Definirea reactiei de aglutinare. Reacția de aglutinare, tipurile sale, metodele de producție, aplicarea. Reacția de neutralizare. liză, reacție opsonofagocitară, reacție de hipersensibilitate

STUDII IMUNOMMICROBIOLOGICE

Metodele imunologice sunt folosite pentru a rezolva multe probleme:

1. Evaluarea stării sistemului imunitar uman (status imunitar) prin determinarea caracteristicilor cantitative și funcționale ale celulelor sistemului imunitar și ale produselor acestora.

2. Determinarea compoziției și caracteristicilor țesuturilor umane: grupe sanguine, factor Rh, antigeni de transplant.

3. Diagnosticul bolilor infecțioase și rezistența la acestea prin detectarea și stabilirea titrurilor de anticorpi (serodiagnostic), identificarea antigenelor patogene din organism și determinarea reacțiilor celulare la acești antigeni.

4. Identificarea seroidică a culturilor de bacterii și virusuri izolate din corpul oamenilor și al animalelor.

5. Detectarea în corpul uman și în mediul extern a oricăror substanțe care au proprietăți antigenice sau haptene (hormoni, enzime, otrăvuri, medicamente, medicamente etc.).

6. Identificarea stărilor imunopatologice, alergiilor, transplantului și reacțiilor antitumorale.

Procesul de interacțiune dintre antigen și anticorp în reacțiile serologice are loc în două faze:

1) specifice- faza de interacţiune în care apare o combinaţie complementară a centrilor activi ai anticorpilor (paratopilor) şi epitopilor antigenici. Această fază durează de obicei câteva secunde sau minute;

2) nespecific- faza de manifestare, caracterizată prin semne externe ale formării complexelor imune. Această fază se poate dezvolta de la câteva minute la câteva ore.

Interacțiunea specifică optimă a anticorpilor cu antigenul are loc într-o soluție izotonă cu un pH apropiat de neutru. Reacția antigen-anticorp într-un sistem in vitro poate fi însoțită de apariția mai multor fenomene

· aglutinare,

· precipitații,

· liză.

Manifestările externe ale reacției depind de proprietățile fizico-chimice ale antigenului (mărimea particulelor, starea fizică), de clasa și tipul de anticorpi (compleți și incompleti), precum și de condițiile experimentale (consistență medie, concentrație de sare, pH, temperatură). ).

Polivalența antigenelor și anticorpilor asigură formarea de agregate vizibile cu ochiul liber. Acest lucru are loc în conformitate cu teoria formării rețelei, conform căreia alte molecule de anticorpi și antigen sunt atașate secvenţial la complexul antigen-anticorp rezultat. Ca urmare, se formează structuri de rețea, care se transformă în agregate care precipită. Natura și severitatea reacției depind de raportul cantitativ dintre antigeni și anticorpi. Cele mai intense reacții apar atunci când reactivii sunt în proporții echivalente.

O condiție necesară pentru formarea unei rețele (rețele) este prezența a mai mult de trei determinanți antigenici pentru fiecare moleculă de antigen și a doi centri activi pentru fiecare moleculă de anticorp. Moleculele de antigen sunt noduri de rețea, iar moleculele de anticorpi sunt legături de legătură. Regiunea raporturilor optime (zona de echivalență) ale concentrațiilor de antigen și anticorpi, când nici antigenele libere, nici anticorpii liberi nu sunt detectați în supernatant după formarea sedimentului.

Agregatele care pot precipita se formează atunci când antigenele se combină cu anticorpi completi. Anticorpii incompleti (monovalenți) nu provoacă formarea de structuri de rețea și agregate mari. Pentru a detecta astfel de anticorpi, se folosesc metode speciale bazate pe utilizarea antiglobulinelor (reacția Coombs).

Reacțiile serologice, datorită specificității și sensibilității lor ridicate, sunt utilizate pentru detectarea și cuantificarea antigenelor și anticorpilor. Cantitatea de imunoreactivi din reacții este exprimată prin titru - diluția maximă de ser sau antigen la care se observă încă o reacție.

Reacțiile serologice din laboratoarele microbiologice și imunologice sunt utilizate în două scopuri:

1) pentru seroidentificarea microorganismelor, toxinelor, antigenelor în general folosind un anticorp cunoscut (ser de diagnostic imunitar),

2) pentru serodiagnostic - determinarea naturii anticorpului din serul sanguin al pacientului pentru boli bacteriene, virale și mai rar alte boli infecțioase folosind un antigen cunoscut (diagnosticum).

Pentru a determina genericul, specia și tipul de antigen, sunt necesare seruri de diagnostic imun cunoscut. Ele sunt obținute prin administrare repetată la animale (de obicei iepuri) în doze crescânde de microorganisme ucise sau vii, produsele lor de descompunere, toxine neutralizate sau native. După un anumit ciclu de imunizare a animalelor, se efectuează sângerare masivă sau sângerare totală a animalului. Sângele colectat într-un recipient steril este plasat mai întâi într-un termostat la o temperatură de 37°C timp de 4 - 6 ore pentru a accelera coagularea, apoi într-o cutie de gheață timp de o zi. Serul transparent rezultat este aspirat într-un recipient steril, se adaugă conservanți, se determină titrul de anticorpi, se verifică sterilitatea și se toarnă în fiole.

Sunt folosite neadsorbităȘi adsorbit seruri de diagnostic. Serurile neadsorbite au titruri mari de anticorpi, dar sunt capabile să dea reacții de grup (încrucișate).

Serurile adsorbite se caracterizează printr-o specificitate strictă de acțiune (reacționează numai cu un antigen omolog). Se numesc seruri care conțin anticorpi la un singur antigen specific monoreceptor.

De asemenea, produc seruri marcate cu fluorocromi, enzime și radioizotopi, care fac posibilă detectarea chiar și a urmelor de antigen cu un grad ridicat de acuratețe.

Suspensiile de bacterii vii sau ucise, produsele lor de degradare, toxinele și virusurile sunt utilizate ca antigene (diagnosticums) în reacțiile serologice. În unele cazuri, se folosesc extracte sau antigene izolate chimic din microorganisme și țesuturi animale.

Toate metodele imunomicrobiologice pot fi împărțite în 3 grupe:

1) pe baza interacțiunea directă a antigenului cu anticorpul(fenomene de aglutinare, precipitare, hemaglutinare, imobilizare etc.);

2) pe baza interacțiunea mediată a antigenului cu anticorpul(reacții de hemaglutinare indirectă, coaglutinare, aglutinare latex, aglomerare carbon, aglutinare bentonită, fixare a complementului etc.);

3) folosind anticorpi sau antigeni marcați(metoda cu anticorpi fluorescenți, teste imunosorbente și radioimuno legate de enzime și alte metode).

REACȚII DE AGLUTINARE

Aceste reacții implică antigeni sub formă de particule (celule microbiene, globule roșii și alți antigeni corpusculari), care sunt lipiți împreună de anticorpi și precipitați.

Pentru a efectua o reacție de aglutinare(RA) sunt necesare trei componente: 1) antigen (aglutinogen);

2) anticorpi (aglutinină)

3) electrolit (soluție izotonică de clorură de sodiu).

Reacția aproximativă de aglutinare (RA)

Un indicativ, sau o placă, RA este plasat pe o lamă de sticlă la temperatura camerei. Pentru a face acest lucru, utilizați o pipetă Pasteur pentru a aplica separat pe sticla o picătură de ser la o diluție de 1:10 până la 1:20 și o picătură de control de soluție izotonică de clorură de sodiu. Coloniile sau o cultură zilnică de bacterii (o picătură de diagnosticum) sunt introduse în ambele bucle bacteriologice și amestecate temeinic. Reacțiile sunt luate în considerare vizual după câteva minute, uneori folosind o lupă (x5). Cu RA pozitivă, se observă apariția de fulgi mari și mici în picătura de ser; cu RA negativă, serul rămâne uniform tulbure.

Reacție de aglutinare detaliată pentru a identifica titrul de anticorpi specifici la un pacient.

