Na kraju članka, vidi
Lančana reakcija polimeraze (PCR) izumio je 1983. Kary Mullis (američki naučnik). Nakon toga je dobio Nobelovu nagradu za ovaj izum. Trenutno je PCR dijagnostika jedna od najpreciznijih i najosjetljivijih metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti.
Lančana reakcija polimeraze (PCR)- eksperimentalna metoda molekularne biologije, metoda za značajno povećanje malih koncentracija određenih fragmenata nukleinske kiseline (DNK) u biološkom materijalu (uzorku).
PCR metoda se zasniva na ponovljenom udvostručavanju određenog dijela DNK pomoću enzima u umjetnim uvjetima (in vitro). Kao rezultat, proizvode se količine DNK dovoljne za vizualnu detekciju. U ovom slučaju se kopira samo dio koji zadovoljava navedene uslove i to samo ako je prisutan u uzorku koji se proučava.
Osim jednostavnog povećanja broja DNK kopija (ovaj proces se naziva amplifikacija), PCR omogućava mnoge druge manipulacije s genetskim materijalom (uvođenje mutacija, spajanje fragmenata DNK), a široko se koristi u biološkoj i medicinskoj praksi, npr. , za dijagnosticiranje bolesti (nasljednih, infektivnih), za utvrđivanje očinstva, za kloniranje gena, uvođenje mutacija i izolaciju novih gena.

Specifičnost i primjena

Izvođenje PCR-a

Za izvođenje PCR-a u najjednostavnijem slučaju potrebne su sljedeće komponente:

• DNK šablon koji sadrži dio DNK koji treba amplificirati;
• dva prajmera komplementarna krajevima željenog fragmenta;
• termostabilna DNK polimeraza;
• deoksinukleotid trifosfati (A, G, C, T);
• Mg2+ joni neophodni za rad polimeraze;
• puferski rastvor.

PCR se izvodi u termičkom ciklusu - uređaju koji obezbjeđuje periodično hlađenje i zagrijavanje epruveta, obično s tačnošću od najmanje 0,1°C. Da biste izbjegli isparavanje reakcione smjese, dodajte ulje visokog ključanja, kao što je vazelin, u epruvetu. Dodatak specifičnih enzima može povećati prinos PCR reakcije.
Napredak reakcije

Tipično, PCR izvodi 20 - 35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze. Dvolančani DNK šablon se zagreva na 94 - 96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5 - 2 minuta da bi se odvojili DNK lanci. Ova faza se zove denaturacija - razorene su vodikove veze između dva lanca. Ponekad se, prije prvog ciklusa, reakciona smjesa prethodno zagrijava 2 - 5 minuta da bi se matriks i prajmeri potpuno denaturirali.
Kada se lanci razdvoje, temperatura se snižava kako bi se prajmerima omogućilo da se vežu za jednolančani šablon. Ova faza se naziva žarenje. Temperatura žarenja zavisi od prajmera i obično se bira 4 - 5°C ispod njihove temperature topljenja. Trajanje faze je 0,5 - 2 minute.

DNK polimeraza replicira šablonski lanac koristeći prajmer kao prajmer. Ovo je faza elongacije. Temperatura elongacije zavisi od polimeraze. Obično korištene polimeraze su najaktivnije na 72°C. Vrijeme elongacije ovisi i o vrsti DNK polimeraze i o dužini amplificiranog fragmenta. Tipično, vrijeme elongacije se uzima kao jedan minut na hiljadu parova baza. Nakon što su svi ciklusi završeni, često se izvodi dodatni završni korak elongacije kako bi se kompletirali svi jednolančani fragmenti. Ova faza traje 10-15 minuta.
Priprema materijala za istraživanje i transport u laboratoriju

Za uspješnu analizu važno je pravilno prikupiti materijal od pacijenta i pravilno ga pripremiti. Poznato je da se u laboratorijskoj dijagnostici većina grešaka (do 70%) pravi upravo u fazi pripreme uzorka. Za prikupljanje krvi u laboratoriji INVITRO trenutno se koriste vakuumski sistemi koji, s jedne strane, minimalno ozljeđuju pacijenta, a s druge omogućavaju prikupljanje materijala na način da ne dolazi u kontakt sa bilo osoblja ili okoline. Time se izbjegava kontaminacija (kontaminacija) materijala i osigurava objektivnost PCR analize.

DNK – deoksiribonukleinska kiselina – je biološki polimer, jedna od dvije vrste nukleinskih kiselina koje osiguravaju skladištenje, prijenos s generacije na generaciju i implementaciju genetskog programa za razvoj i funkcioniranje živih organizama. Glavna uloga DNK u ćelijama je dugoročno skladištenje informacija o strukturi RNK i proteina.

