A cikk végén lásd
Polimeráz láncreakció (PCR, PCR) Carey Mullis (amerikai tudós) találta fel 1983-ban. Ezt követően a találmányért Nobel-díjat kapott. Jelenleg a PCR diagnosztika az egyik legpontosabb és legérzékenyebb módszer a fertőző betegségek diagnosztizálására.
Polimeráz láncreakció (PCR)- a molekuláris biológia kísérleti módszere, bizonyos nukleinsav-fragmensek (DNS) kis koncentrációjának jelentős növelésére szolgáló módszer egy biológiai anyagban (mintában).
A PCR módszer a DNS egy bizonyos szakaszának ismételt megkettőzésén alapul enzimek segítségével mesterséges körülmények között (in vitro). Ennek eredményeként elegendő mennyiségű DNS keletkezik a vizuális kimutatáshoz. Ebben az esetben csak az a terület kerül másolásra, amely megfelel a meghatározott feltételeknek, és csak akkor, ha az jelen van a vizsgált mintában.
Amellett, hogy egyszerűen növeli a DNS-másolatok számát (ezt a folyamatot amplifikációnak nevezik), a PCR számos egyéb genetikai anyaggal végzett manipulációt tesz lehetővé (mutációk bevezetése, DNS-fragmensek splicingje), és széles körben alkalmazzák például a biológiai és orvosi gyakorlatban. betegségek (örökletes, fertőző) diagnosztizálására, apaság megállapítására, gének klónozására, mutációk bevezetésére, új gének izolálására.

Specifikusság és alkalmazás

PCR lefolytatása

A PCR-hez a legegyszerűbb esetben a következő összetevőkre van szükség:

• Az amplifikálandó DNS szakaszt tartalmazó DNS-templát;
• két, a kívánt fragmens végével komplementer primer;
• hőstabil DNS-polimeráz;
• dezoxinukleotid-trifoszfátok (A, G, C, T);
• a polimeráz működéséhez szükséges Mg2+ ionok;
• pufferelési megoldás.

A PCR-t egy erősítőben hajtják végre - olyan eszközben, amely a kémcsövek időszakos hűtését és melegítését biztosítja, általában legalább 0,1 ° C-os pontossággal. A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Specifikus enzimek hozzáadása növelheti a PCR reakció hozamát.
A reakció előrehaladása

A PCR végrehajtása során általában 20-35 ciklust hajtanak végre, amelyek mindegyike három szakaszból áll. A kettős szálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük, hogy lehetővé tegyük a DNS-szálak elválását. Ezt a szakaszt denaturációnak nevezik – a két lánc közötti hidrogénkötések megsemmisülnek. Néha az első ciklus előtt a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik, hogy a templát és a primerek teljesen denaturálódjanak.
Amikor a szálakat szétválasztjuk, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy lehetővé tegyük a primerek kötődését az egyszálú sablonhoz. Ezt a szakaszt lágyításnak nevezik. A lágyítási hőmérséklet a primerektől függ, és általában 4-5°C-kal az olvadáspontjuk alatt van kiválasztva. Színpadi idő - 0,5 - 2 perc.

A DNS-polimeráz replikálja a templátszálat, a primert primerként használva. Ez a megnyúlás szakasza. A nyúlási hőmérséklet a polimeráztól függ. A gyakran használt polimerázok 72 °C-on a legaktívabbak. Az elongációs idő mind a DNS-polimeráz típusától, mind az amplifikálandó fragmens hosszától függ. A nyúlási időt jellemzően minden ezer bázispáronként egy percnek vesszük. Az összes ciklus lejárta után gyakran a végső megnyújtás egy további szakaszát hajtják végre az összes egyszálú fragmentum elkészítése érdekében. Ez a szakasz 10-15 percig tart.
Kutatási anyag előkészítése és laboratóriumba szállítása

A sikeres elemzéshez fontos, hogy helyesen gyűjtsük össze az anyagot a pácienstől és megfelelően készítsük elő. Ismeretes, hogy a laboratóriumi diagnosztikában a hibák többsége (legfeljebb 70%) a minta-előkészítés szakaszában történik. Az INVITRO laboratóriumban történő vérvételhez jelenleg vákuumrendszereket használnak, amelyek egyrészt minimálisan sértik meg a beteget, másrészt lehetővé teszik az anyag felvételét úgy, hogy az ne érintkezzen. akár a személyzettel, akár a környezettel. Ez elkerüli az anyag szennyeződését (szennyeződését), és biztosítja a PCR elemzés objektivitását.

DNS - dezoxiribonukleinsav - egy biológiai polimer, a kétféle nukleinsav egyike, amelyek biztosítják a tárolást, a nemzedékről nemzedékre történő átvitelt és az élő szervezetek fejlődésének és működésének genetikai programjának végrehajtását. A DNS fő szerepe a sejtekben az RNS és a fehérjék szerkezetére vonatkozó információk hosszú távú tárolása.

Az RNS - ribonukleinsav egy biológiai polimer, kémiai szerkezetében hasonló a DNS-hez. Az RNS-molekula ugyanazokból a monomer egységekből - nukleotidokból - épül fel, mint a DNS. A természetben az RNS általában egyetlen szálként létezik. Egyes vírusokban az RNS a genetikai információ hordozója. A sejtben fontos szerepet játszik a DNS-ből a fehérjébe történő információátvitelben. Az RNS-t DNS-templáton szintetizálják. Ezt a folyamatot transzkripciónak nevezik. A DNS-ben vannak olyan szakaszok, amelyek háromféle RNS szintéziséért felelős információt tartalmaznak, amelyek funkciójukban különböznek egymástól: hírvivő vagy hírvivő RNS (mRNS), riboszómális (rRNS) és transzport (tRNS). Az RNS mindhárom típusa valamilyen módon részt vesz a fehérjeszintézisben. A fehérjeszintézissel kapcsolatos információk azonban csak az mRNS-ben találhatók.

