Metode de cercetare virologică directă și indirectă. Metode de cercetare virologică în microbiologie. Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale

Principalele metode utilizate în diagnosticarea bolilor virale sunt cultivarea și identificarea virusurilor.

Pentru a dovedi etiologia virală a bolii, este necesară izolarea virusului din corpul unui pește bolnav, transmiterea acestuia pe o cultură de celule sau pești sensibili, reproducerea bolii la pești sănătoși din aceeași specie sau din specii înrudite și re- izolați același virus de la animalele de experiment.

Pentru identificarea virusurilor se folosesc mai multe metode complementare: microscopia electronică a virusului, studiul proprietăților sale fizico-chimice, detectarea modificărilor morfologice caracteristice în celulele infectate și simptome la animalele infectate, diverse metode imunologice.

Virusurile sunt izolate în principal pe culturi de celule primare sau transplantate cu un singur strat, selectând culturi care sunt sensibile la un virus dat în fiecare caz. Pentru a obține culturi primare de celule de pește, se folosesc cel mai des gonadele femelelor de crap sau caras. Gonadele ar trebui să aibă stadiile II sau II-III de maturitate conform scalei Kiselevich. Astfel de gonade nu conțin ouă vizibile cu ochiul liber. În caz contrar, conținutul ouălor va afecta negativ creșterea celulelor. Culturile celulare din gonadele crapului și carasului se prepară după metoda aprobată.

Ca culturi continue, sunt cele mai utilizate următoarele linii celulare: FHM - din țesuturile pedunculului caudal al piscicolului cu cap gras; RTG - din gonade de păstrăv curcubeu; EPC - de la excrescente de variola pe pielea crapului. Aceste linii se mențin în laboratoare specializate pentru studiul bolilor peștilor ale institutelor de cercetare veterinară și piscicolă, unde pot fi comandate și primite.

La diagnosticarea bolilor virale bine studiate, sunt examinate organele și țesuturile în care este concentrat agentul patogen.

În cazul bolilor peștilor, despre care informațiile sunt insuficiente, organele cele mai afectate sunt supuse examinării virusologice. Răzuiturile de pe piele și branhii, bucăți din aceste organe, împreună cu mucusul, se pun în flacoane sterile cu 2-3 ml de soluție salină sterilă sau soluție tampon. Probele din organele interne sunt prelevate în condiții strict aseptice.

În cazurile în care este imposibil să se examineze rapid materialul, acesta este păstrat cel mult o zi într-un frigider la o temperatură care să nu depășească 5 ° C. Materialul congelat poate fi depozitat mai mult timp.

Materialul patologic destinat cercetării este zdrobit într-un omogenizator sau măcinat într-un mortar de porțelan cu nisip cuarțos. Din țesuturile zdrobite se prepară o suspensie de 10% în soluții Hank, Earl, tampon sau soluție salină fiziologică și se centrifugă timp de 10-15 minute la 2000-3000 rpm, supernatantul este aspirat cu o pipetă și plasat în fiole sterile. Dacă suspensia nu este sterilă, materialele preparate sunt filtrate prin filtre cu membrană cu diametrul porilor de 0,2-0,45 µm sau tratate cu antibiotice (penicilină 1000 UI/ml şi streptomicina 1000 µg/ml).

Se prepară o suspensie 20% din conținutul intestinal în apă distilată sterilă și se centrifughează timp de 10-15 minute la 2000 rpm. Supernatantul este centrifugat din nou la 4000-5000 rpm timp de 30 de minute. Supernatantul este apoi aspirat într-un flacon steril și tratat cu antibiotice. Pentru 1 ml adăugați 1000 µg/ml streptomicina și 1000 UI/ml penicilină. Amestecul se tine 2-3 ore la: temperatura camerei. Toate materialele sunt testate pentru sterilitate bacteriană prin inoculare pe BCH și MPA. Materialele pregătite sunt folosite imediat pentru lucru sau, în cazuri extreme, depozitate în stare înghețată (la o temperatură de minus 20 ° C).

Infecția culturii celulare. Tuburile cu un monostrat celular bun sau o zonă de creștere în jurul explantului sunt folosite pentru infecție. Mediul nutritiv este aspirat și se adaugă 0,2-0,3 ml suspensie de testare în fiecare eprubetă. În același timp, în eprubete se adaugă 0,8-0,9 ml de mediu nutritiv cu 2-3% ser.

Materialul preparat din fiecare probă este infectat cu cultură de țesut în 4-6 eprubete. Din fiecare serie de studii, se lasă același număr de eprubete ca martori, adăugându-le 1 ml de mediu nutritiv. Tuburile sunt lăsate la temperatura camerei timp de 1-2 ore pentru adsorbția virusului pe celule, apoi lichidul supernatant este aspirat cu o pipetă și se adaugă un mediu nutritiv suport la volumul inițial.

Culturile de celule infectate și de control sunt incubate la o temperatură de 22-26°C și examinate zilnic la un microscop cu mărire redusă pentru a detecta schimbările morfologice emergente în celule. Cu degenerarea celulară severă, fluidul de cultură este aspirat și se fac pasaje, iar în absența unui efect citopatogen (CPE) se efectuează două pasaje succesive. Pentru a face acest lucru, utilizați fluidul de cultură împreună cu fracția celulară distrusă prin înghețare și decongelare repetate. Supernatantul masei celulare centrifugate este utilizat pentru a infecta culturi proaspete. CPP după a treia trecere este luată în considerare ca o acțiune specifică a agentului viral.

Gradul de deteriorare a monostratului celular este evaluat conform sistemului cu 4 încrucișări; "+" - daune de până la 25%, "+ +" - până la 50%, "+ + +" - până la 75% și "+ + + +" - până la 100% din monostrat.

În unele boli virale ale peștilor, corpurile de incluziune apar în celulele (citoplasma nucleului) diferitelor organe și țesuturi. Materialul pentru studiul incluziunilor virale sunt culturi de țesuturi infectate, răzuire și frotiuri-amprente din organe și țesuturi, materialele indicate se fixează înainte de colorare după metode general acceptate, folosind lichide Dubosque-Brazil-Bouena, Bouena, Carnoy sau 10% soluție neutră de formol.

Incluziunile virale sunt colorate prin diferite metode: conform lui Muromtsev, rubin, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa etc.

Titrarea virusului- determinarea cantitativă a activităţii virale. Titrul virusului este exprimat ca numărul de unități infecțioase conținute într-o unitate de volum de suspensie de virus. Unitatea infecțioasă a virusului este considerată o astfel de doză care provoacă infecție în 50% din obiectele sensibile infectate cu acesta. Această doză de virus se numește infecțioasă și este desemnată ID 50 .