RA completă pentru serodiagnostic se face în serul pacienților. De asemenea, se diluează într-o soluție izotonică de clorură de sodiu de la 1:50 - 1:100 la 1:800 sau 1:1600.Deoarece titrurile serice mai mici pot conține aglutinine normale găsite la persoanele sănătoase sau la pacienții cu alt diagnostic (titru diagnostic). Ca antigen în această reacție, se folosesc diagnostice - suspensii cunoscute, de obicei din bacterii ucise.

1 ml soluție izotonică de clorură de sodiu se toarnă mai întâi în tuburi de aglutinare. La primul se adaugă 1 ml de ser diluat 1:100, iar după amestecare, se transferă 1 ml în al doilea, de la al doilea în al treilea etc. Se adaugă 1-2 picături dintr-o suspensie bacteriană care conține 3 miliarde de corpi microbieni în 1 ml la diluțiile de două ori rezultate de ser (de la 1:100 la 1:1600 sau mai mult). Tuburile se agită și se introduc într-un termostat la 37°C timp de 2 ore, apoi se păstrează la temperatura camerei timp de 24 de ore.

Reacția de aglutinare detaliată este luată în considerare prin evaluarea succesivă a fiecărei eprubete, începând cu cele de control, cu agitare ușoară. Nu ar trebui să existe aglutinare în tuburile de control. Intensitatea reacţiei de aglutinare este marcată cu următoarele semne: ++++ - aglutinare completă (fulgi de aglutinare într-un lichid transparent absolut); +++ - aglutinare incompletă (fulgi într-un lichid ușor opalescent); ++ - aglutinare parțială (fulgii sunt clar vizibili, lichidul este ușor tulbure); + - aglutinare slabă, discutabilă - lichidul este foarte tulbure, fulgii din el sunt greu de distins; - - absenta aglutinarii (lichidul este uniform tulbure).

Titrul seric este considerat ultima sa diluție, în care intensitatea aglutinarii este evaluată ca fiind nu mai puțin de două plusuri (++)

Aglutinarea este lipirea și precipitarea microbilor sau a altor celule sub influența anticorpilor în prezența unui electrolit (soluție izotonică de clorură de sodiu). Grupurile de bacterii (celule) lipite se numesc aglutinat. Următoarele componente sunt necesare pentru reacția de aglutinare:

1. Anticorpi (aglutinine) care se găsesc în serul unui animal bolnav sau imun.

2. Antigen - o suspensie de microbi vii sau uciși, globule roșii sau alte celule.

3. Soluție izotonică (0,9%) de clorură de sodiu.

Reacția de aglutinare pentru serodiagnostic este utilizată pentru febra tifoidă și febra paratifoidă (reacția Vidal), bruceloză (reacția Wright și Heddleson), tularemie etc. Anticorpul este serul pacientului, iar antigenul este un microbi cunoscut. La identificarea microbilor sau a altor celule, suspensia lor este folosită ca antigen, iar un ser imunitar cunoscut este folosit ca anticorp. Această reacție este utilizată pe scară largă pentru a diagnostica infecțiile intestinale, tusea convulsivă etc.

Metode de stadializare a RA

RA aproximativă pe sticlă

RA desfășurat

(metoda volumului)

Reacția de coaglutinare

RA desfăcut pe sticlă (seroidentificare)

Reacția de aglutinare pe sticlă. Două picături de ser specific (adsorbit) și o picătură de soluție izotonică de clorură de sodiu sunt aplicate pe o lamă de sticlă fără grăsimi. Serurile neadsorbite sunt prediluate într-un raport de 1:5 - 1:100. Picăturile trebuie aplicate pe sticlă, astfel încât să existe o distanță între ele. Cultura este măcinată bine pe sticlă cu o buclă sau pipetă și apoi se adaugă la o picătură de soluție izotonă de clorură de sodiu și la una dintre picăturile de ser, amestecând fiecare până când se formează o suspensie omogenă. O picătură de ser fără cultură este un control al serului.

Atenţie! Nu puteți transfera cultura din ser într-o picătură de soluție izotonică de clorură de sodiu, care servește drept control antigen. Reacția are loc la temperatura camerei timp de 1-3 minute. Dacă controlul seric rămâne transparent, se observă o turbiditate uniformă în controlul antigenului, iar în picătură apar fulgi de aglutinat în care cultura este amestecată cu serul pe fondul unui lichid limpede, rezultatul reacției este considerat pozitiv.

Diagnostic Fiziologic

ser + soluție de cultură + cultură

Reacția de aglutinare detaliată (metoda volumului). Se prepară diluții de ser în serie, cel mai adesea duble. Metoda se numește volumetrică. Pentru a determina titrul de anticorpi din serul sanguin, luați 6 tuburi. Se toarnă 1 ml din diluția serului original 1:50 în prima eprubetă și se adaugă 1 ml de soluție salină în toate cele 6 eprubete folosind o pipetă gradată. Prima eprubetă va produce o diluție a serului de 1:100 cu un volum de 2 ml. Transferați 1 ml din prima eprubetă în a doua eprubetă, unde diluția devine 1:200. Așadar, faceți o serie de diluții în serie ale serului în primele 5 eprubete (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Din a cincea eprubetă se toarnă 1 ml în soluția dezinfectantă. Adăugați 2 picături de diagnosticum în toate cele 6 eprubete. Al șaselea tub este un control de cultură, deoarece conține doar soluție salină și diagnosticum.

Un astfel de control este necesar pentru a exclude aglutinarea spontană a culturii. Tuburile se agită și se introduc într-un termostat la o temperatură de 37°C timp de 2 ore, apoi se lasă o zi la temperatura camerei, după care se înregistrează rezultatele reacției de aglutinare. La efectuarea unei reacții de aglutinare cu serurile copiilor în primele luni de viață, din cauza inferiorității funcționale a formării anticorpilor, este necesar să se identifice titruri mai mici de anticorpi, care se ține cont la diluarea serului. Diluția inițială a serului este de 1:25. În prima eprubetă se obține o diluție de 1:50, apoi 1:100 etc.

Dacă rezultatul reacției este pozitiv, eprubetele prezintă celule blocate sub formă de boabe sau fulgi pe fundalul unui lichid limpede. Aglutinatul se depune treptat la fund sub forma unei „umbrele”, iar lichidul de deasupra sedimentului devine limpede. Controlul antigenului este uniform tulbure.

Pe baza naturii sedimentului, se distinge aglutinarea cu granulație fină și cea grosieră (fulgi). Aglutinarea cu granulație fină se obține atunci când se lucrează cu O-sera. Granulație grosieră - când microbii mobili interacționează cu serul H flagelar. Apare mai repede decât cel cu granulație fină, iar sedimentul rezultat este foarte liber și ușor de spart.

Intensitatea reacției este exprimată astfel:

Toate celulele s-au așezat, lichidul din eprubetă este complet transparent. Rezultatul reacției este puternic pozitiv;

Există mai puțin sediment, lichidul nu se limpezește complet. Rezultatul reacției este pozitiv;

Există și mai puțin sediment, lichidul este mai tulbure. Rezultatul reacției este îndoielnic;

Există un ușor sediment în partea de jos a eprubetei, lichidul este tulbure. Rezultat discutabil al reacției;

Nu există sediment, lichidul este uniform tulbure, ca în controlul antigenului. Rezultatul reactiei negative

Aceste reacții implică antigeni sub formă de particule (celule microbiene, globule roșii și alți antigeni corpusculari), care sunt lipiți împreună de anticorpi și precipitați.

Pentru a efectua o reacție de aglutinare(RA) sunt necesare trei componente: 1) antigen (aglutinogen);

2) anticorpi (aglutinină)

3) electrolit (soluție izotonică de clorură de sodiu).

Reacția aproximativă de aglutinare (RA)

Un indicativ, sau o placă, RA este plasat pe o lamă de sticlă la temperatura camerei. Pentru a face acest lucru, utilizați o pipetă Pasteur pentru a aplica separat pe sticla o picătură de ser la o diluție de 1:10 până la 1:20 și o picătură de control de soluție izotonică de clorură de sodiu. Coloniile sau o cultură zilnică de bacterii (o picătură de diagnosticum) sunt introduse în ambele bucle bacteriologice și amestecate temeinic. Reacțiile sunt luate în considerare vizual după câteva minute, uneori folosind o lupă (x5). Cu RA pozitivă, se observă apariția de fulgi mari și mici în picătura de ser; cu RA negativă, serul rămâne uniform tulbure.