A nukleotidok a nukleinsavmolekulák alapvető ismétlődő egységei, egy nitrogéntartalmú bázis, egy öt szénatomos cukor (pentóz) és egy vagy több foszfátcsoport kémiai vegyületének terméke. A nukleinsavakban jelenlévő nukleotidok egy foszfátcsoportot tartalmaznak. Nevüket a bennük található nitrogénbázis szerint kapják - adenint tartalmazó adenin (A), guanin (G) - guanin, citozin (C) - citozin, timin (T) - timin, uracil (U) - uracil. A DNS 4 típusú nukleotidból áll - A, T, G, C, az RNS-nek is 4 típusa van - A, U, G, C. Az összes DNS nukleotid összetételében a cukor dezoxiribóz, az RNS ribóz. A nukleinsavak képződése során a nukleotidok kötődés útján a molekula cukor-foszfát gerincét képezik, melynek egyik oldalán bázisok találhatók.

A primer egy rövid DNS, amelyet a templátszál replikációjára használnak. A primerek mindegyike komplementer a kétszálú templát egyik láncához, keretezve az amplifikált régió elejét és végét.

Irodalom

1. Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. Per. angolról. - M.: Mir, 2002. - 589 p., illusztráció. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Géntechnológia - Novoszibirszk: Sib. univ. kiadó, 2004. - 496 p.; beteg. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Mesterséges genetikai rendszerek - M .: Nauka, 2005 - 2 kötetben - ISBN 5-02-033278-X

FONTOS!

Az ebben a részben található információkat nem szabad öndiagnózisra vagy önkezelésre használni. Fájdalom vagy a betegség egyéb súlyosbodása esetén csak a kezelőorvos írhat elő diagnosztikai vizsgálatokat. A diagnózis és a megfelelő kezelés érdekében orvoshoz kell fordulni.

A polimeráz láncreakció (PCR) egy nagy pontosságú módszer az örökletes patológiák, fertőzések, vírusos betegségek diagnosztizálásában bármely szakaszban (akut vagy krónikus), valamint - korai stádiumban - a betegség nyilvánvaló megnyilvánulása előtt a kórokozók azonosításával. DNS-ük, RNS-ük alapján, amelyek genetikai anyag, a pácienstől vett mintákban. És ma beszélünk a polimeráz láncreakció (PCR) módszereinek lényegéről, diagnosztikai szakaszairól és elveiről, valamint annak költségeiről.

Mi a polimeráz láncreakció

Az elemzés alapja az amplifikáció (duplázás) - sok másolat létrehozása a DNS egy rövid szakaszából (dezoxiribonukleinsav), amely az emberi genetikai komplexumot képviseli. A vizsgálathoz nagyon kis mennyiségű élettani anyagra van szükség (köpet, széklet, hámkaparék, prosztatalé, vér, sperma, magzatvíz, nyálka, méhlepényszövet, vizelet, nyál, mellhártyafolyadék, agy-gerincvelői folyadék). Ilyenkor például akár egyetlen káros mikroba is kimutatható a beteg urogenitális traktusában.

A PCR technikát (polimeráz láncreakció) K. Mullis amerikai tudós fejlesztette ki, aki 1993-ban Nobel-díjat kapott.

Aktívan használt:

• fertőzések korai diagnosztizálásában, genetikai,;
• igazságügyi orvosszakértői vizsgálat során rendkívül kis mennyiségű DNS jelenlétében kutatás céljából;
• állatgyógyászatban, gyógyszerészetben, biológiában, molekuláris genetikában;
• személy DNS-sel történő azonosítása, apaság igazolása;
• paleontológiában, antropológiában, ökológiában (a termékek minőségének, környezeti tényezők nyomon követésekor).

Ez a videó megmutatja, mi a polimeráz láncreakció:

Kinek van hozzárendelve

A polimeráz láncreakció a fertőző betegségek diagnosztizálásában az egyik legmegbízhatóbb módszer a nagy pontossággal és megbízhatósággal. Például a chlamydia és sok más kórokozó PCR-analízisének megbízhatósága megközelíti a 100%-ot (abszolút). Leggyakrabban a polimeráz láncreakciós eljárást olyan betegek számára írják fel, akiknek a diagnózis során nehézségeik vannak egy adott kórokozó azonosításában.

Laboratóriumi PCR tesztet használnak:

• a húgyúti és a nemi szervek fertőzését okozó kórokozók kimutatására, amelyeket terméssel vagy immunológiai módszerekkel nehéz azonosítani;
• a HIV újbóli diagnosztizálására a kezdeti stádiumban, ha a kezdeti elemzés pozitív, de megkérdőjelezhető eredménye (például AIDS-szel fertőzött szülőktől származó újszülötteknél);
• onkológiai betegség korai szakaszában történő megállapítása (onkogén mutációk vizsgálata) és a kezelési rend egyéni korrekciója egy adott beteg számára;
• örökletes patológiák korai felismerése és lehetséges kezelése céljából.

Tehát a jövőbeli szülőket tesztelik, hogy kiderüljön, genetikai patológia hordozói-e; gyermekeknél a PCR meghatározza az örökletes betegségnek való kitettség valószínűségét.

• a magzati patológiák kimutatására a terhesség korai szakaszában (a növekvő embrió egyes sejtjeit megvizsgálják esetleges mutációk szempontjából);
• betegeknél szervátültetés előtt - "szövettipizáláshoz" (szöveti kompatibilitás meghatározása);
• veszélyes patogén organizmusok kimutatására az adományozott vérben;
• újszülötteknél - látens fertőzések kimutatására;
• az antivirális és antimikrobiális kezelés eredményeinek értékelésére.

Miért kell végigmenni ezen az eljáráson?

Mivel a PCR egy rendkívül hatékony diagnosztikai módszer, amely közel 100%-os eredményt ad, az eljárást alkalmazzák:

• a végső diagnózis megerősítésére vagy kizárására;
• a terápia hatékonyságának gyors felmérése.

