O oligonucleotidă este o bucată scurtă de acid nucleic cu lungimea mai mică de 50 de nucleotide. În ultimii 20 de ani, sensul sa extins pentru a include toți acizii nucleici sintetizați chimic, indiferent de lungime. Prima publicație despre sinteza chimică țintită a unei oligonucleotide a apărut în 1955.

De atunci, milioane de oligonucleotide au fost sintetizate în fiecare an pentru a fi utilizate în laboratoare din întreaga lume. Majoritatea studiilor necesită doar cantități mici de ADN. Sunt necesare cantități mult mai mari de ADN (10 µmol sau mai mult) pentru utilizarea în studiile biofizice (RMN și cristalografie cu raze X), astfel încât pentru a permite sinteza unor cantități atât de mari, au fost dezvoltate metode de sinteză în fază solidă care permit utilizarea oligonucleotidelor ca molecule medicamentoase (de exemplu, oligonucleotide antisens).

Sinteza oligonucleotidelor ADN sau ARN se referă la sinteza chimică a fragmentelor de acid nucleic cu structuri chimice definite sau secvențe de diferite dimensiuni.

Fig.1. Structuri ale oligonucleotidelor.

Principiul sintezei în fază solidă a fost dezvoltat și aplicat pentru prima dată la sinteza polipeptidelor de Robert Bruce Merrifield, un biochimist american care a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 1984 pentru invenția sa a sintezei peptidelor în fază solidă. El a realizat că cheia unei sinteze de succes constă în ancorarea primului monomer la faza solidă polimerică insolubilă. Alți monomeri pot fi apoi conectați, unul câte unul, la capătul terminal imobil al polimerului în creștere. La sfârșitul sintezei, lanțul polimeric finalizat poate fi desprins de polimerul insolubil și purificat. Acest proces a fost optimizat de-a lungul anilor pentru a fi extrem de eficient și a devenit acum o tehnică fundamentală utilizată în sintetizatoarele automate de oligonucleotide.

Pentru a asigura sinteza cu succes a oligonucleotidelor, sunt necesare următoarele condiții:

• Toți reactivii trebuie să fie solubili în solvenți neapoși.
• Grupările amino și hidroxil ale bazelor nucleotidice și resturile de carbohidrați trebuie blocate corespunzător.
• Grupările protectoare introduse în timpul sintezei trebuie să fie stabile în condiții de alungire a lanțului în timpul formării unei legături internucleotide fosfodiester.
• Grupările protectoare trebuie să fie suficient de labile, astfel încât să poată fi îndepărtate la sfârșitul sintezei fără a deteriora produsele de reacție.

Funcțiile oligonucleotidelor și perspectivele de aplicare a acestora

În prezent, oligonucleotidele și analogii lor sunt utilizați pe scară largă în diverse domenii, cum ar fi medicina și cercetarea biologică moleculară, și sunt, de asemenea, considerate agenți terapeutici promițători și sonde pentru diagnosticarea moleculară.

În ultimii 20 de ani, doar două tipuri de analogi ai acidului nucleic cu un schelet formal neutru din punct de vedere electric, acizii nucleici peptidici și oligonucleotide morfolino-fosfodiamide, au fost relativ bine studiate. Analogii ambelor tipuri sunt capabili de legarea complementară la moleculele naturale de ADN și ARN și, prin urmare, au găsit aplicație atât în ​​biologia moleculară, cât și, în special, în medicină ca potențiale medicamente.

În plus, odată cu dezvoltarea tehnologiilor ADN, a devenit posibilă studierea expresiei genelor cunoscute, determinarea mutațiilor în genomul diferitelor organisme și diagnosticarea unui număr de boli infecțioase. În rezolvarea acestor probleme, cea mai promițătoare este utilizarea cipurilor ADN, care sunt plăci mici cu fragmente de ADN depuse pe suprafața lor.

Metoda de creare a cipurilor ADN combină metode bazate pe sinteza țintită a oligonucleotidelor direct pe suprafața cipului. Sinteza este realizată prin adăugare treptat la lanțul de oligonucleotide în creștere de nucleotide care conține o grupare protectoare labilă la capătul 5’, a cărei îndepărtare este posibilă sub acțiunea radiației luminoase, a tensiunii electrice sau în timpul hidrolizei acide.

De asemenea, s-a arătat că, în funcție de gena țintă selectată, oligonucleotidele țintite pe genă au o varietate semnificativă de efecte de modulare asupra țesuturilor tumorale, variind de la încetinirea și oprirea proliferării celulelor tumorale și terminând cu suprimarea proprietăților lor invazive.

Medicamentele anticancerigene pe bază de acizi nucleici sunt un instrument foarte specific pentru modularea expresiei genelor. Suprimarea unui număr de gene care sunt supraexprimate anormal în timpul transformării neoplazice poate fi realizată cu medicamente pe bază de acid nucleic, cum ar fi oligonucleotidele antisens (asON). În general, mecanismul de suprimare a expresiei genelor constă în legarea lor complementară la ARNm-ul țintă, după care ARNm-ul țintă fie este scindat, fie procesul său de translație este blocat.

asON sunt ADN-uri sintetice monocatenar lungi de 15-20 de nucleotide. Recent, au fost obținute asON care pot împiedica transportul ARNm spliced ​​de la nucleu la citoplasmă, precum și asON, care, ca urmare a blocării site-ului de splicing în pre-ARNm, pot duce la exprimarea unui variantă proteică alternativă.

Datorită faptului că oligodeoxirribonucleotidele naturale în cultura celulară și în condiții in vivo suferă o degradare rapidă sub acțiunea nucleazelor, în structura asON sunt introduse diferite modificări chimice pentru a le crește stabilitatea.

Sinteza chimică a oligonucleotidelor

Sinteza în fază solidă este utilizată pe scară largă în sinteza peptidelor, sinteza oligonucleotidelor, sinteza oligozaharidelor și chimia combinatorie. Sinteza chimică în fază solidă a fost inventată în anii 1960 de Bruce Merrifield și a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 1984.

Sinteza în fază solidă se realizează pe un suport solid, între filtre, în coloane care permit trecerea tuturor reactivilor și solvenților. Sinteza în fază solidă are o serie de avantaje față de sinteza în soluție:

 asigură o viteză mare de reacţie

 Impuritățile și excesul de reactivi sunt spălate, deci nu este necesară curățarea după fiecare pas

 procesul este susceptibil de automatizare pe sintetizatoare în fază solidă controlate de computer.

Purtătorii solizi (numiți și rășini) sunt particule insolubile în apă, de obicei cu un diametru de 50-200 um, de care este atașată o oligonucleotidă în timpul sintezei.

Există dovezi că unul dintre cele mai eficiente materiale care poate fi folosit ca suport solid este sticla poroasă. Este destul de rigid și nu poate să se umfle. În porii săi adânci, are loc sinteza oligonucleotidelor. Sticla conține pori de 500 Å (50 nm), care sunt potriviți pentru sinteza oligonucleotidelor scurte. Cu toate acestea, este slab potrivit pentru sinteza oligonucleotidelor cu lungimea de peste 40 de baze. Acest lucru se datorează faptului că oligonucleotida în creștere blochează porii și reduce difuzia reactivilor prin matrice.

Suporturile solide pentru sinteza convențională de oligonucleotide sunt realizate în mod obișnuit cu o încărcare de 20-30 pmol de nucleozidă per gram de rășină. Sinteza oligonucleotidelor la sarcini mai mari devine mai puțin eficientă din cauza obstacolelor sterice dintre catenele de ADN adiacente atașate la rășină.

Etapele sintezei chimice a oligonucleotidelor

Oligo-sinteza fosforamidatului are loc în direcția 3’ până la 5’ (opusă direcției 5’ până la 3’ a biosintezei ADN-ului în replicarea ADN-ului). Se adaugă o nucleotidă pe ciclu de sinteză.

Orez. 2. Ciclul de sinteză a oligonucleotidelor fosforamidate

La începutul sintezei oligonucleotidelor, prima nucleozidă este atașată în prealabil la rășină (purtător) și coloanele de sinteză A, G, C sau T sunt selectate în funcție de nucleozida de la capătul 3’ al oligonucleotidei dorite. Nucleozida ancorată are o grupare protectoare 5'-DMT (DMT=4,4'-dimetoxitritil) al cărei rol este de a preveni polimerizarea şi această grupare protectoare trebuie îndepărtată (detritilare). Mecanismul detrializării este prezentat în Figura 3.

Fig.3. Mecanism de îndepărtare a grupului de protecție.

După detritilare, nucleozida ancorată este gata să reacționeze cu următoarea bază, care se adaugă ca monomer fosforamidat de nucleozid. Un exces mare de nucleozidă corespunzătoare este amestecat cu un activator (tetrazol sau derivații săi). Gruparea diizopropilamino a nucleozidei este protonată de activator și astfel devine o grupare foarte detașabilă. Este deplasat rapid de gruparea 5′-hidroxil a nucleozidei legate, creând un triester fosfit (Fig. 4).

Fig.4. Mecanismul de protonare de către un activator.

Fosforamiditele nucleozidice sunt destul de stabile într-o atmosferă inertă și pot fi produse în cantități mari, expediate în întreaga lume și depozitate ca solid uscat timp de câteva luni înainte de utilizare.

Cu toate acestea, chiar și cu munca de sinteză a oligonucleotidelor de înaltă precizie, rămâne posibilitatea ca câteva grupări 5′-hidroxil nereacționate să fie disponibile pentru a participa la următoarea etapă. Dacă o astfel de întrerupere nu este oprită, acestea se vor acumula cu fiecare ciclu următor, iar produsul final va fi un amestec complex de oligonucleotide, dintre care majoritatea vor purta informații genetice incorecte.

Prin urmare, metoda de acetilare a grupărilor 5’-hidroxil le face inerte în raport cu reacția ulterioară. Acest lucru este, de asemenea, necesar pentru a minimiza impuritățile.

Fosfitul triester (P(III)) format în etapa de adăugare este instabil la acizi și trebuie transformat în forma stabilă (P(V)). Acest lucru se realizează datorită oxidării iodului în prezența apei și a piridinei (Fig. 5). Fosfotriesterul rezultat este de fapt o axă ADN protejată de o grupare 2-cianoetil. Gruparea cianoetil previne reacțiile nedorite cu fosforul în timpul ciclurilor de sinteză ulterioare.

Fig.5. Mecanismul etapei oxidative.

După aceasta, gruparea de protecție a DMT de la capătul 5’ al catenei de ADN trebuie îndepărtată, astfel încât gruparea hidroxil primară să poată reacționa cu următorul fosforamidat de nucleotidă. Reacția de deprotejare cu acid tricloracetic în diclormetan este rapidă. Ciclul se repetă, o dată pentru fiecare bază, până se obține oligonucleotida dorită.

Apoi, trebuie să detașați oligonucleotida sintetizată din suportul solid. În acest caz, se utilizează succinil. Separarea este posibilă atunci când este tratată cu amoniac apos concentrat la temperatura camerei timp de o oră (Fig. 6).

Fig.6. Mecanism de separare a unei oligonucleotide de un purtător solid într-o soluție apoasă concentrată de amoniac.

Reacția de scindare este efectuată automat pe unele sintetizatoare, iar soluția de amoniac care conține oligonucleotida intră într-un flacon de sticlă. Alternativ, digestia se poate face manual prin luarea coloanei din sintetizator și clătirea în seringi care conțin hidroxid de amoniu.

Oligonucleotida este dizolvată în amoniac apos concentrat, iar încălzirea ulterioară permite îndepărtarea grupărilor protectoare din baze heterociclice și fosfați. Soluția apoasă este apoi îndepărtată prin evaporare și oligonucleotida este gata pentru purificare.

Pe lângă grupul de protecție DMT, sunt necesare și grupări protectoare suplimentare pentru adenină, citozină și guanină (Fig. 7). Cu toate acestea, acest lucru nu este necesar pentru timină.

Fig.7. Structuri de grup de protecție utilizate în mod obișnuit pentru a proteja bazele adenină, citozină și guanină în timpul sintezei fosforamidatelor oligonucleotidelor ADN.

concluzii

1. Oligonucleotidele sintetizate artificial sunt din ce în ce mai utilizate în diverse domenii ale științei, iar metodele de preparare a acestora sunt din ce în ce mai îmbunătățite, ceea ce face posibilă sintetizarea unui număr suficient de oligonucleotide pentru experimente de laborator și pentru crearea de medicamente terapeutice.

2. Până în prezent, cea mai comună metodă pentru sinteza oligonucleotidelor este metoda de sinteză în fază solidă, care poate accelera semnificativ procesul de obținere a oligonucleotidelor, precum și poate reduce cantitatea de reactivi uzați.

Kupryushkin, M. S. Fosforilguanidine. O nouă clasă de analogi ai acizilor nucleici / M.S. Kupryushkin, D.V. Pyshny, D.A. Stetsenko // Acta Naturae (versiunea rusă). - 2014. - Nr. 4 (23). - P.123-125.

Garafutdinov, R.R. Aspecte chimice ale creării cipurilor ADN / R.R. Garafutdinov, I.S. Shepelevici, A.V. Chemeris, R.F. Talipov // Buletinul Bashkirskului. universitate - 2005. - Nr. 1. - P.49-54.

Patutina, O. A. Ultimele abordări în tratamentul bolilor oncologice: medicamente anticancerigene pe bază de acizi nucleici țintiți pe gene / O.A. Patutina, N.L. Mironova, V.V. Vlasov, M.A. Zenkova // Acta Naturae (versiunea rusă). - 2009. - Nr. 2. - P.47-66.

Rodriguez, A.A. Conversia adeninei în 5-amino-4-pirimidinilimidazol cauzată de acoperirea cu acetil în timpul sintezei oligonucleotidelor în fază solidă/ A.A. Rodriguez, I. Cedillo, A.K. McPherson// Bioorg Med Chem Lett. - 2016. - P. 30653-9.

Vizualizări ale postărilor: Va rugam asteptati

rezumat

Revizuirea ia în considerare caracteristicile farmacocinetice ale diferitelor preparate de oligonucleotide antisens. S-a comparat farmacocinetica medicamentelor de prima și a doua generație. Și, de asemenea, a luat în considerare efectul asupra farmacocineticii modificării chimice a moleculei.

Cuvinte cheie Cuvinte cheie: oligonucleotide antisens, oligodeoxinucleotide de fosfotioat, farmacocinetică

Introducere

Proprietățile farmacocinetice ale oligonucleotidelor antisens (ASO) devin cel mai bine înțelese atunci când se iau în considerare proprietățile lor fizice și chimice. Parametri precum sarcina, greutatea moleculară și natura amfipatică a fosfotioatului ACO au un efect marcat asupra farmacocineticii lor. Structura chimică, în special, gruparea fosfotioat și 2’-metoxietil (MOE), are un efect deosebit de semnificativ asupra proprietăților farmacocinetice ale ASO.

Absorbția, distribuția, metabolismul și excreția oligodeoxinucleotidelor de fosfotioat de prima generație (ODN) au fost studiate pe larg pe animale de laborator și în studii clinice. Caracteristicile farmacocineticii preparatelor de fosfotioat ASO sunt următoarele: fosfotioat ODN administrat parenteral se găsește rapid în plasma sanguină, unde se leagă de regiunile hidrofile ale proteinelor plasmatice și evită astfel filtrarea glomerulară. Aceste regiuni hidrofile sunt distincte de alte regiuni hidrofile de care se leagă medicamentele lipofile și, prin urmare, există o concurență mică pentru legarea proteinelor plasmatice pentru ASO. Cinetica plasmatică se caracterizează printr-o fază scurtă de distribuție (de ordinul mai multor ore) urmată de o fază de eliminare cu un timp de înjumătățire de zile sau săptămâni. Faza inițială de distribuție include în mod necesar legarea ASO de proteine ​​și distribuția acestor complexe peste țesuturile ficatului, rinichilor, ganglionilor limfatici, măduvei osoase și splinei, care sunt locurile celei mai active legături și acumulări de ASO. . Este clar că faza eliminării ASO datorită legării inițiale de proteine ​​este determinată de stadiul inițial al distribuției sale. Datorită posibilei saturaţii a proteinelor , aria de sub curba farmacocinetică (ASC) crește odată cu creșterea dozei, deoarece ASO nu se mai leagă de proteine ​​după saturarea acestora, ci intră în fluxul sanguin într-o formă liberă. După legare, ASO pătrunde în celule de-a lungul unui gradient de concentrație din spațiul extracelular prin membrana celulară în spațiul intracelular, probabil cu ajutorul unei proteine ​​purtătoare. ASO din celule se leagă de țintele disponibile, dar în principal ASO din celule se leagă cel mai probabil de proteinele intracelulare. În celulă, nucleazele omniprezente, dar nu și enzimele citocromului P450, metabolizează preparatele ASO. Deoarece enzimele citocromului P450 metabolizează de obicei medicamentele cu molecule mici, ASO nu concurează în procesele metabolice cu compușii convenționali cu molecule mici, reducând riscul interacțiunilor medicamentoase. Excreția de ASO în urină este în cele din urmă rezultatul metabolismului în țesuturi și al stabilirii unui echilibru de metaboliți și substanțe native în afara țesuturilor și în circulația sistemică. Aceste procese la animalele de laborator și la oameni sunt foarte asemănătoare, motiv pentru care nu este posibil să se identifice o corelație interspecie între animalele de laborator și oameni.

În prezent, configurația ASO de „a doua generație”, care prezintă grupuri MOE la poziția de 2" a nucleotidelor la capete de 3" și 5", este cea mai utilizată în studiile clinice. Această configurație este o structură mai avansată în comparație cu ODN-urile fosfotioat nemodificate. . , care sunt medicamente antisens de prima generație. Acest lucru se datorează eficacității sale crescute, toxicității reduse și timpului de înjumătățire crescut. Mulți factori asociați cu trecerea de la prima la a doua generație de ASO sunt direct legați de îmbunătățirea farmacocineticii lor.

Caracteristicile structurii chimice a ASO

Schelet fosfotioat

Cele mai timpurii încercări de a crea medicamente cu activitate antisens au fost asociate cu utilizarea ADN-ului nemodificat, care, din păcate, era foarte susceptibil la degradarea de către nuclează. După cum s-a dovedit, nucleazele ubiquitare scindează legăturile fosfodiesterazei ADN-ului nativ, rezultând că timpul de înjumătățire al ASO-urilor nemodificate este de câteva minute. Această degradare rapidă a fost o caracteristică majoră a profilului farmacocinetic al ADN-urilor antisens nemodificate. Schimbarea coloanei vertebrale fosfodiester a ADN-ului în fosfotioat a schimbat drastic profilul farmacocinetic al ASO. În aceste preparate, structura fosfotioatului înlocuiește un atom de sulf din legăturile fosfodiester cu un atom de oxigen fără punte. Această structură crește rezistența ASO la nucleaze și, în consecință, le îmbunătățește proprietățile cinetice.

Chiralitatea fosfotioatului

Studiile au arătat că tiarea scheletului diester al ACO nu numai că îi mărește rezistența la nucleaze, dar contribuie și la apariția chiralității, adică la posibilitatea existenței unor stereoizomeri, la fiecare legătură fosfotioat, ceea ce duce la faptul că că în orice ACO 20-mer există 219 stereoizomeri Sp sau Rp. Combinația dintre rezistența la nuclează și legarea crescută de proteine ​​influențează puternic farmacocinetica ASO. Creșterea stabilității fosfotioatului ASO duce la faptul că timpul de înjumătățire plasmatică al medicamentului crește la 30-60 de minute în comparație cu timpul de înjumătățire al fosfodiesterului ASO, care este de 1-2 minute.

Rezistența nucleazelor și chiralitatea datorită schimbului de fosfodiester cu legături fosfotioat merită discutate, deoarece proprietățile fizice asociate cu această caracteristică structurală sunt importante atât pentru ASO de prima cât și pentru a doua generație. Rezistența la nucleaze de fosfotioat ASO apare din cauza apropierii de sulf pe oxigenul nepuntare din locul activ al exonucleazei față de ionul metalic. Această proximitate poate provoca deplasarea ionului metalic de la locul activ. Acest efect a fost demonstrat în modelul 3’–5’ ADN polimerază exonuclează. Datele cristalografice cu raze X susțin această ipoteză despre deplasarea ionului metalic. Diferențele aparente în sensibilitatea stereoizomerilor la activitatea exonucleazei ADN polimerazei sunt în concordanță cu conformația propusă a stereoizomerilor de fosfotioat ODN în situsul activ. Este probabil ca chiralitatea legăturilor fosforotioat să poată interfera cu alte nucleaze în același mod, adică prin deplasarea ionilor metalici, deși diferite exonucleaze pot prezenta preferințe diferite pentru legăturile Rp și Sp, în funcție de natura situsului activ al enzimei.

Alternativ, sulful poate lua pur și simplu locul oxigenului în legăturile diester. Diferențele în capacitatea sulfului de a prelua o sarcină negativă, în comparație cu oxigenul, fac posibilă prezicerea modificărilor locului activ. Această modificare se datorează cel mai probabil hidrolizei legăturilor fosfodiester și poate fi prin formarea unui fosfor pentavalent tranzitoriu cu doi atomi de oxigen încărcați negativ. Înlocuirea unuia dintre atomii de oxigen ecuatoriali cu sulf va avea efecte negative asupra activității enzimatice: (1) legarea apei este redusă, ceea ce stabilizează sarcina negativă locală asupra atomilor, făcând dificilă obținerea unei a doua sarcini negative asupra sulfului; şi (2) legarea redusă a Mg2+ la sulf. Există dovezi pentru acest din urmă efect în studiile privind nivelul de scindare ribozimă a incluziunilor fosforotioatului diastereomeric, când adăugarea de Mg 2+ inhibă efectele de scindare ale ribozimelor fosforotioatului. În plus, s-a demonstrat că există o oarecare scădere a activității nucleazei în regiunile scheletice mai îndepărtate de legăturile fosfotioat, sugerând o transmitere a efectului de chiralitate. Acest fenomen este cel mai bine explicat prin modificările în aranjarea moleculelor de apă în jurul coloanei vertebrale fosfotioat în comparație cu coloana vertebrală fosfodiester.

Efectele stereospecifice asupra activității nucleazei afectează în mod semnificativ farmacocinetica fosforotioatului ASO, iar acest lucru se manifestă cel mai clar în rata de metabolizare a fosforotioatului ASO de prima generație în plasma sanguină. Rata de eliminare completă a ASO din plasmă scade, sugerând o încetinire a metabolismului. Aceste modificări ale vitezei nu pot fi explicate numai în termeni cinetici de ordinul întâi, dar pot fi explicate prin diferențele de susceptibilitate a legăturilor Rp și Sp.

Diferențele stereospecifice în activitatea exonucleazei sunt mai puțin importante pentru ASO de a doua generație. Acest lucru se datorează faptului că ASO din a doua generație au modificări de 2" la capetele 3" și 5", care împiedică scindarea lor de către exonuclează. Folosind o endonuclează izolată din patogenul Serratia marcescens, efectele chiralității legăturilor fosforotioat. au fost studiate.la fel ca exonucleazele, este unul dintre oxigenii nepunturi pentru hidroliza legăturilor fosfodiesterice.În diastereomer, sulful este localizat în imediata apropiere a Mg 2+, drept urmare activitatea enzima scade, în timp ce în diastereomerul Rp nu.Deoarece endonucleaza Serratia are asemănări semnificative cu unele endonucleaze de mamifere, ar trebui să presupunem că acest mecanism poate fi aplicabil pe scară largă.Modul în care caracteristicile stereochimice ale legăturilor fosforotioat afectează acțiunea altor endonucleaze este Cu toate acestea, dacă presupunem că reacția se desfășoară după o schemă asemănătoare endonucleazei Serratia, putem presupune că locul activ va conține un ion metalic (probabil Mg 2+) și sulful va afecta acțiunea nucleazelor. , când este orientat către ionul metalic. Dacă endonucleazele sunt sensibile la chiralitate, acest lucru ar putea avea implicații importante pentru dezvoltarea problemei creării de medicamente eficiente de a doua generație. Pe lângă efectul chiralității asupra medicamentelor din prima generație, efectul chiral asupra metabolismului medicamentelor din a doua generație poate duce la o încetinire a metabolismului acestora. Astfel, de exemplu, se poate presupune că stereoizomerii cu metabolizare rapidă vor fi distruși selectiv, lăsând să funcționeze doar izomerii metabolizați lent.

Legarea ASO de proteine

S-a constatat că, în comparație cu ASO cu un schelet fosfodiester, farmacocinetica structurilor fosfotioatului este afectată semnificativ de legarea lor la proteine. Baza chimică pentru legarea crescută de proteine ​​este lipofilitatea crescută a legăturilor fosfotioat în comparație cu legăturile fosfodiester. Deoarece interacțiunile moleculare cu apa sunt determinate de forma și funcția macromoleculelor în soluție apoasă, chiar și mici modificări ale lipofilității scheletice pe toată lungimea ASO pot avea consecințe asupra interacțiunii oligomerului cu apa și macromolecule precum proteinele.

Într-o primă aproximare, ODN-urile fosfotioatului se leagă de proteinele celulare mai aleatoriu decât ODN-urile fosfodiester. De ce fosfotioatul ASO se leagă mai bine de proteine ​​nu este pe deplin înțeles. Explicațiile posibile sugerează o lipofilitate crescută și complexare cu ioni metalici.

Importanța legării proteinelor plasmatice pentru farmacologia, farmacocinetica și toxicologia fosfotioatului ASO (atât prima, cât și a doua generație) nu poate fi supraestimată. La nivelul concentrației micromolare, mai mult de 90% din ODN-urile fosfothioate sunt legate în plasmă. Există diferențe specifice în procentul și puterea legării proteinelor, precum și diferențe calitative în legarea ASO la proteine ​​specifice la diferite specii. Legarea fosfotioatului ASO de proteinele circulante împiedică acești compuși să fie filtrați de glomerulii renali și excretați în urină. În cazul saturației, de exemplu, când se administrează o doză mare de ASO, excreția urinară de ASO de lungime completă este îmbunătățită. Datorită diferențelor dintre specii, saturația la diferite specii este determinată de diferite concentrații de ASO. De exemplu, proteinele plasmatice de șoarece au o afinitate mai mică pentru ASO decât cele ale șobolanilor sau oamenilor. Prin urmare, efectul de saturație a procesului de legare a ASO la proteinele plasmatice la șoareci are loc la concentrații mai mici în comparație cu alte specii. Diferențele dintre specii în legarea proteinelor plasmatice sunt un factor semnificativ în diferențele dintre farmacocinetica dintre specii.

Rezistența nucleazelor și legarea proteinelor, care sunt caracteristice pentru ASO cu legături fosfotioat, modifică, de asemenea, farmacocinetica terapiei cu ASO. Structurile chimice suplimentare, caracteristice celei de-a doua generații de medicamente create, introduc alte modificări în farmacocinetica lor.

Derivați metoxietil ai ACO

ASO-urile de a doua generație au fost dezvoltate pentru a îmbunătăți unele dintre caracteristicile ODN-urilor din prima generație. Astfel, structurile de fosfotioat adăugate la grupele MOE în pozițiile 2" își măresc rezistența la nucleaze și modifică eficiența legării proteinelor.