Culturile celulare sunt utilizate în principal ca obiecte sensibile în titrarea virusurilor peștilor. Titrarea în cultura celulară se efectuează în funcție de efectul citopatogen al virusurilor. În acest caz, ID 50 se numește doză citopatogenă tisulară (TCD 50), iar titrul virusului este exprimat ca cantitate de TCD 50 în 1 ml de suspensie virală. Titrul virusului este determinat prin metoda de diluare finală. Conform acestei metode, culturile de celule sensibile injectează un anumit volum de suspensie virală în diluții crescătoare succesive și, ținând cont de rezultatul fiecărei injecții ca pozitiv (dacă CPE este prezent) sau negativ dacă CPE este absent), punctul final al se calculează titrarea - 1 TCD 50 .

Pentru titrarea virusurilor care dau un CPP pronunțat, se folosește și metoda plăcii. În acest caz, un monostrat de celule infectate cu virusul este turnat cu un amestec de mediu nutritiv cu agar pentru a preveni transferul virusului către alte celule care sunt semnificativ îndepărtate de cele infectate inițial și pentru a putea infecta focarele inițiale. de infectare a plăcii).

Fiecare placă provine dintr-o unitate infecțioasă, care este desemnată PFU (unitate de formare a plăcii), iar titrul virusului este exprimat ca număr de PFU per unitate de volum a suspensiei.

Reacția de neutralizare(PH) în cultura celulară.

Reacția se bazează pe legarea unui antigen de către anticorpii unui antiser omolog. Reacția este utilizată pentru identificarea agenților patogeni în diagnosticul bolilor de etiologie virală. Vă permite să determinați prin anticorpi cunoscuți un antigen viral necunoscut sau printr-un antigen cunoscut (standard) - anticorpi necunoscuți în serurile peștilor bolnavi sau recuperați.

Determinarea virusului izolat în reacția de neutralizare se efectuează folosind un set de antiseruri (anticorpi) hiperimune diagnostice de antigene (virusuri) omoloage acestora.

Antiserurile hiperimune sunt obținute prin infectarea animalelor de laborator (de exemplu, iepuri) cu tulpini cunoscute de virusuri care provoacă boli ale peștilor. Antiserurile obținute determină titrurile anticorpilor specifici. Pentru lucru, se iau antiseruri care conțin anticorpi la titruri mari.

Ordinea reacției.

1. Inactivarea serului normal și hiperimun prin încălzire la 56°C timp de 30 de minute.

2. Prepararea diluțiilor ingredientelor de reacție. Antigenul și serul se diluează cu un mediu nutritiv fără ser și antibiotice, începând de la 1: 5, 1: 50, 1: 500 și până se obține o diluție cu un conținut mai mic de 1 TCD 50 / 0,2 ml. Serul hiperimun este diluat 1: 2 sau 1: 5. Cu un titru scăzut, serul este utilizat nediluat. Serul normal este diluat în același mod ca serul hiperimun.

3. Enunțul reacției. Trei rânduri de eprubete sterile sunt plasate într-un suport. Ser hiperimun diluat este turnat în primul rând, ser normal diluat în al doilea și mediu nutritiv în al treilea. Fiecare ingredient se adaugă într-un volum de 0,5 ml.

Diluțiile preparate ale virusului sunt transferate în 0,5 ml în eprubetele corespunzătoare din fiecare dintre cele trei rânduri, iar virusul fiecărei diluții I este transferat cu o pipetă separată, începând cu cea mai mare diluție. Astfel, în fiecare rând de tuburi se obțin diluții seriale de 10 ori ale virusului: 10-1, 10-2 etc.

Pentru a controla toxicitatea serurilor, se adaugă într-un tub separat 0,5 ml din diluția preparată de ser hiperimun și apoi se adaugă o cantitate egală de mediu nutritiv. La fel se procedează cu serul normal.

Agitați bine tuburile cu amestecuri și incubați la temperatura camerei timp de 1 oră. Se infectează apoi cultura celulară cu fiecare diluție a virusului (0,2 ml per tub) cu ser normal hiperimun și mediu nutritiv, 4 tuburi de cultură celulară. În paralel, puneți controale asupra toxicității celulelor utilizate și controlați probele de cultură celulară.

Tuburile cu cultură celulară sunt incubate într-un termostat la temperatura optimă pentru reproducerea acestui virus și sunt examinate zilnic la un microscop cu mărire mică pentru a detecta CPE-ul virusului. Rezultatele sunt înscrise în tabel (Tabelul 11).

Titrul virusului este exprimat ca numărul de unități infecțioase conținute într-o unitate de volum a suspensiei de virus. Găsiți indicele de neutralizare (IN). Ea corespunde cantității maxime de ID 50 care poate fi neutralizată de ser hiperimun. Calcul IN plumb prin formula: lgIN = lgT 1 -lgT 2 unde T 1 - titrul virusului în prezența serului normal; T 2 - titrul virusului în prezența serului hiperimun. Valoarea lui IN se găsește din tabelul de antilogaritmi. Se obișnuiește să se considere valoarea IN până la 10 ca fiind negativă, de la 10 la 49 - îndoielnic, 50 sau mai mult - un rezultat pozitiv.

Rezultatele reacției pot fi considerate fiabile numai dacă serul hiperimun este testat pentru activitate de neutralizare specifică. Pentru a face acest lucru, predeterminați titrul de anticorpi neutralizanți din acest ser sau indicele de neutralizare a acestuia în reacție cu un virus omolog.

Izolarea pe placă a rabdovirusurilor. Această metodă este specifică, se utilizează pentru izolarea, tipizarea preliminară și selecția rabdovirusurilor crapului și păstrăvului în prezența serurilor imune specifice pentru identificarea virusului.

Coloniile rotunjite (plăci) se formează în culturi celulare sub acoperire cu agar în prezența virusului în materialul de testat.

În condiții aseptice, țesuturile rinichilor, ficatului, splinei și lichidului din cavitatea abdominală sunt colectate cu o pipetă Pasteur, transferate într-un flacon cu un mediu care conține 500 UI (mcg) / ml de antibiotice într-un raport de 1: 10. incubat timp de 60-90 minute la o temperatură de 18-22 °C, apoi centrifugat la 2-3 mii rpm timp de 10 minute. Supernatantul este diluat cu mediu nutritiv 1:10 (diluție 1:100). Ambele diluții de supernatanți sunt utilizate pentru a infecta culturile celulare.

