Immunfluoreszcens reakció, direkt és indirekt módszerek. Alkalmazás. Komplex diagnosztika zátony módszerrel Mi a zátony az orvostudományban

Koons 1942-ben fedezte fel, az immunfluoreszcens reakció nem új kutatási módszer. Azonban a hibridóma technológiák megjelenése, amelyek lehetővé tették a monoklonális antitestek előállítását, „második életet” adott ennek a reakciónak, mivel használatuk lehetővé tette a reakció érzékenységének és specificitásának többszörös növelését.

És ma részletesen elmondjuk Önnek a közvetlen és közvetett immunfluoreszcencia (RIF) reakciót, mint Koons diagnosztikai módszert felnőtt férfiak és nők terhesség alatt.

Mi az immunfluoreszcens reakció?

Az immunfluoreszcens reakció kiváló lehetőséget jelent a pontos diagnózis gyors megszerzésére, lehetővé teszi a betegség kórokozójának jelenlétének meghatározását a kóros anyagban. Erre a célra egy speciálisan FITC-vel (fluoreszcein-izotiocianát) jelölt anyagból készült kenetet használnak, amelyet heterogén elemzésként vizsgálnak.

Az eredmény eléréséhez fluoreszcens mikroszkópot használnak, optikai rendszere fényszűrőket tartalmaz, amelyek adott hullámhosszúságú kék-ibolya vagy ultraibolya fénnyel biztosítják a gyógyszert. Ez a feltétel lehetővé teszi, hogy a fluorokróm egy adott tartományon belül tükröződjön. A kutató értékeli a ragyogás tulajdonságait, karakterét, az objektumok méretét és egymáshoz viszonyított helyzetét.

Kinek írják fel?

Számos vírusos betegség diagnosztizálására immunfluoreszcens reakció írható elő. Különösen egy átfogó vizsgálat során írják elő a következő tényezők azonosítására:

• vírus jelenléte a szervezetben;
• szalmonella fertőzés;
• bizonyos antigének jelenléte a szervezetben;
• azonosítják a szervezet chlamydia, mycoplasma és más mikroorganizmusok fertőzésének valószínűségét, amelyek képesek vírusos betegségeket okozni az emberekben;
• vírusos betegségek diagnosztizálása állatokban.

A felsorolt ​​indikációk lehetővé teszik az immunfluoreszcens reakció alkalmazását különböző természetű vírusos betegségek kimutatására az emberi és állati szervezetben.

Célok

Mivel ez a diagnosztikai módszer számos előnnyel rendelkezik, beleértve a nagy hatékonyságot, a végrehajtás és az eredmények megszerzésének sebességét, valamint a nagyszámú ellenjavallat hiányát, ezért a vírusfertőzések szervezetben való jelenlétének meghatározására használják. Ezért ez az elemzés előírható a diagnózis felállításához és tisztázásához, amely alapján kezelési rendet írnak elő.

Az eljárás nem okoz kényelmetlenséget, elemzéshez szükséges anyag beszerzése, amelyet bármilyen testnedvből vesznek: nyál, köpet, nyálkahártya felületéről származó kaparék. Vér is vehető vizsgálat céljából. Az immunfluoreszcens reakció gyakoriságát a kezelőorvos írja elő, akinek adatokat kell szereznie a szervezetben előforduló folyamatok dinamikájáról.

Mivel ez a teszt nem károsítja sem a testet, sem az ember általános jólétét, szükség szerint előírható.

Az ilyen eljárások típusai

Manapság ennek az elemzésnek számos változatát használják, amelyek mindegyike számos sajátos tulajdonsággal rendelkezik, és lehetővé teszi, hogy a legrészletesebb képet kapja a testben előforduló folyamatokról.

Az immunfluoreszcens reakció típusai a következők:

1. - az egyik leggyorsabban fejlődő diagnosztikai típus, ez az elemzés lehetővé teszi a kvantitatív adatok beszerzését sorozathígítások alkalmazása nélkül. A kapott folyadék optikai sűrűségének mérései segítségével pontosan meghatározható a kívánt komponens koncentrációszintje. Az ilyen típusú elemzések széles lehetőségeit használják fel monoklonális antitestek alkalmazása során, amelyek lehetővé teszik a fertőző folyamat fázisának és súlyosságának meghatározását;
2. DNS diagnosztika- ez a módszer a nukleotidok komplementer megkötésén alapul, amihez olyan folyadékok használhatók, mint a nyál, vér, agy-gerincvelői folyadék, vizelet, köpet, biopsziás minták és vér. Ez a módszer a leghatékonyabban kimutatja a papillomavírusok jelenlétét a szervezetben, azonban számos modern tesztrendszer alkalmanként álpozitív és álnegatív eredményeket ad. Ezeket a specifikus DNS elemzésére szolgáló folyékony minták szennyeződése okozhatja, amelyek jelenléte lehet beágyazott vagy teljes természetű;
3. immunkromatográfia— a kóros környezet és a vírusok szervezetben való jelenlétének meghatározására szolgáló e módszer sajátossága, hogy a reakció során jelölt antitesteket használnak. Ezt a diagnosztikai módszert az A csoportú streptococcusok, valamint a következő típusú chlamydia fertőzési folyamat azonosítására és aktivitási fokára használják: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia from Oxoid. A lehető legnagyobb érzékenységgel rendelkező tesztrendszerek, amelyek ezen a kutatási módszeren alapulnak. általában indikatív tesztként használják.

