Na końcu artykułu zob
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) wynaleziony w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa (amerykańskiego naukowca). Za ten wynalazek otrzymał później Nagrodę Nobla. Obecnie diagnostyka PCR jest jedną z najdokładniejszych i najczulszych metod diagnozowania chorób zakaźnych.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)- eksperymentalna metoda biologii molekularnej, metoda znacznego zwiększania małych stężeń niektórych fragmentów kwasu nukleinowego (DNA) w materiale biologicznym (próbce).
Metoda PCR polega na wielokrotnym podwajaniu określonego odcinka DNA przy użyciu enzymów w sztucznych warunkach (in vitro). W rezultacie powstają ilości DNA wystarczające do wizualnej detekcji. W takim przypadku kopiowany jest tylko ten przekrój, który spełnia określone warunki i tylko wtedy, gdy występuje w badanej próbie.
Oprócz prostego zwiększania liczby kopii DNA (proces ten nazywa się amplifikacją), PCR pozwala na wiele innych manipulacji materiałem genetycznym (wprowadzanie mutacji, składanie fragmentów DNA) i jest szeroko stosowany w praktyce biologicznej i medycznej m.in. do diagnozowania chorób (dziedzicznych, zakaźnych), ustalania ojcostwa, klonowania genów, wprowadzania mutacji i izolowania nowych genów.

Specyfika i zastosowanie

Przeprowadzenie PCR

Aby przeprowadzić PCR w najprostszym przypadku, wymagane są następujące elementy:

• Matryca DNA zawierająca odcinek DNA wymagający amplifikacji;
• dwa startery komplementarne do końców pożądanego fragmentu;
• termostabilna polimeraza DNA;
• trifosforany deoksynukleotydów (A, G, C, T);
• jony Mg2+ niezbędne do działania polimerazy;
• roztwór buforowy.

PCR przeprowadza się w termocyklerze – urządzeniu zapewniającym okresowe chłodzenie i ogrzewanie probówek, zwykle z dokładnością co najmniej 0,1°C. Aby uniknąć odparowania mieszaniny reakcyjnej, do probówki należy dodać wysokowrzący olej, np. wazelinę. Dodatek specyficznych enzymów może zwiększyć wydajność reakcji PCR.
Postęp reakcji

Zazwyczaj PCR przeprowadza się od 20 do 35 cykli, z których każdy składa się z trzech etapów. Dwuniciową matrycę DNA ogrzewa się do 94–96°C (lub 98°C, jeśli stosuje się szczególnie termostabilną polimerazę) przez 0,5–2 minuty w celu rozdzielenia nici DNA. Ten etap nazywa się denaturacją – wiązania wodorowe pomiędzy dwoma łańcuchami ulegają zniszczeniu. Czasami przed pierwszym cyklem mieszaninę reakcyjną podgrzewa się przez 2 - 5 minut, aby całkowicie zdenaturować matrycę i startery.
Po rozdzieleniu nici temperaturę obniża się, aby umożliwić starterom związanie się z jednoniciową matrycą. Ten etap nazywa się wyżarzaniem. Temperatura wyżarzania zależy od podkładów i zwykle wybierana jest o 4 - 5°C poniżej ich temperatury topnienia. Czas trwania etapu wynosi 0,5 – 2 minuty.

Polimeraza DNA replikuje nić matrycową, stosując starter jako starter. To jest etap wydłużania. Temperatura wydłużania zależy od polimerazy. Powszechnie stosowane polimerazy są najbardziej aktywne w temperaturze 72°C. Czas wydłużania zależy zarówno od rodzaju polimerazy DNA, jak i długości amplifikowanego fragmentu. Zwykle przyjmuje się, że czas wydłużania wynosi jedną minutę na tysiąc par zasad. Po zakończeniu wszystkich cykli często przeprowadza się dodatkowy końcowy etap wydłużania, aby ukończyć wszystkie fragmenty jednoniciowe. Ten etap trwa 10 – 15 minut.
Przygotowanie materiału do badań i transport do laboratorium

Aby analiza przebiegła pomyślnie, ważne jest prawidłowe pobranie materiału od pacjenta i odpowiednie jego przygotowanie. Wiadomo, że w diagnostyce laboratoryjnej większość błędów (do 70%) popełniana jest właśnie na etapie przygotowania próbki. Do pobrania krwi w laboratorium INVITRO wykorzystuje się obecnie systemy próżniowe, które z jednej strony minimalizują obrażenia pacjenta, a z drugiej pozwalają na pobranie materiału w taki sposób, aby nie miał on kontaktu z ani personel, ani środowisko. Pozwala to uniknąć zanieczyszczenia (skażenia) materiału i zapewnia obiektywność analizy PCR.

DNA – kwas dezoksyrybonukleinowy – jest polimerem biologicznym, jednym z dwóch rodzajów kwasów nukleinowych zapewniających przechowywanie, przekazywanie z pokolenia na pokolenie oraz realizację programu genetycznego rozwoju i funkcjonowania organizmów żywych. Główną rolą DNA w komórkach jest długotrwałe przechowywanie informacji o strukturze RNA i białek.

RNA-kwas rybonukleinowy jest polimerem biologicznym podobnym pod względem struktury chemicznej do DNA. Cząsteczka RNA zbudowana jest z tych samych jednostek monomeru – nukleotydów – co DNA. W naturze RNA zwykle występuje w postaci pojedynczej nici. W niektórych wirusach RNA jest nośnikiem informacji genetycznej. W komórce odgrywa ważną rolę w przekazywaniu informacji z DNA do białka. RNA jest syntetyzowane na matrycy DNA. Proces ten nazywa się transkrypcją. W DNA znajdują się obszary zawierające informację odpowiedzialną za syntezę trzech typów RNA, które różnią się funkcjami, jakie pełnią: informacyjny lub informacyjny RNA (mRNA), rybosomalny RNA (rRNA) i transportowy RNA (tRNA). Wszystkie trzy typy RNA biorą udział w syntezie białek w taki czy inny sposób. Jednak informacja o syntezie białek zawarta jest jedynie w mRNA.