Pentru studiu, o cultură celulară continuă de 3 zile crescută în saltele cu un monostrat bine definit este selectată în proporție de 2 saltele pentru fiecare diluție a materialului patologic și 2 saltele pentru control. Mediul nutritiv este îndepărtat din flacoane și se adaugă 2 ml de mediu fără ser fetal. Apoi, se adaugă 0,2 ml din materialul patologic studiat și se lasă la adsorbția virusului timp de 60 de minute la o temperatură optimă pentru virușii care infectează peștii (pentru virusurile crapului - 24-26 ° C și pentru virușii păstrăvului - 16-18 ° C. ).

Martorul pus in 2 saltele cu culturi celulare de 0,2 ml, continand 100 TCD 50/ml virus cunoscut, si 2 - 0,2 ml mediu nutritiv fara virus.

După 60 de minute, lichidul din flacoane este îndepărtat. Pe peretele opus monostratului, se introduc 5 ml de acoperire cu agar încălzit la 40-42°C (la izolarea virusului HCV - nu mai mult de 38°C) într-un flacon de 50 ml. Saltelele sunt întoarse monostrat în jos, acoperite cu hârtie neagră. După 15-20 de minute, saltelele sunt transferate pentru incubare la temperatura optimă pentru virusurile studiate. Saltelele sunt acoperite cu agar cu partea în sus. Cu un virus necunoscut, culturile sunt păstrate la două condiții de temperatură - 14-18 și 22-24°C.

Culturile de celule infectate sunt privite pe un fundal alb. Dacă există un virus în materialul studiat în cultura celulară, punctele transparente apar mai întâi pe fundalul roz-mat al culturii. În viitor, ele cresc în dimensiune, formând colonii rotunde transparente - plăci, a căror prezență indică prezența rabdovirusurilor în materialul patologic.

Cu o pipetă Pasteur, o bucată de placă este colectată pe marginea părților afectate și neafectate, astfel încât nu numai agarul, ci și stratul celular să intre în el. Piesa selectată este plasată într-o eprubetă cu 1 ml de mediu de creștere, congelată la minus 20°C și incubată timp de 60 min. În cazul unui număr mare de plăci (întregul strat celular este transparent), studiile se repetă în diluții de 10 -3 și 10 -4.

În a 4-7 zi apar plăci cu diametrul de 3-8 mm de rabdovirus de crap pe o cultură continuă de EPC și FHM, incubate la o temperatură de 24-26°C.

În absența plăcilor și a prezenței CPD în culturile celulare, studii suplimentare ale fluidului de cultură care conține virus sunt efectuate în diluții de 10-2-10-3 (2-3 pasaje). Ca metode suplimentare de identificare a virusurilor se folosesc următoarele: metoda anticorpilor fluorescenți; determinarea sensibilității virusului la cloroform, eter, valoarea pH-ului, încălzire; Studiul microscopic electronic al morfologiei virusului.

Cercetări pentru diagnosticarea bolilor cu caracter viral. Acest lucru este necesar pentru a identifica virusul, pentru a-i studia biologia și capacitatea de a afecta celulele animale și umane. Astfel, devine posibil să înțelegem patogeneza bolilor virale și, în consecință, să alegeți metoda potrivită de tratament.

Care este diagnosticul?

în celulele vii. Pentru a-l investiga, este necesar să-l cultivăm la nivelul unui organism experimental sau Pentru aceasta, în practica medicală și în microbiologie în general se desfășoară metode de cercetare virologică, care au următoarele abordări principale:

• Drept;
• indirect;
• serologic.

Materialul poate fi examinat direct pentru prezența acizilor nucleici, a antigenului viral sau, de exemplu, pentru a izola și identifica virusul din materialul clinic.

Pe lângă capacitatea de a stabili etiologia bolii, monitorizarea efectului terapeutic, metodele de cercetare virologică joacă un rol important în măsurile anti-epidemice. Pentru izolare și folosiți embrioni de pui, animale de laborator sau culturi celulare.

Cum sunt cercetate?

Cea mai rapidă este metoda directă. Vă permite să detectați un virus, antigen sau NA (acid nucleic) în materialul clinic în sine. Durează de la două ore până la o zi.

1. EM - microscopie electronică. Detectează virusul direct.
2. IEM - microscopie electronică imună. Folosește anticorpi specifici împotriva virușilor.
3. RIF - reacție de imunofluorescență. Utilizează anticorpi legați de colorant. Astfel de metode de cercetare virologică sunt utilizate pe scară largă ca o decodare rapidă a etiologiei SARS (infecții virale respiratorii acute), atunci când se prelevează tampoane din membrana mucoasă a tractului respirator superior.
4. ELISA - imunotest enzimatic - determinarea antigenelor virale, asemănătoare RIF, dar pe baza etichetării enzimatice a anticorpilor.
5. RIA - radioimunotest. Utilizează marcarea cu radioizotopi a anticorpilor pentru a oferi o sensibilitate ridicată în detectarea antigenului viral.
6. Hibridarea moleculară - NK sau izolarea genomilor virusului folosind PCR (reacția în lanț a polimerazei).
7. Citologie - rar folosită, dar pentru anumite infecții, aceste metode de cercetare virologice sunt foarte eficiente. Materialele de biopsie, autopsiile și frotiurile prelucrate pentru colorare și analiză la microscop sunt examinate.

Care este rostul cercetării?

Pentru izolarea cu succes a virusurilor, materialul clinic este luat în conformitate cu patogeneza și cât mai devreme posibil. Adesea, acest proces necesită mai multe treceri înainte de aplicarea anumitor teste virologice.

Microbiologia este studiul ființelor microscopice. Iar domeniul ei nu este doar medicina. Este o știință fundamentală pentru agricultură, medicina veterinară, industria spațială și tehnică, geologie.

Dar, desigur, totul este creat pentru om și dezvoltarea lui pe această planetă frumoasă. Prin urmare, este foarte important să detectați pericolul la timp și să îl neutralizați. Virușii sunt diferiți de bacterii. Acestea sunt structuri care intră în organism și provoacă formarea unei noi generații. Ele arată ca niște cristale și au ca scop controlul procesului de reproducere, deși ei înșiși nu se hrănesc, nu cresc și nu excretă produse metabolice.

