Bioteknik och mediciner. Grunderna för molekylär terapi. Läkemedel baserade på oligonukleotider Läkemedel baserade på proteiner och oligonukleotider
En oligonukleotid är en kort bit av nukleinsyra som är mindre än 50 nukleotider lång. Under de senaste 20 åren har betydelsen utökats till att omfatta alla kemiskt syntetiserade nukleinsyror, oavsett längd. Den första publikationen om riktad kemisk syntes av en oligonukleotid kom ut 1955.
Sedan dess har miljontals oligonukleotider syntetiserats varje år för användning i laboratorier runt om i världen. De flesta studier kräver endast små mängder DNA. Mycket större mängder DNA (10 µmol eller mer) behövs för användning i biofysikaliska studier (NMR och röntgenkristallografi), så för att möjliggöra syntes av så stora kvantiteter har fastfassyntesmetoder utvecklats som möjliggör användning av oligonukleotider som läkemedelsmolekyler (till exempel antisensoligonukleotider).
Syntesen av DNA- eller RNA-oligonukleotider avser den kemiska syntesen av nukleinsyrafragment med definierade kemiska strukturer eller sekvenser i olika storlekar.
Figur 1. Strukturer av oligonukleotider.
Principen för fastfassyntes utvecklades och tillämpades först på syntesen av polypeptider av Robert Bruce Merrifield, en amerikansk biokemist som fick Nobelpriset i kemi 1984 för sin uppfinning av fastfaspeptidsyntes. Han insåg att nyckeln till en framgångsrik syntes låg i att förankra den första monomeren till den olösliga polymera fasta fasen. Andra monomerer kan sedan anslutas, en efter en, till den orörliga terminala änden av den växande polymeren. Vid slutet av syntesen kan den färdiga polymerkedjan lossas från den olösliga polymeren och renas. Denna process har optimerats under åren för att vara mycket effektiv och har nu blivit en grundläggande teknik som används i automatiserade oligonukleotidsyntes.
För att säkerställa en framgångsrik syntes av oligonukleotider är följande villkor nödvändiga:
- Alla reagenser måste vara lösliga i icke-vattenhaltiga lösningsmedel.
- Amino- och hydroxylgrupper i nukleotidbaser och kolhydratrester måste vara lämpligt blockerade.
- De skyddande grupperna som introduceras under syntesen måste vara stabila under betingelser av kedjeförlängning under bildningen av enng.
- Skyddsgrupperna måste vara tillräckligt labila så att de kan avlägsnas vid slutet av syntesen utan att skada reaktionsprodukterna.
Funktioner av oligonukleotider och möjligheter för deras tillämpning
För närvarande används oligonukleotider och deras analoger i stor utsträckning inom olika områden, såsom medicin och molekylärbiologisk forskning, och anses också vara lovande terapeutiska medel och sönder för molekylär diagnostik.
Under de senaste 20 åren har endast två typer av nukleinsyraanaloger med en formellt elektriskt neutral ryggrad, peptidnukleinsyror och fosfodiamidmorfolino-oligonukleotider, studerats relativt väl. Analoger av båda typerna kan komplementärt binda till naturliga DNA- och RNA-molekyler, och därför har de funnit tillämpning både inom molekylärbiologi och i synnerhet inom medicin som potentiella läkemedel.
Dessutom, med utvecklingen av DNA-teknologier, blev det möjligt att studera uttrycket av kända gener, bestämma mutationer i arvsmassan hos olika organismer och diagnostisera ett antal infektionssjukdomar. För att lösa dessa problem är det mest lovande användningen av DNA-chips, som är små plattor med DNA-fragment avsatta på deras yta.
Metoden för att skapa DNA-chips kombinerar metoder baserade på målinriktad syntes av oligonukleotider direkt på chipytan. Syntes utförs genom stegvis tillsats till den växande oligonukleotidkedjan av nukleotider innehållande en labil skyddsgrupp vid 5'-änden, vars avlägsnande är möjligt under inverkan av ljusstrålning, elektrisk spänning eller under sur hydrolys.
Det har också visat sig att, beroende på den utvalda målgenen, genriktade oligonukleotider har en betydande mängd olika modulerande effekter på tumörvävnader, allt från att sakta ner och stoppa tumörcellsproliferation och sluta med undertryckande av deras invasiva egenskaper.
Anticancerläkemedel baserade på nukleinsyror är ett mycket specifikt verktyg för att modulera genuttryck. Undertryckande av ett antal gener som onormalt överuttrycks under neoplastisk transformation kan uppnås med nukleinsyrabaserade läkemedel såsom antisensoligonukleotider (asONs). I allmänhet består mekanismen för undertryckande av genuttryck i deras komplementära bindning till mål-mRNA:t, varefter mål-mRNA:t antingen klyvs eller dess translationsprocess blockeras.
asON är syntetiska enkelsträngade DNA 15-20 nukleotider långa. Nyligen har asON erhållits som kan förhindra transporten av splitsad mRNA från kärnan till cytoplasman, liksom asONs, som, som ett resultat av blockering av splitsningsstället i pre-mRNA, kan leda till uttryck av en alternativ proteinvariant.
På grund av det faktum att naturliga oligodeoxiribonukleotider i cellkultur och under in vivo-förhållanden genomgår snabb nedbrytning under inverkan av nukleaser, introduceras olika kemiska modifieringar i asON-strukturen för att öka deras stabilitet.
Kemisk syntes av oligonukleotider
Fastfassyntes används i stor utsträckning vid peptidsyntes, oligonukleotidsyntes, oligosackaridsyntes och kombinatorisk kemi. Kemisk syntes i fast tillstånd uppfanns på 1960-talet av Bruce Merrifield och belönades med Nobelpriset i kemi 1984.
Fastfassyntes utförs på ett fast underlag, mellan filter, i kolonner som låter alla reagenser och lösningsmedel passera igenom. Fastfassyntes har ett antal fördelar jämfört med lösningssyntes:
ger en hög reaktionshastighet
Föroreningar och överskott av reagens tvättas bort, så rengöring efter varje steg behövs inte
processen är mottaglig för automatisering på datorstyrda solid-fas synthesizers.
Fasta bärare (även kallade hartser) är vattenolösliga partiklar, typiskt 50-200 µm i diameter, till vilka en oligonukleotid fästs under syntes.
Det finns bevis för att ett av de mest effektiva materialen som kan användas som ett fast underlag är poröst glas. Den är ganska stel och kan inte svälla. I dess djupa porer sker syntesen av oligonukleotider. Glaset innehåller 500 Å (50 nm) porer, som är lämpliga för syntes av korta oligonukleotider. Det är emellertid dåligt lämpat för syntes av oligonukleotider över 40 baser långa. Detta beror på det faktum att den växande oligonukleotiden blockerar porerna och minskar diffusionen av reagens genom matrisen.
Fasta bärare för konventionell oligonukleotidsyntes görs typiskt med en laddning av 20-30 µmol nukleosid per gram harts. Syntes av oligonukleotider vid högre belastningar blir mindre effektiv på grund av steriskt hinder mellan intilliggande DNA-strängar fästa till hartset.
Stadier av kemisk syntes av oligonukleotider
Fosforamidatoligosyntes fortskrider i 3'- till 5'-riktningen (motsatt 5'- till 3'-riktningen för DNA-biosyntes vid DNA-replikation). En nukleotid tillsätts per cykelsyntes.
Ris. 2. Fosforamidatoligonukleotidsyntescykel
I början av oligonukleotidsyntesen är den första nukleosiden förbunden till hartset (bäraren) och synteskolonner A, G, C eller T väljs beroende på nukleosiden vid 3'-änden av den önskade oligonukleotiden. Den förankrade nukleosiden har en 5'-DMT-skyddsgrupp (DMT=4,4'-dimetoxitrityl) vars roll är att förhindra polymerisation och denna skyddsgrupp måste avlägsnas (detritylering). Mekanismen för detrialisering visas i figur 3.
Fig.3. Mekanism för att skydda gruppborttagning.
Efter detritylering är den förankrade nukleosiden redo att reagera med nästa bas, som tillsätts som nukleosid-fosforamidatmonomeren. Ett stort överskott av motsvarande nukleoside blandas med en aktivator (tetrazol eller dess derivat). Nukleosidens diisopropylaminogrupp protoneras av aktivatorn och blir således en mycket lösgörbar grupp. Den förskjuts snabbt av 5'-hydroxylgruppen i den bundna nukleosiden, vilket skapar en fosfittriester (fig. 4).
Fig.4. Mekanismen för protonering av en aktivator.
Nukleosidfosforamiditer är ganska stabila i en inert atmosfär och kan produceras i stora mängder, skickas över hela världen och lagras som torr fast substans i flera månader före användning.
Men även med oligonukleotidsyntesarbete med hög precision kvarstår möjligheten att det kommer att finnas ett fåtal oreagerade 5'-hydroxylgrupper som kommer att vara tillgängliga för att delta i nästa steg. Om sådan störning inte stoppas kommer de att ackumuleras med varje efterföljande cykel, och slutprodukten kommer att vara en komplex blandning av oligonukleotider, av vilka de flesta kommer att bära felaktig genetisk information.
Därför gör metoden för acetylering av 5'-hydroxylgrupper dem inerta med avseende på den efterföljande reaktionen. Detta är också nödvändigt för att minimera föroreningar.
Triesterfosfiten (P(III)) som bildas i tillsatssteget är instabil mot syror och måste omvandlas till den stabila formen (P(V)). Detta uppnås på grund av oxidationen av jod i närvaro av vatten och pyridin (Fig. 5). Den resulterande fosfotriestern är faktiskt en DNA-axel skyddad av en 2-cyanoetylgrupp. Cyanoetylgruppen förhindrar oönskade reaktioner med fosfor under efterföljande syntescykler.
Fig. 5. Mekanismen för det oxidativa stadiet.
Efter detta måste DMT-skyddsgruppen vid 5'-änden av DNA-strängen avlägsnas så att den primära hydroxylgruppen kan reagera med nästa nukleotidfosforamidat. Avskyddningsreaktionen med triklorättiksyra i diklormetan är snabb. Cykeln upprepas, en gång för varje bas, tills den önskade oligonukleotiden erhålls.
Därefter måste du lossa den syntetiserade oligonukleotiden från det fasta underlaget. I detta fall används succinyl. Separation är möjlig när den behandlas med koncentrerad vattenhaltig ammoniak vid rumstemperatur under en timme (fig. 6).
Fig. 6. Mekanism för separation av en oligonukleotid från en fast bärare i en koncentrerad vattenhaltig ammoniaklösning.
Klyvningsreaktionen utförs automatiskt på vissa syntetiserare, och ammoniaklösningen innehållande oligonukleotiden kommer in i en glasflaska. Alternativt kan rötning göras manuellt genom att ta kolonnen från syntetiseraren och skölja i sprutor som innehåller ammoniumhydroxid.
Oligonukleotiden löses i koncentrerad vattenhaltig ammoniak och efterföljande upphettning möjliggör avlägsnande av skyddsgrupper från heterocykliska baser och fosfater. Den vattenhaltiga lösningen avlägsnas sedan genom indunstning och oligonukleotiden är klar för rening.
Förutom DMT-skyddsgruppen behövs även ytterligare skyddsgrupper för adenin, cytosin och guanin (Fig. 7). Detta är dock inte nödvändigt för tymin.
Fig. 7. Skyddsgruppstrukturer som vanligtvis används för att skydda adenin-, cytosin- och guaninbaser under fosforamidatsyntes av DNA-oligonukleotider.
Slutsatser
1. Artificiellt syntetiserade oligonukleotider används i allt större utsträckning inom olika vetenskapsområden, och metoder för deras framställning förbättras alltmer, vilket gör det möjligt att syntetisera ett tillräckligt antal oligonukleotider för laboratorieexperiment och för framställning av terapeutiska läkemedel.
2. Hittills är den vanligaste metoden för syntes av oligonukleotider metoden för fastfassyntes, som avsevärt kan påskynda processen för att erhålla oligonukleotider, samt minska mängden förbrukade reagens.
Sammanfattning
Granskningen tar hänsyn till de farmakokinetiska egenskaperna hos olikar. Farmakokinetiken för första och andra generationens läkemedel jämfördes. Och övervägde också effekten på farmakokinetiken av den kemiska modifieringen av molekylen.
Nyckelord Nyckelord: antisense oligonukleotider, fosfotioat oligodeoxinukleotider, farmakokinetik
Introduktion
De farmakokinetiska egenskaperna hos antisensoligonukleotider (ASOs) blir bäst förstådda när man överväger deras fysikaliska och kemiska egenskaper. Parametrar som laddning, molekylvikt och amfipatisk natur hos fosfotioat ACO har en markant effekt på deras farmakokinetik. Den kemiska strukturen, i synnerhet fosfotioatgruppen och 2'-metoxietyl (MOE), har en särskilt signifikant effekt på ASO:s farmakokinetiska egenskaper.
Absorption, distribution, metabolism och utsöndring av första generationens fosfotioatoligodeoxinukleotider (ODN) har studerats omfattande i laboratoriedjur och i kliniska studier. Egenskaper för farmakokinetiken för fosfotioat ASO-beredningar är som följer: parenteralt administrerat fosfotioat ODN befinner sig snabbt i blodplasman, där de binder till de hydrofila regionerna av plasmaproteiner och därmed undviker glomerulär filtration. Dessa hydrofila regioner skiljer sig från andra hydrofila regioner till vilka lipofila läkemedel binder, och därför finns det liten konkurrens om plasmaproteinbindning för ASO. Plasmakinetiken kännetecknas av en kort distributionsfas (i storleksordningen flera timmar) följt av en eliminationsfas med en halveringstid på dagar eller veckor. Den initiala distributionsfasen inkluderar nödvändigtvis bindningen av ASO till proteiner och fördelningen av dessa komplex över vävnaderna i levern, njurarna, lymfkörtlarna, benmärgen och mjälten, som är platserna för den mest aktiva bindningen och ackumuleringen av ASO . Det är tydligt att fasen av ASO-eliminering på grund av initial proteinbindning bestäms av det initiala skedet av dess distribution. På grund av den möjliga mättnaden av proteiner , arean under den farmakokinetiska kurvan (AUC) ökar med ökande dos, eftersom ASO inte längre binder till proteiner efter deras mättnad, utan kommer in i blodomloppet i fri form. Efter bindning kommer ASO in i cellerna längs en koncentrationsgradient från det extracellulära utrymmet genom cellmembranet in i det intracellulära utrymmet, troligen med hjälp av ett bärarprotein. ASO:er i celler binder till tillgängliga mål, men huvudsakligen binder ASO:er i celler till intracellulära proteiner. I cellen metaboliserar allestädes närvarande nukleaser, men inte cytokrom P450-enzymer, ASO-preparat. Eftersom cytokrom P450-enzymer vanligtvis metaboliserar småmolekylära läkemedel, konkurrerar ASO inte i metaboliska processer med konventionella småmolekylära föreningar, vilket minskar risken för läkemedelsinteraktioner. Utsöndringen av ASO i urinen är i slutändan resultatet av metabolism i vävnader och upprättandet av en jämvikt av metaboliter och naturliga substanser utanför vävnaderna och i den systemiska cirkulationen. Dessa processer hos försöksdjur och människor är mycket lika, varför det inte är möjligt att identifiera en interartskorrelation mellan försöksdjur och människor.
För närvarande används den "andra generationens" ASO-konfigurationen, som har MOE-grupper vid 2"-positionen av nukleotider vid 3" och 5"-ändarna, mest allmänt i kliniska prövningar. Denna konfiguration är en mer avancerad struktur jämfört med omodifierade fosfotioat-ODN:er Detta beror på dess ökade effektivitet, minskade toxicitet och ökade halveringstid. Många faktorer som är förknippade med övergången från den första till den andra generationen av ASO är direkt relaterade till förbättringen av deras farmakokinetik.
Funktioner i den kemiska strukturen hos ASO
Fosfotioatskelett
De tidigaste försöken att skapa läkemedel med antisensaktivitet var förknippade med användningen av omodifierat DNA, som tyvärr var mycket känsligt för nedbrytning av nukleas. Det visade sig att allestädes närvarande nukleaser klyver fosfodiesterasbindningarna av naturligt DNA, vilket resulterar i att halveringstiden för omodifierade ASO:er är minuter. Denna snabba nedbrytning var ett huvuddrag i den farmakokinetiska profilen för omodifierade antisens-DNA. Att ändra fosfodiester-ryggraden i DNA till fosfotioat förändrade drastiskt den farmakokinetiska profilen för ASO. I dessa preparat ersätter fosfotioatstrukturen en svavelatom i fosfodiesterbindningarna med en icke-överbryggande syreatom. Denna struktur ökar motståndet hos ASO mot nukleaser och förbättrar följaktligen deras kinetiska egenskaper.
Fosfotioatkiralitet
Studier har visat att tieringen av diesterskelettet av ACO inte bara ökar dess motståndskraft mot nukleaser, utan också bidrar till uppkomsten av kiralitet, det vill säga möjligheten av förekomsten av stereoisomerer, vid varje fosfotioatbindning, vilket leder till det faktum att att det i vilken 20-mer ACO som helst finns 219 Sp eller Rp stereoisomerer. Kombinationen av nukleasresistens och ökad proteinbindning påverkar starkt ASO:s farmakokinetik. Att öka stabiliteten hos fosfotioat ASO leder till att halveringstiden för läkemedlet från plasma ökar till 30-60 minuter i jämförelse med halveringstiden för fosfodiester ASO, som är 1-2 minuter.
Nukleasresistens och kiralitet på grund av ersättningen av fosfodiester med fosfotioatbindningar är värda att diskutera eftersom de fysikaliska egenskaperna förknippade med denna strukturella egenskap är viktiga för både första och andra generationens ASO:er. Resistensen mot nukleaser av fosfotioat ASO uppstår på grund av närheten av svavel på det icke-bryggbildande syret i exonukleasens aktiva ställe till metalljonen. Denna närhet kan orsaka förskjutning av metalljonen från det aktiva stället. Denna effekt demonstrerades i 3'–5' DNA-polymeras exonukleasmodellen. Röntgenkristallografiska data stöder denna hypotes om förskjutningen av metalljonen. De uppenbara skillnaderna i stereoisomerernas känslighet för exonukleasaktiviteten hos DNA-polymeras överensstämmer med den föreslagna konformationen av ODN-fosfotioatstereoisomerer i det aktiva stället. Det är troligt att kiraliteten hos fosfortioatbindningar kan interferera med andra nukleaser på samma sätt, d.v.s. genom metalljonförskjutning, även om olika exonukleaser kan visa olika preferenser för Rp- och Sp-bindningar beroende på typen av enzymets aktiva plats.
Alternativt kan svavel helt enkelt ersätta syre i diesterbindningar. Skillnader i svavels förmåga att ta på sig en negativ laddning, jämfört med syre, gör det möjligt att förutsäga förändringar i det aktiva stället. Denna förändring beror med största sannolikhet på hydrolysen av fosfodiesterbindningar och kan ske genom bildningen av en övergående femvärdig fosfor med två negativt laddade syreatomer. Att ersätta en av de ekvatoriala syreatomerna med svavel kommer att ha negativa effekter på enzymaktiviteten: (1) vattenbindningen reduceras, vilket stabiliserar den lokala negativa laddningen på atomerna, vilket gör det svårt att få en andra negativ laddning på svavel; och (2) reducerad bindning av Mg2+ till svavel. Det finns bevis för den senare effekten i studier av nivån av ribozymklyvning av diastereomera fosfortioatinneslutningar, när tillsatsen av Mg 2+ hämmar klyvningseffekterna av fosfortioatribozymer. Dessutom har det visats att det finns en viss minskning av nukleasaktivitet i skelettregioner längre från fosfotioatbindningarna, vilket tyder på en överföring av chiralitetseffekten. Detta fenomen förklaras bäst av förändringar i arrangemanget av vattenmolekyler runt fosfotioat-ryggraden jämfört med fosfodiester-ryggraden.
Stereospecifika effekter på nukleasaktivitet påverkar signifikant farmakokinetiken för fosfortioat-ASOs, och detta manifesteras tydligast i metabolismen av första generationens fosforotioat-ASO i blodplasma. Hastigheten för fullständig eliminering av ASO från plasma minskar, vilket tyder på en nedgång i metabolismen. Dessa förändringar i hastighet kan inte förklaras enbart i termer av första ordningens kinetik, men de kan förklaras av skillnader i känsligheten för Rp- och Sp-bindningarna.
Stereospecifika skillnader i exonukleasaktivitet är mindre viktiga för andra generationens ASO:er. Detta beror på det faktum att andra generationens ASO:er har 2"-modifieringar vid 3"- och 5"-ändarna, vilket förhindrar deras klyvning av exonukleas. Med hjälp av ett endonukleas isolerat från patogenen Serratia marcescens, effekterna av kiraliteten av fosfortioatbindningar på samma sätt som exonukleaser är det ett av de icke-överbryggande syrgaserna för hydrolys av fosfodiesterbindningar.I diastereomeren är svavel lokaliserat i närheten av Mg 2+, vilket leder till att aktiviteten hos enzymet minskar, medan det i diastereomeren Rp inte gör det.Eftersom Serratia-endonukleaset har betydande likheter med vissa däggdjursendonukleaser, bör det antas att denna mekanism kan vara allmänt användbar. Hur de stereokemiska egenskaperna hos fosforotioatbindningar påverkar verkan av andra endonukleaser är Men om vi antar att reaktionen fortskrider enligt ett schema som liknar Serratia-endonukleas, kan vi anta att det aktiva stället kommer att innehålla en metalljon (förmodligen Mg 2+) och svavel kommer att påverka verkan av nukleaser , när den är orienterad mot metalljonen. Om endonukleaser är känsliga för kiralitet kan detta ha viktiga konsekvenser för utvecklingen av problemet med att skapa effektiva andra generationens läkemedel. Förutom effekten av kiralitet på första generationens läkemedel, kan den kirala effekten på metabolismen av andra generationens läkemedel leda till en avmattning i deras ämnesomsättning. Sålunda kan det till exempel antas att snabbt metaboliserande stereoisomerer kommer att förstöras selektivt, vilket lämnar endast långsamt metaboliserade isomerer att fungera.
ASO binder till proteiner
Det visade sig att, i jämförelse med ASO med ett fosfodiesterskelett, påverkas fosfotioatstrukturernas farmakokinetik signifikant av deras bindning till proteiner. Den kemiska grunden för ökad proteinbindning är den ökade lipofilicitet hos fosfotioatbindningar jämfört med fosfodiesterbindningar. Eftersom molekylära interaktioner med vatten bestäms av formen och funktionen hos makromolekyler i vattenlösning, kan även små förändringar i skelettlipofilicitet längs hela längden av ASO få konsekvenser för oligomerens interaktion med vatten och makromolekyler såsom proteiner.
Till en första approximation binder fosfotioat-ODN till cellulära proteiner mer slumpmässigt än fosfodiester-ODN. Varför fosfotioat-ASO binder bättre till proteiner är inte helt förstått. Möjliga förklaringar tyder på ökad lipofilicitet och komplexbildning med metalljoner.
Betydelsen av plasmaproteinbindning för farmakologi, farmakokinetik och toxikologi hos fosfotioat-ASO (både första och andra generationen) kan inte överskattas. Vid den mikromolära koncentrationsnivån är mer än 90 % av fosfotioat-ODN bundna i plasma. Det finns specifika skillnader i procent och styrka av proteinbindning, såväl som kvalitativa skillnader i bindningen av ASO till specifika proteiner i olika arter. Bindningen av fosfotioat ASO till cirkulerande proteiner hindrar dessa föreningar från att filtreras av njurens glomeruli och utsöndras i urinen. I fallet med mättnad, till exempel, när en stor dos ASO administreras, förstärks urinutsöndringen av fullängds ASO. På grund av artskillnader bestäms mättnad hos olika arter av olika koncentrationer av ASO. Till exempel har musplasmaproteiner en lägre affinitet för ASO än hos råttor eller människor. Därför inträffar effekten av mättnad av processen för ASO-bindning till plasmaproteiner hos möss vid lägre koncentrationer jämfört med andra arter. Artskillnader i plasmaproteinbindning är en signifikant faktor i skillnader i farmakokinetik mellan arter.
Nukleasresistens och proteinbindning, som är karakteristiska för ASO med fosfotioatbindningar, förändrar också farmakokinetiken för ASO-terapi. Ytterligare kemiska strukturer, karakteristiska för den andra generationen av skapade läkemedel, introducerar andra förändringar i deras farmakokinetik.
Metoxietylderivat av ACO
Den andra generationens ASO:er utvecklades för att förbättra några av egenskaperna hos den första generationens ODN:er. Således ökar fosfotioatstrukturer som läggs till MOE-grupperna i positionerna 2" deras motståndskraft mot nukleaser och förändrar effektiviteten av proteinbindning.
MOE-resistens mot nukleaser
Det visades att strukturen hos MOE påverkar motståndet hos ASO mot nukleaser. Medan fosfotioatstrukturer minskar exonukleasaktivitet, eliminerar strukturen vid 2"-positionen praktiskt taget exonukleasaktivitet. Nukleasresistens kan vara resultatet av (1) substitution av 2"-vätet för MOE, (2) steriska effekter av MOE, eller (3) bildandet av ett styvt vattenskal runt ASO-skelettet. Oavsett orsakerna till resistens mot nukleaser gör närvaron av MOE-gruppen ASO:er förändrade i 2-tumspositionen praktiskt taget immuna mot effekterna av cirkulerande och de flesta cellulära nukleaser. Den centrala regionen av ASO-skelettet, som består av deoxifosfotioater, är inte alls lika resistent mot nukleasmedierade klyvningar. Skillnader i ASO av den första och andra generationen i ställen som är föremål för metabolism, skillnaderna i metaboliska mönster avgör också.
Vid utvärdering av metaboliska mönster med användning av kapillärgelelektrofores (CGE) eller vätskekromatografi/masspektrometri (LC/MS), hittades inga metaboliter som var kortare med en nukleotid. Mest av allt hittades metaboliter som spjälkats i deoxistället (förmodligen av endonukleaser), den vidare metabolismens väg är att minska storleken på klyvningsprodukterna. Exonukleasresistens och långsam metabolism under påverkan av aktiva endonukleaser leder till bildning av föreningar som kännetecknas av en lång halveringstid .