Nukleotydy są podstawową powtarzalną jednostką w cząsteczkach kwasu nukleinowego, produktem chemicznej kombinacji zasady azotowej, pięciowęglowego cukru (pentozy) i jednej lub więcej grup fosforanowych. Nukleotydy obecne w kwasach nukleinowych zawierają jedną grupę fosforanową. Nazywa się je w zależności od zawartej w nich zasady azotowej - adenina (A), zawierająca adeninę, guanina (G) - guanina, cytozyna (C) - cytozyna, tymina (T) - tymina, uracyl (U) - uracyl. DNA zawiera 4 rodzaje nukleotydów - A, T, G, C, RNA zawiera również 4 typy - A, U, G, C. Cukier we wszystkich nukleotydach DNA to deoksyryboza, RNA - ryboza. Kiedy powstają kwasy nukleinowe, nukleotydy wiążą się, tworząc szkielet cukrowo-fosforanowy cząsteczki, po jednej stronie której znajdują się zasady.

Starter to krótki DNA używany do replikacji nici matrycowej. Każdy ze starterów jest komplementarny do jednej z nici dwuniciowego szablonu, wyznaczając początek i koniec amplifikowanego regionu.

Literatura

1. Glick B., Pasternak J. Biotechnologia molekularna. Zasady i zastosowanie. Za. z angielskiego - M.: Mir, 2002. - 589 s., il. ISBN 5-03-003328-9
2. Szczelkunow S.N. Inżynieria genetyczna - Nowosybirsk: Sybirsk. Uniwersytet wydawnictwo, 2004. - 496 s.; chory. ISBN 5-94087-098-8
3. Patruszew L.I. Sztuczne systemy genetyczne - M.: Nauka, 2005 - W 2 tomach - ISBN 5-02-033278-X

WAŻNY!

Informacje zawarte w tej sekcji nie mogą być wykorzystywane do samodzielnej diagnozy i leczenia. W przypadku bólu lub innego zaostrzenia choroby badania diagnostyczne powinny zlecić wyłącznie lekarz prowadzący. Aby postawić diagnozę i właściwie przepisać leczenie, należy skontaktować się z lekarzem.

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) to wysoce precyzyjna metoda w zakresie diagnostyki dziedzicznych patologii, infekcji, chorób wirusowych na każdym etapie (ostrym lub przewlekłym), a także – we wczesnym stadium – przed oczywistymi objawami choroby poprzez identyfikację patogenów na podstawie ich DNA, RNA, które stanowią materiał genetyczny, w próbkach pobranych od pacjenta. A dzisiaj porozmawiamy o istocie, etapach diagnostycznych i zasadach metod reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a także o jej koszcie.

Co to jest reakcja łańcuchowa polimerazy

Podstawą analizy jest amplifikacja (podwojenie) – utworzenie wielu kopii z krótkiego odcinka DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego), który reprezentuje kompleks genetyczny człowieka. Do badania wymagana jest bardzo mała ilość substancji fizjologicznej (plwocina, kał, zeskrobiny nabłonka, sok prostaty, krew, plemniki, płyn owodniowy, śluz, tkanka łożyskowa, mocz, ślina, płyn opłucnowy, płyn mózgowo-rdzeniowy). W tym przypadku można na przykład wykryć nawet pojedynczy szkodliwy drobnoustroj w drogach moczowo-płciowych pacjenta.

Technikę PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) opracował amerykański naukowiec K. Mullis, laureat Nagrody Nobla w 1993 roku.

Aktywnie używane:

• we wczesnej diagnostyce infekcji genetycznych;
• w kryminalistycznych badaniach lekarskich, gdy do badania dostępna jest bardzo mała ilość DNA;
• w weterynarii, farmacji, biologii, genetyce molekularnej;
• w celu identyfikacji osoby na podstawie DNA, potwierdzenie ojcostwa;
• w paleontologii, antropologii, ekologii (przy monitorowaniu jakości produktów, czynników środowiskowych).

W tym filmie szczegółowo dowiesz się, czym jest reakcja łańcuchowa polimerazy:

Komu jest przepisywany?

Reakcja łańcuchowa polimerazy w diagnostyce chorób zakaźnych jest jedną z najbardziej niezawodnych metod charakteryzujących się szczególną dokładnością i niezawodnością. Na przykład wiarygodność analizy PCR dla chlamydii i wielu innych patogenów jest bliska 100% (bezwzględna). Najczęściej procedurę reakcji łańcuchowej polimerazy przepisuje się pacjentom, którzy mają trudności z identyfikacją konkretnego patogenu podczas diagnozy.

Laboratoryjny test PCR wykorzystuje się:

• do wykrywania patogenów wywołujących zakażenia narządów moczowo-płciowych trudne do zidentyfikowania metodami posiewowymi lub immunologicznymi;
• do ponownej diagnozy wirusa HIV na początkowym etapie w przypadku pozytywnego, ale wątpliwego wyniku wstępnego testu (na przykład u noworodków pochodzących od rodziców zakażonych AIDS);
• w celu wczesnego rozpoznania nowotworu (badanie mutacji onkogenu) i indywidualnego dostosowania schematu leczenia dla konkretnego pacjenta;
• w celu wczesnego wykrywania i potencjalnego leczenia patologii dziedzicznych.

Dlatego przyszli rodzice podchodzą do testu, aby dowiedzieć się, czy są nosicielami patologii genetycznej, a u dzieci PCR określa prawdopodobieństwo narażenia na chorobę przenoszoną w drodze dziedziczenia.

• w celu wykrycia patologii płodu we wczesnych stadiach ciąży (poszczególne komórki rosnącego zarodka bada się pod kątem obecności możliwych mutacji);
• u pacjentów przed przeszczepieniem narządu – w celu „typowania tkanek” (określenia zgodności tkanek);
• identyfikacja niebezpiecznych organizmów chorobotwórczych w oddanej krwi;
• u noworodków - w celu identyfikacji ukrytych infekcji;
• w celu oceny wyników leczenia przeciwwirusowego i przeciwdrobnoustrojowego.

Po co poddawać się takiemu zabiegowi?