A felsorolt ​​fajtáknak megvannak a megvalósításuk jellemzői és az eredmények sajátos jellemzői, de mindegyik arra irányul, hogy adatokat szerezzen a kóros mikroorganizmusok és vírusok testben való jelenlétéről, valamint szaporodásuk és aktivitásuk mértékéről.

Használati javallatok

Az immunfluoreszcenciás reakciót fel lehet írni bármilyen típusú kóros környezet azonosítására a szervezetben.

A chlamydia, a Trichomonas, a gonococcusok és a Giardia minden típusa az ilyen típusú diagnózis során kerül meghatározásra. és más betegségek is igényelnek RIF-et. Megvalósításához orvosi előjegyzés szükséges.

Ellenjavallatok a

Mivel ehhez a reakcióhoz bármilyen típusú testfolyadékra van szükség vizsgálati anyagként, ezek bevétele általában nem nehéz, és nincs ellenjavallat az immunfluoreszcens reakció végrehajtására. Terhesség alatt és 6 hónaposnál fiatalabb gyermekeknél azonban a kutatási anyagok összegyűjtése a maximális elővigyázatossággal történik.

Az ellenjavallatok hiánya lehetővé teszi az ilyen típusú diagnózis elvégzését, ha az orvos minden betegnek felírja. Biztonságát fertőtlenített műszerek és eldobható fecskendők használata garantálja.

Az eljárás előkészítése

Az elemzéshez szükséges anyaggyűjtéssel kapcsolatban nincsenek sajátosságok. Ehhez éhgyomorra vesznek vért, hogy ne legyen megnövekedett olyan anyagtartalom benne, amely megváltoztathatja a valós értékeket és hamis képet ad.

Hogyan történik a teszt?

Mivel az analízishez nincs szükség különösebb előkészületre, csak a vizsgálat előtt 12 órával evés és a gyógyszeres kezelés hiánya kizárt, a vizsgálati anyagot a testfolyadék elemzésre történő felvételének szokásos folyamataként vesszük.

Az eljárás során fellépő szubjektív érzések az érzékenységtől függően változhatnak.

Az eredmények dekódolása

A modern tesztrendszerek használata lehetővé teszi a legpontosabb elemzési eredmények elérését. Az eredmény megfejtéséhez a következő adatokat használják:

• a fluoreszcencia intenzitás foka;
• fluoreszcens árnyalat;
• a tárgyi lumineszcencia folyamatának perifériás jellege;
• morfológiai jellemzők, a kórokozó elhelyezkedése a vizsgálati anyag kenetében és mérete.

Nagy objektumok (például Gardenerella, Trichomonas, vírusokkal már fertőzött sejtek) tanulmányozásakor a fenti kritériumok lehetővé teszik a legmegbízhatóbb eredmények elérését. A mycoplasma és a chlamydia elemi testeinek mérete azonban a fluoreszcens mikroszkóp felbontási képességének határán van, ami megnehezíti

Megnehezíti a pontos eredmény elérését, mivel a perifériás izzás veszít intenzitásából. A fennmaradó kritériumok már nem elegendőek a vizsgált mikroorganizmusok pontos azonosításához. Emiatt speciális követelményeket támasztanak az ilyen típusú kutatásokat végző szakemberekkel szemben: képzettségüknek elegendőnek kell lennie a rendelkezésre álló adatokkal való működéshez.

Emiatt csak a megfelelő végzettségű orvos tudja értelmezni a kapott elemzést. Az alábbiakban a RIF módszerrel végzett kutatás áráról olvashat.

átlagköltség

Az immunfluoreszcens reakció ára az egészségügyi intézmény elhelyezkedésétől és szintjétől, valamint az elemzést végző szakember képzettségétől függ. Ma a költségek 1280 és 2160 rubel között mozognak.

Az alábbi videó többet mond az immunológiai reakciókról:

Jelenleg széles körben alkalmazzák a jelölt antigéneket vagy antigéneket magában foglaló szerológiai reakciókat. Ide tartoznak az immunfluoreszcens reakciók, a radioimmun és az enzimes immunológiai vizsgálati módszerek.

Alkalmazzák:

1) fertőző betegségek szerodiagnosztizálására, azaz AT kimutatására ismert konjugált (kémiailag kombinált) antigének segítségével, különféle jelölésekkel (enzimek, fluorokróm festékek);

2) mikroorganizmus vagy szerovariáns meghatározása standard jelölt diagnosztikai antitestekkel (gyorsdiagnosztika).

A szérumokat úgy állítják elő, hogy az állatokat megfelelő antigénekkel immunizálják, majd az immunglobulinokat izolálják és világító festékekkel (fluorokrómokkal), enzimekkel és radioizotópokkal konjugálják.

A jelölt SR-ek specifitásukban nem alacsonyabbak a többi SR-nél, és érzékenységükben felülmúlják az összes SR-t.

Nincsenek hasonló anyagok

Jelölésként világító fluorokróm festékeket (fluoreszcein-izotiocianát stb.) használnak.

A RIF-nek különféle módosításai vannak. A fertőző betegségek expressz diagnosztikájához a Koons RIF-et használják a mikrobák vagy antigénjeik azonosítására a tesztanyagban.

Koons szerint két RIF-módszer létezik: közvetlen és közvetett.

Közvetlen RIF komponensek:

1) a vizsgált anyag (a nasopharynx által kiürített széklet stb.);

2) jelölt specifikus immunszérum, amely AT-la-t tartalmaz a kívánt antigénhez;

3) izotóniás nátrium-klorid oldat.