Rezistența MOE la nucleaze

Sa demonstrat că structura MOE afectează rezistența ASO la nucleaze. În timp ce structurile fosfotioatice reduc activitatea exonucleazei, structura din poziția de 2" elimină practic activitatea exonucleazei. Rezistența la nuclează poate fi rezultatul (1) înlocuirii hidrogenului de 2" cu MOE, (2) efectelor sterice ale MOE sau (3) formarea unui înveliș de apă rigid în jurul scheletului ASO. Oricare ar fi motivele rezistenței la nucleaze, prezența grupului MOE face ca ASO-urile modificate în poziția de 2" practic imuni la efectele nucleazelor circulante și ale majorității celulare. Regiunea centrală a scheletului ASO, constând din deoxifosfotioați, nu este nici pe departe la fel de mult. rezistente la clivajele mediate de nucleaze Diferențele de ASO din prima și a doua generație în situsurile supuse metabolismului, determină și diferențele de tipare metabolice.

La evaluarea modelelor metabolice folosind electroforeza pe gel capilar (CGE) sau cromatografie lichidă/spectrometrie de masă (LC/MS), nu s-au găsit metaboliți care să fie mai scurti cu o nucleotidă. Mai presus de toate, s-au găsit metaboliți scindați în situsul deoxi (probabil de endonucleaze), calea ulterioară a metabolismului este reducerea dimensiunii produselor de scindare. Rezistența la exonuclează și metabolismul lent sub influența endonucleazelor active duce la formarea de compuși caracterizați printr-un timp de înjumătățire lung .

Legarea MOE de proteine

Studiile experimentale au arătat că ASO fosfotioat cu structuri 2’-MOE au o afinitate mai mică pentru proteinele plasmatice în comparație cu ASO fosfotioat nemodificat.aproximativ 18 până la aproximativ 40 μM. În același timp, în structura MOE complet substituită a ASO, afinitatea pentru proteinele plasmatice scade doar ușor. De ce o creștere a numărului de structuri MOE într-o oligonucleotidă nu afectează o scădere suplimentară a afinității pentru proteinele plasmatice nu este clar, dar acest lucru se poate datora caracteristicilor structurii secundare ASO.

Scăderea afinității proteinelor asociată cu structurile MOE poate fi justificată de unele proprietăți fizice. Probabil cel mai semnificativ factor fizic care distinge ASO-urile MOE modificate de cele nemodificate este prezența unei învelișuri moleculare de apă, care provine din lanțul lateral MOE. Substituenții MOE din coloana vertebrală a hidrocarburilor „chelează” moleculele de apă (și eventual ionii metalici), formând o înveliș apoasă și reducând contactul potențial dintre moleculele de sulf „lipicios” și proteinele plasmatice sau celulare. Gradul de legare a ASO de proteine ​​este invers corelat cu excreția lor în urină. Introducerea legăturilor fosfotioat și a substituenților 2’-MOE modifică legarea proteinelor și, ca urmare, modifică proprietățile ASO.

Absorbția, distribuția, metabolismul și excreția ASO

Aspiraţie

Calea parenterală de administrare a ASO

Studiile au stabilit că din cauza greutății moleculare (aproximativ 7000 D) și a sarcinilor negative ale ASO, absorbția acestor medicamente din tractul gastrointestinal este limitată. De aceea, se utilizează de obicei calea parenterală de administrare a acestora. Perfuzia subcutanată, intravenoasă sau injecția intravitreală este utilizată pentru a administra medicamente de prima generație. Activitatea proinflamatoare mai scăzută a ASO de a doua generație le face mai potrivite pentru administrarea subcutanată. Farmacocinetica acestor medicamente în plasmă cu injecții subcutanate și perfuzii intravenoase este comparabilă. Studiile pe animale de laborator arată că, în cele din urmă, distribuția ASO este, de asemenea, comparabilă în diferite organe, cu excepția locului de injectare și a ganglionilor limfatici.

După administrarea subcutanată, atât ASO din prima cât și din a doua generație sunt absorbite rapid de la locul injectării în circulația sistemică. În studiile clinice, după administrarea subcutanată a ASO de a doua generație, timpul până la atingerea concentrației maxime (T max) variază de la 1,5 la 4,7 ore în intervalul de doze de la 25 la 200 mg la un volum constant de 1 ml. Biodisponibilitatea dozei subcutanate variază de la 36 la 82% din doza administrată. Studiile preclinice și clinice sugerează că biodisponibilitatea ASO crește odată cu concentrația.

Cinetica ASO la locul injectării poate afecta răspunsul local, precum și cinetica și distribuția lor sistemică. Reducerea concentrației de ASO la locul injectării reduce ipotetic răspunsul local la injectare. O abordare pentru a reduce concentrația de ASO la locul injectării este de a dilua soluția și, ca urmare, de a crește suprafața de absorbție din depozitul subcutanat. Teoretic, diluția soluțiilor și suprafața mare de aspirație ar trebui să reducă concentrația locală și să reducă reacțiile locale. Aceleași efecte ar putea fi de așteptat cu o creștere a absorbției sistemice. Prin urmare, modificările de doză și volum pot fi considerate variabile potențiale. Cu toate acestea, chiar și astăzi, injecțiile subcutanate cu volume mici și concentrații relativ mari demonstrează o biodisponibilitate ridicată a materialului aplicat.

Administrația locală a ASO

Un studiu al diferitelor metode de administrare a ASO demonstrează că formele lor de aerosoli, administrarea rectală și injecțiile intravitreale sunt utilizate ca mijloace de administrare locală. Pentru tratamentul bolilor pulmonare, este posibil să se creeze concentrații relativ mari de ASO în plămâni folosind aerosoli.

Cinetica ODN-ului de prima generație a fost studiată la șoareci. S-a stabilit că cinetica unor astfel de medicamente este dependentă de doză, clearance-ul este pulmonar cu un timp de înjumătățire de aproximativ 2 ore. În schimb, studiile asupra MOE ASO modificate de a doua generație arată un timp de înjumătățire de mai mult de 4 zile. Ca și în cazul altor tratamente topice, avantajul inhalării este capacitatea de a crea concentrații locale mari în țesuturi care nu acumulează în mod normal substanțele aplicate. În plămâni, ASO de obicei nu se acumulează după administrarea parenterală. De asemenea, administrarea locală cauzează rareori efecte sistemice. De exemplu, când ASO a fost administrat la maimuțe în doză de 0,1 mg/kg prin inhalare (trei doze pe parcursul unei săptămâni), concentrația medicamentului în plămâni a fost de aproximativ 1 μg/g. Dar la aceleași maimuțe, concentrația din ficat și rinichi a fost de aproximativ 5% din concentrația din plămâni, indicând un efect sistemic semnificativ mai mic.

Datele din literatură indică faptul că administrarea rectală de ASO este utilizată cu succes pentru tratamentul colitei ulcerative. Spre deosebire de inhalare, unde se pot folosi cantitati mici din substanta injectata, clisma folosita pentru tratament poate contine pana la 240 mg de substanta (alicaforsen) de prima generatie. În acest caz, epiteliul rectal este expus substanței injectate, cu toate acestea, din cauza permeabilității slabe a ODN-ului foarte încărcat, există o absorbție minimă a medicamentului, precum și un efect general sistemic. Calculele arată că concentrația de ASO în epiteliul intestinal la 12 ore după administrare este de 20 pg/g. Biodisponibilitatea la om variază de la 0,03 la 2,14% și concentrația maximă de ASO determinată în plasmă este de numai 0,126 µg/ml. Absența unei absorbții sistemice semnificative și concentrația locală mare a medicamentului au un efect pozitiv asupra tratamentului.

S-a făcut un studiu al injecțiilor intravitreale cu preparate ASO atât din prima cât și din a doua generație. În acest caz, substanțele sunt injectate în ochi în cantități foarte mici. Datorită izolării locului de injectare, efectele sistemice ale medicamentului sunt reduse într-o măsură și mai mare. În ochi, corpul vitros și retină, ASO intră în rate diferite: intră în corpul vitros mai repede decât în ​​retină. Atât metabolismul local, cât și difuzia din ochi contribuie la eliminarea medicamentului. După cum sa menționat deja, datorită cantităților mici, efectul sistemic al medicamentului administrat este minim. Cu toate acestea, mecanismul de distribuție sistemică este similar cu majoritatea celorlalte medicamente.

Administrarea enterală a ASO

Stabilitatea remarcată a ASO de a doua generație la nucleaze asigură stabilitatea medicamentului în intestin, ceea ce face posibilă absorbția în continuare. Cu toate acestea, dimensiunea moleculei și încărcăturile de ACO limitează absorbția medicamentului. După absorbția din intestin, cinetica ASO este similară cu cea a administrării sale parenterale. Deși ficatul este unul dintre principalele locuri de acumulare a ASO, efectul de primă trecere prin ficat nu este un factor important care influențează cinetica medicamentului ASO.

Distribuția ASO în organism

Rolul perfuziei și al afinității tisulare

Distribuția ASO și a altor medicamente depinde de permeabilitatea, intensitatea alimentării cu sânge, legarea de proteinele plasmatice, țesuturi și celule. S-a demonstrat că distribuția fosfotioatului ASO din prima și a doua generație în țesuturi cu sarcinile lor negative multiple și legarea lor de proteine ​​este cel mai puțin dependentă de alimentarea cu sânge și mult mai dependentă de factorii care afectează transportul lor în celulă.

Distribuția internă de la plasmă la țesuturi este relativ rapidă, timpul de înjumătățire prin eliminare este de 30-90 minute după administrarea intravenoasă. Timpul de înjumătățire al ASO după administrarea subcutanată este mai lung decât după administrarea intravenoasă. Această diferență se datorează timpului necesar absorbției și nu altor diferențe de farmacocinetică.

Studiul cineticii medicamentelor din prima și a doua generație a remarcat micile sale diferențe. Stabilitatea mai mare a nucleazelor ASO de a doua generație este compensată de legarea lor mai scăzută la proteine. Împreună cu aceasta, profilurile farmacocinetice ale medicamentelor de generația 1 și a 2-a sunt similare sau aproape imposibil de distins atunci când suma ASO nativă și metaboliții săi (ASO total) din prima generație este comparată cu medicamentul intact de a doua generație (ISIS 13650). În caz contrar, distrugerea mai rapidă a ASO de către exonucleaze ar scurta timpul de înjumătățire al medicamentelor de prima generație în comparație cu cele de a doua generație. Distribuția medicamentelor ambelor generații este dependentă de doză.

După cum sa menționat mai sus, după absorbția de la locul injectării sau din intestine, ASO se leagă de proteinele plasmatice. Două proteine ​​plasmatice care se leagă în mod specific de fosfotioat ASO sunt albumina și alfa-2-macroglobulina. O altă proteină comună, glicoproteina acidă, nu leagă ASO. Legarea de proteine ​​este foarte importantă pentru distribuția ASO în țesutul țintă. Structurile chimice care reduc legarea duc la o scădere marcată a concentrației medicamentului în țesuturi, cresc gradul de filtrare a acestuia prin glomeruli renali și excreția prin urină. Acest fenomen poate fi observat atunci când se utilizează ASO cu legături diester în scheletul preparatului sau în prezența structurii MOE. O scădere a afinității diesterilor și a structurilor MOE (sau a ambelor) pentru proteine ​​permite ASO să circule mai liber în fluxul sanguin, ceea ce duce la o intensificare a excreției sale în urină.

În toate studiile cu ASO de prima și a doua generație parenterală, nu am observat o curățare liniară a ASO din plasmă. Clearance-ul a scăzut odată cu creșterea dozei de medicament și, prin urmare, biodisponibilitatea acestuia a fost mai mare decât ar fi de așteptat din doza administrată. Deoarece clearance-ul inițial se datorează distribuției ASO în țesuturi și, în același timp, s-a observat absorbția medicamentului de către țesuturi, se poate presupune posibilitatea saturării acestora cu ASO. Studiul procesului de saturație ca urmare a introducerii ASO poate fi efectuat folosind fagocite hepatice. Când legarea ASO de celulele Kupffer ajunge la saturație, va începe o scădere a afinității. Administrarea ulterioară a ASO la șoareci îmbunătățește distribuția ASO la celulele hepatice nefagocitare și, ca rezultat, activitatea farmacologică în hepatocite este îmbunătățită în comparație cu martor. În schimb, la concentrații plasmatice sub 1 ug/ml, ASO se leagă mai activ de celulele Kupffer și se acumulează mai puțin în hepatocite.

Studiul procesului de legare a ASO la proteinele plasmatice a arătat că acest efect este însoțit de o distribuție rapidă a complexului în țesuturi pe suprafața celulei. Deși mecanismele exacte de legare celulară nu au fost stabilite, se poate presupune că ASO se leagă de proteinele plasmatice sau de proteinele celulare atâta timp cât există locuri de legare libere. ASO-urile legate sunt apoi distribuite de-a lungul gradientului de concentrație prin membrana celulară prin schimbul unei proteine ​​extracelulare cu una intracelulară.

Astfel, forța motrice a pătrunderii ASO în celule este gradientul de concentrație. A fost descrisă mișcarea navetă a ASO între citoplasmă și nucleu. În general, este clar că legarea proteinelor facilitează mișcarea ACO prin bariere care inhibă în mod normal mișcarea moleculelor hidrofile foarte încărcate. Acest mecanism de transfer membranar rămâne o ipoteză pentru ASO, dar a fost descris anterior pentru compușii organometalici. Transportul ASO din matricea extracelulară în spațiul intracelular a fost vizualizat în ficatul șoarecilor folosind metode imunohistochimice și în rinichii șobolanilor folosind microscopie vitală cu o etichetă fluorescentă pentru ASO de a doua generație (S. Henry, B. Molitoris).

Identitatea proteinelor care controlează transportul ASO din spațiul extracelular în spațiul intracelular nu este cunoscută, dar se crede că legarea complexului proteină-ASO la celulă este realizată folosind receptorul fagocitar. Deoarece fagocitele, cum ar fi celulele Kupffer, macrofagele tisulare și celulele tubulare proximale, au o afinitate mare pentru ASO, ne putem gândi la posibilitatea de a găsi astfel de receptori pe suprafața lor celulară.

Cu toate acestea, distribuția celulară și farmacodinamia ASO la șoarecii transgenici lipsiți de receptorul fagocitar SR-A I/II nu au fost diferite de cele ale animalelor singeneice martor. Astfel, acest receptor, cunoscut sub numele de receptor Scavenger, nu pare a fi responsabil pentru absorbția complexului de către ficat și rinichi. Rolul altor structuri acceptoare implicate în procesele de endocitoză a complexului ACO-protein nu a fost studiat.

Proteine ​​de membrană care funcționează ca purtători , sunt prezente în toate organismele. Principalii purtători de medicamente sunt: ​​ABC ( transportoare de casete care leagă ATP)și SLC (familie de purtători soluți). Se știe că viteza de transfer a substanțelor prin membranele biologice folosind procese mediate de transportatori se caracterizează prin saturație. Sunt descriși mai mulți membri ai familiei SLC cu caracteristici cunoscute , în principal pentru transportul de nucleozide, zaharuri nucleozide și zaharuri fosfatice. Există opinia că studiile viitoare se vor referi cel mai probabil la procesele de transport intermembranar ASO.

Este clar că, pe lângă diferențele de mai sus în acumularea de structuri create de diferite organe și țesuturi și dependența clearance-ului și distribuției unor astfel de compuși de doza lor, distribuția ASO în țesuturi este influențată de sistemele de transport, caracteristicile fluxului sanguin al indivizilor, timpul posibil de rezidență al medicamentului în organism și, în cele din urmă, saturația țesuturilor cu ASO. În ciuda rolului semnificativ al acestor factori în procesele de distribuție tisulară a ASO, se crede că legarea inițială a ASO de suprafața celulei este unul dintre factorii determinanți în mecanismele analizate. Această concluzie se bazează pe faptul că ficatul și rinichii sunt locurile inițiale de legare a ASO, cu o anumită acumulare suplimentară în primele 24 de ore după administrarea ASO. La studierea parametrilor de distribuție ai ASO în ficat și rinichi, s-a arătat o creștere fracționată a concentrației medicamentului în organe în primele 24 de ore. Acest lucru are loc în timpul unei perioade de redistribuire celulară și subcelulară a ASO, dar, probabil, organele de distribuție primară ar trebui să acumuleze mai mult material în timp, datorită afinității mai mari a acestor organe pentru ASO. Proteinele responsabile pentru această afinitate pot conține situsuri de legare asemănătoare heparinei pentru laminină și fibrinogen și factor de creștere a fibroblastelor (FGF). Interacțiunea timpurie a ASO cu celula se poate datora legării acestor proteine, dar natura acestor proteine, așa cum sa menționat mai sus, a fost puțin studiată.

Având în vedere importanța combinației de situsuri specifice de legare a ASO cu celule în distribuția medicamentului în organism, ar trebui, de asemenea, să remarcăm un factor atât de important, cum ar fi alimentarea cu sânge diferită a diferitelor organe, posibilitatea căreia să influențeze distribuția diferită a fosfotioatului. ASO este evident. Potrivit diverșilor autori, munca cu zeci de serii de substanțe din prima și a doua generație indică distribuția lor similară și o distribuție vizibil similară la indivizii diferitelor specii. Rinichii, ficatul, ganglionii limfatici, splina și măduva osoasă sunt organele care acumulează cea mai mare cantitate de ASO și metaboliții acestora. Faptul că plămânii și inima nu acumulează ASO indică faptul că acumularea pronunțată de ASO în ficat și rinichi nu este suficientă pentru a explica singura buna lor aprovizionare cu sânge. De exemplu, zonele cu cea mai bună circulație a sângelui în rinichi sunt glomerulii și nu sunt zonele care conțin mai mult ASO. Dimpotrivă, în tubii proximali, circulația sângelui este mai puțin activă. Cu toate acestea, celulele tubilor proximali sunt caracterizate printr-un număr mare de celule activ fagocitare, acumulează ASO libere, precum și ASO asociate cu proteine ​​care sunt de obicei reabsorbite în tubii proximali. Ca urmare, cortexul renal și epiteliul tubular proximal conțin cea mai mare concentrație de fosfotioat ASO, atât de prima cât și de a doua generație.

De asemenea, trebuie remarcat faptul că aportul de sânge (ml/g țesut) a ficatului este de aproximativ 20% din cel al rinichilor. Diferențele de 4-5 ori în perfuzia între rinichi și ficat nu duc la diferențe de 4-5 ori în concentrația de ASO în aceste organe. Capilarele fenestrate măresc aria de contact dintre ASO și fluxul sanguin și, prin urmare, acest lucru poate compensa perfuzia insuficientă a ficatului în raport cu rinichii.

Legarea ASO de proteinele plasmatice în timpul distribuției

Deși saturația celulelor cu ASO afectează în cele din urmă distribuția lor în organe, legarea ASO de proteinele plasmatice poate modifica distribuția în rinichi și ficat în serii diferite. Există diferențe în serie în legarea proteinelor. Odată cu scăderea legării ASO de proteinele plasmatice, acumularea acestora în ficat scade și acumularea lor în rinichi crește. În schimb, cu o legare mai mare, concentrația de ASO în formă liberă în fluxul sanguin va fi într-o cantitate mai mică, se va acumula mai puțin în rinichi și mai mult în alte organe. Există o relație inversă între gradul de legare a ASO de proteine ​​și acumularea acestora în rinichii șobolanilor și maimuțelor după administrarea repetată intravenoasă și subcutanată.

Legarea de proteine ​​poate fi utilizată ca criteriu de selecție pentru ASO pentru studiile clinice. Până în prezent, determinarea legării proteinelor este un proces empiric fără nicio modalitate de a prezice care serie se va lega mai mult sau mai puțin de proteine.

Distribuția ASO către alte organe

Indiferent de secvența de distribuție a fosfotioatului ASO din prima și a doua generație, se observă un model caracteristic de localizare a acestor medicamente în rinichi și ficat, precum și în splină și ganglioni limfatici, os și în citoplasma adipocitelor. Acumularea de ASO în țesutul limfoid poate fi explicată parțial prin activitatea fagocitară a histiocitelor și a altor celule mononucleare. Este posibil să se vizualizeze ASO în fagolizozomii histiocitelor și țesuturile macrofage folosind colorarea cu hematoxilină. S-a demonstrat că ASO suferă endocitoză, se localizează în endozomi și rămân în aceste structuri. Concentrația de ASO în fagolizozomi este adesea de așa natură încât poate fi determinată prin colorarea cu hematoxilină (aproape ca ADN-ul nuclear). ASO din fagolizozomi reprezintă probabil cea mai mare parte a ASO acumulat în splină și organele limfoide. În plus, celulele active fagocitare ale oaselor și ale măduvei osoase acumulează ASO în aceste țesuturi, ceea ce este confirmat de prezența granulelor bazofile în celulele lor.

Mușchii (atât scheletici, cât și cardiaci) nu conțin cantități semnificative de ASO. Cu toate acestea, examinarea atentă a mușchilor folosind metode imunohistochimice sau autoradiografice dezvăluie conținutul de ASO în fagolizozomii macrofagelor stromei musculare, iar această acumulare poate afecta parțial măsurarea concentrației de ASO în mușchi și inimă.

Acumularea de ASO în citoplasma adipocitelor este semnificativă din punct de vedere terapeutic. Mai ales că, spre deosebire de majoritatea substanțelor acumulate în adipocite, ASO sunt hidrofile. Metodele imunohistochimice arată clar că ASO se găsește în fracțiunea citoplasmatică a adipocitelor, în timp ce ASO este aproape absent în vacuola grăsime. Intensitatea colorării indică o acumulare semnificativă a substanței în citoplasmă. De exemplu, la maimuțe, după 13 săptămâni de tratament cu ISIS 113715 la o doză de 10 mg/kg/săptămână, concentrația în ficat a fost de 301 ± 88,1 μg/g, dar numai 37,3 ± 14,4 μg/g în țesutul adipos. aceleași animale.

Având în vedere că componenta negrasă reprezintă 10% din masa totală de grăsime, corectarea concentrației de ASO, ținând cont de acest indicator, indică comparabilitatea concentrației sale cu cea din ficat. Concentrații semnificative de ASO în adipocite indică faptul că acestea pot fi utilizate pentru tratarea bolilor genetice ale acestui tip de celule: surse de hormoni și citokine. Astfel, s-a constatat că concentrațiile farmacologic active de ASO sunt înregistrate în adipocitele șoarecilor atunci când ISIS 113715 este administrat în doză de 25 mg/kg de două ori pe săptămână și reduc expresia genei țintă PTP-1B atât în ​​ficat, cât și în adipocite. Observații similare au fost făcute la maimuțe tratate cu ASO ISIS 113715. Deoarece biopsia subcutanată a grăsimii poate fi efectuată clinic și deoarece ASO activ se acumulează în grăsime, grăsimea poate fi folosită pentru biopsie și poate măsura direct efectele farmacologice (reducerea ARNm) și concentrația tisulară a medicamentului în țesuturi umane.

Fosfotioatul ASO este, de asemenea, distribuit în alte țesuturi. Studiile imunohistochimice arată că celulele endoteliale acumulează ASO la concentrații suficiente pentru a reduce nivelurile de ARNm, făcându-le o țintă potențială pentru intervenția farmacologică. În unele țesuturi, concentrațiile lor nu sunt suficient de mari pentru un efect farmacologic. De exemplu, limfocitele mature nu acumulează ASO, iar activitatea antisens este limitată de celulele T.

Celulele osoase, în special osteoblastele active fagocitare, pot acumula ASO și acest efect poate fi folosit în scopuri terapeutice. În plus, celulele insulare pancreatice acumulează și ASO. Atât ASO de prima cât și de a doua generație sunt molecule hidrofile foarte încărcate care nu traversează barierele hematoencefalică sau hemato-testiculare. Cu toate acestea, ca și în mușchi, macrofagele care conțin ASO detectabile sunt localizate în regiunea interstițială a testiculelor. Ovarele nu sunt separate de o barieră, astfel încât ASO poate fi măsurat cantitativ în ovare și vizualizat prin imunohistochimie în stromă.

Distribuția limitată a ASO plasmatic către celulele creierului și cardiomiocite face ca aceste țesuturi să fie ținte improbabile pentru interferența antisens, deși inhibarea selectivă sau expresia anumitor proteine ​​ale canalelor ionice în creier și mușchi poate fi benefică din punct de vedere terapeutic. Cu toate acestea, distribuția limitată a ASO în aceste țesuturi poate fi văzută ca un avantaj. Absența unor concentrații semnificative de ASO în creier și inimă reduce riscul de afectare a sistemului nervos central (SNC) și reduce manifestarea efectelor cardiace nedorite. După cum sa observat mai devreme, administrarea directă la structurile SNC, în special la creier, prin perfuzie sau injecție intratecală, intraventriculară determină distribuția ASO în sistemul nervos central și poate fi utilă terapeutic.

În timpul sarcinii, fătul este destul de bine protejat de efectele medicamentelor antisens. Studiul cineticii transplacentare a ASO nu a evidențiat acumularea acestuia la făt; un nivel scăzut de ASO a fost observat la rozătoare în placentă. Aceste rezultate au fost replicate în mod constant într-un studiu de teratogenitate al diferitelor ASO de a doua generație la șoareci, șobolani și iepuri. Placenta, în ciuda faptului că este foarte perfuzată, nu este un organ cu o acumulare mare de ASO.

În general, faptele prezentate arată că distribuția ASO este unul dintre factorii cheie care determină severitatea activității ASO. Diferențele în distribuția ASO par a fi legate în mare măsură de tropismul tisular pentru aceste medicamente și, într-o măsură mai mică, de perfuzie.

Metabolism

Medicamentele antisens de prima și a doua generație sunt metabolizate de nucleaze, și nu de sistemele de oxidază de tip citocrom P450, care sunt utilizate pentru metabolizarea medicamentelor convenționale cu molecule mici lipofile. ASO nu este nici un substrat pentru izoenzimele citocromului P450 și nici nu induce sau inhibă activitatea acestuia la concentrații semnificative clinic. Clivarea ASO mediată de exonuclează, care este calea majoră pentru metabolism și eliminarea ODN-urilor fosfotioat de prima generație, este secundară ASO de a doua generație. Activitatea exonucleazei este limitată de două fragmente: un MOE la capătul 3’ și altul MOE la capătul 5’.

Enzime responsabile de metabolismul ASO

Nu sunt cunoscute enzime specifice care metabolizează ASO de a doua generație. Nucleazele sunt omniprezente și este posibil să se detecteze metaboliții ASO degradați în majoritatea țesuturilor. Omogenații hepatici și renali sunt atât capabili să metabolizeze ASO de a doua generație in vitro fără adăugarea de surse de energie exogene, cum ar fi nicotinamidă adenin dinucleotide fosfat (NADPH) sau adenozin 5-trifosfat (ATP). Scindarea inițială are ca rezultat două produse, fiecare caracterizat de un capăt protejat MOE de 5" și 3". Acești metaboliți nu se leagă de proteine ​​și sunt astfel excretați din țesuturi. Deoarece metaboliții sunt îndepărtați mai repede decât se formează, practic nu există nicio acumulare de metaboliți în țesuturi. Astfel, nu este posibil să se utilizeze determinarea cantității de metaboliți din țesuturi ca indice al metabolismului ASO în țesuturi.