RNA-ribonukleinska kiselina je biološki polimer sličan po svojoj hemijskoj strukturi DNK. Molekul RNK je izgrađen od istih monomernih jedinica - nukleotida - kao i DNK. U prirodi, RNK obično postoji kao jedan lanac. Kod nekih virusa, RNK je nosilac genetske informacije. U ćeliji igra važnu ulogu u prijenosu informacija sa DNK na protein. RNK se sintetiše na DNK šablonu. Ovaj proces se zove transkripcija. Postoje područja u DNK koja sadrže informacije odgovorne za sintezu tri vrste RNK, koje se razlikuju po funkcijama koje obavljaju: glasnička ili glasnička RNA (mRNA), ribosomska RNA (rRNA) i transportna RNA (tRNA). Sve tri vrste RNK su na ovaj ili onaj način uključene u sintezu proteina. Međutim, informacije o sintezi proteina sadržane su samo u mRNA.

Nukleotidi su osnovna ponavljajuća jedinica u molekulima nukleinske kiseline, proizvod hemijske kombinacije azotne baze, šećera sa pet ugljenika (pentoze) i jedne ili više fosfatnih grupa. Nukleotidi prisutni u nukleinskim kiselinama sadrže jednu fosfatnu grupu. Ime su dobili prema dušičnoj bazi koju sadrže - adenin (A), koji sadrži adenin, gvanin (G) - gvanin, citozin (C) - citozin, timin (T) - timin, uracil (U) - uracil. DNK sadrži 4 vrste nukleotida - A, T, G, C, RNK takođe sadrži 4 tipa - A, U, G, C. Šećer u svim nukleotidima DNK je deoksiriboza, RNK - riboza. Kada se formiraju nukleinske kiseline, nukleotidi se vezuju i formiraju šećerno-fosfatnu kičmu molekule, na čijoj se jednoj strani nalaze baze.

Prajmer je kratka DNK koja se koristi za repliciranje lanca šablona. Svaki od prajmera je komplementaran jednom od lanaca dvolančanog šablona, ​​uokvirujući početak i kraj amplificiranog regiona.

Književnost

1. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija. Principi i primjena. Per. sa engleskog - M.: Mir, 2002. - 589 str., ilustr. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Genetski inženjering - Novosibirsk: Sibirsk. Univ. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.; ill. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Umjetni genetski sistemi - M.: Nauka, 2005 - U 2 toma - ISBN 5-02-033278-X

BITAN!

Informacije u ovom odjeljku ne mogu se koristiti za samodijagnozu i samoliječenje. U slučaju boli ili drugog pogoršanja bolesti, dijagnostičke testove treba propisati samo liječnik. Da biste postavili dijagnozu i pravilno propisali liječenje, obratite se svom ljekaru.

Polimerazna lančana reakcija (PCR) je visokoprecizna metoda u području dijagnosticiranja nasljednih patologija, infekcija, virusnih bolesti u bilo kojoj fazi (akutnoj ili kroničnoj), kao i - u ranoj fazi - prije očiglednih manifestacija bolesti identifikacijom patogene na osnovu njihove DNK, RNK, koji su genetski materijal, u uzorcima dobijenim od pacijenta. A danas ćemo govoriti o suštini, dijagnostičkim fazama i principima metoda polimerazne lančane reakcije (PCR), kao io njegovoj cijeni.

Šta je polimerazna lančana reakcija

Osnova analize je amplifikacija (udvostručavanje) - stvaranje velikog broja kopija iz kratkog dijela DNK (deoksiribonukleinske kiseline), koji predstavlja ljudski genetski kompleks. Za ispitivanje je potrebna vrlo mala količina fizioloških supstanci (sputum, izmet, struganje epitela, sok prostate, krv, sperma, amnionska tečnost, sluz, placentno tkivo, urin, pljuvačka, pleuralna tečnost, likvor). U ovom slučaju, na primjer, čak i jedan štetni mikrob može se otkriti u pacijentovom genitourinarnom traktu.

Tehniku ​​PCR (lančana reakcija polimeraze) razvio je američki naučnik K. Mullis, koji je dobio Nobelovu nagradu 1993. godine.

Aktivno korišteno:

• u ranoj dijagnostici infekcija, genetskih;
• u forenzičkom medicinskom pregledu kada postoji izuzetno mala količina DNK dostupna za ispitivanje;
• u veterinarskoj medicini, farmaciji, biologiji, molekularnoj genetici;
• za identifikaciju osobe po DNK, potvrda očinstva;
• u paleontologiji, antropologiji, ekologiji (prilikom praćenja kvaliteta proizvoda, faktori životne sredine).

Ovaj video će vam detaljno reći šta je lančana reakcija polimeraze:

Kome je propisano?

Lančana reakcija polimeraze u dijagnostici zaraznih bolesti jedna je od najpouzdanijih metoda posebne točnosti i pouzdanosti. Na primjer, pouzdanost PCR analize za klamidiju i mnoge druge patogene je blizu 100% (apsolutno). Najčešće se postupak lančane reakcije polimerazom propisuje pacijentima koji imaju poteškoća u identifikaciji specifičnog patogena tijekom dijagnoze.