Bindning av MOE till proteiner
Experimentella studier har visat att fosfotioat-ASO med 2'-MOE-strukturer har en lägre affinitet för plasmaproteiner jämfört med omodifierade fosfotioat-ASO:er, cirka 18 till cirka 40 μM. Samtidigt, i den fullt substituerade MOE-strukturen av ASO, minskar affiniteten för plasmaproteiner endast något. Varför en ökning av antalet MOE-strukturer i en oligonukleotid inte påverkar en ytterligare minskning av affinitet för plasmaproteiner är inte klart, men detta kan bero på egenskaperna hos den sekundära ASO-strukturen.
Minskningen av proteinaffinitet associerad med MOE-strukturer kan motiveras av vissa fysikaliska egenskaper. Förmodligen den viktigaste fysiska faktorn som skiljer modifierade MOE ASO från omodifierade är närvaron av ett vattenmolekylärt skal, som uppstår från MOE-sidokedjan. MOE-substituenter i kolväteskelettet "kelerar" vattenmolekyler (och möjligen metalljoner), bildar ett vattenhaltigt skal och minskar potentiell kontakt mellan "klibbiga" svavelmolekyler och plasma eller cellulära proteiner. Graden av ASO-bindning till proteiner korrelerar omvänt med deras utsöndring i urinen. Införandet av fosfotioatbindningar och 2'-MOE-substituenter förändrar proteinbindningen och, som ett resultat, ändrar egenskaperna hos ASO.
Absorption, distribution, metabolism och utsöndring av ASO
Sugning
Parenteral administreringsväg för ASO
Studier har fastställt att på grund av molekylvikten (ca 7000 D) och de negativa laddningarna av ASO, är absorptionen av dessa läkemedel från mag-tarmkanalen begränsad. Det är därför den parenterala administreringsvägen för deras administrering vanligtvis används. Subkutan, intravenös infusion eller intravitreal injektion används för att administrera första generationens läkemedel. Den lägre pro-inflammatoriska aktiviteten hos andra generationens ASO gör dem mer lämpade för subkutan administrering. Farmakokinetiken för dessa läkemedel i plasma med subkutana injektioner och intravenösa infusioner är jämförbar. Studier på laboratoriedjur visar att fördelningen av ASO i slutändan också är jämförbar över olika organ, med undantag för injektionsstället och lymfkörtlarna.
Efter subkutan administrering absorberas både första och andra generationens ASO snabbt från injektionsstället till den systemiska cirkulationen. I kliniska studier, efter subkutan administrering av andra generationens ASO, sträcker sig tiden för att nå maximal koncentration (Tmax) från 1,5 till 4,7 timmar i dosintervallet från 25 till 200 mg vid en konstant volym på 1 ml. Biotillgängligheten för den subkutana dosen varierar från 36 till 82 % av den administrerade dosen. Prekliniska och kliniska studier tyder på att biotillgängligheten av ASO ökar med koncentrationen.
Kinetiken för ASO:er på injektionsstället kan påverka det lokala svaret såväl som deras systemiska kinetik och distribution. Att minska koncentrationen av ASO på injektionsstället minskar hypotetiskt det lokala svaret på injektionen. Ett tillvägagångssätt för att minska koncentrationen av ASO på injektionsstället är att späda lösningen och, som ett resultat, öka absorptionsytan från den subkutana depån. Teoretiskt sett bör utspädningen av lösningarna och den stora sugytan minska den lokala koncentrationen och minska de lokala reaktionerna. Samma effekter kan förväntas med en ökad systemisk absorption. Därför kan förändringar i dos och volym betraktas som potentiella variabler. Men även idag visar subkutana injektioner med låga volymer och relativt höga koncentrationer hög biotillgänglighet av det applicerade materialet.
Lokal administration av ASO
En studie av olika metoder för ASO-administration visar att deras aerosolformer, rektal administrering och intravitreala injektioner används som medel för lokal administrering. För behandling av lungsjukdomar är det möjligt att skapa relativt höga koncentrationer av ASO i lungorna med hjälp av aerosoler.
Kinetiken för första generationens ODN har studerats på möss. Det har fastställts att kinetiken för sådana läkemedel är dosberoende, clearance är pulmonell med en halveringstid på cirka 2 timmar. Däremot visar studier av andra generationens modifierade MOE ASO en halveringstid på mer än 4 dagar. Som med andra topikala behandlingar är fördelen med inhalation förmågan att skapa höga lokala koncentrationer i vävnader som normalt inte samlar de applicerade ämnena. I lungorna ackumuleras vanligtvis inte ASO efter parenteral administrering. Lokal administrering orsakar också sällan systemiska effekter. Till exempel, när ASO administrerades till apor i en dos på 0,1 mg/kg genom inhalation (tre doser under 1 vecka), var koncentrationen av läkemedlet i lungorna cirka 1 μg/g. Men hos samma apor var koncentrationen i levern och njurarna ungefär 5 % av koncentrationen i lungorna, vilket tyder på en signifikant mindre systemisk effekt.
Litteraturdata indikerar att rektal administrering av ASO framgångsrikt används för behandling av ulcerös kolit. Till skillnad från inhalationer, där små mängder av den injicerade substansen kan användas, kan lavemanget som används för behandling innehålla upp till 240 mg av substansen (alicaforsen) av den första generationen. I detta fall exponeras det rektala epitelet för den injicerade substansen, men på grund av den dåliga permeabiliteten hos högladdade ODN:er finns det minimal absorption av läkemedlet, såväl som en allmän systemisk effekt. Beräkningar visar att koncentrationen av ASO i tarmepitel 12 timmar efter administrering är 20 µg/g. Biotillgängligheten hos människor varierar från 0,03 till 2,14 % och den maximala koncentrationen av ASO i plasma är endast 0,126 µg/ml. Frånvaron av signifikant systemisk absorption och den höga lokala koncentrationen av läkemedlet har en positiv effekt på behandlingen.
En studie gjordes av intravitreala injektioner av ASO-preparat av både första och andra generationen. I detta fall injiceras ämnena i ögat i mycket små mängder. På grund av isoleringen av injektionsstället reduceras de systemiska effekterna av läkemedlet i ännu större utsträckning. I ögat, glaskroppen och näthinnan kommer ASO in i olika hastigheter: det kommer in i glaskroppen snabbare jämfört med näthinnan. Både lokal metabolism och diffusion från ögat bidrar till eliminering av läkemedlet. Som redan noterats, på grund av små mängder, är den systemiska effekten av det administrerade läkemedlet minimal. Mekanismen för systemisk distribution liknar dock de flesta andra läkemedel.
Enteral administration av ASO
Den noterade stabiliteten hos andra generationens ASO mot nukleaser säkerställer läkemedlets stabilitet i tarmen, vilket gör det möjligt att ytterligare absorbera. Men storleken på molekylen och laddningarna av ACO begränsar absorptionen av läkemedlet. Efter absorption från tarmen är kinetiken för ASO liknande den för dess parenterala administrering. Även om levern är en av de viktigaste platserna för ASO-ackumulering, är den första passage-effekten genom levern inte en viktig faktor som påverkar kinetiken för ASO-läkemedlet.
Fördelning av ASO i kroppen
Rollen av perfusion och vävnadsaffinitet
Fördelningen av ASO och andra läkemedel beror på permeabiliteten, blodtillförselns intensitet, bindning till plasmaproteiner, vävnader och celler. Det har visat sig att fördelningen av fosfotioat-ASO från den första och andra generationen i vävnader med deras multipla negativa laddningar och deras bindning till proteiner är minst beroende av blodtillförseln och mycket mer beroende av faktorer som påverkar deras transport in i cellen.
Den interna distributionen från plasma till vävnader är relativt snabb, eliminationshalveringstiden är 30-90 minuter efter intravenös administrering. Halveringstiden för ASO efter subkutan administrering är längre än efter intravenös administrering. Denna skillnad beror på den tid som krävs för absorption och inte på andra skillnader i farmakokinetiken.
Studien av kinetiken för läkemedel från den första och andra generationen noterade dess små skillnader. Större stabilitet till andra generationens ASO-nukleaser kompenseras av deras lägre bindning till proteiner. Tillsammans med detta är de farmakokinetiska profilerna för 1:a och 2:a generationens läkemedel likartade eller nästan omöjliga att särskilja när summan av naturligt ASO och dess metaboliter (totalt ASO) från den första generationen jämförs med det intakta andra generationens läkemedel (ISIS 13650). Annars skulle snabbare destruktion av ASO av exonukleaser förkorta halveringstiden för första generationens läkemedel jämfört med andra generationens. Fördelningen av läkemedel av båda generationerna är dosberoende.
Som noterats ovan, efter absorption från injektionsstället eller tarmarna, binder ASO till plasmaproteiner. Två plasmaproteiner som specifikt binder till fosfotioat-ASO är albumin och alfa-2-makroglobulin. Ett annat vanligt protein, surt glykoprotein, binder inte ASO. Proteinbindning är mycket viktig för distributionen av ASO i målvävnaden. Kemiska strukturer som minskar bindningen leder till en markant minskning av koncentrationen av läkemedlet i vävnaderna, ökar graden av dess filtrering genom njurens glomeruli och utsöndring i urinen. Detta fenomen kan observeras när man använder ASO med diesterbindningar i beredningens skelett eller i närvaro av MOE-strukturen. En minskning av affiniteten för diestrar och MOE-strukturer (eller båda) för proteiner gör att ASO kan cirkulera mer fritt i blodomloppet, vilket leder till en intensifiering av dess utsöndring i urinen.
I alla studier med parenterala första och andra generationens ASO:er observerade vi inte en linjär clearance av ASO:er från plasma. Clearance minskade med ökande dos av läkemedlet, och därför var dess biotillgänglighet större än vad som kunde förväntas från den administrerade dosen. Eftersom det initiala clearancen beror på fördelningen av ASO i vävnaderna och samtidigt observerades absorptionen av läkemedlet av vävnader, kan man anta möjligheten av deras mättnad med ASO. Studiet av mättnadsprocessen som ett resultat av införandet av ASO kan utföras med hjälp av leverfagocyter. När bindningen av ASO till Kupffer-celler når mättnad, kommer en minskning i affinitet att börja. Efterföljande administrering av ASO till möss förbättrar fördelningen av ASO till icke-fagocytiska leverceller, och som ett resultat förbättras farmakologisk aktivitet i hepatocyter jämfört med kontroll. Omvänt, vid plasmakoncentrationer under 1 µg/ml, binder ASO mer aktivt till Kupffer-celler och ackumuleras mindre i hepatocyter.
Studien av processen för ASO-bindning till plasmaproteiner visade att denna effekt åtföljs av en snabb fördelning av komplexet i vävnader över cellytan. Även om de exakta mekanismerna för cellulär bindning inte har fastställts, kan det antas att ASO binder till plasmaproteiner eller till cellulära proteiner så länge det finns fria bindningsställen. De bundna ASO:erna fördelas sedan längs koncentrationsgradienten över cellmembranet genom att byta ut ett extracellulärt protein mot ett intracellulärt.
Således är den drivande kraften för ASO-inträde i celler koncentrationsgradienten. Shuttle-rörelse av ASO mellan cytoplasman och kärnan har beskrivits. I allmänhet är det tydligt att proteinbindning underlättar rörelsen av ACO genom barriärer som normalt hämmar rörelsen av högt laddade hydrofila molekyler. Denna membranskyttelmekanism förblir en hypotes för ASO, men har tidigare beskrivits för organometalliska föreningar. Transporten av ASO från den extracellulära matrisen till det intracellulära utrymmet visualiserades i levern på möss med användning av immunhistokemiska metoder och i njurarna på råttor med användning av vital mikroskopi med en fluorescerande märkning för andra generationens ASO (S. Henry, B. Molitoris).
Identiteten för de proteiner som kontrollerar transporten av ASO från det extracellulära till det intracellulära utrymmet är inte känd, men man tror att bindningen av protein-ASO-komplexet till cellen utförs med användning av den fagocytiska receptorn. Eftersom fagocyter, såsom Kupffer-celler, vävnadsmakrofager och proximala tubuliceller, har hög affinitet för ASO, kan man fundera på möjligheten att hitta sådana receptorer på sin cellyta.
Den cellulära distributionen och farmakodynamiken för ASO i transgena möss som saknade den SR-A I/II fagocytiska receptorn skiljde sig inte från de för syngena kontrolldjur. Således verkar denna receptor, känd som Scavenger-receptorn, inte vara ansvarig för upptaget av komplexet i levern och njurarna. Rollen för andra acceptorstrukturer involverade i processerna för endocytos av ACO-proteinkomplexet har inte studerats.
Membranproteiner som fungerar som bärare , finns i alla organismer. De huvudsakliga drogbärarna är: ABC ( ATP-bindande kassetttransportörer) och SLC (solute carrier family). Det är känt att hastigheten för överföring av ämnen genom biologiska membran med användning av processer som medieras av transportörer kännetecknas av mättnad. Flera medlemmar av SLC-familjen med kända egenskaper beskrivs , främst för transport av nukleosider, nukleosidsocker och fosfatsocker. Det finns en åsikt att framtida studier med största sannolikhet kommer att beröra processerna för ASO-intermembrantransport.
Det är tydligt att förutom ovanstående skillnader i ackumuleringen av strukturer skapade av olika organ och vävnader och beroendet av clearance och distribution av sådana föreningar på deras dos, påverkas fördelningen av ASO i vävnader av transportsystem, egenskaper hos individers blodflöde, läkemedlets möjliga uppehållstid i kroppen och slutligen vävnadsmättnad med ASO. Trots den betydande roll som dessa faktorer spelar i processerna för vävnadsfördelning av ASO, antas det att den initiala bindningen av ASO till cellytan är en av de avgörande faktorerna i de analyserade mekanismerna. Denna slutsats är baserad på det faktum att levern och njurarna är de första platserna för ASO-bindning med viss ytterligare ackumulering under de första 24 timmarna efter ASO-administrering. När man studerade distributionsparametrarna för ASO i levern och njurarna visades en fraktionerad ökning av koncentrationen av läkemedlet i organen under de första 24 timmarna. Detta inträffar under en period av cellulär och subcellulär omfördelning av ASO, men förmodligen bör de primära distributionsorganen ackumulera mer material över tiden på grund av den större affiniteten hos dessa organ för ASO. Proteinerna som är ansvariga för denna affinitet kan innehålla heparinliknande bindningsställen för laminin och fibrinogen och fibroblasttillväxtfaktor (FGF). Den tidiga interaktionen av ASO med cellen kan bero på bindningen av dessa proteiner, men naturen hos dessa proteiner, som noterats ovan, har studerats lite.
Med tanke på betydelsen av kombinationen av specifika ASO-bindningsställen med celler i distributionen av läkemedlet i kroppen, bör man också notera en så viktig faktor som olika blodtillförsel till olika organ, vars möjlighet att påverka den olika distributionen av fosfotioat ASO är uppenbart. Enligt olika författare indikerar arbete med dussintals serier av ämnen av både den första och andra generationen deras liknande fördelning, och en märkbart liknande fördelning hos individer av olika arter. Njurar, lever, lymfkörtlar, mjälte och benmärg är de organ som ackumulerar den största mängden ASO och deras metaboliter. Det faktum att lungorna och hjärtat inte ackumulerar ASO tyder på att för att förklara den uttalade ackumuleringen av ASO i levern och njurarna räcker inte bara en förklaring till deras goda blodtillförsel. Till exempel är de områden med den bästa blodcirkulationen i njurarna glomeruli, och de är inte de områden som innehåller mer ASO. Tvärtom, i de proximala tubuli är blodcirkulationen mindre aktiv. Emellertid kännetecknas cellerna i de proximala tubuli av ett stort antal aktivt fagocytiska celler, ackumulerar fria ASOs, såväl som ASOs associerade med proteiner som vanligtvis återabsorberas i de proximala tubuli. Som ett resultat innehåller njurbarken och det proximala tubulära epitelet den högsta koncentrationen av fosfotioat-ASO, både första och andra generationen.
Det bör också noteras att blodtillförseln (ml/g vävnad) i levern är cirka 20 % av njurarnas. 4-5-faldiga skillnader i perfusion mellan njurar och lever leder inte till 4-5-faldiga skillnader i koncentrationen av ASO i dessa organ. De fenestrerade kapillärerna ökar kontaktytan mellan ASO och blodflödet och därför kan detta kompensera för den otillräckliga perfusionen av levern i förhållande till njurarna.
ASO binder till plasmaproteiner under distribution
Även om mättnad av celler med ASO i slutändan påverkar deras distribution i organ, kan bindningen av ASO till plasmaproteiner förändra fördelningen i njurarna och levern i olika serier. Det finns seriella skillnader i proteinbindning. Med en minskning av ASO-bindningen till plasmaproteiner minskar deras ackumulering i levern och deras ackumulering i njurarna ökar. Omvänt, med högre bindning kommer koncentrationen av ASO i den fria formen i blodomloppet att vara i en mindre mängd, ackumuleras mindre i njurarna och mer i andra organ. Det finns ett omvänt samband mellan graden av ASO-bindning till protein och deras ackumulering i njurarna hos råttor och apor efter upprepad intravenös och subkutan administrering.
Proteinbindning kan användas som ett urvalskriterium för ASO för kliniska prövningar. Hittills är bestämning av proteinbindning en empirisk process utan något sätt att förutsäga vilka serier som kommer att binda mer eller mindre till proteiner.
Distribution av ASO till andra organ
Oavsett distributionssekvensen för fosfotioat-ASO från den första och andra generationen observeras ett karakteristiskt mönster av lokalisering av dessa läkemedel i njurarna och levern, såväl som i mjälten och lymfkörtlarna, ben och i cytoplasman hos adipocyter. Ackumuleringen av ASO i lymfoid vävnad kan delvis förklaras av den fagocytiska aktiviteten hos histiocyter och andra mononukleära celler. Det är möjligt att visualisera ASO i histiocytfagolysosomer och makrofagvävnader med hjälp av hematoxylinfärgning. Det har visats att ASO genomgår endocytos, lokaliseras i endosomer och förblir inom dessa strukturer. Koncentrationen av ASO i fagolysosomer är ofta sådan att den kan bestämmas genom hematoxylinfärgning (nästan som nukleärt DNA). ASO i fagolysosomer utgör förmodligen majoriteten av ASO som ackumuleras i mjälten och lymfoida organ. Dessutom ackumulerar fagocytiskt aktiva celler av ben och benmärg ASO i dessa vävnader, vilket bekräftas av närvaron av basofila granuler i deras celler.
Muskler (både skelett och hjärta) innehåller inte betydande mängder ASO. Närmare undersökningar av musklerna med hjälp av immunhistokemiska eller autoradiografiska metoder avslöjar dock ASO-innehåll i fagolysosomer av muskelstrommakrofager, och denna ansamling kan delvis påverka mätningen av ASO-koncentration i muskler och hjärta.
Ackumuleringen av ASO i cytoplasman av adipocyter är signifikant ur en terapeutisk synvinkel. Speciellt för att, till skillnad från de flesta av de ämnen som ackumuleras i adipocyter, är ASO:er hydrofila. Immunhistokemiska metoder visar tydligt att ASO finns i den cytoplasmatiska fraktionen av adipocyter, medan ASO nästan saknas i fettvakuolen. Intensiteten av färgningen indikerar en betydande ackumulering av ämnet i cytoplasman. Till exempel, hos apor efter 13 veckors behandling med ISIS 113715 i en dos av 10 mg/kg/vecka, var koncentrationen i levern 301 ± 88,1 μg/g, men endast 37,3 ± 14,4 μg/g i fettvävnaden i samma djur.
Med tanke på att den fettfria komponenten utgör 10% av den totala fettmassan, indikerar korrigeringen av ASO-koncentrationen, med hänsyn till denna indikator, jämförbarheten av dess koncentration med den i levern. Signifikanta koncentrationer av ASO i adipocyter indikerar att de kan användas för att behandla genetiska sjukdomar av denna celltyp: källor till hormoner och cytokiner. Således fann man att farmakologiskt aktiva koncentrationer av ASO registreras i fettceller hos möss när ISIS 113715 administreras i en dos av 25 mg/kg två gånger i veckan och minskar uttrycket av PTP-1B målgenen både i levern och i levern. adipocyter. Liknande observationer gjordes hos apor som behandlats med ASO ISIS 113715. Eftersom subkutan fettbiopsi kan utföras kliniskt och eftersom aktiv ASO ackumuleras i fett, kan fett användas för biopsi och direkt mäta farmakologiska effekter (mRNA-reduktion) och vävnadskoncentration av läkemedlet i mänskliga vävnader.
Fosfotioat-ASOs distribueras också till andra vävnader. Immunhistokemiska studier visar att endotelceller ackumulerar ASO i koncentrationer som är tillräckliga för att minska mRNA-nivåerna, vilket gör dem till ett potentiellt mål för farmakologisk intervention. I vissa vävnader är deras koncentrationer inte tillräckligt höga för en farmakologisk effekt. Till exempel ackumulerar inte mogna lymfocyter ASO, och antisensaktivitet begränsas av T-celler.
Benceller, särskilt fagocytiskt aktiva osteoblaster, kan ackumulera ASO och denna effekt kan användas för terapeutiska ändamål. Dessutom ackumulerar pankreatiska öceller också ASO. Både första och andra generationens ASO är högladdade, hydrofila molekyler som inte passerar blod-hjärna eller blod-testikelbarriärer. Men som i muskler är makrofager som innehåller detekterbara ASO:er lokaliserade i testiklarnas interstitiella region. Äggstockarna är inte åtskilda av en barriär, så ASO kan mätas kvantitativt i äggstockarna och visualiseras med immunhistokemi i stroma.
Den begränsade distributionen av plasma-ASO till hjärnceller och kardiomyocyter gör dessa vävnader till osannolika mål för antisensinterferens, även om selektiv hämning eller uttryck av vissa jonkanalproteiner i hjärna och muskler kan vara terapeutiskt fördelaktigt. Den begränsade distributionen av ASO i dessa vävnader kan dock ses som en fördel. Frånvaron av signifikanta koncentrationer av ASO i hjärnan och hjärtat minskar risken för skador på det centrala nervsystemet (CNS) och minskar manifestationen av oönskade hjärteffekter. Såsom noterats tidigare orsakar direkt administrering till CNS-strukturer, i synnerhet hjärnan, genom intratekal, intraventrikulär infusion eller injektion distribution av ASO inom det centrala nervsystemet och kan vara användbar terapeutiskt.
Under graviditeten är fostret ganska väl skyddat från effekterna av antisensmediciner. Studien av ASO:s transplacentala kinetik avslöjade inte dess ackumulering i fostret; en låg nivå av ASO noterades hos gnagare i moderkakan. Dessa resultat har konsekvent replikerats i en teratogenicitetsstudie av olika andra generationens ASO hos möss, råttor och kaniner. Moderkakan, trots att den är starkt perfunderad, är inte ett organ med en hög ackumulering av ASO.
I allmänhet visar de presenterade fakta att fördelningen av ASO är en av nyckelfaktorerna som bestämmer hur allvarlig ASO-aktiviteten är. Skillnader i ASO-fördelning verkar till stor del vara relaterade till vävnadstropism för dessa läkemedel och, i mindre utsträckning, till perfusion.
Ämnesomsättning
Antisensläkemedel av den första och andra generationen metaboliseras av nukleaser och inte av oxidassystem av cytokrom P450-typ, som används för att metabolisera konventionella lipofila småmolekylära läkemedel. ASO är varken ett substrat för cytokrom P450-isoenzymer och inte heller inducerar eller hämmar det dess aktivitet vid kliniskt signifikanta koncentrationer. Exonukleas-medierad ASO-klyvning, som är den huvudsakliga vägen för metabolism och clearance av första generationens fosfotioat-ODN, är sekundär till andra generationens ASO. Exonukleasaktivitet begränsas av två fragment: ett MOE vid 3'-änden och ett annat MOE vid 5'-änden.
Enzymer som ansvarar för ASO-metabolism
Specifika enzymer som metaboliserar andra generationens ASO är inte kända. Nukleaser är allestädes närvarande och det är möjligt att detektera nedbrutna ASO-metaboliter i de flesta vävnader. Lever- och njurhomogenat kan båda metabolisera andra generationens ASO in vitro utan tillsats av exogena energikällor såsom ni(NADPH) eller adenosin 5-trifosfat (ATP). Initial klyvning resulterar i två produkter, var och en kännetecknad av en 5" och 3" MOE-skyddad ände. Dessa metaboliter binder inte till proteiner och utsöndras därför från vävnaderna. Eftersom metaboliter avlägsnas snabbare än de bildas, finns det praktiskt taget ingen ackumulering av metaboliter i vävnader. Det är således inte möjligt att använda bestämningen av mängden metaboliter i vävnader som ett index för ASO-metabolism i vävnader.
Eftersom hastigheten för eliminering av ASO från vävnader beror på deras metabolism, kan skillnader i metabolismen av ASO i olika vävnader uppskattas baserat på halveringstiden för dessa läkemedel från de karakteriserade vävnaderna. Baserat på data för fyra andra generationens ASO:er dras slutsatsen att beteendet hos medlemmar i denna klass är liknande, men det finns små skillnader i deras halveringstid från lever och njurar hos apor som behandlats med läkemedlet i 4-13 veckor . Det har visat sig att halveringstiden för ACO ISIS 104838 och 112989 preparat från lever och njurar är mycket lika. Dessa data tyder på att det för vissa serier av ASO inte finns några signifikanta skillnader i ämnesomsättningen i olika organ. Skillnader i vävnadshalveringstid har dock identifierats för ISIS 107248, 113715 och 301012. De observerade skillnaderna i metabolismhastigheten för ASO-läkemedel i levern och njurarna indikerar att det kan finnas skillnader i metabolismens hastighet i olika vävnader , eller mer komplex kinetik för vissa produktserier eller resultat återspeglar helt enkelt ett litet antal prover tagna under en begränsad tidsram.
