typ är att använda en av de typer av fluorescerande prober som binder till ett ställe inuti PCR-produkten, vilket gör det möjligt att öka detektionsspecificiteten (se fig. 5) Fluorescensdetektering sker direkt i anordningen under reaktionen.

Förutom möjligheten till kvantitativ detektion finns det andra fördelar med realtids-PCR jämfört med konventionell PCR. Denna PCR-variant är enklare, snabbare och kräver inte att rören öppnas med PCR-produkter, vilket minskar risken för att kontaminera andra prover. Den största nackdelen är den högre kostnaden för en förstärkare med en inbyggd fluorescensdetektionsförmåga jämfört med en konventionell.

Digital kvantitativ PCR

En ny, dyr och fortfarande inte allmänt använd version av PCR, som möjliggör mer exakt bestämning av mängden DNA i ett prov.I denna version är reaktionsblandningen som innehåller ett fluorescerande färgämne uppdelad i ett stort antal mikroskopiska volymer (t.ex. droppar i en emulsion). Efter PCR analyseras i vilken andel av dropparna reaktionen visade sig vara positiv och följaktligen observeras fluorescens. Denna andel kommer att vara proportionell mot antalet DNA-molekyler av intresse i provet.

omvänd transkription PCR

I detta fall, före en eller annan PCR-variant, utförs en omvänd transkriptionsreaktion (RNA till DNA) med användning av det omvända enzymet. Således tillåter denna metod kvalitativ eller kvantitativ detektion av RNA-molekyler. Detta kan användas för att detektera RNA-innehållande virus eller bestämma nivån av transkription (mängden mRNA) för en viss gen.

Bild 1. PCR-steg. Primers är markerade med rött.

Figur 2. Ackumulering av primerbegränsade dubbelsträngade DNA-molekyler under PCR.

Figur 3 Dynamiken i PCR-reaktionen vid olika initiala koncentrationer av de önskade DNA-molekylerna i provet. (a) - den högsta koncentrationen (b) - mellanliggande koncentrationen (c) - den lägsta koncentrationen

Figur 4 Agaroselektrofores av PCR-produkter. K+ - positiv kontroll (uppenbarligen det erforderliga DNA är närvarande). 1-7 - testprover (varav 1-2 är positiva, 3-7 är negativa). K- -negativ kontroll (saknar definitivt önskat DNA). I många fall, förutom målprodukten, är lättare ospecifika reaktionsprodukter (primer-dimerer) synliga.

Figur 5 Detektionsmetoder med realtids-PCR. (a) - interkalerande färgämne - fluorescerar vid bindning till dubbelsträngat DNA (b) - Taqman-prob - fluorescens inträffar när sonden klyvs av DNA-polymeras med 5'-3'-endonukleasaktivitet på grund av separationen av fluoroforen och quenchern. (c) MolecularBeacon-prob - fluorescens inträffar när sonden hybridiserar med målfragmentet på grund av den rumsliga separationen av fluoroforen och quenchern (d) - LightCycler-sonder - acceptorfluorescens uppstår när proberna (som innehåller en acceptor och donator) hybridiserar med målet fragment på grund av resonant fluorescensenergiöverföring (FRET).

Polymeraskedjereaktion (PCR)

Kärnan i PCR-metoden. DNA-polymeras

Polymeraskedjereaktion är en experimentell metod för molekylärbiologi som gör det möjligt att uppnå en signifikant ökning av små koncentrationer av vissa nukleinsyrafragment i biologiskt material. Denna process att öka antalet kopior av DNA kallas förstärkning. DNA-kopiering under PCR utförs av ett speciellt enzym - polymeras. DNA-polymeras (fig. 3) är ett enzym involverat i replikationen (amplifiering av DNA i levande organismer) av DNA. Enzymer av denna klass katalyserar polymerisationen av deoxiribonukleotider längs DNA-nukleotidkedjan, som enzymet "läser" och använder som mall. Typen av en ny nukleotid bestäms av principen om komplementaritet med mallen från vilken avläsningen utförs.