Deoarece rata de eliminare a ASO din țesuturi depinde de metabolismul lor, diferențele în metabolismul ASO în diferite țesuturi pot fi estimate pe baza timpului de înjumătățire al acestor medicamente din țesuturile caracterizate. Pe baza datelor pentru patru ASO din a doua generație, se ajunge la concluzia că comportamentul membrilor acestei clase este similar, dar există diferențe ușoare în timpul lor de înjumătățire față de ficatul și rinichii maimuțelor tratate cu medicamentul timp de 4-13 săptămâni. . S-a demonstrat că timpul de înjumătățire al preparatelor ACO ISIS 104838 și 112989 din ficat și rinichi este foarte asemănător. Aceste date sugerează că pentru unele serii de ASO nu există diferențe semnificative în rata metabolică în diferite organe. Cu toate acestea, au fost identificate diferențe în timpul de înjumătățire al țesuturilor pentru ISIS 107248, 113715 și 301012. Diferențele observate în rata de metabolizare a medicamentelor ASO în ficat și rinichi indică faptul că pot exista diferențe în rata metabolismului în diferite țesuturi. , sau cinetica mai complexă pentru anumite serii de produse sau rezultate reflectă pur și simplu un număr mic de mostre prelevate într-un interval de timp limitat.

Un studiu detaliat al procesului de excreție a ASO de a doua generație arată prezența diferitelor rate ale excreției lor din diferite tipuri de celule hepatice. Deoarece unele tipuri de celule, cum ar fi celulele tubulare proximale ale cortexului renal, tind să conțină ASO în fagolizozomi, acest tip de absorbție explică probabil diferențele în ratele metabolice ale medicamentelor în diferite țesuturi. În plus, este probabil ca secvențele specifice din structura scheletului ASO să fie caracterizate prin sensibilitate diferită la scindarea de către endonucleaze.

Exonucleazele bacteriene prezintă un grad ridicat de specificitate pentru secvența de nucleotide din coloana vertebrală ASO, probabil pentru protecție împotriva virusurilor. O mare parte din activitatea nucleazelor din celulele mamiferelor este asociată cu mecanismele de transcripție și reparare a ADN-ului și, prin urmare, specificitatea de specie a mamiferelor poate diferi de cea a endonucleazelor bacteriene. Nu se știe dacă procesele de replicare și acțiunea enzimelor asociate cu fenomenul de reparare sunt la fel de responsabile pentru catabolismul acestor ASO sintetici. La concentrații mari de ssDNA, ASO-urile pot concura eficient cu substratul natural. Multe enzime din familia nucleazelor sunt capabile să catabolizeze ASO. Determinarea enzimelor specifice implicate în metabolismul ASO nu este critică pentru dezvoltarea medicamentelor antisens, dar o mai bună înțelegere a căilor metabolice va fi utilă pentru dezvoltarea de noi tehnologii.

metaboliți ASO

Diferențele în metabolismul ASO de prima și a doua generație sunt destul de evidente atunci când se compară profilul metabolic cu CGE. Când probele de țesut sau urină sunt analizate într-un detector LC/MS, natura proceselor metabolice devine mai clară. În mod obișnuit, ODN-urile fosforotioat de prima generație sunt metabolizate într-o cascadă de metaboliți ASO, fiecare diferând cu o nucleotidă ca rezultat al scindării unui singur nucleotide de către exonuclează. Astfel, după introducerea unui 20-mer, adică format din 20 de nucleotide, ODN-urile de prima generație, plasma și țesuturile conțin familii de ASO-uri abreviate consecutiv, începând de la 19-mer și mai departe până la un ASO scurt.

Scindarea inițială în metabolismul ASO de a doua generație mediată de
endonucleaze, conduce la formarea a două ASO, unul cu capătul 3’ al MOE și celălalt cu capătul 5’ al MOE. Scindarea produselor cu capete neprotejate poate fi efectuată fie de 5'-exonuclează, fie de 3'-exonuclează. Rezultatele activității combinate ale endo- și exonucleazei sunt o cascadă de produse de clivaj abreviate în lanț, dintre care mulți, dacă nu toți, pot fi detectați în urina colectată de la animale de testat sau oameni. Urina animalelor tratate sau a pacienților tratați cu ASO de a doua generație poate conține metaboliți care variază de la două posibile MOE 15-mer până la două posibile MOE 5-mer și combinații multiple ale fiecăruia dintre metaboliții intermediari.

Metaboliții mai scurti decât lungimea capetelor MOE vor fi prezenți în țesuturi dacă capetele MOE sunt ele însele substraturi pentru nucleaze. Acești metaboliți nu sunt de obicei detectați prin analiza spectrală de masă, ceea ce sugerează că, de regulă, nu există mononucleotide MOE eliberate în timpul metabolismului. Cu toate acestea, există câteva excepții de la această generalizare. Pentru un număr limitat de secvențe de nucleotide , a doua generație de nucleotide ASO observate în țesuturi și plasmă – fie CGE, fie LC/MS: metaboliții par a fi rezultatul digestiei exonucleazei. Acești metaboliți pot fi observați în distribuția inițială. Se presupune că apar rapid în plasma sanguină. Mononucleotidele MOE, care se formează în timpul metabolismului, nu sunt substraturi pentru fosforilare și, prin urmare, este puțin probabil să fie incluse în trifosfații de nucleotide și, în cele din urmă, în nucleotidele endogene. Mononucleotidele MOE nu inhibă enzimele responsabile de sinteza ADN-ului. Astfel, mononucleotidele MOE, dacă sunt formate, nu ar trebui să fie încorporate în nucleotidele endogene.

Partea centrală a deoxinucleotidelor din a doua generație ASO este supusă clivajului exonucleazei, ceea ce duce la eliberarea unei nucleotide. Monodeoxinucleotidele, care sunt produse prin scindarea exonucleazei, sunt identice cu nucleotidele endogene, cu excepția grupării tiofosfat, care teoretic poate fi prezentă. Cu toate acestea, gruparea tiofosfat este labilă la oxidare și pierderi de sulf, ceea ce face ca gruparea fosfat terminală să fie identică cu nucleotidele endogene. Prin urmare, spre deosebire de mononucleotidele MOE, orice deoxinucleotidă eliberată va fi inclusă în mod natural în depozitul intracelular al nucleotidelor endogene. Nucleotidele care rețin grupări tiofosfat vor fi substraturi pentru adăugarea a una sau două grupări fosfat, rezultând di- sau trifosfați tiofosfat de nucleotide mixte. Fosforilarea este posibilă, dar prezența alfa tiofosfatului face reacțiile nefavorabile termodinamic.

Concluzie

Relevanța studiului farmacocineticii datelor și a medicamentelor similare celor descrise, precum și a creării de modele pe diferite specii de animale pentru o înțelegere completă a proceselor care au loc în organism după administrarea medicamentelor, este evidentă. În Rusia, studiile asupra unor astfel de medicamente sunt, de asemenea, în curs de desfășurare.

Literatură

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. Un studiu de fază I a ISIS 2503, un inhibitor antisens al H-ras, în combinație cu gemcitabină la pacienții cu cancer avansat. // clinică. Cancer Res. 2003 Vol. 9, #1. p. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) este o proteină care leagă ODN-ul. // Nat. Med. 1997 Vol. 3, nr. 4. p. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. și colab. Legarea ODN-urilor fosforotioat de factorul de creștere al fibroblastului de bază, CD4 solubil recombinant, laminină și fibronectină în P-chiralitate independentă. // Nucl. Acizi Res. 1995 Vol. 23, nr 21. p. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. Soarta in vitro a ODN-urilor antisens de fosforotioat: absorbția predominantă de către receptorii scavenger de pe celulele endoteliale. // Nucl. Acizi Res. 1997 Vol. 25, nr.16. p. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Modularea legării proteinelor plasmatice și a absorbției in vitro de celule hepatice a ODN-urilor fosforotioat prin conjugarea cu colesterolul. // Nucl. Acizi Res. 2000 Vol. 28, nr. 14. P. 2717.

6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Efectul modificării fosforotioatului a ODN-urilor asupra legării specifice de proteine. // J. Biol. Chim. 1994 Vol. 269, nr.43. R. 26801.

7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. ODN-urile de fosforotioat se distribuie în mod similar la șoarecii de tip sălbatic al receptorului scavenger de clasa A. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 2000 Vol. 292, nr.2. p. 489.

8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Distribuția spinală și metabolizarea ASO-urilor modificate cu 2_-O-(2-metoxietil) după administrarea intratecală la șobolani. // Neuroștiință. 2005 Vol. 131, nr.3. p. 705.

9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Distribuția celulară a ODN-urilor de fosforotioat în țesuturile normale de rozătoare. //Lab. Investi. 1997 Vol. 77, nr 4. p. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Eliminarea fosforotioatului marcat cu 14C ASO ISIS 2105 după administrarea intravenoasă la șobolani. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 1993 Vol. 267, nr.3. p. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Farmacocinetica unui fosforotioat ASO marcat cu 14C, ISIS 2105, după administrarea intradermică la șobolani. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 1994 Vol. 269, nr.1. p. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Proprietățile farmacocinetice ale mai multor analogi noi de ASO la șoareci. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 1996 Vol. 277, nr.2. p. 923.

13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Inhibarea pe bază de ASO a expresiei genelor embrionare. // Nat. Biotehnologia. 1999 Vol. 17. P. 1184.

14. Eckstein F. ODN-uri de fosforotioat: care este originea lor și ce este unic la ele? // Antisens Nucl. Acid Drug Dev. 2000 Vol. 10, #2. R. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Spectrometrie de masă prin electrospray HPLC on-line a metaboliților fosforotioatului ASO. // Anal. Chim. 1997 Vol. 69, nr 3. p. 313.

16. Geary R.S. Evaluarea curentă a relațiilor PK/PD pentru terapii antisens. // Congresul Mondial de Farmacie și Științe Farmaceutice, Nisa, Franța, 2002.

17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. et al. Lipsa interacțiunii farmacocinetice pentru ISIS 113715, o oligonucleotidă antisens modificată cu 2_-O-metoxietil care vizează ARN-ul mesager protein tirozin fosfatază 1B, cu compuși antidiabetici orali metformină, glipizidă sau rosiglitazonă. // clinică. Farmacokineta. 2006 Vol. 45, nr 8. p. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Farmacocinetica și metabolismul la șoareci a unui fosforotioat ASO inhibitor antisens al expresiei C-raf-1 kinazei.// Drug Metab. Dispos. 1997 Vol. 25, nr 11. R. 1272.

19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Inhibitori oligonucleotidici antisens pentru tratamentul cancerului: 1. Proprietăţi farmacocinetice ale ODN-urilor fosforotioat. // Anticancer Drug Des. 1997 Vol. 12, nr 5. R. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Farmacocinetica plasmatică și tisulară independentă de secvență pentru 3 ASO de fosforotioat antisens: șoarece la om. // în Asociația Americană a Oamenilor de Știință Farmaceutică, Pharm. Cercetare, Plenum Press, Seattle, Washington. 1996. R. S.

21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. și colab. Primul pas de extracție hepatică a unei oligonucleotide himerice antisens parțial modificate la câinii Beagle. // în reuniunea anuală a Asociației Americane a Oamenilor de Știință Farmaceutică, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.

22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L și colab. Proprietăți farmacocinetice ale analogilor ASO modificați cu 2_-O-(2-metoxietil) la șobolani. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 2001 Vol. 296, nr.3. R. 890.

23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Farmacocinetica ODN-urilor antisens de fosforotioat. // Curr. Opinează. Investi. droguri. 2001 Vol. 2, #4. R. 562.

24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. et al. Farmacocinetica unui factor de necroză tumorală-alfa fosforotioat 2_-O-(2-metoxietil) oligonucleotidelor antisens modificate: comparație între specii. // Drug Metab. Dispos. 2003 Vol. 31, nr 11. p. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Membrane transporters and drug response, în Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ed. a 11-a, Brunton, L.L., ed., McGraw-Hill, New York, 2006. P. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Eliminarea genei citoprotectoare, clusterina, pentru a crește hormonul și chemosensibilitatea în cancerul de prostată și în alte tipuri de cancer. // Ann. NY Acad. sci. 2005. Vol.1058. P.1.

27. Gleave M., Miyake H. Utilizarea oligonucleotidelor antisens care vizează gena citoprotectoare, clusterina, pentru a crește sensibilitatea la androgeni și la chimiosensibilitate în cancerul de prostată. // Lumea J. Urol. 23. 2005. Nr. 1. p. 38.

28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Siguranța de fază I și profilul farmacocinetic al unei molecule de adeziune intercelulară-1 ODN antisens (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 1997 Vol. 282, nr.3. R. 1173.

29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. Distribuția și metabolizarea in vitro a unui fosforotioat ASO în ficatul de șobolan după administrare intravenoasă. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 1998 Vol. 286, nr.1. p. 447.

30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. ODN-urile de fosforotioat se leagă de factorul de creștere al fibroblastului de bază, inhibă legarea acestuia de receptorii de suprafață celulară și îl îndepărtează de la situsurile de legare cu afinitate scăzută de pe matricea extracelulară. // J. Biol. Chim. 1995 Vol. 270. Str.2620.

31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Efectele inhibitorilor oligonucleotidici antisens umani și murini ai ICAM-1 asupra performanței reproductive, dezvoltării fetale și dezvoltării postnatale la șoareci. // Defecte congenitale Res. Bdev. reproducere. Toxicol. 2004 Vol. 71, nr.6. p. 359.

32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. et al. Inhibarea expresiei proteinei kinazei C alfa spinale de către o oligonucleotidă antisens atenuează toleranța indusă de perfuzia de morfină. // Neuroștiință. 2002 Vol. 113, nr.1. p. 99.

33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Inhibarea angiogenezei de către oligonucleotidele antisens la clusterină. // Angiogeneza. 2005 Vol. 8, nr 3. p. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Reducerea puternică a apolipoproteinei B și a colesterolului cu lipoproteine ​​cu densitate joasă prin administrarea pe termen scurt a unui inhibitor antisens al apolipoproteinei B. // Circulație. 2006 Vol. 114, nr. 16. p. 1729.

35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodiferență – efectul chiralității P a oligo(fosforotioaților de nucleozide) asupra activității RNazei bacteriene H. // Nucl. Acizi Res. 1995. Vol.23, Nr.24. R. 5000.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Proprietățile farmacocinetice ale fosforotioatului ASO la om, în Cercetare și aplicații antisens, ed. 1, Crooke, S. T., ed., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Comparația farmacocineticii administrării subcutanate și intravenoase a unei oligodeoxinucleotide fosforotioat la maimuțele cynomolgus. // Antisens Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, Nr.6. R. 435.

38. Levin A.A. O revizuire a problemelor din farmacocinetica și toxicologia oligonucleotidelor antisens fosforotioat. // Biochim. Biophys. acta. 1999. Vol.1489, Nr.1. R. 69.

39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Farmacocinetica și toxicitatea fosforotioatului ASO, în Biotechnology and Safety Assessment, a doua ed., Thomas, J. A., ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. P. 151.

40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Dezvoltarea preclinica a terapiei antisens, in Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, Ed. I, Oxender D.L. și Post L.E., eds., Springer-Verlag, Heidelberg, Germania, 1998, p. 131.

41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toxicity of antisens oligonucleotids. // în Antisens Drug Technology, Crooke, S. T., ed., Marcel Dekker, New York, 2001. P. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Caracterizarea transportului ASO în celulele vii. //Proc. Natl. Acad. sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 1989 Vol. 86. P. 3474.

43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Naveta nucleocitoplasmatică: o nouă proprietate in vitro a ODN-urilor fosforotioat antisens. // Nucl. Acizi Res. 2000 Vol. 28, nr 2. p. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Biodisponibilitatea și activitatea terapeutică a alicaforsenului (ISIS 2302) a fost administrată sub formă de clisma de retenție rectală subiecților cu colită ulceroasă activă. // Ailment Pharmacol. Acolo. 2006 Vol. 23, nr 10. R. 1427.

45. Mou T.C., Gray D.M. Afinitatea mare de legare a oligomerilor modificați cu fosforotioat pentru proteina 5 a genei Ff este moderată prin adăugarea de C-5 propină sau modificări 2_-O-metil. // Nucl. Acizi Res. 2002 Vol. 30, nr 3. R. 749.

46. ​​Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Proprietăți farmacocinetice ale fosforotioaților la animale-absorbție, distribuție, metabolism și eliminare, în Cercetare și aplicații antisens, ed. 1, Crooke, S. T., ed., Springer, Berlin, 1998. P. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Distribuția tisulară și farmacocinetica pe bază fiziologică a fosforotioatului antisens ASO ISIS 1082 la șobolan. // Antisens Nucl. Acid Drug Dev. 2001 Vol. 11, #1. p. 15.

48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. și colab. Farmacocinetica, metabolismul și eliminarea unui fosforotioat de 20-meri ODN (CGP 69846A) după administrarea intravenoasă și subcutanată. // Biochim. Pharmacol. 1997 Vol. 54, nr.6. R. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Disposition of ASOs in isolated perfused rat kidney: implicarea receptorilor scavenger în absorbția lor renală. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 1996 Vol. 279, nr.1. p. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Studiul de fază I a ISIS 104838, o oligonucleotide antisens modificate cu 2_-metoxietil care vizează factorul de necroză tumorală alfa. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 2002 Vol. 303, nr.3. R. 1334.

51 Slim G., Gait M.J. Oligoribonucleotide care conțin fosforotioat definite configurațional în studiul mecanismului de scindare a ribozimelor capului de ciocan. // Nucl. Acizi Res. 1991 Vol. 19, nr 6. R. 1183.

52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Asocierea celulară, distribuția intracelulară și efluxul auranofinei prin reacții secvențiale de schimb de liganzi. // Biochim. Pharmacol. 1986 Vol. 35, nr 6. p. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Distribuția maternă și fetală a unui fosforotioat ASO la șobolani după perfuzie intravenoasă. // Defecte congenitale Res. Bdev. reproducere. Toxicol. 2006 Vol. 77, nr.1. p. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Inhibarea dezoxiribonucleazelor de către grupările fosforotioat în oligodezoxiribonucleotide. // Nucl. Acizi Res. 1988 Vol. 16, #24. R. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Farmacocinetica și efectul hepatic de primă trecere a unei oligonucleotide antisens (ISIS 2302) la șobolani. // în reuniunea anuală a Asociației Americane a Oamenilor de Știință Farmaceutică, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.

56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. Profilul farmacocinetic și de toxicitate al unui fosforotioat ASO după administrarea prin inhalare în plămâni la șoareci. // Antisens Nucl. Acid Drug Dev. 2000 Vol. 10, nr 5. R. 359.

57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. Structura cristalină și proprietăți antisens îmbunătățite ale 2_-O-(2-metoxietil)-ARN. // Nat. Struct. Biol. 1999. Vol.6, Nr.6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. Un studiu de fază I/II al LY900003, un inhibitor antisens al protein kinazei C-alfa, în combinație cu cisplatină și gemcitabină la pacienții cu cancer pulmonar cu celule non-mici avansate. // clinică. Cancer Res. 2004 Vol. 10, Nr. 18 Pt 1. P. 6086.

59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Legarea la proteinele plasmatice a unei oligonucleotide antisens care vizează ICAM-1 uman (ISIS 2302). // ASO-uri. 2006 Vol. 16, nr 2. p. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hidratarea oligodezoxiribonucleotidelor de fosfodiester și fosforotioat monocatenar. // Nucl. Acizi Res. 1996 Vol. 24, nr 16. R. 3261.

61. Wilson D.M. În al treilea rând, activitatea endonucleazei abazice Ape1 este reglată de concentrațiile de magneziu și potasiu și este robustă pe structuri alternative de ADN. // J. Mol. Biol. 2005 Vol. 345, nr.5. p. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. et al. ODN-uri de fosforotioat stereo-imbogatit: sinteza, proprietati biofizice si biologice. // Bioorg. Med. Chim. 2000. Vol.8, Nr.1. R. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Dezvoltarea unui test imunosorbent legat de enzime de hibridizare necompetitivă ultrasensibilă pentru determinarea ODN-ului fosforotioat în plasmă. // Anal. Biochim. 2002 Vol. 304, nr.1. p. 19.

64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Comparația farmacocineticii și a dispoziției tisulare a unui fosforotioat antisens ASO care vizează ARNm Haras uman la șoarece și maimuță. // J. Pharm. sci. 2001 Vol. 90, #2. p. 182.

65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Aplicarea unor noi metode bioanalitice cantitative pentru evaluările farmacocinetice și farmacocinetice/farmacodinamice ale oligonucleotidelor antisens. // Curr. Opinează. descoperirea drogurilor. dev. 2004 Vol. 7, #2. R. 195.

66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. et al. Comparație farmacocinetică încrucișată de la șoarece la om a unei oligonucleotide antisens de a doua generație ISIS 301012, care vizează apolipoproteina B-100 umană. // Drug Metab. Dispos. 2007 Vol. 35. P. 460.

67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. Farmacocinetica și farmacodinamia unui fosforotioat antisens ASO care vizează ARNm Fas la șoareci. // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 2001 Vol. 296, nr.2. p. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. et al. Oligonucleotidul antisens PTP1B scade proteina PTP1B, normalizează glicemia și îmbunătățește sensibilitatea la insulină la șoarecii diabetici. //Proc. Natl. Acad. sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 2002 Vol. 99, #17. p. 1137.

Medicina pentru gene

Visul de lungă durată al medicilor este să aibă la dispoziție substanțe care să acționeze asupra unor gene specifice, adică. cauza principală a multor boli. Într-adevăr, pe baza unor astfel de substanțe, este posibil să se creeze medicamente - adevărate „gloanțe magice” care pot afecta materialul ereditar al diferiților agenți infecțioși fără a afecta organismul uman, precum și să suprime activitatea oncogenelor responsabile de creșterea celulelor maligne. Crearea unor astfel de substanțe care au un efect direct asupra materialului genetic este una dintre sarcinile principale ale biologiei moleculare, deoarece pot fi folosite pentru a studia funcțiile genelor și, în cele din urmă, pentru a controla activitatea acestora din urmă.

Dar cum poți schimba programul genetic dorit? La urma urmei, toate genele au compoziție chimică și structură similare: diferențele dintre ele se reduc doar la ordinea alternanței a patru blocuri monomerice - nucleotidele A, T, G, C. Pentru a acționa asupra unei anumite gene, o moleculă de substanță trebuie să recunoască cumva această secvență de nucleotide - sarcina, la prima vedere, de nerezolvat.

Dar un grup de chimiști siberieni care au venit la Academgorodok din Novosibirsk în primii ani ai creării sale au gândit diferit. Pe baza principiului recunoașterii moleculare folosit de natură însăși, angajații Institutului de Chimie Organică a Filialei Siberiei a Academiei de Științe a URSS (Novosibirsk) N.I. Grineva și grupurile D.G. Chimiștii siberieni și-au publicat prima lucrare despre oligonucleotide în 1967 - această dată este considerată astăzi data oficială a apariției unei noi direcții în biologia moleculară și farmacologie.

Au fost primii

Implementarea acestui proiect, neobișnuit prin îndrăzneala sa (la vremea aceea, nici măcar nu era planificată să se efectueze astfel de cercetări nicăieri în lume) în stadiul inițial a fost realizată de un grup mic de tineri angajați, studenți absolvenți și studenți ai NSU. Trebuia să începem practic de la zero, pentru că la vremea aceea încă nu știau să sintetizeze oligonucleotidele în cantități notabile; nu existau instrumente tehnice necesare pentru a lucra cu cantități mici de acizi nucleici și o metodă eficientă de determinare a secvenței acestora. Chimiștii noștri au reușit să rezolve aceste probleme datorită interdisciplinarității - unul dintre principiile care au stat la baza activităților Filialei Siberiene.

NIOC a organizat producția de acizi nucleici, a dezvoltat metode de modificare chimică a acestora; împreună cu angajații Institutului de Fizică Nucleară, a fost posibil să se creeze dispozitive pentru analiza și manipularea acizilor nucleici cu cantitățile lor mici, iar împreună cu chimiștii de la Universitatea de Stat din Moscova, au început să lucreze la crearea de sintetizatoare automate de oligonucleotide. Ca urmare, practic toate metodele și instrumentele analitice necesare au fost la dispoziția oamenilor de știință - cercetarea biologică ar putea începe.

Experimentele efectuate mai întâi pe modele simple și apoi pe acizi nucleici naturali au arătat că oligonucleotidele într-adevăr interacționează cu acizii nucleici țintă cu un grad ridicat de selectivitate. În cazul în care grupările reactive sunt atașate la oligonucleotide, are loc o modificare chimică țintită a acizilor nucleici țintă. În plus, s-a demonstrat pentru prima dată că acești reactivi pot fi folosiți pentru suprimarea infecțiilor virale la animale, iar posibilitatea introducerii lor în organism prin piele și mucoase etc.

Publicațiile timpurii despre efectele biologice produse de oligonucleotide au stârnit un mare interes în rândul specialiștilor din întreaga lume. În 1988, la Akademgorodok a avut loc primul simpozion din lume privind substanțele țintite pe gene bazate pe fragmente de acid nucleic. Oamenii de știință din SUA, Franța și apoi din alte țări s-au alăturat lucrării privind crearea unor astfel de medicamente; Zeci de companii au apărut cu scopul de a crea medicamente terapeutice pe bază de oligonucleotide.

Medicina complementară

Așa-numitele oligonucleotide antisens, concepute pentru inactivarea selectivă a ARN-urilor virale și a unor ARN-uri celulare, au devenit primul dintre medicamentele vizate de gene. Inițial, s-a presupus că grupările reactive vor fi atașate la aceste oligonucleotide, care ar trebui să modifice chimic sau să distrugă acizii nucleici țintă. Cu toate acestea, s-a dovedit că atașarea oligonucleotidelor la ARN-ul țintă în sine are un efect atât de puternic asupra acestuia, încât poate provoca distrugerea acestuia de către enzimele celulare.