Sok esetben a PCR az egyetlen lehetséges vizsgálat egy kialakuló betegség kimutatására, ha más bakteriológiai, immunológiai és virológiai diagnosztikai módszerek haszontalanok.

• A vírusokat PCR-rel kimutatják közvetlenül a fertőzés után, még mielőtt a betegség jelei megjelennének. A vírus korai felismerése lehetővé teszi a gyors kezelést.
• Az úgynevezett „vírusterhelést” (vagy a vírusok számát a szervezetben) szintén kvantitatív DNS-elemzés határozza meg.
• A specifikus kórokozók (például a Koch-tubercle bacillus) nehézkesek, és túl sokáig tart a tenyésztés. A PCR elemzés lehetővé teszi, hogy gyorsan azonosítsa a kórokozók minimális számát (élő és elhalt) a mintákban, amelyek alkalmasak a kutatáshoz.

Részletes patogén DNS-elemzést alkalmaznak:

• meghatározott típusú antibiotikumokkal szembeni érzékenységének meghatározása, amely lehetővé teszi a kezelés azonnali megkezdését;
• a járványok terjedésének visszaszorítása a házi-, vadon élő állatok körében;
• új fertőző mikrobiális fajok és kórokozó-altípusok azonosítása és monitorozása, amelyek a korábbi járványokat táplálták.

A diagnosztika típusai

Szabványos módszer

A polimeráz láncreakció elemzését egy specifikus DNS- és RNS-fragmens többszöri amplifikációja (duplázása) alapján végezzük speciális primer enzimek segítségével. A másolási lánc eredményeként a kutatáshoz elegendő mennyiségű anyagot kapunk.

Az eljárás során csak a kívánt fragmentum másolása történik meg (a meghatározott specifikus feltételeknek megfelelően), még akkor is, ha az ténylegesen jelen van a mintában.

Ez a részletes videó hasznos diagramokkal bemutatja a PCR működését:

Egyéb módszerek

• Valós idejű PCR. Az ilyen típusú vizsgálatokban egy adott DNS-fragmens azonosításának folyamata minden ciklus után kezdődik, és nem a teljes 30-40 ciklusból álló lánc befejezése után. Ez a fajta vizsgálat lehetővé teszi, hogy információt szerezzen a kórokozó (vírus vagy mikroba) mennyiségéről a szervezetben, azaz mennyiségi elemzést végezzen.
• RT-PCR (fordított transzkripciós mód). Ezt a vizsgálatot az egyszálú RNS megtalálására használják olyan vírusok kimutatására, amelyek genetikai alapja RNS (például hepatitis C vírus, immunhiányos vírus). Egy ilyen vizsgálat során egy speciális enzimet használnak - reverz transzkriptázt és egy bizonyos primert, valamint az egyszálú DNS-t RNS alapján építik fel. Ezután ebből a szálból egy második DNS-szálat állítunk vissza, és végrehajtjuk a standard eljárást.

A tartás jelzései

A PCR eljárást a fertőző betegségek, neonatológia, szülészet, gyermekgyógyászat, urológia, nőgyógyászat, venerológia, neurológia, nefrológia, szemészet klinikáján alkalmazzák.

Jelzések az elemzés céljára:

• a genetikai rendellenességek kialakulásának kockázatának tisztázása az örökletes patológiák valószínűségével rendelkező gyermekeknél;
• mindkét szülő diagnosztizálása terhesség tervezésekor vagy az anya súlyos állapota folyamatban lévő terhesség alatt;
• a fogamzás nehézségei, a meddőség okainak azonosítása;
• szexuális fertőzések gyanúja akut stádiumban és krónikussá válásuk tüneteivel;
• tisztázatlan eredetű gyulladásos folyamatok okainak feltárása;
• védekezés nélküli alkalmi és állandó szexuális kapcsolatok;
• a patogén mikroorganizmus specifikus antibiotikumokkal szembeni érzékenységének meghatározása;
• lappangó fertőzés gyanúja esetén a kórokozók kimutatása a nyilvánvaló tünetek kialakulása előtt (preklinikai diagnózis);
• betegek a betegség utáni felépülés megerősítésére (retrospektív diagnózis);

A diagnosztikát akkor is alkalmazzák, ha szükséges a következő kórokozók pontos azonosítása:

• hepatitis vírusok (A B C G), humán immunhiány, citomegalovírus;
• vibrio kolera;
• herpes simplex vírus, herpetiform fajok;
• retro - adeno - és rhinovírusok;
• rubeola vírusok, Epstein-Barr, varicella (Zoster - vírus);
• parvo és picornavírusok;
• Helicobacter pylori baktérium;
• legionella, az Escherichia coli patogén típusai;
• staphylococcus aureus;
• kórokozó;
• Clostridia, diftéria és Haemophilus influenzae;

A fertőzések meghatározására is használják:

• Fertőző mononukleózis;
• borreliosis, listeriosis, kullancs által terjesztett agyvelőgyulladás;
• Candida gombák által okozott candidiasis;
• szexuális fertőzések - trichomoniasis, ureaplasmosis, sápadt treponema, gardnerellosis, gonorrhoea, mycoplasmosis, chlamydia;
• tuberkulózis.

A tartás ellenjavallatai

Mivel a beavatkozást nem a pácienssel, szervezetre gyakorolt ​​hatás nélkül, hanem kutatásra vett biológiai anyaggal végezzük, a potenciális veszély hiánya miatt a PCR-re nincs ellenjavallat.

A méh nyaki csatornájából azonban bioanyag-mintavételre a kolposzkópia után nem kerül sor. A kenetek, kaparók elemzésre történő szállítása csak a menstruáció vége és a váladékozás teljes megszűnése után 4-6 nappal megengedett.

Biztonságos-e a módszer

A bioanyagának laboratóriumi izolált vizsgálata során nincs negatív hatás a páciensre.

