Definicija reakcije aglutinacije. Reakcija aglutinacije, njene vrste, metode proizvodnje, primjena. Reakcija neutralizacije. liza, opsonofagocitna reakcija, reakcija preosjetljivosti

IMUNOMIKROBIOLOŠKE STUDIJE

Imunološke metode se koriste za rješavanje mnogih problema:

1. Procjena stanja imunološkog sistema čovjeka (imuni status) određivanjem kvantitativnih i funkcionalnih karakteristika ćelija imunog sistema i njihovih produkata.

2. Određivanje sastava i karakteristika ljudskih tkiva: krvne grupe, Rh faktor, transplantacijski antigeni.

3. Dijagnoza infektivnih bolesti i rezistencije na njih otkrivanjem i utvrđivanjem titra antitela (serodijagnostika), identifikacijom antigena patogena u organizmu i određivanjem ćelijskih reakcija na te antigene.

4. Seroidna identifikacija kultura bakterija i virusa izoliranih iz tijela ljudi i životinja.

5. Detekcija u ljudskom organizmu i spoljašnjem okruženju bilo kojih supstanci koje imaju antigena ili haptenska svojstva (hormoni, enzimi, otrovi, lekovi, lekovi itd.).

6. Identifikacija imunopatoloških stanja, alergija, transplantacijskih i antitumorskih reakcija.

Proces interakcije između antigena i antitijela u serološkim reakcijama odvija se u dvije faze:

1) specifično- faza interakcije u kojoj se javlja komplementarna kombinacija aktivnih centara antitijela (paratopa) i epitopa antigena. Ova faza obično traje nekoliko sekundi ili minuta;

2) nespecifičan- faza manifestacije, koju karakteriziraju vanjski znaci formiranja imunoloških kompleksa. Ova faza se može razviti od nekoliko minuta do nekoliko sati.

Optimalna specifična interakcija antitijela sa antigenom javlja se u izotoničnom rastvoru sa pH blizu neutralnog. Reakcija antigen-antitijelo u in vitro sistemu može biti praćena pojavom nekoliko fenomena

· aglutinacija,

· padavine,

· liza.

Vanjske manifestacije reakcije zavise od fizičko-hemijskih svojstava antigena (veličina čestica, fizičko stanje), klase i tipa antitela (potpuna i nepotpuna), kao i od eksperimentalnih uslova (srednja konzistencija, koncentracija soli, pH, temperatura ).

Polivalentnost antigena i antitijela osigurava stvaranje agregata vidljivih golim okom. To se događa u skladu s teorijom formiranja mreže, prema kojoj su druga antitijela i molekuli antigena sekvencijalno vezani za rezultirajući kompleks antigen-antitijelo. Kao rezultat, formiraju se mrežne strukture koje se pretvaraju u agregate koji se talože. Priroda i težina reakcije zavise od kvantitativnog omjera antigena i antitijela. Najintenzivnije reakcije se javljaju kada su reagensi u ekvivalentnim proporcijama.

Neophodan uslov za formiranje rešetke (mreža) je prisustvo više od tri antigenske determinante za svaki molekul antigena i dva aktivna centra za svaki molekul antitela. Molekuli antigena su rešetkasti čvorovi, a molekuli antitela su veze. Područje optimalnih omjera (zona ekvivalencije) koncentracija antigena i antitijela, kada se u supernatantu nakon formiranja sedimenta ne otkrivaju ni slobodni antigeni ni slobodna antitijela.

Agregati koji mogu precipitirati nastaju kada se antigeni kombinuju sa punim antitijelima. Nepotpuna antitijela (monovalentna) ne uzrokuju stvaranje mrežnih struktura i velikih agregata. Za otkrivanje takvih antitijela koriste se posebne metode zasnovane na upotrebi antiglobulina (Coombsova reakcija).

Serološke reakcije, zbog svoje visoke specifičnosti i osjetljivosti, koriste se za detekciju i kvantifikaciju antigena i antitijela. Količina imunoreagensa u reakcijama izražava se titrom - maksimalnim razrjeđenjem seruma ili antigena pri kojem se reakcija još uvijek opaža.

Serološke reakcije u mikrobiološkim i imunološkim laboratorijama koriste se u dvije svrhe:

1) za seroidifikaciju mikroorganizama, toksina, antigena uopšte pomoću poznatog antitela (imuno dijagnostički serum),

2) za serodijagnostiku - utvrđivanje prirode antitijela u krvnom serumu pacijenta za bakterijske, virusne i rjeđe druge zarazne bolesti pomoću poznatog antigena (diagnosticum).

Da bi se odredio generički, vrsta i tip antigena, potrebni su poznati imunološki dijagnostički serumi. Dobivaju se ponovnim davanjem životinjama (obično zečevima) u sve većim dozama ubijenih ili živih mikroorganizama, produkata njihovog raspadanja, neutraliziranih ili nativnih toksina. Nakon određenog ciklusa imunizacije životinja, vrši se masovno puštanje krvi ili totalno krvarenje životinje. Krv prikupljena u sterilnu posudu prvo se stavlja u termostat na temperaturi od 37°C na 4 - 6 sati kako bi se ubrzalo zgrušavanje, a zatim u ledenicu na jedan dan. Dobijeni prozirni serum usisava se u sterilnu posudu, dodaju se konzervansi, određuje se titar antitijela, provjerava sterilnost i sipa u ampule.

Koriste se neadsorbovan I adsorbovan dijagnostički serumi. Neadsorbirani serumi imaju visoke titre antitijela, ali su sposobni dati grupne (unakrsne) reakcije.

Adsorbirani serumi se odlikuju strogom specifičnošću djelovanja (reaguju samo sa homolognim antigenom). Zovu se serumi koji sadrže antitijela samo na jedan specifični antigen monoreceptor.

Takođe proizvode serume označene fluorohromima, enzimima i radioizotopima, koji omogućavaju detekciju čak i tragova antigena sa visokim stepenom tačnosti.

Kao antigeni (dijagnostikumi) u serološkim reakcijama koriste se suspenzije živih ili ubijenih bakterija, produkti njihovog razgradnje, toksini i virusi. U nekim slučajevima se koriste ekstrakti ili hemijski izolovani antigeni iz mikroorganizama i životinjskih tkiva.

Sve imunomikrobiološke metode mogu se podijeliti u 3 grupe:

1) na osnovu direktna interakcija antigena sa antitijelom(fenomeni aglutinacije, precipitacije, hemaglutinacije, imobilizacije, itd.);

2) na osnovu posredovana interakcija antigena sa antitijelom(reakcije indirektne hemaglutinacije, koaglutinacije, lateks aglutinacije, ugljične aglomeracije, bentonitne aglutinacije, fiksacije komplementa itd.);

3) korišćenje obeležena antitela ili antigeni(metoda fluorescentnih antitijela, enzimski imunosorbentni i radioimuni testovi i druge metode).

REAKCIJE AGLUTINACIJE

Ove reakcije uključuju antigene u obliku čestica (mikrobne ćelije, crvena krvna zrnca i drugi korpuskularni antigeni), koje se spajaju antitijelima i talože.

Za izvođenje reakcije aglutinacije(RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen);

2) antitelo (aglutinin)

3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).

Približna reakcija aglutinacije (RA)

Indikativni ili pločasti RA se stavlja na stakalnu pločicu na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, pomoću Pasteurove pipete nanesite kap seruma u razrjeđenju od 1:10 do 1:20 i kontrolnu kap izotonične otopine natrijum hlorida odvojeno na staklo. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obje bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir vizuelno nakon nekoliko minuta, ponekad pomoću lupe (x5). Kod pozitivnog RA uočava se pojava velikih i malih pahuljica u kapi seruma, a kod negativnog RA serum ostaje ravnomjerno zamućen.

Detaljna reakcija aglutinacije kako bi se utvrdio titar specifičnih antitijela kod pacijenta.