DNA-polymeras lägger till fria nukleotider till 3"-änden av den sammansatta kedjan. Detta leder till en förlängning av kedjan i 5"-3-riktningen. Inget av de kända DNA-polymeraserna kan skapa en kedja "från grunden": de är endast kan lägga till nukleotider till redan existerande 3"-hydroxylgrupp. Av denna anledning behöver DNA-polymeras primer- en kort sekvens av nukleotider (vanligtvis 20-25), komplementära till ändsektionerna av genen som studeras - till vilken hon kunde lägga den första nukleotiden. Primers är alltid sammansatta av DNA- och RNA-baser, där de två första baserna alltid är RNA-baser. Primers syntetiseras av ett annat enzym - primas. Ett annat enzym är helikas- nödvändig för avlindning av DNA-dubbelhelixen med bildandet av en enkelsträngad struktur, vilket säkerställer replikeringen av båda strängarna i enlighet med den semi-konservativa modellen för DNA-replikation.

Vissa DNA-polymeraser har också förmågan att korrigera fel i den nymonterade DNA-strängen. Om ett felaktigt nukleotidpar upptäcks rullar DNA-polymeraset tillbaka ett steg, tar bort fel nukleotid från kedjan, sätter sedan in den korrekta på sin plats, varefter replikeringen fortsätter som vanligt.

Genomförande av PCR

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en DNA-amplifieringsmetod som kan isolera och multiplicera en viss DNA-sekvens miljarder gånger inom några timmar. Möjligheten att få ett stort antal kopior av en strikt definierad region av genomet förenklar i hög grad studien av ett befintligt DNA-prov.

För att polymeraskedjereaktionen ska äga rum måste ett antal villkor vara uppfyllda. För PCR krävs i det enklaste fallet följande komponenter:

En DNA-mall som innehåller den del av DNA som ska amplifieras.

Två primrar som är komplementära till ändarna av det önskade fragmentet. (Ett par artificiellt syntetiserade oligonukleotider, vanligtvis 15 till 30 bp i storlek, identiska med motsvarande regioner av mål-DNA:t. De spelar en nyckelroll i bildandet av amplifieringsreaktionsprodukter. Rätt utvalda primers säkerställer testets specificitet och känslighet systemet.)

Termostabilt DNA-polymeras. Polymeraset som används i PCR måste förbli aktivt vid hög temperatur under lång tid, därför används enzymer isolerade från termofiler - Thermus aquaticus (Taq-polymeras) och andra.

Deoxinukleotidtrifosfater (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ joner nödvändiga för att polymeras ska fungera.

En buffertlösning som ger de nödvändiga reaktionsförhållandena - pH, lösningens jonstyrka. Innehåller salter, serumalbumin.

För att undvika avdunstning av reaktionsblandningen tillsätts en högkokande olja, såsom vaselin, i provröret. Om en apparat med uppvärmt lock används krävs inte detta.

Tillsatsen av pyrofosfatas kan öka utbytet av PCR-reaktionen. Detta enzym katalyserar hydrolysen av pyrofosfat, en biprodukt av tillsatsen av nukleotidtrifosfater till den växande DNA-strängen, till ortofosfat. Pyrofosfat kan hämma PCR-reaktionen.

För att multiplicera antalet kopior av det ursprungliga DNA:t behövs en cyklisk reaktion. Som regel består var och en av de sekventiellt upprepade PCR-cyklerna av tre steg:

1. Denaturering, eller "smältning" av DNA. Den dubbelsträngade DNA-mallen upphettas till 94-96°C (eller 98°C om ett särskilt värmestabilt polymeras används) under 0,5-2 minuter för att tillåta DNA-strängarna att separera. Detta steg kallas denaturering eftersom vätebindningarna mellan de två DNA-strängarna är brutna. Ibland, före den första cykeln (innan polymeraset tillsätts), förvärms reaktionsblandningen i 2–5 minuter för att helt denaturera mallen och primrarna. Detta tillvägagångssätt kallas varmstart, tillåter det att minska mängden ospecifika reaktionsprodukter.