Ponieważ PCR jest wysoce skuteczną metodą diagnostyczną, dającą niemal 100% wyników, stosuje się procedurę:

• aby potwierdzić lub wykluczyć ostateczną diagnozę;
• szybka ocena skuteczności terapii.

W wielu przypadkach PCR jest jedynym możliwym badaniem pozwalającym wykryć rozwijającą się chorobę, jeśli inne metody diagnostyki bakteriologicznej, immunologicznej i wirusologicznej są nieskuteczne.

• Wirusy wykrywa się metodą PCR bezpośrednio po zakażeniu, a przed pojawieniem się objawów choroby. Wczesne wykrycie wirusa pozwala na szybkie leczenie.
• Tak zwane „ładunek wirusa” (lub liczba wirusów w organizmie) jest również określana poprzez analizę DNA metodą ilościową.
• Określone patogeny (np. pałeczka gruźlicy Kocha) są trudne, a ich hodowla zajmuje zbyt dużo czasu. Testy PCR umożliwiają szybkie wykrycie minimalnej ilości patogenów (żywych i martwych) w próbkach dogodnych do testowania.

Stosowana jest szczegółowa analiza DNA patogenu:

• określić jego wrażliwość na określone rodzaje antybiotyków, co umożliwia natychmiastowe leczenie;
• kontrola rozprzestrzeniania się epidemii wśród zwierząt domowych i dzikich;
• identyfikacja i śledzenie nowych zakaźnych gatunków drobnoustrojów i podtypów patogenów, które były przyczyną poprzednich epidemii.

Rodzaje diagnostyki

Metoda standardowa

Analizę reakcji łańcuchowej polimerazy przeprowadza się w oparciu o wielokrotną amplifikację (podwojenie) określonego fragmentu DNA i RNA przy użyciu specjalnych enzymów starterowych. W wyniku łańcucha kopiowania uzyskuje się wystarczającą ilość materiału do badań.

Podczas zabiegu kopiowany jest tylko żądany fragment (odpowiadający określonym konkretnym warunkom) i jeśli faktycznie występuje w próbce.

Ten szczegółowy film z przydatnymi diagramami wyjaśnia, jak działa PCR:

Inne metody

• PCR w czasie rzeczywistym. W tego typu badaniach proces identyfikacji danego fragmentu DNA rozpoczyna się po każdym cyklu, a nie po ukończeniu całego łańcucha liczącego 30 – 40 cykli. Tego typu badania pozwalają uzyskać informację o ilości patogenu (wirusa lub drobnoustroju) w organizmie, czyli przeprowadzić analizę ilościową.
• RT-PCR (tryb odwrotnej transkrypcji). Test ten służy do poszukiwania jednoniciowego RNA w celu wykrycia wirusów, których podstawą genetyczną jest RNA (na przykład wirus zapalenia wątroby typu C, wirus niedoboru odporności). W badaniu tym wykorzystuje się specjalny enzym – odwrotną transkryptazę oraz specyficzny starter, a na bazie RNA budowany jest jednoniciowy DNA. Następnie z tej nici odzyskuje się drugą nić DNA i przeprowadza się standardową procedurę.

Wskazania do badań

Procedura PCR znajduje zastosowanie w klinice chorób zakaźnych, neonatologii, położnictwie, pediatrii, urologii, ginekologii, wenerologii, neurologii, nefrologii i okulistyce.

Wskazania do badania:

• określenie ryzyka wystąpienia nieprawidłowości genetycznych u dziecka z prawdopodobieństwem dziedzicznych patologii;
• diagnozowanie obojga rodziców w przypadku planowania ciąży lub ciężkiego stanu matki w trakcie ciąży;
• trudności z poczęciem, rozpoznanie przyczyn niepłodności;
• podejrzenie infekcji przenoszonych drogą płciową w ostrej fazie i z objawami ich przejścia w przewlekłe;
• wykrywanie przyczyn procesów zapalnych nieznanego pochodzenia;
• niezabezpieczone przypadkowe i regularne kontakty seksualne;
• określenie wrażliwości drobnoustroju chorobotwórczego na określone antybiotyki;
• u pacjentów z podejrzeniem zakażenia utajonego w celu wykrycia patogenów przed wystąpieniem oczywistych objawów (diagnostyka przedkliniczna);
• potwierdzenie powrotu do zdrowia po chorobie (diagnoza retrospektywna);

Diagnostykę stosuje się również w przypadku konieczności dokładnej identyfikacji następujących patogenów:

• wirusy zapalenia wątroby (A B C G), ludzki niedobór odporności, wirus cytomegalii;
• Vibrio cholerae;
• wirus opryszczki pospolitej, gatunek opryszczkowaty;
• retro - adeno - i rinowirusy;
• wirusy różyczki, Epsteina-Barra, ospy wietrznej (półpaśca);
• parwo i pikornowirusy;
• bakteria Helicobacter pylori;
• Legionella, patogenne typy Escherichia coli;
• Staphylococcus aureus;
• patogen;
• Clostridia, błonica i hemophilus influenzae;

Służy również do wykrywania infekcji:

• Zakaźna mononukleoza;
• borelioza, listerioza, kleszczowe zapalenie mózgu;
• kandydoza wywołana przez grzyby Candida;
• infekcje przenoszone drogą płciową – rzęsistkowica, ureaplazmoza, treponema pallidum, gardnereloza, rzeżączka, mykoplazmoza, chlamydia;
• gruźlica.

Przeciwwskazania do

Ponieważ zabieg nie jest wykonywany na pacjencie, bez wpływu na organizm, ale z materiałem biologicznym pobranym do badań, nie ma przeciwwskazań do wykonania PCR ze względu na brak potencjalnego zagrożenia.

Po zabiegu kolposkopii nie pobiera się jednak biomateriału z kanału szyjki macicy macicy. Przesyłanie wymazów i zeskrobin do analizy jest dozwolone dopiero 4–6 dni po zakończeniu miesiączki i całkowitym ustaniu wydzieliny.

Czy metoda jest bezpieczna?

Nie jest możliwy żaden negatywny wpływ na pacjenta podczas izolowanego badania jego biomateriału w laboratorium.