A vizsgálati anyagból származó kenetet jelölt antiszérummal kezeljük.

Megtörténik az AG-AT reakció. Lumineszcens mikroszkópos vizsgálat során fluoreszcenciát észlelünk azon a területen, ahol az AG-AT komplexek lokalizálódnak.

A közvetett RIF összetevői:

1) a vizsgált anyag;

2) specifikus antiszérum;

3) antiglobulin szérum (AT-la immunglobulin ellen), fluorikrómmal jelölt;

4) Izotóniás nátrium-klorid oldat.

A tesztanyagból származó kenetet először immunszérummal kezeljük a kívánt antigénnel, majd jelölt antiglobulin szérummal.

A lumineszcens AG-AT komplexeket – a jelölt AT-t fluoreszcens mikroszkóppal detektáljuk.

Az indirekt módszer előnye, hogy nem kell sokféle fluoreszcens specifikus szérumot készíteni, hanem csak egy fluoreszcens antiglobulin szérumot használnak.

Létezik egy 4 komponensű közvetett RIF típus is, amikor kiegészítésként (tengerimalac szérum) kerül beadásra. Pozitív reakcióban AG-AT - jelölt - AT-komplement komplex képződik.

A RIF baktériumok, rickettsia és vírusok antigénjeinek és fluoreszcens festékekkel jelölt specifikus antitestekkel (fluoreszcein-izotiocianát, rodamin, B-izoticianát, lisszatin-rodamin B-200, szulfoklorid stb.) kombinációján alapul, amelyek reaktív csoportokkal (szulfoklorid-ciánnal) rendelkeznek. stb.) . Ezek a csoportok az antitestmolekulák szabad aminocsoportjaival egyesülnek, amelyek nem veszítik el specifikus affinitásukat a megfelelő antigénhez, ha fluorokrómmal kezelik. A keletkező AG-AT komplexek fluoreszcens mikroszkóp alatt jól látható, erősen világító szerkezetekké válnak (7. ábra). A RIF képes kimutatni kis mennyiségű bakteriális és vírusantigént. A RIF módszer két változatban használatos: direkt és indirekt módszerrel.

A közvetlen módszer egy antigén és egy jelölt antitest közvetlen kombinációján alapul. Az indirekt módszer az AG-AT komplex fluoreszcens festékek segítségével történő lépésről lépésre történő kimutatásán alapul. Az első szakasz egy specifikus antigén immunkomplexeinek kialakulása specifikus antitestekkel. A második lépés ennek a komplexnek az azonosítása jelzett antigammaglobulinnal történő kezeléssel.

A RIF előnye az egyszerűség, a nagy érzékenység és az eredmények elérésének gyorsasága. A RIF-et influenza, vérhas, malária, pestis, tularémia, szifilisz stb. korai expressz diagnosztizálására használják. Fluoreszcens mikroszkópot használnak az ilyen vizsgálatok elvégzésére.

Radioimmunoassay (RIA)

A RIA az egyik legérzékenyebb immundiagnosztikai módszer. A hepatitis B vírus antigén kimutatására szolgál vírusos hepatitisben szenvedő betegeknél. Ehhez referenciaszérumot (a hepatitis B vírus elleni antitesteket tartalmazó szérumot) adnak a vizsgált szérumhoz. A keveréket 1-2 napig 40 °C-on inkubáljuk, majd referencia antigént (125 J izotóppal jelölt antigént) adunk hozzá, és az inkubálást további 24 órán át folytatjuk. A referencia szérumfehérjék ellen kicsapó antiimmunglobulinokat adunk a kapott antigén-antitest komplexhez, ami csapadék képződéséhez vezet (8. ábra). Az eredményt a számláló által rögzített csapadékban lévő impulzusok jelenléte és száma veszi figyelembe. Ha van a tesztszérumban olyan antigén, amely specifikus antitestekhez kötődött, az utóbbiak nem lépnek kölcsönhatásba a jelölt antigénnel, és ezért nem mutatható ki a csapadékban. Így a RIA a meghatározandó antigén és az ismert mennyiségű jelölt antigén és az antitestek aktív központjai közötti kompetitív kölcsönhatás elvén alapul.

A színpadi technikától függően két RIA módszer létezik.

1) „Folyadékfázisú” technika (klasszikus RIA). Ennek a színpadi technikának a hátránya az igény

a szabad és a kötött jelölt antigének (vagy antitestek) speciális elkülönítése.

2) „Szilárd fázisú” technika.

Az ismert specifitású AG vagy AT a szorbensekhez (szilárd fázis) kötődik - egy polisztirol kút vagy műanyag cső falához. A fennmaradó IC komponenseket szekvenciálisan felszívják az immobilizált AG-ra (AT).

A reakció természetétől függően a következő módszereket különböztetjük meg:

1) Versenyképes módszer – AG-versenyen alapuló módszer.

A reakció összetevői:

a) meghatározott magas vérnyomás (vizsgálati anyag - vér, köpet stb.);

b) a teszt Ag-vel azonos, radioizotóppal jelölt antigén;

c) a szorbenshez kötött, ismert koncentrációjú specifikus AT-k;

d) standard magas vérnyomás (kontroll);

e) pufferoldat.