Laboratorijski PCR test se koristi:

• otkrivanje patogena koji uzrokuju infekcije mokraćnih i genitalnih organa koje je teško identificirati kultiviranjem ili imunološkim metodama;
• za ponovnu dijagnozu HIV-a u početnoj fazi u slučaju pozitivnog, ali upitnog rezultata inicijalnog testa (na primjer, kod novorođenčadi od roditelja zaraženih AIDS-om);
• identificirati rak u ranoj fazi (proučavanje onkogenih mutacija) i individualno prilagoditi režim liječenja za određenog pacijenta;
• u svrhu ranog otkrivanja i potencijalnog liječenja nasljednih patologija.

Tako budući roditelji testiraju se da li su nosioci genetske patologije, a kod djece PCR utvrđuje vjerovatnoću izloženosti bolesti koja se prenosi naslijeđem.

• za otkrivanje fetalnih patologija u ranim fazama gestacije (pojedinačne ćelije rastućeg embrija se ispituju na prisustvo mogućih mutacija);
• kod pacijenata prije transplantacije organa - za “tipizaciju tkiva” (određivanje kompatibilnosti tkiva);
• identificirati opasne patogene organizme u darovanoj krvi;
• kod novorođenčadi - za prepoznavanje skrivenih infekcija;
• za procjenu rezultata antivirusnog i antimikrobnog liječenja.

Zašto se podvrgnuti takvoj proceduri?

Budući da je PCR visokoefikasna dijagnostička metoda, koja daje gotovo 100% rezultata, koristi se postupak:

• potvrditi ili isključiti konačnu dijagnozu;
• brza procjena efikasnosti terapije.

U mnogim slučajevima, PCR je jedini mogući test za otkrivanje bolesti u razvoju ako su druge bakteriološke, imunološke i virološke dijagnostičke metode beskorisne.

• Virusi se otkrivaju PCR procedurom neposredno nakon infekcije i prije pojave znakova bolesti. Rano otkrivanje virusa omogućava brzo liječenje.
• Takozvano “virusno opterećenje” (ili broj virusa u tijelu) se također određuje analizom DNK pomoću kvantitativne metode.
• Specifični patogeni (npr. Kochov bacil tuberkuloze) su teški i predugo se uzgajaju. PCR testiranje omogućava brzo otkrivanje minimalnog broja patogena (živih i mrtvih) u uzorcima pogodnim za testiranje.

Detaljna analiza DNK patogena se koristi:

• utvrditi njegovu osjetljivost na određene vrste antibiotika, što omogućava hitno liječenje;
• suzbijanje širenja epidemija među domaćim i divljim životinjama;
• identificirati i pratiti nove zarazne mikrobne vrste i podtipove patogena koji su potaknuli prethodne epidemije.

Vrste dijagnostike

Standardna metoda

Analiza lančane reakcije polimeraze provodi se na osnovu višestruke amplifikacije (udvostručavanja) specifičnog fragmenta DNK i RNK pomoću posebnih prajmer enzima. Kao rezultat lanca kopiranja, dobija se dovoljna količina materijala za istraživanje.

Tokom postupka kopira se samo željeni fragment (koji odgovara navedenim specifičnim uslovima) i ako je zaista prisutan u uzorku.

Ovaj detaljni video sa korisnim dijagramima objašnjava kako PCR radi:

Druge metode

• PCR u realnom vremenu. U ovoj vrsti istraživanja, proces identifikacije datog DNK fragmenta počinje nakon svakog ciklusa, a ne nakon završetka cijelog lanca od 30 - 40 ciklusa. Ova vrsta istraživanja omogućava vam da dobijete informacije o količini patogena (virusa ili mikroba) u tijelu, odnosno da izvršite kvantitativnu analizu.
• RT-PCR (režim reverzne transkripcije). Ovaj test se koristi za traženje jednolančane RNK za otkrivanje virusa čija je genetska baza RNA (na primjer, virus hepatitisa C, virus imunodeficijencije). U ovoj studiji se koristi poseban enzim - reverzna transkriptaza i specifični prajmer, a jednolančana DNK se gradi na bazi RNK. Zatim se iz ovog lanca izdvaja drugi lanac DNK i izvodi se standardni postupak.

Indikacije za testiranje

PCR postupak se koristi u klinici za infektivne bolesti, neonatologiji, akušerstvu, pedijatriji, urologiji, ginekologiji, venerologiji, neurologiji, nefrologiji i oftalmologiji.