Felkészülés az eljárásra (biológiai anyagok elemzésre történő szállítása)

PCR-elemzés mintájaként, amelyben idegen kórokozó DNS-ét mutatják ki, bármilyen biológiai folyadékot, szövetet, testváladékot használnak. A vizsgált anyag mintavételét vénából, a gégeből, az orrüregből, a húgycsőből, a mellhártya üregéből, a méhnyakból történő kaparással végzik.

A diagnosztikai eljárás előtt az orvos elmagyarázza a páciensnek, hogy milyen anyagot kell venni:

1. A nemi fertőzések vizsgálatakor a nemi szervek váladékát, vizeletet és a húgycsőből kenetet vesznek.
2. Herpetikus fertőzések, citomegalovírus, mononukleózis elemzésekor - vizeletet, torokkenetet vesznek az elemzéshez, hepatitis, toxoplazmózis - vért vesznek a vénából.
3. A különböző típusok diagnosztizálására liquort vesznek.
4. A pulmonológiában az elemzésre szolgáló minták a köpet és a pleurális folyadék.
5. A terhesség alatti lehetséges méhen belüli fertőzések vizsgálatakor magzatvíz és placenta sejteket használnak az elemzéshez.

Az elemzés megbízhatósága és pontossága az anyagfelvétel körülményeinek sterilitásától függ. Mivel a PCR-teszt nagyon érzékeny, a vizsgált anyag bármilyen szennyeződése torzíthatja az eredményt.

A bioanyag bejuttatásának szakszerű előkészítése nem jelent nehézséget a betegek számára. Vannak bizonyos ajánlások:

• a szexuális fertőzések elemzésekor:
  • zárja ki az intim érintkezést 72 órával az anyag átadása előtt;
  • hagyja abba a hüvelyi termékek használatát 3 napig;
  • az előző nap este óta ne végezzen higiéniát a vizsgált területen;
  • kizárja a vizelést 3-4 órán keresztül, amikor mintát vesz a húgycsőből;
• hagyja abba az antibiotikumok szedését egy hónappal a fertőzések vizsgálata előtt;
• vért adni reggel étkezés és ivás előtt;
• az első reggeli vizeletadag összegyűjtése steril edényben történik alapos intim WC után.

Tudjon meg többet arról, hogyan történik a diagnosztika a polimeráz láncreakciós módszerrel.

Milyen az eljárás

Amikor újra és újra PCR-vizsgálatot végeznek a reaktorban (erősítőben vagy hőciklusban), bizonyos ciklusok megismétlődnek:

1. Az első lépés a denaturáció. A nyálat, vért, biopsziát, nőgyógyászati ​​mintákat, köpetet, amelyben a kórokozó DNS-ének (vagy RNS-ének) jelenlétére gyanakszik, erősítőbe helyezik, ahol az anyagot felmelegítik és a DNS-t két külön láncra hasítják.
2. A második lépés az anyag lágyítása vagy enyhe hűtése.és olyan primereket adunk hozzá, amelyek képesek felismerni a kívánt szakaszokat a DNS-molekulában és kötődni hozzájuk.
3. A harmadik lépés a nyúlás- minden DNS-szálhoz 2 primer hozzáadása után következik be. A folyamat során elkészül a kórokozó DNS-fragmentuma, ennek másolata keletkezik.

Ezek a ciklusok „láncreakcióként” ismétlődnek, és minden alkalommal egy adott DNS-fragmens másolatának megkétszereződéséhez vezetnek (például egy olyan szegmenshez, amelybe egy bizonyos vírus be van programozva). Néhány óra alatt sok kópia keletkezik a DNS-fragmensből, és kimutatható a jelenlétük a mintában. Ezt követően az eredményeket elemzik és összehasonlítják a különböző típusú kórokozók adatbázisával, hogy meghatározzák a fertőzés típusát.

Az eredmények értelmezéséről és a PCR reakció alapján levont következtetésről az alábbiakban olvashat.

Az eredmények megfejtése

A vizsgálat végeredményét a biológiai anyag leadása után 1-2 nappal adják ki. Gyakran - már az elemzést követő első napon.

Kvalitatív elemzés

• Negatív az eredmény azt jelenti, hogy a kutatásra benyújtott anyagban nem találtak fertőző ágensek nyomait.
• Pozitív az eredmény a kórokozó vírusok vagy baktériumok biológiai mintában a benyújtás időpontjában történő nagyon nagy pontosságú kimutatását jelenti.

Ha az eredmény pozitív, de nincs jele a fertőzés aktiválódásának, akkor ezt a testállapotot tünetmentes „egészséges hordozásnak” nevezik. Leggyakrabban a bioanyag egy bizonyos helyről (nyaki csatornából, húgycsőből, szájüregből) történő felvételekor figyelhető meg vírusos betegségekben. Kezelés ebben az esetben nem szükséges, de állandó orvosi felügyelet szükséges, mivel lehetőség van:

• a vírus terjedése a hordozóktól és az egészséges emberek fertőzése;
• a folyamat aktiválása és a betegség krónikus formába való átmenete.

Ha azonban a vérvizsgálat pozitív, az azt jelzi, hogy a fertőzés érintette a szervezetet, és ez már nem hordozó állapot, hanem azonnali specifikus terápiát igénylő patológia.

Mennyiségi elemzés

A mennyiségi eredményt a szakember határozza meg kifejezetten egy adott fertőzéstípusra. Ennek alapján felmérhető a fejlettség foka, a betegség stádiuma, ami lehetővé teszi a megfelelő kezelés azonnali előírását.

átlagköltség

A polimeráz láncreakció lebonyolításának árait a következők határozzák meg: a vizsgálat típusa, a kórokozó azonosításának összetettsége, a biológiai anyag gyűjtésének nehézsége, az elemzés típusa (kvalitatív vagy kvantitatív), a laboratóriumi árszint.

Másrészt a PCR vizsgálata során egy-egy anyag elemzésre vételével egyszerre több kórokozó is kimutatható. Ez megtakarítja a többi laboratóriumi vizsgálatot.