Először az AG tesztet vezetjük be a reakcióba. A szorbens felületén AG-AT komplex képződik. A szorbenst mossuk, majd jelzett AG-t vezetünk be Minél magasabb a vizsgált AG tartalma, annál kevésbé kötődik a jelölt AG az AT-m-hez a szorbens felületén. A jelzett AG koncentrációját a reakció radioaktivitásának számlálók segítségével történő mérésével határozzuk meg. A reakcióban a radioaktivitás mennyisége fordítottan arányos a vizsgált mintában lévő AG mennyiségével.

2) Nem kompetitív módszer.

A reakció összetevői:

a) kimutatható magas vérnyomás;

b) ismert koncentrációjú specifikus AT-a, társítva

szorbensen;

c) a kötött antitesttel azonos, jelölt antitestek

radioizotóp;

d) standard AG;

e) pufferoldat.

A teszt AG-t hozzáadjuk a megkötött antitestekhez. Az inkubációs folyamat során AG-AT komplexek képződnek a szorbensen. A szorbenst lemossák a szabad komponensekről, és jelölt AT-ket adnak hozzá, amelyek a komplexben lévő AG szabad vegyértékeihez kötődnek. A radioaktivitás mértéke arányos a vizsgált antigén koncentrációjával.

3) „Szendvics módszer” (indirekt módszer) - a leggyakoribb módszer.

Alkatrészek:

a) tesztszérum (vagy tesztantigén);

b) a szorbensre kötött AG-k (vagy az AG-a meghatározásakor a szorbensre kötött AT-la);

c) radioizotópokkal jelölt immunglobulinok elleni diagnosztikai antitestek;

d) kontroll szérumok (vagy AG-k);

e) pufferoldatok.

A tesztelt AT-k (vagy AG-k) reakcióba lépnek a szilárd fázisú AG-kkal (AT-k), majd az inkubátumot eltávolítják, és a reakcióba jelzett antiglobulin Abs-okat vezetnek be, amelyek a szorbens felületén lévő specifikus AG-AT komplexekhez kötődnek. A reakció radioaktivitásának mértéke egyenesen arányos a teszt antitest (vagy AG) mennyiségével.

A RIA előnyei:

1) nagy specifitás és érzékenység;

2) a rendezési technika egyszerűsége;

3) az eredmények mennyiségi értékelésének pontossága;

4) könnyen automatizálható.

Hátránya: radioaktív izotópok használata.

Nincsenek hasonló anyagok (

Enzimhez kötött immunszorbens módszer (ELISA)

A módszert antigének kimutatására használják a megfelelő antitestek felhasználásával, amelyek egy tag enzimhez (torma-peroxidáz, b-galaktóz vagy alkalikus foszfatáz) konjugáltak. Az antigénnek az enzimmel jelölt immunszérummal való egyesítése után szubsztrátot és kromogént adunk a keverékhez. A szubsztrátot az enzim hasítja, és bomlástermékei a kromogén kémiai módosulását okozzák. Ugyanakkor a kromogén megváltoztatja a színét – a szín intenzitása egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával (9. ábra).

A legelterjedtebb a szilárd fázisú ELISA, amelyben az immunreakció egyik komponense (antigén vagy antitest) szilárd hordozón adszorbeálódik. A polisztirol mikropaneleket szilárd hordozóként használják. Az antitestek meghatározásakor a páciens vérszérumát, az enzimmel jelölt antiglobulin szérumot, valamint az enzim- és kromogénszubsztrát oldatok keverékét egymás után hozzáadják a szorbeált antigént tartalmazó üregekhez. Minden alkalommal, amikor újabb komponenst adunk hozzá, a meg nem kötött reagenseket alapos mosással távolítjuk el a lyukakból. Ha az eredmény pozitív, a kromogén oldat színe megváltozik. A szilárd fázisú hordozó nemcsak antigénnel, hanem antitesttel is érzékenyíthető. Ezután a kívánt antigént hozzáadjuk a szorbeált antitestekkel ellátott üregekbe, az enzimmel jelölt antigén elleni immunszérumot, majd az enzim és a kromogén szubsztrát oldatainak keverékét.

Az ELISA a vírusos és bakteriális kórokozók által okozott betegségek diagnosztizálására szolgál, jelölőként enzimeket használnak: peroxidáz, alkalikus foszfatáz stb.

A reakció indikátora az enzimek azon képessége, hogy színreakciót váltanak ki, amikor a megfelelő szubsztrátra hatnak. Például a peroxidáz szubsztrátja ortofenil-diamin oldat.

A legszélesebb körben használt szilárd fázisú ELISA. Az ELISA lényege hasonló a RIA-hoz.

Az ELISA eredmények vizuálisan és az optikai sűrűség spektrofotométeren történő mérésével értékelhetők.

Az ELISA előnyei a következők:

Nincs érintkezés radioaktív anyagokkal;

A reakcióértékelési módszerek egyszerűsége;

A konjugátumok stabilitása;

Könnyen automatizálható.

A RIA-hoz képest azonban a módszer érzékenysége alacsonyabb, de bizonyos esetekben az érzékenység jobb, mint a RIF és a RIM.

Példaként a következő típusú ELISA-t mutatjuk be:

Versenyképes típus.

Célja.

A hepatitis B vírus (HB3Ad) felszíni antigénjének kimutatására szérumban és vérplazmában a vírusos hepatitis B diagnosztizálásában és a HB5Ad hordozásának meghatározására tervezték.