Orez. 2. Reacția aproximativă de aglutinare.

Reacție de aglutinare detaliată pentru a identifica titrul de anticorpi specifici la un pacient.

RA completă pentru serodiagnostic se face în serul pacienților. De asemenea, se diluează într-o soluție izotonică de clorură de sodiu de la 1:50 - 1:100 la 1:800 sau 1:1600.Deoarece titrurile serice mai mici pot conține aglutinine normale găsite la persoanele sănătoase sau la pacienții cu alt diagnostic (titru diagnostic). Ca antigen în această reacție, se folosesc diagnostice - suspensii cunoscute, de obicei din bacterii ucise.

1 ml soluție izotonică de clorură de sodiu se toarnă mai întâi în tuburi de aglutinare. La primul se adaugă 1 ml de ser diluat 1:100, iar după amestecare, se transferă 1 ml în al doilea, de la al doilea în al treilea etc. Se adaugă 1-2 picături dintr-o suspensie bacteriană care conține 3 miliarde de corpi microbieni în 1 ml la diluțiile de două ori rezultate de ser (de la 1:100 la 1:1600 sau mai mult). Tuburile se agită și se introduc într-un termostat la 37°C timp de 2 ore, apoi se păstrează la temperatura camerei timp de 24 de ore.

Reacția de aglutinare detaliată este luată în considerare prin evaluarea succesivă a fiecărei eprubete, începând cu cele de control, cu agitare ușoară. Nu ar trebui să existe aglutinare în tuburile de control. Intensitatea reacţiei de aglutinare este marcată cu următoarele semne: ++++ - aglutinare completă (fulgi de aglutinare într-un lichid transparent absolut); +++ - aglutinare incompletă (fulgi într-un lichid ușor opalescent); ++ - aglutinare parțială (fulgii sunt clar vizibili, lichidul este ușor tulbure); + - aglutinare slabă, discutabilă - lichidul este foarte tulbure, fulgii din el sunt greu de distins; - - absenta aglutinarii (lichidul este uniform tulbure).

Titrul seric este considerat ultima sa diluție, în care intensitatea aglutinarii este evaluată ca fiind nu mai puțin de două plusuri (++)

Orez. 7. Reacția de aglutinare detaliată.

Reacție de hemaglutinare indirectă (pasivă) (IRHA, RPHA)

Reacția este dată:

1) pentru detectarea polizaharidelor, proteinelor, extractelor bacteriene și a altor substanțe foarte dispersate, rickettsia și virusurile, ale căror complexe cu aglutinine nu pot fi observate în RA convenționale;

2) pentru a detecta anticorpi în serul pacienților la aceste substanțe foarte dispersate și microorganisme mici.

Aglutinarea indirectă sau pasivă este înțeleasă ca o reacție în care anticorpii interacționează cu antigeni pre-adsorbiți pe particule inerte (latex, celuloză, polistiren, oxid de bariu etc. sau globule roșii de oaie, grupa sanguină I(0) umană)

În reacția de hemaglutinare pasivă (RPHA), globule rosii. Globulele roșii încărcate cu antigen se lipesc împreună în prezența anticorpilor specifici la acest antigen și precipită. Eritrocitele sensibilizate la antigen sunt utilizate în RPGA ca diagnostic eritrocitar pentru detectarea anticorpilor (serodiagnostic). Dacă celulele roșii din sânge sunt încărcate cu anticorpi (diagnostic de anticorpi eritrocitari), acesta poate fi utilizat pentru a detecta antigene.

Orez. 3. Schema RPGA: globulele roșii (1), încărcate cu antigen (3), sunt legate de anticorpi specifici (4).

Înscenare. În godeurile plăcilor de polistiren se prepară o serie de diluții seriate de ser. Adăugați 0,5 ml de ser evident pozitiv în penultimul godeu și 0,5 ml de soluție fiziologică (martori) în ultimul godeu. Apoi se adaugă 0,1 ml de diagnostic de eritrocite diluat în toate godeurile, se agită și se plasează într-un termostat timp de 2 ore.

Contabilitate. Într-un caz pozitiv, celulele roșii din sânge se instalează în partea de jos a găurii sub forma unui strat uniform de celule cu o margine îndoită sau zimțată (umbrelă inversată); în caz negativ, se instalează sub forma unui nasture sau a unui inel. .

Fig.4. Contabilitate pentru RNGA (RPGA).

Contabilizarea rezultatelor RNGA efectuate pentru detectarea toxinei botulinice.

Agentul cauzator al botulismului, Clostridium botulinum, produce toxine din șapte serovare (A, B, C, D, E, F, G), dar sunt mai frecvente serovarele A, B și E. Toate toxinele diferă în proprietăți antigenice și pot să fie diferențiate în reacții folosind seruri specifice tipului . În acest scop, se poate realiza o reacție de hemaglutinare pasivă (indirectă) cu serul pacientului, în care se presupune prezența toxinei, și eritrocite încărcate cu anticorpi ai serurilor anti-botulinice antitoxice de tipurile A, B, E. Normal serul servește drept control.

Orez. 3. Declarația și rezultatul RNGA.

Contabilitate. Într-un caz pozitiv, celulele roșii din sânge se instalează în partea de jos a găurii sub forma unui strat uniform de celule cu o margine îndoită sau zimțată (umbrelă inversată); în caz negativ, se instalează sub forma unui nasture sau a unui inel. .

Concluzie: Toxina botulinica de tip E a fost detectata in serul pacientului.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (HAI).

Orez. 8. Reacția de inhibiție a hemaglutinării (HAI) (schemă).

Principiul reacției se bazează pe capacitatea AT de a lega diferite viruși și de a le neutraliza, făcând imposibilă aglutinarea globulelor roșii. Vizual, acest efect se manifestă prin „inhibarea” hemaglutinării. RTGA este utilizat în diagnosticul infecțiilor virale pentru a identifica antihemaglutininele specifice și pentru a identifica diferite viruși prin hemaglutininele lor, care prezintă proprietățile Ag.

Tiparea virusului se realizează într-o reacție RTGA cu un set de seruri specifice tipului. Rezultatele reacției sunt luate în considerare de absența hemaglutinării. Subtipurile de virus de tip A cu antigene H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 și altele pot fi diferențiate în RTGA cu un set de seruri omoloage specifice tipului

Orez. 9. Rezultate RTGA pentru tiparea virusului gripal

Legendă: - inhibarea hemaglutinării (buton); - hemaglutinare (umbrelă).

Concluzii: Materialul studiat conține virusul gripal tip A cu antigenul H3N2

Reacții imune. Aplicarea reacțiilor imune în diagnosticul bolilor infecțioase.

PLAN:

Tipuri de reacții imune.

Condiții pentru efectuarea reacțiilor serologice.

Cerințe de ser.

Conceptul de rezultate pozitive și negative.

CUPRINS PRINCIPAL:

Tipuri de reacții imune.

Reacție imunologică – Aceasta este interacțiunea unui antigen cu un anticorp, care este determinată de interacțiunea specifică a centrilor activi ai anticorpului (paratop) cu epitopii antigenilor.

Clasificarea generală a reacțiilor imunologice:

reacții serologice – reacții între antigene (Ag) și anticorpi (Ig)

in vitro ;

reacții celulare cu participarea celulelor imunocompetente;

teste de alergie – detectarea hipersensibilității.

Reacții serologice: 1) definiție, 2) faze, 3) scopuri, 4) clasificare generală.

1) Definiție

Metode de cercetare serologică (din latinescul Serum - ser și logos - studiu) folosind reacția antigen-anticorp.

2) Faze

2 faze de interactiune:

eu. Specific (vizibil) – apare rapid, anticorpii se combină cu antigenele corespunzătoare. În această fază, grupurile determinante de antigene (AG) și centrii activi de anticorpi (AT) interacționează.