Potpuni RA za serodijagnostiku se pravi u serumu pacijenata. Takođe se razblažuje u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida od 1:50 - 1:100 do 1:800 ili 1:1600. Budući da niži titar seruma može sadržati normalne aglutinine koji se nalaze kod zdravih ljudi ili pacijenata sa drugom dijagnozom (dijagnostički titar). Kao antigen u ovoj reakciji koriste se dijagnostikumi - poznate suspenzije, najčešće ubijenih bakterija.

U epruvete za aglutinaciju prvo se sipa 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida. Prvom se dodaje 1 ml seruma razrijeđenog 1:100, a nakon miješanja 1 ml se prebacuje u drugi, iz drugog u treći itd. 1-2 kapi bakterijske suspenzije koja sadrži 3 milijarde mikrobnih tijela u 1 ml dodaju se u rezultirajuća dvostruka razrjeđenja seruma (od 1:100 do 1:1600 ili više). Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C 2 sata, a zatim drže na sobnoj temperaturi 24 sata.

Detaljna reakcija aglutinacije se uzima u obzir tako što se svaka epruveta procjenjuje uzastopno, počevši od kontrolnih, uz lagano protresanje. U kontrolnim epruvetama ne bi trebalo biti aglutinacije. Intenzitet reakcije aglutinacije označen je sljedećim znacima: ++++ - potpuna aglutinacija (aglutinirajuće pahuljice u apsolutno providnoj tekućini); +++ - nepotpuna aglutinacija (ljuspice u blago opalescentnoj tečnosti); ++ - djelomična aglutinacija (ljuspice su jasno vidljive, tečnost je blago zamućena); + - slaba, upitna aglutinacija - tečnost je veoma zamućena, pahuljice u njoj se teško razlikuju; - - odsustvo aglutinacije (tečnost je jednolično zamućena).

Titar seruma se uzima kao njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se intenzitet aglutinacije procjenjuje kao najmanje dva plusa (++)

Aglutinacija je lijepljenje i taloženje mikroba ili drugih stanica pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). Grupe slijepljenih bakterija (ćelija) nazivaju se aglutinati. Za reakciju aglutinacije potrebne su sljedeće komponente:

1. Antitijela (aglutinini) koja se nalaze u serumu bolesne ili imune životinje.

2. Antigen - suspenzija živih ili ubijenih mikroba, crvenih krvnih zrnaca ili drugih ćelija.

3. Izotonični (0,9%) rastvor natrijum hlorida.

Reakcija aglutinacije za serodijagnostiku koristi se za trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija), brucelozu (reakcija Wright i Heddleson), tularemiju itd. Antitijelo je pacijentov serum, a antigen je poznati mikrob. Prilikom identifikacije mikroba ili drugih ćelija, njihova suspenzija se koristi kao antigen, a poznati imunološki serum se koristi kao antitijelo. Ova reakcija se široko koristi za dijagnosticiranje crijevnih infekcija, velikog kašlja itd.

Metode stadijuma RA

Približan RA na staklu

Deployed RA

(metoda zapremine)

Reakcija koaglutinacije

Rasklopljeni RA na staklu (seroididentifikacija)

Reakcija aglutinacije na staklu. Dvije kapi specifičnog (adsorbiranog) seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Neadsorbirani serumi se prethodno razblažuju u omjeru 1:5 - 1:100. Kapi se moraju nanijeti na staklo tako da postoji razmak između njih. Kultura se temeljno melje na staklu petljom ili pipetom, a zatim se dodaje kapi izotonične otopine natrijum hlorida i jednoj od kapi seruma, miješajući svaku dok se ne formira homogena suspenzija. Kap seruma bez kulture je kontrola seruma.

Pažnja! Ne možete prenijeti kulturu iz seruma u kap izotonične otopine natrijum hlorida, koja služi kao kontrola antigena. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane prozirna, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje se kultura pomiješa sa serumom na pozadini bistre tekućine, rezultat reakcije se smatra pozitivnim.

Diagnostic Physiological

serum + rastvor kulture + kultura

Detaljna reakcija aglutinacije (volumenska metoda). Pripremaju se serijska, najčešće dvostruka, razrjeđenja seruma. Metoda se naziva volumetrijska. Za određivanje titra antitijela u krvnom serumu uzmite 6 epruveta. U prvu epruvetu sipajte 1 ml originalnog seruma u omjeru 1:50 i dodajte 1 ml fiziološkog rastvora u svih 6 epruveta koristeći graduisanu pipetu. Prva epruveta će dati razrjeđenje seruma od 1:100 sa zapreminom od 2 ml. Prebacite 1 ml iz prve epruvete u drugu epruvetu, gde razblaženje postaje 1:200. Zato napravite seriju serijskih razblaženja seruma u prvih 5 epruveta (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Iz pete epruvete sipajte 1 ml u rastvor za dezinfekciju. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma u svih 6 epruveta. Šesta epruveta je kontrola kulture, jer sadrži samo fiziološki rastvor i dijagnostikum.

Takva kontrola je neophodna da bi se isključila spontana aglutinacija kulture. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 2 sata, a zatim ostave jedan dan na sobnoj temperaturi, nakon čega se bilježe rezultati reakcije aglutinacije. Prilikom izvođenja reakcije aglutinacije sa serumima djece u prvim mjesecima života, zbog funkcionalne inferiornosti stvaranja antitijela, potrebno je utvrditi niže titre antitijela, što se uzima u obzir pri razrjeđivanju seruma. Početno razrjeđenje seruma je 1:25. U prvoj epruveti dobije se razrjeđenje 1:50, zatim 1:100 itd.

Ako je rezultat reakcije pozitivan, epruvete pokazuju zaglavljene ćelije u obliku zrnaca ili pahuljica na pozadini bistre tečnosti. Aglutinat se postepeno taloži na dno u obliku "kišobrana", a tečnost iznad sedimenta postaje bistra. Kontrola antigena je jednolično zamućena.

Na osnovu prirode sedimenta razlikuje se fino i krupnozrnasta (ljuskasta) aglutinacija. Pri radu sa O-serumom postiže se fino zrnasta aglutinacija. Krupnozrnast - kada pokretni mikrobi stupaju u interakciju sa flagelarnim H-serumima. Javlja se brže od sitnozrnog, a nastali sediment je vrlo labav i lako se lomi.

Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:

Sve ćelije su se slegle, tečnost u epruveti je potpuno prozirna. Rezultat reakcije je oštro pozitivan;

Taloga je manje, tečnost se ne bistri u potpunosti. Rezultat reakcije je pozitivan;

Taloga je još manje, tečnost je zamućenija. Rezultat reakcije je sumnjiv;

Na dnu epruvete je blagi talog, tečnost je mutna. Upitan rezultat reakcije;

Nema sedimenta, tečnost je jednolično zamućena, kao u kontroli antigena. Rezultat negativne reakcije

Ove reakcije uključuju antigene u obliku čestica (mikrobne ćelije, crvena krvna zrnca i drugi korpuskularni antigeni), koje se spajaju antitijelima i talože.

Za izvođenje reakcije aglutinacije(RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen);

2) antitelo (aglutinin)

3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).

Približna reakcija aglutinacije (RA)

Indikativni ili pločasti RA se stavlja na stakalnu pločicu na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, pomoću Pasteurove pipete nanesite kap seruma u razrjeđenju od 1:10 do 1:20 i kontrolnu kap izotonične otopine natrijum hlorida odvojeno na staklo. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obje bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir vizuelno nakon nekoliko minuta, ponekad pomoću lupe (x5). Kod pozitivnog RA uočava se pojava velikih i malih pahuljica u kapi seruma, a kod negativnog RA serum ostaje ravnomjerno zamućen.

Rice. 2. Približna reakcija aglutinacije.

Detaljna reakcija aglutinacije kako bi se utvrdio titar specifičnih antitijela kod pacijenta.