En detaljerad studie av processen för utsöndring av ASO andra generationen visar närvaron av olika hastigheter för deras utsöndring från olika typer av leverceller. Eftersom vissa celltyper, såsom proximala tubulära celler i njurbarken, tenderar att innehålla ASO i fagolysosomer, står denna typ av upptag sannolikt för skillnader i läkemedelsmetaboliska hastigheter i olika vävnader. Dessutom är det troligt att specifika sekvenser i strukturen av ASO-skelettet kan karakteriseras av olika känslighet för klyvning av endonukleaser.
Bakteriella exonukleaser uppvisar en hög grad av specificitet för nukleotidsekvensen i ASO-ryggraden, förmodligen för skydd mot virus. Mycket av aktiviteten hos nukleaser i däggdjursceller är associerad med mekanismerna för transkription och DNA-reparation, och sålunda kan artspecificiteten för däggdjur skilja sig från den hos bakteriella endonukleaser. Det är inte känt om replikationsprocesser och verkan av enzymer associerade med reparationsfenomenet är lika ansvariga för katabolismen av dessa syntetiska ASO. Vid höga koncentrationer av ssDNA kan ASO:er effektivt konkurrera med det naturliga substratet. Många enzymer i nukleasfamiljen kan katabolisera ASO. Bestämning av specifika enzymer involverade i ASO-metabolism är inte avgörande för utvecklingen av antisensläkemedel, men en bättre förståelse av metaboliska vägar kommer att vara användbar för utvecklingen av nya teknologier.
ASO-metaboliter
Skillnader i metabolismen av första och andra generationens ASO:er är ganska uppenbara när man jämför den metaboliska profilen med CGE. När vävnads- eller urinprover analyseras i en LC/MS-detektor blir de metaboliska processernas karaktär tydligare. Typiskt metaboliseras första generationens fosforotioat-ODN till en kaskad av ASO-metaboliter, som var och en skiljer sig med en nukleotid som ett resultat av enstaka nukleotidklyvningar av ett exonukleas. Sålunda, efter introduktionen av en 20-mer, det vill säga bestående av 20 nukleotider, innehåller första generationens ODN, plasma och vävnader familjer av konsekutivt förkortade ASO, med början från 19-mer och vidare upp till en kort ASO.
Initial klyvning i andra generationens ASO-metabolism förmedlad av
endonukleaser, leder till bildandet av två ASO, en med 3'-änden av MOE och den andra med 5'-änden av MOE. Klyvning av produkter med oskyddade ändar kan utföras antingen med 5'-exonukleas eller 3'-exonukleas. Resultaten av kombinerad endo- och exonukleasaktivitet är en kaskad av kedjeförkortade klyvningsprodukter, av vilka många, om inte alla, kan detekteras i urin som samlats in från försöksdjur eller människor. Urinen från behandlade djur eller patienter som behandlats med andra generationens ASO kan innehålla metaboliter som sträcker sig från två möjliga 15-mer till två möjliga 5-mer MOE och flera kombinationer av var och en av de intermediära metaboliterna.
Metaboliter som är kortare än längden på MOE-ändarna kommer att finnas i vävnader om ändarna av MOE själva är substrat för nukleaser. Dessa metaboliter detekteras vanligtvis inte genom masspektralanalys, vilket tyder på att det som regel inte finns några MOE-mononukleotider som frisätts under metabolism. Det finns dock några undantag från denna generalisering. För ett begränsat antal nukleotidsekvenser , andra generationens ASO enkelnukleotidtrimningar observerade i vävnader och plasma – antingen CGE eller LC/MS: metaboliter verkar vara resultatet av exonukleas-digestion. Dessa metaboliter kan observeras i den initiala distributionen. Det antas att de snabbt uppträder i blodplasman. MOE-mononukleotider, som bildas under metabolism, är inte substrat för fosforylering och är därför osannolikt att inkluderas i nukleotidtrifosfater och slutligen i endogena nukleotider. MOE-mononukleotider hämmar inte de enzymer som är ansvariga för DNA-syntes. Således bör MOE-mononukleotider, om de bildas, inte inkorporeras i endogena nukleotider.
Den centrala delen av deoxinukleotiderna i andra generationens ASO är föremål för exonukleasklyvning, vilket leder till frisättning av en nukleotid. Monodeoxinukleotider, som produceras genom exonukleasklyvning, är identiska med endogena nukleotider, med undantag för tiofosfatgruppen, som teoretiskt kan vara närvarande. Tiofosfatgruppen är dock labil för oxidation och svavelförlust, vilket gör den terminala fosfatgruppen identisk med endogena nukleotider. Därför, till skillnad från MOE-mononukleotider, kommer alla frigjorda deoxinukleotider att inkluderas naturligt i den intracellulära depån av endogena nukleotider. Nukleotider som bibehåller tiofosfatgrupper kommer att vara substrat för tillsats av en eller två fosfatgrupper, vilket resulterar i blandade nukleotidtiofosfatdi- eller trifosfater. Fosforylering är möjlig, men närvaron av alfa-tiofosfat gör reaktionerna termodynamiskt ogynnsamma.
Slutsats
Relevansen av studien av farmakokinetiken för data och läkemedel som liknar de som beskrivs, såväl som skapandet av modeller för olika djurarter för en fullständig förståelse av de processer som sker i kroppen efter att ha tagit läkemedlen, är uppenbar. I Ryssland pågår också studier av sådana läkemedel.
Litteratur
1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. En fas I-studie av ISIS 2503, en antisenshämmare av H-ras, i kombination med gemcitabin hos patienter med avancerad cancer. // klinik. Cancer Res. 2003 vol. 9, #1. S. 115.
2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) är ett ODN-bindande protein. // Nat. Med. 1997 vol. 3, nr 4. s. 414.
3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Bindning av fosforotioat-ODN till grundläggande fibroblasttillväxtfaktor, rekombinant löslig CD4, laminin och fibronektin i P-kiralitetsoberoende. // Nukl. Acids Res. 1995 vol. 23, nr 21. s. 4239.
4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. In vitro öde för fosforotioat-antisens ODN: dominerande upptag av scavenger-receptorer på endotelceller. // Nukl. Acids Res. 1997 vol. 25, nr 16. s. 3290.
5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Modulering av plasmaproteinbindning och in vitro levercellsupptag av fosforotioat-ODN genom kolesterolkonjugering. // Nukl. Acids Res. 2000 Vol. 28, nr 14. P. 2717.
6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Effekt av fosforotioatmodifiering av ODN på specifik proteinbindning. // J. Biol. Chem. 1994 vol. 269, nr 43. R. 26801.
7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. Fosforothioate ODNs fördelar sig på liknande sätt i klass A scavenger receptor knockout och vildtyp möss. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000 Vol. 292, nr 2. s. 489.
8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Spinal distribution och metabolism av 2_-O-(2-metoxietyl)-modifierade ASOs efter intratekal administrering hos råttor. // Neurovetenskap. 2005 vol. 131, nr 3. s. 705.
9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Cellulär distribution av fosforotioat-ODN i normala gnagarvävnader. //Labb. Investera. 1997 vol. 77, nr 4. s. 379.
10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Disponering av det 14C-märkta fosforotioatet ASO ISIS 2105 efter intravenös administrering till råttor. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993 vol. 267, nr 3. s. 1181.
11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Farmakokinetik för en 14C-märkt fosfortioat ASO, ISIS 2105, efter intradermal administrering till råttor. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994 vol. 269, nr 1. s. 89.
12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Farmakokinetiska egenskaper hos flera nya ASO-analoger i möss. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 vol. 277, nr 2. s. 923.
13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. ASO-baserad hämning av embryonalt genuttryck. // Nat. Biotechnol. 1999 vol. 17. s. 1184.
14. Eckstein F. Fosforothioate ODN: vad är deras ursprung och vad är unikt med dem? // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000 Vol. 10, #2. R. 117.
15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. On-line HPLC elektrospray masspektrometri av fosforotioat ASO metaboliter. // Anal. Chem. 1997 vol. 69, nr 3. s. 313.
16. Geary R.S. Aktuell bedömning av PK/PD-samband för antisensterapi. // World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Nice, Frankrike, 2002.
17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. et al. Brist på farmakokinetisk interaktion för ISIS 113715, en 2_-O-metoxietylmodifierad antisensoligonukleotid riktad mot proteintyrosinfosfatas 1B budbärar-RNA, med orala antidiabetiska föreningar metformin, glipizid eller rosiglitazon. // klinik. Farmakokinet. 2006 vol. 45, nr 8. s. 789.
18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Farmakokinetik och metabolism hos möss av en fosforotioat ASO-antisenshämmare av C-raf-1 kinasuttryck.// Drug Metab. Dispos. 1997 vol. 25, nr 11. R. 1272.
19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Antisensoligonukleotidhämmare för behandling av cancer: 1. Farmakokinetiska egenskaper hos fosforotioat-ODN. // Anticancerläkemedel Des. 1997 vol. 12, nr 5. R. 383.
20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Sekvensoberoende plasma- och vävnadsfarmakokinetik för 3 antisens-fosforotioat-ASO:er från mus till människa. // i American Association of Pharmaceutical Scientists, Pharm. Research, Plenum Press, Seattle, Washington. 1996. R.S.
21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. et al. Första gången leverextraktion av en delvis modifierad chimär antisense-oligonukleotider i Beagle-hundar. // i årsmöte för American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. S. 216.
22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L et al. Farmakokinetiska egenskaper hos 2_-O-(2-metoxietyl)-modifierade ASO-analoger hos råttor. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001 vol. 296, nr 3. R. 890.
23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Farmakokinetik för fosforotioat-antisens-ODN. // Curr. Opin. Investera. läkemedel. 2001 vol. 2, #4. R. 562.
24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. et al. Farmakokinetik för en tumörnekrosfaktor-alfa-fosforotioat-2_-O-(2-metoxietyl)-modifierade antisensoligonukleotider: jämförelse mellan arter. // Drug Metab. Dispos. 2003 vol. 31, nr 11. s. 1419.
25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Membrane transporters and drug response, i Goodman & Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11:e upplagan, Brunton, L.L., upplaga, McGraw-Hill, New York, 2006. P. 41.
26. Gleave M., Chi K.N. Nedbrytning av den cytoprotektiva genen, clusterin, för att förbättra hormon- och kemokänsligheten i prostata och andra cancerformer. // Ann. NY Acad. sci. 2005. Vol.1058. P.1.
27. Gleave M., Miyake H. Användning av antisens-oligonukleotider som riktar sig mot den cytoprotektiva genen, klusterin, för att förbättra androgen- och kemokänsligheten vid prostatacancer. // Världen J. Urol. 23. 2005. Nr 1. S. 38.
28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Fas I säkerhet och farmakokinetisk profil för en intercellulär adhesionsmolekyl-1 antisens ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997 vol. 282, nr 3. R. 1173.
29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. In vitro distribution och metabolism av en fosforotioat ASO i råttlever efter intravenös administrering. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998 vol. 286, nr 1. s. 447.
30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Fosforotioat-ODN binder till grundläggande fibroblasttillväxtfaktor, hämmar dess bindning till cellytreceptorer och tar bort den från bindningsställen med låg affinitet på extracellulär matris. // J. Biol. Chem. 1995 vol. 270. P.2620.
31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Effekter av humana och murina antisense oligonukleotidhämmare av ICAM-1 på reproduktionsförmåga, fosterutveckling och postnatal utveckling hos möss. // Födelseskador Res. Bdev. fortplantning. Toxicol. 2004 vol. 71, nr 6. s. 359.
32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. et al. Hämning av spinalproteinkinas C alfa-uttryck av en antisensoligonukleotid dämpar morfininfusionsinducerad tolerans. // Neurovetenskap. 2002 vol. 113, nr 1. s. 99.
33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Inhibering av angiogenes genom antisensoligonukleotider till klusterin. // Angiogenes. 2005 vol. 8, nr 3. S. 229.
34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Potent minskning av apolipoprotein B och lågdensitetslipoproteinkolesterol genom kortvarig administrering av en antisenshämmare av apolipoprotein B. // Cirkulation. 2006 vol. 114, nr 16. s. 1729.
35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodiferens – effekten av P-kiralitet hos oligo (nukleosidfosforotioater) på aktiviteten av bakteriellt RNas H. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol.23, No.24. R. 5000.
36. Leeds J.M., Geary R.S. Farmakokinetiska egenskaper hos fosforotioat-ASO hos människor, i Antisense Research and Applications, 1:a upplagan, Crooke, S.T., upplaga, Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.
37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Jämförelse av farmakokinetiken för subkutan och intravenös administrering av en fosfortioatoligodeoxinukleotid hos cynomolgusapor. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, nr.6. R. 435.
38. Levin A.A. En genomgång av frågor i farmakokinetiken och toxikologin för fosforotioat-antisensoligonukleotider. // Biochim. Biophys. acta. 1999. Vol.1489, No.1. R. 69.
39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Farmakokinetiken och toxiciteten hos fosforotioat-ASOs, i Biotechnology and Safety Assessment, 2:a upplagan, Thomas, J.A., red., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. P. 151.
40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Preklinisk utveckling av antisensterapi, i Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, 1st ed., Oxender D.L. och Post L.E., red., Springer-Verlag, Heidelberg, Tyskland, 1998, s. 131.
41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toxicitet hos antisensoligonukleotider. // i Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., red., Marcel Dekker, New York, 2001. P. 201.
42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Karakterisering av ASO-transport in i levande celler. //Proc. Natl. Acad. sci. USA. 1989 vol. 86. s. 3474.
43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Nukleocytoplasmatisk shuttling: en ny in vitro-egenskap hos antisense fosforotioat-ODN. // Nukl. Acids Res. 2000 Vol. 28, nr 2. s. 582.
44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Biotillgänglighet och terapeutisk aktivitet av alicaforsen (ISIS 2302) administrerades som ett rektalt retentionlavemang till patienter med aktiv ulcerös kolit. // Ailment Pharmacol. Ther. 2006 vol. 23, nr 10. R. 1427.
45. Mou T.C., Gray D.M. Den höga bindningsaffiniteten hos fosfortioatmodifierade oligomerer för Ff-gen 5-protein modereras genom tillsats av C-5-propyn eller 2_-O-metylmodifieringar. // Nukl. Acids Res. 2002 vol. 30, nr 3. R. 749.
46. Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Farmakokinetiska egenskaper hos fosfortioater i djur-absorption, distribution, metabolism och eliminering, i Antisense Research and Applications, 1:a upplagan, Crooke, S.T., upplaga, Springer, Berlin, 1998. P. 141.
47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Vävnadsfördelning och fysiologiskt baserad farmakokinetik för antisensfosforotioat ASO ISIS 1082 hos råtta. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2001 vol. 11, #1. S. 15.
48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. et al. Farmakokinetik, metabolism och eliminering av en 20-mer fosforotioat ODN (CGP 69846A) efter intravenös och subkutan administrering. // Biochem. Pharmacol. 1997 vol. 54, nr 6. R. 657.
49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Disposition av ASOs i isolerade perfuserade råttnjure: involvering av scavenger-receptorer i deras renala upptag. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 vol. 279, nr 1. S. 284.
50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Fas I-studie av ISIS 104838, en 2_-metoxietyl-modifierad antisens-oligonukleotider som riktar sig till tumörnekrosfaktor-alfa. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002 vol. 303, nr 3. R. 1334.
51 Slim G., Gait M.J. Konfigurationsdefinierade fosforotioat-innehållande oligoribonukleotider i studien av mekanismen för klyvning av hammarhuvud-ribozymer. // Nukl. Acids Res. 1991 vol. 19, nr 6. R. 1183.
52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Cellulär association, intracellulär distribution och utflöde av auranofin via sekventiella ligandutbytesreaktioner. // Biochem. Pharmacol. 1986 vol. 35, nr 6. s. 923.
53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Maternal och fetal distribution av en fosforotioat-ASO i råttor efter intravenös infusion. // Födelseskador Res. Bdev. fortplantning. Toxicol. 2006 vol. 77, nr 1. S. 22.
54. Spitzer S., Eckstein F. Inhibering av deoxiribonukleaser av fosforotioatgrupper i oligodeoxiribonukleotider. // Nukl. Acids Res. 1988 vol. 16, #24. R. 11691.
55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Farmakokinetik och hepatisk förstapassageeffekt av en antisensoligonukleotid (ISIS 2302) hos råttor. // i årsmöte för American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. S. 216.
56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. Farmakokinetisk och toxicitetsprofil för en fosfortioat ASO efter inhalationsleverans till lungan hos möss. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000 Vol. 10, nr 5. R. 359.
57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. Kristallstruktur och förbättrade antisensegenskaper hos 2_-O-(2-metoxietyl)-RNA. // Nat. Struktur. Biol. 1999. Vol. 6, nr. 6. R.535.
58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. En fas I/II-studie av LY900003, en antisenshämmare av proteinkinas C-alfa, i kombination med cisplatin och gemcitabin hos patienter med avancerad icke-småcellig lungcancer. // klinik. Cancer Res. 2004 vol. 10, nr 18 Pt 1. P. 6086.
59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Plasmaproteinbindning av en antisens-oligonukleotid riktad mot human ICAM-1 (ISIS 2302). // ASOs. 2006 vol. 16, nr 2. S. 169.
60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hydrering av enkelsträngade fosfodiester- ochider. // Nukl. Acids Res. 1996 vol. 24, nr 16. R. 3261.
61. Wilson D.M. För det tredje, Ape1 abasisk endonukleasaktivitet regleras av magnesium- och kaliumkoncentrationer och är robust på alternativa DNA-strukturer. // J. Mol. Biol. 2005 vol. 345, nr 5. S. 1003.
62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. et al. Stereoberikade fosforotioat-ODN: syntes, biofysiska och biologiska egenskaper. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Vol.8, No.1. R. 275.
63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Utveckling av en ultrakänslig icke-kompetitiv hybridiserings-ligeringsenzymkopplad immunosorbentanalys för bestämning av fosfortioat ODN i plasma. // Anal. Biochem. 2002 vol. 304, nr 1. S. 19.
64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Jämförelse av farmakokinetik och vävnadsdisposition av en antisens-fosforotioat-ASO riktad mot humant Haras-mRNA hos mus och apa. // J. Pharm. sci. 2001 vol. 90, #2. S. 182.
65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Tillämpning av nya kvantitativa bioanalytiska metoder för farmakokinetiska och farmakokinetiska/farmakodynamiska bedömningar av antisensoligonukleotider. // Curr. Opin. drogdiskov. dev. 2004 vol. 7, #2. R. 195.
66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. et al. Farmakokinetisk jämförelse mellan olika arter från mus till människa av en andra generationens antisensoligonukleotid ISIS 301012, inriktad på humant apolipoprotein B-100. // Drug Metab. Dispos. 2007 Vol. 35. S. 460.
67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. Farmakokinetik och farmakodynamik för en antisense fosforotioat ASO som riktar sig mot Fas mRNA i möss. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001 vol. 296, nr 2. s. 388.
68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. et al. PTP1B antisense-oligonukleotid sänker PTP1B-protein, normaliserar blodsockret och förbättrar insulinkänsligheten hos diabetiska möss. //Proc. Natl. Acad. sci. USA. 2002 vol. 99, #17. s. 1137.
Medicin för generna
Läkarnas långvariga dröm är att ha till sitt förfogande ämnen som skulle verka på specifika gener, d.v.s. grundorsaken till många sjukdomar. Faktum är att baserat på sådana ämnen är det möjligt att skapa droger - riktiga "magiska kulor" som kan påverka det ärftliga materialet från olika smittämnen utan att skada människokroppen, samt undertrycka aktiviteten hos onkogener som är ansvariga för maligna celltillväxt. Skapandet av sådana ämnen som har en direkt effekt på genetiskt material är en av molekylärbiologins huvuduppgifter, eftersom de kan användas för att studera geners funktioner och i slutändan kontrollera de senares arbete.
Men hur kan du ändra det önskade genetiska programmet? När allt kommer omkring har alla gener liknande kemisk sammansättning och struktur: skillnaderna mellan dem reduceras endast till växlingsordningen av fyra monomera block - nukleotider A, T, G, C. För att verka på en viss gen, en ämnesmolekyl måste på något sätt känna igen denna nukleotidsekvens - uppgiften, vid första anblicken, olöslig.
Men en grupp sibiriska kemister som kom till Novosibirsk Academgorodok under de första åren av dess skapelse trodde annorlunda. Baserat på principen om molekylärt erkännande som används av naturen själv, anställda vid Institutet för organisk kemi i den sibiriska grenen av USSR Academy of Sciences (Novosibirsk) N.I. Grineva och D.G.-grupper. Det första arbetet om oligonukleotider publicerades av sibiriska kemister 1967 - detta datum anses idag vara det officiella datumet för uppkomsten av en ny riktning inom molekylärbiologi och farmakologi.
De var de första
Genomförandet av detta projekt, ovanligt i sin djärvhet (vid den tiden var det inte ens planerat att genomföra sådan forskning någonstans i världen) i det inledande skedet utfördes av en liten grupp unga anställda, doktorander och studenter från NSU. Vi var tvungna att börja praktiskt taget från början, eftersom de vid den tiden fortfarande inte visste hur man syntetiserar oligonukleotider i märkbara mängder; det fanns inga tekniska instrument som var nödvändiga för att arbeta med små mängder nukleinsyror och en effektiv metod för att bestämma deras sekvens. Våra kemister lyckades lösa dessa problem tack vare tvärvetenskaplighet - en av principerna som låg till grund för den sibiriska grenens verksamhet.
NIOC organiserade produktionen av nukleinsyror, utvecklade metoder för deras kemiska modifiering; Tillsammans med anställda vid Institute of Nuclear Physics var det möjligt att skapa enheter för analys av nukleinsyror och manipulation med deras små mängder, och tillsammans med kemister från Moscow State University började de arbetet med att skapa automatiska synthesizers av oligonukleotider. Som ett resultat stod praktiskt taget alla nödvändiga analytiska metoder och instrument till forskarnas förfogande - biologisk forskning kunde börja.
Experiment utförda först på enkla modeller och sedan på naturliga nukleinsyror visade att oligonukleotider verkligen interagerar med målnukleinsyror med en hög grad av selektivitet. I fallet då reaktiva grupper är fästa till oligonukleotiderna, sker en riktad kemisk modifiering av målnukleinsyrorna. Dessutom visades det för första gången att dessa reagens kan användas för att undertrycka virusinfektioner hos djur, och möjligheten att föra in dem i kroppen genom hud och slemhinnor etc. har bevisats.
Tidiga publikationer om de biologiska effekterna som produceras av oligonukleotider väckte stort intresse bland specialister runt om i världen. 1988 hölls världens första symposium om geninriktade substanser baserade på nukleinsyrafragment i Akademgorodok. Forskare från USA, Frankrike och sedan andra länder gick med i arbetet med att skapa sådana läkemedel; Dussintals företag har vuxit fram med målet att skapa terapeutiska läkemedel baserade på oligonukleotider.
Komplementär medicin
Så kallade antisens-oligonukleotider, designade för selektiv inaktivering av virala RNA och vissa cellulära RNA, blev de första av de geninriktade läkemedlen. Initialt antogs det att reaktiva grupper skulle fästas till dessa oligonukleotider, vilket skulle kemiskt modifiera eller förstöra målnukleinsyrorna. Det visade sig dock att bindningen av oligonukleotider till mål-RNA:t i sig har en så stark effekt på det att det kan provocera dess förstörelse av cellulära enzymer.
D. G. KNORRE - Akademiker vid Ryska vetenskapsakademin, specialist inom kemisk kinetik, molekylärbiologi och bioorganisk kemi. Chef för Laboratory of Chemistry of Natural Polymers (1960-1984), Institutionen för biokemi och laboratorium för nukleinsyrakemi (1970-1984) vid Institutet för organisk kemi i den sibiriska grenen av USSR Academy of Sciences, chef för institutet för bioorganisk kemi från den sibiriska grenen av USSR Academy of Sciences och den sibiriska grenen av den ryska vetenskapsakademin (1984-1996). )
Antisensmetoder baserade på användningen av nukleotider och nukleinsyror för att undertrycka den biologiska aktiviteten av nukleinsyror erbjuder intressanta möjligheter i fall där det är nödvändigt att undertrycka implementeringen av oönskad information i levande organismer. Först och främst öppnar sig möjligheten att skapa en ny generation av antivirala och antitumörläkemedel. Sådana läkemedel har en obestridlig fördel framför andra... Alla oligonukleotider, oavsett vilket mål de är riktade mot, kan skapas med en enda teknologi. Endast sekvensen av nukleotider behöver varieras. I synnerhet inom virologi och onkologi måste man ofta hantera ett sådant fenomen som uppkomsten av läkemedelsresistens. Detta händer oftast eftersom en enda viruspartikel eller en enda cancercell har en mutation som leder till sådan resistens. I alla andra fall bör ett empiriskt sökande efter ett nytt läkemedel påbörjas. När det gäller antisenseffekter är det bara nödvändigt att bestämma vilken förändring i strukturen av det virala genomet eller onkogenen som ledde till uppkomsten av resistens. Efter det blir det omedelbart klart hur man skapar ett nytt läkemedel med samma enhetliga teknik *. * Soros Educational Journal. - 1998. - 12. - C. 25-31.
Interfererande RNA, korta dubbelsträngade komplex av RNA-oligonukleotider, visade sig vara det mest kraftfulla sättet att "stänga av" gener. När ett sådant komplex införs i en cell, binder en av strängarna till dess komplementära sekvens i cellens budbärar-RNA. Detta fungerar som en signal för att starta arbetet med en grupp enzymer som skär RNA associerat med oligonukleotider. Som ett resultat försvinner programmet för syntes av ett visst protein.
2006 tilldelades två amerikanska forskare Nobelpriset i fysiologi eller medicin för att de förklarade mekanismen för RNA-interferens. Skapandet av genuttrycksregulatorer baserade på störande RNA har öppnat stora möjligheter för att erhålla ett brett utbud av mycket effektiva icke-toxiska läkemedel som undertrycker uttrycket av nästan alla gener, inklusive tumörer och virala.