Przygotowanie do zabiegu (poddanie substancji biologicznych do analizy)

Każdy płyn biologiczny, tkanka lub wydzielina organizmu służy jako próbka do analizy PCR, która wykrywa DNA obcego patogenu. Substancję badaną pobiera się w postaci pobrania krwi z żyły, zeskrobania z krtani, jamy nosowej, cewki moczowej, jamy opłucnej, szyjki macicy.

Przed przystąpieniem do diagnostyki lekarz wyjaśnia pacjentowi, jaki materiał będzie pobrany:

1. Podczas badania pod kątem infekcji przenoszonych drogą płciową pobiera się wydzielinę z narządów płciowych, mocz i wymaz z cewki moczowej.
2. Podczas analizy pod kątem infekcji opryszczkowych do analizy pobiera się wirusa cytomegalii, mononukleozę, mocz i wymaz z gardła, w przypadku zapalenia wątroby, toksoplazmozy pobiera się krew z żyły.
3. W celu diagnozy różnych typów pobiera się płyn mózgowo-rdzeniowy.
4. W pulmonologii próbkami do analizy są plwocina i płyn opłucnowy.
5. Podczas badania możliwych infekcji wewnątrzmacicznych podczas ciąży do analizy wykorzystuje się płyn owodniowy i komórki łożyska.

Wiarygodność i dokładność analizy zależy od sterylności warunków pobierania materiału. Ponieważ badanie PCR jest bardzo czułe, każde zanieczyszczenie badanej substancji może zniekształcić wynik.

Właściwe przygotowanie do podania biomateriału nie nastręcza pacjentom żadnych trudności. Istnieją pewne zalecenia:

• podczas analizy pod kątem infekcji przenoszonych drogą płciową:
  • wykluczyć kontakty intymne na 72 godziny przed przesłaniem materiału;
  • zaprzestać używania jakichkolwiek produktów dopochwowych 3 dni wcześniej;
  • od wieczora poprzedniego dnia nie przeprowadzać higieny badanego obszaru;
  • wykluczyć oddanie moczu na 3–4 godziny przed pobraniem próbki z cewki moczowej;
• zaprzestać przyjmowania antybiotyków na miesiąc przed badaniem na obecność infekcji;
• krew oddaje się rano przed jedzeniem i piciem;
• Pierwszą poranną próbkę moczu pobiera się do sterylnego pojemnika po dokładnej toalecie intymnej.

Poniżej przeczytasz jak przeprowadzana jest diagnostyka metodą reakcji łańcuchowej polimerazy.

Jak działa procedura?

Podczas przeprowadzania badania PCR pewne cykle są powtarzane w kółko w reaktorze (wzmacniaczu lub termocyklerze):

1. Pierwszym krokiem jest denaturacja. Ślina, krew, materiał biopsyjny, próbki ginekologiczne, plwocina, w której podejrzewa się obecność DNA (lub RNA) patogenu, umieszcza się we wzmacniaczu, gdzie materiał jest podgrzewany, a DNA zostaje rozdzielony na dwa oddzielne łańcuchy.
2. Drugim etapem jest wyżarzanie lub lekkie schłodzenie materiału i dodanie do niego starterów, które potrafią rozpoznać pożądane regiony w cząsteczce DNA i związać się z nimi.
3. Trzecim krokiem jest wydłużenie– następuje po przyłączeniu 2 starterów do każdej nici DNA. W trakcie tego procesu fragment DNA patogenu zostaje skompletowany i powstaje jego kopia.

Cykle te powtarzają się niczym „reakcja łańcuchowa”, za każdym razem prowadząc do podwojenia kopii określonego fragmentu DNA (na przykład odcinka, w którym zaprogramowany jest konkretny wirus). W ciągu kilku godzin powstaje wiele kopii fragmentu DNA i wykrywana jest ich obecność w próbce. Następnie wyniki są analizowane i porównywane z danymi z bazy danych różnych typów patogenów w celu określenia rodzaju zakażenia.

Przeczytaj poniżej o dekodowaniu wyników i wnioskach na podstawie reakcji PCR.

Dekodowanie wyników

Ostateczny wynik badania wydawany jest po 1 – 2 dniach od dostarczenia materiału biologicznego. Często – już pierwszego dnia po analizie.

Analiza jakościowa

• Negatywny wynik oznacza, że ​​w substancji przekazanej do badania nie stwierdzono śladów czynników zakaźnych.
• Pozytywny wynik oznacza wykrycie patogennych wirusów lub bakterii w próbce biologicznej z bardzo dużą dokładnością w momencie przekazania materiału.

Jeśli wynik jest pozytywny, ale nie wykryto żadnych oznak wzmożonej infekcji, taki stan organizmu nazywa się bezobjawowym „zdrowym nosicielem”. Najczęściej obserwowane podczas pobierania biomateriału z określonego miejsca (kanał szyjki macicy, cewka moczowa, jama ustna) w chorobach wirusowych. W takim przypadku leczenie nie jest wymagane, ale wymagany jest stały nadzór lekarski, ponieważ istnieje możliwość:

• rozprzestrzenianie się wirusa od nosicieli i zakażenie zdrowych osób;
• aktywacja procesu i przejście choroby do postaci przewlekłej.

Jeśli jednak wynik badania krwi jest pozytywny, oznacza to, że infekcja zaatakowała organizm i nie jest to już stan nosiciela, ale patologia wymagająca natychmiastowego specyficznego leczenia.

Analiza ilościowa

Wynik ilościowy ustala specjalista specjalnie dla konkretnego rodzaju infekcji. Na tej podstawie można ocenić stopień rozwoju i stadium choroby, co pozwala na szybkie przepisanie prawidłowego leczenia.

średni koszt

O cenach reakcji łańcuchowej polimerazy decydują: rodzaj badań, trudność identyfikacji patogenu, trudność pobrania materiału biologicznego, rodzaj analizy (jakościowa lub ilościowa) oraz poziom cen w laboratorium.

Z drugiej strony podczas badania PCR można zidentyfikować kilka patogenów jednocześnie, pobierając jeden rodzaj materiału do analizy. Pozwala to zaoszczędzić na innych badaniach laboratoryjnych.