Hozzávetőlegesen a PCR-elemzés költsége rubelben:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis - 180-tól
• chlamydia trachomatis - 190-től
• papillomavírus - 380-500
• az urogenitális traktus biocenózisa nőknél (a mikroflóra mennyiségi és minőségi értékelése) - 800-tól.

A PCR-vizsgálattal kapcsolatos további hasznos információkért lásd az alábbi videót:

Bakteriális genetika. Információk a második leckéhez.

polimeráz láncreakció

A polimeráz láncreakció olyan módszer, amely lehetővé teszi bizonyos DNS-molekulák számának többszörös növelését (amplifikációját) az elemzett mintában (beleértve a biológiai anyagot vagy a tiszta tenyészetet is).

A PCR, mint mikrobiológiai diagnosztikai módszer fő előnye a nagyon magas érzékenység, amely lehetővé teszi a kórokozók rendkívül alacsony koncentrációjának kimutatását a mintákban, valamint az állítható specificitás, amely lehetővé teszi a kórokozók kimutatását vagy azonosítását a generikus fajoknál. , vagy alfaj szinten. A PCR fő hátránya a rendkívül nagy érzékenységéből adódik – a képek nagyon könnyen szennyezhetik a pozitív kontrollból, másik mintából vagy PCR-termékből származó DNS-t, ami hamis pozitív reakcióhoz vezet. Ez szigorú korlátozásokat ír elő a PCR-nek a kész PCR-termékekkel való keverésének és feldolgozásának körülményeire vonatkozóan.

PCR lefolytatása. A következő komponenseket tartalmazó reakcióelegyet készítünk:

izolált DNS a vizsgálati mintából,

pufferelési megoldás,

Mg2+ ionok (az enzim működéséhez szükségesek),

Két primer egyszálú rövid DNS-molekula (leggyakrabban 18-24 nukleotid hosszúságú), amelyek komplementerek a kimutatandó DNS-szekvencia különböző szálainak végeihez.

Dezoxinukleotid-trifoszfátok keveréke.

Hőálló DNS-polimeráz (a leggyakrabban használt Taq polimeráz, egy polimeráz, amelyből izolált Thermus aquaticus).

Ezután ezt a reakcióelegyet a ciklusba helyezzük, ami valójában egy programozható termosztát. A ciklusban 30-40 hőmérséklet-változási ciklust hajtanak végre. Ezen ciklusok mindegyike három szakaszból áll (lásd 1. ábra):

Denaturáció (hőmérséklet 94 ° C) - a hidrogénláncok megszakadnak, és a DNS-láncok eltérnek.

Primer annealing (a hőmérséklet általában 50-60 ° C körül van) - a primerek a DNS-láncok végeihez kapcsolódnak. Általánosságban elmondható, hogy a hőmérséklet csökkentésével energetikailag kedvezőbb az eredeti DNS-szálak újraegyesítése a vizsgált mintából (renaturáció), azonban a primerek koncentrációja a reakcióelegyben sok nagyságrenddel magasabb, mint a DNS koncentrációja. a mintából (legalábbis a kezdeti PCR ciklusokban), így a primer annealing reakció gyorsabban megy végbe, mint a renaturáció.DNS. A lágyítási hőmérsékletet a primerek olvadási (denaturációs) hőmérsékletétől függően választjuk meg.

Megnyúlás (a hőmérséklet általában 72 ° C) - a DNS-polimeráz kiegészíti a primereket a hosszú DNS-láncok templátja mentén. A hőmérséklet megfelel az alkalmazott DNS-polimeráz optimális működési hőmérsékletének.

Az eredmények kimutatása a különböző PCR-készítményekben eltérő, és a „PCR-változatok” című részben ismertetjük.

A PCR dinamikája

A korai PCR-ciklusokban a kettős szálú DNS-molekulák száma, amelyek méretét a primer helyek közötti távolság határozza meg, minden ciklussal megduplázódik. Kis számú hosszabb DNS-molekula is keletkezik, ami elhanyagolható (lásd 2. ábra).

Így a korai ciklusokban a PCR termék mennyiségét az m*2 n képlet írja le, ahol m a kívánt DNS kezdeti mennyisége a mintában, n a ciklusok száma. Ezután a reakció elér egy platót. Ennek oka a reakciótermék felhalmozódása, a primerek és a dezoxinukleotid-trifoszfátok koncentrációjának csökkenése, valamint a pirofoszfát koncentrációjának növekedése (lásd 3. ábra).

A PCR fajtái

Hagyományos PCR

A PCR beállításnak ebben a változatában a reakció előre meghatározott számú cikluson keresztül (30-40) folytatódik, majd megvizsgálják, hogy a reakcióelegyben megtörtént-e a kétszálú DNS-molekulák felhalmozódása.

A PCR ezen változata, ha diagnosztikai módszerként alkalmazzák, kvalitatív módszer. A pozitív reakció azt jelzi, hogy a mintában legalább nyomokban jelen van a kívánt DNS-molekula. A negatív reakció hiányukat jelzi. A mintában lévő kiindulási DNS-molekulák tartalmának kvantitatív értékelése lehetetlen, mivel a reakció egy platót ér el.

A termék jelenlétének kimutatásának fő módszere az elektroforézis agarózban vagy poliakrilamid gélben. A PCR-termékeket a gélben elektromos tér hatására molekulatömegük szerint választják el. A gélhez interkaláló festéket adnak (a kétszálú DNS-hez kapcsolódó állapotban fluoreszkál - leggyakrabban etidium-bromid). Így ultraibolya fénynek kitéve látható lesz a kívánt molekulatömegű DNS-nek megfelelő csík jelenléte vagy hiánya. Diagnosztikai célú PCR végzésekor mindig pozitív és negatív reakciókontrollokat helyezünk el, amelyekkel összehasonlítjuk a mintákat (lásd 4. ábra).

valós idejű PCR

A PCR-elrendezés ezen változatában a reakció során folyamatosan rögzítjük a reakcióelegyben lévő PCR-termék mennyiségét. Ez lehetővé teszi egy reakciógörbe felépítését (lásd 3. ábra), és ennek alapján kiszámítja a kívánt DNS-molekulák számát a mintákban.