Korrekt mutationer
Specialisters uppmärksamhet har länge lockats av metoder för mutagen verkan på DNA med användning av oligonukleotider eller deras derivat. Om det lyckas kan det som idag verkar som en fantasi bli verklighet: korrigeringen av defekta genetiska program.
Det har redan experimentellt bevisats att punktmutationer kan introduceras i genetiska program med hjälp av korta oligonukleotider. Hur man gör det? Mutagena oligonukleotider som innehåller "fel" nukleotidblock införs i cellen, där de kombineras med DNA. Som ett resultat av detta uppträder "fel", dvs icke-komplementära, baspar i vissa delar av nukleotidsekvenserna, vilket uppfattas av det cellulära DNA-reparationssystemet ("reparation") som skada. Nukleotider i ett sådant par ersätts av reparativa enzymer på ett sådant sätt att det blir "korrekt", komplementärt. I detta fall kan ersättningen ske både i oligonukleotidsekvensen och i själva cellulära DNA.
I det senare fallet har vi att göra med en förändring i det genetiska programmet, det vill säga med en mutation. Och även om effektiviteten för en sådan mutationsprocess generellt sett är låg, kan den användas i förhållande till nya cellulära teknologier. Till exempel kan stamcellerna från en patient med någon ärftlig sjukdom behandlas med ett selektivt mutagen, och sedan kan de av dem där den önskade mutationen har inträffat (dvs celler med ett "korrigerat" genetiskt program) selekteras, multipliceras och förs in i kroppen.
1967 Det första arbetet om oligonukleotider, geninriktade biologiskt aktiva substanser, publiceradesSåledes kan de för närvarande existerande oligonukleotiderna reglera "arbetet" av gener på olika nivåer. Sålunda fungerar de tidigare nämnda antisensoligonukleotiderna och störande RNA:n vid proteinsyntesstadiet och verkar på budbärar-RNA - informationsmolekyler i vilka polypeptidkedjor är sammansatta. Antigena oligonukleotider som bildar komplex med DNA undertrycker genuttryck - själva bildningen av budbärar-RNA, och aptamer-oligonukleotider, liksom antikroppar, kan bilda bindningar med vissa proteiner och blockera dem. Dessutom kan vissa oligonukleotider stimulera immunförsvaret - idag används de som komponenter i vacciner.
För närvarande utförs utvecklingen och syntesen av oligonukleotider och deras analoger av stora forsknings- och industrisektorer. Så förra året översteg volymen av marknaden för oligonukleotider avsedda för forskningsändamål 800 miljoner dollar! Dussintals nya typer av kemiskt modifierade oligonukleotider har nu utvecklats och syntetiserats, och ett antal antivirala och antiinflammatoriska läkemedel baserade på dem testas. Forskning av detta slag i Ryssland utförs för närvarande huvudsakligen vid Institutet för kemisk biologi och grundläggande medicin i den sibiriska grenen av den ryska vetenskapsakademin, där studenter och anhängare av akademiker D. G. Knorre arbetar.
Så här bevisades fruktbarheten av idén som uppstod i den sibiriska grenen för fyrtio år sedan av livet självt. Genom att använda korta fragment av nukleinsyror som grundläggande strukturer för att skapa genriktade biologiskt aktiva substanser är det möjligt att snabbt utveckla och införa specifika läkemedel mot nästan alla virus i produktionen. För att göra detta är det bara nödvändigt att dechiffrera nukleotidsekvensen av virala gener, vilket är lätt att göra med hjälp av modern teknik. Detta universella tillvägagångssätt har en stor framtid: resultaten av studier under de senaste åren, särskilt om platsriktad mutagenes, gör att vi kan räkna med framväxten av effektiva läkemedel inom en snar framtid för att bekämpa sjukdomar som fortfarande anses obotliga.
Introduktion
Utvecklingen av riktade läkemedel är en prioriterad uppgift för modern molekylärbiologi, bioorganisk kemi och medicin. För närvarande finns det ett stort antal verk som återspeglar olika tillvägagångssätt för att lösa detta problem. Av ett antal anledningar är det mest lovande tillvägagångssättet baserat på att välja ett patogent protein-mRNA som mål och använda egenskapen komplementaritet i interaktionen av nukleinsyror med varandra. Hittills pågår arbete inom tre områden:
Antisens-oligonukleotider;
Ribozymer och DNAzymer;
SiRNA och miRNA.
Dessa metoder är baserade på användningen av korta nukleinsyramolekyler (17 - 70 nt) med en sekvens som är delvis eller helt komplementär till mål-mRNA-stället. De allmänna principerna för verkan av sådana medel förenar dem också inom området för nya problem, bland vilka de mest akuta är leverans in i cellen, resistens mot verkan av nukleaser och effektiviteten av interaktion med mål-mRNA. Kemiska modifieringar av NC-medel hjälper till att delvis eller helt lösa många av dessa problem och ökar effektiviteten hos medlen.
Studiet av mekanismerna för undertryckande av genuttryck med hjälp av komplementära interaktioner kräver användning av analysmetoder som gör det möjligt att entydigt bestämma antisenseffekten av oligonukleotider.
Syftet med detta arbete är att utveckla en metod för att undertrycka expressionen av EGFP-genen i celler med hjälp av konjugat av oligonukleotiden med pyren.
Antisense oligonukleotidmodifieringar (litteraturöversikt)
Utvecklingen av läkemedel som gör det möjligt att på gennivå förhindra utvecklingen av sjukdomar orsakade av uttryck av patogena proteiner (virala, onkogena produkter) eller proteiner som förhindrar att botemedel (MDR) har lett till uppkomsten och utvecklingen av antisensteknologi. Principen för antisensteknologi är enkel: antisens-oligoribonukleotider orsakar undertryckande av målgenexpression på ett sekvensspecifikt sätt, genom att använda oligonukleotidernas förmåga att hybridisera till mål-mRNA:t via Watson-Crick-interaktioner. Oligonukleotiden, som binder till mål-RNA:t, förhindrar dess vidare bearbetning. Experiment på cellkulturer har visat att användningen av oligodeoxiribonukleotider (nedan kallade ODN) 20–30 nt långa, komplementära till mRNA-regionen, avsevärt minskar uttrycksnivån av det protein som det kodar för. Utvecklingen av metoden har visat ett antal orsaker som leder till en minskning av effektiviteten av ODN: en kort livslängd för ODN i serum, låg effektivitet för penetration (transport) in i cellen och otillräcklig effektivitet för bindning till strukturerade RNA-fragment.
Utvecklingen av organisk kemi, i synnerhet nukleinsyrors kemi, gör det möjligt att leta efter sätt att lösa nya problem genom att introducera olika kemiska modifieringar av ODN. Både kvävehaltiga baser och sockerfosfatryggraden kan utsättas för kemisk modifiering, vilket leder till en ökning av dess ODN-nukleasresistens och effektiviteten av dess bindning till den komplementära sekvensen. Ett försök görs att öka effektiviteten av ODN-leverans in i cellen genom att införa olika grupper i dess sammansättning vid en av ändarna, vilket underlättar passage genom membranet.
I grund och botten särskiljs två verkningsmekanismer för antisensoligonukleotider: translationsstopp på grund av bindning av den regulatoriska regionen och RNA-klyvning i RNA-DNA-heteroduplexet. Att underhålla ändringar kan ha olika inverkan på en eller annan mekanism, vilket bör beaktas när du väljer ett modifieringsalternativ.
1.1 Verkningsmekanism för antisensoligonukleotider
När en antisensoligonukleotid interagerar med mRNA inträffar två händelser: sterisk blockering och klyvning av mål-mRNA:t av RNas H. För vissa oligonukleotider inträffar båda händelserna (RNas H-kompetenta oligonukleotider), för andra endast sterisk blockering (RNas H-oberoende ). Dessa två varianter är baserade på olika cellulära mekanismer. Det bredaste utbudet av molekylära mekanismer används när du använder det andra alternativet. Detta uppnås genom att adressera oligonukleotider till specifika regulatoriska sekvenser i både pre-mRNA och mRNA. I fallet med pre-mRNA, stör ODN-adressering till gränsregionen mellan intron och exon splitsningen, vilket leder antingen till dess avslutning eller till bildningen av mRNA som kodar för ett icke-funktionellt protein (se fig. 1). Ett annat lovande ODN-bindningsställe i pre-mRNA är 5'-ändregionen Interaktion av ODN med denna region leder till blockering av kapning.
När ODN interagerar med mRNA störs dess translation, och därmed proteinsyntesen, på grund av att ribosomens rörelse blockeras längs mRNA eller till och med dess sammansättning, beroende på positionen för bindningsstället.
Figur 1.
RNas H-kompetenta ODN:er kan adresseras till vilken region som helst av pre-mRNA och mRNA, eftersom deras verkan är baserad på aktiveringen av RNas H, vars substrat är RNA i sammansättningen av RNA-DNA-duplex. Men många kemiskt modifierade antisensoligonukleotider kan inte aktivera denna mekanism på grund av den höga steriska specificiteten hos RNase H. Detta beror på det faktum att de flesta modifieringar leder till en förändring av parametrarna för helixen av ODN-RNA-duplexet, och de upphör att vara substrat för RNase H.
Antisensoligonukleotider av den andra generationen - modifierade i 2 "positionen av sockerresten, är inte substrat för RNas H, därför måste andra spjälkningsmedel (konstgjorda RNaser) sökas. Ett antal små molekyler (interkalatorer, polykatjoner) kan att klyva mål-RNA. leder till klyvning av de önskade regionerna av mål-RNA. Sådana grupper är metallkomplex, aminer, oligopeptider och molekylära strukturer med grupper av det aktiva centrumet av nukleaser (imidazolring, COO - -, NH 2 grupper, guanidin).
1.2 Antisens-oligonukleotidmodifikationer
1.2.1 Strategier för utveckling av kemiska modifieringar av oligonukleotider
Baserat på ackumulerade data om användningen av antisensoligonukleotider har ett antal kriterier formulerats som ett ODN måste uppfylla för att vara ett effektivt terapeutiskt medel:
motstånd mot nukleaser
hög affinitet för målet
RNase H-substratbildning
olika verkningsmekanismer (påverkan av alternativ splitsning, stopp av translation)
icke-toxicitet och specificitet
Möjlighet till ospecifik bindning till proteiner för transport
Enkel syntes, patenterbarhet, fördel
Inbyggda ODN:er kan inte helt uppfylla alla de listade kriterierna. De huvudsakliga begränsningarna är svag nukleasresistens och otillräckligt stabila ODN-RNA-komplex. Införandet av kemiska modifieringar i ODN för alla eller enskilda nukleotider kan i stort sett eliminera de existerande bristerna. ODN-modifieringar utförs vid fosfatgruppen, sackarosresten, den kvävehaltiga basen eller vid de terminala fosfatresterna. För att öka nukleasresistens utförs modifiering oftast av fosfatgruppen och deoxiribosresten. En ökning av bindningseffektiviteten erhålls på grund av modifieringen av kvävehaltiga baser, såväl som deoxiribosresten. För att öka effektiviteten av proteinbindningen och förbättra transporten utförs konjugering med ligander av olika natur. I vissa fall fungerar de bifogade kemiska konstruktionerna som katalysatorer för fosfodiesterbindningar i RNA.
1.2.2 Modifieringar av fosfatgrupp
Klyvning av fosfodiesterbindningar i DNA av nukleaser sker genom effektiv bindning vid det aktiva stället och genom att använda fosfatgruppens syra-basegenskaper. Ett sätt att öka motståndet hos ODN-bindningar mot verkan av nukleaser är att ändra den elektroniska konfigurationen av fosfatgruppen. För att göra detta ersätts en av de obundna syreatomerna med en atom av ett annat grundämne. Svavel var ett av de första sådana element som användes, som ett resultat av vilka fosfortioater (modifierade första generationens antisensoligonukleotider; se Fig. 2, II) erhölls.
Ris. 2.
Fosforotioater visade hög resistens mot verkan av nukleaser, men denna modifiering ökade signifikant toxiciteten av ODN.
Genom att ersätta den obundna syreatomen i fosfatgruppen med en metylgrupp erhålls metylfosfonater (se fig. 3, III), som uppvisar hög motståndskraft mot verkan av nukleaser. Modifiering utförs ofta endast vid de terminala nukleotiderna, vilket resulterar i minskad toxicitet.
Om vi ersätter syreatomen i fosfatet med BH 3 - erhålls boranofosfater. Återstoden -BH 3 - är isoelektronisk till syreatomen i fosfodiesterbindningar, på grund av vilka boranofosfater behåller sin negativa laddning, är mycket lösliga i vatten och bildar komplex med mål-RNA:t. Denna rest är också isoelektronisk och isosterisk för metylgruppen, på grund av vilka egenskaper som liknar de hos metylfosfonater, såsom resistens mot nukleaser, bör förväntas från dem.
Ris. 3.
1.2.3 Modifieringar av sockerrester
Modifieringar av fosfodiesterbindningar har inte någon signifikant effekt på stabiliteten hos DNA-RNA-heteroduplexet. Därför, förutom modifierade oligodeoxinukleotider, är de så kallade andra generationens modifierade antisens-oligonukleotider av intresse - dessa är oligoribonukleotider substituerade vid 2 "-hydroxylgruppen i ribosresten. Sådan modifiering ökar också resistensen mot nukleaser. Även om RNA är mycket mindre motståndskraftig mot miljöpåverkan jämfört med DNA på grund av närvaron av en 2"-OH-grupp, är det modifieringarna av denna grupp som gör det möjligt att erhålla stabila produkter som uppvisar mindre toxicitet jämfört med fosfonater. Andra generationens modifierade antisensoligonukleotider inkluderar också ofta oligonukleotider med en modifierad ryggrad av icke-sockerfosfatnatur, till exempel peptidnukleinsyror som också uppvisar nukleasresistens och bildandet av termodynamiskt stabila hybrider med mål-mRNA-molekyler.
Fig.4. Andra generationens modifikationer: V - 2 "-O-alkyl-RNA, VI - LNA, VII - Morpholino, VIII - PNA.
En analys av data om användningen av ett antal 2'-O-alkyl-RNA-derivat innehållande från en till fem metylenenheter i alkylradikalen visade att med en ökning av antalet metylenenheter, resistensen hos den modifierade oligonukleotiden mot verkan av nukleaser (pentoxi > propoxi > metoxi > deoxi) ökar. Detta beroende kan förklaras av nukleotidens steriska otillgänglighet när en större substituent är fäst. Steriskt hinder orsakat av förekomsten av skrymmande substituenter minskar dock effektiviteten av bildningen av komplementära komplex med mål-mRNA, därför uppnåddes den högsta affiniteten för målet vid användning av små substituenter. 2 "-O-metylerade fosforotioater (Me-S-ODN), S-DNA och omodifierat DNA, visade det sig att smälttemperaturen (Tm) för DNA-RNA-heteroduplexer ökar i följande ordning: Me-S-ODN - RNA > normalt DNA - RNA > S-ODN - RNA . Nackdelen med denna modifiering är att RNas H inte kan klyva mål-mRNA:t i RNA-RNA-komplexet. Som en konsekvens av denna nackdel är sådana oligonukleotider mindre potenta hämmare av genuttryck jämfört med omodifierade.
2"-katjoniska modifieringar leder till bildandet av zwitterjoniska oligonukleotider. Sådana oligonukleotider, förutom bildningen av mer stabila heteroduplexer, jämfört med omodifierade, har en större förmåga att penetrera biologiska membran och hög stabilitet mot nukleaser på grund av sin laddning. 2 '-O-etyl]-oligonukleotider (2"-O-DMAEOE, se fig. 5), på grund av laddningseffekten, bildar heteroduplex med mål-RNA:t med en smältpunkt som är 2 °C högre jämfört med omodifierade oligonukleotider. Zwitterjoniska oligonukleotider bibehåller RNas H-kompetens om modifieringarna är utspridda över oligonukleotidens längd.
Ris. 5.2 "-O-DMAEOE
Konformationsmässigt begränsade "låsta" nukleinsyror (låsta nukleinsyror, LNA) är modifierade nukleinsyror som har minst en monomer med bicyklisk furanos som en sockerrest (se fig. 4, VI). De har en hög affinitet för den komplementära sekvensen (duplexets smältpunkt ökar med 6 °C när en nukleotid modifieras), vilket är både en fördel (effektiv målbindning) och en nackdel (hårnålsbildning). Sådan affinitet måste beaktas vid utformningen av LNA. Studier på möss har visat att LNA har låg toxicitet.
Peptidnukleinsyror (PNA) är analoger till nukleinsyror där sockerfosfatryggraden är ersatt av en pseudopeptid N-(2-aminoetyl)-glycinpolymer. N-terminalen härmar 3'-änden av oligonukleotiden, medan C-terminalen härmar dess 5'-ände (se Fig. 3, VII). PNA-RNA-komplex är mer stabila än DNA-DNA- och RNA-RNA-komplex. Trots att PNA kan binda målet i både antiparallell (enligt Watson-Crick) och parallell (enligt Hoogsteen) orientering, bildas mer stabila komplex med antiparallell orientering av PNA. Studier har visat liten toxicitet av PNA.
Morfoliner (se fig. 3, VIII) är reagens som kombinerar stabilitet, resistens mot nukleaser, effektivitet, långtidsaktivitet, vattenlöslighet, hög specificitet och låg toxicitet. Molekyler har en neutral laddning. Morfoliner produceras av Gene Tools, LLC ( http://www.gene-tools.com).
För att upprätthålla RNase H-kompetens är det nödvändigt att det i mitten av oligonukleotiden finns en region med minst 7 deoxinukleotider; därför används "blandade" antisensoligonukleotider, dvs. har olika modifieringar i olika länkar (LNA/DNA, LNA/RNA, etc.). Dessutom tillsätts föreningar som innehåller grupper som orsakar klyvning av mål-mRNA på grund av sin likhet med det aktiva centret av RNas H till reaktionsblandningen, eller så är inte alla nukleotidenheter modifierade (till exempel endast 3'- och 5'-ändar ). .
Således kan huvudegenskaperna hos sockerfosfatmodifierade antisensoligonukleotider sammanfattas i följande tabell:
Tabell 1. Jämförelse av modifieringar av sockerfosfatryggraden.
|
Modifiering |
Nukleas stabilitet |
Målaffinitet |
RNase H-aktivering |
Icke-toxicitet |
1.2.4 Modifieringar av kvävehaltiga baser
Effektiv antisensaktivitet kan vara svår att uppnå med enbart modifieringar av sockerfosfatryggraden. Modifierade kvävehaltiga baser ökar effektiviteten av antisens ODN genom att öka affiniteten för mål-RNA (aminoadenosin, G-klämma) och penetrationshastigheten genom plasmamembranet (katjoniska och zwitterjoniska grupper).
När fenoxazin tillsätts till cytosinresten erhålls den så kallade G-klämman (se fig. 6, X), som bildar en ytterligare vätebindning med guaninresten, på grund av vilken smältpunkten för ODN-RNA-hybriden ökar med 6–18 °C. En sådan modifiering utförs vanligtvis i 3'-änden, vilket inte försämrar RNas H-kompetens.
När en aminogrupp införs i en adeninrest (se fig. 6, XI), ökar affiniteten för målet också på grund av bildandet av en ytterligare vätebindning med tyminresten.
Ris. 6. Ytterligare vätebindningar mellan C- och G-klämma (X), mellan T och A NH2 (XI)
ODN:er med katjoniska och zwitterjoniska grupper bundna till rester av kvävehaltiga baser (till exempel spermidin, fig. 7) har på grund av sin positiva laddning inte bara en större affinitet för målet, utan också en förbättrad förmåga att penetrera in i cellen och stabilitet för att verkan av nukleaser.
Ris. 7.
Terminala kvävebaser är konjugerade med stora fluorescerande ligander såsom fluorescein för att visualisera platsen för ODN i cellen.
Fig. 8.
1.2.5 Fastsättning av skrymmande substituenter
Förmågan att penetrera cellen utan att passera genom cellmembranet är en av de egenskaper som måste finnas i en effektiv antisensoligonukleotid. De flesta av de ovan beskrivna modifieringarna av nukleotider i ODN:er påverkar inte signifikant ODN-transport över cellmembranet. Det finns flera vägar för molekyler att passera plasmalemma, men två är viktiga för ODN: diffus eller icke-receptormedierad och receptormedierad. Transport enligt den första varianten hämmas av den totala negativa laddningen av ODN och deras hydrofilicitet. Användningen av den andra vägen begränsas av otillräckliga data om ytproteinerna i cellmembranet som ansvarar för transporten av nukleinsyror in i cellen. Skapandet av ODN-konjugat med olika kemiska grupper förbättrar effektiviteten för transport längs en eller annan väg, beroende på typen av kemisk grupp och platsen för dess anslutning till ODN. Figur 9 visar länkvarianterna som används vid framställningen av konjugat. Ligander kan bindas till kvävehaltiga baser, terminala fosfater, fosfodiester (eller liknande) bindningar och sockerrester. Vissa typer av kemiska grupper tillåter också visualisering av kompartmentalisering genom fluorescensdetektion. oligonukleotidmodifierings-antisensreaktion
Fig. 9.
Partiell och till och med fullständig neutralisering av den negativa laddningen av ODN har ingen signifikant effekt på förmågan hos ODN att spontant transportera in i cellen. Vidfästning av olika skrymmande hydrofoba ligander, såsom de som visas i figur 9, underlättar ODN-transport över membranet.
Fig. 10.
Kolesterolkonjugat har studerats väl. Mekanismen som förbättrar cellinträde genom kolesteroltillsats är ännu inte helt klarlagd, även om receptormedierad lipoproteininkorporering har föreslagits. Kolesterolkonjugat bildar miceller, vilket underlättar deras transport in i cellen. Kolesterolresten är vanligtvis fäst vid de terminala 5 "- och 3"-fosfaterna, och 3 "-monokolesteryloligonukleotider är mer effektiva än 5"-monokolesteryloligonukleotider, och 5", 3"-biskolesteryloligonukleotider är de mest effektiva. Till exempel, 6 minuter efter injektion i blodet hos möss, var nivån i vävnaderna av 3'-mono-modifierade fosforotioater 4 gånger och 5'-mono- och 3,5'-bis-modifierade - 7 gånger högre jämfört med till omodifierade fosfortioater.
Monomerer med 5 "- eller / och 3"-kolesteryl-substituerat fosfat används, oligonukleotider med en ligand konjugerad med en fosfodiesterbindning före den 3"-terminala nukleosiden, såväl som kolesteryldendrimerer med en lysinrest som en länk (se fig. 11).
Fig. 11.
Oligonukleotider konjugerade med andra hydrofoba molekyler (adamantan, pyren, eikosansyra, etc.) syntetiserades och jämfördes med kolesterol. Kolesterolkonjugat visade optimal lipofilicitet, samt en god förmåga att ackumuleras i levern.
Konjugering med pyrenderivat, förutom att förbättra förmågan att transportera, är av intresse på grund av deras förmåga att fluorescera. Bis-pyrenylderivat kan bilda excimerer - bimolekylära komplex där en molekyl är i grundtillståndet, den andra är i ett exciterat tillstånd. Sådana komplex är mycket känsliga för den rumsliga miljön; nivån av fluorescens kan användas för att bedöma om ODN är i det tillstånd som är associerat med mål-RNA:t eller inte:
Fig. 12.
Peptidkonjuganter används också för att förbättra effektiviteten av transporten in i cellen. Till oligonukleotider, inkl. PNA, fäst en peptid som kan transportera stora polärt laddade molekyler över membranet. Således har Antennapedia-peptiden DNA-bindningsställen. PNA med den bifogade Antennapedia-peptiden kommer inte bara effektivt in i cellen utan migrerar också till kärnan.
Fig. 13.
Fastsättning till ändarna av antisens ODN-molekyler med stora plana interkalerande molekyler, såsom akridin (se fig. 14), är av intresse som en ökning av effektiviteten av mål-RNA-klyvning. På grund av interkalering lossas interaktionen mellan ODN och RNA lokalt. På grund av ökningen av avståndet mellan DNA och RNA på grund av storleken på interkalatormolekylen, "loopar RNA-molekylen ut" från dubbelhelixen i heteroduplexet. Tungmetallkatjoner, till exempel Lu 3+ , koordinerade till kväveatomerna i akridinresten, katalyserar RNA-hydrolys utan deltagande av RNase H, och "looping" som en destabiliserande struktur påskyndar denna process.
Ris. 14.
1.3 Fysikalisk-kemiska aspekter av interaktion mellan oligonukleotid och mål-RNA
Effektiviteten hos antisens-oligonukleotider kvantifieras genom affiniteten hos ODN för mål-mRNA:t och den effektiva klyvningskonstanten för det senare.
ODN:s affinitet för det RNA som är adresserat till det (eller den fria energin för heteroduplexbildning) beskriver stabiliteten hos DNA-RNA-hybriden. r G kan mätas kalorimetriskt eller beräknas teoretiskt. Vid beräkning av Gibbs fria energi för heteroduplexbildning används Hess-lagen (Gibbs fria energi för en komplex reaktion beror inte på dess väg) och beräkningarna av bildningsenergierna för sekundära och tertiära strukturer enligt "närmaste granne-regeln" ” med hjälp av mfold-programmet utvecklat av Zucker et al. Reaktionen kan representeras enligt följande:
I detta schema är M, O, H mål-mRNA, respektive antisens-ODN och ODN-heteroduplex-RNA, med hänsyn till deras sekundära och tertiära strukturer, Mu, O u, Hu-mål-mRNA respektive antisens-ODN och ODN heteroduplex - RNA utan att ta hänsyn till deras sekundära och tertiära struktur, fn G (M) , fn G (o) , fn G (H)- Gibbs fria energier för att lägga dem i en sekundär och tertiär struktur, r g, r G (uppfälld)är de fria energierna för ODN- och mRNA-hybridisering i de vikta respektive helt denaturerade tillstånden.
fn G (M) , fn G (o) , fn G (H) Och r G (uppfälld) kan teoretiskt beräknas. Sedan hittas hybridiseringens fria energi enligt Hess-lagen:
Jämviktskonstanten för hK 1 kan hittas från den beräknade Gibbs fria energin från hybridiseringsprocessen:
För att uppskatta smälttemperaturen för en heteroduplex används också regeln "närmaste granne" och den beräknas med hjälp av lämpliga program.