Potpuni RA za serodijagnostiku se pravi u serumu pacijenata. Takođe se razblažuje u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida od 1:50 - 1:100 do 1:800 ili 1:1600. Budući da niži titar seruma može sadržati normalne aglutinine koji se nalaze kod zdravih ljudi ili pacijenata sa drugom dijagnozom (dijagnostički titar). Kao antigen u ovoj reakciji koriste se dijagnostikumi - poznate suspenzije, najčešće ubijenih bakterija.

U epruvete za aglutinaciju prvo se sipa 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida. Prvom se dodaje 1 ml seruma razrijeđenog 1:100, a nakon miješanja 1 ml se prebacuje u drugi, iz drugog u treći itd. 1-2 kapi bakterijske suspenzije koja sadrži 3 milijarde mikrobnih tijela u 1 ml dodaju se u rezultirajuća dvostruka razrjeđenja seruma (od 1:100 do 1:1600 ili više). Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C 2 sata, a zatim drže na sobnoj temperaturi 24 sata.

Detaljna reakcija aglutinacije se uzima u obzir tako što se svaka epruveta procjenjuje uzastopno, počevši od kontrolnih, uz lagano protresanje. U kontrolnim epruvetama ne bi trebalo biti aglutinacije. Intenzitet reakcije aglutinacije označen je sljedećim znacima: ++++ - potpuna aglutinacija (aglutinirajuće pahuljice u apsolutno providnoj tekućini); +++ - nepotpuna aglutinacija (ljuspice u blago opalescentnoj tečnosti); ++ - djelomična aglutinacija (ljuspice su jasno vidljive, tečnost je blago zamućena); + - slaba, upitna aglutinacija - tečnost je veoma zamućena, pahuljice u njoj se teško razlikuju; - - odsustvo aglutinacije (tečnost je jednolično zamućena).

Titar seruma se uzima kao njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se intenzitet aglutinacije procjenjuje kao najmanje dva plusa (++)

Rice. 7. Detaljna reakcija aglutinacije.

Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (IRHA, RPHA)

Reakcija je data:

1) za detekciju polisaharida, proteina, bakterijskih ekstrakata i drugih visoko dispergiranih supstanci, rikecija i virusa, čiji se kompleksi sa aglutininima ne mogu vidjeti u konvencionalnim RA,

2) za otkrivanje antitela u serumu pacijenata na ove visoko dispergovane supstance i male mikroorganizme.

Indirektna, ili pasivna, aglutinacija se podrazumijeva kao reakcija u kojoj antitijela stupaju u interakciju s antigenima prethodno adsorbiranim na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. ili crvena krvna zrnca ovaca, I(0)-ljudska krvna grupa)

U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA), crvena krvna zrnca. Crvena krvna zrnca napunjena antigenom se lijepe zajedno u prisustvu specifičnih antitijela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPGA kao eritrocitni dijagnostikum za detekciju antitijela (serodijagnostika). Ako su crvena krvna zrnca napunjena antitijelima (dijagnostikum antitijela eritrocita), mogu se koristiti za otkrivanje antigena.

Rice. 3. RPGA šema: crvena krvna zrnca (1), napunjena antigenom (3), vezana su specifičnim antitijelima (4).

Staging. Serija serijskih razblaženja seruma priprema se u jamicama polistirenskih ploča. Dodajte 0,5 ml očigledno pozitivnog seruma u pretposljednju jažicu i 0,5 ml fiziološkog rastvora (kontrole) u posljednju. Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razrijeđenog eritrocitnog dijagnostikuma, promućka i stavi u termostat na 2 sata.

Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, crvena krvna zrnca se talože na dnu rupe u obliku ravnog sloja stanica sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran); u negativnom slučaju se talože u obliku dugmeta ili prstena. .

Fig.4. Računovodstvo za RNGA (RPGA).

Obračun rezultata RNGA obavljenog za otkrivanje botulinum toksina.

Uzročnik botulizma, Clostridium botulinum, proizvodi toksine sedam serovara (A, B, C, D, E, F, G), ali su češći serovari A, B i E. Svi toksini se razlikuju po antigenskim svojstvima i mogu mogu se razlikovati u reakcijama korištenjem seruma specifičnih za tip. U tu svrhu može se izvesti pasivna (indirektna) reakcija hemaglutinacije sa serumom pacijenta u kojoj se pretpostavlja prisustvo toksina i crvenih krvnih zrnaca napunjenih antitijelima antitoksičnih anti-botulinum seruma tipa A, B, E. Normalno. serum služi kao kontrola.

Rice. 3. Izjava i rezultat RNGA.

Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, crvena krvna zrnca se talože na dnu rupe u obliku ravnog sloja stanica sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran); u negativnom slučaju se talože u obliku dugmeta ili prstena. .

Zaključak: Botulinski toksin tipa E otkriven je u serumu pacijenta.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI).

Rice. 8. Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) (šema).

Princip reakcije temelji se na sposobnosti AT da veže različite viruse i neutralizira ih, čineći nemogućim aglutiniranje crvenih krvnih stanica. Vizualno, ovaj efekat se manifestuje u „inhibiciji“ hemaglutinacije. RTGA se koristi u dijagnozi virusnih infekcija za identifikaciju specifičnih antihemaglutinina i identifikaciju različitih virusa po njihovim hemaglutininima, koji pokazuju svojstva Ag.

Tipizacija virusa se provodi u RTGA reakciji sa setom seruma specifičnih za tip. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir odsustvom hemaglutinacije. Podtipovi virusa tipa A sa antigenima H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 i drugim mogu se diferencirati u RTGA sa setom homolognih seruma specifičnih za tip

Rice. 9. RTGA rezultati za tipizaciju virusa gripe

Legenda: - inhibicija hemaglutinacije (dugme); - hemaglutinacija (kišobran).

Zaključci: Materijal koji se proučava sadrži virus gripa tipa A sa antigenom H3N2

Imune reakcije. Primjena imunoloških reakcija u dijagnostici zaraznih bolesti.

PLAN:

Vrste imunoloških reakcija.

Uslovi za provođenje seroloških reakcija.

Potrebe za serumom.

Koncept pozitivnih i negativnih rezultata.

GLAVNI SADRŽAJ:

Vrste imunoloških reakcija.

Imunološka reakcija – Ovo je interakcija antigena sa antitelom, koja je određena specifičnom interakcijom aktivnih centara antitela (paratopa) sa epitopima antigena.

Opća klasifikacija imunoloških reakcija:

serološke reakcije – reakcije između antigena (Ag) i antitela (Ig)

in vitro ;

ćelijske reakcije uz učešće imunokompetentnih ćelija;

alergijske testove – otkrivanje preosjetljivosti.

Serološke reakcije: 1) definicija, 2) faze, 3) ciljevi, 4) opšta klasifikacija.

1) Definicija

Serološke metode istraživanja (od latinskog Serum - serum i logos - proučavanje) primjenom reakcije antigen-antitijelo.

2) Faze

2 faze interakcije:

I. Specifično (vidljivo) – javlja se brzo, antitela se kombinuju sa odgovarajućim antigenima. Tokom ove faze, determinantne grupe antigena (AG) i aktivni centri antitela (AT) interaguju.

Sile uključene u formiranje AG + AT kompleksa su:

privjesak;

van der Waals

Vodikove veze.

U ovoj fazi nema vidljivih promjena. Elektronska mikroskopija pokazuje kompleks AG+AT u obliku rešetke.

II. Nespecifičan – odvija se sporo, nastali kompleks antigen-antitijelo reaguje sa dodatnim nespecifičnim faktorom okoline u kojem se reakcija javlja, a to je vidljivo oku – lijepljenje, otapanje, taloženje pahuljica itd. U prisustvu elektrolita naboj se smanjuje , rastvorljivost se smanjuje, formiraju se vidljivi konglomerati koji se talože (aglutiniraju).