Alkatrészek:

1) a vizsgálati anyag szérum vagy vérplazma;

2) polisztirol mikrolemez üregének felületén adszorbeált HB3 Ad elleni antitestek;

3) konjugátum – peroxidázzal jelölt HB3 Ad elleni egér monoklonális antitestek,

4) ortofenilén-diamin (OPD) szubsztrát;

5) foszfáttal pufferolt sóoldat;

6) kontroll szérum:

Pozitív (HBeAd-ot tartalmazó szérum);

Negatív (szérum HB3 Ad nélkül). Előrehalad

1) Kontroll- és tesztszérum hozzáadása.

2) Inkubálás 1 óra 37 °C-on.

3) A lyukak kimosása.

4) A konjugátum hozzáadása.

5) Inkubálás 1 óra 37 °C-on.

6) A lyukak kimosása.

7) Belépés az OFD-be. HB3 jelenlétében az üregekben lévő oldat sárgává válik.

Az ELISA elszámolást optikai sűrűséggel, fotométerrel végezzük. Az optikai sűrűség mértéke fordítottan arányos a vizsgált NV-k Ad koncentrációjával.

Gépezet

A reakció három fázisban megy végbe:

1) A tesztszérum (plazma) HB3 Ad-ja a lyuk felületén adszorbeált homológ Abs-hoz kötődik. IR AG-AT képződik. (NVz Ad - agl\NVz AT).

2) A peroxidázzal jelölt HB3Ad antitestek az AG-AT HB3Ad komplexének fennmaradó szabad determinánsaihoz kötődnek. Komplex AT-AG-jelölt AT (ap!1 HB3 AT-HB3 Ad-ap(1 HB3 AT, peroxidázzal jelölt) képződik.

3) Az OPD kölcsönhatásba lép (peroxidázzal) az AT-AG-AT komplexszel, és sárga elszíneződés lép fel.

Közvetett típus

Ez a HIV-fertőzés diagnosztizálásának fő tesztreakciója.

Cél: HIV-fertőzés szerológiai diagnosztikája - HIV antigének elleni antitestek kimutatása, Összetevők:

1) vizsgálati anyag - vérszérum;

2) szintetikus

Jelenleg széles körben alkalmazzák a szerológiai reakciókat (SR), amelyekben jelölt antigének vagy antitestek vesznek részt. Ezek közé tartozik az immunfluoreszcens reakció, a radioimmun és enzimes immunoassay módszerek, az immunblot reakció, az áramlási citometria és az elektronmikroszkópia.

Alkalmazzák:

1) fertőző betegségek szerodiagnózisára, azaz antitestek kimutatására ismert konjugált (kémiailag kombinált) antigének készletével, különféle jelölésekkel (enzimek, fluorokróm festékek);

2) mikroorganizmus vagy szerovariáns meghatározása standard jelölt diagnosztikai antitestekkel (gyorsdiagnosztika).

A diagnosztikai szérumokat úgy állítják elő, hogy az állatokat a megfelelő antigénnel immunizálják, majd az immunglobulinokat izolálják és világító festékekkel (fluorokrómokkal), enzimekkel és radioizotópokkal konjugálják.

A diagnosztikai monoklonális antitesteket olyan hibrid sejtek felhasználásával állítják elő, amelyek egy immun B-limfocita mielóma sejttel való fuzionálásával jönnek létre. A hibridómák képesek gyorsan szaporodni in vitro sejttenyészetben, és a felvett B-limfocitára jellemző immunglobulinokat termelni.

A jelölt SR-ek specifitásukban nem alacsonyabbak a többi SR-nél, és érzékenységükben felülmúlják az összes SR-t.

Immunfluoreszcens reakció (RIF)

Jelölésként világító fluorokróm festékeket (fluoreszcein-izotiocianát stb.) használnak.

A RIF-nek különféle módosításai vannak. A fertőző betegségek expressz diagnosztikájához a Koons RIF-et a vizsgált anyagban lévő mikrobák vagy antigénjeik azonosítására használják.

Koons szerint két RIF-módszer létezik: közvetlen és közvetett.

Közvetlen RIF komponensek:

1) vizsgálati anyag (széklet, nasopharyngealis váladék stb.);

2) jelölt specifikus immunszérum, amely a kívánt antigén elleni antitesteket tartalmazza;

3) izotóniás nátrium-klorid oldat.

A vizsgálati anyagból származó kenetet jelölt antiszérummal kezeljük.

Megtörténik az AG-AT reakció. Lumineszcens mikroszkópos vizsgálat során a jelölés fluoreszcenciája az AG-AT komplexek lokalizációjának területén észlelhető (34. ábra).

Alkatrészek Az influenza A gyors diagnosztizálására szánt indirekt RIF:

1) a vizsgálati anyagot kimossák az influenzagyanús beteg orrgaratából;

2) specifikus antiszérum az influenza A vírus elleni antitestekkel;

3) antiglobulin szérum (AT immunglobulin ellen), fluorokrómmal jelölt;

4) izotóniás nátrium-klorid oldat.

A tesztanyagból származó kenetet először immunszérummal kezeljük a kívánt antigénnel, majd jelölt antiglobulin szérummal.

Az AG-AT-vel jelölt AT immunkomplexeket fluoreszcens mikroszkóppal detektáljuk.

Az indirekt módszer előnye, hogy nem kell sokféle fluoreszcens specifikus szérumot készíteni, hanem csak egy fluoreszcens antiglobulin szérumot használnak.