Experimentellt kan man hitta den effektiva hastighetskonstanten k eff grova reaktioner av omvandlingen av mRNA M till en villkorad produkt X (detta villkor påverkar inte resultatet av kinetiska beräkningar, men förenklar dem avsevärt):
Den effektiva totala reaktionshastighetskonstanten indikerar den observerade hastigheten för mål-mRNA-klyvning.
Reaktionsmekanismen kan representeras av följande schema:
I detta schema är E enzymet RNase H, HE är dess intermediära komplex med substratet H, K 1 - heteroduplex associationskonstant, beräknad med formel (3).
För detta kinetiska schema kan vi komponera ett system av kinetiska ekvationer:
Var MED A- koncentration av ämne A, k i - hastighetskonstant för den i:te elementära reaktionen.
En vanligen mätt parameter är koncentrationen av mRNA i lösning (initial C M0 och nuvarande C M), Det är därför k eff räkna i förhållande till matrisen:
Använda den kvasistationära approximationen för mellanprodukten HE och förenkla uttrycket för reaktionshastigheten w med Michaelis-Mentens ekvation:
där är Michaelis-konstanten, är det möjligt att transformera uttrycket för förändringshastigheten i koncentrationen av heteroduplex H:
Låt oss hitta ett uttryck för den effektiva hastighetskonstanten för mål-mRNA-klyvning i två fall: när processen begränsas av bindningen av mRNA av antisens-ODN och begränsas av katalytisk klyvning av mål-mRNA:t i heteroduplexet.
Fall 1. Begränsning genom hybridisering.
I detta fall är delningsprocessen mycket snabbare än hybridisering. Därför kan vi anta upprättandet av en stationär koncentration av heteroduplex H, dvs:
Å andra sidan är det lätt att se (6) att:
Det vill säga, i detta fall sammanfaller uttrycket för hastigheten för mRNA-klyvning i absolut värde med uttrycket för reaktionshastigheten (hastigheten för bildning av den villkorliga produkten X). Med hjälp av detta kommer vi att transformera uttrycket för förändringshastigheten i koncentrationen av oligonukleotiden, vi kommer att se att dess koncentration kan anses nästan oförändrad:
Att använda uttryck (14) och, som en konsekvens, försumma termens bidrag k -1 MED H c hitta hastigheten för mRNA-klyvning i en ny form och uttrycka k eff .
Fall 2. Begränsning genom katalytisk klyvning av substratet.
I det fall då splittringen går mycket långsammare än bildandet av en heteroduplex, kan vi anta att jämvikt har tid att etableras.
Jämviktskoncentrationen av heteroduplexet kan försummas jämfört med Michaelis-konstanten i hastighetsuttrycket:
Att skriva ner uttrycket för jämviktskonstanten K 1 och materialbalansekvationen för M och O, får vi tillräckligt med villkor för att lösa ekvationen:
Var [ A] - jämviktskoncentration, MED A 0 - den initiala koncentrationen av ämnet.
Med hänsyn till (17) och (18) får vi uttrycken för jämviktskoncentrationerna av H och O:
Genom att ersätta (21) i Michaelis-Mentens ekvation (16), får vi en modifierad reaktionshastighetsekvation:
Genom att ersätta uttryck (20), (21) och (22) i (12) och utelämna besvärliga mellanliggande beräkningar, får vi ett uttryck för hastigheten för mRNA-katalytisk klyvning:
varifrån det är lätt att hitta formeln för den effektiva hastighetskonstanten för bruttoprocessen:
Det finns många hinder i vägen för att skapa läkemedel baserade på antisens ODN: dålig internaliseringsförmåga, nukleasinstabilitet, toxicitet och andra. Kemiska modifieringar kan eliminera många av dessa problem, men bara delvis, och det är svårt att hitta en kompromiss mellan fördelarna och nackdelarna med någon modifiering. Trots detta har många ODN-baserade läkemedel testats. Det första ODN-baserade läkemedlet, Vitravene, syftade till att bekämpa cytomegalovirusinfektion hos AIDS-patienter.
INTRODUKTION
KAPITEL 1. LITTERATURGRANSKNING.
1.1. Huvudidéer och sätt att skapa riktade läkemedel mot cancer 15 1.1.1. Riktade läkemedel inom onkologi: läkemedel baserade på monoklonala antikroppar och antisensoligonukleotider.
1.2. Receptormedierad endocytos och dess roll i leveransen av biologiskt aktiva föreningar till målceller
1.3. Alternativa system för riktad leverans av läkemedel mot cancer för att förbättra effektiviteten av cancerterapi.
1.4. Tumörspecifika antigener som mål för riktad leverans av läkemedel mot cancer
1.5. Riktad leverans av läkemedel som en del av konjugat med protein- och peptidvektormolekyler.
1.6. Chimära proteiner
1.7. Alfa-fetoprotein och dess receptorer som mål för selektiv leverans av biologiskt aktiva substanser till tumörceller.
1.7.1. Struktur och funktioner av alfa-fetoprotein
1.7.2. Receptorer för alfa-fetoprotein.
1.7.3. Biologiskt aktiva fragment av alfa-fetoprotein
1.8. Riktad leverans av anticancerläkemedel som huvudmetod för att övervinna multidrogresistens (MDR)
1.8.1. Fenomenet multidrogresistens hos tumörceller.
1.8.2. Moderna metoder för att övervinna multidrogresistens.
KAPITEL 2. MATERIAL OCH METODER.
2.1. Isolering av naturligt humant alfa-fetoprotein och produktion av rekombinanta AFP-fragmentproteiner.
2.1.1. Isolering av mänsklig AFP
2.1.2. Erhålla ett rekombinant C-terminalt fragment av AFP (gAFP27)
2.1.3. Framställning av rekombinant PGA-protein
2.1.4. Erhållande av ett rekombinant fragment av AFP AFP-3BC
2.2. Syntes av protein- och peptidkonjugat med FITC, cytostatika och oligonukleotider.
2.2.1. Syntes av FITC-märkt AFP, mAb och C-terminala fragment av AFP hAFP27 och AFP-3BC.
2.2.2. Syntes av FITC-märkt AFP-oktapeptid GIP8.
EMTPVNPG (GIP8) med doxorubicin.
2.2.4. Syntes av AFP-konjugat med vinblastin.
2.2.5. Syntes av AFP-konjugat med ftalocyaniner
2.2.6. Syntes av AFP och GIP8 konjugat med esperamycin Aib (EsA).
2.2.9. Syntes av AFP-konjugat med oligonukleotider.
2.2.10. Framställning av ON-komplex med proteiner.
2.3. Cellkulturer och odlingsförhållanden.
2.4. Utvärdering av receptorbindning och endocytos av fluorescensmärkta proteiner, peptider och konjugat med hjälp av flödescytometri.
2.4.1. Bedömning av bindningen av AFP och Mab till AFP-receptorn.
2.4.2. Utvärdering av endocytos av fluorescensmärkt AFP, C-terminalt fragment av AFP, AFP-oktapeptid GIP8.
2.5. Utvärdering av endocytos av protein- och peptidkonjugat med DOX med hjälp av flödescytometri.
2.6. Immunocytokemiska och immunhistokemiska studier.
2.6.1. Studie av uttrycket av AFP-receptorer på cellytan.
2.6.2. Studie av uttrycket av c-Myc, Bc1-2 och Pgpl70 proteiner.
2.6.3. Immunokemisk färgning av histologiska snitt.
2.7. Studie av uttryck av c-Myc, Bcl-2 och Pgpl70 i tumörceller.
2.7.1. Studie av uttrycket av c-Myc, Bcl-2 och Pgpl70 med hjälp av Western blot.
2.7.2. Undersökning av uttrycket av c-Myc, Bcl-2 och Pgpl70 i tumörceller med hjälp av flödescytometri.
2.8. Fluorescensmikroskopi.
2.9. Bestämning av den cytostatiska aktiviteten av läkemedel in vitro.
2.9.1. Bestämning av cellviabilitet.
2.9.2. Bestämning av hämning av proliferativ aktivitet hos celler.
2.9.3. Analys av nivån av apoptos med hjälp av fluorescensmikroskopi.
2.8.4. Bestämning av fotocytostatisk och kemiocytostatisk aktivitet av AFP-konjugat med aluminium (A1Pc) och kobolt (CoPc) ftalocyaniner.
2.9. Studie av proliferativ aktivitet hos celler.
2.10. Cellcykelanalys med flödescytometri.
2.11. Studie av antitumöraktiviteten av läkemedel in vivo.
2.12. Statistisk bearbetning av resultat.
KAPITEL 3. RESULTAT OCH DESSA DISKUSSION.
3.1. Studie av uttrycket av alfa-fetoproteinreceptorn på humana tumörcellinjer.
3.1.1. Studie av specificiteten av mAb-kloner till AFPR
3.1.2. Utvärdering av mängden AFPR på in vitro-odlade humana tumörceller.
3.2. Immunokemisk detektion av AFPR på celler och vävnadssnitt
3.2.1. Studie av uttrycket av AFP-receptorer på ytan av tumörceller med hjälp av immuncytokemi.
3.2.2. Immunhistokemisk färgning av tumörvävnadssnitt
3.3. Studie av bindning och endocytos av fluorescensmärkt AFP av tumörceller in vitro.
3.3.1. Studie av AFP-bindning till receptorn på ytan av tumörceller och normala humana perifera blodlymfocyter med hjälp av flödescytometri.
3.3.2. Studie av AFP-endocytos in vitro med flödescytometri och fluorescensmikroskopi.
3.4. Användningen av receptormedierad endocytos för riktad leverans av läkemedel mot cancer - doxorubicin, vinblastin, esperamycin, ftalocyaniner.
3.4.1. Analys av internalisering av konjugat av tumörceller in vitro
AFP med antibiotika/cytostatika på exemplet doxorubicin.
3.4.2. Studie av den cytostatiska aktiviteten av proteinkonjugat med doxorubicin in vitro.
3.4.3. Studie av antitumöraktiviteten av AFP-konjugat med DOX in vivo.
3.4.4. Studie av fotocytostatisk och kemiocytostatisk aktivitet av AFP-konjugat med aluminiumftalocyaniner (A1Pc) och kobolt
3.4.5. Studie av den cytostatiska aktiviteten hos AFP-konjugat med vissa andra antitumörantibiotika (cytostatika).
3.4.6. Studie av den cytostatiska aktiviteten av AFP-konjugat med esperamycin Ajb (EsA) in vitro.
3.4.7. Studie av antitumöraktiviteten hos AFP-konjugat med esperamycin Aib (EsA) in vivo.
3.5. Att övervinna multiläkemedelsresistens orsakad av MDR 1-genuttryck med hjälp av AFP-konjugat med anticancerläkemedel in vitro.
3.5.1. Karakterisering av resistenta cellinjer.
3.5.2. Analys av internaliseringen av DOX och dess proteinkonjugat i resistenta cellinjer.
3.5.3. Studie av den cytostatiska aktiviteten av DOX-AFP-konjugat mot resistenta cellinjer.
3.6. Biologiskt aktiva fragment av AFP.
3.6.1. Rekombinant C-terminalt fragment av AFP (gAFP27).
3.6.2. Rekombinant C-terminalt fragment av AFP AFP-ZVS.
3.6.3. Biologiskt aktiv oktapeptid - AFP-fragment
3.7. Riktad leverans av antisens-oligonukleotider till tumörceller.
3.7.1. Riktad leverans av antisens-oligonukleotider till tumörceller i form av deras konjugat med AFP.
3.7.2. Studie av effektiviteten av ASON-leverans med användning av icke-kovalenta komplex med AFP.
Rekommenderad lista över avhandlingar
Skapande och studie av egenskaperna hos rekombinanta humana proteiner med en potentiell antitumöreffekt 2007, kandidat för kemiska vetenskaper Savvateeva, Lyudmila Vladimirovna
Utveckling av riktade anticancerläkemedel baserade på peptidvektorer och antiangiogena medel 2007, doktor i biologiska vetenskaper Feldman, Natalia Borisovna
Användning av den C-terminala domänen av alfa-fetoprotein för riktad leverans av läkemedel mot cancer 2012, kandidat för biologiska vetenskaper Godovanny, Artem Vitalievich
Erhålla och studera den biologiska aktiviteten av epidermal tillväxtfaktorkonjugat med kemoterapeutiska läkemedel mot tumörer 2000, kandidat för biologiska vetenskaper Gumanov, Sergey Georgievich
Syntes av konjugat av humant α-fetoprotein med anticancerläkemedel för riktad leverans till tumörceller 2001, kandidat för kemivetenskap Zabolotnev, Dmitry Viktorovich
Introduktion till avhandlingen (del av abstraktet) om ämnet "Användningen av protein- och peptidvektorer för selektiv leverans av läkemedel mot cancer och terapeutiska oligonukleotider till tumörceller"
Problemets brådska. De främsta orsakerna till den otillräckliga effektiviteten av kemoterapeutisk behandling av onkologiska sjukdomar är den låga biotillgängligheten av antitumörmedel för tumören, behovet av att använda höga doser av läkemedel och den icke-selektiva naturen hos dessa läkemedel. Den begränsade penetrationen av läkemedel i biologiskt heterogena tumörer leder till att en del av tumörcellerna överlever, även efter långtidsbehandling med cellgifter. Behandling med höga doser, nödvändig för fullständig remission, orsakar allvarliga systemiska biverkningar, som ofta tvingar patienter att avbryta behandlingen. Dessutom är långvarig användning av kemoterapeutiska medel fylld av utvecklingen av multidrogresistens, vilket gör de använda läkemedlen ineffektiva. Fenomenet läkemedelsresistens är baserat på intracellulära mekanismer av olika karaktär, såsom en minskning av transporten av läkemedel över plasmamembranet, en kränkning av nivån av onkogenuttryck, skador på signaltransduktionssystem etc. För att öka effektiviteten av tumörterapi, är det nödvändigt att öka selektiviteten för verkan av läkemedel. Två riktningar kan urskiljas här: utvecklingen av nya mycket selektiva läkemedel och skapandet av nya system för reglerad transport av välkända antitumörföreningar in i målceller.
Selektiviteten för verkan av ett läkemedel kan ökas genom att använda målinriktade medel i leveranssystem - molekyler som kan binda till specifika determinanter på cellytan. Sålunda bestämmer användningen av den riktade komponenten interaktionen mellan det selektiva tillförselsystemet med strikt definierade celler och vävnader, i synnerhet tumörceller. Fysiologiska ligander av tillväxtfaktorreceptorer eller onkofetalproteiner kan fungera som målinriktade medel eller vektorer; tillväxtfaktorer själva och oncofetala proteiner. Anticancerläkemedlet kan kopplas till vektorn kovalent för att bilda ett konjugat, eller icke-kovalent för att bilda ett starkt komplex. Bindning av en målmolekyl till en specifik receptor på cellytan inducerar processen med receptormedierad endocytos, vilket säkerställer ackumulering av ett läkemedel av tumörceller, vars molekylära mål är beläget inuti cellen.
Det bör noteras att i vissa fall är användningen av selektiva leveranssystem det enda sättet att använda den terapeutiska potentialen hos vissa mycket toxiska antitumörantibiotika, till exempel antibiotika av enediyne-serien. Ett exempel är läkemedlet Mylotarg, som är ett konjugat av kalichemiacin Xi med humaniserade antikroppar mot CD33. Dessutom kan användningen av högeffektiva tillförselsystem avsevärt öka den terapeutiska effekten av antisensoligonukleotider, som tyvärr ännu inte har funnit tillämpning i klinisk praxis.
Framgångsrik lösning av problemet med riktad transport av läkemedel baserade på receptormedierad endocytos bestäms först av allt av valet av en vektormolekyl. Proteinvektorer måste uppfylla ett antal grundläggande krav, inklusive hög affinitet hos vektorerna för motsvarande receptorer på ytan av tumörmålceller, hög stabilitet, möjligheten till deras kemiska modifiering genom konjugering med kemoterapiläkemedel utan förlust av biologiska egenskaper, och tillgång på proteiner i preparativa mängder. Det onkofetala proteinet alfa-fetoprotein motsvarar närmast dessa krav. Viktiga faktorer vid utformningen av selektiva tillförselsystem är också valet av ett läkemedel (cytostatiskt medel, fotosensibilisator, antisensoligonukleotid) och en länk som förbinder de målinriktade och cytostatiska komponenterna. Screening av de skapade konstruktionerna i in vitro-systemet och studier av deras intracellulära beteende gör det möjligt att identifiera de mest optimala varianterna av leveranssystem.
Syftet med detta arbete var att utveckla principer för att skapa system för selektiv leverans av anticancerläkemedel och terapeutiska oligonukleotider till tumörceller baserat på naturliga och rekombinanta proteiner och peptider och att identifiera mönster som bestämmer deras effektivitet. Forskningsmål:
Val av protein- och peptidvektormolekyler för selektiv leverans av anticancerläkemedel och antisensoligonukleotider;
Skapande av konstruktioner för selektiv leverans av anticancerläkemedel till målceller baserat på alfa-fetoprotein och dess peptidfragment,
Studie av internalisering och intracellulär distribution av läkemedel beroende på typ av konstruktion för att optimera leveranssystem;
Utveckling av tillvägagångssätt för att övervinna multidrogresistens med hjälp av riktade leveranssystem; Utveckling av konstruktioner baserade på alfa-fetoprotein och epidermal tillväxtfaktor för selektiv leverans av antisensoligonukleotider och utvärdering av deras effektivitet.
Vetenskaplig nyhet och praktisk betydelse.
Närvaron av AFP-receptorer har bevisats både på ytan av celler av humana tumörlinjer och på histologiska sektioner av mänskliga maligna tumörer (äggstockar, bröst, lever, mage, tarmar). På sektioner av godartade tumörer och normala vävnader, såväl som på ytan av vilande lymfocyter isolerade från blodet från friska frivilliga, hittades inte AFP-receptorn. Sålunda kan AFP-receptorn användas som en tumörmarkör för ett brett spektrum av maligna tumörer, och antikroppar mot receptorn kan användas för att diagnostisera tumörer.
Konceptet med ett system för riktad leverans av biologiskt aktiva föreningar till målceller med användning av AFP och dess peptidfragment som målmotiv har formulerats och utvecklats.
Metoder har utvecklats som tillåter in vitro-experiment i cellkulturer för att förutsäga effektiviteten av läkemedel med selektiv verkan.
Det visade sig för första gången att det rekombinanta C-terminala fragmentet av AFP (från 357 till 590 a.a.) specifikt binder till AFP-receptorn, endocyteras av tumörceller som AFP och på samma sätt som AFP hämmar den östradiol-inducerade tillväxten av hormon -beroende tumörceller. Således kan detta rekombinanta protein användas som en vektormolekyl i målinriktade leveranssystem.
Skapade genkonstruktioner för inducerad biosyntes av C-terminala fragment av AFP i E. coli. Mycket effektiva metoder för att isolera rekombinanta AFP-fragment har utvecklats.
Förmågan hos det biologiskt aktiva fragmentet av AFP-oktapeptiden GIP8 (472-479 a.a.) att selektivt binda till ytan av tumörceller och internaliseras av dem med hög effektivitet har visats för första gången, vilket öppnar för möjligheten att använda GIP8 som en vektor i målinriktade leveranssystem.
Effektiviteten och selektiviteten av antitumöraktiviteten av AFP-, AFP-ZVS- och GIP8-konjugat in vitro mot ett brett spektrum av humana tumörcellinjer har bevisats. Regelbundenheterna för deras intracellulära translokation har studerats, beroendet av effektiviteten av konjugatverkan på labiliteten av den kemiska bindningen mellan proteinet och det cytostatiska medlet har visats.
Vid användning av riktade tillförselsystem baserade på AFP fann man möjligheten att övervinna multiläkemedelsresistensen hos tumörceller på grund av aktiviteten av Pgpl70.
Den höga antitumöreffektiviteten av AFP-konjugat med esperamycin Aib visades för första gången in vivo.
System för selektiv leverans av terapeutiska oligonukleotider har utvecklats och den grundläggande möjligheten och löftet att använda proteinvektorer (AFP och epidermal tillväxtfaktor) för deras riktade leverans till tumörceller har visats.
De viktigaste bestämmelserna för försvar:
1. AFP-receptorn är ett unikt tumörspecifikt antigen som finns på ytan av tumörceller och frånvarande från de flesta normala celler.
2. Alfa-fetoproteinreceptorn kan tjäna som mål för selektiv antitumörterapi. Genom att binda specifikt till dess receptor internaliseras alfa-fetoprotein av tumörceller tillsammans med molekyler av läkemedelsföreningar som är kovalent bundna till det, vilket säkerställer selektiv leverans av läkemedel till tumörceller.
3. Användningen av riktade tillförselsystem baserade på alfa-fetoprotein gör det möjligt att övervinna multiläkemedelsresistensen hos tumörceller orsakad av plasmamembranets ABC-transportörer.
4. Rekombinanta alfa-fetoproteinfragment som innehåller ett receptorbindande motiv kan användas i selektiva tillförselsystem istället för det naturliga fullängdsproteinet.
5. Användningen av proteinvektorer (AFP och epidermal tillväxtfaktor) kan signifikant öka effektiviteten av intracellulär leverans av antisensoligonukleotider.
Författarens personliga bidrag består i utvecklingen av idén, organisationen och genomförandet av experimentella studier, analys, generalisering och tolkning av de erhållna resultaten. Alla experiment med cellkulturer utfördes direkt av författaren. Godkännande av arbete.
Huvudresultaten av arbetet rapporterades vid V International Symposium on Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers (1995, Barcelona, Spanien), XVI Intern.
Congress of Clinical Chemistry, (1996, London), The interdependence of Tumor Biology and Clinical Oncology (1996, Coronado, USA), sid. 121. Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), Den europeiska cancerkonferensen ECCO (1997, Frankrike), Rysslands nationella kongress "Man and medicine" (2000, 2005, Moskva), 37:e årliga vetenskapliga mötet för European Society for Clinical Investigation (2003, Verona, Italien), 1:a EUFEPS-konferensen om optimering av läkemedelsleverans och -formulering: Nya utmaningar vid läkemedelsleverans (2003, Versailles, Frankrike), Den 5:e ISTC/Korea workshop om bioteknik (2004, Chungbuk, Korea), World Conference on Magic Bullets (2004, Nürnberg, Tyskland), International Conference on Molecular Medicine and Biosafety (2005, Moskva), III Moscow International Congress "Biotechnology: Status och utvecklingsmöjligheter" (2005, Moskva), Moskvas internationella konferens "Biotechnology and Medicine" (2006, Moskva), 19:e mötet för European Association for Cancer Research (EACR), Budapest, Ungern, 1-4 juli 2006, konferens " Ny teknisk plattform för biomedicinsk forskning (biologi, sjukvård, apotek)" (2006, Rostov-on-Don), I International Scientific and Practical Conference "Post-genomic Methods of Analysis in Biology, Laboratory and Clinical Medicine" (2010, Moskva) .
Avhandlingens struktur och omfattning. Arbetet presenteras på 256 maskinskrivna sidor och består av en introduktion, en litteraturgenomgång, en beskrivning av forskningsmetoder, en presentation och diskussion av resultaten, en slutsats, slutsatser och en referenslista som omfattar 406 källor. Avhandlingen innehåller 94 figurer och 14 tabeller.
Liknande teser i specialiteten "Biokemi", 03.01.04 kod HAC
Utveckling av riktade anticancerläkemedel baserade på peptidvektorer och kemoterapiläkemedel 2004 PhD Al-Nazvani Nasser Salem
Rekombinanta fragment av humant alfa-fetoprotein för framställning av riktade läkemedel 2012, kandidat för biologiska vetenskaper Sharapova, Olga Andreevna
Konstruktion av protein-nukleinsyrakomplex för riktad transport av främmande DNA in i celler 2010, kandidat för biologiska vetenskaper Tatarinova, Olga Nikolaevna
Syntes och studie av transportformer av anticancerläkemedel baserade på alfa-fetoprotein och polymera nanopartiklar 2000, kandidat för biologiska vetenskaper Bobruskin, Alexey Igorevich
Erhålla och studera antitumörpotentialen hos antiangiogena polypeptider och riktade kemoterapiläkemedel 2006, kandidat för biologiska vetenskaper Digtyar, Anton Vasilyevich
Avhandlingens slutsats på ämnet "Biokemi", Posypanova, Galina Aronovna
1. Konceptet med ett system för målinriktad leverans av biologiskt aktiva föreningar till tumörceller har utvecklats, där alfa-fetoprotein (AFP) och dess fragment används som ett målmotiv.
2. Närvaron av AFP-receptorer har fastställts både på ytan av celler av humana tumörlinjer och på celler av humana maligna tumörer (äggstockar, bröst, lever, mage, tarmar). På sektioner av godartade tumörer och normala vävnader, såväl som på ytan av lymfocyter från friska frivilliga, hittades inte AFP-receptorn.
3. Det har visats att inte bara AFP utan även dess rekombinanta C-terminala fragment binder specifikt till AFP-receptorn och endocyteras av tumörceller.
4. Det visade sig att det biologiskt aktiva fragmentet av AFP, GIP8-oktapeptiden, binder selektivt till en okänd receptor på ytan av tumörceller, internaliseras med hög effektivitet och kan användas som en vektor i målinriktade leveranssystem.
5. Det har fastställts att konjugat av antitumörläkemedel med AFP selektivt ackumuleras av målceller, har en uttalad cytostatisk effekt på tumörceller och har låg toxicitet för normala mänskliga celler; effektiviteten av konjugaten bestäms av labiliteten av den kemiska bindningen mellan proteinet och det cytotoxiska medlet.
6. Användningen av AFP-baserade riktade tillförselsystem gör det möjligt att övervinna multiläkemedelsresistensen hos tumörceller på grund av Pgpl70-aktivitet.
7. Effektiviteten av doxorubicintransport in i tumörceller i sammansättningen av konjugat med AFP överstiger signifikant effektiviteten av dess transport i sammansättningen av konjugat med transferrin och serumalbumin.