3) Postavljanje ciljeva :

a) za identifikaciju antigena (poznatog dijagnostičkog seruma antitela):

• u patološkom materijalu (brza dijagnostika);

  u čistoj kulturi:

  1. serološka identifikacija (identifikacija vrste);

     serotipizacija (određivanje serovara) – određivanje soja;

b) za otkrivanje antitela (Ig) (antigen je poznat-dijagnostikum):

• prisustvo (kvalitativne reakcije);

  količine (povećanje titra - metoda "upareni serum").

4) Opšta klasifikacija serološke reakcije :

a) jednostavan (2-komponentni: Ag+Ig):

Reakcije aglutinacije RA (sa korpuskularnim antigenom);

PR precipitacijske reakcije (sa rastvorljivim antigenom);

b) kompleks (3-komponentni: Ag+Ig+C);

c) korištenjem oznake.

Varijante reakcija aglutinacije i precipitacije

Reakcija aglutinacije :

Reakcija aglutinacije (RA) je imunološka reakcija interakcije suspenzije antigena (eritrocita, bakterija) sa antigenima u fiziološkoj otopini.

Tokom aglutinacije, AT čestice se lijepe i formiraju flokulantni sediment.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA) je vrsta reakcije aglutinacije u kojoj se koristi antitijelo ili antigen eritrocitni dijagnostikum (eritrociti sa AT ili AG adsorbiranim na njihovoj površini).

Crvena krvna zrnca djeluju kao pasivni nosioci ove reakcije.

Evaluacija rezultata RPGA provodi se na sljedeći način:

- at pozitivna reakcija pasivno zalijepljena crvena krvna zrnca prekrivaju dno rupe u obliku slova U ili V u ravnom sloju sa zaobljenim rubovima („kišobran“);

- at negativnu reakciju (u nedostatku aglutinacije), crvena krvna zrnca se nakupljaju u središnjem udubljenju rupe, tvoreći kompaktno "dugme" s oštro definiranim rubovima.

Test inhibicije hemaglutinacije (HAI) koristi se u dijagnostici virusnih infekcija. Neki virusi na svojoj površini sadrže protein nazvan hemaglutinin, koji spaja crvena krvna zrnca. Dodavanje specifičnih antivirusnih antitijela blokira virusni hemaglutinin – nema hemaglutinacije.

Reakcija indirektne hemaglutinacije (IRHA), ili Coombsova reakcija, koristi se za određivanje nepotpunih antitijela. Dodatak antiglobulinskog seruma (AT protiv humanog Ig) poboljšava rezultate reakcije. RNGA se koristi za određivanje Rh faktora.

Za izvođenje reakcije aglutinacije (RA), potrebne su tri komponente:

1) antigen (aglutinogen) AG;

2) antitelo(aglutinin) AT;

3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).
Ag + AT + elektrolit = aglutinat

Aglutinacija (od latinskog agglutinatio - lijepljenje) - lijepljenje tjelešca (bakterija, crvenih krvnih zrnaca itd.) antitijelima u prisustvu elektrolita - natrijum hlorida.

RA se manifestira u obliku pahuljica ili sedimenta koji se sastoji od tjelešca (na primjer, bakterija, crvenih krvnih zrnaca) "zalijepljenih zajedno" antitijelima.

RA se koristi za:

Direktna reakcija mikrobne aglutinacije (RA).

U ovoj reakciji, antitijela (aglutinini) direktno aglutiniraju korpuskularne antigene (aglutinogene).

Obično su predstavljeni suspenzijom inaktiviranih mikroorganizama (reakcija mikrobne aglutinacije).

Za određivanje vrste mikroorganizama koristitestandardna dijagnostička aglutinacija serum ( poznati AT ).

Najčešći su lamelarni (približni) i prošireni RA.

Ploča RA se postavlja na staklo. Koristi se kao ubrzana metoda za detekciju antitijela ili identifikaciju mikroorganizama.

Komponente:

1. standardni dijagnostički aglutinirajući serumi (AT);

2. čista kultura koja se proučava od pacijenta;

3. fiziološki rastvor.

U čistoj kulturi koja se proučava, antigeni (AG) su u obliku čestica (mikrobnih ćelija, eritrocita i drugih korpuskularnih antigena), koje se spajaju antitijelima i talože.

primjer:

Staging indikativno reakcije aglutinacije (RA ) na staklu u svrhu identifikacije koliformnih bakterija.

Nanesite kapi na staklo:

1 dizenterija ;
2 -th kap: - aglutinirajući serum protiv patogenatifusne groznice ;

(1-2 dijagnostička seruma)
3 -ta kap: - fiziološki rastvor (kontrola).
U svaku kap dodajte testiranu čistu bakterijsku kulturu. Stir.

Rezultat : pozitivno - prisustvo aglutinatnih pahuljica,
negativan - odsustvo aglutiniranih pahuljica
zaključak:Proučavane bakterije su uzročnici trbušnog tifusa (utvrđeni su antigeni).

Za određivanje AT u pacijentovom serumu (serološka dijagnoza), standardni mikrobdiagnosticum , koji sadrži suspenzijupoznati mikrobi ili njihovi antigeniAG .

Određivanje ABO krvnih grupa (reakcija hemaglutinacije (HRA)) – aglutiniraju crvena krvna zrnca.

Komponente reakcije:

1. AG (crvena krvna zrnca) testiraju krv

2. AT (eritrotesti - zolikloni)

Set zoliklona:

Coliclone anti-A reagens (ružičasti)

Coliclone anti-B reagens (plavi)

Reagens Tsoliklon anti-AV (bezbojan)

3. elektrolit (fiziološki rastvor)

Tehnika određivanja:

1 .

Jedna kap (0,1 ml) anti-A, anti-B i anti-AB zolikona se nanese na jažice tablete (za kontrolu).

2.

Pored svake kapi reagensa stavlja se mala (0,05-0,01 ml) kap krvi koja se testira.

Zatim se kap zoliklona pomiješa s kapljicom krvi koristeći pojedinačnu čistu staklenu šipku.

3.

Reakcija aglutinacije se razvija tokom prvih 3-5 sekundi kada se ploča lagano ljulja.

Rezultati reakcije se uzimaju u obzir 2,5 - 3 minute nakon miješanja kapi. S lijeva na desno u bunarima su anti-A, anti-B, anti-AB.

Pozitivan rezultat je pojava zrnastog sedimenta (aglutinata).

pozitivan RA (+)

Negativno - nema taloga.

negativan RA(-)

4.

Analiza rezultata.

O(I) α β – nema aglutinacije

A(II) β – aglutinacija sa anti-A

B(III) α – aglutinacija sa anti-B

AB(IV)O – aglutinacija sa anti-A, sa anti-B

Šematski prikaz aglutinacije.

Ag antigeni na eritrocitima (mogu se detektovati) + antiteloAT(zoliklon) dijagnostički serum

Obračun aglutinacije u tabletama

Reakcija padavina:

Reakcija precipitacije je imunološka reakcija interakcije antigena u rastvorljivom stanju sa antigenom u fiziološkoj otopini.

Tokom precipitacije nastaje makromolekularni imuni kompleks, koji se manifestuje prelaskom prozirne koloidne otopine u neprozirnu suspenziju, odnosno precipitat.

Količina oba reagensa mora biti u strogo određenim omjerima, jer višak jednog od njih smanjuje rezultat.

Postoje različiti načini za izvođenje reakcije precipitacije.

1. Prstenasta reakcija taloženja izvodi se u taložnim cijevima malog prečnika. Imuni serum se dodaje u epruvetu i rastvorljivi antigen se pažljivo slojeva. AG i AT se miješaju zbog termičkog kretanja molekula i međusobno djeluju. Ako je rezultat pozitivan, na granici između dva rastvora formira se prsten neprozirnog taloga.