Forțele implicate în formarea complexului AG + AT sunt:

pandantiv;

van der Waals

Legături de hidrogen.

Nu există modificări vizibile în această fază. Microscopia electronică arată complexul AG+AT sub forma unei rețele.

II. Nespecific – are loc lent, complexul antigen-anticorp rezultat reacționează cu un factor suplimentar de mediu nespecific în care are loc reacția, iar acesta este vizibil pentru ochi – lipire, dizolvare, fulgi de precipitare etc. În prezența unui electrolit, sarcina scade , solubilitatea scade, se formează conglomerate vizibile, precipitând (aglutinând).

3) Stabilirea obiectivelor :

a) pentru a identifica antigenul (anticorp cunoscut ser de diagnostic):

• în material patologic (diagnostic rapid);

  în cultura pură:

  1. identificarea serologică (identificarea speciei);

     serotiparea (determinarea serovarului) – determinarea tulpinii;

b) pentru a detecta anticorpi (Ig) (antigenul este cunoscut-diagnosticum):

• prezența (reacții calitative);

  cantități (creșterea titrului - metoda „ser pereche”).

4) Clasificare generală reacții serologice :

a) simplu (2-component: Ag+Ig):

Reacții de aglutinare RA (cu antigen corpuscular);

Reacții de precipitare PR (cu antigen solubil);

b) complex (3-component: Ag+Ig+C);

c) folosind o etichetă.

Variante ale reacțiilor de aglutinare și precipitare

Reacția de aglutinare :

Reacția de aglutinare (RA) este o reacție imună de interacțiune a unei suspensii de antigene (eritrocite, bacterii) cu antigene în soluție fiziologică.

În timpul aglutinării, particulele AT se lipesc împreună pentru a forma un sediment floculant.

Reacția de hemaglutinare pasivă (RPHA) este un tip de reacție de aglutinare în care se utilizează un anticorp sau un antigen eritrocite diagnostic (eritrocite cu AT sau AG adsorbite pe suprafața lor).

Celulele roșii acționează ca purtători pasivi în această reacție.

Evaluarea rezultatelor RPGA se realizează după cum urmează:

- la reacție pozitivă globulele roșii aderate pasiv acoperă fundul găurii în formă de U sau V într-un strat uniform cu margini festonate („umbrelă”);

- la reacție negativă (în absența aglutinarii), globulele roșii se acumulează în adâncitura centrală a găurii, formând un „buton” compact cu margini bine definite.

Testul de inhibiție a hemaglutinării (HAI) este utilizat în diagnosticul infecțiilor virale. Unii virusuri conțin pe suprafața lor o proteină numită hemaglutinină, care lipește celulele roșii din sânge. Adăugarea de anticorpi antivirali specifici blochează hemaglutinina virală - nu există hemaglutinare.

Reacția de hemaglutinare indirectă (IRHA) sau reacția Coombs este utilizată pentru a determina anticorpi incompleti. Adăugarea de ser antiglobulinic (AT împotriva Ig umane) îmbunătățește rezultatele reacției. RNGA este utilizat pentru a determina factorul Rh.

Pentru a efectua o reacție de aglutinare (RA), sunt necesare trei componente:

1) antigen (aglutinogen) AG;

2) anticorp(aglutinină) AT;

3) electrolit (soluție izotonică de clorură de sodiu).
Ag + AT + electrolit = aglutinat

Aglutinare (din latină agglutinatio - lipire) - lipire a corpusculilor (bacterii, globule roșii etc.) de către anticorpi în prezența electroliților - clorură de sodiu.

RA se manifestă sub formă de fulgi sau sediment constând din corpusculi (de exemplu, bacterii, globule roșii) „lipiți împreună” de anticorpi.

RA este folosit pentru:

Reacția directă de aglutinare microbiană (RA).

În această reacție, anticorpii (aglutinine) aglutinează direct antigenele corpusculare (aglutinogeni).

Ele sunt de obicei reprezentate de o suspensie de microorganisme inactivate (reacție de aglutinare microbiană).

Pentru a determina tipul de microorganisme, utilizațidiagnostic standard aglutinant ser ( celebrul AT ).

Cele mai frecvente sunt RA lamelară (aproximativă) și expandată.

Placa RA se așează pe sticlă. Este folosit ca metodă accelerată pentru detectarea anticorpilor sau identificarea microorganismelor.

Componente:

1. seruri aglutinante standard de diagnostic (AT);

2. cultura pura in studiu de la pacient;

3. soluție salină.

În cultura pură studiată, antigenele (AG) sunt sub formă de particule (celule microbiene, eritrocite și alți antigeni corpusculari), care sunt lipite împreună de anticorpi și precipitate.

Exemplu:

Înscenare indicativ reactii de aglutinare (RA ) pe sticlă în scopul identificării bacteriilor coliforme.

Aplicați picături pe o lamă de sticlă:

1 dizenterie ;
2 -a picătură: - ser aglutinant împotriva agenților patogenifebră tifoidă ;

(1-2 seruri de diagnostic)
3 -a picătură: - soluție salină (martor).
Adăugați cultura bacteriană pură testată la fiecare picătură. Se amestecă.

Rezultat : pozitiv - prezenta fulgilor de aglutinat,
negativ - absenta fulgilor de aglutinat
Concluzie:Bacteriile studiate sunt agenți cauzali ai febrei tifoide (s-au determinat antigenele).

Pentru a determina AT în serul pacientului (diagnostic serologic), un microbian standarddiagnosticum , conţinând suspensiecelebru microbii sau antigenele acestoraAG .

Determinarea grupelor sanguine ABO (reacție de hemaglutinare (HRA)) – aglutinează globulele roșii.

Componente de reacție:

1. AG (globule roșii) testează sânge

2. AT (eritrotest - zoliclone)

Set de zolicloni:

Reactiv coliclonă anti-A (roz)

Reactiv Coliclone anti-B (albastru)

Reactiv Tsoliklon anti-AV (incolor)

3. electrolit (soluție salină)

Tehnica de determinare:

1 .

Se aplică o picătură (0,1 ml) de zoliconă anti-A, anti-B și anti-AB pe godeurile tabletei (pentru control).

2.

Lângă fiecare picătură de reactiv se aplică o picătură mică (0,05-0,01 ml) din sângele testat.

Apoi, o picătură de zoliclonă este amestecată cu o picătură de sânge folosind o baghetă individuală de sticlă curată.

3.

Reacția de aglutinare se dezvoltă în primele 3-5 secunde când placa este legănată ușor.

Rezultatele reacției sunt luate în considerare la 2,5 - 3 minute după amestecarea picăturilor. De la stânga la dreapta în godeuri sunt anti-A, anti-B, anti-AB.

Un rezultat pozitiv este apariția unui sediment granular (aglutinat).

RA pozitiv (+)

Negativ - fără sedimente.

negativ RA(-)

4.

Analiza rezultatelor.

O(eu) α β – fără aglutinare

A(II) β – aglutinare cu anti-A

B(III) α – aglutinare cu anti-B

AB(IV)O – aglutinare cu anti-A, cu anti-B

Reprezentarea schematică a aglutinarii.

Antigene Ag pe eritrocite (detectabile) + anticorpLA(zoliclon) ser de diagnostic

Contabilizarea aglutinarii în tablete

Reacția de precipitare:

Reacția de precipitare este o reacție imună a interacțiunii antigenului în stare solubilă cu antigenul într-o soluție fiziologică.

În timpul precipitării, se formează un complex imunitar macromolecular, care se manifestă prin trecerea unei soluții coloidale transparente într-o suspensie opacă sau precipitat.

Cantitatea ambilor reactivi trebuie să fie în proporții strict definite, deoarece un exces al unuia dintre ei reduce rezultatul.

Există diferite moduri de a efectua reacția de precipitare.

1. Reacția de precipitare inelară se realizează în tuburi de precipitare cu un diametru mic. Serul imunitar este adăugat în eprubetă și antigenul solubil este stratificat cu grijă. AG și AT se amestecă datorită mișcării termice a moleculelor și interacționează. Dacă rezultatul este pozitiv, la interfața celor două soluții se formează un inel de precipitat opac.