8. Den höga antitumöraktiviteten hos AFP-konjugatet med esperamycin Aib in vivo visades med användning av en transplanterad mustumörmodell (bot -30 %, ökad förväntad livslängd - 163 %).
9. Konjugatet av GIP8 AFP-fragmentet med doxorubicin ackumuleras selektivt i känsliga och resistenta tumörcellinjer, har en uttalad cytostatisk effekt på tumörceller och är lågtoxisk för humana mononukleära leukocyter.
Användningen av proteinvektorer baserade på AFP och epidermal tillväxtfaktor för målinriktad leverans av antisensoligonukleotider till målceller har visats.
Slutsats.
Detta arbete ägnas åt studiet av regelbundenhet i utformningen av riktade läkemedelstillförselsystem baserade på proteinvektorer. Studiet av funktionerna i intracellulär translokation av de studerade läkemedlen, deras jämförelse med den biologiska aktiviteten mot tumörceller och normala celler in vitro hjälper till att förutsäga framgången för en viss strategi och därmed optimera processen för att skapa effektiva selektiva anticancerläkemedel.
Användningen av den riktade komponenten bestämmer interaktionen av SAD med strikt definierade celler och vävnader, vilket säkerställer selektiviteten hos läkemedelsverkan. Mekanismen för receptormedierad endocytos främjar ackumuleringen av ett läkemedel vars molekylära mål är beläget inuti cellen.
Jämförelse av SAD, som är (vektorprotein)-linker-(läkemedels)konjugat, där serumalbumin, transferrin och alfa-fetoprotein användes som vektorprotein, visade fördelen med det senare både vad gäller förmågan att ackumuleras av tumör celler och i termer av cytotoxisk aktivitet för dessa celler. Dessa konjugat använde 3-maleimidobensoesyrahydrazid som länk och doxorubicin som läkemedel. Nämnda linker är syralabil och kan genomgå hydrolys i cellulära avdelningar såsom endosomer och lysosomer, och därigenom frisätter läkemedlet från SAD. Doxorubicin, ett antibiotikum från antracyklingruppen, är ett effektivt och allmänt använt terapeutiskt medel. Det finns två huvudmekanismer genom vilka läkemedlet orsakar celldöd: interkalering i DNA, som ett resultat av vilket DOX infogas mellan två intilliggande nukleotider, vilket ger en stark interaktion med DNA och stör replikation och transkription; bindning och hämning av topoisomeras II. På grund av närvaron av en kinongrupp i strukturen är DOX involverad i redoxprocesser, vilket leder till bildandet av fria radikaler som inducerar DNA-skada och lipidperoxidation. Effektiviteten av DOX-terapi beror på dess intracellulära ackumulering.
Free DOX, på grund av sin hydrofobicitet, tränger snabbt in i celler och cellkärnor. Upptagningshastigheten av celler av DOX i konjugatets sammansättning bestäms av antalet specifika receptorer på ytan av målceller och intensiteten av receptorförmedlad endocytos.
Som vektorproteiner (målkomponenter) använde vi, förutom AFP, de välkända transportproteinerna HSA och Trf, som aktivt endocyteras av tumörceller och används med varierande framgång för intratumoral läkemedelstillförsel (se Litteraturöversikt, avsnitt 1,5). AFP-konjugatet med DOX var emellertid signifikant överlägset liknande DOX-konjugat med HSA och Trf både vad gäller ackumuleringseffektivitet i tumörceller och cytotoxisk aktivitet mot dessa celler.
Studien av uttrycket av AFP-receptorn på ytan av celler av humana tumörlinjer och normala perifera blodlymfocyter, såväl som på histologiska sektioner av cancerösa, godartade och normala vävnader med användning av monoklonala antikroppar mot AFPR avslöjade den dominerande närvaron av denna receptor i maligna tumörceller. Senare bekräftades våra resultat av forskning av R. Moro. Sålunda kan AFPR tjäna som ett unikt mål på ytan av tumörceller, och leveranssystem baserade på dess naturliga ligand, AFP, kan tillhandahålla selektiv läkemedelsleverans till dessa celler. Analys av bindningen och endocytosen av fluorescensmärkt AFP antyder en hög effektivitet och specificitet av AFP-ackumulering i aktivt prolifererande tumörceller och frånvaron av denna proteinackumulering i icke-prolifererande lymfocyter.
En in vitro-studie av antitumöreffekten av ett antal AFP-baserade konjugat, i vilka olika cytostatika, antitumörantibiotika, antimetaboliter, fotosensibilisatorer (doxorubicin, daunomycin, calicheamicin, bleomycin, esperamycin, cisplatin, karboxifosfamid) användes som cytotoxiska komponenter, visade hög selektiv antitumöraktivitet. AFP-konjugatet med esperamycin Aib visade signifikant effekt i in vivo-modellexperiment vid behandling av möss med experimentella tumörer, vilket förhindrade utvecklingen av tumörer och ökade livslängden för djur flera gånger. Det bör noteras att detta antibiotikum, som tillhör endiinerna, är en extremt giftig förening. Den kemiska strukturen av enediyne-antibiotika delar ett gemensamt element, ofta kallad "stridsspetsen", som är en 10-ledad endiynring som innehåller två acetyleniska bindningar i a-positioner till dubbelbindningen eller oxiranringen. Under fysiologiska förhållanden och under viss aktivering genomgår en sådan "stridsspets" en omarrangemang till en reaktiv diradikal. Den cytotoxiska effekten av esperamycin beror på induktionen av enkel- och dubbelsträngade DNA-avbrott. Kliniska prövningar av detta läkemedel slutade i misslyckande på grund av dess höga systemiska toxicitet. Det kanske enda sättet att använda potentialen hos detta antibiotikum är att öka dess selektivitet genom kemisk bindning till vektormolekyler, vilket ger riktad leverans till tumören, vilket vi gjorde.
Det bör noteras att valet av en linker som binder ett vektorprotein till ett cytotoxiskt medel är av särskild betydelse vid utformningen av CAD. Ett cytostatika kan framgångsrikt levereras till målcellen, men om det inte spjälkas från vektorn i tid, kommer den biologiska effekten antingen inte att realiseras eller kommer att uttryckas svagt. En analys av effektiviteten av AFP-konjugat med DOKS, i vilka länkar som skiljer sig i deras labilitet användes, visade att de mest aktiva var konjugat, i vars syntes glutaraldehyd och 3-maleimidobensoesyrahydrazid användes. Den cytotoxiska aktiviteten hos AFP-konjugat med DOX korrelerade med ackumuleringen av DOX i cellkärnor: ju snabbare detta hände, desto mer aktivt var konjugatet. När N-hydroxisuccinimidester av 3-(2-ditiopyridyl)propionsyra användes som en länk, var lokalisering i DOX-celler övervägande cytoplasmatisk, även en dag efter konjugatappliceringen. Samtidigt uppvisade detta konjugat mycket låg aktivitet (25 gånger lägre än fri DOX). Tydligen förhindrar en stark disulfidbindning den snabba klyvningen av DOX i endosomer. I celler är enzymer som kan återställa disulfidbindningen (tiol-proteindisulfidreduktas, tiol-proteindisulfidreduktas, tioredoxin, glutaredoxin, gamma-interferon-inducerbart lysosomal tiolreduktas - GILT) lokaliserade i mikrosomhålan, i strukturerna i Golgi. komplex; tioredoxin och glutaredoxin katalyserar reduktionen av disulfidbindningar i kärnan och cytoplasman; GILT - i sena endosomer/lysosomer (optimalt pH 4-5). Återställande av disulfidbindningar i proteiner sker i sena endosomer/lysosomer efter begränsad proteolys av katepsiner. Återställande av disulfidbindningen genom verkan av tiol-proteindisulfidreduktas saktar ner avsevärt med sjunkande pH. Frisättningen av DOX från konjugat där antibiotikan är fäst vid proteinet via en disulfidbindning verkar vara ganska långsam, vilket förklarar den låga cytotoxiska aktiviteten hos sådana konjugat. Den andra faktorn som kan påverka effektiviteten av det diskuterade konjugatet är modifieringen av aminogruppen i sockerresten av DOX vid införandet av en tiolgrupp med användning av SPDP. Även om ett antal studier har visat produktionen av aktiva DOX-antikroppskonjugat med denna syntesstrategi, har andra studier visat att aminosockermodifiering av DOX minskar den cytotoxiska aktiviteten hos detta antibiotikum och leder till en förlust av den cytotoxiska aktiviteten av antracyklin i konjugera.
Icke desto mindre visade sig användningen av SPDP vid syntesen av AFP-EsA-konjugat vara mycket effektiv. I själva verket var cytotoxiciteten för konjugatet när det testades in vitro för det mesta lägre än den för fritt EsA. Emellertid, som ett resultat av att öka selektiviteten för verkan av EsA i konjugatets sammansättning, var det möjligt att uppnå betydande framgång vid testning av konjugatet in vivo.
De erhållna resultaten gör det möjligt att förutsäga effektivitetsnivån för riktade läkemedel baserat på proteinvektormolekyler. Effektiviteten av sådana läkemedel beror inte bara på vektorproteinet, utan i stor utsträckning på typen av kemisk bindning mellan proteinet och antitumörantibiotikumet. Detta förhållande bör inte vara för starkt, eftersom detta förlorar fördelarna med riktad tillförsel: trots den höga intracellulära koncentrationen av antibiotikumet kanske det senare inte har en farmakologisk effekt om det inte når sitt mål. Men sambandet bör inte vara för labilt, eftersom läkemedlet måste bibehålla sin integritet innan det interagerar med målceller. Samtidigt, när man skapar en riktad konstruktion, måste man ta hänsyn till att klyvningen av läkemedlet (antibiotikum, cytostatika, etc.) från proteinmolekylen sannolikt kommer att ske i endosomer vid pH-värden på 5,5-6 , det vill säga länken som binder AFP-molekylen till läkemedlet helst måste hydrolyseras vid de angivna pH-värdena eller vara ett substrat för endosomala enzymer.
Den viktigaste egenskapen hos de syntetiserade AFP-baserade konjugaten var deras förmåga att vända multiläkemedelsresistens på grund av aktiviteten hos ABC-transportörer.
De erhållna resultaten tillåter oss att dra slutsatsen att AFP effektivt kan användas som ett målinriktat medel för leverans av antitumörläkemedel till tumörceller av olika ursprung.
Den kanske enda betydande nackdelen med naturlig mänsklig AFP är källan till dess isolering: i preparativa mängder kan AFP endast isoleras från abortmaterial. I navelsträngsblod, det biomaterial vi använde, är innehållet av AFP mycket lägre, och i själva verket är detta inte heller den bästa biologiska källan. Därför satte vi uppgiften att erhålla en rekombinant proteinvektor - ett AFP-fragment som innehåller ett receptorbindningsställe som är identiskt med det i den naturliga molekylen. Det resulterande rekombinanta C-terminala fragmentet av AFP (gAFP27) band specifikt till AFP-receptorn på tumörceller och endocytoserades av dem på samma sätt som fullängds human AFP. hAFP27 bibehöll också några andra biologiska egenskaper hos fullängdsproteinet. Användningen av hAFP27 som en vektor i SAD öppnar möjligheten för praktisk användning av proteinets potential som en ligand för AFPR.
Transformerade celler kännetecknas av genförändringar associerade med regleringen av cellproliferation och apoptos. Bland många studier som ägnas åt utvecklingen av nya selektiva medel för tumörceller hör en speciell plats till antisensoligonukleotider. ASONs är en av en klass av nya medel som kan hämma syntesen av specifika tumörassocierade proteiner genom att binda till det mRNA som kodar för dessa proteiner och därigenom blockera proteinsyntesen. Många modifierade (särskilt tiofosfat) ASONs in vitro visade en övertygande minskning av uttrycket av målgenen och förväntades vara framgångsrika mot ett brett spektrum av tumörer. Ett hinder som minskar selektiviteten för verkan av ASON är den nuvarande bristen på adekvat och effektiv SAD av dessa föreningar i målceller, vilket är nödvändigt för att realisera den terapeutiska potentialen hos ASON.
Transformerade celler kännetecknas av genförändringar associerade med regleringen av cellproliferation och apoptos. Bland många studier som ägnas åt utvecklingen av nya selektiva medel för tumörceller hör en speciell plats till antisensoligonukleotider. Antisensoligonukleotider är en sådan klass av nya medel som kan hämma syntesen av specifika tumörassocierade proteiner genom att binda till det mRNA som kodar för dessa proteiner, och därigenom blockera proteinsyntesen. Under de senaste decennierna har flera antisenses utvecklats och testats i prekliniska och kliniska studier. Många av dem visade en övertygande minskning av uttrycket av målgenen i in vitro-system och förväntades vara framgångsrika i ett brett spektrum av tumörer. På grund av tumörernas genetiska heterogenitet verkar användningen av antisense som enda läkemedel inte vara effektiv vid behandling av sjukdomar. Antisenseterapier som riktar sig mot signalvägar involverade i cellproliferation och apoptos är särskilt lovande när de kombineras med konventionella anticancerbehandlingar.
Tillförsel av tiofosfat A8(G) till tumörceller i form av konjugat med AFP visade sig vara extremt effektiv, eftersom det gjorde det möjligt att övervinna barriären av det cytoplasmatiska membranet, vilket begränsar penetrationen av ABOI in i cellerna. antingen i form av en direkt cytostatisk effekt eller i form av sensibilisering av målceller för verkan av andra anticancerläkemedel. Det visade sig att den ospecifika toxiciteten hos vissa sekvenser (G) inte var ett hinder för användningen av dessa (G) , eftersom användningen av en vektormolekyl i SAD begränsade deras toxicitet till tumörceller. Syntesen av konjugat visade sig dock vara en mycket arbetsintensiv process, åtföljd av samma betydande förlust av protein och ABOB.Alternativa konstruktioner, som är icke-kovalenta komplex av proteiner med ABOM, kan vara mer tekniskt avancerade.OB, särskilt deras tiofosfatanaloger, har en hög negativ laddning och kan bilda starka komplex med polykatjoniska molekyler. För att öka effektiviteten av bildandet av sådana komplex infördes en positivt laddad sekvens i molekylerna av rekombinanta proteiner (hAFP27 och EuR), vilket säkerställer deras starka interaktion med LBM. De resulterande konstruktionerna visade sig vara framgångsrika SBP, som inte bara kraftigt ökar effektiviteten av ABOB-ackumulering i celler som kännetecknas av ett ökat innehåll av receptorer för ovanstående proteiner, utan också skyddar naturliga fosfodiester GO från nedbrytning. Användningen av en mitogen, som är EOP, som en målinriktad komponent i SAD, begränsar dock intervallet av applicerade ABO, vilket i vissa fall förhindrar realiseringen av en biologisk effekt. Det är möjligt att modifiering av den receptorbindande regionen i EuR-molekylen kan bidra till att lösa detta problem, vilket leder till att förmågan hos receptorn att aktiveras (förmågan att autofosforylera) kommer att förloras, men det påverkar inte förmågan hos receptorn att internaliseras efter bindning till dess ligand.
Resultaten av experimentella studier som presenteras i detta dokument indikerar den höga effektiviteten och selektiviteten hos riktade leveranssystem baserade på alfa-fetoprotein, dess fragment och modifierad epidermal tillväxtfaktor.
Framsteg i studiet av de molekylära mekanismerna för sjukdomspatogenes och framväxten av nya metoder inom området molekylärbiologi och bioteknik öppnar möjligheter för utveckling av nya läkemedel som selektivt påverkar olika signalvägar som är karakteristiska för tumörceller och därmed möjligheten. av riktad individuell behandling baserad på ett unikt komplex av molekylära mål som produceras av patientens tumör. Läkemedel kan nå målet på egen hand (t.ex. terapeutiska antikroppar), eller som en del av tillförselsystem riktade mot specifika organ som påverkas av tumören, eller direkt till ytan eller in i cancerceller. Förstå tumörens cellbiologi, studier av tumörcellers mikromiljö kommer att möjliggöra utvecklingen av effektiva alternativ för riktade läkemedel.
Lista över referenser för avhandlingsforskning Doktor i biologiska vetenskaper Posypanova, Galina Aronovna, 2013
1 Jain R.K. Leverans av molekylär och cellulär medicin till solida tumörer. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. Nr 1-3. S. 149-168.
2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Läkemedelstillförsel och transport till solida tumörer. // Pharm Res. 2003. V. 20. Nr 9. P. 1337-1350.
3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. Översikt över den kliniska utvecklingen av rituximab: första monoklonala antikroppen godkänd för behandling av lymfom. // Semin Oncol. 1999. V. 26. Nr 5 Suppl 14. S. 66-73.
4. Huhn D., von Schilling C „ Wilhelm M „ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W „ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab behandling av patienter med B-cells kronisk lymfatisk leukemi. // Blod. 2001. V. 98. Nr 5. s. 1326-1331.
5. Gribben J.G., Hallek M. Återupptäcka alemtuzumab: nuvarande och framväxande terapeutiska roller. //Br J Haematol. 2009. V. 144. Nr 6. s. 818-831.
6. Ravandi F., O "Brien S. Alemtuzumab i KLL och andra lymfoida neoplasmer. // Cancer Invest. 2006. V. 24. Nr. 7. P. 718-725.
7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-IH) vid behandling av kronisk lymfatisk leukemi. // Onkogen. 2007. V. 26. Nr 25. s. 3644-3653.
8. Baselga J. En översyn av EGFR riktad terapi. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. Nr 4. s. 218-219.
9. Fischgrabe J., Wulfing P. Riktade terapier vid bröstcancer: etablerade läkemedel och den senaste utvecklingen. // Curr Clinic Pharmacol. 2008. V. 3. Nr 2. s. 85-98.
10. Goldenberg M.M. Trastuzumab, en rekombinant DNA-härledd humaniserad monoklonal antikropp, ett nytt medel för behandling av metastaserad bröstcancer. // Clin Ther. 1999. V. 21. Nr 2. s. 309-318.
11. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Human bröstcancer: korrelation av återfall och överlevnad med amplifiering av HER-2/neu-onkogenen. // Vetenskap. 1987. V. 235. Nr 4785. S. 177-182.
12. Azim H., Azim H.A., Jr. Inriktning på Her-2/neu i bröstcancer: så enkelt som detta! // Onkologi. 2008. V. 74. Nr 3-4. S. 150-157.
13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado B., Gascon P. Verkningsmekanism för anti-HER2 monoklonala antikroppar: vetenskaplig uppdatering om trastuzumab och 2C4. // Adv Exp Med Biol. 2003. V. 532. S. 253-268.
14. Stern M., Herrmann R. Översikt över monoklonala antikroppar i cancerterapi: närvarande och löfte. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. Nr 1. S. 11-29.
15. Gutheil J. Löftet om monoklonala antikroppar för behandling av cancer. // Crit Rev Oncol Hematol. 2001. V. 38. Nr 1. S. 1-2.
16. Moiseenko B.M. Monoklonala antikroppar vid behandling av maligna tumörer. // Praktisk onkologi. 2003. V. 4. Nr 3. R. 148-156.
17. Guillemard V., Uri Saragovi H. Prodrug kemoterapeutika kringgår p-glykoproteinresistens och dödar tumörer in vivo med hög effekt och målberoende selektivitet. // Onkogen. 2004. V. 23. Nr 20. s. 3613-3621.
18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Teknikinsikt: cytotoxiska läkemedelsimmunkonjugat för cancerterapi. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. Nr. 4. s. 245-255.
19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) för återfall av CD30-positiva lymfom. // New England Journal of Medicine. V. 363. N:o 19. P. 1812-1821.
20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. Fas I-studie av Trastuzumab
21. DM1, ett HER2-antikropps-läkemedelskonjugat, ges var tredje vecka till patienter med HER2-positiv metastaserad bröstcancer. // Journal of Clinical Oncology. V. 28. Nr 16. s. 2698-2704.
22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: ett anti-CD33-immunkonjugat för behandling av akut myeloid leukemi. // Expert åsikt Biol Ther. 2008. V. 8. Nr 4. s. 527-540.
23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O "Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. Rollen av gemtuzumab ozogamicin i akut leukemiterapi. // Br J Haematol. 2006. V. 132. P No. 4. 398-409.
24. Gao Z., McAlister V.C., Williams G.M. Återpopulation av leverendotel med benmärgshärledda celler. // Lancet. 2001. V. 357. Nr 9260. s. 932-933.
25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Calicheamicin gamma II: ett antitumörantibiotikum som specifikt klyver dubbelsträngat DNA-ställe. // Vetenskap. 1988. V. 240. Nr 4856. s. 1198-1201.
26. Reiter Y. Rekombinanta immunotoxiner i målinriktad cancercellsterapi. // Adv Cancer Res. 2001. V. 81. S. 93-124.
27. Goyal A., Batra J.K. Inkluderandet av en furinkänslig spacer förstärker cytotoxiciteten hos ribotoxinrestriktocin innehållande rekombinanta enkelkedjiga immunotoxiner. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.
28. Kreitman R.J. Rekombinanta immunotoxiner innehållande trunkerade bakteriella toxiner för behandling av hematologiska maligniteter. // BioDrugs. 2009. V. 23. Nr 1. S. 1-13.
29. Jain R.K., Baxter L.T. Mekanismer för heterogen fördelning av monoklonala antikroppar och andra makromolekyler i tumörer: betydelsen av förhöjt interstitiellt tryck. // Cancer Res. 1988. V. 48. Nr 24 Pt 1. P. 7022-7032.
30. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Monoklonal antikroppsterapi för solida tumörer. // Cancer Treat Rev. 2000. V. 26. Nr 4. s. 269-286.
31. Brada M. BCL2-genen: aktuell relevans för klinisk onkologi. // Eur J Cancer. 1992. V. 28. Nr 1. s. 270-272.
32. Yip K.W., Reed J.C. Bcl-2 familjens proteiner och cancer. // Onkogen. 2008. V. 27. Nr 50. s. 6398-6406.
33 Reed J.C. Bcl-2 familjeproteiner: strategier för att övervinna kemoresistens vid cancer. //Adv Pharmacol. 1997. V. 41. P. 501-532.
34 Reed J.C. Bel-2 familjeproteiner: regulatorer av kemoresistens vid cancer. // Toxicol Lett. 1995. V. 82-83. S. 155-158.
35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen vid behandling av metastaserande melanom. // Future Oncol. 2007. V. 3. Nr. 3. s. 263-271.
36. Oblimersen: Augmerosen, BCL-2 antisense oligonukleotid Genta, G 3139, GC 3139, oblimersen natrium. // Drugs R D. 2007. V. 8. Nr 5. s. 321-334.
37. Manoharan M. Oligonukleotidkonjugat som potentiella antisensläkemedel med förbättrat upptag, biodistribution, riktad leverans och verkningsmekanism. /"/ Antisense Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. Nr. 2. P. 103-128.
38. Abels C. Målinriktning av det vaskulära systemet hos solida tumörer genom fotodynamisk terapi (PDT). // Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. Nr 8. s. 765-771.
39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. Direkta tumörskadamekanismer för fotodynamisk terapi. // Acta Biochim Pol. 2005. V. 52. Nr 2. s. 339-352.
40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Fotodynamisk terapi (PDT): en kort recension om cellulära mekanismer och cancerforskningstillämpningar för PDT. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. Nr 1. S. 1-8.
41. Aveline B.M., Redmond R.W. Exklusiva fria radikaler för cellulär fotosensibilisering. // Fotokemi och fotobiologi. 1998. V. 68. Nr 3. s. 266-275.
42. Henderson B.W., Dougherty T.J. Hur fungerar fotodynamisk terapi? // Photochem Photobiol. 1992. V. 55. Nr 1. S. 145-157.
43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Biverkning kännetecknad av bröstsmärtor, andnöd och synkope i samband med verteporfin (visudyne). // Am J Ophthalmol. 2002. V. 134. Nr 2. s. 281-282.
44. Cheng Y., A C.S., Meyers J.D., Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Mycket effektiv läkemedelsleverans med guld nanopartikelvektorer för in vivo fotodynamisk terapi av cancer. // J Am Chem Soc. 2008. V. 130. Nr 32. s. 10643-10647.
45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Riktad fotodynamisk terapi via receptormedierade leveranssystem. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. Nr 1. S. 53-76.
46. Olenick N.L., Evans H.H. Fotobiologin för fotodynamisk terapi: cellulära mål och mekanismer. // Radiat Res. 1998. V. 150. Nr 5 Suppl. P. S146-156.
47. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Riktad intracellulär leverans av fotosensibilisatorer för att förbättra fotodynamisk effektivitet. // Immunol Cell Biol. 2000. V. 78. Nr 4. s. 452-464.
48. Rozanova Torshina N., Zhang J.Z., Heck D.E. Katalytisk terapi av cancer med porfyriner och askorbat. // Cancer Lett. 2007. V. 252. Nr 2. s. 216-224.
49. Khorosheva E.V., Gerasimova G.K., Kaliya O.J1. Studie av mekanismen för teraftaltransport in i tumörceller
50. Russian Biotherapeutic Journal 2007. V. 6. Nr 1. R. 8.
51. Kulbachevskaya N.Yu., Manzyuk L.V., Mikhailova JI.M. Klinisk och experimentell studie av toxiciteten hos det antitumörkatalytiska systemet "teraftal + askorbinsyra" ("TF + AA"). // Rysk bioterapeutisk tidskrift. 2004. V. 3. Nr 2. R. 70.
52. Ravi Kumar M.N. Nano och mikropartiklar som kontrollerade läkemedelstillförselanordningar. // J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. Nr 2. s. 234-258.
53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanopartiklar och riktade system för cancerterapi. // Adv Drug Deliv Rev. 2012.V.P.
54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Nanopartikelalbuminbundet (nab) Teknik är en lovande metod för läkemedelsleverans mot cancer. // Senaste Pat Anticancer Drim Dkrnv 9PP9 V P
55. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Inriktning av albumininbäddade paklitaxelnanopartiklar till tumörer. //Nanomedicin. 2009. V, 5. Nr 1. s. 73-82.