Indikacije za testiranje:

• utvrđivanje rizika od razvoja genetskih abnormalnosti kod djeteta s vjerojatnošću nasljednih patologija;
• dijagnosticiranje oba roditelja prilikom planiranja trudnoće ili ozbiljnog stanja majke u toku trudnoće;
• poteškoće sa začećem, utvrđivanje uzroka neplodnosti;
• sumnja na spolno prenosive infekcije u akutnoj fazi i sa simptomima njihovog prijelaza u kroničnu;
• otkrivanje uzroka upalnih procesa nepoznatog porijekla;
• nezaštićeni slučajni i redovni seksualni kontakti;
• određivanje osjetljivosti patogenog mikroorganizma na specifične antibiotike;
• pacijenti sa sumnjom na latentnu infekciju radi otkrivanja patogena prije razvoja očiglednih simptoma (preklinička dijagnoza);
• pacijenti za potvrdu oporavka nakon bolesti (retrospektivna dijagnoza);

Dijagnostika se također koristi ako je potrebno precizno identificirati sljedeće patogene:

• virusi hepatitisa (A B C G), humana imunodeficijencija, citomegalovirus;
• Vibrio cholerae;
• herpes simplex virus, herpetiformne vrste;
• retro - adeno - i rinovirusi;
• virusi rubeole, Epstein-Barr, varičele (Zoster);
• parvo i pikornovirusi;
• bakterija Helicobacter pylori;
• Legionela, patogeni tipovi Escherichia coli;
• Staphylococcus aureus;
• patogen;
• klostridija, difterija i hemofilus influenzae;

Također se koristi za određivanje infekcija:

• Infektivna mononukleoza;
• borelioza, listerioza, krpeljni encefalitis;
• kandidijaza uzrokovana gljivicama Candida;
• spolno prenosive infekcije – trihomonijaza, ureaplazmoza, treponema pallidum, gardnereloza, gonoreja, mikoplazmoza, klamidija;
• tuberkuloza.

Kontraindikacije za

Kako se zahvat ne izvodi sa pacijentom, bez ikakvog uticaja na organizam, već sa biološkim materijalom uzetim za istraživanje, nema kontraindikacija za PCR zbog odsustva potencijalne opasnosti.

Međutim, biomaterijal se ne prikuplja iz cervikalnog kanala materice nakon kolposkopije. Dostavljanje razmaza i struganja na analizu dozvoljeno je tek 4-6 dana nakon završetka menstruacije i potpunog prestanka iscjetka.

Da li je metoda sigurna?

Nije moguć negativan uticaj na pacijenta tokom izolovanog proučavanja njegovog biomaterijala u laboratoriji.

Priprema za proceduru (dostavljanje bioloških supstanci na analizu)

Bilo koja biološka tekućina, tkivo ili izlučevina tijela služe kao uzorak za PCR analizu, koja otkriva DNK stranog patogena. Ispitna tvar se uzima u obliku vađenja krvi iz vene, struganja iz larinksa, nosne šupljine, uretre, pleuralne šupljine, grlića materice.

Prije dijagnostičke procedure, doktor objašnjava pacijentu koji materijal će biti prikupljen:

1. Prilikom pregleda na spolno prenosive infekcije prikuplja se sekret iz genitalnih organa, urin i bris iz uretre.
2. Prilikom analize na herpetične infekcije uzima se na analizu citomegalovirus, mononukleoza, urin i bris grla, a za hepatitis, toksoplazmozu vadi se krv iz vene.
3. Kako bi se dijagnosticirali različiti tipovi, prikuplja se cerebrospinalna tekućina.
4. U pulmologiji uzorci za analizu su sputum i pleuralna tečnost.
5. Prilikom provođenja studije o mogućim intrauterinim infekcijama tijekom trudnoće, za analizu se koriste amnionska tekućina i stanice placente.

Pouzdanost i tačnost analize zavisi od sterilnosti uslova pri uzimanju materijala. Budući da je PCR testiranje visoko osjetljivo, svaka kontaminacija ispitivane tvari može iskriviti rezultat.

Kompetentna priprema za isporuku biomaterijala ne predstavlja nikakve poteškoće za pacijente. Postoje određene preporuke:

• prilikom analize na spolno prenosive infekcije:
  • isključiti intimne kontakte 72 sata prije podnošenja materijala;
  • prestanite koristiti bilo koje vaginalne proizvode 3 dana prije;
  • od večeri prethodnog dana ne vršiti higijenu područja koje se pregleda;
  • isključiti mokrenje 3-4 sata prije uzimanja uzorka iz uretre;
• prestati uzimati antibiotike mjesec dana prije testiranja na infekcije;
• krv se daje ujutro prije jela i pića;
• Prvi jutarnji uzorak urina sakuplja se u sterilnu posudu nakon temeljitog intimnog toaleta.

U nastavku pročitajte kako se dijagnostika provodi metodom lančane reakcije polimeraze.

Kako funkcioniše procedura?