A valós idejű PCR egyik típusa egy interkaláló festéket használ, amelyet közvetlenül adnak a reakcióelegyhez (a SYBRGreen a leggyakrabban). Egy másik típus a fluoreszcens próbák egyik típusa, amely a PCR-terméken belüli helyhez kötődik, ami lehetővé teszi a detektálás specifitásának növelését (lásd 5. ábra) A fluoreszcencia detektálás közvetlenül a készülékben történik a reakció során.

A kvantitatív kimutatás lehetőségén túl a valós idejű PCR-nek további előnyei is vannak a hagyományos PCR-hez képest. Ez a PCR-változat egyszerűbb, gyorsabb, és nem igényli a csöveket PCR-termékekkel, ami csökkenti más minták szennyeződésének lehetőségét. A fő hátrány a beépített fluoreszcencia-detektáló képességgel rendelkező erősítő magasabb költsége a hagyományoshoz képest.

Digitális kvantitatív PCR

A PCR új, drága és még mindig nem elterjedt változata, amely lehetővé teszi a mintában lévő DNS mennyiségének pontosabb meghatározását, ebben a változatban a fluoreszcens festéket tartalmazó reakcióelegyet hatalmas számú mikroszkopikus térfogatra osztják (pl. , cseppek emulzióban). A PCR után elemezzük, hogy a cseppek hányadában bizonyult pozitívnak a reakció, és ennek megfelelően figyelhető meg a fluoreszcencia. Ez az arány arányos lesz a mintában található érdekes DNS-molekulák számával.

reverz transzkripciós PCR

Ebben az esetben egy vagy másik PCR-változat előtt reverz transzkripciós reakciót (RNS-t DNS-vé) hajtanak végre a reverz enzim segítségével. Így ez a módszer lehetővé teszi az RNS-molekulák kvalitatív vagy kvantitatív kimutatását. Ez felhasználható RNS-tartalmú vírusok kimutatására, vagy egy adott gén transzkripciójának (mRNS mennyiségének) meghatározására.

1. kép PCR lépések. Az alapozók pirossal vannak jelölve.

2. ábra. Primer-limitált kétszálú DNS-molekulák felhalmozódása a PCR során.

3. ábra A PCR reakció dinamikája a kívánt DNS-molekulák különböző kezdeti koncentrációinál a mintában. (a) - a legmagasabb koncentráció (b) - közepes koncentráció (c) - a legalacsonyabb koncentráció

4. ábra PCR termékek agaróz elektroforézise. K+ - pozitív kontroll (nyilvánvalóan jelen van a szükséges DNS). 1-7 - vizsgálati minták (ebből 1-2 pozitív, 3-7 negatív). K- -negatív kontroll (határozottan hiányzik a kívánt DNS). Sok esetben a célterméken kívül könnyebb, nem specifikus reakciótermékek (primer-dimerek) is láthatók.

5. ábra Kimutatási módszerek valós idejű PCR segítségével. (a) - interkaláló festék - fluoreszkál, ha kettős szálú DNS-hez kötődik (b) - Taqman próba - fluoreszcencia akkor következik be, amikor a próbát 5'-3' endonukleáz aktivitású DNS polimeráz hasítja a fluorofor és a kioltó elválasztása miatt. (c) MolecularBeacon próba - fluoreszcencia akkor következik be, amikor a próba hibridizálódik a célfragmenssel a fluorofor és a kioltó térbeli elválasztása miatt (d) - LightCycler próbák - akceptor fluoreszcencia akkor következik be, amikor a szondák (akceptort és donort tartalmaznak) hibridizálnak a célponttal fragmentum a rezonáns fluoreszcens energiatranszfer (FRET) következtében.

Polimeráz láncreakció (PCR)

A PCR módszer lényege. DNS polimeráz

A polimeráz láncreakció a molekuláris biológia kísérleti módszere, amely lehetővé teszi bizonyos nukleinsavfragmensek kis koncentrációjának jelentős növekedését a biológiai anyagokban. A DNS másolatok számának növelésének ezt a folyamatát ún erősítés. A PCR során a DNS-másolást egy speciális enzim végzi - polimeráz. A DNS polimeráz (3. ábra) a DNS replikációjában (élő szervezetekben a DNS amplifikációjában) részt vevő enzim. Az ebbe az osztályba tartozó enzimek katalizálják a dezoxiribonukleotidok polimerizációját a DNS-nukleotid lánc mentén, amelyet az enzim "beolvas" és templátként használ. Az új nukleotid típusát az a templáttal való komplementaritás elve határozza meg, amelyből a leolvasás történik.

A DNS-polimeráz szabad nukleotidokat ad az összeállított lánc 3 "végéhez. Ez a lánc 5"-3 irányú megnyúlásához vezet. Az ismert DNS-polimerázok egyike sem képes "a semmiből" láncot létrehozni: csak a már meglévő 3"-hidroxilcsoporthoz képes nukleotidokat adni. Emiatt a DNS-polimeráznak szüksége van alapozó- egy rövid nukleotidszekvencia (általában 20-25), amely komplementer a vizsgált gén terminális szakaszaival - amelyhez hozzáadhatta az első nukleotidot. A primerek mindig DNS- és RNS-bázisokból állnak, az első két bázis mindig RNS-bázis. A primereket egy másik enzim szintetizálja - prímás. Egy másik enzim az helicase- szükséges a DNS kettős hélix feltekercseléséhez egyszálú szerkezet kialakításával, amely biztosítja mindkét szál replikációját a DNS-replikáció félkonzervatív modelljének megfelelően.

Egyes DNS-polimerázok arra is képesek, hogy kijavítsák az újonnan összeállított DNS-szál hibáit. Ha nem megfelelő nukleotidpárt észlelünk, a DNS-polimeráz egy lépést visszagördít, eltávolítja a rossz nukleotidot a láncból, majd beilleszti a megfelelő nukleotidot a helyére, majd a replikáció a szokásos módon folytatódik.