Przybliżony koszt analizy PCR w rublach:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas pochwylis – od 180
• chlamydia trachomatis – od 190
• wirus brodawczaka – od 380 do 500
• biocenoza układu moczowo-płciowego u kobiet (ilościowa i jakościowa ocena mikroflory) – od 800.

Jeszcze bardziej przydatne informacje dotyczące testów PCR znajdują się w poniższym filmie:

Genetyka bakterii. Informacje na drugą lekcję.

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest metodą pozwalającą na wielokrotne zwiększenie (amplifikację) ilości określonych cząsteczek DNA w analizowanej próbce (w tym w materiale biologicznym lub czystej hodowli).

Głównymi zaletami PCR jako metody diagnostycznej w mikrobiologii jest bardzo wysoka czułość, pozwalająca na wykrycie wyjątkowo niskich stężeń patogenów w próbkach, a także regulowana specyficzność, pozwalająca na wykrycie lub identyfikację patogenów na poziomie rodzaju, gatunku lub podgatunku. Główna wada PCR wynika z jej niezwykle wysokiej czułości – bardzo łatwo jest zanieczyszczenie próbek DNA z kontroli pozytywnej, innej próbki lub produktu PCR, co skutkuje fałszywie dodatnią reakcją. Nakłada to surowe ograniczenia na warunki, w jakich przeprowadza się mieszanie PCR i pracę z gotowymi produktami PCR.

Przeprowadzenie PCR. Przygotowuje się mieszaninę reakcyjną zawierającą następujące składniki:

Wyizolowane DNA z próbki testowej,

roztwór buforowy,

jony Mg2+ (niezbędne do działania enzymu),

Dwa startery to jednoniciowe krótkie cząsteczki DNA (najczęściej o długości od 18 do 24 nukleotydów), komplementarne do końców różnych nici wykrywanej sekwencji DNA.

Mieszanina trifosforanów deoksynukleotydów.

Termoodporna polimeraza DNA (najczęściej stosowana jest polimeraza Taq – polimeraza wyizolowana z Termus wodny).

Tę mieszaninę reakcyjną umieszcza się następnie w termocyklerze, który zasadniczo jest programowalnym termostatem. Termocykler wykonuje 30-40 cykli zmian temperatury. Każdy z tych cykli składa się z trzech etapów (patrz ryc. 1):

Denaturacja (temperatura 94 o C) - łańcuchy wodorowe ulegają rozerwaniu i nici DNA ulegają rozbieżności.

Wyżarzanie starterów (temperatura wynosi zwykle około 50-60 o C) - startery przyłączane są do końców łańcuchów DNA. Ogólnie rzecz biorąc, gdy temperatura spada, energetycznie korzystniejsze jest ponowne połączenie oryginalnych łańcuchów DNA z próbki badanej (renaturacja), jednakże stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej jest o wiele rzędów wielkości większe niż stężenie DNA z próbki próbki (przynajmniej w początkowych cyklach PCR), więc reakcja przyłączania startera przebiega szybciej niż renaturacja DNA. Temperaturę wyżarzania dobiera się w zależności od temperatur topnienia (denaturacji) starterów.

Elongacja (temperatura wynosi zwykle 72 o C) - polimeraza DNA uzupełnia startery wzdłuż matrycy długich łańcuchów DNA. Temperatura odpowiada optymalnej temperaturze roboczej stosowanej polimerazy DNA.

Wykrywanie wyników różni się w zależności od wersji PCR i jest opisane w sekcji „Rodzaje PCR”.

Dynamika PCR

We wczesnych cyklach PCR liczba cząsteczek dwuniciowego DNA, których wielkość zależy od odległości pomiędzy miejscami lądowania starterów, podwaja się w każdym cyklu. Powstaje także niewielka ilość dłuższych cząsteczek DNA, co można pominąć (patrz ryc. 2).

Zatem we wczesnych cyklach ilość produktu PCR opisana jest wzorem m*2 n, gdzie m jest początkową ilością pożądanego DNA w próbce, n jest liczbą cykli. Następnie reakcja osiąga plateau. Dzieje się tak na skutek akumulacji produktu reakcji, spadku stężenia starterów i trifosforanów deoksynukleotydów, a także na skutek wzrostu stężenia pirofosforanu (patrz ryc. 3).

Rodzaje PCR

Konwencjonalna PCR

W tej wersji konfiguracji PCR reakcja przebiega przez wybraną liczbę cykli (30-40), po czym sprawdza się, czy w mieszaninie reakcyjnej nastąpiła akumulacja cząsteczek dwuniciowego DNA.

Ta możliwość przeprowadzenia PCR, gdy jest stosowana jako metoda diagnostyczna, jest metodą jakościową. Reakcja dodatnia wskazuje na obecność w próbce co najmniej śladowych ilości pożądanych cząsteczek DNA. Reakcja negatywna wskazuje na ich brak. Ilościowa ocena zawartości oryginalnych cząsteczek DNA w próbce jest niemożliwa ze względu na osiągnięcie plateau reakcji.

Główną metodą wykrywania obecności produktu jest elektroforeza w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym. Produkty PCR rozdzielane są w żelu pod wpływem pola elektrycznego według ich masy cząsteczkowej. Do żelu dodaje się barwnik interkalujący (fluorescencyjny w stanie dwuniciowego DNA – najczęściej bromek etydyny). Zatem po naświetleniu światłem ultrafioletowym będzie można zobaczyć obecność lub brak paska odpowiadającego DNA o wymaganej masie cząsteczkowej. Podczas przeprowadzania PCR w celach diagnostycznych zawsze stosuje się kontrole reakcji pozytywnej i negatywnej, z którymi porównuje się próbki (patrz ryc. 4).

PCR w czasie rzeczywistym

W tej wersji PCR ilość produktu PCR w mieszaninie reakcyjnej jest stale rejestrowana podczas przebiegu reakcji. Pozwala to na skonstruowanie krzywej reakcji (patrz rys. 3) i na jej podstawie obliczenie liczby pożądanych cząsteczek DNA w próbkach.