2. Annealing - bindning av primrar till mall-DNA. När strängarna väl har separerats sänks temperaturen långsamt för att tillåta primrarna att binda till den enkelsträngade mallen. Glödgningstemperaturen beror på primersammansättningen och väljs vanligtvis vid 50–65°C. Scentid - 20 - 60 sekunder. Ett felaktigt val av hybridiseringstemperatur leder antingen till dålig bindning av primers till mallen (vid förhöjd temperatur) eller till bindning på fel ställe och uppkomsten av ospecifika produkter (vid låg temperatur).

3. Syntes (kedjeförlängning). DNA-polymeras replikerar mallsträngen med användning av primern som ett "frö". Polymeraset startar syntesen av den andra strängen från 3"-änden av primern, som har bundit till mallen och rör sig längs mallen. Förlängningstemperaturen beror på polymeraset. De vanligast använda Taq- och Pfu-polymeraserna är mest aktiva vid 72 °C längden på fragmentet som ska amplifieras Vanligtvis tas förlängningstiden till en minut för varje tusen baspar Efter att alla cykler har avslutats utförs ofta ett extra steg slutlig förlängning för att fullborda alla enkelsträngade fragment. Detta steg varar 7-10 minuter.

Därefter upprepas stadierna av denaturering, hybridisering och förlängning många gånger (30 eller fler gånger). Vid varje cykel fördubblas antalet syntetiserade kopior av ett DNA-fragment.

Alla reaktioner utförs i provrör nedsänkta i en termostat. Ändring av temperaturregimen och dess underhåll utförs automatiskt.

För att förstå exakt hur amplifieringen av ett visst DNA-segment sker under PCR, är det nödvändigt att tydligt förstå positionen för alla primrar och deras komplementära sekvenser i de amplifierbara kedjorna i varje omgång. I den första omgången är var och en av de nysyntetiserade kedjorna mycket längre än avståndet från 3"-hydroxylgruppen i dess primer till den terminala nukleotiden i sekvensen som är komplementär till den andra primern. Sådana kedjor kallas "långa mallar", den är på dem att ytterligare syntes kommer att äga rum.

I den andra omgången denatureras dubbelsträngat DNA, bestående av liknande och nyligen syntetiserade (lång mall) strängar, igen och hybridiseras sedan med primrar. Under syntesen i denna omgång syntetiseras återigen "långa mallar", liksom ett antal strängar med en primer i ena änden och med en sekvens som är komplementär till den andra primern i den andra ("korta mallar"). Under den tredje omgången denatureras alla heteroduplexer som bildats tidigare samtidigt och hybridiseras med primrar och replikeras sedan. I efterföljande omgångar finns det fler och fler "korta matriser", och vid den 30:e omgången är deras antal redan 10 6 gånger större än antalet initiala kedjor eller "långa matriser".

Mängden specifik reaktionsprodukt (begränsad av primers) ökar teoretiskt proportionellt till 2n, där n är antalet reaktionscykler. Faktum är att effektiviteten för varje cykel kan vara mindre än 100%, så i verkligheten:

där P är mängden produkt, E är den genomsnittliga effektiviteten för cykeln.

Antalet "långa" DNA-kopior växer också, men linjärt, så ett specifikt fragment dominerar i reaktionsprodukterna. Tillväxten av den erforderliga produkten begränsas exponentiellt av mängden reagens, närvaron av inhibitorer och bildningen av biprodukter.

PCR är en mycket känslig metod, därför, om det till och med finns en obetydlig mängd DNA i testprovet som av misstag kommit från en reaktionsblandning till en annan, kan falskt positiva resultat erhållas. Detta gör det nödvändigt att noggrant kontrollera alla lösningar och redskap som används för PCR.

Grundläggande principer för val av primer.