D. G. KNORRE - Academician al Academiei Ruse de Științe, specialist în domeniul cineticii chimice, biologiei moleculare și chimiei bioorganice. Șef al Laboratorului de Chimie a Polimerilor Naturali (1960-1984), Departamentul de Biochimie și Laboratorul de Chimie a Acizilor Nucleici (1970-1984) al Institutului de Chimie Organică al Filialei Siberiene a Academiei de Științe URSS, Director al Institutului de Chimie Bioorganică a Filialei Siberiene a Academiei de Științe URSS și Filiala Siberiană a Academiei de Științe Ruse (1984-1996). Abordările antisens bazate pe utilizarea nucleotidelor și acizilor nucleici pentru suprimarea activității biologice a acizilor nucleici oferă perspective interesante în cazurile în care este necesară suprimarea implementării informațiilor nedorite în organismele vii. În primul rând, se deschide perspectiva creării unei noi generații de medicamente antivirale și antitumorale. Astfel de medicamente au un avantaj incontestabil față de altele... Toate oligonucleotidele, indiferent de ținta către care sunt vizate, pot fi create folosind o singură tehnologie. Numai secvența de nucleotide trebuie variată. În special, în virologie și oncologie, de multe ori trebuie să se confrunte cu un astfel de fenomen precum apariția rezistenței la medicamente. Acest lucru se întâmplă cel mai adesea deoarece o singură particulă de virus sau o singură celulă canceroasă are o mutație care duce la o astfel de rezistență. În orice alt caz, ar trebui începută o căutare empirică a unui nou medicament. În cazul efectelor antisens, este necesar doar să se determine care modificare a structurii genomului viral sau a oncogenei a dus la apariția rezistenței. După aceea, devine imediat clar cum să creați un nou medicament folosind aceeași tehnologie unificată *.

* Jurnal Educațional Soros. - 1998. - 12. - C. 25-31.

ARN-urile interferente, complexe scurte dublu-catenar de oligonucleotide ARN, s-au dovedit a fi cele mai puternice mijloace de „dezactivare” a genelor. Când un astfel de complex este introdus într-o celulă, una dintre catene se leagă de secvența sa complementară din ARN-ul mesager al celulei. Acesta servește ca un semnal pentru a începe activitatea unui grup de enzime care taie ARN-ul asociat cu oligonucleotidele. Ca urmare, programul pentru sinteza unei anumite proteine ​​dispare.

În 2006, doi cercetători americani au primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină pentru explicarea mecanismului interferenței ARN. Crearea de regulatori ai expresiei genelor bazate pe ARN-uri de interferență a deschis oportunități mari pentru obținerea unei game largi de medicamente netoxice extrem de eficiente care suprimă expresia aproape tuturor genelor, inclusiv a celor tumorale și virale.

Mutații corecte

Atenția specialiștilor a fost mult timp atrasă de metodele de acțiune mutagenă asupra ADN-ului folosind oligonucleotide sau derivații acestora. Dacă are succes, ceea ce astăzi pare a fi o fantezie poate deveni real: corectarea programelor genetice defecte.

S-a dovedit deja experimental că mutațiile punctuale pot fi introduse în programele genetice folosind oligonucleotide scurte. Cum să o facă? Oligonucleotidele mutagene care conțin blocuri de nucleotide „greșite” sunt introduse în celulă, unde sunt combinate cu ADN. Ca rezultat, perechile de baze „greșite”, adică necomplementare, apar în unele părți ale secvențelor de nucleotide, care este percepută de sistemul de reparare („reparare”) ADN-ului celular ca o deteriorare. Nucleotidele dintr-o astfel de pereche sunt înlocuite cu enzime reparatoare în așa fel încât să devină „corectă”, complementară. În acest caz, înlocuirea poate avea loc atât în ​​secvența de oligonucleotide, cât și în ADN-ul celular însuși.

În acest din urmă caz, avem de-a face cu o schimbare a programului genetic, adică cu o mutație. Și deși eficiența unui astfel de proces de mutație este în general scăzută, acesta poate fi utilizat în legătură cu noile tehnologii celulare. De exemplu, celulele stem ale unui pacient cu o tulburare ereditară pot fi tratate cu un mutagen selectiv, iar apoi acelea dintre ele în care a apărut mutația dorită (adică celulele cu un program genetic „corectat”) pot fi selectate, multiplicate. și introdus în corp.

1967 A fost publicată prima lucrare despre oligonucleotide, substanțe biologic active vizate de gene

Astfel, oligonucleotidele existente în prezent sunt capabile să regleze „lucrarea” genelor la diferite niveluri. Astfel, oligonucleotidele antisens și ARN-urile interferente menționate mai sus funcționează în stadiul sintezei proteinelor, acționând asupra ARN-urilor mesager - molecule informaționale în care sunt asamblate lanțuri polipeptidice. Oligonucleotidele antigenice care formează complexe cu ADN-ul suprimă expresia genelor - formarea ARN-urilor mesager în sine, iar oligonucleotidele aptamer, ca și anticorpii, pot forma legături cu anumite proteine, blocându-le. În plus, unele oligonucleotide sunt capabile să stimuleze sistemul imunitar - astăzi sunt folosite ca componente ale vaccinurilor.

În prezent, dezvoltarea și sinteza oligonucleotidelor și a analogilor acestora sunt realizate de mari sectoare industriale și de cercetare. Deci, anul trecut, volumul pieței de oligonucleotide destinate doar cercetării a depășit 800 de milioane de dolari! Zeci de noi tipuri de oligonucleotide modificate chimic au fost acum dezvoltate și sintetizate, iar o serie de medicamente antivirale și antiinflamatoare bazate pe acestea sunt testate. Cercetările de acest fel în Rusia se desfășoară în prezent în principal la Institutul de Biologie Chimică și Medicină Fundamentală al Filialei Siberiei a Academiei Ruse de Științe, unde lucrează studenții și adepții academicianului D. G. Knorre.

Așa a fost dovedită de viața însăși fecunditatea ideii apărute în ramura siberiană în urmă cu patruzeci de ani. Folosind fragmente scurte de acizi nucleici ca structuri de bază pentru crearea de substanțe biologic active vizate de gene, este posibil să se dezvolte și să introducă rapid în producție medicamente specifice împotriva aproape oricărui virus. Pentru a face acest lucru, este necesar doar descifrarea secvenței de nucleotide a genelor virale, ceea ce este ușor de realizat cu ajutorul tehnologiilor moderne. Această abordare universală are un viitor mare: rezultatele studiilor din ultimii ani, în special asupra mutagenezei direcționate, ne permit să mizăm pe apariția unor medicamente eficiente în viitorul apropiat pentru combaterea bolilor care sunt încă considerate incurabile.

Introducere

Dezvoltarea de medicamente țintite este o sarcină prioritară a biologiei moleculare moderne, chimiei bioorganice și medicinei. În prezent, există un număr mare de lucrări care reflectă diverse abordări pentru rezolvarea acestei probleme. Din mai multe motive, cea mai promițătoare abordare se bazează pe alegerea ARNm a unei proteine ​​patogene ca țintă și pe utilizarea proprietății de complementaritate în interacțiunea acizilor nucleici între ei. Până în prezent, se lucrează în trei domenii:

oligonucleotide antisens;

Ribozime și ADNzime;

SiRNA și miARN.

Aceste metode se bazează pe utilizarea de molecule scurte de acid nucleic (17 - 70 nt) cu o secvență care este parțial sau complet complementară cu situsul ARNm țintă. Principiile generale de acțiune ale unor astfel de agenți îi unesc și în domeniul problemelor emergente, dintre care cele mai acute sunt livrarea în celulă, rezistența la acțiunea nucleazelor și eficiența interacțiunii cu ARNm țintă. Modificările chimice ale agenților NC ajută la rezolvarea parțială sau completă a multora dintre aceste probleme și la creșterea eficacității agenților.

Studiul mecanismelor de suprimare a expresiei genelor folosind interacțiuni complementare necesită utilizarea unor metode de analiză care să permită determinarea fără ambiguitate a efectului antisens al oligonucleotidelor.

Scopul acestei lucrări este de a dezvolta o metodă pentru suprimarea expresiei genei EGFP în celule utilizând conjugați ai oligonucleotidei cu piren.

Modificări ale oligonucleotidelor antisens (Revista literaturii)

Dezvoltarea unor medicamente care permit la nivel de gene prevenirea dezvoltării bolilor cauzate de expresia proteinelor patogene (virale, produse oncogene) sau a proteinelor care împiedică vindecarea acesteia (MDR) a dus la apariția și dezvoltarea tehnologiei antisens. Principiul tehnologiei antisens este simplu: oligoribonucleotidele antisens provoacă suprimarea expresiei genei țintă într-o manieră specifică secvenței, folosind capacitatea oligonucleotidelor de a hibridiza la ARNm țintă prin interacțiuni Watson-Crick. Oligonucleotida, care se leagă de ARN-ul țintă, împiedică prelucrarea ulterioară a acestuia. Experimentele pe culturi de celule au arătat că utilizarea oligodeoxirribonucleotidelor (denumite în continuare ODN) lungi de 20–30 nt, complementare regiunii ARNm, reduce semnificativ nivelul de expresie al proteinei pe care o codifică. Dezvoltarea metodei a arătat o serie de motive care duc la o scădere a eficienței ODN-ului: durata scurtă de viață a ODN-ului în ser, eficiență scăzută a pătrunderii (transportului) în celulă și eficiența insuficientă a legării la fragmentele structurate de ARN.

Dezvoltarea chimiei organice, în special a chimiei acizilor nucleici, face posibilă căutarea modalităților de rezolvare a problemelor emergente prin introducerea diferitelor modificări chimice ale ODN. Atât bazele azotate, cât și coloana vertebrală zahăr-fosfat pot fi supuse modificărilor chimice, ceea ce duce la o creștere a rezistenței sale la nuclează ODN și la eficiența legării sale la secvența complementară. Se încearcă creșterea eficienței livrării ODN în celulă prin introducerea diferitelor grupuri în compoziția sa la unul dintre capete, care facilitează trecerea prin membrană.

Practic, se disting două mecanisme de acțiune ale oligonucleotidelor antisens: oprirea translației datorită legării regiunii reglatoare și clivajul ARN în heteroduplexul ARN-ADN. Menținerea modificărilor poate avea un impact diferit asupra unuia sau altuia mecanism, care trebuie luat în considerare atunci când alegeți o opțiune de modificare.

1.1 Mecanismul de acțiune al oligonucleotidelor antisens

Când o oligonucleotidă antisens interacționează cu ARNm, au loc două evenimente: blocarea sterică și scindarea ARNm-ului țintă de către RNaza H. Pentru unele oligonucleotide, ambele evenimente au loc (oligonucleotide competente pentru RNază H), pentru altele, numai blocarea sterica (RNază H-independentă). ). Aceste două variante se bazează pe mecanisme celulare diferite. Cea mai largă gamă de mecanisme moleculare este utilizată atunci când se utilizează a doua opțiune. Acest lucru se realizează prin adresarea oligonucleotidelor la secvențe reglatoare specifice atât în ​​pre-ARNm, cât și în ARNm. În cazul pre-ARNm, ODN care se adresează regiunii de graniță dintre intron și exon perturbă splicing, ceea ce duce fie la terminarea acestuia, fie la formarea ARNm care codifică o proteină nefuncțională (vezi Fig. 1). Un alt sit promițător de legare a ODN-ului în pre-ARNm este regiunea de capăt 5'. Interacțiunea ODN-ului cu această regiune duce la blocarea plafonării.

Când ODN interacționează cu ARNm, traducerea acestuia este perturbată și, prin urmare, sinteza proteinei, datorită blocării mișcării ribozomului de-a lungul ARNm sau chiar a ansamblului acestuia, în funcție de poziția situsului de legare.

Fig.1.

ODN-urile competente pentru RNază H pot fi adresate oricărei regiuni de pre-ARNm și ARNm, deoarece acțiunea lor se bazează pe activarea RNazei H, al cărei substrat este ARN în compoziția duplexurilor ARN-ADN. Cu toate acestea, multe oligonucleotide antisens modificate chimic nu pot activa acest mecanism din cauza specificității sterice ridicate a RNazei H. Acest lucru se datorează faptului că majoritatea modificărilor duc la o modificare a parametrilor helixului duplexului ODN-ARN, și încetează să mai fie substraturi pentru RNaza H.

Oligonucleotidele antisens de a doua generație - modificate la poziția 2 "a reziduului de zahăr, nu sunt substraturi ale RNazei H, prin urmare, trebuie căutați și alți agenți de scindare (RNaze artificiale). O serie de molecule mici (intercalatori, policationi) sunt capabile pentru a scinda ARN-ul țintă duce la scindarea regiunilor dorite ale ARN-ului țintă.Asemenea grupe sunt complexe metalice, amine, oligopeptide și structuri moleculare cu grupări ale centrului activ al nucleazelor (inel imidazol, COO - -, grupări NH2, guanidina).

1.2 Modificări antisens de oligonucleotide

1.2.1 Strategii pentru dezvoltarea modificărilor chimice ale oligonucleotidelor

Pe baza datelor acumulate privind utilizarea oligonucleotidelor antisens, au fost formulate o serie de criterii pe care un ODN trebuie să le îndeplinească pentru a fi un agent terapeutic eficient:

rezistență la nucleaze

afinitate mare pentru țintă

Formarea substratului RNază H

diferite mecanisme de acțiune (influența îmbinării alternative, oprirea translației)

nontoxicitate și specificitate

Posibilitatea de legare nespecifică la proteine ​​pentru transport

Ușurință de sinteză, brevetabilitate, beneficiu

ODN-urile native nu pot satisface pe deplin toate criteriile enumerate. Principalele limitări sunt rezistența slabă la nuclează și complexele ODN-ARN insuficient de stabile. Introducerea modificărilor chimice în ODN pentru toate nucleotidele sau individuale poate elimina în mare măsură deficiențele existente. Modificările ODN sunt efectuate la gruparea fosfat, restul de zaharoză, baza azotată sau la resturile terminale de fosfat. Pentru a crește rezistența la nuclează, modificarea este cel mai adesea efectuată la gruparea fosfat și la reziduul dezoxiriboză. O creștere a eficienței de legare se obține datorită modificării bazelor azotate, precum și a reziduului de deoxiriboză. Pentru a crește eficiența legării proteinelor și a îmbunătăți transportul, se realizează conjugarea cu liganzi de natură diferită. În unele cazuri, constructele chimice atașate acționează ca catalizatori pentru legăturile fosfodiester din ARN.

1.2.2 Modificări ale grupului fosfat

Scindarea legăturilor fosfodiester din ADN de către nucleaze are loc prin legarea eficientă la locul activ și prin utilizarea proprietăților acido-bazice ale grupării fosfat. O modalitate de a crește rezistența legăturilor ODN la acțiunea nucleazelor este schimbarea configurației electronice a grupării fosfat. Pentru a face acest lucru, unul dintre atomii de oxigen nelegați este înlocuit cu un atom al altui element. Sulful a fost unul dintre primele astfel de elemente care au fost utilizate, în urma căruia s-au obținut fosforotioați (oligonucleotide antisens modificate de prima generație; vezi Fig. 2, II).

Orez. 2.

Fosforotioații au arătat rezistență ridicată la acțiunea nucleazelor, totuși, această modificare a crescut semnificativ toxicitatea ODN-ului.

Prin înlocuirea atomului de oxigen nelegat al grupării fosfat cu o grupare metil, se obțin metilfosfonați (vezi Fig. 3, III), care prezintă rezistență ridicată la acțiunea nucleazelor. Modificarea este adesea efectuată numai la nucleotidele terminale, rezultând o toxicitate redusă.

Dacă înlocuim atomul de oxigen al fosfatului cu BH 3 - , se obțin boranofosfați. Reziduul -BH 3 - este izoelectronic la atomul de oxigen din legăturile fosfodiesterice, datorită cărora boranofosfații își păstrează sarcina negativă, sunt foarte solubili în apă și formează complexe cu ARN-ul țintă. De asemenea, acest reziduu este izoelectronic și izosteric pentru gruparea metil, datorită căreia proprietăți similare cu cele ale metilfosfonaților, cum ar fi rezistența la nucleaze, ar trebui să fie așteptate de la aceștia.

Orez. 3.

1.2.3 Modificări ale reziduurilor de zahăr

Modificările legăturilor fosfodiester nu au un efect semnificativ asupra stabilității heteroduplexului ADN-ARN. Prin urmare, pe lângă oligodeoxinucleotidele modificate, sunt de interes așa-numitele oligonucleotide antisens modificate de a doua generație - acestea sunt oligoribonucleotide substituite la grupa hidroxil 2" a restului de riboză. O astfel de modificare crește și rezistența la nucleaze. Deși ARN-ul este mult mai puțin rezistent la influențele mediului în comparație cu ADN-ul datorită prezenței unei grupe 2"-OH, modificările acestui grup fac posibilă obținerea de produse stabile care prezintă o toxicitate mai mică în comparație cu fosfonații. De asemenea, oligonucleotidele antisens modificate de a doua generație includ adesea oligonucleotide cu un schelet modificat de natură non-zahăr-fosfat, de exemplu, acizi nucleici peptidici care prezintă, de asemenea, rezistență la nuclează și formarea de hibrizi stabili termodinamic cu molecule de ARNm țintă.

Fig.4. Modificări de a doua generație: V - 2 "-O-alchil-ARN, VI - LNA, VII - Morpholino, VIII - PNA.

O analiză a datelor privind utilizarea unui număr de derivați de ARN 2’-O-alchil care conțin de la una la cinci unități de metilen în radicalul alchil a arătat că, odată cu creșterea numărului de unități de metilen, rezistența oligonucleotidei modificate la acțiunea nucleazelor (pentoxi > propoxi > metoxi > deoxi) crește.Această dependență poate fi explicată prin inaccesibilitatea sterica a nucleotidei atunci când este atașat un substituent mai mare.Totuși, obstacolul steric cauzat de prezența substituenților voluminosi reduce eficiența formării. de complexe complementare cu ARNm țintă, prin urmare, cea mai mare afinitate pentru țintă a fost obținută atunci când se utilizează substituenți mici. 2 "-O-fosforotioați metilati (Me-S-ODN), S-ADN și ADN nemodificat, sa dovedit că punctul de topire (T m) al heteroduplexurilor ADN-ARN crește în următoarea ordine: Me-S-ODN - ARN > ADN normal - ARN > S-ODN - ARN . Dezavantajul acestei modificări este că RNaza H nu poate scinda ARNm țintă în complexul ARN-ARN. Ca o consecință a acestui dezavantaj, astfel de oligonucleotide sunt inhibitori mai puțin puternici ai expresiei genelor în comparație cu cei nemodificați.

Modificările cationice 2" duc la formarea de oligonucleotide zwitterionice. Astfel de oligonucleotide, pe lângă formarea de heteroduplexuri mai stabile, în comparație cu cele nemodificate, au o capacitate mai mare de a pătrunde în membranele biologice și o stabilitate ridicată împotriva nucleazelor datorită încărcării lor. 2 Oligonucleotidele '-O-etil] (2"-O-DMAEOE, vezi Fig. 5), datorită efectului de încărcare, formează heteroduplexuri cu ARN-ul ţintă cu un punct de topire cu 2 °C mai mare în comparaţie cu oligonucleotidele nemodificate. Oligonucleotidele Zwitterionice păstrează competența RNază H dacă modificările sunt împrăștiate pe toată lungimea oligonucleotidului.

Orez. 5.2 „-O-DMAEOE

Acizii nucleici "blocați" limitați conformațional (Locked Nucleic Acids, LNA) sunt acizi nucleici modificați având cel puțin un monomer cu furanoză biciclică ca reziduu de zahăr (vezi Fig. 4, VI). Au o afinitate mare pentru secvența complementară (punctul de topire al duplexului crește cu 6 °C atunci când o nucleotidă este modificată), ceea ce este atât un avantaj (legarea efectivă a țintei) cât și un dezavantaj (formarea acelor de păr). O astfel de afinitate trebuie luată în considerare la proiectarea LNA. Studiile la șoareci au arătat că LNA are o toxicitate scăzută.

Acizii nucleici peptidici (PNA) sunt analogi ai acizilor nucleici în care scheletul zahăr-fosfat este înlocuit cu un polimer pseudopeptidic N-(2-aminoetil)-glicină. Capătul N-terminal imită capătul 3’ al oligonucleotidei, în timp ce capătul C-terminal imită capătul său 5’-terminal (vezi Fig. 3, VII). Complexele PNA-ARN sunt mai stabile decât complexele ADN-ADN și ARN-ARN. În ciuda faptului că PNA-urile pot lega ținta atât în ​​orientări antiparalele (conform Watson-Crick) cât și paralele (conform Hoogsteen), se formează complexe mai stabile cu orientarea antiparalelă a PNA. Studiile au arătat o toxicitate redusă a PNA.

Morfolinele (vezi Fig. 3, VIII) sunt reactivi care combină stabilitatea, rezistența la nucleaze, eficiența, activitatea pe termen lung, solubilitatea în apă, specificitatea ridicată și toxicitatea scăzută. Moleculele au o sarcină neutră. Morpholines sunt produse de Gene Tools, LLC ( http://www.gene-tools.com).

Pentru a menține competența RNază H, este necesar ca mijlocul oligonucleotidei să conțină cel puțin 7 deoxinucleotide; prin urmare, sunt utilizate oligonucleotide antisens „mixte”, adică având modificări diferite în diferite legături (LNA/ADN, LNA/ARN etc.). De asemenea, la amestecul de reacție se adaugă compuși care conțin grupări care provoacă scindarea ARNm-ului țintă datorită asemănării lor cu centrul activ al RNazei H sau nu sunt modificate toate unitățile de nucleotide (de exemplu, numai capete 3’ și 5’). ). .

Astfel, principalele proprietăți ale oligonucleotidelor antisens modificate cu zahăr-fosfat pot fi rezumate în următorul tabel:

Tabelul 1. Comparația modificărilor scheletului de fosfat de zahăr.

Modificare	Stabilitatea nucleară	Afinitatea țintă	activarea RNazei H	Non-toxicitate

1.2.4 Modificări ale bazelor azotate

Activitatea antisens eficientă poate fi dificil de realizat doar cu modificări ale scheletului de fosfat de zahăr. Bazele azotate modificate cresc eficacitatea ODN-urilor antisens prin creșterea afinității pentru ARN-ul țintă (aminoadenozină, G-clamp) și a vitezei de penetrare prin membrana plasmatică (grupe cationice și zwitterionice).

Când se adaugă fenoxazină la reziduul de citozină, se obține așa-numita clemă G (vezi Fig. 6, X), care formează o legătură suplimentară de hidrogen cu reziduul de guanină, datorită căreia punctul de topire al hibridului ODN-ARN crește cu 6–18 °C. O astfel de modificare este de obicei efectuată la capătul 3’, ceea ce nu afectează competența RNază H.

Când o grupare amino este introdusă într-un rest de adenină (vezi Fig. 6, XI), afinitatea pentru țintă crește, de asemenea, datorită formării unei legături suplimentare de hidrogen cu restul de timină.

Orez. 6. Legături de hidrogen suplimentare între clema C și G (X), între T și A NH2 (XI)

ODN-urile cu grupări cationice și zwitterionice atașate la reziduurile bazelor azotate (de exemplu, spermidină, Fig. 7) datorită încărcăturii lor pozitive nu numai că au o afinitate mai mare pentru țintă, ci și o capacitate îmbunătățită de a pătrunde în celulă și stabilitate la acţiunea nucleazelor.

Orez. 7.

Bazele azotate terminale sunt conjugate cu liganzi fluorescenți mari, cum ar fi fluoresceina, pentru a vizualiza locația ODN-ului în celulă.

Fig.8.

1.2.5 Atașarea substituenților voluminosi

Capacitatea de a pătrunde în celulă fără a trece prin membrana celulară este una dintre calitățile care trebuie să fie prezente într-o oligonucleotidă antisens eficientă. Majoritatea modificărilor descrise mai sus ale nucleotidelor în ODN-uri nu afectează în mod semnificativ transportul ODN-ului prin membrana celulară. Există mai multe căi prin care moleculele traversează plasmalema, dar două sunt importante pentru ODN: difuză sau non-mediată de receptor și mediată de receptor. Transportul conform primei variante este îngreunat de încărcătura negativă totală a ODN-urilor și de hidrofilitatea acestora. Utilizarea celei de-a doua căi este limitată de date insuficiente privind proteinele de suprafață ale membranei celulare responsabile de transportul acizilor nucleici în celulă. Crearea conjugatelor ODN cu diverse grupe chimice îmbunătățește eficiența transportului de-a lungul uneia sau alteia rute, în funcție de tipul grupului chimic și de locul atașării acesteia la ODN. Figura 9 prezintă variantele de linker care sunt utilizate la prepararea conjugatelor. Liganzii pot fi atașați la baze azotate, fosfați terminali, legături fosfodiester (sau similare) și reziduuri de zahăr. Anumite tipuri de grupări chimice permit, de asemenea, vizualizarea compartimentării prin detectarea fluorescenței. reacție antisens de modificare a oligonucleotidelor

Fig.9.

Neutralizarea parțială și chiar completă a sarcinii negative a ODN nu are un efect semnificativ asupra capacității ODN-ului de a se transporta spontan în celulă. Atașarea diverșilor liganzi hidrofobi voluminosi, cum ar fi cei reprezentați în Figura 9, facilitează transportul ODN prin membrană.

Fig.10.

Conjugații de colesterol au fost bine studiati. Mecanismul care îmbunătățește intrarea în celule prin adăugarea de colesterol nu este încă pe deplin înțeles, deși s-a sugerat încorporarea lipoproteinelor mediate de receptor. Conjugații de colesterol formează micelii, ceea ce facilitează transportul lor în celulă. Reziduul de colesterol este de obicei atașat la 5"- și 3"-fosfați terminali, iar oligonucleotidele 3"-monocolesteril sunt mai eficiente decât oligonucleotidele 5"-monocolesteril și oligonucleotidele 5", 3"-bischolesteril sunt cele mai eficiente. De exemplu, la 6 minute după injectarea în sângele de șoarece, nivelul în țesuturi de fosforotioați 3’-mono-modificați a fost de 4 ori mai mare, iar fosforotioații 5’-mono- și 3’5’-bis-modificați a fost de 7 ori mai mare în comparație. la fosforotioaţii nemodificaţi.

Se folosesc monomeri cu fosfat substituit cu 5"- sau / și 3"-colesteril, oligonucleotide cu un ligand conjugat cu o legătură fosfodiester înaintea nucleozidei 3"-terminale, precum și dendrimeri de colesteril cu un rest de lizină ca linker (vezi Fig. . 11).

Fig.11.

Oligonucleotidele conjugate cu alte molecule hidrofobe (adamantan, piren, acid eicosanoic etc.) au fost sintetizate și comparate cu cele de colesterol. Conjugații de colesterol au prezentat o lipofilitate optimă, precum și o bună capacitate de acumulare în ficat.

Conjugarea cu derivați de piren, pe lângă îmbunătățirea capacității de transport, este de interes datorită capacității lor de a fluoresce. Derivații de bis-pirenil sunt capabili să formeze excimeri - complexe bimoleculare în care o moleculă este în starea fundamentală, cealaltă este în stare excitată. Astfel de complexe sunt foarte sensibile la mediul spațial; nivelul de fluorescență poate fi utilizat pentru a aprecia dacă ODN-ul este în starea asociată cu ARN-ul țintă sau nu:

Fig.12.

Conjuganții de peptide sunt, de asemenea, utilizați pentru a îmbunătăți eficiența transportului în celulă. La oligonucleotide, incl. PNA, atașează o peptidă capabilă să transporte molecule mari încărcate polar prin membrană. Astfel, peptida Antennapedia are locuri de legare la ADN. PNA cu peptida Antennapedia atașată nu numai că intră eficient în celulă, dar migrează și în nucleu.