2. Ouchterlony reakcija dvostruke imunodifuzije se izvodi u agar gelu, u čije se jažice dodaje ili AG rastvor ili rastvor AT prema šemi. AG i AT difundiraju u gel jedan prema drugom i, ako je reakcija pozitivna, formiraju imune komplekse vidljive kao precipitacijske linije.

Reakcija padavina -ovo je formacijai taloženje rastvorljivog molekularnog kompleksa antigen-antitelo kao oblak koji se naziva precipitat. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama.

RA komponente:

precipitirajući serum (poznati AT-precipitin);

test serum (nepoznati precipitogen antigen);

fizički Rješenje.

Reakcija precipitacije se provodi ili u posebnim uskim epruvetama (reakcija taloženja prstena), ili u Petrijevim posudama u gelovima, hranjivim podlogama itd.

Ring-pricipitation reakcija

Izjava i bilježenje rezultata reakcijeprstenaste padavineza otkrivanje uzročnika antraksa (Ascolijeva reakcija).

Staging .

1. Materijal koji se proučava (koža, vuna, filc, čekinje, tkanina, meso, zemlja, životinjski izmet itd.) se kuva u fiziološkom rastvoru 5-45 minuta. da se dobije izotonični ekstrakt (ekstrakt). Filtrirano.

2. Precipitirajući serum protiv antraksa se sipa u epruvetu.

3. Pažljivo nanesite sloj testnog materijala (ekstrakta) na njega.

Računovodstvo .

U narednih 10 minuta. U pozitivnim slučajevima, na granici između seruma i ekstrakta pojavljuje se prsten zamućenja (prstenasta precipitacija). Ascolijeva reakcija je vrlo osjetljiva i specifična

Uz njegovu pomoć moguće je brzo identificirati materijale zaražene antraksom.

Reakcija precipitacije u agaru

Izjava i evidentiranje rezultatareakcije taloženja u agaruza određivanje toksičnosti korinebakterija (uzročnika difterije)

Staging

Stavljeno na fosfatni pepton agar u Petrijevoj posudi.

1. Postavite traku sterilnog filter papira navlaženu duž sredine čaše.antitoksični serum.

2. Nakon sušenja, na udaljenosti od 1 cm od ivice trake, zasijavaju se plakovi prečnika 10 mmodabrane kulture.

U jednoj čaši možete posijati od 3 do 10 useva, od kojih jedankontrolu, mora biti poznatotoksično.

Usjevi se stavljaju u termostat.

Računovodstvo

Analiza se vrši nakon 24-48-72 sata.

Pozitivan rezultat - (kulturatoksično) - na nekoj udaljenosti od trake papira se pojavljujutaložne linije, « strelice sa viticama“, koji su jasno vidljivi u prolaznom svjetlu.

Na slici je prikazana reakcija precipitacije u agaru za određivanje toksičnosti bacila difterije. Srednje kulture nisu formirale „vitice strelice“; to nisu toksikogeni patogeni.

Sojevi uzročnika difterije mogu biti toksigeni (proizvode egzotoksin) i netoksični. Stvaranje egzotoksina ovisi o prisutnosti profaga u bakterijama koji nosi tox gen koji kodira stvaranje egzotoksina.

U slučaju bolesti, svi patogeni difterije se testiraju na toksičnost - proizvodnju egzotoksina difterije reakcijom taloženja u agaru

Složene serološke reakcije ( 3-komponentni: Ag+Ig+C):

Reakcija fiksacije komplementa (CFR).

Reakcija se odvija u dvije faze.

U prvoj fazi, AT stupa u interakciju s antigenom i komplementom, u drugoj fazi se dodaje indikator - hemolitički sistem (mješavina eritrocita i antieritrocitnog seruma).

Ako je rezultat pozitivan, u prvoj fazi, antitijela formiraju imuni kompleks sa antigenima, koji vezuje komplement reakcione smjese.

U ovom slučaju, crvena krvna zrnca hemolitičkog sistema dodana u drugoj fazi nisu uništena.

Inače, nevezani komplement uzrokuje lizu indikatorskih crvenih krvnih zrnaca.

Za njegovu realizaciju potrebno je pet sastojaka: AG, AT i komplement (prvi sistem), ovčiji eritrociti i hemolitički serum (drugi sistem) (Sl. 1).

Reakcija se odvija u dvije faze (slika 3).

Prva faza - interakcija antigena i antitela uz obavezno učešće komplementa.

Sekunda - identifikacija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sistema (crvena krvna zrnca ovaca i hemolitički serum). Uništavanje crvenih krvnih zrnaca hemolitičkim serumom događa se samo ako se hemolitičkom sistemu doda komplement. Ako je komplement prethodno bio adsorbovan na kompleksu antigen-antitelo, onda ne dolazi do hemolize eritrocita (Sl.).

Doživite rezultat procijenjen (slika 2), primjećujući prisustvo ili odsustvo hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom kada je hemoliza potpuno odgođena, kada je tekućina u epruveti bezbojna i crvena krvna zrnca talože na dno, negativnom - kada su crvena krvna zrnca potpuno lizirana, kada je tekućina intenzivno obojena ("lakirana" krv ).

Stepen kašnjenja hemolize se procjenjuje ovisno o intenzitetu boje tekućine i veličini sedimenta crvenih krvnih zrnaca na dnu (++++, +++, ++, +).

Rice. 4. Izjava i rezultat RSC.

zaključak:Antitijela su otkrivena u test serumu.

RSK vam omogućava da otkrijete antitijela na bilo koji soj istog serotipa virusa.

Dijagnostička vrijednost ima:

četverostruko povećanje titra antitijela u parnim serumima (tokom epidemije gripa);

dvostruko povećanje krvnog seruma pacijenata s karakterističnom kliničkom slikom.

Reakcije pomoću oznake :

Ove metode su vrlo osjetljive. Boje, radioaktivni izotopi, enzimi, itd. se koriste kao oznake za antigene ili antitijela.

RIF – reakcija imunofluorescencije

Reakcija imunofluorescencije zasniva se na svjetlosnoj indikaciji kompleksa antigen-antitijelo

Vezani imunosorbentni test.

Savremeni laboratorijski test koji traži specifična antitijela u krvi ili antigene na određene bolesti kako bi se utvrdila ne samo etiologija, već i stadijum bolesti.

ELISA rezultati se mogu dati kvalitativno i kvantitativno.

Trenutno se ELISA koristi u sljedećim situacijama:

1) traženje specifičnih antitela na bilo koju zaraznu bolest;

2) traženje antigena bilo koje bolesti (zarazne, venerološke);

3) proučavanje hormonskog statusa pacijenta;

4) pregled tumorskih markera;

5) pregled na prisustvo autoimunih bolesti.

Na slici, čvrsta faza ELISA pokazuje poznate antigene (na lijevoj strani) adsorbirane na udubljenje ploče, (desno) na jažice ploče poznate antigene

Prednosti ELISA metode:

1) Visoka specifičnost i osjetljivost ELISA metode (više od 90%).

2) Sposobnost utvrđivanja bolesti i praćenja dinamike procesa, odnosno poređenja broja antitela u različitim vremenskim periodima.

3) Dostupnost ELISA dijagnostike u bilo kojoj medicinskoj ustanovi.

Relativni nedostatak: Detekcija imunološkog odgovora (antitijela), ali ne i samog patogena, konjugiranog sa tag-enzimom.

ELISA test (opći mehanizam):

Osnova enzimskog imunoeseja je imunološka reakcija antigena i antitijela sa stvaranjem imunog kompleksa: antigen-antitijelo, što rezultira promjenom enzimske aktivnosti specifičnih oznaka na površini antitijela.

Komponente reakcije:

1. AG(AT) poznat - na bunar tablete.

2. AT (AG) se proučava.

3. AT sa enzimom, specifičnim za AT(AG)-AG(AT) kompleks

4. hromogeni supstrat koji je u interakciji sa enzimom

5. stop rješenje

Glavne faze ELISA

1. Na površini jažica ploče nalazi se pročišćeni antigen specifičnog patogena. Dodaje im se pacijentov biološki materijal i dolazi do specifične reakcije između ovog antigena i željenog antitijela (imunoglobulina). Formira se kompleks.