Prilikom izvođenja PCR studije, određeni ciklusi se ponavljaju iznova i iznova u reaktoru (pojačavač ili termalni ciklus):

1. Prvi korak je denaturacija. Pljuvačka, krv, materijal za biopsiju, ginekološki uzorci, sputum, u kojem se sumnja na prisustvo DNK (ili RNK) patogena, stavlja se u pojačalo, gdje se materijal zagrijava i DNK dijeli u dva odvojena lanca.
2. Drugi korak je žarenje ili lagano hlađenje materijala i dodavanje prajmera koji mogu prepoznati željene regije u molekulu DNK i vezati se za njih.
3. Treći korak je elongacija– javlja se nakon što su 2 prajmera pričvršćena na svaki od DNK lanca. Tokom procesa, fragment DNK patogena se dovršava i formira se njegova kopija.

Ovi ciklusi se ponavljaju poput "lančane reakcije", svaki put dovodeći do udvostručavanja kopija određenog fragmenta DNK (na primjer, segmenta u kojem je programiran određeni virus). U roku od nekoliko sati formiraju se mnoge kopije fragmenta DNK i otkriva se njihovo prisustvo u uzorku. Nakon toga se rezultati analiziraju i upoređuju sa podacima iz baze podataka različitih vrsta patogena kako bi se odredila vrsta infekcije.

U nastavku pročitajte o dekodiranju rezultata i zaključivanju na osnovu PCR reakcije.

Dekodiranje rezultata

Konačan rezultat studije se izdaje 1 – 2 dana nakon predaje biološkog materijala. Često - već prvog dana nakon analize.

Kvalitativna analiza

• Negativno rezultat znači da u supstanci dostavljenoj na ispitivanje nisu pronađeni tragovi infektivnih agenasa.
• Pozitivno rezultat znači otkrivanje patogenih virusa ili bakterija u biološkom uzorku s vrlo visokim stupnjem tačnosti u trenutku predaje materijala.

Ako je rezultat pozitivan, ali se ne otkriju znakovi povećane infekcije, ovo stanje tijela naziva se asimptomatskim "zdravim nošenjem". Najčešće se opaža pri uzimanju biomaterijala sa određenog mjesta (cervikalni kanal, uretra, usna šupljina) kod virusnih bolesti. U ovom slučaju nije potrebno liječenje, ali je potreban stalni medicinski nadzor, jer postoji mogućnost:

• širenje virusa od nosilaca i infekcija zdravih ljudi;
• aktivacija procesa i prelazak bolesti u kronični oblik.

Međutim, ako je nalaz krvi pozitivan, to ukazuje da je infekcija zahvatila tijelo, a to više nije stanje prijenosnika, već patologija koja zahtijeva hitnu specifičnu terapiju.

Kvantitativna analiza

Kvantitativni rezultat određuje specijalist posebno za određenu vrstu infekcije. Na osnovu toga moguće je procijeniti stupanj razvoja i stadijum bolesti, što omogućava pravovremeno propisivanje ispravnog liječenja.

prosječna cijena

Cijene polimerazne lančane reakcije određuju se prema: vrsti istraživanja, težini identifikacije patogena, težini prikupljanja biološkog materijala, vrsti analize (kvalitativne ili kvantitativne) i nivou cijene u laboratoriji.

S druge strane, prilikom proučavanja PCR-a moguće je identificirati nekoliko patogena odjednom prilikom prikupljanja jedne vrste materijala za analizu. To vam omogućava da uštedite na drugim laboratorijskim testovima.

Približna cijena PCR analize u rubljama:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis – od 180
• chlamydia trachomatis – od 190
• papiloma virus – od 380 do 500
• biocenoza urogenitalnog trakta kod žena (kvantitativna i kvalitativna procjena mikroflore) – od 800.

Još korisnije informacije o PCR testiranju nalaze se u videu ispod:

Genetika bakterija. Informacije za drugu lekciju.

Lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimerazom je metoda koja omogućava višestruko povećanje (amplifikaciju) količine određenih molekula DNK u analiziranom uzorku (uključujući u biološkom materijalu ili čistoj kulturi).

Glavne prednosti PCR-a kao dijagnostičke metode u mikrobiologiji su vrlo visoka osjetljivost, koja omogućava otkrivanje ekstremno niskih koncentracija patogena u uzorcima, kao i podesiva specifičnost, omogućavajući detekciju ili identifikaciju patogena na nivou roda, vrste ili podvrste. Glavni nedostatak PCR-a proizlazi iz njegove izuzetno visoke osjetljivosti - vrlo je lako da se uzorci kontaminiraju DNK iz pozitivne kontrole, drugog uzorka ili PCR proizvoda, što rezultira lažno pozitivnom reakcijom. Ovo nameće stroga ograničenja za uslove pod kojima se vrši PCR mešanje i rad sa gotovim PCR proizvodima.

Izvođenje PCR-a. Priprema se reakciona smeša koja sadrži sledeće komponente:

Izolovani DNK iz uzorka za testiranje,

puferski rastvor,

Mg2+ joni (neophodni za funkcioniranje enzima),

Dva prajmera su jednolančani kratki DNK molekuli (najčešće dužine 18 do 24 nukleotida), komplementarni krajevima različitih lanaca DNK sekvence koja se detektuje.