Fig.13.

Atașarea la capetele moleculelor ODN antisens cu molecule mari intercalate planare, cum ar fi acridina (vezi Fig. 14), este de interes ca o creștere a eficienței clivajului ARN țintă. Datorită intercalării, interacțiunea dintre ODN și ARN este slăbită local. Datorită creșterii distanței dintre ADN și ARN din cauza dimensiunii moleculei intercalatoare, molecula de ARN „iese” din dubla helix a heteroduplexului. Cationii de metale grele, de exemplu, Lu 3+, coordonați cu atomii de azot ai reziduului de acridină, catalizează hidroliza ARN fără participarea RNazei H, iar „bucla” ca structură destabilizatoare accelerează acest proces.

Orez. 14.

1.3 Aspecte fizico-chimice ale interacțiunii dintre oligonucleotide și ARN țintă

Eficacitatea oligonucleotidelor antisens este cuantificată prin afinitatea ODN-ului pentru ARNm țintă și constanta de clivaj efectivă a acestuia din urmă.

Afinitatea ODN-ului pentru ARN-ul adresat acestuia (sau energia liberă a formării heteroduplexului) descrie stabilitatea hibridului ADN-ARN. r G poate fi măsurat calorimetric sau calculat teoretic. Atunci când se calculează energia liberă Gibbs a formării heteroduplexului, se utilizează legea Hess (energia liberă Gibbs a unei reacții complexe nu depinde de calea acesteia) și calculele energiilor de formare ale structurilor secundare și terțiare conform „regula vecinului cel mai apropiat. ” folosind programul mfold dezvoltat de Zucker et al. . Reacția poate fi reprezentată astfel:

În această schemă, M, O, H sunt ARNm țintă, respectiv, ODN antisens și ODN heteroduplex - ARN, ținând cont de structurile lor secundare și terțiare, M u , O u , H u - ARNm țintă, respectiv, ODN antisens și ODN heteroduplex - ARN fără a lua în considerare structura lor secundară și terțiară, un G (M) , un G (o) , un G (H)- Energiile libere ale Gibbs de a le plasa într-o structură secundară și terțiară, r g, r G (desfacut) sunt energiile libere ale hibridizării ODN și ARNm în stările pliate și, respectiv, complet denaturate.

un G (M) , un G (o) , un G (H)Și r G (desfacut) pot fi calculate teoretic. Atunci energia liberă a hibridizării se găsește conform legii Hess:

Constanta de echilibru a procesului de asociere heteroduplex K 1 poate fi găsită din energia liberă Gibbs calculată a procesului de hibridizare:

Pentru a estima temperatura de topire a unui heteroduplex, se folosește și regula „cel mai apropiat vecin” și se calculează folosind programele adecvate.

Experimental, se poate găsi constanta ratei efective k eff reacții brute ale transformării ARNm M într-un produs condiționat X (această condiționalitate nu afectează rezultatul calculelor cinetice, dar le simplifică foarte mult):

Constanta efectivă a vitezei de reacție globală indică viteza observată de scindare ARNm țintă.

Mecanismul de reacție poate fi reprezentat prin următoarea schemă:

În această schemă, E este enzima RNaza H, HE este complexul său intermediar cu substratul H, K 1 - constantă de asociere heteroduplex, calculată prin formula (3).

Pentru această schemă cinetică, putem compune un sistem de ecuații cinetice:

Unde CU A- concentrația substanței A, k i - constanta de viteză a i-a reacții elementare.

Un parametru măsurat în mod obișnuit este concentrația de ARNm în soluție (inițial C M0 si curent C M), De aceea k eff numărare relativ la matrice:

Folosind aproximarea cvasi-staționară pentru produsul intermediar HE și simplificând expresia vitezei de reacție w folosind ecuația Michaelis-Menten:

unde este constanta Michaelis, este posibil să se transforme expresia ratei de modificare a concentrației heteroduplexului H:

Să găsim o expresie pentru constanta de viteză efectivă a clivajului ARNm țintă în două cazuri: când procesul este limitat de legarea ARNm de către ODN antisens și este limitat de clivajul catalitic al ARNm țintă în heteroduplex.

Cazul 1. Limitarea prin hibridizare.

În acest caz, procesul de divizare este mult mai rapid decât hibridizarea. Prin urmare, putem presupune stabilirea unei concentrații staționare a heteroduplexului H, adică:

Pe de altă parte, este ușor de observat (6) că:

Adică, în acest caz, expresia pentru viteza de scindare a ARNm coincide în valoare absolută cu expresia pentru viteza de reacție (rata de formare a produsului condiționat X). Folosind aceasta, vom transforma expresia pentru viteza de modificare a concentrației oligonucleotidei, vom vedea că concentrația sa poate fi considerată aproape neschimbată:

Folosind expresia (14) și, ca urmare, neglijând contribuția termenului k -1 CU H c găsiți viteza clivajului ARNm într-o formă nouă și exprimați k eff .

Cazul 2. Limitarea prin scindarea catalitică a substratului.

În cazul în care divizarea decurge mult mai lent decât formarea unui heteroduplex, putem presupune că echilibrul are timp să fie stabilit.

Concentrația de echilibru a heteroduplexului poate fi neglijată în comparație cu constanta Michaelis în expresia ratei:

Scrierea expresiei constantei de echilibru K 1 și ecuația bilanțului material pentru M și O, obținem suficiente condiții pentru rezolvarea ecuației:

Unde [ A] - concentrația de echilibru, CU A 0 - concentrația inițială a substanței.

Ținând cont de (17) și (18), obținem expresiile pentru concentrațiile de echilibru ale H și O:

Înlocuind (21) în ecuația Michaelis-Menten (16), obținem o ecuație modificată a vitezei de reacție:

Înlocuind expresiile (20), (21) și (22) în (12) și omițând calculele intermediare greoaie, obținem o expresie pentru rata de scindare catalitică a ARNm:

de unde este ușor de găsit formula pentru constanta de viteză efectivă a procesului brut:

Există multe obstacole în calea creării de medicamente bazate pe ODN-uri antisens: capacitate slabă de internalizare, instabilitate nucleazică, toxicitate și altele. Modificările chimice pot elimina multe dintre aceste probleme, dar numai parțial, și este dificil de găsit un compromis între avantajele și dezavantajele oricărei modificări. În ciuda acestui fapt, multe medicamente pe bază de ODN au fost testate. Primul medicament pe bază de ODN, Vitravene, a avut ca scop combaterea infecției cu citomegalovirus la pacienții cu SIDA.

INTRODUCERE

CAPITOLUL 1. REVISTA LITERATURĂ.

1.1. Principalele idei și modalități de creare a medicamentelor împotriva cancerului țintite 15 1.1.1. Medicamente vizate în oncologie: medicamente pe bază de anticorpi monoclonali și oligonucleotide antisens.

1.2. Endocitoza mediată de receptor și rolul său în livrarea de compuși biologic activi către celulele țintă

1.3. Sisteme alternative pentru administrarea țintită a medicamentelor anticancer pentru a îmbunătăți eficacitatea terapiei cancerului.

1.4. Antigenii specifici tumorii ca ținte pentru livrarea țintită a medicamentelor anticancer

1.5. Livrarea țintită a medicamentelor ca parte a conjugatelor cu molecule de vector proteine ​​și peptide.

1.6. Proteine ​​himerice

1.7. Alfa-fetoproteina și receptorii săi ca țintă pentru livrarea selectivă a substanțelor biologic active către celulele tumorale.

1.7.1. Structura și funcțiile alfa-fetoproteinei

1.7.2. Receptori pentru alfa-fetoproteina.

1.7.3. Fragmente active biologic de alfa-fetoproteina

1.8. Livrarea țintită a medicamentelor anticanceroase ca abordare principală pentru a depăși rezistența la mai multe medicamente (MDR)

1.8.1. Fenomenul de rezistență la mai multe medicamente a celulelor tumorale.

1.8.2. Abordări moderne pentru depășirea rezistenței la mai multe medicamente.

CAPITOLUL 2. MATERIALE ȘI METODE.

2.1. Izolarea alfa-fetoproteinei umane naturale și producerea de proteine ​​fragment AFP recombinante.

2.1.1. Izolarea AFP umană

2.1.2. Obținerea unui fragment C-terminal recombinant de AFP (gAFP27)

2.1.3. Prepararea proteinei PGA recombinante

2.1.4. Obținerea unui fragment recombinant de AFP AFP-3BC

2.2. Sinteza conjugatelor de proteine ​​și peptide cu FITC, citostatice și oligonucleotide.

2.2.1. Sinteza AFP, mAb și fragmente C-terminale marcate cu FITC ale AFP hAFP27 și AFP-3BC.

2.2.2. Sinteza octapeptidei AFP GIP8 marcate cu FITC.

EMTPVNPG (GIP8) cu doxorubicină.

2.2.4. Sinteza conjugaților AFP cu vinblastină.

2.2.5. Sinteza conjugaților AFP cu ftalocianine

2.2.6. Sinteza conjugatelor AFP și GIP8 cu esperamicină Aib (EsA).

2.2.9. Sinteza conjugatelor AFP cu oligonucleotide.

2.2.10. Prepararea complexelor ON cu proteine.

2.3. Culturi celulare și condiții de cultivare.

2.4. Evaluarea legării receptorilor și a endocitozei proteinelor, peptidelor și conjugatelor marcate fluorescent utilizând citometria în flux.

2.4.1. Evaluarea legării AFP și Mab la receptorul AFP.

2.4.2. Evaluarea endocitozei AFP marcate fluorescent, fragment C-terminal al AFP, octapeptida AFP GIP8.

2.5. Evaluarea endocitozei conjugatelor de proteine ​​și peptide cu DOX utilizând citometria în flux.

2.6. Studii imunocitochimice și imunohistochimice.

2.6.1. Studiul exprimării receptorilor AFP pe suprafața celulei.

2.6.2. Studiul exprimării proteinelor c-Myc, Bc1-2 și Pgpl70.

2.6.3. Colorarea imunochimică a secțiunilor histologice.

2.7. Studiul exprimării c-Myc, Bcl-2 și Pgpl70 în celulele tumorale.

2.7.1. Studiul exprimării c-Myc, Bcl-2 și Pgpl70 folosind Western blot.

2.7.2. Investigarea exprimării c-Myc, Bcl-2 și Pgpl70 în celulele tumorale utilizând citometria în flux.

2.8. Microscopia cu fluorescență.

2.9. Determinarea activității citostatice a medicamentelor in vitro.

2.9.1. Determinarea viabilității celulare.

2.9.2. Determinarea inhibării activității proliferative a celulelor.

2.9.3. Analiza nivelului de apoptoză folosind microscopie cu fluorescență.

2.8.4. Determinarea activității fotocitostatice și chemiocitostatice a conjugaților AFP cu ftalocianine de aluminiu (A1Pc) și cobalt (CoPc).

2.9. Studiul activității proliferative a celulelor.

2.10. Analiza ciclului celular prin citometrie în flux.

2.11. Studiul activității antitumorale a medicamentelor in vivo.

2.12. Prelucrarea statistică a rezultatelor.

CAPITOLUL 3. REZULTATE ŞI DISCUŢIE LOR.

3.1. Studiul exprimării receptorului alfa-fetoproteină pe liniile celulare tumorale umane.

3.1.1. Studiul specificității clonelor mAb față de AFPR

3.1.2. Evaluarea cantității de AFPR pe celule tumorale umane cultivate in vitro.

3.2. Detectarea imunochimică a AFPR pe celule și secțiuni de țesut

3.2.1. Studiul exprimării receptorilor AFP pe suprafața celulelor tumorale folosind imunocitochimie.

3.2.2. Colorarea imunohistochimică a secțiunilor de țesut tumoral

3.3. Studiul legării și endocitozei AFP marcate fluorescent de către celulele tumorale in vitro.

3.3.1. Studiul legării AFP la receptorul de pe suprafața celulelor tumorale și a limfocitelor normale din sângele periferic uman folosind citometria în flux.

3.3.2. Studiul endocitozei AFP in vitro folosind citometrie în flux și microscopie cu fluorescență.

3.4. Utilizarea endocitozei mediate de receptori pentru administrarea țintită a medicamentelor anticancer - doxorubicină, vinblastină, esperamicină, ftalocianine.

3.4.1. Analiza internalizării conjugatelor de către celulele tumorale in vitro

AFP cu antibiotice/citostatice pe exemplul doxorubicinei.

3.4.2. Studiul activității citostatice a conjugatelor proteice cu doxorubicină in vitro.

3.4.3. Studiul activității antitumorale a conjugaților AFP cu DOX in vivo.

3.4.4. Studiul activității fotocitostatice și chemiocitostatice a conjugaților AFP cu ftalocianine de aluminiu (A1Pc) și cobalt

3.4.5. Studiul activității citostatice a conjugaților AFP cu alte antibiotice antitumorale (citostatice).

3.4.6. Studiul activității citostatice a conjugaților AFP cu esperamicină Ajb (EsA) in vitro.

3.4.7. Studiul activității antitumorale a conjugaților AFP cu esperamicină Aib (EsA) in vivo.

3.5. Depășirea rezistenței la mai multe medicamente cauzată de expresia genei MDR 1 folosind conjugați AFP cu medicamente anticancer in vitro.

3.5.1. Caracterizarea liniilor celulare rezistente.

3.5.2. Analiza internalizării DOX și a conjugaților săi de proteine ​​în linii celulare rezistente.

3.5.3. Studiul activității citostatice a conjugaților DOX-AFP împotriva liniilor celulare rezistente.

3.6. Fragmente active biologic de AFP.

3.6.1. Fragment C-terminal recombinant al AFP (gAFP27).

3.6.2. Fragment C-terminal recombinant al AFP AFP-ZVS.

3.6.3. Octapeptidă activă biologic - fragment AFP

3.7. Livrarea țintită a oligonucleotidelor antisens către celulele tumorale.

3.7.1. Livrarea țintită a oligonucleotidelor antisens către celulele tumorale sub forma conjugaților lor cu AFP.

3.7.2. Studiul eficacității eliberării ASON folosind complexe necovalente cu AFP.

Lista recomandată de dizertații

• Crearea și studiul proprietăților proteinelor umane recombinante cu un potențial efect antitumoral 2007, candidat la științe chimice Savvateeva, Lyudmila Vladimirovna

• Dezvoltarea de medicamente anticancer țintite bazate pe vectori peptidici și agenți antiangiogenici 2007, doctor în științe biologice Feldman, Natalia Borisovna

• Utilizarea domeniului C-terminal al alfa-fetoproteinei pentru livrarea țintită a medicamentelor anticancer 2012, Candidatul de Științe Biologice Godovanny, Artem Vitalievich

• Obținerea și studierea activității biologice a conjugaților de factor de creștere epidermic cu medicamente chimioterapeutice antitumorale 2000, candidat la științe biologice Gumanov, Sergey Georgievich

• Sinteza de conjugate ale α-fetoproteinei umane cu medicamente anticancerigene pentru livrarea țintită către celulele tumorale 2001, candidat la științe chimice Zabolotnev, Dmitri Viktorovich

Introducere în teză (parte a rezumatului) pe tema „Utilizarea vectorilor proteici și peptidici pentru livrarea selectivă a medicamentelor anticancer și a oligonucleotidelor terapeutice către celulele tumorale”

Urgența problemei. Principalele motive pentru eficacitatea insuficientă a tratamentului chimioterapeutic al bolilor oncologice sunt biodisponibilitatea scăzută a agenților antitumorali pentru tumoră, necesitatea utilizării unor doze mari de medicamente și natura neselectivă a acestor medicamente. Pătrunderea limitată a medicamentelor în tumorile eterogene din punct de vedere biologic duce la supraviețuirea unei părți a celulelor tumorale, chiar și după un tratament pe termen lung cu agenți citotoxici. Tratamentul cu doze mari, necesare remisiunii complete, determină reacții adverse sistemice severe, care obligă adesea pacienții să întrerupă tratamentul. În plus, utilizarea pe termen lung a agenților chimioterapeutici este plină de dezvoltarea rezistenței la mai multe medicamente, ceea ce face ca medicamentele utilizate să fie ineficiente. Fenomenul de rezistență la medicamente se bazează pe mecanisme intracelulare de natură variată, cum ar fi o scădere a transportului medicamentelor prin membrana plasmatică, o încălcare a nivelului de exprimare a oncogenelor, deteriorarea sistemelor de transducție a semnalului etc. Pentru a crește eficacitatea a terapiei tumorale, este necesară creșterea selectivității acțiunii medicamentelor. Aici se pot distinge două direcții: dezvoltarea de noi medicamente extrem de selective și crearea de noi sisteme pentru transportul reglementat al compușilor antitumorali bine-cunoscuți în celulele țintă.

Selectivitatea acțiunii unui medicament poate fi crescută prin utilizarea agenților țintiți în sistemele de livrare - molecule care se pot lega de determinanți specifici de pe suprafața celulei. Astfel, utilizarea componentei vizate determină interacțiunea sistemului de livrare selectivă cu celule și țesuturi strict definite, în special cu celule tumorale. Liganzii fiziologici ai receptorilor factorului de creștere sau proteinelor oncofetale pot acționa ca agenți țintiți sau vectori; factorii de creștere înșiși și proteinele oncofetale. Medicamentul anticancer poate fi legat de vector în mod covalent pentru a forma un conjugat sau necovalent pentru a forma un complex puternic. Legarea unei molecule țintă de un receptor specific de pe suprafața celulei induce procesul de endocitoză mediată de receptor, care asigură acumularea unui medicament de către celulele tumorale, a cărui țintă moleculară se află în interiorul celulei.

Trebuie remarcat faptul că, în unele cazuri, utilizarea sistemelor de livrare selectivă este singura modalitate de a utiliza potențialul terapeutic al unor antibiotice antitumorale foarte toxice, de exemplu, antibioticele din seria enediyne. Un exemplu este medicamentul Mylotarg, care este un conjugat al calichemiacinei Xi cu anticorpi umanizați la CD33. În plus, utilizarea unor sisteme de livrare foarte eficiente poate crește semnificativ efectul terapeutic al oligonucleotidelor antisens, care, din păcate, nu și-au găsit încă aplicație în practica clinică.

Rezolvarea cu succes a problemei transportului țintit al medicamentelor pe baza endocitozei mediate de receptor este determinată, în primul rând, de alegerea unei molecule vector. Vectorii proteici trebuie să îndeplinească o serie de cerințe de bază, inclusiv afinitatea ridicată a vectorilor pentru receptorii corespunzători de pe suprafața celulelor țintă tumorale, stabilitatea ridicată, posibilitatea modificării lor chimice prin conjugare cu medicamente pentru chimioterapie fără pierderea proprietăților biologice și disponibilitatea proteinelor în cantităţi preparative. Proteina oncofetală alfa-fetoproteina corespunde cel mai îndeaproape acestor cerințe. Factorii importanți în proiectarea sistemelor de livrare selectivă sunt, de asemenea, alegerea unui medicament (agent citostatic, fotosensibilizant, oligonucleotidă antisens) și un linker care conectează componentele țintite și citostatice. Screening-ul constructelor construite în sistemul in vitro și studiul comportamentului lor intracelular face posibilă identificarea celor mai optime variante de sisteme de livrare.

Scopul acestei lucrări a fost de a dezvolta principii pentru crearea sistemelor pentru livrarea selectivă a medicamentelor anticancer și a oligonucleotidelor terapeutice la celulele tumorale pe baza de proteine ​​și peptide naturale și recombinante și de a identifica modele care determină eficacitatea acestora. Obiectivele cercetării:

Selectarea moleculelor vector proteine ​​și peptide pentru eliberarea selectivă de medicamente anticancer și oligonucleotide antisens;

Crearea de constructe pentru livrarea selectivă a medicamentelor anticancer la celulele țintă pe baza alfa-fetoproteinei și a fragmentelor sale peptidice,

Studiul internalizării și distribuției intracelulare a medicamentelor în funcție de tipul de construcție pentru optimizarea sistemelor de livrare;

Dezvoltarea de abordări pentru a depăși rezistența la mai multe medicamente folosind sisteme de livrare țintite; Dezvoltarea de construcții bazate pe alfa-fetoproteină și factor de creștere epidermică pentru livrarea selectivă a oligonucleotidelor antisens și evaluarea eficacității acestora.

Noutate științifică și semnificație practică.

Prezența receptorilor AFP a fost dovedită atât pe suprafața celulelor liniilor tumorale umane, cât și pe secțiuni histologice ale tumorilor maligne umane (ovar, sân, ficat, stomac, intestine). Pe secțiuni de tumori benigne și țesuturi normale, precum și pe suprafața limfocitelor în repaus izolate din sângele voluntarilor sănătoși, receptorul AFP nu a fost găsit. Astfel, receptorul AFP poate fi utilizat ca marker tumoral pentru o gamă largă de tumori maligne, iar anticorpii la receptor pot fi utilizați pentru a diagnostica tumorile.

Conceptul unui sistem pentru livrarea țintită a compușilor biologic activi către celulele țintă folosind AFP și fragmentele sale peptidice ca motiv țintit a fost formulat și dezvoltat.

Au fost dezvoltate metode care permit experimentelor in vitro în culturi celulare să prezică eficacitatea medicamentelor cu acțiune selectivă.

S-a descoperit pentru prima dată că fragmentul C-terminal recombinant al AFP (de la 357 la 590 a.a.) se leagă în mod specific de receptorul AFP, este endocitozat de celulele tumorale precum AFP și, în mod similar cu AFP, inhibă creșterea hormonului indusă de estradiol. -celule tumorale dependente. Astfel, această proteină recombinată poate fi utilizată ca moleculă vector în sistemele de livrare țintite.

S-au creat constructe de gene pentru biosinteza indusă a fragmentelor C-terminale ale AFP în E. coli. Au fost dezvoltate metode foarte eficiente pentru izolarea fragmentelor de AFP recombinante.

Capacitatea fragmentului biologic activ al AFP-octapeptidei GIP8 (472-479 a.a.) de a se lega selectiv de suprafața celulelor tumorale și de a fi interiorizat de acestea cu eficiență ridicată a fost demonstrată pentru prima dată, ceea ce deschide posibilitatea folosind GIP8 ca vector în sistemele de livrare țintite.

Eficacitatea și selectivitatea activității antitumorale a conjugatelor AFP, AFP-ZVS și GIP8 in vitro împotriva unei game largi de linii celulare tumorale umane au fost dovedite. Au fost studiate regularitățile translocației lor intracelulare, s-a demonstrat dependența eficacității acțiunii conjugate de labilitatea legăturii chimice dintre proteină și agentul citostatic.

Atunci când se utilizează sisteme de livrare țintite bazate pe AFP, a fost găsită posibilitatea de a depăși rezistența la mai multe medicamente a celulelor tumorale datorită activității Pgpl70.

Eficacitatea antitumorală ridicată a conjugatului AFP cu esperamicină Aib a fost demonstrată pentru prima dată in vivo.

Au fost dezvoltate sisteme pentru livrarea selectivă a oligonucleotidelor terapeutice și s-a demonstrat posibilitatea fundamentală și promisiunea utilizării vectorilor proteici (AFP și factorul de creștere epidermică) pentru livrarea lor țintită către celulele tumorale.

Principalele dispoziții pentru apărare:

1. Receptorul AFP este un antigen unic specific tumorii care este prezent pe suprafața celulelor tumorale și absent din majoritatea celulelor normale.

2. Receptorul alfa-fetoproteină poate servi ca țintă pentru terapia antitumorală selectivă. Prin legarea specifică de receptorul său, alfa-fetoproteina este internalizată de celulele tumorale împreună cu moleculele de compuși medicinali atașați covalent de aceasta, asigurând astfel livrarea selectivă a medicamentelor către celulele tumorale.

3. Utilizarea sistemelor de livrare țintite bazate pe alfa-fetoproteină face posibilă depășirea rezistenței la mai multe medicamente a celulelor tumorale cauzată de transportorii ABC ai membranei plasmatice.

4. Fragmentele de alfa-fetoproteină recombinante care conţin un motiv de legare la receptor pot fi utilizate în sistemele de livrare selectivă în locul proteinei naturale de lungime completă.

5. Utilizarea vectorilor proteici (AFP și factorul de creștere epidermică) poate crește semnificativ eficiența eliberării intracelulare a oligonucleotidelor antisens.

Contribuția personală a autorului constă în dezvoltarea ideii, organizarea și desfășurarea unor studii experimentale, analiza, generalizarea și interpretarea rezultatelor obținute. Toate experimentele cu culturi celulare au fost efectuate direct de autor. Aprobarea lucrării.

Principalele rezultate ale lucrării au fost raportate la Simpozionul Internațional V privind biologia și utilitatea clinică a markerilor tumorali (1995, Barcelona, ​​​​Spania), al XVI-lea stagiar.

Congresul de Chimie Clinică, (1996, Londra), The Interdependence of Tumor Biology and Clinical Oncology (1996, Coronado, SUA), p. 121. Întâlnirea Societății Internaționale pentru Biologie și Medicină Oncodevelopmentale (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), Conferința Europeană pentru Cancer ECCO (1997, Franța), Congresul Național Rus „Omul și medicina” (2000, 2005, Moscova), a 37-a reuniune științifică anuală a Societății Europene pentru Investigații Clinice (2003, Verona, Italia), prima conferință EUFEPS privind optimizarea eliberării și formulării medicamentelor: noi provocări în livrarea medicamentelor (2003, Versailles, Franța), Al 5-lea workshop ISTC/Coreea despre biotehnologie (2004, Chungbuk, Coreea), Conferința Mondială despre Gloanțele Magice (2004, Nürnberg, Germania), Conferința Internațională de Medicină Moleculară și Biosecuritate (2005, Moscova), III Congres Internațional de la Moscova „Biotehnologie: Status și perspective de dezvoltare” (2005, Moscova), Conferința internațională de la Moscova „Biotehnologie și medicină” (2006, Moscova), a 19-a întâlnire a Asociației Europene pentru Cercetarea Cancerului (EACR), Budapesta, Ungaria, 1-4 iulie 2006, conferința „ Nouă platformă tehnologică pentru cercetarea biomedicală (biologie, asistență medicală, farmacie)” (2006, Rostov-on-Don), I Conferință internațională științifică și practică „Metode post-genomice de analiză în biologie, laborator și medicină clinică” (2010, Moscova) .

Structura și scopul disertației. Lucrarea este prezentată pe 256 de pagini de text dactilografiat și constă dintr-o introducere, trecere în revistă a literaturii, descrierea metodelor de cercetare, prezentarea și discutarea rezultatelor, concluzie, concluzii și o listă de referințe, care include 406 surse. Teza conține 94 de figuri și 14 tabele.