Jednym z rodzajów reakcji PCR w czasie rzeczywistym jest zastosowanie barwnika interkalującego, który dodaje się bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej (najczęściej stosowany jest SYBRGreen). Innym rodzajem jest zastosowanie jednego z typów sond fluorescencyjnych, które wiążą się z miejscem wewnątrz produktu PCR, co pozwala na zwiększenie specyficzności detekcji (patrz rys. 5).Detekcja fluorescencji następuje bezpośrednio w urządzeniu podczas reakcji.

Oprócz możliwości wykrywania ilościowego, PCR w czasie rzeczywistym ma inne zalety w porównaniu z konwencjonalną PCR. Ta opcja PCR jest prostsza, szybsza, a także nie wymaga otwierania probówek z produktami PCR, co zmniejsza prawdopodobieństwo zanieczyszczenia innych próbek. Główną wadą jest wyższy koszt termocyklera z wbudowanymi funkcjami wykrywania fluorescencji w porównaniu z konwencjonalnym.

Cyfrowy ilościowy PCR

Nowa, droga i wciąż rzadko stosowana wersja PCR, która pozwala dokładniej określić ilość DNA w próbce.W tej wersji mieszanina reakcyjna zawierająca barwnik fluorescencyjny jest dzielona na ogromną liczbę mikroskopijnych objętości (np. kropelki w emulsji). Po PCR analizuje się, w jakiej części kropel reakcja była dodatnia i odpowiednio obserwuje się fluorescencję. Ułamek ten będzie proporcjonalny do liczby cząsteczek DNA poszukiwanych w próbce.

PCR z odwrotną transkrypcją

W tym przypadku przed jedną lub drugą wersją PCR przeprowadza się reakcję odwrotnej transkrypcji (RNA na DNA) przy użyciu enzymu odwrotnej tazy. Zatem metoda ta pozwala na jakościową lub ilościową detekcję cząsteczek RNA. Można to wykorzystać do wykrycia wirusów RNA lub określenia poziomu transkrypcji (ilości mRNA) konkretnego genu.

Obrazek 1. Etapy PCR. Podkłady zaznaczono na czerwono.

Rysunek 2. Akumulacja cząsteczek dwuniciowego DNA ograniczona przez startery podczas PCR.

Rysunek 3. Dynamika reakcji PCR przy różnych początkowych stężeniach pożądanych cząsteczek DNA w próbce. (a) – stężenie najwyższe (b) – stężenie pośrednie (c) – stężenie najniższe

Rysunek 4. Elektroforeza agarozowa produktów PCR. K+ – kontrola pozytywna (wiadomo, że pożądane DNA jest obecne). 1-7 – próbki do badań (w tym 1-2 są pozytywne, 3-7 są negatywne). K- – kontrola negatywna (wyraźnie brakuje pożądanego DNA). W wielu przypadkach oprócz produktu docelowego widoczne są lżejsze, niespecyficzne produkty reakcji (dimery starterów).

Rysunek 5. Metody wykrywania wykorzystujące PCR w czasie rzeczywistym. (a) – barwnik interkalujący – fluoryzuje po związaniu z dwuniciowym DNA (b) – Sonda Taqman – fluorescencja zachodzi, gdy sonda zostanie rozszczepiona przez polimerazę DNA o aktywności endonukleazy 5’-3’ w wyniku oddzielenia fluoroforu i wygaszacza. (c) – Sonda MolecularBeacon – fluorescencja występuje, gdy sonda hybrydyzuje z fragmentem docelowym w wyniku przestrzennego oddzielenia fluoroforu i wygaszacza (d) – Sondy LightCycler – fluorescencja akceptora występuje, gdy sondy (zawierające akceptor i donor) hybrydyzują z fragmentem docelowym docelowy fragment w wyniku rezonansowego przeniesienia energii fluorescencji (FRET).

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Istota metody PCR. Polimeraza DNA

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest eksperymentalną metodą biologii molekularnej, która pozwala na osiągnięcie istotnego wzrostu małych stężeń określonych fragmentów kwasów nukleinowych w materiale biologicznym. Ten proces zwiększania liczby kopii DNA nazywa się wzmocnienie. Kopiowanie DNA podczas PCR odbywa się za pomocą specjalnego enzymu - polimeraza. Polimeraza DNA (ryc. 3) jest enzymem biorącym udział w replikacji (amplifikacji DNA w organizmach żywych) DNA. Enzymy tej klasy katalizują polimeryzację deoksyrybonukleotydów wzdłuż łańcucha nukleotydów DNA, który enzym „odczytuje” i wykorzystuje jako matrycę. Rodzaj nowego nukleotydu określa zasada komplementarności z matrycą, z której jest on odczytywany.

Polimeraza DNA dodaje wolne nukleotydy na końcu 3" złożonego łańcucha. Prowadzi to do wydłużenia łańcucha w kierunku 5"-3. Żadna ze znanych polimeraz DNA nie jest w stanie stworzyć łańcucha od zera: mogą jedynie dodawać nukleotydy do już istniejącej grupy 3"-hydroksylowej. Z tego powodu potrzebuje polimerazy DNA Elementarz- krótka sekwencja nukleotydów (zwykle 20-25), komplementarna do końcowych odcinków badanego genu - do której mogła dodać pierwszy nukleotyd. Startery zawsze składają się z zasad DNA i RNA, przy czym pierwsze dwie zasady są zawsze zasadami RNA. Startery są syntetyzowane przez inny enzym - prymas. Kolejny enzym helikaza- jest niezbędna do rozwinięcia się podwójnej helisy DNA do postaci struktury jednoniciowej, która zapewnia replikację obu nici zgodnie z półkonserwatywnym modelem replikacji DNA.

Niektóre polimerazy DNA mają również zdolność korygowania błędów w nowo utworzonej nici DNA. W przypadku wykrycia nieprawidłowej pary nukleotydów, polimeraza DNA cofa się o jeden krok, eliminuje nieprawidłowy nukleotyd z łańcucha, następnie wstawia w jego miejsce właściwy, po czym replikacja przebiega normalnie.