Smjesa deoksinukleotid trifosfata.

DNK polimeraza otporna na toplinu (najčešće se koristi Taq polimeraza - polimeraza izolirana iz Thermus aquaticus).

Ova reakciona smeša se zatim stavlja u termički ciklus, koji je u suštini programabilni termostat. Termocikler izvodi 30-40 ciklusa promjena temperature. Svaki od ovih ciklusa sastoji se od tri faze (vidi sliku 1):

Denaturacija (temperatura 94 o C) - lanci vodonika su prekinuti i DNK lanci divergiraju.

Žarenje prajmera (temperatura je obično oko 50-60 o C) - prajmeri se vezuju za krajeve lanaca DNK. Općenito, kada se temperatura snizi, energetski je povoljnije ponovo spojiti originalne lance DNK iz uzorka za testiranje (renaturacija), međutim, koncentracija prajmera u reakcionoj smjesi je mnogo reda veličine veća od koncentracije DNK iz uzorka. uzorak (barem u početnim PCR ciklusima), tako da se reakcija žarenja prajmera odvija brže od renaturacije DNK. Temperatura žarenja se bira u zavisnosti od temperature topljenja (denaturacije) prajmera.

Elongacija (temperatura je obično 72 o C) - DNK polimeraza kompletira prajmere duž šablona dugih DNK lanaca. Temperatura odgovara optimalnoj radnoj temperaturi korišćene DNK polimeraze.

Otkrivanje rezultata se razlikuje u različitim verzijama PCR-a i opisano je u odjeljku „Vrste PCR-a“.

PCR dinamika

U ranim PCR ciklusima, broj dvolančanih DNK molekula, čija je veličina određena razdaljinom između mjesta za slijetanje prajmera, udvostručuje se sa svakim ciklusom. Nastaje i mala količina dužih molekula DNK, što se može zanemariti (vidi sliku 2).

Tako se u ranim ciklusima količina PCR proizvoda opisuje formulom m*2 n, gdje je m početna količina željene DNK u uzorku, n broj ciklusa. Tada reakcija dostiže plato. To se događa zbog nakupljanja produkta reakcije, smanjenja koncentracije prajmera i deoksinukleotid trifosfata, kao i zbog povećanja koncentracije pirofosfata (vidi sliku 3).

Vrste PCR

Konvencionalni PCR

U ovoj verziji PCR postavke, reakcija se odvija u unaprijed odabranom broju ciklusa (30-40), nakon čega se analizira da li je došlo do akumulacije dvolančanih DNK molekula u reakcijskoj smjesi.

Ova opcija za izvođenje PCR-a, kada se koristi kao dijagnostička metoda, je kvalitativna metoda. Pozitivna reakcija ukazuje na prisustvo najmanje tragova željenih molekula DNK u uzorku. Negativna reakcija ukazuje na njihovo odsustvo. Kvantitativna procjena sadržaja originalnih molekula DNK u uzorku je nemoguća zbog toga što reakcija dostiže plato.

Glavna metoda za otkrivanje prisustva proizvoda je elektroforeza u agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. PCR proizvodi se odvajaju u gelu pod utjecajem električnog polja prema njihovoj molekularnoj težini. U gel se dodaje interkalirajuća boja (fluorescentna u dvolančanom DNK stanju – najčešće etidijev bromid). Dakle, nakon zračenja ultraljubičastom svjetlošću, moći će se vidjeti prisustvo ili odsustvo trake koja odgovara DNK potrebne molekularne težine. Prilikom izvođenja PCR-a u dijagnostičke svrhe, uvijek se koriste kontrole pozitivne i negativne reakcije sa kojima se uzorci upoređuju (vidi sliku 4).

PCR u realnom vremenu

U ovoj verziji PCR-a, količina PCR proizvoda u reakcionoj smjesi se konstantno bilježi tokom reakcije. Ovo vam omogućava da konstruišete reakcijsku krivu (vidi sliku 3) i na osnovu nje izračunate broj željenih molekula DNK u uzorcima.

Jedan tip PCR-a u realnom vremenu koristi se interkalirajuća boja, koja se dodaje direktno u reakcionu smjesu (najčešće se koristi SYBRGreen). Drugi tip koristi jedan od tipova fluorescentnih sondi koje se vezuju za mesto unutar PCR proizvoda, što omogućava povećanje specifičnosti detekcije (vidi sliku 5.) Detekcija fluorescencije se dešava direktno u uređaju tokom reakcije.

Pored mogućnosti kvantitativne detekcije, postoje i druge prednosti PCR-a u realnom vremenu u odnosu na konvencionalni PCR. Ova PCR opcija je jednostavnija, brža, a također ne zahtijeva otvaranje epruveta sa PCR proizvodima, što smanjuje vjerovatnoću kontaminacije drugih uzoraka. Glavni nedostatak je veći trošak termociklera sa ugrađenom sposobnošću detekcije fluorescencije u odnosu na konvencionalni.