Teze similare la specialitatea „Biochimie”, 03.01.04 cod HAC

• Dezvoltarea de medicamente anti-cancer țintite pe baza vectorilor peptidici și a medicamentelor pentru chimioterapie 2004 dr. Al-Nazvani Nasser Salem

• Fragmente recombinante de alfa-fetoproteină umană pentru crearea de medicamente țintite 2012, Candidat la Științe Biologice Sharapova, Olga Andreevna

• Construcția de complexe proteină-acid nucleic pentru transportul țintit al ADN-ului străin în celule 2010, candidat la științe biologice Tatarinova, Olga Nikolaevna

• Sinteza și studiul formelor de transport ale medicamentelor anticancer bazate pe alfa-fetoproteine ​​și nanoparticule polimerice 2000, candidat la științe biologice Bobruskin, Alexey Igorevich

• Obținerea și studierea potențialului antitumoral al polipeptidelor antiangiogenice și al medicamentelor de chimioterapie țintite 2006, candidat la științe biologice Digtyar, Anton Vasilyevich

Concluzia disertației pe tema „Biochimie”, Posypanova, Galina Aronovna

1. A fost dezvoltat conceptul unui sistem pentru livrarea țintită a compușilor activi biologic la celulele tumorale, în care alfa-fetoproteina (AFP) și fragmentele sale sunt utilizate ca motiv țintit.

2. Prezența receptorilor AFP a fost stabilită atât pe suprafața celulelor liniilor tumorale umane, cât și pe celulele tumorilor maligne umane (ovar, sân, ficat, stomac, intestine). Pe secțiuni de tumori benigne și țesuturi normale, precum și pe suprafața limfocitelor voluntarilor sănătoși, receptorul AFP nu a fost găsit.

3. S-a demonstrat că nu numai AFP, ci și fragmentele sale recombinate C-terminale se leagă în mod specific la receptorul AFP și sunt endocitate de celulele tumorale.

4. S-a descoperit că fragmentul biologic activ al AFP, octapeptida GIP8, se leagă selectiv la un receptor necunoscut de pe suprafața celulelor tumorale, este internalizat cu eficiență ridicată și poate fi utilizat ca vector în sistemele de livrare țintite.

5. S-a stabilit că conjugatele de medicamente antitumorale cu AFP sunt acumulate selectiv de către celulele țintă, au un efect citostatic pronunțat asupra celulelor tumorale și sunt de toxicitate scăzută pentru celulele umane normale; eficacitatea conjugaţilor este determinată de labilitatea legăturii chimice dintre proteină şi agentul citotoxic.

6. Utilizarea sistemelor de livrare țintită bazate pe AFP face posibilă depășirea rezistenței la mai multe medicamente a celulelor tumorale datorită activității Pgpl70.

7. Eficiența transportului doxorubicinei în celulele tumorale în compoziția conjugatelor cu AFP depășește semnificativ eficiența transportului acesteia în compoziția conjugaților cu transferină și albumină serică.

8. Activitatea antitumorală ridicată a conjugatului AFP cu esperamicină Aib in vivo a fost demonstrată utilizând un model de tumoră de șoarece transplantat (cura -30%, creșterea speranței de viață - 163%).

9. Conjugatul fragmentului GIP8 AFP cu doxorubicină se acumulează selectiv în linii de celule tumorale sensibile și rezistente, are un efect citostatic pronunțat asupra celulelor tumorale și are toxicitate scăzută pentru leucocitele mononucleare umane.

Utilizarea vectorilor proteici bazați pe AFP și factorul de creștere epidermic pentru livrarea țintită a oligonucleotidelor antisens către celulele țintă s-a dovedit a fi promițătoare.

Concluzie.

Această lucrare este dedicată studiului regularităților în proiectarea sistemelor de administrare a medicamentelor țintite bazate pe vectori proteici. Studiul caracteristicilor translocării intracelulare a medicamentelor studiate, compararea lor cu activitatea biologică împotriva celulelor tumorale și normale in vitro ajută la prezicerea succesului unei anumite strategii și, astfel, la optimizarea procesului de creare a medicamentelor selective eficiente împotriva cancerului.

Utilizarea componentei vizate determină interacțiunea SAD cu celule și țesuturi strict definite, asigurând astfel selectivitatea acțiunii medicamentului. Mecanismul de endocitoză mediată de receptor promovează acumularea unui medicament a cărui țintă moleculară este localizată în interiorul celulei.

Comparația SAD, care sunt conjugați (proteina vectorială)-linker-(medicament), în care albumina serică, transferrina și alfa-fetoproteina au fost folosite ca proteină vector, a arătat avantajul acesteia din urmă atât în ​​ceea ce privește capacitatea de acumulare prin tumoră. celule şi în ceea ce priveşte activitatea citotoxică pentru aceste celule. Acești conjugați au folosit hidrazida acidului 3-maleimidobenzoic ca linker și doxorubicină ca medicament. Respectivul linker este acid labil și poate suferi hidroliză în compartimente celulare cum ar fi endozomi și lizozomi, eliberând astfel medicamentul din SAD. Doxorubicina, un antibiotic din grupa antraciclinelor, este un agent terapeutic eficient și utilizat pe scară largă. Există două mecanisme principale prin care medicamentul provoacă moartea celulelor: intercalarea în ADN, în urma căreia DOX este inserat între două nucleotide adiacente, oferind o interacțiune puternică cu ADN-ul și perturbând replicarea și transcripția; legarea și inhibarea topoizomerazei II. Datorită prezenței unui grup chinonic în structură, DOX este implicat în procesele redox, ceea ce duce la formarea de radicali liberi care induc deteriorarea ADN-ului și peroxidarea lipidelor. Eficacitatea terapiei DOX depinde de acumularea sa intracelulară.

Free DOX, datorită hidrofobicității sale, pătrunde rapid în celule și nuclee celulare. Rata de absorbție de către celulele DOX în compoziția conjugatului este determinată de numărul de receptori specifici de pe suprafața celulelor țintă și de intensitatea endocitozei mediate de receptor.

Ca proteine ​​vector (componente vizate), pe lângă AFP, am folosit binecunoscutele proteine ​​de transport HSA și Trf, care sunt endocitate activ de celulele tumorale și sunt utilizate cu grade diferite de succes pentru administrarea intratumorală a medicamentelor (vezi Revizuirea literaturii, secțiunea 1.5). Cu toate acestea, conjugatul AFP cu DOX a fost semnificativ superior conjugaților similari DOX cu HSA și Trf atât în ​​ceea ce privește eficiența acumulării în celulele tumorale, cât și activitatea citotoxică împotriva acestor celule.

Studiul exprimării receptorului AFP pe suprafața celulelor liniilor tumorale umane și a limfocitelor normale din sângele periferic, precum și pe secțiuni histologice ale țesuturilor canceroase, benigne și normale folosind anticorpi monoclonali la AFPR a relevat prezența predominantă a acestui receptor în celule tumorale maligne. Ulterior, rezultatele noastre au fost confirmate de cercetările lui R. Moro. Astfel, AFPR poate servi ca o țintă unică pe suprafața celulelor tumorale, iar sistemele de livrare bazate pe ligandul său natural, AFP, pot asigura livrarea selectivă a medicamentelor către aceste celule. Analiza legării și endocitozei AFP marcate fluorescent sugerează o eficiență și specificitate ridicate a acumulării de AFP în celulele tumorale care proliferează activ și absența acestei acumulări de proteine ​​în limfocitele neproliferante.

Un studiu in vitro al eficacității antitumorale a unui număr de conjugați pe bază de AFP, în care au fost diferite citostatice, antibiotice antitumorale, antimetaboliți, fotosensibilizanți (doxorubicină, daunomicină, calicheamicină, bleomicina, esperamicină, cisplatină, carboxifosfamidă, vininoxablastină, metofotalaxanteină) utilizate ca componente citotoxice, au demonstrat o activitate antitumorală selectivă ridicată. Conjugatul AFP cu esperamicină Aib a arătat o eficacitate semnificativă în experimentele model in vivo în tratamentul șoarecilor cu tumori experimentale, prevenind dezvoltarea tumorilor și crescând de mai multe ori durata de viață a animalelor. Trebuie remarcat faptul că acest antibiotic, care aparține enedinelor, este un compus extrem de toxic. Structura chimică a antibioticelor enediyne împărtășește un element comun, adesea denumit „focoș”, care este un inel enediyne cu 10 membri care conține două legături acetilenice în poziții a față de legătura dublă sau inelul oxiran. În condiții fiziologice și cu o anumită activare, un astfel de „focoș” suferă o rearanjare într-un diradical reactiv. Efectul citotoxic al esperamicinei se datorează inducerii rupurilor ADN-ului simplu și dublu catenar. Studiile clinice ale acestui medicament s-au încheiat cu eșec din cauza toxicității sale sistemice ridicate. Poate că singura modalitate de a folosi potențialul acestui antibiotic este de a crește selectivitatea acestuia prin atașarea chimică la moleculele vector, oferind livrare țintită către tumoră, ceea ce am făcut.

Trebuie remarcat faptul că selecția unui linker care leagă o proteină vector la un agent citotoxic este de o importanță deosebită în proiectarea CAD. Un citostatic poate fi livrat cu succes la celula țintă, dar dacă nu este scindat în timp util din vector, efectul biologic fie nu va fi realizat, fie va fi slab exprimat. O analiză a eficacității conjugaților AFP cu DOKS, în care au fost utilizați linkeri care diferă ca labilitate, a arătat că cei mai activi au fost conjugații, în sinteza cărora au fost utilizate glutaraldehida și hidrazida acidului 3-maleimidobenzoic. Activitatea citotoxică a conjugaților AFP cu DOX s-a corelat cu acumularea de DOX în nucleele celulare: cu cât se întâmpla mai repede, cu atât conjugatul era mai activ. Când a fost utilizat esterul N-hidroxisuccinimid al acidului 3-(2-ditiopiridil)propionic ca linker, localizarea în celulele DOX a fost predominant citoplasmatică, chiar și la o zi după aplicarea conjugatului. În același timp, acest conjugat a prezentat o activitate foarte scăzută (de 25 de ori mai mică decât DOX liber). Aparent, o legătură disulfurică puternică previne scindarea rapidă a DOX în endozomi. În celule, enzimele capabile să restabilească legătura disulfură (tiol-protein disulfur reductază, tiol-protein disulfur reductază, tioredoxină, glutaredoxină, tiol reductază lizozomală lizozomală inductibilă cu interferon gamma - GILT) sunt localizate în cavitatea microzomului, în structurile Golgi. complex; tioredoxina și glutaredoxina catalizează reducerea legăturilor disulfurice din nucleu și citoplasmă; GILT - în endozomi tardivi/lizozomi (pH optim 4-5). Restaurarea legăturilor disulfurice din proteine ​​are loc în endozomii/lizozomii tardivi după proteoliza limitată de către catepsine. Restabilirea legăturii disulfură prin acțiunea tiol-proteină disulfura reductazei încetinește semnificativ odată cu scăderea pH-ului. Eliberarea de DOX din conjugații în care antibioticul este atașat de proteină printr-o legătură disulfurică pare să fie destul de lentă, ceea ce explică activitatea citotoxică scăzută a acestor conjugate. Al doilea factor care ar putea afecta eficacitatea conjugatului discutat este modificarea grupării amino a reziduului de zahăr al DOX la introducerea unei grupări tiol folosind SPDP. Deși o serie de studii au demonstrat producerea de conjugați activi DOX-anticorp folosind această strategie de sinteză, alte studii au arătat că modificarea amino-zahărului a DOX reduce activitatea citotoxică a acestui antibiotic și duce la o pierdere a activității citotoxice a antraciclinei în conjuga.

Cu toate acestea, utilizarea SPDP în sinteza conjugaților AFP-EsA s-a dovedit a fi foarte eficientă. Într-adevăr, citotoxicitatea conjugatului când a fost testat in vitro a fost în cea mai mare parte mai mică decât cea a EsA liberă. Cu toate acestea, ca urmare a creșterii selectivității acțiunii EsA în compoziția conjugatului, a fost posibil să se obțină un succes semnificativ în testarea conjugatului in vivo.

Rezultatele obținute fac posibilă prezicerea nivelului de eficacitate al medicamentelor vizate pe baza moleculelor de vector proteic. Eficacitatea unor astfel de medicamente depinde nu numai de proteina vector, ci, în mare măsură, de tipul de legătură chimică dintre proteină și antibioticul antitumoral. Această relație nu ar trebui să fie prea puternică, deoarece aceasta pierde avantajele livrării țintite: în ciuda concentrației intracelulare mari a antibioticului, acesta din urmă poate să nu aibă un efect farmacologic dacă nu își atinge ținta. Dar conexiunea nu ar trebui să fie prea labilă, deoarece medicamentul trebuie să-și mențină integritatea înainte de a interacționa cu celulele țintă. În același timp, atunci când se creează un construct țintit, trebuie să se țină cont de faptul că clivajul medicamentului (antibiotic, citostatic etc.) din molecula de proteină va avea loc cel mai probabil în endozomi la valori ale pH-ului de 5,5-6. , adică linkerul care leagă molecula AFP de medicament în mod ideal trebuie să fie hidrolizat la valorile pH-ului indicate sau să fie un substrat al enzimelor endozomale.

Cea mai importantă proprietate a conjugatelor pe bază de AFP sintetizate a fost capacitatea lor de a inversa rezistența la mai multe medicamente datorită activității transportatorilor ABC.

Rezultatele obținute ne permit să concluzionam că AFP poate fi utilizat în mod eficient ca agent țintit pentru livrarea medicamentelor antitumorale la celulele tumorale de diferite origini.

Poate singurul dezavantaj semnificativ al AFP umană naturală este sursa izolării sale: în cantități preparative, AFP poate fi izolată numai din materialul abortiv. În sângele din cordonul ombilical, biomaterialul pe care l-am folosit, conținutul de AFP este mult mai scăzut și, de fapt, aceasta nu este nici cea mai bună sursă biologică. Prin urmare, ne-am stabilit sarcina de a obține un vector proteic recombinant - un fragment AFP care conține un situs de legare la receptor identic cu cel din molecula naturală. Fragmentul C-terminal recombinant rezultat al AFP (gAFP27) s-a legat în mod specific la receptorul AFP de pe celulele tumorale și a fost endocitozat de acestea în mod similar cu AFP umană de lungime completă. hAFP27 a păstrat, de asemenea, alte proprietăți biologice ale proteinei de lungime completă. Utilizarea rAFP27 ca vector în SAD deschide posibilitatea utilizării practice a potențialului proteinei ca ligand pentru AFPR.

Celulele transformate sunt caracterizate prin modificări ale genelor asociate cu reglarea proliferării celulare și apoptozei. Printre numeroasele studii dedicate dezvoltării de noi agenți selectivi pentru celulele tumorale, un loc special revine oligonucleotidelor antisens. ASONs fac parte dintr-o clasă de agenți noi capabili să inhibe sinteza proteinelor specifice asociate tumorii prin legarea de ARNm care codifică aceste proteine, blocând astfel sinteza proteinelor. Multe ASON modificate (în special tiofosfat) in vitro au arătat o scădere convingătoare a expresiei genei țintă și se aștepta să aibă succes împotriva unei game largi de tumori. Un obstacol care reduce selectivitatea acțiunii ASON este lipsa actuală a SAD adecvată și eficientă a acestor compuși în celulele țintă, ceea ce este necesar pentru realizarea potențialului terapeutic al ASON.

Celulele transformate sunt caracterizate prin modificări ale genelor asociate cu reglarea proliferării celulare și apoptozei. Printre numeroasele studii dedicate dezvoltării de noi agenți selectivi pentru celulele tumorale, un loc special revine oligonucleotidelor antisens. Oligonucleotidele antisens sunt o astfel de clasă de agenți noi capabili să inhibe sinteza proteinelor specifice asociate tumorii prin legarea la ARNm care codifică aceste proteine, blocând astfel sinteza proteinelor. În ultimele decenii, mai multe antisensuri au fost dezvoltate și testate în studii preclinice și clinice. Multe dintre ele au arătat o scădere convingătoare a expresiei genei țintă în sistemele in vitro și s-a așteptat să aibă succes într-o gamă largă de tumori. Cu toate acestea, din cauza eterogenității genetice a tumorilor, utilizarea antisensului ca singur medicament nu pare a fi eficientă în tratarea bolilor. Terapiile anti-sens care vizează căile de semnalizare implicate în proliferarea celulară și apoptoza sunt deosebit de promițătoare atunci când sunt combinate cu tratamente anticancer convenționale.

Livrarea tiofosfatului A8(G) către celulele tumorale sub formă de conjugate cu AFP s-a dovedit a fi extrem de eficientă, deoarece a făcut posibilă depășirea barierei membranei citoplasmatice, care limitează pătrunderea ABOI în celule.Această eficiență s-a manifestat. fie sub forma unui efect citostatic direct, fie sub forma sensibilizării celulelor țintă la acțiunea altor medicamente anticancerigene.S-a constatat că toxicitatea nespecifică a unor secvențe (G) nu a constituit un obstacol în calea utilizării acestor (G) , deoarece utilizarea unei molecule vectoriale în SAD a limitat toxicitatea acestora la celulele tumorale.Cu toate acestea, sinteza conjugatelor s-a dovedit a fi un proces foarte laborios, însoțit de aceeași pierdere semnificativă de proteine ​​și ABOB.Construcții alternative, care sunt complexele necovalente de proteine ​​cu ABOM, pot fi mai avansate tehnologic.OB, în special analogii lor tiofosfat, au o sarcină negativă mare și sunt capabili să formeze complexe puternice cu molecule policationice. Pentru a crește eficiența formării unor astfel de complexe, în moleculele proteinelor recombinante (hAFP27 și EuR) a fost introdusă o secvență încărcată pozitiv, ceea ce asigură interacțiunea puternică a acestora cu LBM. Construcțiile rezultate s-au dovedit a fi SBP de succes, care nu numai că măresc foarte mult eficiența acumulării ABOB în celulele caracterizate printr-un conținut crescut de receptori pentru proteinele de mai sus, dar și protejează GO-urile fosfodiester naturale de degradare. Cu toate acestea, utilizarea unui mitogen, care este EOP, ca componentă vizată a SAD, limitează gama de ABO aplicate, împiedicând în unele cazuri realizarea unui efect biologic. Este posibil ca modificarea regiunii de legare a receptorului a moleculei EuR să poată ajuta la rezolvarea acestei probleme, în urma căreia capacitatea receptorului de a fi activat (capacitatea de autofosforilare) se va pierde, dar nu afectează. capacitatea receptorului de a fi internalizat după legarea de ligandul său.

Rezultatele studiilor experimentale prezentate în această lucrare indică eficiența și selectivitatea ridicată a sistemelor de livrare țintite bazate pe alfa-fetoproteina, fragmentele acesteia și factorul de creștere epidermic modificat.

Progresul în studiul mecanismelor moleculare ale patogenezei bolii și apariția unor noi metode în domeniul biologiei moleculare și al biotehnologiei deschid oportunități pentru dezvoltarea de noi medicamente care afectează selectiv diferite căi de semnalizare caracteristice celulelor tumorale și, astfel, posibilitatea de tratament individual țintit bazat pe un complex unic de ținte moleculare produse de tumora pacientului. Medicamentele pot atinge ținta pe cont propriu (de exemplu, anticorpi terapeutici) sau ca parte a sistemelor de eliberare care vizează anumite organe afectate de tumoră sau direct la suprafață sau în celulele canceroase. Înțelegerea biologiei celulare a tumorii, studierea micromediului celulelor tumorale va permite dezvoltarea de opțiuni eficiente pentru medicamentele vizate.

Lista de referințe pentru cercetarea disertației Doctor în Științe Biologice Posypanova, Galina Aronovna, 2013

1 Jain R.K. Livrarea medicinei moleculare și celulare la tumorile solide. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. Nr. 1-3. P. 149-168.

2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Livrarea și transportul medicamentelor către tumori solide. // Pharm Res. 2003. V. 20. Nr. 9. P. 1337-1350.

3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. Prezentare generală a dezvoltării clinice a rituximabului: primul anticorp monoclonal aprobat pentru tratamentul limfomului. // Semin Oncol. 1999. V. 26. Nr 5 Suppl 14. P. 66-73.

4. Huhn D., von Schilling C „ Wilhelm M „ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W „ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab terapia pacienţilor cu leucemie limfocitară cronică cu celule B. // Sânge. 2001. V. 98. Nr. 5. P. 1326-1331.

5. Gribben J.G., Hallek M. Redescoperirea alemtuzumabului: rolurile terapeutice actuale și emergente. //Br J Haematol. 2009. V. 144. Nr. 6. p. 818-831.

6. Ravandi F., O „Brien S. Alemtuzumab in CLL and other limfoid neoplasms. // Cancer Invest. 2006. V. 24. No. 7. P. 718-725.

7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-IH) în tratamentul leucemiei limfocitare cronice. // Oncogene. 2007. V. 26. Nr. 25. p. 3644-3653.

8. Baselga J. O revizuire a terapiei țintite EGFR. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. Nr. 4. P. 218-219.

9. Fischgrabe J., Wulfing P. Terapii țintite în cancerul de sân: medicamente stabilite și evoluții recente. // Curr Clinic Pharmacol. 2008. V. 3. Nr. 2. P. 85-98.

10. Goldenberg M.M. Trastuzumab, un anticorp monoclonal umanizat derivat din ADN recombinant, un agent nou pentru tratamentul cancerului de sân metastatic. // Clin Ther. 1999. V. 21. Nr. 2. P. 309-318.

11. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Cancerul de sân uman: corelarea recidivei și supraviețuirii cu amplificarea oncogenei HER-2/neu. // Știință. 1987. V. 235. Nr. 4785. P. 177-182.

12. Azim H., Azim H.A., Jr. Vizarea lui Her-2/neu în cancerul de sân: la fel de ușor ca asta! // Oncologie. 2008. V. 74. Nr. 3-4. P. 150-157.

13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado B., Gascon P. Mecanism of action of anti-HER2 monoclonal anticorps: science update on trastuzumab and 2C4. // Adv Exp Med Biol. 2003. V. 532. P. 253-268.

14. Stern M., Herrmann R. Privire de ansamblu asupra anticorpilor monoclonali în terapia cancerului: prezent și promisiune. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. Nr. 1. P. 11-29.

15. Gutheil J. Promisiunea anticorpilor monoclonali pentru terapia cancerului. // Crit Rev Oncol Hematol. 2001. V. 38. Nr. 1. P. 1-2.

16. Moiseenko B.M. Anticorpi monoclonali în tratamentul tumorilor maligne. // Oncologie practică. 2003. V. 4. Nr. 3. R. 148-156.

17. Guillemard V., Uri Saragovi H. Chimioterapicele promedicamentului ocolesc rezistența p-glicoproteinei și ucid tumorile in vivo cu eficacitate ridicată și selectivitate dependentă de țintă. // Oncogene. 2004. V. 23. Nr. 20. p. 3613-3621.

18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Technology Insight: imunoconjugate de medicamente citotoxice pentru terapia cancerului. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. Nr. 4. P. 245-255.

19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) pentru limfoamele CD30-Pozitive recidivante. // New England Journal of Medicine. V. 363. Nr. 19. P. 1812-1821.

20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. Studiul de fază I al Trastuzumab

21. DM1, un conjugat anticorp HER2-medicament, administrat la fiecare 3 săptămâni pacienților cu cancer de sân metastatic HER2-pozitiv. // Jurnalul de Oncologie Clinică. V. 28. Nr. 16. p. 2698-2704.

22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: un imunoconjugat anti-CD33 pentru tratamentul leucemiei mieloide acute. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. Nr. 4. p. 527-540.

23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O "Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. Rolul gemtuzumab ozogamicin în terapia leucemiei acute. // Br J Haematol. 2006. V. 132. Nr. 4. P. 398-409.

24. Gao Z., McAlister V.C., Williams G.M. Repopularea endoteliului hepatic de către celulele derivate din măduva osoasă. // Lancet. 2001. V. 357. Nr 9260. p. 932-933.

25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Calicheamicin gamma II: un antibiotic antitumoral care scindează în mod specific situsul ADN dublu catenar. // Știință. 1988. V. 240. Nr. 4856. P. 1198-1201.

26. Reiter Y. Imunotoxine recombinate în terapia cu celule canceroase țintite. // Adv Cancer Res. 2001. V. 81. P. 93-124.

27. Goyal A., Batra J.K. Includerea unui distanțier sensibil la furină crește citotoxicitatea restrictocinei ribotoxinei care conține imunotoxine recombinate cu un singur lanț. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.

28. Kreitman R.J. Imunotoxine recombinante care conțin toxine bacteriene trunchiate pentru tratamentul afecțiunilor maligne hematologice. // Biomedicamente. 2009. V. 23. Nr. 1. P. 1-13.

29. Jain R.K., Baxter L.T. Mecanisme de distribuție heterogenă a anticorpilor monoclonali și a altor macromolecule în tumori: semnificația presiunii interstițiale crescute. // Cancer Res. 1988. V. 48. Nr 24 Pt 1. P. 7022-7032.

30. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Terapia cu anticorpi monoclonali pentru tumorile solide. // Cancer Treat Rev. 2000. V. 26. Nr. 4. p. 269-286.

31. Brada M. Gena BCL2: relevanță actuală pentru oncologia clinică. // Eur J Cancer. 1992. V. 28. Nr. 1. P. 270-272.

32. Yip K.W., Reed J.C. Proteinele familiei Bcl-2 și cancerul. // Oncogene. 2008. V. 27. Nr. 50. p. 6398-6406.

33 Reed J.C. Proteinele familiei Bcl-2: strategii pentru depășirea chimiorezistenței în cancer. //Adv Pharmacol. 1997. V. 41. P. 501-532.

34 Reed J.C. Proteinele familiei Bel-2: regulatori ai chimiorezistenței în cancer. // Toxicol Lett. 1995. V. 82-83. P. 155-158.

35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen în tratamentul melanomului metastatic. // Viitorul Oncol. 2007. V. 3. Nr. 3. P. 263-271.

36. Oblimersen: Augmerosen, oligonucleotidă antisens BCL-2 Genta, G 3139, GC 3139, oblimersen sodiu. // Droguri R D. 2007. V. 8. Nr. 5. P. 321-334.

37. Manoharan M. Oligonucleotide conjugate ca potențiale medicamente antisens cu absorbție îmbunătățită, biodistribuție, livrare țintită și mecanism de acțiune. /"/ Antisens Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. Nr. 2. P. 103-128.

38. Abels C. Direcționarea sistemului vascular al tumorilor solide prin terapie fotodinamică (PDT). // Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. Nr. 8. p. 765-771.

39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. Direct tumor damage mechanisms of photodynamic therapy. // Acta Biochim Pol. 2005. V. 52. Nr. 2. P. 339-352.

40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Terapia fotodinamică (PDT): o scurtă revizuire a mecanismelor celulare și a aplicațiilor de cercetare a cancerului pentru PDT. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. Nr. 1. P. 1-8.

41. Aveline B.M., Redmond R.W. Mecanisme exclusive ale radicalilor liberi de fotosensibilizare celulară. // Fotochimie și Fotobiologie. 1998. V. 68. Nr. 3. P. 266-275.

42. Henderson B.W., Dougherty T.J. Cum funcționează terapia fotodinamică? // Photochem Photobiol. 1992. V. 55. Nr. 1. P. 145-157.

43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Reacție adversă caracterizată prin durere în piept, dificultăți de respirație și sincopă asociată cu verteporfină (visudyne). // Am J Ophthalmol. 2002. V. 134. Nr. 2. P. 281-282.