56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paklitaxel för bröstcancer: en ny formulering med en förbättrad säkerhetsprofil och större effektivitet. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. Nr 7. s. 919-943.
57. Moreno-Aspitia A., Perez E.A. Nanopartikelalbuminbundet paklitaxel (ABI-007): ett nyare taxanalternativ vid bröstcancer. // Future Oncol. 2005. V. 1. Nr 6. s. 755-762.
58. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytiska mekanismer för riktad läkemedelsleverans. // Avancerade läkemedelsleveransrecensioner. 2007. V. 59. Nr 8. s. 748-758.
59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-beroende endocytos. // Biochem J. 2004. V. 377. Nr Pt l.P. 1-16.
60. Rodemer C., Haucke V. Clathrin/AP-2-beroende endocytos: en ny lekplats för den farmakologiska verktygslådan? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. nr 186. S. 105-122.
61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-beroende endocytos. // The Biochemical journal. 2004. V. 377. Nr Pt 1. P. 1-16.
62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Tillbehörsfaktorer i clathrin-beroende synaptisk vesikelendocytos. //Nat Rev Neurosci. 2000. V. 1. Nr 3. S. 161-172.
63. Marsh M., McMahon H.T. Endocytosens strukturella era. // Vetenskap. 1999. V. 285. Nr 5425. s. 215-220.
64. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytiska mekanismer för riktad läkemedelsleverans. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. Nr 8. s. 748-758.
65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. Dynamin självmonteras till ringar vilket tyder på en mekanism för belagd vesikelknoppning. // Natur. 1995. V. 374. Nr 6518. S. 190-192.
66. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, ett membranombyggande GTPase. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. Nr 2. s. 75-88.
67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Cytoplasmatisk dyneinberoende vesikulär transport från tidiga till sena endosomer. // Journal of cell biology. 1993. V. 123. Nr 6 Pt 1. P. 1373-1387.
68. Stahl P.D., Barbieri M.A. Multivesikulära kroppar och multivesikulära endosomer: "ins och outs" av endosomal trafik. // Science "s STKE: signaltransduction kunskapsmiljö. 2002. V. 2002. Nr 141. P. pe32.
69. Piper R.C., Luzio J.P. Sena endosomer: sortering och uppdelning i multivesikulära kroppar. // Trafik. 2001. V. 2. Nr 9. s. 612-621.
70. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Endolysosomal proteolysis och dess reglering. // The Biochemical journal. 2002. V. 363. Nr. Pt 3. P. 417-429.
71. Eskelinen E.-L. Roller för LAMP-1 och LAMP-2 i lysosombiogenes och autofagi. // Molecular Aspects of Medicine. 2006. V. 27. Nr 5-6. s. 495-502.
72. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Caveoliner, vätskeordnade domäner och signaltransduktion. // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. Nr 11. s. 7289-7304.
73. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. Upptagsvägar och efterföljande intracellulär handel med icke-viral genleverans. // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. Nr 1. S. 32-45.
74. Lajoie P., Nabi I.R. Kapitel 3 Lipidflottar, kaveoler och deras endocytos. I: Kwang WJ, redaktör. International Review of Cell and Molecular Biology: Academic Press; 2010.s. 135163.
75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Clathrin- och caveolin-1-oberoende endocytos: inträde av simianvirus 40 i celler som saknar kaveoler. // J Cell Biol. 2005. V. 168. Nr 3. s. 477-488.
76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. Riktad intracellulär leverans av terapeutika: en översikt. // Die Pharmazie. 2007. V. 62. Nr 9. s. 643-658.
77. Fenton C., Perry C.M. Gemtuzumab ozogamicin: en översyn av dess användning vid akut myeloid leukemi. //Läkemedel. 2005. V. 65. Nr 16. s. 2405-2427.
78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Nya CD20 monoklonala antikroppar för lymfomterapi. // Journal of Hematology & Oncology. 2012. V. 5. Nr 1. S. 64.
79. Chari R.V.J. Riktad cancerterapi: ger specificitet till cytotoxiska läkemedel. // Redovisningar för kemisk forskning. 2007. V. 41. Nr 1. s. 98-107.
80. Casi G., Neri D. Antikropps-läkemedelskonjugat: grundläggande koncept, exempel och framtidsperspektiv. // Journal of controlled release: officiell tidning för Controlled Release Society. 2012. V. 161. Nr 2. s. 422-428.
81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren T., Venkatachalam T., Waddick K.G., Rostostev A., Myers D.E. Cytotoxisk aktivitet av epidermal tillväxtfaktor-genistein mot bröstcancerceller. // Clin Cancer Res. 1998. V. 4. Nr 4. s. 901-912.
82. Rihova B. Inriktning av läkemedel mot cellytreceptorer. // Kritiska recensioner inom bioteknik. 1997. V. 17. Nr 2. S. 149-169.
83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Nya framsteg i tumörinriktade anticancerläkemedelskonjugat. // Bioorganisk & medicinsk kemi. 2005. V. 13. .№17. P. 50435054.
84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Prodrug-baserad intracellulär leverans av anticancermedel. // Avancerade läkemedelsleveransrecensioner. 2011. V. 63. Nr 1-2. S. 3-23.
85. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J. Nya trender inom riktad anticancerprodrug och konjugatdesign. // Aktuell medicinsk kemi. 2008. V. 15. Nr 18. S. 1802-1826.
86. Sanderson R.J., Hering M A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. Läkemedelslänkstabilitet in vivo för ett anti-CD30-dipeptidkopplat auristatin-immunkonjugat. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. Nr 2 Pt 1. P. 843-852.
87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Icke-linjär farmakokinetik för terapeutiska proteiner resulterande från receptormedierad endocytos. // J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2009. V. 36. Nr 3. s. 239-260.
88. Malyankar U.M. Tumörassocierade antigener och biomarkörer i cancer och immunterapi. // Int Rev Immunol. 2007. V. 26. Nr 3-4. s. 223-247.
89. Tyuryaeva I.I. tumörantigener. // Cytologi. 2008. V. 50. Nr 3. R. 189-209.
90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon T., van der Bruggen P. En MAGE-A4-peptid som presenteras av HLA-A2 känns igen av cytolytiska T-lymfocyter. // Eur J Immunol. 1999. V. 29. Nr 10. s. 3329-3337.
91. Houghton A.N. Cancerantigener: immunigenkänning av jaget och förändrat jag. // J Exp Med. 1994. V. 180. Nr 1. S. 1-4.
92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Gangliosider av normala och neoplastiska humana melanocyter. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 120. Nr 2. s. 500-504.
93. Tang C.K., Katsara M., Apostolopoulos V. Strategier som används för MUC1-immunterapi: kliniska studier på människa. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. Nr 7. s. 963-975.
94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Roll av HER-receptorfamiljen i utveckling och differentiering. //J Cell Physiol. 2004. V. 200. Nr 3. s. 343-350.
95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. ErbB-signalnätverket: receptorheterodimerisering i utveckling och cancer. // EMBO J. 2000. V. 19. Nr 13. s. 3159-3167.
96. Baryshnikov A.Yu. Förhållandet mellan tumören och kroppens immunförsvar. // Praktisk onkologi. 2003. V. 4. Nr 3. R. 127-130.
97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Carcinoembryonalt antigen som ett vaccinmål. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. Nr 7. s. 987-993.
98. Singer J.W., De Vries P., Bhatt R, Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis R.A., Wallace S. Conjugation of camptothecins to poly-(L-glutaminsyra). // Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 922. S. 136-150.
99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Cytofluorescensdetektering av adriamycin-mitokondrierinteraktioner i isolerat, perfunderat råtthjärta. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. Nr 1. S. 35-41.
100. Evdokimova V.N., Butterfield L.H. Alfa-fetoprotein och andra tumörassocierade antigener för immunterapi av hepatocellulär cancer. // Expert åsikt Biol Ther. 2008. V. 8. Nr 3. P. 325336.
101. Abelev G.I., Eraiser T.L. Cellulära aspekter av återuttryck av alfa-fetoprotein i tumörer. // Semin Cancer Biol. 1999. V. 9. Nr 2. s. 95-107.
102. Mizejewski G.J. Alfa-fetoproteinstruktur och funktion: relevans för isoformer, epitoper och konformationsvarianter. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. Nr 5. s. 377-408.
103. Castelli C., Rivoltini L., Andreola G., Carrabba M., Renkvist N., Parmiani G. T-celligenkänning av melanomassocierade antigener. // J Cell Physiol. 2000. V. 182. Nr 3. s. 323-331.
104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. En ny familj av gener som kodar för ett antigen som känns igen av autologa cytolytiska T-lymfocyter på ett humant melanom. // J Exp Med. 1995. V. 182. Nr 3. s. 689-698.
105. Lewis J.J., Houghton A.N. Definition av tumörantigener lämpliga för vaccinkonstruktion. // Semin Cancer Biol. 1995. V. 6. Nr 6. s. 321-327.
106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Läkemedelsinriktning vid cancerbehandling: aktiva daunorubicin-proteinkonjugat. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pt A. P. 291-298.
107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Tumörvaskulär permeabilitet och EPR-effekten i makromolekylär terapi: en översikt. // J Control Release. 2000. V. 65. Nr 1-2. s. 271-284.
108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Tidig fas av tumörackumulering av makromolekyler: en stor skillnad i clearancehastighet mellan tumör och normala vävnader. // Jpn J Cancer Res. 1998. V. 89. Nr 3. s. 307-314.
109. Kratz F., Beyer U. Serumproteiner som läkemedelsbärare av anticancermedel: en recension. // Drug Deliv. 1998. V. 5. Nr 4. s. 281-299.
110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Framställning, karakterisering och in vitro-effektivitet av albuminkonjugat av doxorubicin. // Biol Pharm Bull. 1998. V. 21. Nr 1. S. 56-61.
111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Albuminkonjugat av anticancerläkemedlet klorambucil: syntes, karakterisering och in vitro-effektivitet. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. V. 331. Nr 2. S. 47-53.
112. Föreningen för medicinsk onkologi hos tyska cancerföreningen. // Clin Cancer Res. 1999. V. 5. Nr 4. s. 753-759.
113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. Syntes, klyvningsprofil och antitumöreffektivitet av en albuminbindande prodrug av metotrexat som klyvs av plasmin och cathepsin B. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. V. 340. Nr 8. s. 389-395.
114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Utveckling och in vitro-effektivitet av nya MMP2- och MMP9-specifika doxorubicinalbuminkonjugat. // Bioorg Med Chem Lett. 2001. V. 11. Nr 15. P. 2001-2006.
115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Läkemedels-polymerkonjugat som innehåller syraspjälkbara bindningar. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. V. 16. Nr 3. s. 245-288.
116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung D.E., Gitzel M. Prodrugs av antracykliner i cancerkemoterapi. // Curr Med Chem. 2006. V. 13. Nr 5. s. 477-523.
117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. Fas I och farmakokinetisk studie av (6-maleimidokaproyl)hydrazonderivatet av doxorubicin. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. Nr 16. s. 4858-4866.
118. Kratz F., Mansour A., Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Utveckling av albuminbindande doxorubicin-prodrugs som klyvs av prostataspecifikt antigen. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. V. 338. Nr 10. s. 462-472.
119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. Studie in vitro och in vivo av en albuminbindande prodrug av doxorubicin som spjälkas av cathepsin B. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. V. 64. Nr 2. s. 413-418.
120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Utveckling av proteinbindande bifunktionella linkers för en ny generation av dubbelverkande prodrugs. // Bioconjug Chem. 2009. V. 20. Nr 2. s. 390-396.
121. Abu Ajaj K., Kratz F. Utveckling av dubbelverkande prodrugs för att kringgå multidrug resistens. // Bioorg Med Chem Lett. 2009. V. 19. Nr 3. s. 995-1000.
122. Dautry-Varsat A. Receptormedierad endocytos: den intracellulära resan av transferrin och dess receptor. // Biokemi. 1986. V. 68. Nr 3. s. 375-381.
123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez J.A., Helguera G., Penichet M.L. Transferrinreceptorn del I: Biologi och målsökning med cytotoxiska antikroppar för behandling av cancer. // Clin Immunol. 2006. V. 121. Nr 2. S. 144-158.
124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: struktur, funktion och potentiella terapeutiska handlingar. // Drug Discovery Today. 2005. V. 10. Nr 4. s. 267-273.
125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Transferrin riktad leverans av adriamycin till humana celler. // Anticancer Res. 1998. V. 18. Nr 3A. P. 1423-1427.
126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. Adriamycinkonjugat av humant transferrin binder transferrinreceptorer och dödar K562- och HL60-celler. // Arch Biochem Biophys. 1993. V. 300. Nr 1. s. 356-363.
127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. Hämning av traav transferrin-adriamycinkonjugat. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1105. Nr 1. s. 84-88.
128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Inverkan av konjugation av doxorubicin till transferrin på järnupptaget av K562-celler via receptormedierad endocytos. // Eur J Biochem. 1993. V. 213. Nr 1. s. 427-436.
129 Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Verkningsmekanism och spektrum av cellinjer som är känsliga för ett doxorubicin-transferrinkonjugat. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. V. 41. Nr 2. P. 155160.
130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. Transferrinreceptorn del II: riktad leverans av terapeutiska medel till cancerceller. // Clin Immunol. 2006. V. 121. Nr 2. S. 159-176.
131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. In vitro cytotoxicitet och in vivo distribution av transferrin-platina(II)-komplex. // J Pharm Sci. 1995. V. 84. Nr 2. s. 216-221.
132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. Preliminär utvärdering av platinatransferrin (MPTC-63) som en potentiell icke-toxisk behandling för bröstcancer. // Cancer Upptäck Föreg. 1988. V. 12. Nr 1-6. s. 469-480.
133. Chef J.F., Wang F., Elliott R.L. Antineoplastiska läkemedel som stör järnmetabolismen i cancerceller. //Adv Enzyme Regul. 1997. V. 37. S. 147-169.
134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Syntes och in vitro-effektivitet av transferrinkonjugat av anticancerläkemedlet klorambucil. // J Med Chem. 1998. V. 41. Nr 15. s. 2701-2708.
135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Tumörinriktning baserat på effekten av förbättrad permeabilitet och retention (EPR) och mekanismen för receptormedierad endocytos (RME). // Int J Pharm. 2004. V. 277. Nr 1-2. S. 39-61.
136. Frankel A.E. Ökad sofistikering av immunotoxiner. // Clin Cancer Res. 2002. V. 8. Nr 4. s. 942-944.
137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Immunotoxinbehandling av hematologiska maligniteter. // Semin Oncol. 2003. V. 30. Nr 4. s. 545-557.
138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. Effekten av transferrinreceptorinriktade immunotoxiner i hjärntumörcellinjer och pediatriska hjärntumörer. // Cancer Res. 1993. V. 53. Nr 6. s. 1348-1353.
139. Weaver M., Laske D.W. Transferrinreceptorligandriktat toxinkonjugat (Tf-CRM107) för terapi av maligna gliom. // J Neuroncol. 2003. V. 65. Nr 1. S. 3-13.
140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. Nedreglering av c-FLIP sensibiliserar DU145 prostatacancerceller till Fas-medierad apoptos. // Cancer Biol Ther. 2002. V. 1. Nr 4. s. 401-406.
141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. Epidermal tillväxtfaktor-medierad inriktning av klor e6 förstärker selektivt dess fotodynamiska aktivitet. // Cancer Res. 2000. V. 60. Nr 8. s. 2197-2202.
142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. EGF-ricin A-konjugat: kinetiska profiler av cytotoxiska effekter och resistenta cellvarianter. // Cell Struct Funct. 1984. V. 9. Nr 3. s. 203-212.
143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. Fysikalisk-kemiska krav för cellulärt upptag av pAntp-peptid. Roll av lipidbindande affinitet. // Eur J Biochem. 2001. V. 268. Nr 5. P. 1304-1314.
144. Vives E., Richard J.P., Rispal C., Lebleu B. TAT-peptidinternalisering: söker mekanismen för inträde. // Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. Nr 2. S. 125-132.
145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Nya daunorubicin-bärarpeptidkonjugat härledda från humana kalcitoninsegment. // J Mol Recognit. 2003. V. 16. Nr 5. s. 280-287.
146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. Telomerhämning och telomeravbrott som processer för läkemedelsmålinriktning. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. V. 43. S. 359-379.
147. Chomczynski P., Sacchi N. Enkelstegsmetod för RNA-isolering genom extraktion av sur guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform. // Analytisk biokemi. 1987. V. 162. Nr 1. P. 156159.
148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Adenokarcinomceller målsöks av det nya chimära toxinet GnRH-PE66 genom specifika bindningsställen för gonadotropinfrisättande hormon. // J Biol Chem. 1997. V. 272. Nr 17. P. 11597-11603.
149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. Ett difteritoxin-epidermal tillväxtfaktorfusionsprotein är cytotoxiskt för humana glioblastoma multiforme-celler. // Cancer Res. 2003. V. 63. Nr 8. S. 1834-1837.
150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. Inriktning mot epidermal tillväxtfaktorreceptor i bröstcancercellinjer med ett rekombinant ligandfusionstoxin (DAB389EGF). // Cancer J Sci Am. 1996. V. 2. Nr 3. S. 175-180.
151. Turturro F. Denileukin diftitox: ett bioterapeutiskt paradigmskifte vid behandling av lymfoidhärledda störningar. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. Nr 1. S. 11-17.
152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox som ny riktad terapi för lymfoida maligniteter. // Cancer Invest. 2007. V. 25. Nr 6. s. 495-501.
153. Duvic M., Talpur R. Optimering av denileukin diftitox (Ontak) terapi. // Future Oncol. 2008. V. 4. Nr. 4. s. 457-469.
154. Foss F. Klinisk erfarenhet av denileukin diftitox (ONTAK). // Semin Oncol. 2006. V. 33. Nr 1 Suppl 3. P. SI 1-16.
155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. Nya terapier för kronisk lymfatisk leukemi. // Blod Rev. 2004. V. 18. Nr 2. s. 137-148.
156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox som ny riktad terapi vid non-Hodgkins lymfom // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. No. 2. P. 169-174.
157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: en kortfattad klinisk recension. // Expert Rev Anticancer Ther. 2005. V. 5. Nr 1. S. 33-38.
158. Black J.H., McCubrey J.A., Willingham M.C., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. Difteritoxin-interleukin-3 fusionsprotein (DT(388)IL3) förlänger sjukdomsfri överlevnad hos leukemiska immunkomprometterade möss. // Leukemi. 2003. V. 17. Nr 1. S. 155-159.
159. Frankel A., Liu J.S., Rizzieri D., Hogge D. Fas I klinisk studie av difteritoxin-interleukin 3-protein hos patienter med akut myeloid leukemi och myelodysplasi. // Leuk lymfom. 2008. V. 49. Nr 3. s. 543-553.
160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. IL-4 och IL-13 pseudomonas exotoxiner: nytt hopp för hjärntumörterapi. // Neurokirurgiskt fokus. 2006. V. 20. Nr 4. P. El 1.
161. Terapi med och utan temozolomid vid nyligen diagnostiserade maligna gliom: Fas 1-studie av slutliga säkerhetsresultat. //Neurokirurgi. 2008.V.P.
162. Jarboe J.S., Johnson K.R., Choi Y., Lonser R.R., Park J.K. Uttryck av interleukin-13-receptor alfa2 i glioblastoma multiforme: implikationer för riktade terapier. // Cancer Res. 2007. V. 67. Nr 17. s. 7983-7986.
163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: en ny prototyp av humana chimära proteiner för riktad terapi. // FEBS Lett. 1999. V. 457. Nr 2. s. 271-276.
164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Verkningsmekanism för interleukin-2 (IL-2)-Bax, ett apoptosinducerande chimärt protein riktat mot celler som uttrycker IL-2 receptor. // Biochem J. 2003. V. 370. Nr. Pt 1. P. 129-140.
165. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstration av en ny proteinfraktion i serum från det mänskliga fostret. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. Nr 2. S. 174.
166. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., S.I.I. Embryonalt serum a-globulin och dess syntes av transplanterade mushepatom. // Biokemi. 1963. V. 28. Nr 4. R. 625-634.
167. Tatarinov Yu.S. Detektion av embryospecifikt a-globulin i blodserumet hos en patient med primär levercancer. // Fråga. honung. kemi. 1964. V. 10. R. 90-91.
168. Abelev G.I., Elgort D.A. Alfa-fetoprotein som en immunologisk markör för hepatocellulär cancer och testikel- och ovarie-teratokarcinom. // Onkologi. 1978. V. 10. R. 3-17.
169. Brock D.J., Bolton A.E., Monaghan J.M. Prenatal diagnos av anencefali genom maternell serum-alfafetoproteinmätning. // Lancet. 1973. V. 2. Nr 7835. s. 923-924.
170. Aitken D.A., Crossley J.A. Neuralrörsdefekter / alfa-fetoprotein / Downs syndrom screening. // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. Nr 2. P. 113-120.
171. Deutsch H.F. Kemi och biologi av alfa-fetoprotein. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.t "t i ng. zjj-j1z.
172 Luft A.J., Lorscheider F.L. Strukturell analys av humant och bovint alfa-fetoprotein genom elektronmikroskopi, bildbehandling och cirkulär dikroism. // Biokemi. 1983. V. 22. Nr 25. s. 5978-5981.
173 Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake C., Ho S.K. Strukturer av sjukdomsspecifika serum alfa-fetoprotein isoformer. // Br J Cancer. 2000. V. 83. Nr 10. s. 1330-1337.
174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. Närvaron av fettsyror i humant alfa-fetoprotein. // J Biol Chem. 1978. V. 253. Nr 7. s. 2114-2119.
175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Tandem arrangemang av generna för albumin och alfa-fetoprotein i det mänskliga genomet. // Gene. 1984. V. 32. Nr 3. s. 255-261.
176. Lazarevich N.L. Molekylära mekanismer för reglering av alfa-fetoproteingenuttryck. // Biokemi. 2000. V. 65. Nr 1. R. 139-158.
177. Jose-Estanyol M., Danan J.L. En leverspecifik faktor och nukleär faktor I binder till rått-alfa-fetoproteinpromotorn. // J Biol Chem. 1988. V. 263. Nr 22. P. 10865-10871.
178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Hepatocyt nukleär faktor 3 lindrar kromatinmedierad repression av alfa-fetoproteingenen. // J Biol Chem. 1999. V. 274. Nr 35. s. 25113-25120.
179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. Alfa-1-fetoproteinlokuset aktiveras av en nukleär receptor av Drosophila FTZ- F1 familj. // Mol. cell. Biol. 1996. V. 16. Nr 7. s. 3853-3865.
180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 är en repressor av a-fetoproteinuttryck i humana hepatomcellinjer. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. Nr 6b. s. 2772-2780.
181 Van Reeth T, Gabant P, Szpirer C, Szpirer J. Stimulering av alphafeioproiein-promotorn genom oliganderad sköldkörtelhormonreceptor i samband med proteindeacetylering. // Molekylär och cellulär endokrinologi. 2002. V. 188. Nr 1-2. s. 99-109.
182. Lienard P., De Mees C., Drnze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Reglering av alfa-fetoproteinpromotorn: Ku-bindning och rumslig DNA-konformation. // Biokemi. 2006. V. 88. Nr 10. P. 1409-1417.
183. Mizejewski G.J. Biologiska roller av alfa-fetoprotein under graviditet och perinatal utveckling. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. V. 229. Nr 6. s. 439-463.
184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. Fettsyrabindningsstället för humant alfa-fetoprotein. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. V. 196. Nr 3. s. 1049-1057.
185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Effekt av alfa-fetoprotein och albumin på upptaget av fleromättade fettsyror av råtthepatomceller och fetala råtthepatocyter. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. Nr 1. s. 81-88.
186. Mizejewski G.J., Pass K.A. Fettsyror, alfa-fetoprotein och cystisk fibros. // Pediatrik. 2001. V. 108. Nr 6. s. 1370-1373.
187. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Effekter av tungmetaller på alfa-fetoprotein i moderns sera och fostervatten från gravida möss. // Toxikologi. 1990. V. 64. Nr 1. S. 19-32.
188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. Renat humant alfa-fetoprotein hämmar follikelstimulerande hormonstimulerad östradiolproduktion av grisgranulosaceller i kultur. // Mol Cell Endocrinol. 1993. V. 94. Nr 1. S. 21-25.
189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Östradiolaktiverat alfa-fetoprotein undertrycker det uterotropa svaret på östrogener. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. Nr 9. s. 2733-2737.
190. Jacobson H.I., Bennett J.A., Mizejewski G.J. Hämning av östrogenberoende bröstcancertillväxt genom en reaktionsprodukt av alfa-fetoprotein och östradiol. // Cancer Res. 1990. V. 50. Nr 2. s. 415-420.
191. Mizejewski G.J., Warner A.S. Alfa-fetoprotein kan reglera tillväxten i livmodern hos den omogna och vuxna ovariektomiserade musen. // J Reprod Fertil. 1989. V. 85. Nr 1. S. 177-185.
192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Studier av den inneboende antiuterotropa aktiviteten hos murint alfa-fetoprotein. // Tumörbiologi. 1986. V. 7. Nr 1. S. 19-36.
193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., .Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Graviditetshormoner, alfa-fetoprotein och minskning av risken för bröstcancer. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. S. 477-484.
194. Mizejewski G.J. Biologisk roll av alfa-fetoprotein i cancer: utsikter för anticancerterapi. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. Nr 6. s. 709-735.
195 Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. Den främjande molekylära mekanismen för alfa-fetoprotein på tillväxten av human hepatom Bel7402-cellinje. // World J Gastroenterol. 2002. V. 8. Nr 3. s. 469-475.
196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. Den intracellulära mekanismen för alfa-fetoprotein som främjar proliferationen av NIH 3T3-celler. // Cell Res. 2002. V. 12. Nr 2. P. 151156.
197 Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Förbättring av proliferation av HeLa-celler av alfa-fetoproteinet. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2002. V. 34. Nr 6. s. 769-774.
198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alfa-fetoprotein: En ny medlem av intracellulär signal molekyler vid reglering av PI3K/AKT-signalering i humana hepatomcellinjer. // Int J Cancer. V.P.