Mert az influenza A szerológiai diagnózisa, vagyis az influenza A vírus elleni antitestek meghatározására a vérszérumban segítségével indirekt RIF használjon influenza diagnosticumot (influenza A vírus antigén). A vírusfertőzések szerodiagnosztizálása elsősorban retrospektív jellegű, és a diagnózis megerősítésére és az epidemiológiai elemzésre szolgál.

Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA): kompetitív módszer (a hepatitis B vírus HBs-AG meghatározása) és indirekt módszer (HIV-fertőzés szerológiai diagnózisa)

Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA)

Jelölőként enzimeket használnak: peroxidáz, alkalikus foszfatáz stb.

A reakció indikátora az enzimek azon képessége, hogy színreakciót váltanak ki, amikor a megfelelő szubsztrátra hatnak. Például a peroxidáz szubsztrátja ortofenil-diamin (OPD) vagy tetrametil-benzidin (TMB) oldata.

A legszélesebb körben alkalmazott szilárdfázisú ELISA (35. ábra), indirekt és kompetitív módszerek (36. ábra).

Az ELISA eredményei vizuálisan és az optikai sűrűség spektrofotométeren (ELISA analizátor) történő mérésével értékelhetők.

Az ELISA előnyei a következők:

A reakcióértékelési módszerek egyszerűsége;

A konjugátumok stabilitása;

Könnyen automatizálható.

Példaként a következő típusú ELISA-t mutatjuk be:

A) versengő típus

A hepatitis B vírus felszíni antigénjének (HBs Ag) kimutatására szérumban és vérplazmában, a vírusos hepatitis B diagnosztizálására és a HBs Ag hordozásának meghatározására.

Alkatrészek:

1) vizsgálati anyag – szérum vagy vérplazma;

2) polisztirol mikrolemez üregének felületén adszorbeált HBs Ag elleni antitestek;

3) konjugátum – peroxidázzal jelölt HBs Ag elleni egér monoklonális antitestek;

4) ortofenilén-diamin (OPD) – szubsztrát;

5) foszfát-sóoldat puffer;

6) kontroll szérum:

Pozitív (szérum HBs Ag-vel);

Negatív (szérum HBs Ag nélkül).

Előrehalad:

2. Inkubálás 1 óra 37 °C-on.

3. A lyukak mosása.

4. A konjugátum hozzáadása.

5. Inkubálás 1 óra 37 °C-on.

6. A lyukak mosása.

7. Belépés az OFD-be. HBs Ag jelenlétében a lyukak oldata sárgává válik.

8. Az ELISA-számlálást optikai sűrűség alapján, fotométerrel végezzük. Az optikai sűrűség mértéke fordítottan arányos a vizsgált Ag HB-k koncentrációjával.

A reakció három fázisban megy végbe:

1. A tesztszérum (plazma) HBs Ag-ja a lyuk felületén adszorbeált homológ antitestekhez kötődik. IR AG-AT képződik. (HBs Ag – anti HBs AT).

2. A peroxidázzal jelölt HBs Ag elleni antitestek az AG-AT komplexben lévő HBs Ag fennmaradó szabad determinánsaihoz kötődnek. AT-AG-vel jelölt AT komplex képződik (anti HBs AT - HBs Ag - peroxidázzal jelölt anti HBs AT).

3. Az OPD kölcsönhatásba lép az AT-AG-AT komplex peroxidázával, és sárga elszíneződés lép fel.

B) közvetett típus

Ez a HIV-fertőzés diagnosztizálásának fő tesztreakciója.

Cél: HIV-fertőzés szerológiai diagnosztikája – HIV-antigének elleni antitestek kimutatása.

Alkatrészek:

1) vizsgálati anyag – vérszérum (AT to HIV Ags);

2) szintetikus peptidek, amelyek 2 HIV antigént imitálnak: gp 120 és gp 41, polisztirol lyuk felületén adszorbeálva;

3) peroxidázzal jelölt antiglobulin szérum, amelyet nyulak humán globulinokkal történő immunizálásával nyernek (AT-tól AT-ig);

5) foszfáttal pufferolt sóoldat;

6) kontroll szérum:

Pozitív;

Negatív.

Előrehalad:

1. Kontroll és tesztszérum hozzáadása.

2. Inkubálás 30 percig 37 °C-on.

3. Mosás.

4. Enzimmel jelölt antiglobulin szérum hozzáadása.

5. Inkubálás 30 percig 37 °C-on.

6. Mosás.

7. Belépés az OFD-be.

A reakció 3 fázisban megy végbe:

1. A tesztszérum HIV-ellenes antitestei homológ antigénekhez (gp 120 és gp 41) kötődnek, és a szorbens felületén IR AG-AT képződik (HIV Ag - AT HIV-hez).

2. Peroxidázzal jelölt IR AG-AT-AT képződése, mert A tesztszérum antitestei az antiglobulin szérum antigénjei.

3. Az OPD kölcsönhatásba lép az AG-AT-AT komplex peroxidázával, és a lyukoldat sárga elszíneződése következik be. Az enzimaktivitás mértéke egyenesen arányos a vizsgált antitestek koncentrációjával.

A reakció azon a tényen alapul, hogy az immunszérumokat fluorokrómokkal (FITC) kezelik, amelyek antitestekkel kombinálódnak. A szérumok nem veszítik el immunspecifitásukat. Amikor a létrejövő lumineszcens szérum kölcsönhatásba lép a megfelelő antigénnel, specifikus lumineszcens komplex képződik, amely lumineszcens mikroszkópban jól látható.