Przeprowadzenie PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to metoda amplifikacji DNA, którą można zastosować do izolowania i namnażania określonej sekwencji DNA miliardy razy w ciągu kilku godzin. Możliwość uzyskania ogromnej liczby kopii jednego ściśle określonego regionu genomu znacznie upraszcza badanie istniejącej próbki DNA.

Aby przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy, należy spełnić szereg warunków. Aby przeprowadzić PCR w najprostszym przypadku, wymagane są następujące elementy:

Matryca DNA zawierająca część DNA, która wymaga amplifikacji.

Dwa startery komplementarne do końców pożądanego fragmentu. (Para sztucznie syntetyzowanych oligonukleotydów, zwykle o wielkości od 15 do 30 bp, identyczna z odpowiednimi odcinkami docelowego DNA. Odgrywają kluczową rolę w tworzeniu produktów reakcji amplifikacji. Prawidłowo dobrane startery zapewniają specyficzność i czułość systemu testowego.)

Termostabilna polimeraza DNA. Polimeraza stosowana w PCR musi pozostać aktywna w wysokich temperaturach przez długi czas, dlatego stosuje się enzymy izolowane od termofilów – Thermus aquaticus (polimeraza Taq) i inne.

Trifosforany deoksynukleotydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Jony Mg 2+ niezbędne do działania polimerazy.

Roztwór buforowy zapewniający niezbędne warunki reakcji - pH, siłę jonową roztworu. Zawiera sole, albuminę surowicy.

Aby uniknąć odparowania mieszaniny reakcyjnej, do probówki należy dodać wysokowrzący olej, np. wazelinę. Jeśli używasz urządzenia z podgrzewaną pokrywą, nie jest to wymagane.

Dodatek pirofosfatazy może zwiększyć wydajność reakcji PCR. Enzym ten katalizuje hydrolizę pirofosforanu, produktu ubocznego dodawania trifosforanów nukleotydów do rosnącej nici DNA, do ortofosforanu. Pirofosforan może hamować reakcję PCR.

Aby pomnożyć liczbę kopii oryginalnego DNA, wymagana jest reakcja cykliczna. Z reguły każdy z kolejno powtarzanych cykli PCR składa się z trzech etapów:

1. Denaturacja, czyli „topienie” DNA. Dwuniciową matrycę DNA ogrzewa się do 94 - 96°C (lub do 98°C, jeśli stosuje się szczególnie termostabilną polimerazę) przez 0,5 - 2 minuty, aby nici DNA się rozdzieliły. Ten etap nazywa się denaturacją, ponieważ wiązania wodorowe pomiędzy dwiema niciami DNA zostają zerwane. Czasami przed pierwszym cyklem (przed dodaniem polimerazy) mieszaninę reakcyjną podgrzewa się wstępnie przez 2 - 5 minut, aby całkowicie zdenaturować matrycę i startery. Ta technika nazywa się Gorący start pozwala na redukcję ilości nieswoistych produktów reakcji.

2. Wyżarzanie - wiązanie starterów z matrycą DNA. Po rozdzieleniu łańcuchów temperaturę powoli obniża się, aby umożliwić starterom kontakt z jednoniciową matrycą. Temperatura wyżarzania zależy od składu podkładów i zwykle wynosi 50-65°C. Czas trwania etapu wynosi 20 - 60 sekund. Niewłaściwy dobór temperatury wygrzewania prowadzi albo do złego związania starterów z matrycą (w zbyt wysokiej temperaturze), albo do związania w niewłaściwym miejscu i pojawienia się niespecyficznych produktów (w zbyt niskiej temperaturze).

3. Synteza (wydłużenie łańcucha). Polimeraza DNA replikuje nić matrycową, stosując starter jako starter. Polimeraza rozpoczyna syntezę drugiej nici od 3" końca startera, która związała się z matrycą i porusza się wzdłuż matrycy. Temperatura wydłużania zależy od polimerazy. Często stosowane polimerazy Taq i Pfu są najbardziej aktywne w temperaturze 72 C. Czas syntezy zależy od rodzaju polimerazy DNA i długości amplifikowanego fragmentu. Zazwyczaj przyjmuje się, że czas wydłużania wynosi jedną minutę na tysiąc par zasad. Po zakończeniu wszystkich cykli często przeprowadza się dodatkowy etap końcowe wydłużenie, aby uzupełnić wszystkie jednoniciowe fragmenty. Ten etap trwa 7 – 10 minut.

Następnie etapy denaturacji, wyżarzania i wydłużania powtarzają się wielokrotnie (30 i więcej razy). W każdym cyklu liczba syntetyzowanych kopii fragmentu DNA podwaja się.

Wszystkie reakcje przeprowadza się w probówkach zanurzonych w termostacie. Zmiana reżimu temperaturowego i utrzymanie go odbywa się automatycznie.

Aby dokładnie zrozumieć, w jaki sposób konkretny segment DNA ulega amplifikacji podczas PCR, należy jasno wyobrazić sobie położenie wszystkich starterów i ich komplementarnych sekwencji w amplifikowanych niciach w każdej rundzie. W pierwszej rundzie każdy z nowo syntetyzowanych łańcuchów ma znacznie większą długość niż odległość od grupy 3"-hydroksylowej jego startera do końcowego nukleotydu o sekwencji komplementarnej do drugiego startera. Takie łańcuchy nazywane są „długimi szablonami” ; to na nich będzie miała miejsce dalsza synteza.

W drugiej rundzie dwuniciowy DNA, składający się z podobnych i nowo zsyntetyzowanych nici (długa matryca), jest ponownie denaturowany, a następnie hybrydyzowany ze starterami. Podczas syntezy w tej rundzie ponownie syntetyzuje się „długie szablony”, jak również pewną liczbę nici ze starterem na jednym końcu i sekwencją komplementarną do drugiego startera na drugim („krótkie szablony”). Podczas trzeciej rundy wszystkie utworzone wcześniej heterodupleksy są jednocześnie denaturowane i przyłączane ze starterami, a następnie replikowane. W kolejnych rundach „krótkich macierzy” jest coraz więcej, a do 30. rundy ich liczba jest już 10 6 razy większa niż liczba początkowych łańcuchów lub „długich macierzy”.