Virusul poate provoca boli grave în orice organism viu în care a intrat. În plus, poate evolua. De aceea, metodele de cercetare virologică în microbiologie trebuie dezvoltate și îmbunătățite, deoarece civilizația umană în ansamblu poate fi amenințată.

materiale

Pentru a detecta și identifica virușii în medicină, de regulă, aceștia iau:

• lavaj nazofaringian (infectii respiratorii);
• înroșirea fețelor și fecalele (infecții cu enterovirus);
• răzuire, conținutul veziculelor (leziuni ale pielii, mucoase, precum herpesul, varicela);
• bufeuri (infectii exantemice precum rujeola, rubeola);
• sânge, lichid cefalorahidian (infecții cu arbovirus).

faze

Toate etapele metodei de cercetare virologică includ:

• colectarea materialelor;
• selecția, obținerea unui sistem de testare, determinarea viabilității acestuia;
• infecția sistemului de testare;
• indicația virusului;
• determinarea tipului de virus.

Practic, virusurile patogeni diferă prin prezența specificității tisulare și a tipului. Luați, de exemplu, poliovirusul, care se reproduce doar la primate (în celulele lor). În consecință, o cultură specifică de țesut este utilizată pentru a izola un virus specific. Dacă vorbim despre un agent patogen necunoscut, atunci ar fi indicat să infectați simultan trei, și de preferință patru culturi celulare.

Astfel, poate că unul dintre ei va fi sensibil. Pentru a determina prezența virusului în culturile infectate, uitați-vă la dezvoltarea degenerării celulare specifice, incluziuni intracelulare, detectarea unui antigen specific, teste de hemaglutinare pozitivă și hemadsorbție.

Toate metodele virologice de investigare (directe și indirecte, serologice) trebuie selectate ca fiind cele mai potrivite pentru un anumit caz de infecție suspectată.

Metodele indirecte se bazează pe izolarea și identificarea virusului. Sunt laborioase, lungi, dar precise.

Serodiagnostic

Acest diagnostic se referă la o metodă bazată pe reacția antigen-anticorp. Cel mai adesea se folosesc seruri de sânge pereche, luate la intervale de câteva săptămâni. Dacă creșterea titrului de anticorpi este de 4 sau mai multe ori, reacția este considerată pozitivă. Pentru a determina specificitatea tipului unui virus, se folosește un test de neutralizare a virusului. Pentru a determina specificitatea grupului, trebuie să obțineți reacția de fixare a complementului.

Sunt utilizate pe scară largă diverse variante de imunotest enzimatic, reacția de inhibare a hemaglutinării, hemaglutinarea pasivă, hemaglutinarea pasivă inversă, RIF. Chiar și în inginerie genetică a fost dezvoltată o metodă de obținere a anticorpilor monoclonali. Specificitatea îngustă a monoclonelor poate fi depășită prin utilizarea mai multor anticorpi monoclonali la diverși determinanți virali. Astfel, specificitatea și sensibilitatea testului cu determinarea antigenelor a fost crescută.

Unele caracteristici

Astăzi, au fost create multe sisteme de testare diferite pentru diagnosticarea imunologică a infecțiilor rezultate din intrarea unui virus într-un organism viu.

Astfel, metodele de cercetare virologică sunt metode de izolare a virusurilor, studierea proprietăților acestora și stabilirea relației lor etiologice cu anumite boli.

Lucrări de curs

„Metode de virologie clinică”

Introducere

Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale se realizează în principal folosind microscopie electronică, culturi de celule sensibile și metode imunologice. De regulă, se alege orice metodă pentru diagnostic, în funcție de stadiul infecției virale. Astfel, de exemplu, toate cele trei abordări pot fi utile în diagnosticarea varicelei, dar utilizarea cu succes a microscopiei și a culturii celulare depinde de capacitatea de a colecta probe satisfăcătoare într-un stadiu relativ incipient al bolii.

În mare măsură, succesul diagnosticului viral depinde și de calitatea probelor obținute. Din acest motiv, personalul laboratorului însuși ar trebui să fie direct implicat în colectarea probelor necesare. Caracteristicile probelor, precum și metodele de livrare a acestora în laborator, sunt descrise de Lennett, Schmidt, Krist și colab.

Majoritatea reactivilor și instrumentelor utilizate în diagnosticarea de laborator sunt disponibile de la diverse companii. În cele mai multe cazuri, același reactiv este produs simultan de mai multe companii. Din acest motiv, nu am enumerat firme individuale, cu excepția cazului în care reactivul este furnizat de o singură firmă. În toate celelalte cazuri, ar trebui să vă referiți la lista generală a furnizorilor indicată în tabel. 1.

Nu am urmărit o descriere cuprinzătoare a tuturor metodelor disponibile în prezent pentru diagnosticarea infecțiilor virale umane. În primul rând, am descris principalele metode. Pe măsură ce câștigați experiență cu munca independentă, aceste metode de bază pot fi folosite pentru a rezolva probleme mai complexe.

1. Microscopia electronică

Pentru diagnosticul microscopic electronic al infecțiilor virale, se pot utiliza secțiuni subțiri ale țesutului afectat. Cel mai comun material pentru microscopia electronică sunt fecalele sau lichidul.

Tabelul 1. Lista companiilor furnizoare de reactivi și echipamente

Flow Laboratories: Gibco Europa: Servicii de cultură a țesuturilor: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, Regatul Unit Unitatea 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, Regatul Unit 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, Marea Britanie Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, Regatul Unit South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, Marea Britanie Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, Marea Britanie Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, Marea Britanie 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, Marea Britanie Brighton Hill Parade, Marea Britanie Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, Marea Britanie

vezicule care caracterizează anumite boli, cum ar fi varicela. În analiza unui astfel de material, virușii pot fi detectați folosind colorarea negativă, ceea ce duce la delimitarea componentelor virionului cu material dens în electroni. Metoda este eficientă la concentrații mari de virus în probele de testat, cum ar fi în fecale sau în lichidul vezicular. În cazurile în care conținutul de particule virale din probe este scăzut, probabilitatea detectării virusului poate fi crescută prin concentrarea virusului prin ultracentrifugare sau prin agregarea acestuia cu anticorpi specifici. Această din urmă metodă este, de asemenea, convenabilă pentru identificarea virușilor. Aici descriem metoda microscopică electronică pentru diagnosticarea infecției cu rotavirus și metoda microscopiei imunoelectronice folosind exemplul de detectare a anticorpilor specifici la parvovirusuri. Metodele de microscopie electronică sunt descrise mai detaliat de Field.

2.1 Microscopia electronică directă a fecalelor

1. Capătul pipetei Pasteur este scufundat în fecale și se colectează suficient material pentru a obține un frotiu de 1 cm.