Különféle immunfluoreszcens szérumok használhatók direkt és indirekt immunfluoreszcens módszerekhez. A direkt módszerben minden mikrobához specifikus fluoreszcens immunszérumot készítenek úgy, hogy egy nyulat a kórokozó elölt tenyészetével immunizálnak, majd a nyúl immunszérumot fluorokrómmal (fluoreszcein-izocianát vagy izotiocianát) kombinálják. A módszert gyors diagnosztikára használják bakteriális vagy vírusantigének kimutatására.

Az indirekt módszer diagnosztikai immunrendszer nem fluoreszcens szérum (immunizált nyúlból vagy beteg személytől származó) és fluoreszcens szérum felhasználását foglalja magában, amely a diagnosztikai szérum specifikus globulinjai ellen antitesteket tartalmaz.

Munka 3. sz

Enzim immunoassay (ELISA)

Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatot (ELISA) széles körben használják. Ez azon a tényen alapul, hogy a fehérjék szilárdan adszorbeálódnak például polivinil-kloridból készült lemezeken. A gyakorlatban az egyik legelterjedtebb ELISA-változat azonos specifitású, enzimmel jelölt specifikus antitestek alkalmazásán alapul. Az elemzett antigént tartalmazó oldatot immobilizált antitestekkel együtt adjuk a hordozóhoz. A szilárd fázison történő inkubálás során specifikus antigén-antitest komplexek képződnek. Ezután a hordozót lemossuk a kötetlen komponensekről, és enzimmel jelölt homológ antitesteket adunk hozzá, amelyek a komplexekben lévő antigén szabad vegyértékeihez kötődnek. Másodlagos inkubáció és ezen enzimmel jelölt antitestek feleslegének eltávolítása után meghatározzuk a hordozón kifejtett enzimaktivitást, amelynek értéke arányos a vizsgált antigén kezdeti koncentrációjával.

Az ELISA egy másik változatában a vizsgálandó szérumot az immobilizált antigénhez adják. Inkubálás és a nem kötött komponensek eltávolítása után a specifikus immunkomplexeket enzimmel jelölt antiglobulin antitestek segítségével mutatják ki. Ez a séma az egyik leggyakoribb ELISA-vizsgálat során.

Specifikus vizsgálati anyag - Specifikus antitestek Szubsztrát

antitestek patogén peroxidázzal peroxidázhoz

Tanulmány AGS, címkézett

Szérum peroxidáz szubsztrát számára

Specifikus peroxidáz

Ellenőrzés:

pozitív - peroxidázzal jelölt immunszérum + szubsztrát - 2 lyuk;

negatív - normál szérum + szubsztrát - 2 lyuk.

Treponema pallidum immobilizációs reakció(RIBT). Előfeltétel, hogy a vizsgálat előtt a beteg ne szedjen antibiotikumot, amely toxikus hatást fejt ki a Treponema pallidumra, így nem specifikus immobilizációt okoz.

A RIBT pozitív eredményei körülbelül a szifilisz másodlagos friss periódusának közepétől észlelhetők, és a kezelés után is hosszú ideig fennmaradhatnak. Szükség esetén a módszert alkalmazzák az AT kimutatására a CSF-ben, ezt a vizsgálatot nagy specificitás, de alacsony érzékenység (kb. 40%) jellemzi.

A RIBT kevéssé használható a szifilisz korai formáinak diagnosztizálására az AT-immobilizin késői (a fertőzés pillanatától számított 8-9 hétnél korábban) megjelenése miatt; a módszer álpozitív eredményt adhat, különösen autoimmun patológiás, rosszindulatú betegségekben és cukorbetegeknél. Ezenkívül az RIBT egy meglehetősen összetett, munkaigényes és költséges elemzés, amely magasan képzett személyzetet és vivárium jelenlétét igényel, ezért az utóbbi években csak bizonyos laboratóriumokban alkalmazták. A diagnosztikában az RIBT-t reakcióbíróként alkalmazzák, ha más szerológiai vizsgálatok eredményeiben eltérések vannak, a hamis pozitív eredmények megkülönböztetésére és a szifilisz késői formáinak diagnózisára.

Komplement rögzítési reakció treponemális antigénnel (RSC TA-val) A módszer érzékenysége körülbelül 80%, specificitása 98%. A módszer része volt a szifiliszre vonatkozó standard szerológiai reakciók sorozatának, amelyet a Szovjetunió Egészségügyi Minisztériumának 1985. szeptember 2-i 1161. számú, „A szifilisz szerológiai diagnózisának javításáról szóló rendelete” szabályozott. Jelenleg ennek a reakciónak az alkalmazása, akárcsak a kardiolipin-antigénnel végzett CSC, az egyes laboratóriumokra korlátozódik.

Immunfluoreszcens reakció (RIF). A szifilisz diagnosztizálására a RIF számos módosítását alkalmazzák: RIF-c - AT kimutatására a CSF-ben, RIF-200 (a tesztszérumot 200-szor hígítják a reakció előtt); RIF-abs (RIF abszorpcióval), IgM-RIF-abs (IgM AT meghatározására). Szenzitivitás és specifitás tekintetében a RIF-abs nem marad el a RIBT-től, de ennek a módszernek a megvalósítása sokkal egyszerűbb. A RIF-abs eredményei a fertőzést követő 3. héttől pozitívvá válnak (a chancroid megjelenése előtt vagy azzal egyidejűleg), ez a szifilisz korai diagnózisának módszere. Pozitív kutatási eredményeket gyakran találnak sok évvel a korai szifilisz teljes kezelése után, a késői szifiliszben szenvedő betegeknél pedig évtizedekig.