2. Reacția de imunodifuziune dublă Ouchterlony este efectuată într-un gel de agar, în godeurile căruia se adaugă fie o soluție AG, fie o soluție AT conform schemei. AG și AT difuzează în gel unul spre celălalt și, dacă reacția este pozitivă, formează complexe imune vizibile ca linii de precipitare.

Reacția de precipitare -aceasta este formareași precipitarea complexului solubil antigen molecular-anticorp sub forma unui nor numit precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente.

Componente RA:

ser precipitant (precipitină AT cunoscută);

ser de testare (antigen precipitinogen necunoscut);

fizic Soluţie.

Reacția de precipitare se realizează fie în eprubete speciale înguste (reacție de precipitare cu inel), fie în vase Petri în geluri, medii nutritive etc.

Reacție de precipitare inel

Declarația și înregistrarea rezultatelor reacțiilorprecipitații inelarepentru a detecta agentul cauzal al antraxului (reacția Ascoli).

Înscenare .

1. Materialul studiat (piele, lână, pâslă, peri, pânză, carne, pământ, fecale de animale etc.) se fierbe în soluție salină timp de 5-45 de minute. pentru a obține un extract (extract) izotonic. Filtrată.

2. Ser anti-antrax precipitant se toarnă într-o eprubetă.

3. Așezați cu grijă materialul de testat (extractul) pe acesta.

Contabilitate .

În următoarele 10 minute. În cazurile pozitive, la interfața dintre ser și extract apare un inel de turbiditate (precipitare inel). Reacția Ascoli este foarte sensibilă și specifică

Cu ajutorul acestuia, este posibilă identificarea rapidă a materialelor infectate cu antrax.

Reacția de precipitare în agar

Declarația și înregistrarea rezultatelorreacții de precipitare în agarpentru a determina toxicitatea corynebacteriilor (agenți cauzatori ai difteriei)

Înscenare

Se plasează pe agar peptonă fosfat într-o cutie Petri.

1. Așezați o fâșie de hârtie de filtru sterilă umezită de-a lungul mijlocului cupei.ser antitoxic.

2. După uscare, la o distanță de 1 cm de marginea benzii, se însămânță plăci cu diametrul de 10 mm.culturi selectate.

Într-o cană puteți semăna de la 3 la 10 culturi, dintre care unaControl, trebuie cunoscuttoxigenă.

Culturile sunt plasate într-un termostat.

Contabilitate

Analiza se efectuează după 24-48-72 ore.

Rezultat pozitiv - (culturatoxigen) - la oarecare distanta de banda de hartie aparlinii precipitate, « săgeți în formă de crin", care sunt clar vizibile în lumina transmisă.

Figura prezintă reacția de precipitare în agar pentru a determina toxicitatea bacililor difteriei. Culturile medii nu au format „vârle săgeată”; aceștia nu sunt agenți patogeni toxicogeni.

Tulpinile agentului cauzal al difteriei pot fi toxigenice (producând exotoxină) și non-toxigenice. Formarea unei exotoxine depinde de prezența în bacterii a unui profag care poartă o genă toxică care codifică formarea unei exotoxine.

În caz de boală, toți agenții patogeni difterici sunt testați pentru toxicitate - producerea de exotoxină difterice folosind reacția de precipitare în agar

Reacții serologice complexe ( 3 componente: Ag+Ig+C):

Reacția de fixare a complementului (CFR).

Reacția se desfășoară în două etape.

În prima etapă, AT interacționează cu antigenul și complementul; în a doua etapă se adaugă un indicator - sistemul hemolitic (un amestec de eritrocite și ser antieritrocitar).

Dacă rezultatul este pozitiv, în prima etapă, anticorpii formează un complex imun cu antigenele, care leagă complementul amestecului de reacție.

În acest caz, globulele roșii ale sistemului hemolitic adăugat în a doua etapă nu sunt distruse.

În caz contrar, complementul nelegat determină liza globulelor roșii indicatoare.

Pentru realizarea acesteia sunt necesare cinci ingrediente: AG, AT și complement (primul sistem), eritrocite de oaie și ser hemolitic (al doilea sistem) (Fig. 1).

Reacția are loc în două faze (Fig. 3).

Primă fază - interacțiunea antigenului și a anticorpilor cu participarea obligatorie a complementului.

Al doilea - identificarea rezultatelor reacţiei utilizând un sistem hemolitic indicator (hematii de oaie şi ser hemolitic). Distrugerea globulelor roșii de către serul hemolitic are loc numai dacă se adaugă complement în sistemul hemolitic. Dacă complementul a fost adsorbit anterior pe complexul antigen-anticorp, atunci nu are loc hemoliza eritrocitelor (Fig.).

Rezultatul experienței evaluat (Fig. 2), constatând prezența sau absența hemolizei în toate tuburile. Reacția este considerată pozitivă atunci când hemoliza este complet întârziată, când lichidul din eprubetă este incolor și celulele roșii din sânge se depun la fund, negativă - când globulele roșii sunt complet lizate, când lichidul este intens colorat (sânge „lac” ).

Gradul de întârziere a hemolizei este evaluat în funcție de intensitatea culorii lichidului și de dimensiunea sedimentului de globule roșii din partea de jos (++++, +++, ++, +).

Orez. 4. Declarația și rezultatul RSC.

Concluzie:Au fost detectați anticorpi în serul de testat.

RSK vă permite să detectați anticorpi la orice tulpină a aceluiași serotip al virusului.

Valoarea diagnostica are:

o creștere de patru ori a titrului de anticorpi în serurile pereche (în timpul unei epidemii de gripă);

o creștere de două ori a serului sanguin la pacienții cu un tablou clinic caracteristic.

Reacții folosind o etichetă :

Aceste metode sunt extrem de sensibile. Coloranții, izotopii radioactivi, enzimele etc. sunt utilizați ca etichete pentru antigene sau anticorpi.

RIF – reacție de imunofluorescență

Reacția de imunofluorescență se bazează pe indicarea ușoară a complexului antigen-anticorp

Test imunosorbant legat.

Un test de laborator modern care caută anticorpi specifici în sânge sau antigeni pentru anumite boli pentru a identifica nu numai etiologia, ci și stadiul bolii.

Rezultatele ELISA pot fi date calitativ și cantitativ.

În prezent, ELISA este utilizat în următoarele situații:

1) căutarea de anticorpi specifici oricărei boli infecțioase;

2) căutarea antigenelor oricăror boli (infecțioase, venerologice);

3) studiul stării hormonale a pacientului;

4) examinarea markerilor tumorali;

5) examinarea prezenței bolilor autoimune.

În figură, ELISA în fază solidă - antigene cunoscute (în stânga) adsorbite pe un godeu al unei plăci, (în dreapta) pe godeurile unei plăci antigene cunoscute

Avantajele metodei ELISA:

1) Specificitate și sensibilitate ridicată a metodei ELISA (mai mult de 90%).

2) Capacitatea de a determina boala și de a urmări dinamica procesului, adică de a compara numărul de anticorpi în diferite perioade de timp.

3) Disponibilitatea diagnosticelor ELISA în orice instituție medicală.

Dezavantaj relativ: Detectarea unui răspuns imun (anticorpi), dar nu a agentului patogen însuși, conjugat la o enzimă etichetă.

Test ELISA (mecanism general):

Baza imunotestului enzimatic este reacția imună a antigenului și anticorpului cu formarea unui complex imun: antigen-anticorp, care are ca rezultat o modificare a activității enzimatice a semnelor specifice de pe suprafața anticorpilor.

Componente de reacție:

1. AG(AT) cunoscut - pe godeul tabletei.

2. AT (AG) în curs de studiu.

3. AT cu enzimă, specifică complexului AT(AG)-AG(AT).

4. substrat cromogen care interactioneaza cu enzima

5. soluție stop

Etapele principale ale ELISA

1. Pe suprafața godeurilor plăcii există un antigen purificat al unui agent patogen specific. La acestea se adaugă materialul biologic al pacientului, iar între acest antigen și anticorpul dorit (imunoglobulină) apare o reacție specifică. Se formează un complex.