199. Chakraborty M., Mandal C. Immunsuppressiv effekt av humant alfafetoprotein: en studie över arter. // Immunol Invest. 1993. V. 22. Nr 5. s. 329-339.
200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. (alfa)-Fetoprotein försämrar APC-funktionen och inducerar deras apoptos. // J Immunol. 2004. V. 173. Nr 3. P. 1772-1778.
201 Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Förbättring av autoimmun neuroinflammation genom rekombinant humant alfa-fetoprotein. // Exp Neurol. 2006. V. 198. Nr 1. s. 136-144.
202. Chereshnev B.A., Rodionov S.Yu. Cherkasov VA, Malyutina N. N., Orlov O.A. Alfa-fetoprotein. Jekaterinburg: Ural-grenen av Ryska vetenskapsakademin; 2004.
203 Dudich E. MM-093, ett rekombinant humant alfa-fetoprotein för potentiell behandling av reumatoid artrit och andra autoimmuna sjukdomar. // Curr Opin Mol Ther. 2007. V. 9. Nr 6. s. 603-610.
204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. Hämningen av apoptos av alfa-fetoprotein (AFP) och rollen av AFP-receptorer i anti-cellulär senescens. // Anticancer Res. 1994. V. 14. Nr 6B. s. 2429-2438.
205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. Kemoterapeutisk effekt av protein-doxorubicinkonjugaten på multiläkemedelsresistent råtthepatomcellinje in vitro. // Br J Cancer. 1993. V. 67. Nr 2. s. 274-278.
206. Lubgan D., Jozwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. Doxorubicin-transferrinkonjugat övervinner selektivt multiläkemedelsresistens i leukemiceller. // Cell Mol Biol Lett. 2009. V. 14. Nr 1. s. 113-127.
207. Sarti D.A., Crandall B.F., Winter J., Robertson R.D., Kaback N.M., Karp L.E. Korrelation mellan biparietal och fosterkroppsdiametrar: 12-26 veckors graviditet. // AJR. Amerikansk tidskrift för röntgenologi. 1981. V. 137. Nr 1. s. 87-91.
208 Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus P.E., Giaccone G. Topoisomerase Ilalpha och andra läkemedelsresistensmarkörer vid avancerad icke-småcellig lungcancer. // Lungcancer. 2001. V. 32. Nr 2. s. 117-128.
209 Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Medfödd kontrakturell arachnodactyly, keratokonus och troligt Marfans syndrom i samma stamtavla. // The Journal of Pediatrics. 1981. V. 98. Nr 4. s. 591-593.
210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Sen replikationsstudier i en mänsklig X/13-translokation: korrelation med autosomalt genuttryck. // Cytogenetik och cellgenetik. 1981. V. 29. Nr 4. s. 215-220.
211 Uriel J., Villacampa M. J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Upptag av radiomärkt alfa-fetoprotein av musbröstkarcinom och dess användbarhet vid tumörscintigrafi. // Cancer Res. 1984. V. 44. Nr 11. s. 5314-5319.
212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Rollen för dynamin i clathrin-belagd vesikelbildning. // Cold Spring Harbor-symposier om kvantitativ biologi. 1995. V. 60. S. 235-242.
213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Alfafoetoproteinupptag av klonade cellinjer härledda från ett nickel-inducerat rabdomyosarkom från råtta. // Br J Cancer. 1983. V. 48. Nr 2. s. 261-269.
214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. Upptaget av alfa-fetoprotein av C-1300 musneuroblastomceller. // Br J Cancer. 1985. V. 51. Nr 6. s. 791-797.
215. Villacampa M. J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alfa-fetoproteinreceptorer i en human bröstcancercellinje. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. Nr 3. s. 1322-1327.
216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Celltypspecifika receptorer för alfa-fetoprotein i en T-lymfomcellinje från mus. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. Nr 10. s. 3301-3305.
217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Isolering och partiell karakterisering av en specifik alfa-fetoproteinreceptor på humana monocyter. // J Clin Invest. 1992. V. 90. Nr 4. s. 1530-1536.
218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Aktivering av en alfa-fetoprotein (AFP)/receptor autokrin loop i HT-29 humana kolonkarcinomceller. // Int J Cancer. 1991. V. 49. Nr 3. P. 425430.
219. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Uttryck av alfa-fetoproteinreceptorer av humana T-lymfocyter under blastisk transformation. // Mol Immunol. 1989. V. 26. Nr 9. s. 851-857.
220. Biddle W., Sarcione E.J. Specifikt cytoplasmatiskt alfa-fetoproteinbindande protein i MCF-7 humana bröstcancerceller och primär bröstcancervävnad. // Bröstcancer Res Treat. 1987. V. 10. Nr 3. s. 279-286.
221. Mizejewski G.J. Alfa-fetoproteinbindande proteiner: implikationer för transmembranpassage och subcellulär lokalisering. // Life Sci. 1995. V. 56. Nr 1. S. 1-9.
222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoklonala antikroppar riktade mot ett utbrett onkofetalt antigen: alfa-fetoproteinreceptorn. // Tumör Biol. 1993. V. 14. Nr 2. S. 116-130.
223. Kanevsky V., Pozdnyakova L.P., Aksenova O.A., Severin S.E., Katukov V., Severin E.S. Isolering och karakterisering av AFP-bindande proteiner från tumör- och fostervävnad. // Biochem Mol Biol Int. 1997. V. 41. Nr 6. s. 1143-1151.
224 Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Specifikt upptag av alfa-fetoprotein och albumin av råtta Morris 7777 hepatomceller. // Tumör Biol. 1999. V. 20. Nr 1. S. 52-64.
225. Mizejewski G.J., MacColl R. Alfa-fetoproteintillväxthämmande peptider: potentiella leads för cancerterapi. // Mol Cancer Ther. 2003. V. 2. Nr 11. s. 1243-1255.
226. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Alfa-fetoprotein-härledda syntetiska peptider: analys av ett östrogenmodifierande regulatoriskt segment. // Mol Cell Endocrinol. 1996. V. 118. Nr 1-2. S. 15-23.
227 Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Alfa-fetoprotein hämmar grodmetamorfos: konsekvenser för bevarande av proteinmotiv. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. V. 124. Nr 1. S. 39-45.
228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Effekt av alfa-fetoprotein och härledda peptider på insulin- och östrogeninducerad fostertoxicitet. // Fosterdiagn. Ther. 2003. V. 18. Nr 5. s. 360-369.
229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Studier på en tillväxthämmande peptid härledd från alfa-fetoprotein och vissa analoger. // J Pept Res. 2001. V. 57. Nr 1. S. 29-38.
230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Studier på analoger av en peptid härledd från alfa-fetoprotein med antiväxtegenskaper. // J Pept Res. 2001. V. 57. Nr 6. s. 539-546.
231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Undersökning av funktionella aktiviteter av alfa-fetoprotein-härledda tillväxthämmande peptider: översyn och framtidsutsikter. // Curr Protein Pept Sci. 2006. V. 7. Nr 1. S. 73-100.
232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. Genomgång av tillväxthämmande peptid som ett bioterapeutiskt medel för tumörtillväxt, vidhäftning och metastasering. // Cancer Metastas Rev. 2005. V. 24. Nr 3. s. 441-467.
233. Vakharia D., Mizejewski G.J. Humana alfa-fetoproteinpeptider binder östrogenreceptorer och östradiol och undertrycker bröstcancer. // Bröstcancer Res Treat. 2000. V. 63. Nr 1. S. 41-52.
234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Studier av 99mTc-märkning av det modifierade fragmentet av humant alfa-fetoprotein (P149-QY). // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2008. V. 275. Nr 1. s. 101-107.
235. Linton K.J., Higgins C.F. Proteinerna från Escherichia coli ATP-bindande kassett (ABC). // Mol Microbiol. 1998. V. 28. Nr 1. S. 5-13.
236. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. Den humana ATP-bindande kassetten (ABC) transportör superfamiljen. // Genome Res. 2001. V. 11. Nr 7. s. 1156-1166.
237. Dean M., Annilo T. Evolution av ATP-bindande kassett (ABC) transportör superfamiljen i ryggradsdjur. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. V. 6. S. 123-142.
238. Riordan J.R., Ling V. Rening av P-glykoprotein från plasmamembranvesiklar från äggstockscellmutanter från kinesisk hamster med reducerad kolkicinpermeabilitet. // J Biol Chem. 1979. V. 254. Nr 24. P. 12701-12705.
239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC-transportörer: kraften att förändra. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10. Nr 3. s. 218-227.
240. Choi C.H. ABC-transportörer som multidrogresistensmekanismer och utvecklingen av kemosensibilisatorer för att vända dem. // Cancer Cell Int. 2005. V. 5. S. 30.
241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Transmembrantransport av endo- och xenobiotika av däggdjurs ATP-bindande kassett-multidrogresistensproteiner. // Physiol Rev. 2006. V. 86. Nr 3. s. 849-899.
242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, kemoterapi och kromatinremodellering. // Cancer Biol Ther. 2004. V. 3. Nr 9. s. 819-824.
243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. Transkriptionella regulatorer av den humana multidrogresistens 1-genen: senaste vyer. // Biochem Pharmacol. 2002. V. 64. Nr 5-6. s. 943-948.
244. Breier A., Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-glykoprotein-implikationer av metabolism av neoplastiska celler och cancerterapi. // Curr Cancer Drug Targets. 2005. V. 5. Nr 6. s. 457-468.
245. Doz F., Roosen N., Rosenblum M.L. Metallothionein och anticancermedel: metallotioneinets roll i cancerkemoterapi. // J Neuroncol. 1993. V. 17. Nr 2. s. 123-129.
246. Lazo J.S., Basu A. Metallothionein-uttryck och övergående resistens mot elektrofila antineoplastiska läkemedel. // Semin Cancer Biol. 1991. V. 2. Nr 4. s. 267-271.
247. Chen A.Y., Liu L.F. DNA-topoisomeraser: essentiella enzymer och dödliga mål. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. V. 34. S. 191-218.
248. Makin G. Inriktning på apoptos vid cancerkemoterapi. // Expert åsikter om mål. 2002. V. 6. Nr 1. s. 73-84.
249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2nd, Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,
250. RAPPAG \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct lomlag nolle +A Lionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/YCH/I VI 1U11VUU11 JVllJiU^VJ l/l WUJ.11 W X*A/1/WHO IU WlOUllUlill WlUlUlill pentoxifylline // Cancer Res. 1995. V. 55. Nr 8. P. 1649-1654.
251. Sarkar R., Jain R.K., Puri P. Melasma hos indiska hanar. // Dermatol Surg. 2003. V. 29. Nr 2. S. 204.
252. Smith D.J., Ng H., Kluck R.M., Nagley P. Den mitokondriella porten till celldöd. // IUBMB Life. 2008. V. 60. Nr 6. s. 383-389.
253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Mitokondriella bärare och porer: nyckelregulatorer för det mitokondriella apoptotiska programmet? // Apoptos. 2007. V. 12. Nr 5. s. 869-876.
254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. En litteraturöversikt av molekylära markörer som förutsäger kliniskt svar på cytotoxisk kemoterapi hos patienter med bröstcancer. // Int J Clin Oncol. 2009. V. 14. Nr 2. s. 112-119.
255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. Rollen av Bcl-2 familjemedlemmar i tumörbildning. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. Nr 2-3. s. 229-249.
256 Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. Kliniska studier av Bcl-2 och behandlingsnytta hos bröstcancerpatienter. // Endocr Relat Cancer. 1999. V. 6. Nr 1. s. 61-68.
257. Adams J.M., Cory S. Bcl-2-reglerad apoptos: mekanism och terapeutisk potential. // Curr Opin Immunol. 2007. V. 19. Nr 5. s. 488-496.
258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Direkt observation av en cytosinanalog som bildar fem vätebindningar till guanosin: guanidino G-klämma. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. V. 41. Nr 1. S. 115-117.
259 Cowling V.H., Cole M.D. Mekanism för transkriptionell aktivering av Myc-onkoproteinerna. // Semin Cancer Biol. 2006. V. 16. Nr 4. s. 242-252.
260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Cancerterapi: riktar in sig på den mörka sidan av Myc. // Eur J Cancer. 2005. V. 41. Nr 16. s. 2485-2501.
261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. Icke-transkriptionell kontroll av DNA-replikation av c-myc. // Natur. 2007. V. 448. Nr 7152. s. 445-451.
262. Spencer C.A., Groudine M. Kontroll av c-myc-reglering i normala och neoplastiska celler. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. S. 1-48.
263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. MYC-onkogener och human neoplastisk sjukdom. //Onkogen. 1999. V. 18. Nr 19. s. 3004-3016.
264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Parakrin reglering av angiogenes och adipocytdifferentiering under in vivo adipogenes. // Circ Res. 2003. V. 93. Nr 9. P.e88-97.
265. Sears R.C. Livscykeln för C-myc: från syntes till nedbrytning. // Cellcykel. 2004. V. 3. Nr 9. s. 1133-1137.
266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. Svar på antiangiogenesbehandling av spontana autoktona tumörer och deras isotransplantat. // Cancer Res. 2003. V. 63. Nr 4. s. 747-751.
267 Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc är en metastasgen för icke-småcellig lungcancer. //PLOS One. 2009. V. 4. Nr 6. P.e6029.
268. Ahmed F.E. Molekylära markörer som förutsäger svar på tjocktarmscancerterapi. // Expert Rev Mol Diagn. 2005. V. 5. Nr 3. s. 353-375.
269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. Nedströmsmål för tillväxtfaktor och östrogensignalering och endokrin resistens: de potentiella rollerna för c-Myc, cyclin Dl och cyclin E. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12 Suppl 1. P. S47-59.
270. Blackburn E.H. Telomerer: struktur och syntes. // J Biol Chem. 1990. V. 265. Nr 11. s. 5919-5921.
271. Olovnikov A.M. En teori om marginotomi. Den ofullständiga kopieringen av mallmarginalen i enzymsyntes av polynukleotider och biologisk betydelse av fenomenet. // J Theor Biol. 1973. V. 41. Nr 1. S. 181-190.
272. Wright W.E., Shay J.W. Tvåstegsmekanismen som kontrollerar cellulär åldrande och odödlighet. // Exp Gerontol. 1992. V. 27. Nr 4. s. 383-389.
273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Telomere architecture. // EMBO Rep. 2002. V. 3. Nr 12. s. 1139-1145.
274. Liu J.P. Studier av de molekylära mekanismerna i regleringen av telomerasaktivitet. // FASEB J. 1999. V. 13. Nr 15. s. 2091-2104.
275. Wu K. J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Direkt aktivering av TERT-transkription genom c-MYC. // Nat Genet. 1999. V. 21. Nr 2. s. 220224.
276. Tian X., Chen B., Liu X. Telomer och telomeras som mål för cancerterapi. // Appl Biochem Biotechnol. V. 160. Nr 5. s. 1460-1472.
277 Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Liposomsammansättningen är viktig för retention av liposomal rhodamin i P-glykoprotein-överuttryckande cancerceller. // Drug Deliv. 2009. V. 16. Nr 5. s. 261-267.
278 Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Liposominkapslad daunorubicin för PGP-relaterad multidrogresistens. // Br J Haematol. 1999. V. 106. Nr 1. s. 92-99.
279 Morinaga T., Sakai M., Wegmann T. G., Tamaoki T. Primära strukturer av humant alfa-fetoprotein och dess mRNA. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. Nr 15. s. 4604-4608.
280. Bogush T., Robert J. Jämförande utvärdering av den intracellulära ackumuleringen och DNA-bindningen av idarubicin och daunorubicin i känsliga och multiresistenta humana leukemi K562-celler. // Anticancer Res. 1996. V. 16. Nr 1. s. 365-368.
281. Cartier R., Reszka R. Användning av syntetiska peptider som innehåller nukleära lokaliseringssignaler för icke-virala genöverföringssystem. // Gene Ther. 2002. V. 9. Nr 3. s. 157-167.
282. Collas P., Alestrom P. Nukleära lokaliseringssignaler: en drivkraft för nukleär transport av plasmid-DNA i zebrafisk. // Biochem Cell Biol. 1997. V. 75. Nr 5. s. 633-640.
283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Faktorer som påverkar förmågan hos nukleära lokaliseringssekvenspeptider för att förbättra icke-viral genleverans. // Biokonjugatkemi. 2003. V. 15. Nr 1. S. 152-161.
284. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Syntes av 2'-0-2-[(N,N-dimetylamino)oxi.etyl]-modifierade nukleosider och oligonukleotider // J Org Chem. 2002. V. 67. Nr 2. P. 357-369.
285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Cytotoxiska effekter av ett doxorubicin-transferrinkonjugat i multiresistenta KB-celler. // Biochem Pharmacol. 1996. V. 51. Nr 4. s. 489-493.
286. Lemieux P., Sida M. Känslighet hos multiresistenta MCF-7-celler för ett transferrin-doxorubicinkonjugat. // Anticancer Res. 1994. V. 14. Nr 2A. s. 397-403.
287 Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Cellulär ackumulering och cytotoxicitet av makromolekylära platinakomplex i cisplatinresistenta tumörceller. // J Control Release. 2008. V. 131. Nr 2. S. 100-106.
288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Känslighet hos multiläkemedelsresistenta KB-C1-celler mot ett antikropp-dextran-adriamycinkonjugat. // Anticancer Res. 1989. V. 9. Nr 3. s. 637-641.
289. Chitambar C.R. Galliumföreningar som antineoplastiska medel. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. Nr 6. s. 547-552.
290. Ehrlich P. Cellernas partiella funktion. (Nobelpristal hölls den 11 december 1908 i Stockholm).. // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. V. 5. Nr 2. s. 67-86.
291 Butcher E.C., Weissman I.L. Direkt fluorescerande märkning av celler med fluorescein eller rhodamin isotiocyanat. I. Tekniska aspekter. // J Immunol Methods. 1980. V. 37. Nr 2. P. 97108.
292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. Kvantifiering genom flödescytofluorimetri av HLA klass I-molekyler vid ytan av murina celler transformerade av klonade HLA-gener. // J Immunol Methods. 1983. V. 61. Nr 3. s. 301-315.
293. Fenton C., Perry C.M. Spotlight på gemtuzumab ozogamicin vid akut myeloid leukemi. // BioDrugs: klinisk immunterapi, bioläkemedel och genterapi. 2006. V. 20. Nr 2. s. 137-139.
294 Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptormedierad endocytos och återvinning av alfa-fetoprotein i humana B-lymfom och T-leukemiceller. // Int J Cancer. 1991. V. 47. Nr 1. s. 110-117.
295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Aktivering av en alfa-fetoprotein/receptorväg i humana normala och maligna mononukleära celler från perifert blod. // Leukemi. 1993. V. 7. Nr 11. P. 1807-1816.
296. Biaglow J.E., Miller R.A. Tioredoxinreduktas/tioredoxinsystemet: nya redoxmål för cancerterapi. // Cancer Biol Ther. 2005. V. 4. Nr 1. S. 6-13.
297. Arunachalam B., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Enzymatisk reduktion av disulfidbindningar i lysosomer: karakterisering av ett gamma-interferon-inducerbart lysosomalt tiolreduktas (GILT). // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. Nr 2. s. 745-750.
298. Kooistra T., Millard P.C., Lloyd J.B. Tiolers roll i nedbrytning av proteiner av katepsiner. // Biochem J. 1982. V. 204. Nr 2. s. 471-477.
299 Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Klyvning av disulfidbindningar i endocyterade makromolekyler. En bearbetning som inte är associerad med lysosomer eller endosomer. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx y y V/ . t ^ ■ v<-л. л. » x w I vy v x v f w
300. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Likhet mellan naturligt och rekombinant humant alfa-fetoprotein som hämmare av östrogenberoende bröstcancertillväxt. // Bröstcancer Res Treat. 1997. V. 45. Nr 2. S. 169-179.
301. DiMarco A. Adriamycin (NSC-123127): sätt och verkningsmekanism. // Cancer Chemother. Rep. 1975. V. 6. S. 91-106.
302. Hamza A., Sarma M.H., Sarma R.H. Plausibel interaktion av en alfa-fetoproteincyklopeptid med den G-proteinkopplade receptormodellen GPR30: dockningsstudie genom molekylär dynamik simulerad hybridisering. // J Biomol Struct Dyn. 2003. V. 20. Nr 6. s. 751-758.
303 Tan W., Loke Y. H., Stein C. A., Miller P., Colombini M. Fosforothioate-oligonukleotider blockerar VDAC-kanalen. // Biophys J. 2007. V. 93. Nr 4. s. 1184-1191.
304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. Ett farmakologiskt mål för G3139 i melanomceller kan vara mitokondriella VDAC. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. Nr 19. s. 7494-7499.
305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein C.A., Colombini M. Fosforothioate-oligonukleotider minskar mitokondriell yttre membranpermeabilitet för ADP. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. V. 292. Nr 4. P. C1388-1397.
306. Carpenter G., Cohen S. Epidermal tillväxtfaktor. // Annu Rev Biochem. 1979. V. 48. S. 193-216.
307 Saeki T, Takashima S, Tachibana M, Koga M, Hiyama E, Salomon D.S., Holland J.F., Ohnuma T. Hämmande effekt av telomer-härmande fosforotioat-oligodeoxinukleotider (S-ODNS) på humana tumörcellinjer. // Onkologi. 1999. V. 57 Suppl 2. S. 27-36.
308. Sida T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. De cytotoxiska effekterna av enkelsträngade telomerhärmar på OMA-BL1-celler. // Exp Cell Res. 1999. V. 252. Nr 1. S. 41-49.
309. Berkers J.A., van Bergen en Henegouwen P.M., Boonstra J. Tre klasser av epidermala tillväxtfaktorreceptorer på HeLa-celler. // J Biol Chem. 1991. V. 266. Nr 2. s. 922-927.
310. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Förbättring av läkemedelskänslighet hos mänskliga maligniteter genom epidermal tillväxtfaktor. // Br J Cancer. 1995. V. 72. Nr 3. s. 615-619.
311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molecular manifestations and molecular determinants of telomer cappping. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. S. 253-263.
312. Collas P., Alestrom P. Nukleära lokaliseringssignaler förbättrar könslinjeöverföringen av en transgen i zebrafisk. // Transgenic Res. 1998. V. 7. Nr 4. s. 303-309.
313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. En ny peptidvektor för effektiv leverans av oligonukleotider till däggdjursceller. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. Nr 14. s. 2730-2736.
314 Sinha B.K., Politi P.M. Antracykliner. // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1990. V. 11. S. 45-57.
315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamiciner, en klass av potenta antitumörantibiotika: verkningsmekanism. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. Nr 1. S. 2-6.
316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Selektiv cytotoxicitet av adriamycinimmunkonjugat av monoklonal antikropp MSN-1 mot endometrieadenokarcinom in vitro och in vivo. // Oncol Rep. 2000. V. 7. Nr 5. s. 1099-1106.
317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. Effektiviteten av ett adriamycinimmunkonjugat som känner igen C-erbB-2-produkten på bröstcancercellinjer. // SurgToday. 1996. V. 26. Nr 7. s. 501-507.
318. Yamamoto K., Acton E.M., Henry D.W. Antitumöraktivitet hos vissa derivat av daunorubicin vid amino- och metylketonfunktionerna. // Journal of Medicinal Chemistry. 2002. V. 15. Nr 8. s. 872-875.
319. Arnon R., Sela M. Effektivitet in vitro och in vivo av konjugat av daunomycin med antitumörantikroppar. // Immunol Rev. 1982. V. 62. S. 5-27.
320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. Den kovalenta bindningen av daunomycin och adriamycin till antikroppar, med retention av både läkemedels- och antikroppsaktiviteter. // Cancer Res. 1975. V. 35. Nr 5. s. 1175-1181.
321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. Framtiden för antisensterapi: kombination med cancerbehandlingar. // Onkogen. 2003. V. 22. Nr 42. s. 6579-6588.
Observera att de vetenskapliga texterna som presenteras ovan läggs ut för granskning och erhålls genom original avhandlingstextigenkänning (OCR). I detta sammanhang kan de innehålla fel relaterade till ofullkomligheten i igenkänningsalgoritmer. Det finns inga sådana fel i PDF-filerna för avhandlingar och sammanfattningar som vi levererar.
Liknande artiklar
-
När en man är emot ett barn, hur blir man gravid utan hans vetskap?
Ibland kan man bli gravid av oaktsamhet. För att förhindra att detta inträffar är det viktigt att veta hur du kan bli gravid med ett barn av misstag och vilka medel du kan använda för att undvika oönskad graviditet. Även i den här artikeln kan du hitta information om ...
-
Vilka stenar och amuletter är lämpliga för Oxen enligt horoskopet och födelsedatumet Elefanttalisman för Oxen
April-maj Oxen (21 april - 20 maj) är mätt, inte kinkig och kolossalt produktiv! Deras avundsvärda envishet kan få andra att ta tag i, men de vet exakt vad de gör och varför de behöver det. Bland de positiva...
-
Restriktioner för åtkomst till data i roller 1c
Alla användarrättighetsinställningar som vi kommer att göra inom ramen för denna artikel finns i avsnitt 1C 8.3 "Administration" - "Användar- och rättighetersinställningar". Denna algoritm är liknande i de flesta konfigurationer på ...
-
1c startar en tunn klient istället för en tjock
Plattformar: 1C: Enterprise 8.3, 1C: Enterprise 8.2, 1C: Enterprise 8.1 Konfigurationer: Alla konfigurationer2012-11-16 21362 De lanseras genom att specificera speciella ...
-
Bevis på kända sätt att stjäla el Hur man tar reda på vem som stjäl el
Höjningen av energitaxor är ett av de slående dragen i den fördjupade ekonomiska krisen. I detta sammanhang är stöld av el och de problem som är förknippade med dess upptäckt av största vikt. Sätt att upptäcka stöld ...
-
Funktioner för montering av uttag och strömbrytare på olika ytor
Hälsningar till alla läsare av vår blogg Idag, kära läsare, vill jag lyfta fram ämnet om hur man installerar uttag. Denna procedur efterfrågas mycket ofta när man byter ut ett gammalt uttag med ett nytt i händelse av ett haveri, när ...