PCR lefolytatása

A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan DNS-amplifikációs módszer, amely néhány órán belül több milliárdszor képes izolálni és megsokszorozni egy bizonyos DNS-szekvenciát. A genom egy szigorúan meghatározott régiójának hatalmas számú másolatának beszerzése nagyban leegyszerűsíti a meglévő DNS-minta vizsgálatát.

A polimeráz láncreakció lejátszódásához számos feltételnek kell teljesülnie. A PCR-hez a legegyszerűbb esetben a következő összetevőkre van szükség:

Az amplifikálandó DNS szakaszt tartalmazó DNS-templát.

Két primer komplementer a kívánt fragmens végeihez. (Egy mesterségesen szintetizált oligonukleotid pár, általában 15-30 bp méretű, azonos a cél DNS megfelelő régióival. Ezek kulcsszerepet játszanak az amplifikációs reakciótermékek képződésében. A megfelelően kiválasztott primerek biztosítják a teszt specificitását és szenzitivitását rendszer.)

Hőstabil DNS polimeráz. A PCR-ben használt polimeráznak magas hőmérsékleten hosszú ideig aktívnak kell maradnia, ezért termofilekből izolált enzimeket - Thermus aquaticus (Taq polimeráz) és másokat - használnak.

Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

A polimeráz működéséhez szükséges Mg 2+ ionok.

Pufferoldat, amely biztosítja a szükséges reakciókörülményeket - pH, az oldat ionerőssége. Sókat, szérumalbumint tartalmaz.

A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Ha fűtött tetővel ellátott készüléket használ, ez nem szükséges.

Pirofoszfatáz hozzáadása növelheti a PCR reakció hozamát. Ez az enzim katalizálja a pirofoszfát hidrolízisét, amely a nukleotid-trifoszfátok növekvő DNS-szálhoz való hozzáadásának mellékterméke, az ortofoszfáttá. A pirofoszfát gátolhatja a PCR-reakciót.

Az eredeti DNS másolatainak számának megsokszorozásához ciklikus reakcióra van szükség. Általános szabály, hogy a szekvenciálisan ismételt PCR-ciklusok mindegyike három szakaszból áll:

1. A DNS denaturációja vagy „olvadása”. A kettős szálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük, hogy lehetővé tegyük a DNS-szálak elválását. Ezt a lépést denaturációnak nevezik, mivel a DNS két szála közötti hidrogénkötések megszakadnak. Néha az első ciklus előtt (a polimeráz hozzáadása előtt) a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik, hogy a templát és a primerek teljesen denaturálódjanak. Ezt a megközelítést ún melegindítás, lehetővé teszi a nem specifikus reakciótermékek mennyiségének csökkentését.

2. Annealing – primerek kötődése templát DNS-hez. Miután a szálak elváltak, a hőmérsékletet lassan csökkentjük, hogy lehetővé tegyük a primerek megkötődését az egyszálú sablonhoz. A lágyítási hőmérséklet az alapozó összetételétől függ, és általában 50-65 °C-ra választják. Színpadi idő - 20-60 másodperc. Az illesztési hőmérséklet helytelen megválasztása vagy a primerek gyengén kötődik a templáthoz (emelt hőmérsékleten), vagy rossz helyen kötődik, és nem specifikus termékek jelennek meg (alacsony hőmérsékleten).

3. Szintézis (lánc megnyúlás). A DNS-polimeráz replikálja a templátszálat, a primert "magként" használva. A polimeráz a primer 3"-os végétől kezdi meg a második szál szintézisét, amely a templáthoz kötődött és a templát mentén mozog. Az elongációs hőmérséklet a polimeráztól függ. Az általánosan használt Taq és Pfu polimerázok 72 °C-on a legaktívabbak °C az amplifikálandó fragmentum hossza Tipikusan az elongációs időt minden ezer bázispáronként egy percnek tekintik. Az összes ciklus befejezése után gyakran egy további lépést is végrehajtanak. végső nyúlás hogy elkészüljön az összes egyszálú töredék. Ez a szakasz 7-10 percig tart.

Ezt követően a denaturáció, a lágyítás és a megnyújtás szakaszai sokszor (30 vagy több alkalommal) megismétlődnek. Minden ciklusban megduplázódik a DNS-fragmens szintetizált másolatainak száma.

Minden reakciót termosztátba merített kémcsövekben hajtanak végre. A hőmérsékleti rendszer megváltoztatása és karbantartása automatikusan megtörténik.

Ahhoz, hogy pontosan megértsük, hogyan megy végbe egy bizonyos DNS-szegmens amplifikációja a PCR során, világosan meg kell értenünk az összes primer és azok komplementer szekvenciáinak helyzetét az amplifikálható láncokban minden körben. Az első körben az újonnan szintetizált láncok mindegyike sokkal hosszabb, mint a távolság a primer 3"-hidroxilcsoportjától a második primerrel komplementer szekvencia terminális nukleotidjáig. Az ilyen láncokat "hosszú templátoknak" nevezik. rajtuk megy végbe a további szintézis.

A második körben a hasonló és újonnan szintetizált (hosszú templát) szálakból álló kettős szálú DNS-t ismét denaturálják, majd primerekkel összekapcsolják. A szintézis során ebben a körben ismét "hosszú templátok" szintetizálódnak, valamint számos olyan szál, amelyek egyik végén egy primer, a másik végén pedig a második primerrel komplementer szekvencia ("rövid templátok"). A harmadik körben az összes korábban kialakult heteroduplex egyidejűleg denaturálódik és primerekkel lágyul, majd replikálódik. A következő körökben egyre több a "rövid mátrix", és a 30. fordulóra számuk már 10 6-szor nagyobb, mint a kezdeti láncok vagy "hosszú mátrixok".