2. Resuspendați frotiul fecal în colorant negativ la microscop electronic până când se obține o suspensie translucidă. Pata de contrast negativ este o soluție 2% de acid fosfotungstic în apă distilată.

3. Pentru a obține un preparat microscopic electronic, o picătură de suspensie este plasată pe o rețea de microscopie electronică acoperită cu un film de carbon-formvar. În timpul acestei operațiuni, plasa este ținută cu o pensetă fină.

4. Medicamentul este lăsat în aer timp de 30 de secunde.

5. Excesul de lichid este îndepărtat prin atingerea marginii paharului cu hârtie de filtru.

6. Medicamentul este uscat în aer.

7. Dacă este necesar, virusul viabil este inactivat prin iradierea ambelor părți ale rețelei cu lumină ultravioletă cu o intensitate de 440.000 μW-s/cm 2 . În acest caz, se folosește o lampă ultravioletă cu undă scurtă cu filtru. Lampa trebuie să fie la o distanță de 15 cm de grilă; timpul de iradiere a fiecărei părți - 5 min.

8. Virionii rotavirus pot fi caracterizați la microscop electronic cu transmisie cu o mărire de 30.000 până la 50.000.

2.2 Microscopia imunoelectronică

Metoda de microscopie imunoelectronică descrisă mai jos este doar una dintre multele metode imunologice similare. Pentru a studia anticorpii specifici virusului, în plus, se folosește o metodă care implică legarea la o rețea microscopică a proteinei A. Concentrația de lucru a anticorpilor antivirali este determinată prin încercare și eroare în intervalul de la 1/10 la 1/1000. Concentrația indicată de noi, de regulă, este folosită în munca de rutină. Pentru a obține rezultate optime ale interacțiunii anticorpilor cu virusul, serul care conține parvovirus este titrat în același mod.

1. 10 pl de antiser uman parvovirus diluat de 100 de ori cu PBS. Soluția este încălzită într-o baie de apă la 56°C.

2. Topiți 10 ml de agaroză 2% în PBS în modul obișnuit și răciți la 56°C într-o baie de apă.

3. La 56°C, amestecați 1 ml de antiser diluat cu 1 ml de agaroză 2%.

4. Transferați 200 µl din amestecul rezultat în două godeuri ale unei plăci de microtitrare cu 96 de godeuri.

5. Lăsați agaroza să se solidifice la temperatura camerei. Placa poate fi păstrată la 4°C timp de câteva săptămâni dacă este sigilată cu bandă adezivă.

6. Adăugați 10 µl de ser care conține parvovirus în godeul care conține amestecul de agaroză și antiser.

7. O grilă de microscopie electronică cu un strat de carbon-formvar pregătit în prealabil este plasată cu partea mai puțin lucioasă pe o picătură de ser.

8. Grila se ține 2 ore la 37 °C într-o cameră umedă.

9. Cu penseta subțire se scoate plasa și se aplică o picătură de acid fosfotungstic 2% pe suprafața plasei care a fost în contact cu serul.

10. După 30 s, excesul de vopsea este spălat, preparatul este uscat și virusul este inactivat.

Particulele virale agregate sunt examinate la un microscop electronic cu transmisie la o mărire de 30.000 până la 50.000.

3. Identificarea antigenelor virale

Virușii din țesuturi sau fluide tisulare pot fi identificați prin proteine ​​specifice virusului folosind reacția antigen-anticorp. Produsul reacției antigen-anticorp este testat pentru o etichetă, care este introdusă fie direct în anticorpi antivirali, fie în anticorpi direcționați împotriva anticorpilor specifici virusului. Anticorpii pot fi marcați cu fluoresceină, iod radioactiv sau o enzimă care scindează substratul cu o schimbare de culoare. În plus, o reacție de hemaglutinare este utilizată pentru a identifica virusul. În practica de zi cu zi, metodele descrise sunt utilizate în principal pentru a detecta antigenele virusului hepatitei B în sânge și pentru a căuta antigene ale diferitelor virusuri care provoacă diferite boli respiratorii.

În prezent, multe companii produc diagnostice eritrocitare, radioactive și enzimatice, inclusiv cele pentru depistarea virusului hepatitei B. Nu considerăm oportun să descriem metodele de lucru cu aceste diagnostice: este suficient să urmați instrucțiunile atașate. Mai jos ne vom concentra pe metoda imunofluorescentă pentru identificarea virusului respirator sincițial în secrețiile nazofaringiene.

3.1 Identificarea virusului respirator sincițial în secrețiile nazofaringiene prin imunofluorescență

Metoda de obținere a preparatelor de secreții nazofaringiene este descrisă de Gardner și McQuilin. În condiții de laborator, această operație se realizează în două etape. Mai întâi, se prepară un frotiu din mucusul nazofaringian pe o lamă de sticlă. Tampoanele obținute pot fi păstrate în stare fixă ​​la -20°C timp de mai multe luni. În a doua etapă, frotiurile sunt colorate pentru a detecta antigenul virusului respirator sincițial. În acest scop, se utilizează metoda imunofluorescenței indirecte.

3.1.1 Prepararea secretiilor nazofaringiene

1. Mucusul de la pense speciale este spălat cu 1-2 ml de PBS și transferat într-un tub de centrifugă.

2. Se centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm într-o centrifugă de masă.

3. Supernatantul este aruncat.

4. Peletul celular este resuspendat ușor în 2-3 ml PBS până se obține o suspensie omogenă. Pentru a face acest lucru, utilizați o pipetă Pasteur cu gura largă.

5. Suspensia rezultată este transferată într-o eprubetă.

6. Adăugați încă 2-4 ml de PBS în suspensie și amestecați prin pipetare. Cheaguri mari de mucus sunt îndepărtate.

7. Se centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm într-o centrifugă de masă.

8. Supernatantul este drenat, precipitatul este resuspendat într-un astfel de volum de PBS încât suspensia rezultată este ușor separată de pereții eprubetei.

9. Suspensia rezultată se aplică pe lama de sticlă marcată.

10. Paharul se usucă la aer.

Se fixează în acetonă timp de 10 minute la 4°C.