Javallatok RIF-abs végzésére:

• az NTT pozitív eredményei terhes nőknél a szifiliszre utaló klinikai és anamnesztikus adatok hiányában;
• különböző szomatikus és fertőző betegségekben szenvedők vizsgálata, amelyekben az NTT pozitív eredményeit észlelik;
• szifiliszre jellemző klinikai tünetekkel rendelkező, de negatív NTT-eredményekkel rendelkező személyek vizsgálata;
• a szifilisz korai diagnosztizálása;
• egyes esetekben - a szifilisz elleni kezelés sikerének kritériumaként: a pozitív RIF-abs kezelést követően negatívra váltása 100%-os kritérium a szifilisz gyógyulásához.

Az IgM-RIF-abs az Ig osztályú AT-k külön kimutatására szolgál, ami különösen érdekes a veleszületett szifilisz diagnosztikájában, amikor a gyermek szervezetében szintetizált Treponema AT-ket IgM képviseli, az IgG AT-k pedig anyai eredetűek. A vizsgálat indikációi a következők: veleszületett szifilisz diagnózisa; a korai szifilisz kezelésének eredményeinek értékelése.

A RIF magas érzékenységgel (98,5%) és specificitással (99,6%) rendelkezik a szifilisz szinte minden formájával szemben. A RIF hátrányai: a kutatás automatizálásának és az eredmények rögzítésének lehetetlensége; a fertőzött nyúl heréjéből nyert Treponema pallidum szuszpenzióból jó minőségű antigén előállításának nehézségei; szubjektivitás az eredmények értékelésében.

Passzív hemagglutinációs reakció (RPHA). Az RPGA és RIBT, RIF-abs, CSR, MRP használatával kapott eredmények összehasonlítása az RPGA nagy érzékenységét és specificitását mutatta a szifilisz diagnosztizálásában, ami egybeesett a RIF-abs eredményeivel.

Az RPGA minőségi és kvantitatív változatban is végrehajtható, vannak makro- és mikromódosításaik. A kvantitatív RPGA módszer lehetővé teszi a specifikus treponemális antitestek koncentrációjának becslését a vérben. Az 1:640 és az alatti titerek jellemzőek a korábban szifilisz miatt kezelt betegekre. A magasabb titerek gyakoriak az aktív, kezeletlen fertőzéseknél.

Az RPGA pozitív eredményeit általában 3 héttel a chancre megjelenése után észlelik, majd azoknál a betegeknél, akik sok éve, gyakran élethosszig tartó szifiliszben szenvednek.

Az RPGA érzékenysége primer szifiliszre 76%; 100% másodlagos szifilisz esetén; 97% látens szifilisz esetén; 94% késői szifiliszre. Az RPGA specificitása magasabb, mint a RIF-abs specificitása, 99%.

A szifilisz szerodiagnózisára szolgáló treponemális tesztek között a magas specifitás, érzékenység, könnyű teljesítőképesség és a reagensek szabványosításának aránya miatt az RPGA folyamatosan vezető helyet foglal el a klinikai gyakorlatban a világon.

Az ELISA különleges előnyei a következők: a módszer nagy érzékenysége és specifitása; a reakció beállításának automatizálása; magas fokú szabványosítás; nagyszámú szérumminta vizsgálatának képessége; a mennyiségi elszámolásban és a kapott eredmények objektív dokumentálásában; a különböző osztályok (IgG és IgM) antitreponemális antitestek titerének egyidejű meghatározásának lehetősége egy mintában; alkalmasság a szifilisz korai diagnosztizálására és a veleszületett szifilisz diagnosztizálására; a vérátömlesztési szolgálatban végzett vérvizsgálatok megkönnyítése érdekében; alkalmazhatóság megerősítő specifikus treponemális tesztként. Az ELISA érzékenysége 98-100%, specificitása 96-100%.

Az ELISA hátrányai a következők: alkalmatlanság egyedi minták vizsgálatára; hosszabb ideig az eredmény elérése előtt, és például az ELISA készletek rövidebb eltarthatósági idejét az RPGA-hoz képest.

Immunblot (IB). A szifilisz diagnosztizálásának egyik modern módszere az IB bizonyos Treponema pallidum antitestek elleni IgG vagy IgM antitestek meghatározására.

A módszer nagy érzékenységgel (akár 100%), specificitással (98%) és reprodukálhatósággal (100%) rendelkezik. A vizsgálat lehetővé teszi több T. pallidum antigén elleni antitestek spektrumának egyidejű tanulmányozását, nagy tisztaságú rekombináns és peptid antigének alkalmazásával, amelyek minimálisra csökkentik a nemspecifikus szérum reaktivitást.

Mindez meghatározza annak lehetőségét, hogy nehéz esetekben az IB módszert előnyben részesítsük más treponemális tesztekkel szemben a szifilisz diagnózisának igazolására, különösen a lappangási időszak második felében a szifilisz, a látens veleszületett szifilisz diagnosztizálására a betegség első napjaiban. gyermek élete, a látens szifilisz azonosítására gyenge humorális válaszadású személyeknél, valamint a hamis pozitív eredmények megkülönböztetésére más tesztektől.