2. Se adaugă un conjugant – AT cu enzima. Conjugantul este specific complexului AT-AG din prima etapă. Enzima este activată.

3. Se adaugă substratul și enzima activă reacționează cu acesta, schimbând culoarea incoloră a soluției.

4. Se adaugă o soluție stop pentru a opri interacțiunea enzimă-substrat.

Contabilitate.

Un rezultat pozitiv este o schimbare de culoare, galben în imagine.

Analiza imunocromatografică

Metoda de analiză imunocromatografică (ICA, teste rapide) este o metodă de screening preliminară de înaltă calitate, care vă permite să efectuați rapid, în câteva minute, analiza în orice condiții, inclusiv. "camp".

Avantajele ICA includ:

Viteză și ușurință în utilizare;

Volume mici de probă, lipsa pregătirii probei;

Ieftin pentru producător și consumator;

Posibilitatea de a produce teste în volume mari;

Ușurință de citire și interpretare a rezultatului;

Sensibilitate și reproductibilitate ridicate;

Posibilitate de determinare cantitativă;

Posibilitatea de a utiliza cititoare portabile compatibile cu un computer;

Posibilitate de multi-analiză.

Componente (aplicate pe banda de testare):

1. Conjugatul cu o etichetă de aur coloidal este specific antigenului detectat.

2. Linie de testare AT – specifică complexului AT-AG

3. Abdominalele liniei de control sunt specifice conjugatului.

Setare ICA:

1. Aplicați proba pe zona de pornire desemnată a benzii.

2. Obținerea rezultatului sub forma apariției dungilor colorate în locul liniilor de test și control.

Contabilitate

Pozitiv – când linia de testare este colorată.

Negativ - dacă nu există nicio colorare a liniei de testare.

Invalid – dacă linia de control nu este pătată.

Mecanismul general al ICA:

1. Proba este introdusă pe câmpul de pornire (sample pad) și este asociată cu conjugatul (un corp specific cu o etichetă colorată), care se află pe pad-ul conjugat. Ca rezultat, se formează un complex colorat.

2. Complexul imunitar colorat rezultat se deplasează sub acțiunea forțelor capilare de-a lungul membranei de nitrocelulozăȘi interactioneazacu linia de testare AT.Rezultatul este o singură dungă de culoare roz-roșu.

3. AT (conjugat) nelegat pe banda testatăse deplasează mai departe și ajunge la linia de control, comunică cu AT-ul liniei de control.Ca rezultat, apare o a doua dungă colorată.Dacă analiza este efectuată corect, linia de control ar trebui să apară întotdeauna, indiferent de prezența antigenului (anticorpului) de testat în proba de fluid biologic.

2. Condiţii de desfăşurare a reacţiilor serologice.

1. Prezența omologului - corespunzând unul altuia antigen și anticorp.

2. Vase curate, uscate.

3. Un anumit raport de medicamente (cel mai adesea egal).

4. Prezența obligatorie a unui electrolit (soluție izotonică de NaCl).

5. pH neutru sau aproape de ușor alcalin.

6. Temperatura +37°C sau temperatura camerei (neapărat pozitivă).

7. Se efectuează controlul antigenului și controlul serului (anticorpilor).

3 Cerințe de ser

Serul trebuie să fie complet transparent, fără niciun amestec de celule.

De obicei îl primesc în a 2-a săptămână de boală, când anticorpii sunt deja disponibili.

Sângele se ia în cantitate de 3-5 ml pe stomacul gol sau la 6 ore după masă.

Pentru a obține ser, sângele este lăsat timp de 1 oră la temperatura camerei sau centrifugat. Serul este aspirat foarte atent pentru a nu capta elementele formate.

Serurile imune se obțin din sângele oamenilor sau animalelor (de obicei iepuri și cai), imunizate după o anumită schemă cu antigenul corespunzător (vaccinul). Serurile sunt de obicei preparate în producție.

4. Conceptul de rezultate pozitive și negative.

RA.

Cu o reacție pozitivă, globulele roșii lipite pasiv acoperă fundul găurii într-un strat uniform cu margini festonate („umbrelă”); în absența aglutinarii, globulele roșii se acumulează în adâncitura centrală a găurii, formând un „buton” compact cu margini bine definite (vezi imaginile de mai sus).

RP.

Dacă rezultatul este pozitiv, la interfața celor două soluții se formează un inel lăptos (vezi imaginile de mai sus).

ELISA.

O schimbare a culorii soluției are loc cu o reacție pozitivă.

RSK.

Hemoliza intarziata - reactia este pozitiva; dacă complementul este liber, se observă hemoliză - reacția este negativă(vezi pozele de mai sus).

Rezultatele reacției Wasserman:

a - întârzierea completă a hemolizei (+ + ++);

b - întârziere pronunțată a hemolizei (+ ++);

c - întârzierea parțială a hemolizei (++);

d - ușoară întârziere a hemolizei (+);

d - hemoliză completă (-).

Reacția este pozitivă cu întârziere parțială, pronunțată și completă a hemolizei, determinată de gradul de colorare a conținutului tuburilor de la roz deschis la roșu aprins; eritrocitele nehemolizate formează ulterior un precipitat roșu.

Teme pentru acasă:

1. Studiază materialul

Faceți 3 note pe videoclip

13.1. Reacții antigen-anticorp și aplicațiile lor

Când se introduce un antigen, se formează anticorpi în organism. Anticorpii sunt complementari cu antigenul care a determinat sinteza lor și sunt capabili să se lege de acesta. Legarea antigenelor de anticorpi constă în două faze. Prima fază este specifică, în care are loc legarea rapidă a determinantului antigenic la centrul activ al fragmentului Fab de anticorpi. Trebuie remarcat faptul că legarea se datorează forțelor van der Waals, hidrogenului și interacțiunilor hidrofobe. Forța legăturii este determinată de gradul de corespondență spațială dintre locul activ al anticorpului și epitopul antigenului. După faza specifică, începe o fază mai lentă - nespecifică, care se manifestă printr-un fenomen fizic vizibil (de exemplu, formarea de fulgi în timpul aglutinarii etc.).

Reacțiile imune sunt interacțiuni între anticorpi și antigeni, iar aceste reacții sunt specifice și foarte sensibile. Sunt utilizate pe scară largă în practica medicală. Cu ajutorul reacțiilor imune pot fi rezolvate următoarele probleme:

Determinarea anticorpilor necunoscuți prin antigeni cunoscuți (diagnostic antigenic). Această sarcină apare atunci când este necesar să se determine anticorpii la un agent patogen în serul sanguin al pacientului (serodiagnostic). Găsirea anticorpilor vă permite să confirmați diagnosticul;

Determinarea antigenelor necunoscute folosind anticorpi cunoscuți (ser diagnostic). Acest studiu se realizează la identificarea unei culturi de patogen izolată din materialul unui pacient (serotipizare), precum și la detectarea

antigenele microbiene și toxinele lor din sânge și alte fluide biologice. Există multe tipuri de reacții imune, care diferă în tehnica de stadializare și efectul înregistrat. Acestea sunt reacții de aglutinare (RA), reacții de precipitare (RP), reacții care implică complement (RSC), reacții care utilizează componente marcate (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reacția de aglutinare

O reacție de aglutinare (RA) este o reacție imună a interacțiunii unui antigen cu anticorpi în prezența electroliților, iar antigenul se află în stare corpusculară (eritrocite, bacterii, particule de latex cu antigene adsorbite). În timpul aglutinării, antigenele corpusculare sunt lipite împreună de anticorpi, ceea ce se manifestă prin formarea unui precipitat floculent. Formarea fulgilor are loc datorită faptului că anticorpii au doi centri activi, iar antigenele sunt polivalente, adică. au mai mulți determinanți antigenici. RA este utilizat pentru a identifica agentul patogen izolat din materialul pacientului, precum și pentru a detecta anticorpi la agentul patogen în serul sanguin al pacientului (de exemplu, reacțiile Wright și Heddleson pentru bruceloză, reacția Widal pentru febra tifoidă și febra paratifoidă).