A specifikus reakciótermék mennyisége (amelyet a primerek korlátoznak) elméletileg arányosan növekszik 2 n -re, ahol n a reakcióciklusok száma. Valójában az egyes ciklusok hatékonysága 100% alatti lehet, tehát a valóságban:

ahol P a termék mennyisége, E a ciklus átlagos hatékonysága.

A "hosszú" DNS-másolatok száma is nő, de lineárisan, így a reakciótermékekben egy specifikus fragmentum dominál. A szükséges termék növekedését exponenciálisan korlátozza a reagensek mennyisége, az inhibitorok jelenléte és a melléktermékek képződése.

A PCR rendkívül érzékeny módszer, ezért ha a vizsgált mintában csak jelentéktelen mennyiségű DNS van, amely véletlenül egyik reakcióelegyből a másikba került, téves pozitív eredményt kaphatunk. Ez szükségessé teszi a PCR-hez használt összes oldat és eszköz gondos ellenőrzését.

Az alapozó kiválasztásának alapelvei.

A PCR tesztrendszer létrehozásakor az egyik fő feladat a primerek helyes kiválasztása, amelyeknek számos kritériumnak kell megfelelniük:

1. Az alapozóknak specifikusnak kell lenniük. Különös figyelmet kell fordítani a primerek 3" végére, mivel ezektől kezdi meg a Taq polimeráz befejezni a komplementer DNS-láncot. Ha ezek specificitása nem megfelelő, akkor nagy valószínűséggel nemkívánatos folyamatok mennek végbe a kémcsőben a reakciókeverékkel együtt. , nevezetesen a nem specifikus DNS (rövid vagy hosszú fragmentumok) szintézise. Elektroforézis során nehéz vagy könnyű további sávok formájában látható. Ez megnehezíti a reakció eredményeinek értékelését, mert könnyen összetéveszthető egy specifikus amplifikációs termék szintetizált idegen DNS-sel. Egyes primereket és dNTP-ket a nem specifikus DNS szintéziséhez használnak fel, ami az érzékelés jelentős elvesztéséhez vezet.

2. A primerek nem képezhetnek dimereket és hurkokat, pl. nem szabad stabil kettős szálakat kialakítani a primerek önmagukhoz vagy egymáshoz való illesztésével.

Ez lehetővé teszi, hogy a biológiai anyagokban kis mennyiségben, pontosabban annak bizonyos töredékeit észlelje, és sokszorosára megsokszorozza. Ezután vizuálisan azonosítják őket gélelektroforézissel. A reakciót 1983-ban K. Mullis fejlesztette ki, és az utóbbi évek kiemelkedő felfedezéseinek listájára került.

Melyek a PCR mechanizmusai?

Az egész technika a nukleinsavak önreplikációjának képességén alapul, amelyet ebben az esetben mesterségesen, laboratóriumban hajtanak végre. A DNS-reprodukció nem kezdődhet meg a molekula egyetlen régiójában sem, hanem csak bizonyos nukleotidszekvenciájú régiókban - kiindulási fragmentumokban. Ahhoz, hogy a polimeráz láncreakció beinduljon, primerekre (vagy DNS-próbákra) van szükség. Ezek egy DNS-lánc rövid fragmentumai adott nukleotidszekvenciával. Kiegészítik (vagyis megfelelnek) a kiindulási helyeknek

Természetesen ahhoz, hogy primereket hozzanak létre, a tudósoknak meg kell vizsgálniuk a technikában résztvevő nukleotidszekvenciáját. Ezek a DNS-próbák biztosítják a reakció specifitását és annak beindítását. nem fog működni, ha a kívánt DNS legalább egy molekulája nem található a mintában. Általánosságban elmondható, hogy a fenti primerek, egy sor nukleotid, egy hőálló DNS-polimeráz szükséges a reakció végbemeneteléhez. Ez utóbbi egy enzim, amely a minta alapján új nukleinsavmolekulák szintézisét katalizálja. Mindezeket az anyagokat, beleértve azt a biológiai anyagot is, amelyben a DNS kimutatására van szükség, reakcióelegybe (oldatba) egyesítik. Speciális termosztátba van helyezve, amely adott ideig - cikluson keresztül - nagyon gyors fűtést és hűtést végez. Általában 30-50 darab van.

Hogyan zajlik ez a reakció?

Lényege, hogy egy ciklus alatt a primerek a DNS kívánt szakaszaihoz kapcsolódnak, majd az enzim hatására megduplázódnak. Az így létrejövő DNS-szálak alapján a molekula újabb és újabb, azonos fragmentumai szintetizálódnak a következő ciklusokban.

A polimeráz láncreakció szekvenciálisan megy végbe, a következő szakaszokat különböztetjük meg. Az elsőre jellemző, hogy minden egyes fűtési és hűtési ciklus során megkétszereződik a termék mennyisége. A második szakaszban a reakció lelassul, mivel az enzim sérül és aktivitása is csökken. Ezenkívül a nukleotidok és primerek tartalékai kimerülnek. Az utolsó szakaszban - egy fennsíkon - a termékek már nem halmozódnak fel, mivel a reagensek elfogytak.

Hol használják

Kétségtelen, hogy a polimeráz láncreakciót a legszélesebb körben alkalmazzák az orvostudományban és a tudományban. Használják az általános és magánbiológiában, az állatgyógyászatban, a gyógyszerészetben és még az ökológiában is. Sőt, az utóbbiban ezt az élelmiszerek és a környezeti tárgyak minőségének ellenőrzésére teszik. A polimeráz láncreakciót aktívan használják a törvényszéki gyakorlatban az apaság megerősítésére és egy személy azonosítására. A kriminalisztika és az őslénytan területén gyakran ez a technika az egyetlen kiút, mivel általában nagyon kevés DNS áll rendelkezésre a kutatáshoz. Természetesen a módszer igen széles körű alkalmazásra talált a gyakorlati gyógyászatban. Szükséges olyan területeken, mint a genetika, a fertőző és onkológiai betegségek.