2. Doda se konjugant – AT sa enzimom. Konjugant je specifičan za AT-AG kompleks prve faze. Enzim je aktiviran.

3. Doda se supstrat i aktivni enzim reaguje sa njim, menjajući bezbojnu boju rastvora.

4. Za zaustavljanje interakcije enzima i supstrata dodaje se otopina za zaustavljanje.

Računovodstvo.

Pozitivan rezultat je promjena boje, žuta na slici.

Imunohromatografska analiza

Metoda imunohromatografske analize (ICA, brzi testovi) je visokokvalitetna preliminarna metoda skrininga koja vam omogućava da brzo, u roku od nekoliko minuta, izvršite analizu pod bilo kojim uvjetima, uklj. "polje".

Prednosti ICA uključuju:

Brzina i jednostavnost upotrebe;

Male količine uzoraka, nedostatak pripreme uzorka;

Jeftina za proizvođača i potrošača;

Mogućnost izrade testova u velikim količinama;

Jednostavnost čitanja i interpretacije rezultata;

Visoka osjetljivost i reproduktivnost;

Mogućnost kvantitativnog određivanja;

Mogućnost korištenja prijenosnih čitača kompatibilnih sa računarom;

Mogućnost multianalize.

Komponente (nanesene na test traku):

1. Konjugat sa koloidnom zlatnom oznakom je specifičan za otkriveni antigen.

2. AT test linija – specifična za AT-AG kompleks

3. Trbušnjaci kontrolne linije su specifični za konjugat.

ICA postavka:

1. Nanesite uzorak na naznačeno početno područje trake.

2. Dobivanje rezultata u vidu pojave obojenih pruga na mjestu testnih i kontrolnih linija.

Računovodstvo

Pozitivan – kada je test linija umrljana.

Negativno - ako nema bojenja test linije.

Nevažeći – ako kontrolna linija nije zamrljana.

Opšti mehanizam ICA:

1. Uzorak se unosi u početno polje (podloga za uzorak) i povezuje se sa konjugatom (specifičnim tijelom sa obojenom etiketom), koji se nalazi na podlozi konjugata. Kao rezultat, formira se obojeni kompleks.

2. Nastali obojeni imunološki kompleks kreće se pod djelovanjem kapilarnih sila duž nitrocelulozne membrane I interagujesa AT test linijom.Rezultat je jednobojna ružičasto-crvena pruga.

3. AT (konjugat) nije vezan za testiranu trakukreće dalje i stiže do kontrolne linije, komunicira sa AT kontrolne linije.Kao rezultat, pojavljuje se druga traka u boji.Ako je analiza pravilno obavljena, kontrolna linija bi se uvijek trebala pojaviti, bez obzira na prisustvo test antigena (antitijela) u uzorku biološke tekućine.

2. Uslovi za provođenje seroloških reakcija.

1. Prisustvo homolognih - međusobno odgovaraju antigena i antitela.

2. Čisto, osušite suđe.

3. Određeni odnos lijekova (najčešće jednak).

4. Obavezno prisustvo elektrolita (izotonični rastvor NaCl).

5. pH neutralan ili blizu blago alkalnog.

6. Temperatura +37°C ili sobna temperatura (obavezno pozitivna).

7. Provodi se kontrola antigena i kontrola seruma (antitijela).

3 Zahtevi za serumom

Serum treba da bude potpuno providan bez ikakvih primesa ćelija.

Obično ga dobiju u 2. sedmici bolesti, kada su antitijela već dostupna.

Krv se uzima u količini od 3-5 ml na prazan želudac ili 6 sati nakon obroka.

Da bi se dobio serum, krv se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi ili centrifugira. Serum se isisava vrlo pažljivo kako ne bi zahvatio formirane elemente.

Imuni serumi se dobijaju iz krvi ljudi ili životinja (obično zečeva i konja), imuniziranih prema određenoj shemi odgovarajućim antigenom (vakcinom). Serumi se obično pripremaju u proizvodnji.

4. Koncept pozitivnih i negativnih rezultata.

RA.

Uz pozitivnu reakciju, pasivno zalijepljena crvena krvna zrnca prekrivaju dno rupe u ravnom sloju sa nazubljenim rubovima („kišobran“); u odsustvu aglutinacije, crvena krvna zrnca se akumuliraju u središnjem udubljenju rupe, formirajući kompaktno „dugme“ sa oštro definisanim ivicama (vidi slike iznad).

RP.

Ako je rezultat pozitivan, mliječni prsten se formira na granici između dva rješenja (pogledajte slike iznad).

ELISA.

Promjena boje otopine javlja se pozitivnom reakcijom.

RSK.

Odgođena hemoliza - reakcija je pozitivna; ako je komplement slobodan, uočava se hemoliza - reakcija je negativna(pogledajte slike iznad).

Rezultati Wassermanove reakcije:

a - potpuno odlaganje hemolize (++ + ++);

b - izraženo kašnjenje u hemolizi (+ ++);

c - parcijalno odlaganje hemolize (++);

d - blago kašnjenje u hemolizi (+);

d - potpuna hemoliza (-).

Reakcija je pozitivna sa djelomičnim, izraženim i potpunim kašnjenjem hemolize, što je određeno stepenom bojenja sadržaja epruveta od svijetloružičaste do svijetlocrvene; nehemolizirani eritrociti nakon toga formiraju crveni talog.

Zadaća:

1. Proučite gradivo

Napravite 3 bilješke na videu

13.1. Reakcije antigen-antitijelo i njihova primjena

Kada se unese antigen, u tijelu se stvaraju antitijela. Antitijela su komplementarna antigenu koji je izazvao njihovu sintezu i sposobna su da se vežu za njega. Vezivanje antigena za antitela sastoji se od dve faze. Prva faza je specifična, u kojoj dolazi do brzog vezivanja antigenske determinante za aktivni centar Fab fragmenta antitijela. Treba napomenuti da je vezivanje posljedica van der Waalsovih sila, vodonika i hidrofobnih interakcija. Snaga veze određena je stepenom prostorne korespondencije između aktivnog mjesta antitijela i epitopa antigena. Nakon specifične faze počinje sporija faza – nespecifična, koja se manifestuje vidljivim fizičkim fenomenom (npr. stvaranje ljuskica tokom aglutinacije i sl.).

Imunološke reakcije su interakcije između antitijela i antigena, a te reakcije su specifične i vrlo osjetljive. Široko se koriste u medicinskoj praksi. Uz pomoć imunoloških reakcija mogu se riješiti sljedeći problemi:

Određivanje nepoznatih antitela poznatim antigenima (antigenski dijagnostikum). Ovaj zadatak se javlja kada je potrebno odrediti antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta (serodijagnostika). Pronalaženje antitijela omogućava vam da potvrdite dijagnozu;

Određivanje nepoznatih antigena korištenjem poznatih antitijela (dijagnostički serum). Ova studija se provodi prilikom identifikacije kulture patogena izolirane iz materijala pacijenta (serotipizacija), kao i prilikom otkrivanja

mikrobnih antigena i njihovih toksina u krvi i drugim biološkim tečnostima. Postoji mnogo vrsta imunoloških reakcija koje se razlikuju po tehnici insceniranja i zabilježenom efektu. To su reakcije aglutinacije (RA), reakcije precipitacije (RP), reakcije koje uključuju komplement (RSC), reakcije koje koriste označene komponente (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reakcija aglutinacije

Reakcija aglutinacije (RA) je imunološka reakcija interakcije antigena sa antitijelima u prisustvu elektrolita, a antigen je u korpuskularnom stanju (eritrociti, bakterije, čestice lateksa sa adsorbiranim antigenima). Tokom aglutinacije, korpuskularni antigeni su zalijepljeni antitijelima, što se manifestira stvaranjem flokulantnog taloga. Do stvaranja pahuljica dolazi zbog činjenice da antitijela imaju dva aktivna centra, a antigeni su polivalentni, tj. imaju nekoliko antigenskih determinanti. RA se koristi za identifikaciju patogena izoliranog iz pacijentovog materijala, kao i za otkrivanje antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta (na primjer, Wrightove i Heddlesonove reakcije za brucelozu, Widalovu reakciju za trbušni tifus i paratifusnu groznicu).