12. După fixare, sticla este din nou uscată la aer.

13. Preparatele rezultate se colorează imediat sau se păstrează la -20 °C.

3.1.2. Tehnica de colorare

1. Imprimați și diluați antiserul comercial împotriva RSV în PBS la concentrația de lucru recomandată.

2. Aplicați o picătură de antiser pe preparatul preparat cu o pipetă Pasteur.

3. Medicamentul este plasat într-o cameră umedă.

4. Preparatul este incubat timp de 30 de minute la 37 °C.

5. Probele sunt spălate cu grijă cu PBS pentru a îndepărta excesul de anticorpi într-un rezervor special.

6. Probele sunt spălate în trei schimburi de PBS timp de 10 minute fiecare.

7. Uscați probele, îndepărtați excesul de PBS cu hârtie de filtru și uscați la aer.

Metode de cercetare virologică— metode de studiere a biologiei virusurilor și de identificare a acestora. În virologie, sunt utilizate pe scară largă metode de biologie moleculară, cu ajutorul cărora a fost posibilă stabilirea structurii moleculare a particulelor virale, modul în care acestea pătrund în celulă și caracteristicile reproducerii virusurilor, structura primară a acizilor nucleici virali. si proteine. Sunt în curs de dezvoltare metode pentru determinarea secvenței elementelor constitutive ale acizilor nucleici virali și ale aminoacizilor proteici. Devine posibilă legarea funcțiilor acizilor nucleici și a proteinelor codificate de aceștia cu secvența de nucleotide și stabilirea cauzelor proceselor intracelulare care joacă un rol important în patogenia unei infecții virale.

Metodele de cercetare virologică se bazează și pe procese imunologice (interacțiunea antigenului cu anticorpii), proprietățile biologice ale virusului (capacitatea de a hemaglutina, hemoliză, activitate enzimatică), caracteristicile interacțiunii virusului cu celula gazdă (natura citopatiei). efect, formarea de incluziuni intracelulare etc.) .

În diagnosticarea infecțiilor virale, în cultivarea, izolarea și identificarea virusurilor, precum și în prepararea preparatelor de vaccin, metoda culturii de țesut și celule este utilizată pe scară largă. Se folosesc culturi de celule primare, secundare, stabile continue și diploide. Culturile primare se obțin prin dispersarea țesutului cu enzime proteolitice (tripsină, colagenază). Sursa celulelor poate fi țesuturile și organele (mai adesea rinichii) embrionilor umani și animale. O suspensie de celule într-un mediu nutritiv este plasată în așa-numitele saltele, sticle sau vase Petri, unde, după ce s-au atașat la suprafața vasului, celulele încep să se înmulțească. Pentru infecția cu virus, se folosește de obicei un monostrat celular. Se scurge lichidul nutritiv, se introduce suspensia virala in anumite dilutii, iar dupa contactul cu celulele se adauga mediu nutritiv proaspat, de obicei fara ser.

Celulele din majoritatea culturilor primare pot fi subcultivate și sunt denumite culturi secundare. Odată cu trecerea în continuare a celulelor, se formează o populație de celule asemănătoare fibroblastelor, capabile de reproducere rapidă, dintre care majoritatea păstrează setul original de cromozomi. Acestea sunt așa-numitele celule diploide. În cultivarea în serie a celulelor, se obțin culturi de celule continue stabile. În timpul trecerilor, apar celule omogene cu diviziune rapidă cu un set heteroploid de cromozomi. Liniile celulare stabile pot fi monostrat și suspensie. Culturile monostrat cresc sub forma unui strat continuu pe suprafata sticlei, culturile in suspensie cresc sub forma de suspensii in diverse vase folosind agitatoare. Există peste 400 de linii celulare derivate din 40 de specii diferite de animale (inclusiv primate, păsări, reptile, amfibieni, pești, insecte) și oameni.

Bucăți de organe și țesuturi individuale (culturi de organe) pot fi cultivate în medii nutritive artificiale. Aceste tipuri de culturi păstrează structura țesuturilor, ceea ce este deosebit de important pentru izolarea și trecerea virusurilor care nu se reproduc în culturi de țesut nediferențiate (de exemplu, coronavirusuri).

În culturile de celule infectate, virusurile pot fi detectate prin modificarea morfologiei celulare, acţiunea citopatică, care poate fi specifică, apariţia incluziunilor, prin determinarea antigenelor virale în celulă şi în fluidul de cultură; determinarea proprietăților biologice ale descendenților virali în fluidul de cultură și titrarea virusurilor în cultura de țesuturi, embrioni de pui sau animale sensibile; prin detectarea acizilor nucleici virali individuali în celule prin hibridizare moleculară sau a grupurilor de acizi nucleici prin metoda citochimică folosind microscopia fluorescentă.

Izolarea virușilor este un proces laborios și îndelungat. Se efectuează pentru a determina tipul sau varianta virusului care circulă în rândul populației (de exemplu, pentru a identifica serovarianta virusului gripal, tulpină sălbatică sau vaccinală a virusului poliomielitei etc.); în cazurile în care este necesar să se efectueze măsuri epidemiologice urgente; când apar noi tipuri sau variante de viruși; dacă este necesar, confirmați diagnosticul preliminar; pentru indicarea virușilor în obiectele din mediu. La izolarea virusurilor se ia în considerare posibilitatea persistenței acestora în corpul uman, precum și apariția unei infecții mixte cauzate de doi sau mai mulți viruși. O populație omogenă genetic a unui virus obținut dintr-un singur virion se numește clonă virală, iar procesul de obținere a acesteia se numește clonare.

Pentru a izola virusurile, se utilizează infecția animalelor de laborator sensibile, embrionii de pui, dar cel mai adesea se utilizează cultura de țesut. Prezența unui virus este determinată de obicei de degenerarea celulară specifică (efect citopatic), formarea de simplaste și sinciții, detectarea incluziunilor intracelulare, precum și un antigen specific detectat prin imunofluorescență, hemadsorbție, hemaglutinare (în virusurile hemaglutinante), etc. . Aceste semne pot fi detectate numai după 2-3 treceri ale virusului.

Pentru izolarea unui număr de virusuri, precum virusurile gripale, se folosesc embrioni de pui, pentru izolarea unor virusuri Coxsackie și a unui număr de arbovirusuri se folosesc șoareci nou-născuți. Identificarea virusurilor izolate se realizează folosind teste serologice și alte metode.