Cel mai simplu mod de a diagnostica RA este reacția pe sticlă; aceasta este o RA aproximativă, care este utilizată pentru a determina agentul patogen izolat de la pacient. Când se stabilește o reacție, pe o lamă de sticlă se aplică ser aglutinant diagnostic (la o diluție de 1:10 sau 1:20), apoi se adaugă o cultură de la pacient. Reacția este pozitivă dacă în picătură apare un sediment floculant. În apropiere este plasat un control: în loc de ser, se aplică o picătură de soluție de clorură de sodiu. Dacă serul aglutinant de diagnostic nu este adsorbit 1, atunci este diluat (la titrul - diluția la care ar trebui să aibă loc aglutinarea), adică. pune RA expandată în eprubete cu creștere

1 Serul aglutinant neadsorbit poate aglutina bacteriile înrudite care au antigene comune (reacții încrucișate). Prin urmare ei folosescseruri aglutinante adsorbite, din care anticorpii cu reacție încrucișată au fost îndepărtați prin adsorbție la bacteriile înrudite. Astfel de seruri rețin anticorpi care sunt specifici doar unei anumite bacterii.

diluții de ser aglutinant, la care se adaugă 2-3 picături dintr-o suspensie de agent patogen izolat de la pacient. Aglutinarea este luată în considerare de cantitatea de sediment și de gradul de curățare a lichidului din eprubete. Reacția este considerată pozitivă dacă se observă aglutinare într-o diluție apropiată de titrul serului de diagnostic. Reacția este însoțită de controale: serul diluat cu soluție izotonică de clorură de sodiu trebuie să fie transparent, suspensia de microbi în aceeași soluție să fie uniform tulbure, fără sedimente.

Pentru a determina anticorpii la agentul patogen din serul sanguin al pacientului, se utilizează RA la scară completă. Când se instalează, serul de sânge al pacientului este diluat în eprubete și se adaugă o cantitate egală de suspensie de diagnostic (suspensie de microbi uciși) în eprubete. După incubare, se determină cea mai mare diluție a serului la care a avut loc aglutinarea, adică. s-a format un precipitat (titru seric). În acest caz, reacția de aglutinare cu O-diagnosticum (bacterii ucise prin încălzire, reținând antigenul O termostabil) are loc sub formă de aglutinare cu granulație fină. Reacția de aglutinare cu H-diagnosticum (bacterii ucise de formaldehidă, reținând antigenul H flagelar termolabil) este grosieră și decurge mai rapid.

Reacție de hemaglutinare indirectă (pasivă).(RNGA sau RPGA) este un tip de RA. Această metodă este foarte sensibilă. Cu ajutorul RNGA se pot rezolva două probleme: determinarea anticorpilor în serul sanguin al pacientului, la care se adaugă un diagnostic eritrocitar antigenic, adică eritrocite pe care sunt adsorbiți antigeni cunoscuți; determinați prezența antigenelor în materialul de testat. În acest caz, reacția este uneori numită reacție de hemaglutinare indirectă inversă (RONHA). În timpul procedurii, la materialul de testat se adaugă un anticorp erythrocyte diagnosticum (eritrocite cu anticorpi adsorbiți pe suprafața lor). În această reacție, celulele roșii din sânge acționează ca purtători și sunt implicate pasiv în formarea agregatelor imune. Cu o reacție pozitivă, globulele roșii lipite pasiv acoperă fundul găurii într-un strat uniform cu margini festonate („umbrelă”); în absența aglutinarii, celulele roșii din sânge se acumulează în adâncitura centrală a găurii, formând un „buton” compact cu margini bine definite.

Reacția de coaglutinare folosit pentru determinarea celulelor patogene (antigeni) folosind anticorpi adsorbiți pe Staphylococcus aureus, conţinând proteina A. Proteina A are afinitate pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor. Datorită acestui fapt, anticorpii se leagă de stafilococ indirect prin fragmentul Fc, iar fragmentele Fab sunt orientate spre exterior și sunt capabile să interacționeze cu microbii corespunzători izolați de la pacienți. În acest caz, se formează fulgi.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (HAI) utilizat în diagnosticul infecțiilor virale, și numai infecții cauzate de virusuri hemaglutinante. Acești virusuri conțin o proteină la suprafața lor - hemaglutinină, care este responsabilă de reacția de hemaglutinare (HRA) atunci când celulele roșii din sânge sunt adăugate virușilor. RTGA implică blocarea antigenelor virale cu anticorpi, în urma cărora virușii își pierd capacitatea de a aglutina globulele roșii.

Reacția Coombs - RA pentru determinarea anticorpilor incompleti. În unele boli infecțioase, cum ar fi bruceloza, în serul sanguin al pacientului circulă anticorpi incompleti împotriva agentului patogen. Anticorpii incompleti sunt numiți anticorpi de blocare deoarece au un loc de legare a antigenului, și nu două, ca anticorpii completi. Prin urmare, atunci când se adaugă un diagnostic antigenic, anticorpii incompleti se leagă de antigene, dar nu îi lipesc împreună. Pentru a manifesta reacția se adaugă ser antiglobulinic (anticorpi la imunoglobulinele umane), care va duce la aglutinarea complexelor imune (diagnostic antigenic + anticorpi incompleti) formate în prima etapă a reacției.

Reacția Coombs indirectă este utilizată la pacienții cu hemoliză intravasculară. La unii dintre acești pacienți sunt detectați anticorpi anti-Rhesus monovalenți incompleti. Ele interacționează în mod specific cu eritrocitele Rh-pozitive, dar nu provoacă aglutinarea acestora. Prin urmare, serul antiglobulinic este adăugat la sistemul de anticorpi anti-Rh + eritrocite Rh-pozitive, ceea ce determină aglutinarea eritrocitelor. Folosind reacția Coombs, sunt diagnosticate stările patologice asociate cu liza intravasculară a eritrocitelor de origine imună, de exemplu, boala hemolitică a nou-născutului cauzată de conflictul Rh.

RA pentru determinarea grupelor sanguine se bazează pe aglutinarea eritrocitelor de către anticorpii serici imun la antigenele grupelor sanguine A(II), B(III). Martorul este ser care nu conține anticorpi, adică. grupa sanguină AB(IV) serică și antigenele eritrocitare din grupele A(P) și B(III). Eritrocitele din grupa 0(I) sunt folosite ca martor negativ deoarece nu au antigeni.

Pentru determinarea factorului Rh se folosesc seruri anti-Rh (cel puțin două serii diferite). Dacă există un antigen Rh pe membrana eritrocitelor studiate, are loc aglutinarea acestor celule.

13.3. Reacția de precipitare

RP este o reacție imună a interacțiunii anticorpilor cu antigenele în prezența electroliților, iar antigenul este în stare solubilă. În timpul precipitării, antigenele solubile sunt precipitate de anticorpi, ceea ce se manifestă prin tulbureală sub formă de benzi de precipitare. Formarea unui precipitat vizibil se observă atunci când ambii reactivi sunt amestecați în rapoarte echivalente. Un exces al unuia dintre ele reduce numărul de complexe imune precipitate. Există diferite moduri de a efectua reacția de precipitare.

Reacția de precipitare inelară plasate în tuburi de precipitare cu diametru mic. Serul imunitar este adăugat în eprubetă și antigenul solubil este stratificat cu grijă. Dacă rezultatul este pozitiv, la interfața celor două soluții se formează un inel lăptos. Reacția de precipitare inelară, care este utilizată pentru a determina prezența antigenelor în organe și țesuturi, ale căror extracte sunt fierte și filtrate, se numește reacția de termoprecipitare (reacția Ascoli pentru determinarea antigenului antrax termostabil).