Digitalni kvantitativni PCR

Nova, skupa i još uvijek rijetko korištena verzija PCR-a koja vam omogućava da preciznije odredite količinu DNK u uzorku.U ovoj verziji, reakcijska smjesa koja sadrži fluorescentnu boju podijeljena je na ogroman broj mikroskopskih volumena (npr. kapljice u emulziji). Nakon PCR-a, analizira se u kojoj frakciji kapljica je reakcija bila pozitivna i, shodno tome, uočava se fluorescencija. Ovaj dio će biti proporcionalan broju molekula DNK koji se traže u uzorku.

PCR reverzne transkripcije

U ovom slučaju, prije jedne ili druge verzije PCR-a, provodi se reakcija reverzne transkripcije (RNA u DNK) pomoću enzima reversetaze. Dakle, ova metoda omogućava kvalitativnu ili kvantitativnu detekciju RNK molekula. Ovo se može koristiti za otkrivanje RNA virusa ili određivanje nivoa transkripcije (količine mRNA) određenog gena.

Slika 1. PCR faze. Prajmeri su označeni crvenom bojom.

Slika 2. Akumulacija dvolančanih DNK molekula ograničenih prajmerima tokom PCR-a.

Slika 3. Dinamika PCR reakcije pri različitim početnim koncentracijama željenih DNK molekula u uzorku. (a) – najveća koncentracija (b) – srednja koncentracija (c) – najniža koncentracija

Slika 4. Agarozna elektroforeza PCR proizvoda. K+ – pozitivna kontrola (poznato je da je prisutna željena DNK). 1-7 – test uzorci (od kojih je 1-2 pozitivno, 3-7 negativno). K- – negativna kontrola (željena DNK je očigledno odsutna). U mnogim slučajevima, pored ciljnog proizvoda, vidljivi su i lakši nespecifični produkti reakcije (prajmer-dimeri).

Slika 5. Metode detekcije koristeći PCR u realnom vremenu. (a) – interkalirajuća boja – fluorescira kada je vezana za dvolančanu DNK (b) – Taqman sonda – fluorescencija se javlja kada je sonda cijepana od strane DNK polimeraze s 5’-3’ endonukleaznom aktivnošću zbog razdvajanja fluorofora i gasitelja. (c) – MolecularBeacon sonda – fluorescencija se javlja kada se sonda hibridizira sa ciljnim fragmentom zbog prostornog odvajanja fluorofora i gasitelja (d) – LightCycler sonde – fluorescencija akceptora se javlja kada se sonde (koje sadrže akceptor i donor) hibridiziraju sa ciljni fragment zbog rezonantnog prijenosa energije fluorescencije (FRET).

Lančana reakcija polimeraze (PCR)

Suština PCR metode. DNK polimeraza

Lančana reakcija polimerazom je eksperimentalna metoda molekularne biologije koja omogućava postizanje značajnog povećanja malih koncentracija određenih fragmenata nukleinske kiseline u biološkom materijalu. Ovaj proces povećanja broja kopija DNK naziva se pojačanje. Kopiranje DNK tokom PCR-a vrši se posebnim enzimom - polimeraza. DNK polimeraza (slika 3) je enzim uključen u replikaciju (amplifikaciju DNK u živim organizmima) DNK. Enzimi ove klase kataliziraju polimerizaciju deoksiribonukleotida duž lanca DNK nukleotida, koje enzim „čita“ i koristi kao šablon. Tip novog nukleotida određen je principom komplementarnosti sa šablonom iz kojeg se čita.

DNK polimeraza dodaje slobodne nukleotide na 3" kraj sastavljenog lanca. Ovo dovodi do produžavanja lanca u smjeru 5"-3. Nijedna od poznatih DNK polimeraza nije sposobna stvoriti lanac od nule: mogu samo dodati nukleotide na već postojeću 3"-hidroksilnu grupu. Iz tog razloga DNK polimeraza je potrebna prajmer- kratka sekvenca nukleotida (obično 20-25), komplementarna krajnjim dijelovima gena koji se proučava - kojoj bi mogla dodati prvi nukleotid. Prajmeri se uvek sastoje od DNK i RNK baza, pri čemu su prve dve baze uvek RNK baze. Prajmere sintetiše drugi enzim - primase. Još jedan enzim helicase- neophodan je za odmotavanje dvostruke spirale DNK kako bi se formirala jednolančana struktura, koja osigurava replikaciju oba lanca u skladu sa polukonzervativnim modelom replikacije DNK.

Neke DNK polimeraze takođe imaju sposobnost ispravljanja grešaka u novosastavljenom DNK lancu. Ako se otkrije netačan par nukleotida, DNK polimeraza se vraća za jedan korak, eliminiše netačan nukleotid iz lanca, a zatim ubacuje ispravan na njegovo mjesto, nakon čega se replikacija nastavlja kao i obično.