Când se lucrează cu viruși, se determină titrul acestora. Titrarea virusurilor se efectuează de obicei în cultura de țesut, determinând cea mai mare diluție a fluidului care conține virus, la care are loc degenerarea țesuturilor, se formează incluziuni și antigene specifici virusului. Metoda plăcii poate fi utilizată pentru a titra un număr de viruși. Plăcile, sau coloniile negative de viruși, sunt focare de celule distruse de virus dintr-o cultură de țesut cu un singur strat sub acoperire cu agar. Numărarea coloniilor permite o analiză cantitativă a activității infecțioase a virusurilor pe baza faptului că o particulă de virus infecțios formează o placă. Plăcile sunt identificate prin colorarea culturii cu coloranți vitali, de obicei roșu neutru; plăcile nu adsorb colorantul și, prin urmare, sunt vizibile ca pete luminoase pe fundalul celulelor vii colorate. Titrul virusului este exprimat ca număr de unități formatoare de plăci în 1 ml.

Purificarea și concentrarea virusurilor se realizează de obicei prin ultracentrifugare diferențială urmată de centrifugare în gradienți de concentrație sau densitate. Pentru purificarea virusurilor se folosesc metode imunologice, cromatografia cu schimb de ioni, imunosorbenti etc.

Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale include detectarea agentului patogen sau a componentelor acestuia în materialul clinic; izolarea virusului din acest material; serodiagnostic. Alegerea metodei de diagnostic de laborator în fiecare caz individual depinde de natura bolii, perioada bolii și capacitățile laboratorului. Diagnosticul modern al infecțiilor virale se bazează pe metode exprese care permit obținerea unui răspuns la câteva ore după preluarea materialului clinic în stadiile incipiente după boală, printre care microscopia electronică și imună electronică, precum și imunofluorescența, metoda hibridizării moleculare, detectarea anticorpilor din clasa lgM etc.

Microscopia electronică a virusurilor colorate negativ permite diferențierea virusurilor și determinarea concentrației acestora. Utilizarea microscopiei electronice în diagnosticul infecțiilor virale este limitată la acele cazuri în care concentrația de particule virale în materialul clinic este suficient de mare (10 5 în 1). mlși mai sus). Dezavantajul metodei este incapacitatea de a face distincția între virușii aparținând aceluiași grup taxonomic. Acest dezavantaj este eliminat prin utilizarea microscopiei electronice imune. Metoda se bazează pe formarea de complexe imune atunci când se adaugă ser specific la particulele virale, în timp ce are loc concentrația simultană de particule virale, ceea ce face posibilă identificarea acestora. Metoda este folosită și pentru a detecta anticorpi. În scopul diagnosticării exprese, se efectuează o examinare cu microscop electronic a extractelor de țesut, fecale, lichid din vezicule și secrete din nazofaringe. Microscopia electronică este utilizată pe scară largă pentru a studia morfogeneza virusului; capacitățile sale sunt extinse cu utilizarea anticorpilor marcați.

Metoda de hibridizare moleculară, bazată pe detectarea acizilor nucleici specifici virusului, face posibilă detectarea unor copii unice ale genelor și nu are egal în ceea ce privește sensibilitatea. Reacția se bazează pe hibridizarea catenelor complementare de ADN sau ARN (sonde) și formarea de structuri dublu catenare. Cea mai ieftină sondă este ADN-ul recombinat clonat. Sonda este marcată cu precursori radioactivi (de obicei fosfor radioactiv). Utilizarea reacțiilor colorimetrice este promițătoare. Există mai multe variante de hibridizare moleculară: hibridizare punctuală, hibridizare blot, hibridizare sandwich, hibridizare in situ etc.

Anticorpii din clasa lgM apar mai devreme decât anticorpii din clasa G (în a 3-5-a zi de boală) și dispar după câteva săptămâni, deci detectarea lor indică o infecție recentă. Anticorpii din clasa IgM sunt detectați prin imunofluorescență sau imunotest enzimatic folosind antiseruri anti-m (seruri cu lanț greu anti-IgM).

Metodele serologice în virologie se bazează pe reacții imunologice clasice (vezi. Metode de cercetare imunologică ): reacții de fixare a complementului, inhibarea hemaglutinării, neutralizare biologică, imunodifuzie, hemaglutinare indirectă, hemoliză radială, imunofluorescență, imunotest enzimatic, radioimunotest. Au fost dezvoltate micrometode pentru multe reacții, iar tehnicile lor sunt îmbunătățite continuu. Aceste metode sunt folosite pentru identificarea virusurilor folosind un set de seruri cunoscute și pentru serodiagnostic pentru a determina creșterea anticorpilor în al doilea ser față de primul (primul ser se ia în primele zile după boală, al doilea - după 2-3 săptămâni). Valoarea diagnostică nu este mai mică de o creștere de patru ori a anticorpilor în al doilea ser. Dacă detectarea anticorpilor din clasa lgM indică o infecție recentă, atunci anticorpii din clasa lgC persistă câțiva ani și uneori pentru viață.

Pentru a identifica antigenele individuale ale virusurilor și anticorpii împotriva acestora în amestecuri complexe fără purificare prealabilă a proteinelor, se utilizează imunoblot. Metoda combină fracţionarea proteinelor utilizând electroforeza pe gel de poliacrilamidă cu imunotestarea ulterioară a proteinelor prin imunotestul enzimatic. Separarea proteinelor reduce cerințele pentru puritatea chimică a antigenului și face posibilă identificarea perechilor individuale antigen-anticorp. Această sarcină este relevantă, de exemplu, în serodiagnosticul infecției cu HIV, unde reacțiile imunotestare enzimatice fals pozitive se datorează prezenței anticorpilor la antigenele celulare, care sunt prezenți ca urmare a purificării insuficiente a proteinelor virale. Identificarea anticorpilor în serul pacienților la antigenele virale interne și externe face posibilă determinarea stadiului bolii, iar în analiza populațiilor, variabilitatea proteinelor virale. Imunoblotting în infecția cu HIV este utilizat ca un test de confirmare pentru a detecta antigenele virale individuale și anticorpii împotriva acestora. Atunci când se analizează populațiile, metoda este utilizată pentru a determina variabilitatea proteinelor virale. Valoarea mare a metodei constă în posibilitatea analizării antigenelor sintetizate cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant, stabilindu-se mărimea acestora și prezența determinanților antigenici.