När du skapar ett PCR-testsystem är en av huvuduppgifterna det korrekta urvalet av primers som måste uppfylla ett antal kriterier:

1. Primers måste vara specifika. Särskild uppmärksamhet ägnas åt de 3 "ändarna av primrarna, eftersom det är från dem som Taq-polymeras börjar fullborda den komplementära DNA-kedjan. Om deras specificitet är otillräcklig, kommer oönskade processer troligen att inträffa i provröret med reaktionsblandningen , nämligen syntesen av ospecifikt DNA (korta eller långa fragment).Det är synligt på elektrofores i form av tunga eller lätta ytterligare band.Detta gör det svårt att utvärdera reaktionsresultaten, eftersom det är lätt att förväxla en specifik amplifieringsprodukt med syntetiserat främmande DNA. Vissa primrar och dNTP:er konsumeras för syntes av ospecifikt DNA, vilket leder till en betydande känselförlust.

2. Primers ska inte bilda dimerer och slingor, d.v.s. inga stabila dubbelsträngar bör bildas genom att primrarna hybridiseras till sig själva eller till varandra.

Vilket gör att du i biologiskt material kan upptäcka små mängder, mer exakt, av vissa fragment av det och multiplicera dem många gånger om. De identifieras sedan visuellt genom gelelektrofores. Reaktionen utvecklades 1983 av K. Mullis och inkluderades i listan över enastående upptäckter de senaste åren.

Vilka är mekanismerna för PCR

Hela tekniken är baserad på nukleinsyrors förmåga att självreplikera, vilket i detta fall utförs artificiellt i ett laboratorium. DNA-reproduktion kan inte börja i någon region av molekylen, utan bara i regioner med en viss nukleotidsekvens - startfragment. För att polymeraskedjereaktionen ska starta behövs primrar (eller DNA-sonder). Dessa är korta fragment av en DNA-kedja med en given nukleotidsekvens. De är komplementära (det vill säga motsvarar) startplatserna

Naturligtvis, för att skapa primers, måste forskare studera nukleotidsekvensen för den som är involverad i tekniken. Det är dessa DNA-sonder som ger specificiteten för reaktionen och dess initiering. kommer inte att fungera om minst en molekyl av önskat DNA inte finns i provet. I allmänhet är ovanstående primrar, en uppsättning nukleotider, ett värmebeständigt DNA-polymeras nödvändiga för att reaktionen ska äga rum. Det senare är ett enzym som katalyserar syntesen av nya nukleinsyramolekyler baserat på provet. Alla dessa ämnen, inklusive det biologiska materialet i vilket det är nödvändigt att detektera DNA, kombineras till en reaktionsblandning (lösning). Den är placerad i en speciell termostat som utför mycket snabb uppvärmning och kylning under en given tid - en cykel. Vanligtvis är det 30-50 av dem.

Hur går denna reaktion till?

Dess väsen är att under en cykel fästs primrarna till de önskade sektionerna av DNA, varefter det fördubblas under inverkan av enzymet. Baserat på de resulterande DNA-strängarna syntetiseras nya och nya identiska fragment av molekylen i efterföljande cykler.

Polymeraskedjereaktionen fortskrider sekventiellt, dess följande steg urskiljs. Den första kännetecknas av en fördubbling av mängden produkt under varje uppvärmnings- och kylningscykel. I det andra steget saktar reaktionen ner, eftersom enzymet skadas och dessutom tappar aktivitet. Dessutom är reserverna av nukleotider och primrar uttömda. I det sista skedet - en platå - ackumuleras inte produkterna längre, eftersom reagenserna har tagit slut.

Var används den

Utan tvekan finner polymeraskedjereaktionen den bredaste tillämpningen inom medicin och vetenskap. Det används i allmän och privat biologi, veterinärmedicin, apotek och till och med ekologi. Dessutom gör de detta för att övervaka kvaliteten på livsmedelsprodukter och miljöobjekt. Polymeraskedjereaktionen används aktivt i rättsmedicinsk praxis för att bekräfta faderskap och identifiera en person. Inom kriminalteknik, såväl som inom paleontologi, är denna teknik ofta den enda utvägen, eftersom vanligtvis mycket lite DNA är tillgängligt för forskning. Naturligtvis har metoden fått en mycket bred tillämpning inom praktisk medicin. Det är nödvändigt inom sådana områden som genetik, infektionssjukdomar och onkologiska sjukdomar.