Najjednostavniji način za dijagnosticiranje RA je reakcija na staklu; ovo je približni RA, koji se koristi za određivanje patogena izoliranog od pacijenta. Kada se uspostavi reakcija, dijagnostički aglutinirajući serum se nanese na predmetno staklo (u razrjeđenju 1:10 ili 1:20), zatim se dodaje kultura pacijenta. Reakcija je pozitivna ako se u kapi pojavi flokulantni sediment. U blizini se postavlja kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijum hlorida. Ako dijagnostički aglutinirajući serum nije adsorbiran 1, onda se razrjeđuje (do titra - razrjeđenja do kojeg treba doći do aglutinacije), tj. stavite prošireni RA u epruvete sa povećanjem

1 Neadsorbirani aglutinirajući serum može aglutinirati srodne bakterije koje imaju zajedničke (unakrsne) antigene. Stoga koristeadsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su ukrštena antitijela uklonjena adsorpcijom na srodne bakterije. Takvi serumi zadržavaju antitijela koja su specifična samo za datu bakteriju.

razrjeđenja aglutinirajućeg seruma, u koje se dodaju 2-3 kapi suspenzije patogena izoliranog od pacijenta. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stepenom bistrenja tečnosti u epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Reakcija je praćena kontrolama: serum razrijeđen izotoničnim rastvorom natrijum hlorida treba da bude providan, suspenzija mikroba u istom rastvoru treba da bude jednolično zamućena, bez sedimenta.

Za određivanje antitijela na patogen u pacijentovom krvnom serumu koristi se RA u punom opsegu. Prilikom postavljanja, pacijentov krvni serum se razrjeđuje u epruvetama i u epruvete se dodaje jednaka količina suspenzije dijagnostikuma (suspenzije ubijenih mikroba). Nakon inkubacije određuje se najveće razrjeđenje seruma pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. formiran je precipitat (titar seruma). U ovom slučaju, reakcija aglutinacije sa O-diagnosticumom (bakterije ubijene zagrijavanjem, zadržavajući termostabilni O-antigen) se javlja u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije sa H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i teče brže.

Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA ili RPGA) je vrsta RA. Ova metoda je vrlo osjetljiva. Uz pomoć RNGA mogu se riješiti dva problema: odrediti antitijela u krvnom serumu pacijenta, čemu se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum, a to su eritrociti na kojima su adsorbirani poznati antigeni; utvrdi prisustvo antigena u test materijalu. U ovom slučaju, reakcija se ponekad naziva reakcija reverzne indirektne hemaglutinacije (RONHA). Tokom postupka testnom materijalu se dodaje eritrocitni dijagnostikum antitijela (eritrociti sa adsorbiranim antitijelima na njihovoj površini). U ovoj reakciji crvena krvna zrnca djeluju kao nosioci i pasivno su uključena u formiranje imunoloških agregata. Uz pozitivnu reakciju, pasivno zalijepljena crvena krvna zrnca prekrivaju dno rupe u ravnom sloju sa nazubljenim rubovima („kišobran“); u nedostatku aglutinacije, crvena krvna zrnca se akumuliraju u središnjem udubljenju rupe, tvoreći kompaktno "dugme" s oštro definiranim rubovima.

Reakcija koaglutinacije koristi se za određivanje ćelija patogena (antigena) korištenjem antitijela adsorbiranih na Staphylococcus aureus, koji sadrže protein A. Protein A ima afinitet za Fc fragment imunoglobulina. Zahvaljujući tome, antitijela se vezuju za stafilokok indirektno preko Fc fragmenta, a Fab fragmenti su orijentirani prema van i mogu stupiti u interakciju s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. U tom slučaju nastaju pahuljice.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) koristi se u dijagnostici virusnih infekcija, i to samo infekcija uzrokovanih hemaglutinirajućim virusima. Ovi virusi na svojoj površini sadrže protein - hemaglutinin, koji je odgovoran za reakciju hemaglutinacije (HRA) kada se crvena krvna zrnca dodaju virusima. RTGA uključuje blokiranje virusnih antigena antitijelima, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica.

Coombsova reakcija - RA za određivanje nekompletnih antitijela. Kod nekih zaraznih bolesti, kao što je bruceloza, nepotpuna antitijela na patogen cirkuliraju u krvnom serumu pacijenta. Nepotpuna antitijela nazivaju se blokirajućim antitijelima jer imaju jedno mjesto vezanja antigena, a ne dva, kao potpuna antitijela. Stoga, kada se doda antigenski dijagnostikum, nekompletna antitijela se vežu za antigene, ali ih ne lijepe zajedno. Za ispoljavanje reakcije dodaje se antiglobulinski serum (antitijela na humane imunoglobuline), što će dovesti do aglutinacije imunih kompleksa (antigenski dijagnostikum + nepotpuna antitijela) nastalih u prvoj fazi reakcije.

Indirektna Coombsova reakcija se koristi kod pacijenata sa intravaskularnom hemolizom. Kod nekih od ovih pacijenata otkrivena su nepotpuna monovalentna anti-Rhesus antitijela. Oni specifično stupaju u interakciju s Rh-pozitivnim eritrocitima, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Zbog toga se antiglobulinski serum dodaje u sistem anti-Rh antitela + Rh-pozitivni eritrociti, što izaziva aglutinaciju eritrocita. Koristeći Coombsovu reakciju, dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunološkog porijekla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčeta uzrokovana Rh konfliktom.

RA za određivanje krvnih grupa zasniva se na aglutinaciji eritrocita antitijelima imunološkog seruma na antigene krvne grupe A(II), B(III). Kontrola je serum koji ne sadrži antitijela, tj. serumske AB(IV) krvne grupe i eritrocitnih antigena grupa A(P) i B(III). Crvena krvna zrnca grupe 0(I) koriste se kao negativna kontrola jer nemaju antigene.

Za određivanje Rh faktora koriste se anti-Rh serumi (najmanje dvije različite serije). Ako na membrani ispitivanih eritrocita postoji Rh antigen, dolazi do aglutinacije ovih stanica.

13.3. Reakcija precipitacije

RP je imunološka reakcija interakcije antitijela sa antigenima u prisustvu elektrolita, a antigen je u rastvorljivom stanju. Tokom precipitacije, rastvorljivi antigeni se precipitiraju antitelima, što se manifestuje zamućenjem u obliku taložnih traka. Stvaranje vidljivog taloga se opaža kada se oba reagensa pomiješaju u ekvivalentnim omjerima. Višak jednog od njih smanjuje broj precipitiranih imunoloških kompleksa. Postoje različiti načini za izvođenje reakcije precipitacije.

Prstenasta reakcija precipitacije smeštene u taložne cevi malog prečnika. Imuni serum se dodaje u epruvetu i rastvorljivi antigen se pažljivo slojeva. Ako je rezultat pozitivan, na granici između dva rješenja formira se mliječni prsten. Reakcija prstenaste precipitacije, koja se koristi za određivanje prisustva antigena u organima i tkivima, čiji se ekstrakti kuhaju i filtriraju, naziva se reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija za određivanje termostabilnog antigena antraksa).

Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija. Ova reakcija se izvodi u agar gelu. U sloju gela ujednačene debljine, jažice se izrezuju na određenoj udaljenosti jedna od druge i pune antigenom, odnosno imunološkim serumom. Nakon toga, antigeni i antitijela difundiraju u gel, susreću se i formiraju imunološke komplekse, koji se talože u gelu i postaju vidljivi kao precizne linije.

ishrana. Ova reakcija se može koristiti za identifikaciju nepoznatih antigena ili antitela, kao i za testiranje sličnosti između različitih antigena: ako su antigeni identični, linije precipitacije se spajaju, ako antigeni nisu identični, linije precipitacije se ukrštaju, ako su antigeni delimično identično, formira se ostruga.

Radijalna imunodifuzijska reakcija. U rastopljeni agar gel se dodaju antitijela i gel se nanosi u ravnomjernom sloju na staklo. Jažice se izrezuju u gelu i u njih se dodaje standardni volumen otopina antigena različitih koncentracija. Tokom inkubacije, antigeni difundiraju radijalno iz bunara i, susrećući se s antitijelima, formiraju precipitacijski prsten. Sve dok višak antigena ostaje u bušotini, dolazi do postepenog povećanja prečnika precipitacionog prstena. Ova metoda se koristi za određivanje antigena ili antitijela u test otopini (na primjer, za određivanje koncentracije imunoglobulina različitih klasa u krvnom serumu).

Imunoelektroforeza. Mješavina antigena se prvo elektroforetski odvaja, a zatim se precipitirajući antiserum dodaje u žlijeb koji ide duž smjera kretanja proteina. Antigeni i antitela difunduju u gel jedni prema drugima; u interakciji, formiraju lučne linije padavina.

Reakcija flokulacije(prema Ramonu) - vrsta precipitacijske reakcije koja se koristi za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida. Reakcija se izvodi u epruvetama. U epruveti u kojoj su toksoid i antitoksin u ekvivalentnom omjeru, uočava se zamućenost.

13.4. Reakcija fiksacije komplementa

Antitela, u interakciji sa odgovarajućim antigenom, vezuju dodatni komplement (1. sistem). Indikator fiksacije komplementa su eritrociti senzibilizirani hemolitičkim serumom, tj. antitela na crvena krvna zrnca (2. sistem). Ako komplement nije fiksiran u 1. sistemu, tj. Ako ne dođe do reakcije antigen-antitijelo, senzibilizirana crvena krvna zrnca se potpuno liziraju (negativna reakcija). Kada se komplement fiksira imunim kompleksima 1. sistema nakon dodavanja senzibiliziranih eritrocita, dolazi do hemolize iz

odsutan (pozitivna reakcija). Reakcija fiksacije komplementa koristi se za dijagnosticiranje zaraznih bolesti (gonoreja, sifilis, gripa, itd.).

13.5. Reakcija neutralizacije

Mikrobi i njihovi toksini štetno djeluju na organe i tkiva ljudskog tijela. Antitijela su u stanju da se vežu za ove štetne agense i blokiraju ih, tj. neutralisati. Dijagnostička reakcija neutralizacije zasniva se na ovoj osobini antitijela. Provodi se unošenjem mješavine antigen-antitijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (ćelijske kulture, embrije). Na primjer, da bi se otkrili toksini u materijalu pacijenta, životinjama 1. grupe ubrizgava se materijal od pacijenta. Životinjama 2. grupe ubrizgava se sličan materijal, prethodno tretiran odgovarajućim antiserumom. Životinje 1. grupe uginu ako se u materijalu nalazi toksin. Druga grupa životinja preživljava; štetni učinak toksina se ne manifestira, jer je neutraliziran.

13.6. Reakcije koje koriste obilježena antitijela ili antigene

13.6.1. Reakcija imunofluorescencije (RIF, Koons metoda)

Ova metoda se koristi za ekspresnu dijagnostiku. Može se koristiti za otkrivanje i mikrobnih antigena i antitijela.

Direktna RIF metoda- imunološka reakcija interakcije antitela sa antigenima, a antitela su obeležena fluorohromom - supstancom koja je sposobna da emituje kvante svetlosti određene talasne dužine kada je izložena svetlosti određene talasne dužine. Posebnost ove metode je potreba za uklanjanjem neizreagiranih komponenti kako bi se isključila detekcija nespecifične luminiscencije. Da biste to učinili, isperite nereagirana antitijela. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom svijetle na tamnoj pozadini duž periferije ćelije.

Indirektna RIF metoda koristi se češće od prethodnog. Ova reakcija se odvija u dvije faze. U prvoj fazi, antigeni međusobno

stupaju u interakciju s odgovarajućim antitijelima, formirajući imune komplekse. Sve komponente koje nisu reagirale (tj. nisu dio imunoloških kompleksa) moraju se ukloniti pranjem. U drugoj fazi, nastali kompleks antigen-antitijelo se detektuje korištenjem fluorohromiranog antiglobulinskog seruma. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + antitijela na zečje imunoglobuline, označena fluorohromom. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.

13.6.2. Enzimska imunosorbentna metoda ili test

ELISA je najčešća moderna metoda koja se koristi za dijagnostiku virusnih, bakterijskih, protozojskih infekcija, posebno za dijagnostiku HIV infekcije, virusnog hepatitisa itd.

Postoji mnogo ELISA modifikacija. Nekompetitivna ELISA u čvrstoj fazi se široko koristi. Izvodi se u polistirenskim pločama sa 96 jažica (čvrsta faza). Prilikom izvođenja reakcije potrebno je u svakoj fazi isprati neizreagovane komponente. Prilikom određivanja antitijela, u jažice na kojima se sorbiraju antigeni dodaje se testni serum krvi, zatim enzimom obilježen antiglobulinski serum. Reakcija se izvodi dodavanjem supstrata za enzim. U prisustvu enzima, supstrat se menja, a kompleks enzim-supstrat se bira tako da se proizvod koji nastaje u reakciji oboji. Dakle, uz pozitivnu reakciju, uočava se promjena boje otopine. Za određivanje antigena, nosač u čvrstoj fazi se senzibilizira antitijelima, zatim se antigenima uzastopno dodaje test materijal (antigeni) i enzimski obilježeni serum. Da bi se reakcija odvijala, dodaje se supstrat za enzim. Promjena boje otopine javlja se pozitivnom reakcijom.

13.6.3. Imunobloting

Ova metoda se zasniva na kombinaciji elektroforeze i ELISA. Prilikom izvođenja imunoblotinga (blotiranje sa engleskog. mrlja- spot) kompleksna mješavina antigena se prvo podvrgava elektroforezi u poliakrilamidnom gelu. Dobijeni frakcionisani anti-

genski peptidi se prenose na nitroceluloznu membranu. Mrlje se zatim tretiraju enzimima označenim antitijelima na specifični antigen, tj. izvršiti ELISA blot. Imunobloting se koristi u dijagnostici infekcija kao što je HIV.

13.6.4. Imunološka elektronska mikroskopija

Metoda uključuje mikroskopiranje virusa (rjeđe drugih mikroba) u elektronskom mikroskopu, prethodno tretiranih odgovarajućim imunološkim serumom označenim elektronskim optički gustim preparatima, na primjer feritinom, proteinom koji sadrži željezo.

13.7. Protočna citometrija

Krvne ćelije se razlikuju na osnovu laserske citofluorometrije. Da bi se to postiglo, željene ćelije su obojene fluorescentnim monoklonskim antitelima na CD antigene. Uzorak krvi, nakon što je tretiran obilježenim antitijelima, prolazi kroz tanku cijev i kroz nju se propušta laserski snop koji pobuđuje fluorokrom da svijetli. Intenzitet fluorescencije je u korelaciji sa gustinom antigena na površini ćelije i može se kvantitativno meriti pomoću fotomultiplikatora. Dobijeni rezultati se pretvaraju u histogram.

Protočna citometrija se koristi za određivanje imunološkog statusa (sadržaj glavnih populacija limfocita, sadržaj intracelularnih i ekstracelularnih citokina, funkcionalna aktivnost NK ćelija, aktivnost fagocitoze, itd.).