Studiile virologice din clinica bolilor infecțioase devin din ce în ce mai importante, ceea ce se datorează în primul rând creșterii proporției de infecții de natură virală, a căror clinică nu este întotdeauna tipică. În același timp, metode rapide și fiabile de diagnosticare virusologică nu au fost dezvoltate pentru toate bolile infecțioase, multe dintre ele sunt laborioase, necesită condiții speciale, animale experimentale, medii nutritive și personal instruit. În prezent, 3 tipuri principale de cercetare sunt utilizate pentru a diagnostica infecțiile virale.
1. Examinarea microscopică a materialului infecțios în vederea identificării antigenului viral sau modificărilor patognomonice în țesuturi. În scopuri de diagnostic, examinarea microscopică directă a materialului infecțios de la pacienți este utilizată pentru un număr limitat de infecții virale (rabie, varicela, febră galbenă, herpes etc.). O metodă bazată pe detectarea antigenului viral folosind anticorpi fluorescenți a câștigat o aplicare mai largă. Metoda de imunofluorescență poate fi de încredere numai dacă toate cerințele tehnice sunt strict îndeplinite.
2. Metode virologice.
3. Studii serologice pentru determinarea creșterii titrului de anticorpi în cursul bolii. Metodele de cercetare serologică sunt mai disponibile în laborator.
Pentru aceste studii, este necesar să se ia ser sanguin în perioada acută a bolii și în perioada de convalescență (seruri împerecheate). Probele de sânge pentru studii serologice se prelevează steril fără anticoagulante și conservanți.
Principalele etape ale cercetării virologice sunt izolarea virusurilor, identificarea acestora și caracterizarea principalelor proprietăți biologice. În prezent, nu există o metodă unică pentru izolarea diferitelor grupuri de viruși. Acest lucru se datorează în primul rând diversității proprietăților și caracteristicilor lor de cultivare în afara organismului gazdă. Pentru studiu se folosesc biosubstrate (spălaturi de la mucoase, sânge și componente ale acestuia, lichid cefalorahidian, urină și fecale, specimene de biopsie de organe și țesuturi sau bucățile acestora prelevate în timpul autopsiei), care sunt supuse unei prelucrări speciale urmate de trecerea materialul. Materialul luat pentru cercetare trebuie păstrat la o temperatură de la -20 °C la -70 °C. În funcție de diagnosticul preliminar, prelucrarea materialului are propriile sale caracteristici, dar în toate cazurile se presupune că se obține un substrat care este purificat la maxim din impuritățile de mucus, celulele organelor și țesuturilor sau fragmentele acestora, bacterii. Acest lucru se realizează prin omogenizarea materialului de testat într-un aparat special sau măcinarea într-un mortar de porțelan la rece cu sticlă de cuarț (bucăți de organe și țesuturi) cu adaos de refrigerat steril (+4 C) 0,9 %

soluție de clorură de sodiu pentru a obține o suspensie 10-30% și centrifugare ulterioară la 1500-3000 rpm timp de 10-15 minute. Supernatantul astfel obținut este utilizat pentru studii ulterioare.
Înainte de dezvoltarea intensivă și introducerea în practică largă a metodei culturii de țesuturi și celule, s-a folosit infecția animalelor de experiment sau a embrionilor de pui. Aceste metode sunt încă utilizate astăzi. Detectarea virusurilor folosind animale este cea mai potrivită în cazurile în care este posibilă reproducerea în experiment a unei imagini tipice a unei boli infecțioase sau a manifestărilor sale individuale. Astfel, agenții patogeni ai arbovirusurilor și grupelor Coxsackie pot fi detectați prin infecția la creierul șoarecilor care alăptează, gripa - prin infectarea embrionilor de pui sau administrarea intranazală a materialului de testat la șoareci. În ultimii ani, laboratoarele virologice au folosit cel mai pe scară largă metoda culturii celulare și tisulare, care face posibilă izolarea adenovirusurilor, virusurilor herpetice, virusului sincițial respirator, mixovirusurilor și altele, și efectuarea diagnosticului etiologic al bolii deja la primele etape ale studiului. Baza pentru aceasta este caracteristicile citologice bine studiate ale interacțiunii majorității virusurilor și celulelor. Astfel, infecția celulelor HeLa, Hep-2 cu un material care conține adenovirus de tip 2 duce deja în a 3-a zi la o modificare a modelului de creștere a monostratului celular și la apariția celulelor tipice sub formă de ciorchini de struguri etc. , care sunt bine definite în microscopul obișnuit la o mărire redusă.
De o importanță excepțională pentru diagnosticul etiologic al unei boli infecțioase este standardizarea izolării virusului din materialul de testat, care în această etapă a lucrării implică utilizarea animalelor liniare pure genetic, ținând cont de caracteristicile lor fenotipice (în primul rând de vârstă). Acest lucru se datorează în primul rând faptului că animalele experimentale de diferite linii genetice și vârste sunt susceptibile la viruși în diferite grade. Astfel, în timpul infecției intracerebrale a șoarecilor cu tulpina neurotropă WSN a virusului gripal, liniile BALB/c, A, CBA și animale de consanguinitate au prezentat cea mai mare sensibilitate, același model fiind stabilit în cazurile de administrare intranazală a materialului de testat. Esențială pentru rezultatele finale ale izolării virusului este o examinare preliminară a animalelor, embrionilor de pui, culturilor de celule și țesuturi pentru purtătorii latenți de virus. Foarte larg folosiți în practica de laborator, embrionii de pui pot fi infectați cu viruși de leucemie aviară, encefalomielita aviară, sinuzită infecțioasă, psitacoză, boala Newcastle, agenți patogeni ai unor infecții bacteriene (paratifoide etc.), precum și micoplasme. Un număr și mai mare de agenți bacterieni și în special virali sunt capabili să infecteze spontan culturile de celule și țesuturi și să supraviețuiască în ele. Prezența lor afectează semnificativ evaluarea materialului studiat. Unele tipuri de micoplasme în cultura celulară
poate provoca hemaglutinare și hemadsorbție și chiar să formeze plăci sub învelișul de agar, asemănătoare cu virusurile formate. De importanță nu mică este și contaminarea culturilor celulare de un tip de către altele, cel mai adesea aceasta este asociată cu celulele HeLa și se observă atunci când se lucrează cu diferite tipuri de culturi în aceeași încăpere, cu procesarea proastă a sticlei de laborator etc. prezența contaminării culturilor celulare sau infectarea animalelor cu agenți bacterieni, cum ar fi, de regulă, se manifestă destul de clar (modificări ale modelului de creștere a monostratului celular, proprietățile mediului de cultură, moartea embrionilor de pui sau a animalelor). cu anumite simptome etc.) şi nu prezintă dificultăţi deosebite în evaluarea rezultatelor. Situația este mai complicată cu formele latente de infecție, unde este necesară utilizarea metodelor serologice și a altor metode. Aceste instrucțiuni trebuie luate în considerare în munca unui virolog, în special atunci când se efectuează un diagnostic etiologic al cazurilor neclare ale bolii.