Reacție de imunodifuzie dublă Ouchterlony. Această reacție este efectuată într-un gel de agar. Într-un strat de gel de grosime uniformă, godeurile sunt tăiate la o anumită distanță unele de altele și umplute cu antigen și, respectiv, ser imun. După aceasta, antigenele și anticorpii difuzează în gel, se întâlnesc și formează complexe imune, care precipită în gel și devin vizibile ca linii de precizie.

nutriție. Această reacție poate fi utilizată pentru a identifica antigeni sau anticorpi necunoscuți și, de asemenea, pentru a testa asemănarea dintre diferiți antigeni: dacă antigenele sunt identice, liniile de precipitare se contopesc, dacă antigenele nu sunt identice, liniile de precipitare se intersectează, dacă antigenele sunt parțial identic, se formează un pinten.

Reacție de imunodifuzie radială. La gelul de agar topit se adaugă anticorpi și gelul este aplicat într-un strat uniform pe sticlă. Godeurile sunt tăiate în gel și li se adaugă un volum standard de soluții de antigen de diferite concentrații. În timpul incubației, antigenele difuzează radial din godeu și, întâlnind anticorpii, formează un inel de precipitare. Atâta timp cât excesul de antigen rămâne în godeu, are loc o creștere treptată a diametrului inelului de precipitare. Această metodă este utilizată pentru a determina antigene sau anticorpi în soluția de testare (de exemplu, pentru a determina concentrația de imunoglobuline de diferite clase în serul sanguin).

Imunoelectroforeza. Amestecul de antigen este mai întâi separat electroforetic, apoi antiserul precipitant este adăugat în canalul care merge de-a lungul direcției de mișcare a proteinei. Antigenii și anticorpii difuzează în gel unul către celălalt; interacționând, ele formează linii de precipitații arcuite.

Reacția de floculare(după Ramon) - un tip de reacție de precipitare care este utilizat pentru a determina activitatea serului antitoxic sau a toxoidului. Reacția se realizează în eprubete. Într-o eprubetă în care toxoidul și antitoxina sunt într-un raport echivalent, se observă turbiditate.

13.4. Reacția de fixare a complementului

Anticorpii, care interacționează cu antigenul corespunzător, leagă complementul adăugat (primul sistem). Un indicator al fixării complementului sunt eritrocitele sensibilizate cu ser hemolitic, adică. anticorpi la celulele roșii din sânge (sistemul 2). Dacă complementul nu este fixat în primul sistem, i.e. Dacă nu are loc reacția antigen-anticorp, globulele roșii sensibilizate sunt complet lizate (reacție negativă). Când complementul este fixat de complexele imune ale primului sistem după adăugarea eritrocitelor sensibilizate, hemoliza din

absent (reacție pozitivă). Reacția de fixare a complementului este utilizată pentru a diagnostica boli infecțioase (gonoree, sifilis, gripă etc.).

13.5. Reacția de neutralizare

Microbii și toxinele lor au un efect dăunător asupra organelor și țesuturilor corpului uman. Anticorpii sunt capabili să se lege de acești agenți dăunători și să-i blocheze, de exemplu. neutraliza. Reacția de neutralizare diagnostică se bazează pe această caracteristică a anticorpilor. Se realizează prin introducerea unui amestec antigen-anticorp în animale sau în obiecte de testare sensibile (cultură celulară, embrioni). De exemplu, pentru a detecta toxine în materialul unui pacient, animalele din primul grup sunt injectate cu material de la pacient. Animalele din grupa a 2-a sunt injectate cu material similar, pre-tratat cu antiser adecvat. Animalele din grupa 1 mor dacă există o toxină în material. Al doilea grup de animale supraviețuiește; efectul dăunător al toxinei nu se manifestă, deoarece este neutralizat.

13.6. Reacții folosind anticorpi sau antigeni marcați

13.6.1. Reacție de imunofluorescență (RIF, metoda Koons)

Această metodă este utilizată pentru diagnosticare expresă. Poate fi folosit pentru a detecta atât antigenele microbiene, cât și anticorpii.

Metoda RIF directă- o reacție imună a interacțiunii anticorpilor cu antigenii, iar anticorpii sunt marcați cu un fluorocrom - o substanță capabilă să emită cuante de lumină de o anumită lungime de undă atunci când sunt expuși la lumină de o anumită lungime de undă. Particularitatea acestei metode este necesitatea de a elimina componentele nereacționate pentru a exclude detectarea luminiscenței nespecifice. Pentru a face acest lucru, spălați anticorpii nereacționați. Rezultatele sunt evaluate cu ajutorul unui microscop fluorescent. Bacteriile dintr-un frotiu tratat cu un astfel de ser luminiscent strălucesc pe un fundal întunecat de-a lungul periferiei celulei.

Metoda RIF indirectă este folosit mai des decât precedentul. Această reacție se realizează în două etape. În prima etapă, antigenele reciproc

interacționează cu anticorpii corespunzători, formând complexe imune. Toate componentele care nu au reacționat (adică nu fac parte din complexele imune) trebuie îndepărtate prin spălare. În a doua etapă, complexul antigen-anticorp rezultat este detectat folosind ser antiglobulină fluorocromat. Ca urmare, se formează un complex de microbi + anticorpi antimicrobieni de iepure + anticorpi la imunoglobulinele de iepure, marcați cu fluorocrom. Rezultatele sunt evaluate cu ajutorul unui microscop cu fluorescență.

13.6.2. Metoda sau testul imunosorbent enzimatic

ELISA este cea mai comună metodă modernă utilizată pentru diagnosticarea infecțiilor virale, bacteriene, protozoare, în special pentru diagnosticarea infecției cu HIV, hepatitei virale etc.

Există o mulțime de modificări ELISA. ELISA necompetitiv în fază solidă este utilizat pe scară largă. Se realizează în plăci de polistiren cu 96 de godeuri (fază solidă). Când se efectuează o reacție, este necesar să se spele componentele nereacționate în fiecare etapă. La determinarea anticorpilor, serul sanguin de testat este adăugat în godeurile pe care sunt absorbiți antigenele, apoi serul antiglobulinic marcat cu o enzimă. Reacția se realizează prin adăugarea unui substrat pentru enzimă. În prezența unei enzime, substratul se schimbă și complexul enzimă-substrat este selectat astfel încât produsul format în reacție să fie colorat. Astfel, cu o reacție pozitivă, se observă o schimbare a culorii soluției. Pentru a determina antigenele, purtătorul în fază solidă este sensibilizat cu anticorpi, apoi materialul de testat (antigenele) și serul marcat cu enzimă la antigeni sunt adăugate secvenţial. Pentru ca reacția să aibă loc, se adaugă un substrat pentru enzimă. O schimbare a culorii soluției are loc cu o reacție pozitivă.

13.6.3. Imunoblotting

Această metodă se bazează pe o combinație de electroforeză și ELISA. Când se efectuează imunoblotting (blotting din engleză. pata- spot) un amestec complex de antigeni este mai întâi supus electroforezei într-un gel de poliacrilamidă. Anti-

peptidele genice sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză. Petele sunt apoi tratate cu anticorpi marcați cu enzimă la un antigen specific, de ex. efectuați ELISA blot. Imunoblotting este utilizat în diagnosticarea infecțiilor precum HIV.

13.6.4. Microscopia electronică imunitară

Metoda implică microscopia virușilor (mai puțin frecvent alți microbi) într-un microscop electronic, pre-tratat cu serul imunitar corespunzător marcat cu preparate dense electron-optic, de exemplu feritina, o proteină care conține fier.

13.7. Citometrie în flux

Celulele sanguine sunt diferențiate pe baza citofluorometriei cu laser. Pentru a face acest lucru, celulele dorite sunt colorate cu anticorpi monoclonali fluorescenți la antigenele CD. Proba de sânge, după ce a fost tratată cu anticorpi marcați, este trecută printr-un tub subțire și trece un fascicul laser prin acesta, care excită fluorocromul să strălucească. Intensitatea fluorescenței se corelează cu densitatea antigenelor de pe suprafața celulei și poate fi măsurată cantitativ folosind un tub fotomultiplicator. Rezultatele obţinute sunt convertite într-o histogramă.

Citometria în flux este utilizată pentru a determina starea imunitară (conținutul principalelor populații de limfocite, conținutul de citokine intracelulare și extracelulare, activitatea funcțională a celulelor NK, activitatea de fagocitoză etc.).