Ilość specyficznego produktu reakcji (ograniczona starterami) teoretycznie wzrasta proporcjonalnie do 2n, gdzie n jest liczbą cykli reakcji. W rzeczywistości wydajność każdego cyklu może być mniejsza niż 100%, więc w rzeczywistości:

gdzie P to ilość produktu, E to średnia wydajność cyklu.

Zwiększa się także liczba „długich” kopii DNA, ale liniowo, zatem w produktach reakcji dominuje określony fragment. Wzrost wymaganego produktu jest wykładniczo ograniczony przez liczbę odczynników, obecność inhibitorów i tworzenie się produktów ubocznych.

PCR jest metodą bardzo czułą, dlatego jeśli badana próbka zawiera nawet niewielką ilość DNA, która przypadkowo przeszła z jednej mieszaniny reakcyjnej do drugiej, można uzyskać wyniki fałszywie dodatnie. Powoduje to konieczność dokładnej kontroli wszystkich roztworów i naczyń szklanych używanych do PCR.

Podstawowe zasady doboru podkładu.

Podczas tworzenia systemu testów PCR jednym z głównych zadań jest prawidłowy dobór starterów, które muszą spełniać szereg kryteriów:

1. Startery muszą być specyficzne. Szczególną uwagę zwraca się na 3" końce starterów, gdyż to właśnie od nich polimeraza Taq zaczyna kompletować komplementarny łańcuch DNA. Jeżeli ich specyficzność jest niewystarczająca, wówczas prawdopodobne jest, że w probówce z udziałem starterów zajdą niepożądane procesy. mieszanina reakcyjna, czyli synteza nieswoistego DNA (krótkie lub długie fragmenty). Jest to widoczne na elektroforezie w postaci ciężkich lub lekkich dodatkowych prążków. Utrudnia to ocenę wyników reakcji, gdyż łatwo jest pomylić specyficzne produkt amplifikacji z syntetyzowanym obcym DNA Część starterów i dNTP jest zużywana na syntezę nieswoistego DNA, co prowadzi do znacznej utraty czułości.

2. Startery nie powinny tworzyć dimerów i pętli, tj. stabilne podwójne nici nie powinny tworzyć się w wyniku przyłączania starterów do siebie lub do siebie.

Co pozwala wykryć w materiale biologicznym niewielkie ilości, a raczej pewne jego fragmenty, i wielokrotnie je pomnożyć. Następnie identyfikuje się je wizualnie metodą elektroforezy żelowej. Reakcja została opracowana w 1983 roku przez K. Mullisa i znajduje się na liście wybitnych odkryć ostatnich lat.

Jakie są mechanizmy PCR

Cała technika opiera się na zdolności kwasów nukleinowych do samodzielnej replikacji, co w tym przypadku odbywa się sztucznie w laboratorium. Reprodukcja DNA może rozpocząć się nie w żadnym regionie cząsteczki, ale tylko w obszarach o określonej sekwencji nukleotydów - fragmentach początkowych. Aby rozpoczęła się reakcja łańcuchowa polimerazy, potrzebne są startery (lub sondy DNA). Są to krótkie fragmenty łańcucha DNA o danej sekwencji nukleotydowej. Są one komplementarne (tzn. odpowiadają) w stosunku do miejsc startowych

Oczywiście, aby stworzyć startery, naukowcy muszą zbadać sekwencję nukleotydów tego, którego dotyczy ta technika. To właśnie te sondy DNA zapewniają specyficzność reakcji i jej inicjację. nie zadziała, jeśli próbka nie zawiera przynajmniej jednej cząsteczki pożądanego DNA. Ogólnie rzecz biorąc, do przeprowadzenia reakcji wymagane są powyższe startery, zestaw nukleotydów i termostabilna polimeraza DNA. Ten ostatni jest enzymem katalizującym reakcję syntezy nowych cząsteczek kwasu nukleinowego na podstawie próbki. Wszystkie te substancje, łącznie z materiałem biologicznym, w którym ma zostać wykryty DNA, łączy się w mieszaninę reakcyjną (roztwór). Umieszczony jest w specjalnym termostacie, który w zadanym czasie – cyklu wykonuje bardzo szybkie nagrzewanie i schładzanie. Zwykle jest ich 30-50.

Jak zachodzi ta reakcja?

Jego istota polega na tym, że podczas jednego cyklu startery przyłączają się do pożądanych odcinków DNA, po czym ulegają podwojeniu pod działaniem enzymu. Na podstawie powstałych nici DNA w kolejnych cyklach syntetyzuje się coraz więcej identycznych fragmentów cząsteczki.

Reakcja łańcuchowa polimerazy przebiega sekwencyjnie, wyróżnia się następujące etapy. Pierwsza charakteryzuje się podwojeniem ilości produktu podczas każdego cyklu grzania i chłodzenia. W drugim etapie reakcja zwalnia, gdyż enzym ulega uszkodzeniu, a także traci aktywność. Ponadto wyczerpują się rezerwy nukleotydów i starterów. Na ostatnim etapie – plateau – produkty już się nie kumulują, ponieważ skończyły się odczynniki.

Gdzie jest używany?

Niewątpliwie reakcja łańcuchowa polimerazy jest szeroko stosowana w medycynie i nauce. Znajduje zastosowanie w biologii ogólnej i specjalnej, weterynarii, farmacji, a nawet ekologii. Co więcej, w tym ostatnim robią to w celu monitorowania jakości żywności i obiektów środowiskowych. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest aktywnie wykorzystywana w praktyce sądowej do potwierdzania ojcostwa i identyfikacji tożsamości danej osoby. W medycynie sądowej, a także w paleontologii, technika ta jest często jedynym wyjściem, ponieważ do badań dostępna jest zwykle bardzo mała ilość DNA. Oczywiście metoda znalazła bardzo szerokie zastosowanie w medycynie praktycznej. Jest niezbędna w takich obszarach jak genetyka, choroby zakaźne i choroby onkologiczne.