44. Cheng Y., A C.S., Meyers J.D., Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Livrarea de droguri foarte eficientă cu vectori de nanoparticule de aur pentru terapia fotodinamică in vivo a cancerului. // J Am Chem Soc. 2008. V. 130. Nr. 32. p. 10643-10647.

45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Terapie fotodinamică țintită prin sisteme de livrare mediate de receptor. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. Nr. 1. P. 53-76.

46. ​​Oleinick N.L., Evans H.H. Fotobiologia terapiei fotodinamice: ținte și mecanisme celulare. // Radiat Res. 1998. V. 150. Nr 5 Suppl. P. S146-156.

47. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Livrarea intracelulară direcționată a fotosensibilizatorilor pentru a îmbunătăți eficiența fotodinamică. // Immunol Cell Biol. 2000. V. 78. Nr. 4. p. 452-464.

48. Rozanova Torshina N., Zhang J.Z., Heck D.E. Terapia catalitică a cancerului cu porfirine și ascorbat. // Cancer Lett. 2007. V. 252. Nr. 2. P. 216-224.

49. Khorosheva E.V., Gerasimova G.K., Kaliya O.J1. Studiul mecanismului de transport teraftal în celulele tumorale

50. Russian Biotherapeutic Journal 2007. V. 6. Nr. 1. R. 8.

51. Kulbachevskaya N.Yu., Manzyuk L.V., Mikhailova JI.M. Studiu clinic și experimental al toxicității sistemului catalitic antitumoral „teraftal + acid ascorbic” („TF + AA”). // Jurnal bioterapeutic rus. 2004. V. 3. Nr. 2. R. 70.

52. Ravi Kumar M.N. Nano și microparticule ca dispozitive de administrare controlată a medicamentelor. // J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. Nr. 2. P. 234-258.

53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanoparticule și sisteme țintite pentru terapia cancerului. // Adv Drug Deliv Rev. 2012.V.P.

54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Tehnologia legată de nanoparticule cu albumină (nab) este o metodă promițătoare pentru livrarea medicamentelor anti-cancer. // Recent Pat Anticancer Drim Dkrnv 9PP9 V P

55. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Targeting of albumin-embedded paclitaxel nanoparticules to tumors. //Nanomedicina. 2009. V, 5. Nr. 1. P. 73-82.

56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paclitaxel pentru cancerul de sân: o nouă formulare cu un profil de siguranță îmbunătățit și o eficacitate mai mare. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. Nr. 7. p. 919-943.

57. Moreno-Aspitia A., Perez E.A. Paclitaxel legat de nanoparticule albumină (ABI-007): o alternativă mai nouă a taxanului în cancerul de sân. // Viitorul Oncol. 2005. V. 1. Nr. 6. p. 755-762.

58. Bareford L.M., Swaan P.W. Mecanisme endocitare pentru livrarea țintită a medicamentelor. // Evaluări avansate privind livrarea medicamentelor. 2007. V. 59. Nr. 8. p. 748-758.

59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // Biochem J. 2004. V. 377. Nr. Pt l.P. 1-16.

60. Rodemer C, Haucke V. Endocitoza dependentă de Clathrin/AP-2: un nou loc de joacă pentru setul de instrumente farmacologice? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. Nr. 186. P. 105-122.

61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // Jurnalul Biochimic. 2004. V. 377. Nr Pt 1. P. 1-16.

62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Factori accesorii în endocitoza veziculelor sinaptice dependente de clatrină. //Nat Rev Neurosci. 2000. V. 1. Nr. 3. P. 161-172.

63. Marsh M., McMahon H.T. Era structurală a endocitozei. // Știință. 1999. V. 285. Nr. 5425. P. 215-220.

64. Bareford L.M., Swaan P.W. Mecanisme endocitare pentru livrarea țintită a medicamentelor. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. Nr. 8. p. 748-758.

65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. Dynamin se auto-asambla în inele sugerând un mecanism pentru înmugurirea veziculelor acoperite. // Natură. 1995. V. 374. Nr. 6518. P. 190-192.

66. Ferguson S. M., De Camilli P. Dynamin, o GTPază de remodelare a membranei. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. Nr. 2. P. 75-88.

67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Transport vezicular dependent de dineină citoplasmatică de la endozomii timpurii la întârzii. // Jurnalul de biologie celulară. 1993. V. 123. Nr. 6 Pt 1. P. 1373-1387.

68. Stahl P.D., Barbieri M.A. Corpuri multiveziculare și endozomi multiveziculari: „intrările și ieșirile” traficului endozomal. // Science "s STKE: signal transduction knowledge environment. 2002. V. 2002. Nr. 141. P. pe32.

69. Piper R.C., Luzio J.P. Endozomi tardivi: sortare și împărțire în corpuri multiveziculare. // Trafic. 2001. V. 2. Nr. 9. p. 612-621.

70. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Proteoliza endolizozomală și reglarea acesteia. // Jurnalul Biochimic. 2002. V. 363. Nr Pt 3. P. 417-429.

71. Eskelinen E.-L. Rolurile LAMP-1 și LAMP-2 în biogeneza lizozomului și autofagie. // Aspecte moleculare ale medicinei. 2006. V. 27. Nr. 5-6. p. 495-502.

72. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Caveoline, domenii ordonate în lichid și transducția semnalului. // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. Nr. 11. p. 7289-7304.

73. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. ​​Căile de absorbție și traficul intracelular ulterior în livrarea genelor nevirale. // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. Nr. 1. P. 32-45.

74. Lajoie P., Nabi I.R. Capitolul 3 Plutele lipidice, caveolele și endocitoza lor. În: Kwang WJ, editor. Revista internațională de biologie celulară și moleculară: Academic Press; 2010.p. 135163.

75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Endocitoza independentă de Clathrin și caveolin-1: intrarea virusului simian 40 în celulele lipsite de caveole. // J Cell Biol. 2005. V. 168. Nr. 3. p. 477-488.

76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. Livrarea intracelulară direcționată a terapiei: o prezentare generală. // Die Pharmazie. 2007. V. 62. Nr. 9. p. 643-658.

77. Fenton C., Perry C.M. Gemtuzumab ozogamicin: o revizuire a utilizării sale în leucemia mieloidă acută. //Droguri. 2005. V. 65. Nr. 16. p. 2405-2427.

78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Noi anticorpi monoclonali CD20 pentru terapia limfomului. // Jurnal de hematologie și oncologie. 2012. V. 5. Nr. 1. p. 64.

79. Chari R.V.J. Terapia țintită a cancerului: conferirea specificității medicamentelor citotoxice. // Conturi de cercetare chimică. 2007. V. 41. Nr. 1. P. 98-107.

80. Casi G., Neri D. Conjugate anticorp-medicament: concepte de bază, exemple și perspective de viitor. // Jurnalul de eliberare controlată: jurnalul oficial al Societății de eliberare controlată. 2012. V. 161. Nr. 2. P. 422-428.

81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren T., Venkatachalam T., Waddick K.G., Rostostev A., Myers D.E. Activitatea citotoxică a factorului de creștere epidermic-genisteină împotriva celulelor canceroase de sân. // Clin Cancer Res. 1998. V. 4. Nr. 4. p. 901-912.

82. Rihova B. Direcționarea medicamentelor către receptorii de suprafață celulară. // Recenzii critice în biotehnologie. 1997. V. 17. Nr. 2. P. 149-169.

83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Recent advances in tumor-targeting anticancer drug conjugates. // Chimie bioorganică și medicinală. 2005. V. 13. .№17. p. 50435054.

84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Livrarea intracelulară pe bază de prodrog a agenților anticancer. // Evaluări avansate privind livrarea medicamentelor. 2011. V. 63. Nr. 1-2. P. 3-23.

85. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J. Tendințele recente în designul de promedicament și conjugat țintit împotriva cancerului. // Chimie medicinală actuală. 2008. V. 15. Nr. 18. P. 1802-1826.

86. Sanderson R.J., Hering M A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. Stabilitatea linkerului medicamentului in vivo a unui imunoconjugat de auristatin legat de dipeptidă anti-CD30. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. Nr 2 Pt 1. P. 843-852.

87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Nonlinear pharmacokinetics of therapeutic proteins resulting of receptor mediated endocytosis. // J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2009. V. 36. Nr. 3. P. 239-260.

88. Malyankar U.M. Antigeni și biomarkeri asociați tumorilor în cancer și imunoterapia. // Int Rev Immunol. 2007. V. 26. Nr. 3-4. P. 223-247.

89. Tyuryaeva I.I. antigene tumorale. // Citologie. 2008. V. 50. Nr. 3. R. 189-209.

90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon T., van der Bruggen P. O peptidă MAGE-A4 prezentată de HLA-A2 este recunoscută de limfocitele T citolitice. // Eur J Immunol. 1999. V. 29. Nr. 10. P. 3329-3337.

91. Houghton A.N. Antigeni de cancer: recunoașterea imună a sinelui și a sinelui modificat. // J Exp Med. 1994. V. 180. Nr. 1. P. 1-4.

92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Gangliozide ale melanocitelor umane normale și neoplazice. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 120. Nr. 2. p. 500-504.

93. Tang C.K., Katsara M., Apostolopoulos V. Strategii utilizate pentru imunoterapie MUC1: studii clinice umane. // Expert Rev Vaccins. 2008. V. 7. Nr. 7. p. 963-975.

94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Rolul familiei de receptori HER în dezvoltare și diferențiere. //J Cell Physiol. 2004. V. 200. Nr. 3. P. 343-350.

95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. Rețeaua de semnalizare ErbB: heterodimerizarea receptorului în dezvoltare și cancer. // EMBO J. 2000. V. 19. Nr. 13. p. 3159-3167.

96. Baryshnikov A.Yu. Relația dintre tumoră și sistemul imunitar al organismului. // Oncologie practică. 2003. V. 4. Nr. 3. R. 127-130.

97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Antigenul carcinoembrionar ca țintă a vaccinului. // Expert Rev Vaccins. 2008. V. 7. Nr. 7. p. 987-993.

98. Singer J. W., De Vries P., Bhatt R, Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis R. A., Wallace S. Conjugation of camptothecins to poly-(L-glutamic acid). // Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 922. P. 136-150.

99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Cytofluorescence detection of adriamycin-mitochondria interactions in isolated, perfused rat heart. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. Nr. 1. P. 35-41.

100. Evdokimova V.N., Butterfield L.H. Alfa-fetoproteina și alți antigeni asociati tumorilor pentru imunoterapia cancerului hepatocelular. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. Nr. 3. str. 325336.

101. Abelev G.I., Eraiser T.L. Aspecte celulare ale reexprimării alfa-fetoproteinei în tumori. // Semin Cancer Biol. 1999. V. 9. Nr. 2. P. 95-107.

102. Mizejewski G.J. Structura și funcția alfa-fetoproteinei: relevanță pentru izoforme, epitopi și variante conformaționale. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. Nr. 5. P. 377-408.

103. Castelli C., Rivoltini L., Andreola G., Carrabba M., Renkvist N., Parmiani G. T-cell recognition of melanom-associated antigens. // J Cell Physiol. 2000. V. 182. Nr. 3. P. 323-331.

104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. O nouă familie de gene care codifică un antigen recunoscut de limfocitele T citolitice autologe pe un melanom uman. // J Exp Med. 1995. V. 182. Nr. 3. p. 689-698.

105. Lewis J. J., Houghton A.N. Definiția antigenelor tumorale potrivite pentru construcția vaccinului. // Semin Cancer Biol. 1995. V. 6. Nr. 6. P. 321-327.

106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Drug targeting in cancer treatment: active daunorubicin-protein conjugates. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pct. A. P. 291-298.

107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: o review. // J Control Release. 2000. V. 65. Nr. 1-2. P. 271-284.

108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Acumularea tumorală în fază incipientă a macromoleculelor: o diferență mare în rata de clearance între tumoră și țesuturile normale. // Jpn J Cancer Res. 1998. V. 89. Nr. 3. P. 307-314.

109. Kratz F., Beyer U. Proteinele serului ca purtători de medicamente ai agenților anticancer: o revizuire. // Livrare medicamente 1998. V. 5. Nr. 4. p. 281-299.

110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Preparation, characterization and in vitro efficacy of albumin conjugates of doxorubicin. // Biol Pharm Bull. 1998. V. 21. Nr. 1. P. 56-61.

111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Albumin conjugates of the anticancer drug chlorambucil: synthesis, characterization, and in vitro eficacy. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. V. 331. Nr. 2. P. 47-53.

112. Asociația pentru Oncologie Medicală a Societății Germane de Cancer. // Clin Cancer Res. 1999. V. 5. Nr. 4. p. 753-759.

113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. Sinteza, profilul de clivaj și eficacitatea antitumorală a unui promedicament de metotrexat de legare la albumină care este scindat de plasmină și catepsină B. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. V. 340. Nr. 8. P. 389-395.

114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Dezvoltarea și eficacitatea in vitro a noilor conjugați de albumină cu doxorubicină specifică MMP2 și MMP9. // Bioorg Med Chem Lett. 2001. V. 11. Nr. 15. p. 2001-2006.

115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Conjugați medicament-polimer care conțin legături scindabile de acid. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. V. 16. Nr. 3. P. 245-288.

116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung D.E., Gitzel M. Prodrugs of anthracyclines in cancer chemotherapy. // Curr Med Chem. 2006. V. 13. Nr. 5. p. 477-523.

117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. Studiul de fază I și farmacocinetică al derivatului (6-maleimidocaproil)hidrazonă al doxorubicinei. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. Nr. 16. p. 4858-4866.

118. Kratz F., Mansour A., ​​​​Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Dezvoltarea de promedicamente doxorubicină care se leagă de albumină care sunt scindate de antigenul specific prostatei. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. V. 338. Nr. 10. p. 462-472.

119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. Studiu in vitro și in vivo al unui promedicament de doxorubicină de legare la albumină care este scindat de catepsina B. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. V. 64. Nr. 2. P. 413-418.

120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Dezvoltarea de linkeri bifuncționali de legare a proteinei pentru o nouă generație de promedicamente cu acțiune dublă. // Bioconjug Chem. 2009. V. 20. Nr. 2. P. 390-396.

121. Abu Ajaj K., Kratz F. Dezvoltarea de promedicamente cu dublă acțiune pentru eludarea rezistenței la mai multe medicamente. // Bioorg Med Chem Lett. 2009. V. 19. Nr. 3. p. 995-1000.

122. Dautry-Varsat A. Endocitoza mediată de receptor: călătoria intracelulară a transferinei și a receptorului său. // Biochimie. 1986. V. 68. Nr. 3. P. 375-381.

123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez J.A., Helguera G., Penichet M.L. Receptorul transferinei partea I: Biologie și țintire cu anticorpi citotoxici pentru tratamentul cancerului. // Clin Immunol. 2006. V. 121. Nr. 2. P. 144-158.

124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: structură, funcție și potențiale acțiuni terapeutice. // Drug Discov Today. 2005. V. 10. Nr. 4. P. 267-273.

125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Transferrina a direcționat livrarea adriamicinei către celulele umane. // Anticancer Res. 1998. V. 18. Nr 3A. P. 1423-1427.

126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. Conjugații de adriamicină ale transferinei umane leagă receptorii transferinei și ucid celulele K562 și HL60. // Arch Biochem Biophys. 1993. V. 300. Nr. 1. P. 356-363.

127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. Inhibarea transportului de electroni ai membranei transplasmatice de către conjugații transferină-adriamicină. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1105. Nr. 1. P. 84-88.

128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Influența conjugării doxorubicinei la transferină asupra captării fierului de către celulele K562 prin endocitoză mediată de receptor. // Eur J Biochem. 1993. V. 213. Nr. 1. P. 427-436.

129 Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Mecanismul de acțiune și spectrul liniilor celulare sensibile la un conjugat doxorubicină-transferină. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. V. 41. Nr. 2. str. 155160.

130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. Partea II a receptorului de transferină: livrarea direcționată a agenților terapeutici în celulele canceroase. // Clin Immunol. 2006. V. 121. Nr. 2. P. 159-176.

131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. Citotoxicități in vitro și distribuție in vivo a complexului transferină-platină (II). // J Pharm Sci. 1995. V. 84. Nr. 2. P. 216-221.

132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. Evaluarea preliminară a transferinei de platină (MPTC-63) ca un potențial tratament netoxic pentru cancerul de sân. // Detectarea cancerului Prev. 1988. V. 12. Nr. 1-6. p. 469-480.

133. Head J.F., Wang F., Elliott R.L. Medicamentele antineoplazice care interferează cu metabolismul fierului în celulele canceroase. //Adv Enzyme Regul. 1997. V. 37. P. 147-169.

134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Sinteza și eficacitatea in vitro a conjugaților de transferină ale medicamentului anticancer clorambucil. // J Med Chem. 1998. V. 41. Nr. 15. p. 2701-2708.

135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Direcționarea tumorii bazată pe efectul îmbunătățirii permeabilității și retenției (EPR) și a mecanismului de endocitoză mediată de receptor (RME). // Int J Pharm. 2004. V. 277. Nr. 1-2. P. 39-61.

136. Frankel A.E. Rafinament crescut al imunotoxinelor. // Clin Cancer Res. 2002. V. 8. Nr. 4. p. 942-944.

137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Terapia cu imunotoxine a tumorilor maligne hematologice. // Semin Oncol. 2003. V. 30. Nr. 4. p. 545-557.

138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. Eficacitatea imunotoxinelor vizate de receptorii transferinei în liniile celulare tumorale cerebrale și tumorile cerebrale pediatrice. // Cancer Res. 1993. V. 53. Nr. 6. P. 1348-1353.

139. Weaver M., Laske D.W. Conjugat de toxină vizată de ligand al receptorului transferrinei (Tf-CRM107) pentru terapia glioamelor maligne. // J Neuroncol. 2003. V. 65. Nr. 1. P. 3-13.

140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. Reglarea în jos a c-FLIP sensibilizează celulele cancerului de prostată DU145 la apoptoza mediată de Fas. // Cancer Biol Ther. 2002. V. 1. Nr. 4. P. 401-406.

141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. Factorul de creștere epidermal mediată de țintire a clorului e6 potențează selectiv activitatea fotodinamică. // Cancer Res. 2000. V. 60. Nr. 8. P. 2197-2202.

142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. Conjugații EGF-ricină A: profiluri cinetice ale efectelor citotoxice și variante de celule rezistente. // Funct. 1984. V. 9. Nr. 3. P. 203-212.

143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. Cerințele fizico-chimice pentru absorbția celulară a peptidei pAntp. Rolul afinității de legare a lipidelor. // Eur J Biochem. 2001. V. 268. Nr. 5. P. 1304-1314.

144. Vives E., Richard J.P., Rispal C., Lebleu B. TAT peptide internalization: seeking the mechanism of entry. // Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. Nr. 2. P. 125-132.

145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Conjugate noi de peptidă purtător de daunorubicină derivate din segmente de calcitonină umană. // J Mol Recognit. 2003. V. 16. Nr. 5. P. 280-287.

146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. Inhibarea telomerilor și perturbarea telomerilor ca procese pentru țintirea medicamentelor. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. V. 43. P. 359-379.

147. Chomczynski P., Sacchi N. Metodă într-o singură etapă de izolare a ARN-ului prin extracție cu tiocianat de guanidiniu acid-fenol-cloroform. // Biochimie analitică. 1987. V. 162. Nr. 1. str. 156159.

148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Celulele de adenocarcinom sunt vizate de noua toxină himerică GnRH-PE66 prin situsuri specifice de legare a hormonului de eliberare a gonadotropinei. // J Biol Chem. 1997. V. 272. Nr. 17. p. 11597-11603.

149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. O proteină de fuziune toxină difteric-factorul de creștere epidermic este citotoxică pentru celulele multiforme ale glioblastomului uman. // Cancer Res. 2003. V. 63. Nr. 8. P. 1834-1837.

150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. țintirea receptorului factorului de creștere epidermic în liniile celulare de cancer de sân cu o toxină de fuziune a ligandului recombinant (DAB389EGF). // Cancer J Sci Am. 1996. V. 2. Nr. 3. P. 175-180.

151. Turturro F. Denileukin diftitox: o schimbare de paradigmă bioterapeutică în tratamentul tulburărilor derivate din limfoid. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. Nr. 1. P. 11-17.

152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox ca terapie țintită nouă pentru afecțiunile maligne limfoide. // Cancer Invest. 2007. V. 25. Nr. 6. p. 495-501.

153. Duvic M., Talpur R. Optimizing denileukin diftitox (Ontak) therapy. // Viitorul Oncol. 2008. V. 4. Nr. 4. p. 457-469.

154. Foss F. Experiență clinică cu denileukin diftitox (ONTAK). // Semin Oncol. 2006. V. 33. Nr 1 Suppl 3. P. SI 1-16.

155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. Terapii noi pentru leucemia limfocitară cronică. // Sânge Rev. 2004. V. 18. Nr. 2. P. 137-148.

156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox as novel targeted therapy in non-Hodgkin's lymphoma. // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. No. 2. P. 169-174.

157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: o revizuire clinică concisă. // Expert Rev Anticancer Ther. 2005. V. 5. Nr. 1. P. 33-38.

158. Black J.H., McCubrey J.A., Willingham M.C., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. Proteina de fuziune toxină difteric-interleukină-3 (DT(388)IL3) prelungește supraviețuirea fără boală a șoarecilor imunocompromiși cu leucemie. // Leucemie. 2003. V. 17. Nr. 1. P. 155-159.

159. Frankel A., Liu J.S., Rizzieri D., Hogge D. Studiu clinic de fază I al proteinei toxinei difterice-interleukina 3 la pacienții cu leucemie mieloidă acută și mielodisplazie. // Limfom Leuk. 2008. V. 49. Nr. 3. P. 543-553.

160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. Exotoxinele IL-4 și IL-13 pseudomonas: o nouă speranță pentru terapia tumorii cerebrale. // Focalizare neurochirurgicală. 2006. V. 20. Nr. 4. P. El 1.

161. Terapia cu și fără Temozolomidă în glioamele maligne nou diagnosticate: Studiul de fază 1 al rezultatelor finale de siguranță. //Neurochirurgie. 2008.V.P.

162. Jarboe J.S., Johnson K.R., Choi Y., Lonser R.R., Park J.K. Exprimarea receptorului alfa2 al interleukinei-13 în glioblastomul multiform: implicații pentru terapiile țintite. // Cancer Res. 2007. V. 67. Nr. 17. p. 7983-7986.

163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: un nou prototip de proteine ​​himerice umane pentru terapie țintită. // FEBS Lett. 1999. V. 457. Nr. 2. P. 271-276.

164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Mecanismul de acțiune al interleukinei-2 (IL-2)-Bax, o proteină himerică care induce apoptoza țintită împotriva celulelor care exprimă IL-2 receptor. // Biochem J. 2003. V. 370. Nr. Pt 1. P. 129-140.

165. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstrarea unei noi fracții proteice în serul fătului uman. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. Nr. 2. p. 174.

166. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., S.I.I. A-globulina serică embrionară și sinteza acesteia prin hepatoame de șoarece transplantate. // Biochimie. 1963. V. 28. Nr. 4. R. 625-634.

167. Tatarinov Yu.S. Detectarea a-globulinei specifice embrionului în serul sanguin al unui pacient cu cancer hepatic primar. // Întrebare. Miere. chimie. 1964. V. 10. R. 90-91.

168. Abelev G.I., Elgort D.A. Alfa-fetoproteina ca marker imunologic al cancerului hepatocelular și al teratocarcinomului testicular și ovarian. // Oncologie. 1978. V. 10. R. 3-17.

169. Brock D.J., Bolton A.E., Monaghan J.M. Diagnosticul prenatal al anencefaliei prin măsurarea serului-alfafetoproteinei materne. // Lancet. 1973. V. 2. Nr 7835. p. 923-924.

170. Aitken D.A., Crossley J.A. Defecte de tub neural / alfa-fetoprotein / Screening sindromul Down "s. // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. Nr. 2. P. 113-120.

171. Deutsch H.F. Chimia și biologia alfa-fetoproteinei. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.t "t i ng. zjj-j1z.

172 Luft A.J., Lorscheider F.L. Analiza structurală a alfa-fetoproteinei umane și bovine prin microscopie electronică, procesare de imagini și dicroism circular. // Biochimie. 1983. V. 22. Nr. 25. p. 5978-5981.

173 Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake C., Ho S.K. Structuri ale izoformelor alfa-fetoproteinei serice specifice bolii. // Br J Cancer. 2000. V. 83. Nr. 10. P. 1330-1337.

174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. Prezența acizilor grași în alfa-fetoproteina umană. // J Biol Chem. 1978. V. 253. Nr. 7. P. 2114-2119.

175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Aranjament în tandem al genelor albuminei și alfa-fetoproteinei în genomul uman. // Gene. 1984. V. 32. Nr. 3. P. 255-261.

176. Lazarevici N.L. Mecanisme moleculare de reglare a expresiei genei alfa-fetoproteinei. // Biochimie. 2000. V. 65. Nr. 1. R. 139-158.

177. Jose-Estanyol M., Danan J.L. Un factor specific hepatic și un factor nuclear I se leagă de promotorul alfa-fetoproteinei de șobolan. // J Biol Chem. 1988. V. 263. Nr. 22. p. 10865-10871.

178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Factorul nuclear 3 al hepatocitelor ameliorează represiunea mediată de cromatină a genei alfa-fetoproteinei. // J Biol Chem. 1999. V. 274. Nr. 35. Str. 25113-25120.

179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. Locusul alfa 1-fetoproteină este activat de un receptor nuclear al Drosophila FTZ- Familia F1. // Mol. celulă. Biol. 1996. V. 16. Nr. 7. p. 3853-3865.

180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 este un represor al expresiei a-fetoproteinei în liniile celulare de hepatom uman. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. Nr 6b. P. 2772-2780.

181 Van Reeth T, Gabant P, Szpirer C, Szpirer J. Stimularea promotorului alfafeioproieinei de către receptorul hormonului tiroidian neligandat în asociere cu deacetilarea proteinei. // Endocrinologie moleculară și celulară. 2002. V. 188. Nr. 1-2. P. 99-109.

182. Lienard P., De Mees C., Drnze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Regulament of the alpha-fetoprotein promoter: Ku binding and DNA spatial conformation. // Biochimie. 2006. V. 88. Nr. 10. P. 1409-1417.

183. Mizejewski G.J. Rolurile biologice ale alfa-fetoproteinei în timpul sarcinii și dezvoltării perinatale. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. V. 229. Nr. 6. P. 439-463.

184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. Situl de legare a acidului gras al alfa-fetoproteinei umane. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. V. 196. Nr. 3. P. 1049-1057.

185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Efectul alfa-fetoproteinei și al albuminei asupra absorbției acizilor grași polinesaturați de către celulele hepatomului de șobolan și hepatocitele fetale de șobolan. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. Nr. 1. P. 81-88.

186. Mizejewski G.J., Pass K.A. Acizi grași, alfa-fetoproteină și fibroză chistică. // Pediatrie. 2001. V. 108. Nr. 6. P. 1370-1373.

187. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Efectele metalelor grele asupra alfa-fetoproteinei din serul matern și lichidul amniotic al șoarecilor gestante. // Toxicologie. 1990. V. 64. Nr. 1. P. 19-32.

188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. Alfa-fetoproteina umană purificată inhibă producția de estradiol stimulată de hormonul foliculostimulant de către celulele granuloasei porcine în cultură. // Mol Cell Endocrinol. 1993. V. 94. Nr. 1. P. 21-25.

189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Alfa-fetoproteina activată de estradiol suprimă răspunsul uterotrop la estrogeni. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. Nr. 9. P. 2733-2737.

190. Jacobson H.I., Bennett J.A., Mizejewski G.J. Inhibarea creșterii cancerului de sân dependent de estrogen printr-un produs de reacție al alfa-fetoproteinei și estradiolului. // Cancer Res. 1990. V. 50. Nr. 2. P. 415-420.

191. Mizejewski G.J., Warner A.S. Alfa-fetoproteina poate regla creșterea în uterul șoarecelui ovariectomizat imatur și adult. // J Reprod Fertil. 1989. V. 85. Nr. 1. P. 177-185.

192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Studii privind activitatea antiuterotropă intrinsecă a alfa-fetoproteinei murine. // Biologia tumorii. 1986. V. 7. Nr. 1. P. 19-36.

193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., .Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Hormonii sarcinii, proteina alfa-feto și reducerea riscului de cancer de sân. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. P. 477-484.

194. Mizejewski G.J. Rolul biologic al alfa-fetoproteinei în cancer: perspective pentru terapia anticancer. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. Nr. 6. p. 709-735.

195 Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. Mecanismul molecular de promovare al alfa-fetoproteinei asupra creșterii liniei celulare Bel7402 de hepatom uman. // World J Gastroenterol. 2002. V. 8. Nr. 3. p. 469-475.

196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. Mecanismul intracelular al alfa-fetoproteinei care promovează proliferarea celulelor NIH 3T3. // Celulă Res. 2002. V. 12. Nr. 2. str. 151156.

197 Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Creșterea proliferării celulelor HeLa de către alfa-fetoproteina. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2002. V. 34. Nr. 6. p. 769-774.

198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alpha-fetoprotein: Un nou membru al semnalului intracelular molecule în reglarea semnalizării PI3K/AKT în liniile celulare de hepatom uman. // Int J Cancer. V.P.

199. Chakraborty M., Mandal C. Efectul imuno-supresor al alfafetoproteinei umane: un studiu între specii. // Immunol Invest. 1993. V. 22. Nr. 5. P. 329-339.

200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. (alfa)-Fetoprotein afectează funcția APC și induce apoptoza lor. // J Immunol. 2004. V. 173. Nr. 3. P. 1772-1778.

201 Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Amelioration of autoimmune neuroinflammation by recombinant human alpha-fetoprotein. // Exp Neurol. 2006. V. 198. Nr. 1. P. 136-144.

202. Chereshnev B.A., Rodionov S.Yu. Cherkasov V A, Malyutina N. N., Orlov O. A. Alfa-fetoproteina. Ekaterinburg: Filiala Ural a Academiei Ruse de Științe; 2004.

203 Dudich E. MM-093, o alfa-fetoproteină umană recombinantă pentru tratamentul potențial al artritei reumatoide și al altor boli autoimune. // Curr Opin Mol Ther. 2007. V. 9. Nr. 6. p. 603-610.

204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. Inhibarea apoptozei de către alfa-fetoproteina (AFP) și rolul receptorilor AFP în senescența anti-celulară. // Anticancer Res. 1994. V. 14. Nr 6B. p. 2429-2438.

205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. Eficacitatea chimioterapeutică a conjugatelor proteină-doxorubicină pe linia celulară de hepatom de șobolan rezistentă la mai multe medicamente in vitro. // Br J Cancer. 1993. V. 67. Nr. 2. P. 274-278.

206. Lubgan D., Jozwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. Conjugatul doxorubicină-transferină învinge selectiv rezistența la mai multe medicamente în celulele leucemice. // Cell Mol Biol Lett. 2009. V. 14. Nr. 1. P. 113-127.

207. Sarti D.A., Crandall B.F., Winter J., Robertson R.D., Kaback N.M., Karp L.E. Corelația diametrelor corpului biparietal și fetal: 12-26 săptămâni de gestație. // AJR. Jurnal american de roentgenologie. 1981. V. 137. Nr. 1. P. 87-91.

208 Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus P.E., Giaccone G. Topoisomerase Ilalpha și alți markeri de rezistență la medicamente în cancerul pulmonar cu celule non-mici avansate. // Cancer de plamani. 2001. V. 32. Nr. 2. P. 117-128.

209 Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Arahnodactilie contractuală congenitală, keratoconus și probabil sindromul Marfan în același pedigree. // Jurnalul de Pediatrie. 1981. V. 98. Nr. 4. P. 591-593.

210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Studii de replicare tardivă într-o translocare X/13 umană: corelație cu expresia genei autosomale. // Citogenetică și genetică celulară. 1981. V. 29. Nr. 4. P. 215-220.

211 Uriel J., Villacampa M. J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Captarea alfa-fetoproteinei radiomarcate de către carcinoamele mamare la șoarece și utilitatea sa în scintigrafia tumorală. // Cancer Res. 1984. V. 44. Nr. 11. p. 5314-5319.

212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Rolul dinaminei în formarea veziculelor acoperite cu clatrină. // Simpozioane Cold Spring Harbor despre biologie cantitativă. 1995. V. 60. P. 235-242.

213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Captarea alfafoetoproteinei de către linii celulare clonate derivate dintr-un rabdomiosarcom de șobolan indus de nichel. // Br J Cancer. 1983. V. 48. Nr. 2. P. 261-269.

214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. The uptake of alpha-foetoprotein by C-1300 mouse neuroblastom cells. // Br J Cancer. 1985. V. 51. Nr. 6. p. 791-797.

215. Villacampa M. J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Receptorii alfa-fetoproteinei într-o linie celulară de cancer de sân uman. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. Nr. 3. P. 1322-1327.

216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Cell-type-specific receptors for alpha-fetoprotein in a mouse T-limfom cell line. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. Nr. 10. P. 3301-3305.

217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Izolarea și caracterizarea parțială a unui receptor specific alfa-fetoproteină pe monocite umane. // J Clin Invest. 1992. V. 90. Nr. 4. P. 1530-1536.

218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Activarea unei bucle autocrine alfa-fetoproteinei (AFP)/receptor în celulele carcinomului de colon uman HT-29. // Int J Cancer. 1991. V. 49. Nr. 3. str. 425430.

219. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-limfocytes during blastic transformation. // Mol Immunol. 1989. V. 26. Nr. 9. p. 851-857.

220. Biddle W., Sarcione E.J. Proteina specifică de legare a alfa-fetoproteinei citoplasmatice în celulele cancerului de sân uman MCF-7 și țesutul primar de cancer mamar. // Tratament pentru cancerul de sân. 1987. V. 10. Nr. 3. P. 279-286.

221. Mizejewski G.J. Proteine ​​de legare la alfa-fetoproteine: implicații pentru trecerea transmembranară și localizarea subcelulară. // Life Sci. 1995. V. 56. Nr. 1. P. 1-9.

222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Anticorpi monoclonali direcționați împotriva unui antigen oncofetal larg răspândit: receptorul alfa-fetoproteinelor. // Tumor Biol. 1993. V. 14. Nr. 2. P. 116-130.

223. Kanevsky V., Pozdnyakova L.P., Aksenova O.A., Severin S.E., Katukov V., Severin E.S. Izolarea și caracterizarea proteinelor care leagă AFP din țesuturile umane tumorale și fetale. // Biochem Mol Biol Int. 1997. V. 41. Nr. 6. P. 1143-1151.

224 Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Absorbția specifică a alfa-fetoproteinei și albuminei de către celulele de hepatom Morris 7777 de șobolan. // Tumor Biol. 1999. V. 20. Nr. 1. P. 52-64.

225. Mizejewski G.J., MacColl R. Alpha-fetoprotein growth inhibitory peptides: potential leads for cancer therapeutics. // Mol Cancer Ther. 2003. V. 2. Nr. 11. P. 1243-1255.

226. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Alpha-fetoprotein derived synthetic peptides: assay of an estrogen-modifying regulatory segment. // Mol Cell Endocrinol. 1996. V. 118. Nr. 1-2. P. 15-23.

227 Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Alfa-fetoproteina inhibă metamorfoza broaștei: implicații pentru conservarea motivului proteic. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. V. 124. Nr. 1. P. 39-45.

228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Efectul alfa-fetoproteinei și al peptidelor derivate asupra fetotoxicității induse de insulină și estrogen. // Diagnostic fetal Ther. 2003. V. 18. Nr. 5. P. 360-369.

229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Studii asupra unei peptide care inhibă creșterea derivată din alfa-fetoproteina și unii analogi. // J Pept Res. 2001. V. 57. Nr. 1. P. 29-38.

230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Studii asupra analogilor unei peptide derivate din alfa-fetoproteina având proprietăți anti-creștere. // J Pept Res. 2001. V. 57. Nr. 6. p. 539-546.

231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Studiul activităților funcționale ale peptidelor inhibitoare de creștere derivate de alfa-fetoproteine: revizuire și perspective. // Curr Protein Pept Sci. 2006. V. 7. Nr. 1. P. 73-100.

232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. Revizuirea peptidei inhibitoare a creșterii ca agent bioterapeutic pentru creșterea tumorii, aderența și metastaza. // Metastaza cancerului Rev. 2005. V. 24. Nr. 3. P. 441-467.

233. Vakharia D., Mizejewski G.J. Peptidele alfa-fetoproteine ​​umane leagă receptorul de estrogen și estradiol și suprimă cancerul de sân. // Tratament pentru cancerul de sân. 2000. V. 63. Nr. 1. P. 41-52.

234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Studii privind marcarea cu 99mTc a fragmentului modificat al alfa-fetoproteinei umane (P149-QY). // Revista de chimie radioanalitică și nucleară. 2008. V. 275. Nr. 1. P. 101-107.

235. Linton K.J., Higgins C.F. Proteinele casetei de legare ATP (ABC) ale Escherichia coli. // Mol Microbiol. 1998. V. 28. Nr. 1. P. 5-13.

236. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. Superfamilia de transportoare a casetei de legare a ATP-ului uman (ABC). // Genom Res. 2001. V. 11. Nr. 7. P. 1156-1166.

237. Dean M., Annilo T. Evoluția superfamiliei de transportoare a casetei de legare ATP (ABC) la vertebrate. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. V. 6. P. 123-142.

238. Riordan J.R., Ling V. Purificarea glicoproteinei P din veziculele membranei plasmatice ale celulelor ovariene de hamster chinezesc cu permeabilitate redusă la colchicină. // J Biol Chem. 1979. V. 254. Nr. 24. p. 12701-12705.

239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC transporters: the power to change. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10. Nr. 3. P. 218-227.

240. Choi C.H. Transportorii ABC ca mecanisme de rezistență la mai multe medicamente și dezvoltarea de chimiosensibilizatori pentru inversarea acestora. // Cancer Cell Int. 2005. V. 5. P. 30.

241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Transportul transmembranar al endo- și xenobioticelor de către proteinele de rezistență la mai multe medicamente din caseta de legare ATP la mamifer. // Physiol Rev. 2006. V. 86. Nr. 3. p. 849-899.

242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, chimioterapie și remodelare a cromatinei. // Cancer Biol Ther. 2004. V. 3. Nr. 9. p. 819-824.

243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. Regulatori transcripționali ai genei umane de rezistență la multidrog 1: opinii recente. // Biochem Pharmacol. 2002. V. 64. Nr. 5-6. p. 943-948.

244. Breier A., ​​​​Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-glicoproteina-implicații ale metabolismului celulelor neoplazice și terapia cancerului. // Curr ținte de medicamente pentru cancer. 2005. V. 5. Nr. 6. p. 457-468.

245. Doz F., Roosen N., Rosenblum M.L. Metalotioneina și agenți anticancerigen: rolul metalotioneinei în chimioterapia cancerului. // J Neuroncol. 1993. V. 17. Nr. 2. P. 123-129.

246. Lazo J.S., Basu A. Expresia metalotioneinei și rezistența tranzitorie la medicamente antineoplazice electrofile. // Semin Cancer Biol. 1991. V. 2. Nr. 4. P. 267-271.

247. Chen A.Y., Liu L.F. ADN topoizomeraze: enzime esențiale și ținte letale. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. V. 34. P. 191-218.

248. Makin G. Dirijarea apoptozei în chimioterapia cancerului. // Expert Opin Ther Targets. 2002. V. 6. Nr. 1. P. 73-84.

249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2nd, Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,

250. RAPPAG \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct lomlag nolle +A Lionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/YCH/I VI 1U11VUU11 JVllJiU^VJ l/l WUJl W14J.11. X*A/1/WHO IU WlOUllUlill WlUlUlill pentoxifilină // Cancer Res. 1995. V. 55. Nr. 8. P. 1649-1654.

251. Sarkar R., Jain R.K., Puri P. Melasma la bărbați indieni. // Dermatol Surg. 2003. V. 29. Nr. 2. p. 204.

252. Smith D.J., Ng H., Kluck R.M., Nagley P. The mitocondrial gateway to cell death. // Viața IUBMB. 2008. V. 60. Nr. 6. P. 383-389.

253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Mitocondrial carriers and pores: key regulators of the mitocondrial apoptotic program? // Apoptoză. 2007. V. 12. Nr. 5. p. 869-876.

254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. O revizuire a literaturii de specialitate a markerilor moleculari predictivi a răspunsului clinic la chimioterapia citotoxică la pacienții cu cancer de sân. // Int J Clin Oncol. 2009. V. 14. Nr. 2. P. 112-119.

255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. Rolul membrilor familiei Bcl-2 în tumorigenesis. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. Nr. 2-3. P. 229-249.

256 Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. Clinical studies of Bcl-2 and treatment benefit in the breast cancer patients. // Endocr Relat Cancer. 1999. V. 6. Nr. 1. P. 61-68.

257. Adams J.M., Cory S. Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential. // Curr Opin Immunol. 2007. V. 19. Nr. 5. P. 488-496.

258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Observarea directă a unui analog de citozină care formează cinci legături de hidrogen la guanozină: guanidino G-clamp. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. V. 41. Nr. 1. P. 115-117.

259 Cowling V.H., Cole M.D. Mecanismul de activare transcripțională de către oncoproteinele Myc. // Semin Cancer Biol. 2006. V. 16. Nr. 4. P. 242-252.

260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Terapie împotriva cancerului: țintirea părții întunecate a Myc. // Eur J Cancer. 2005. V. 41. Nr. 16. p. 2485-2501.

261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. Non-transcriptional control of DNA replication de c-myc. // Natură. 2007. V. 448. Nr. 7152. P. 445-451.

262. Spencer C.A., Groudine M. Control of c-myc regulation in normal and neoplastic cells. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. P. 1-48.

263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. Oncogene MYC și boala neoplazică umană. //Oncogene. 1999. V. 18. Nr. 19. p. 3004-3016.

264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Reglarea paracrină a angiogenezei și diferențierea adipocitelor în timpul adipogenezei in vivo. // Circ Res. 2003. V. 93. Nr. 9. P.e88-97.

265. Sears R.C. Ciclul de viață al C-myc: de la sinteză la degradare. // Ciclul celulei. 2004. V. 3. Nr. 9. P. 1133-1137.

266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., ​​​​Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. Răspunsuri la tratamentul antiangiogeneză al tumorilor autohtone spontane și al izogrefelor acestora. // Cancer Res. 2003. V. 63. Nr. 4. p. 747-751.

267 Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc Is a Metastasis Gene for Non-Small-Cell Lung Cancer. //Plus unu. 2009. V. 4. Nr. 6. P.e6029.

268. Ahmed F.E. Markeri moleculari care prezic răspunsul la terapia cancerului de colon. // Expert Rev Mol Diagn. 2005. V. 5. Nr. 3. P. 353-375.

269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. Țintele din aval ale factorului de creștere și ale semnalizării estrogenului și ale rezistenței endocrine: rolurile potențiale ale c-Myc, ciclinei Dl și ciclinei E. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12 Suppl 1. P. S47-59.

270. Blackburn E.H. Telomeri: structură și sinteză. // J Biol Chem. 1990. V. 265. Nr. 11. P. 5919-5921.

271. Olovnikov A.M. O teorie a marginotomiei. Copierea incompletă a marginii șablonului în sinteza enzimatică a polinucleotidelor și semnificația biologică a fenomenului. // J Theor Biol. 1973. V. 41. Nr. 1. P. 181-190.

272. Wright W.E., Shay J.W. Mecanismul în două etape care controlează senescența și imortalizarea celulară. // Exp Gerontol. 1992. V. 27. Nr. 4. P. 383-389.

273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Telomere architecture. // EMBO Rep. 2002. V. 3. Nr. 12. P. 1139-1145.

274. Liu J.P. Studii ale mecanismelor moleculare în reglarea activității telomerazei. // FASEB J. 1999. V. 13. Nr. 15. p. 2091-2104.

275 Wu K. J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Activarea directă a transcripției TERT prin c-MYC. // Nat Genet. 1999. V. 21. Nr. 2. p. 220224.

276. Tian X., Chen B., Liu X. Telomere și telomeraza ca ținte pentru terapia cancerului. // Appl Biochem Biotechnol. V. 160. Nr. 5. P. 1460-1472.

277 Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Compoziția lipozomilor este importantă pentru reținerea rodaminei lipozomale în celulele canceroase care supraexprimă glicoproteina P. // Livrare medicamente 2009. V. 16. Nr. 5. P. 261-267.

278 Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Liposome-encapsulated daunorubicin for PGP-related multidrog resistance. // Br J Haematol. 1999. V. 106. Nr. 1. P. 92-99.

279 Morinaga T., Sakai M., Wegmann T. G., Tamaoki T. Structuri primare ale alfa-fetoproteinei umane și ARNm al acesteia. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. Nr. 15. p. 4604-4608.

280. Bogush T., Robert J. Evaluarea comparativă a acumulării intracelulare și a legării ADN a idarubicinei și daunorubicinei în celulele K562 de leucemie umane sensibile și rezistente la multidrog. // Anticancer Res. 1996. V. 16. Nr. 1. P. 365-368.

281. Cartier R., Reszka R. Utilizarea peptidelor sintetice care conțin semnale de localizare nucleară pentru sistemele de transfer de gene nonvirale. // Gene Ther. 2002. V. 9. Nr. 3. P. 157-167.

282. Collas P., Alestrom P. Semnale de localizare nucleară: o forță motrice pentru transportul nuclear al ADN-ului plasmid la peștele zebra. // Biochem Cell Biol. 1997. V. 75. Nr. 5. p. 633-640.

283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Factori care influențează capacitatea peptidelor secvenței de localizare nucleară de a îmbunătăți livrarea genelor nonvirale. // Chimie bioconjugate. 2003. V. 15. Nr. 1. P. 152-161.

284. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Sinteza nucleozidelor și oligonucleotidelor modificate cu 2'-0-2-[(N,N-dimetilamino)oxi.etil] // J Org Chem. 2002. V. 67. Nr. 2. P. 357-369.

285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Efectele citotoxice ale unui conjugat doxorubicină-transferină în celulele KB rezistente la multidrog. // Biochem Pharmacol. 1996. V. 51. Nr. 4. P. 489-493.

286. Lemieux P., Pagina M. Sensibilitatea celulelor MCF-7 multirezistente la un conjugat transferină-doxorubicină. // Anticancer Res. 1994. V. 14. Nr 2A. P. 397-403.

287 Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Cellular acumulation and cytotoxicity of macromolecular platinum complexs in cisplatin-resistant tumor cells. // J Control Release. 2008. V. 131. Nr. 2. P. 100-106.

288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Sensibilitatea celulelor KB-C1 rezistente la multidrog la un conjugat anticorp-dextran-adriamicină. // Anticancer Res. 1989. V. 9. Nr. 3. p. 637-641.

289. Chitambar C.R. Compușii de galiu ca agenți antineoplazici. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. Nr. 6. p. 547-552.

290. Ehrlich P. Funcția parțială a celulelor. (Adresa Premiului Nobel dată la 11 decembrie 1908 la Stockholm).. // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. V. 5. Nr. 2. P. 67-86.

291 Măcelar E.C., Weissman I.L. Marcarea fluorescentă directă a celulelor cu fluoresceină sau izotiocianat de rodamină. I. Aspecte tehnice. // J Immunol Methods. 1980. V. 37. Nr. 2. str. 97108.

292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. Cuantificarea prin citofluorimetrie în flux a moleculelor HLA clasa I la suprafața celulelor murine transformate de gene HLA donate. // J Immunol Methods. 1983. V. 61. Nr. 3. P. 301-315.

293. Fenton C., Perry C.M. În centrul atenției gemtuzumab ozogamicin în leucemia mieloidă acută. // Biomedicamente: imunoterapeutice clinice, biofarmaceutice și terapie genică. 2006. V. 20. Nr. 2. P. 137-139.

294 Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Endocitoza mediată de receptor și reciclarea alfa-fetoproteinei în limfomul B uman și celulele leucemiei T. // Int J Cancer. 1991. V. 47. Nr. 1. P. 110-117.

295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Activarea unei căi alfa-fetoproteinei/receptoare în celulele mononucleare din sângele periferic normal și maligne umane. // Leucemie. 1993. V. 7. Nr. 11. P. 1807-1816.

296. Biaglow J.E., Miller R.A. Sistemul de tioredoxin reductază/tioredoxină: noi ținte redox pentru terapia cancerului. // Cancer Biol Ther. 2005. V. 4. Nr. 1. P. 6-13.

297. Arunachalam B., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Reducerea enzimatică a legăturilor disulfurice în lizozomi: caracterizarea unei tiol reductazei lizozomale induse de gamma-interferon (GILT). // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. Nr. 2. p. 745-750.

298. Kooistra T., Millard P.C., Lloyd J.B. Rolul tiolilor în degradarea proteinelor de către catepsine. // Biochem J. 1982. V. 204. Nr. 2. P. 471-477.

299 Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Scindarea legăturilor disulfurice în macromoleculele endocitozate. O procesare care nu este asociată cu lizozomi sau endozomi. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx y y V/ . t ^ ■ v<-л. л. » x w I vy v x v f w

300. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Similaritate între alfa-fetoproteina umană naturală și recombinantă ca inhibitori ai creșterii cancerului de sân dependent de estrogen. // Tratament pentru cancerul de sân. 1997. V. 45. Nr. 2. P. 169-179.

301. DiMarco A. Adriamycin (NSC-123127): mod și mecanism de acțiune. // Cancer Chemother. Reprezentant. 1975. V. 6. P. 91-106.

302. Hamza A., Sarma M.H., Sarma R.H. Interacțiunea plauzibilă a unei ciclopeptide alfa-fetoproteinei cu modelul GPR30 de receptor cuplat cu proteina G: studiu de andocare prin recoacere simulată de dinamică moleculară. // J Biomol Struct Dyn. 2003. V. 20. Nr. 6. p. 751-758.

303 Tan W., Loke Y. H., Stein C. A., Miller P., Colombini M. Oligonucleotidele de fosforotioat blochează canalul VDAC. // Biophys J. 2007. V. 93. Nr. 4. P. 1184-1191.

304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. O țintă farmacologică a G3139 în celulele melanomului poate fi VDAC mitocondrial. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. Nr. 19. p. 7494-7499.

305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein C.A., Colombini M. Oligonucleotidele fosforotioate reduc permeabilitatea membranei exterioare mitocondriale la ADP. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. V. 292. Nr. 4. P. C1388-1397.

306. Carpenter G., Cohen S. Epidermal growth factor. // Annu Rev Biochem. 1979. V. 48. P. 193-216.

307. Saeki T., Takashima S., Tachibana M., Koga M., Hiyama E., Salomon D.S., Holland J.F., Ohnuma T. Efectul inhibitor al telomere-mimic phosphorothioate oligodeoxy nucleotides (S-ODNS) pe liniile celulare tumorale umane . // Oncologie. 1999. V. 57 Suppl 2. P. 27-36.

308. Pagina T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. Efectele citotoxice ale imită telomerilor monocatenare asupra celulelor OMA-BL1. // Exp Cell Res. 1999. V. 252. Nr. 1. P. 41-49.

309. Berkers J.A., van Bergen en Henegouwen P.M., Boonstra J. Three classes of epidermal growth factor receptors on HeLa cells. // J Biol Chem. 1991. V. 266. Nr. 2. p. 922-927.

310. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Creșterea sensibilității la medicamente a tumorilor maligne umane prin factorul de creștere epidermică. // Br J Cancer. 1995. V. 72. Nr. 3. p. 615-619.

311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molecular manifestations and molecular determinants of telomere capping. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. P. 253-263.

312. Collas P., Alestrom P. Semnalele de localizare nucleară îmbunătățesc transmiterea liniei germinale a unei transgene la peștele zebra. // Transgenic Res. 1998. V. 7. Nr. 4. P. 303-309.

313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Un nou vector peptidic pentru livrarea eficientă a oligonucleotidelor în celulele de mamifere. // Acizi nucleici Res. 1997. V. 25. Nr. 14. P. 2730-2736.

314 Sinha B.K., Politi P.M. Antracicline. // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1990. V. 11. P. 45-57.

315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamicine, o clasă de antibiotice antitumorale puternice: mecanism de acțiune. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. Nr. 1. P. 2-6.

316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Citotoxicitatea selectivă a imunoconjugatului adriamicină al anticorpului monoclonal MSN-1 la adenocarcinomul endometrial in vitro și in vivo. // Oncol Rep. 2000. V. 7. Nr. 5. p. 1099-1106.

317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. Eficacitatea unui imunoconjugat de adriamicină care recunoaște produsul C-erbB-2 pe liniile celulare de cancer de sân. // SurgToday. 1996. V. 26. Nr. 7. p. 501-507.

318. Yamamoto K., Acton E.M., Henry D.W. Activitatea antitumorală a unor derivați ai daunorubicinei la funcțiile amino și metil cetone. // Journal of Medicinal Chemistry. 2002. V. 15. Nr. 8. p. 872-875.

319. Arnon R., Sela M. Eficacitatea in vitro și in vivo a conjugaților daunomicinei cu anticorpi antitumorali. // Immunol Rev. 1982. V. 62. P. 5-27.

320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. Legarea covalentă a daunomicinei și adriamicinei la anticorpi, cu reținerea atât a activităților medicamentoase, cât și a anticorpilor. // Cancer Res. 1975. V. 35. Nr. 5. P. 1175-1181.

321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. Viitorul terapiei antisens: combinație cu tratamente anticancer. // Oncogene. 2003. V. 22. Nr. 42. p. 6579-6588.

Vă rugăm să rețineți că textele științifice prezentate mai sus sunt postate pentru revizuire și obținute prin recunoașterea textului original al disertației (OCR). În acest sens, ele pot conține erori legate de imperfecțiunea algoritmilor de recunoaștere. Nu există astfel de erori în fișierele PDF ale disertațiilor și rezumatelor pe care le livrăm.