Izvođenje PCR-a

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je metoda amplifikacije DNK koja se može koristiti za izolaciju i umnožavanje specifične DNK sekvence milijarde puta u roku od nekoliko sati. Mogućnost dobivanja ogromnog broja kopija jednog strogo definiranog područja genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje postojećeg uzorka DNK.

Za izvođenje lančane reakcije polimerazom potrebno je ispuniti niz uvjeta. Za izvođenje PCR-a u najjednostavnijem slučaju potrebne su sljedeće komponente:

DNK šablon koji sadrži deo DNK koji treba da se pojača.

Dva prajmera komplementarna krajevima željenog fragmenta. (Par umjetno sintetiziranih oligonukleotida, obično veličine od 15 do 30 bp, identičnih odgovarajućim dijelovima ciljne DNK. Oni igraju ključnu ulogu u formiranju produkata reakcije amplifikacije. Pravilno odabrani prajmeri osiguravaju specifičnost i osjetljivost sistem za testiranje.)

Termostabilna DNK polimeraza. Polimeraza koja se koristi u PCR-u mora ostati aktivna na visokim temperaturama dugo vremena, pa se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus (Taq polimeraza) i drugi.

Deoksinukleotid trifosfati (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ joni neophodni za funkcionisanje polimeraze.

Puferski rastvor koji obezbeđuje potrebne reakcione uslove - pH, jonsku snagu rastvora. Sadrži soli, serumski albumin.

Da biste izbjegli isparavanje reakcione smjese, dodajte ulje visokog ključanja, kao što je vazelin, u epruvetu. Ako koristite uređaj sa grijanim poklopcem, to nije potrebno.

Dodatak pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusproizvoda dodavanja nukleotid trifosfata rastućem DNK lancu, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Da bi se umnožio broj kopija originalne DNK, potrebna je ciklička reakcija. Po pravilu, svaki od sekvencijalno ponavljanih PCR ciklusa sastoji se od tri faze:

1. Denaturacija, ili "topljenje" DNK. Dvolančani DNK šablon se zagrijava na 94 - 96 °C (ili na 98 °C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5 - 2 minute tako da se lanci DNK razdvoje. Ova faza se naziva denaturacija jer su vodonične veze između dva lanca DNK prekinute. Ponekad se, prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), reakciona smjesa prethodno zagrijava 2 - 5 minuta kako bi se matriks i prajmeri potpuno denaturirali. Ova tehnika se zove vruć start, omogućava vam da smanjite količinu nespecifičnih proizvoda reakcije.

2. Žarenje - vezivanje prajmera za šablonsku DNK. Kada se lanci razdvoje, temperatura se polako snižava kako bi se prajmerima omogućilo da stupe u kontakt sa jednolančanim šablonom. Temperatura žarenja zavisi od sastava prajmera i obično se bira na 50-65°C. Vrijeme etape je 20 - 60 sekundi. Nepravilan odabir temperature žarenja dovodi ili do lošeg vezivanja prajmera za šablon (na previsokoj temperaturi) ili do vezivanja na pogrešnom mjestu i pojave nespecifičnih proizvoda (na preniskoj temperaturi).

3. Sinteza (izduženje lanca). DNK polimeraza replicira šablonski lanac koristeći prajmer kao prajmer. Polimeraza započinje sintezu drugog lanca od 3" kraja prajmera, koji se vezao za šablon i kreće se duž šablona. Temperatura elongacije zavisi od polimeraze. Često korištene Taq i Pfu polimeraze su najaktivnije na 72 ? C. Vrijeme sinteze ovisi o vrsti DNK polimeraze i dužini amplificiranog fragmenta. Tipično, vrijeme elongacije se uzima kao jedan minut na hiljadu parova baza. Nakon što se svi ciklusi završe, često se izvodi dodatna faza konačno izduženje, za kompletiranje svih jednolančanih fragmenata. Ova faza traje 7-10 minuta.

Potom se faze denaturacije, žarenja i elongacije ponavljaju više puta (30 ili više puta). U svakom ciklusu, broj sintetiziranih kopija fragmenta DNK se udvostručuje.

Sve reakcije se provode u epruvetama uronjenim u termostat. Promjena temperaturnog režima i njegovo održavanje vrši se automatski.

Da biste tačno razumeli kako se određeni segment DNK amplificira tokom PCR-a, morate jasno zamisliti položaj svih prajmera i njihovih komplementarnih sekvenci u amplificiranim lancima u svakoj rundi. U prvom krugu, svaki od novosintetiranih lanaca ima mnogo veću dužinu od udaljenosti od 3"-hidroksilne grupe njegovog prajmera do terminalnog nukleotida sekvence komplementarne drugom prajmeru. Takvi lanci se nazivaju "dugi šabloni" ; na njima će se odvijati dalja sinteza.

U drugom krugu, dvolančana DNK, koja se sastoji od sličnih i novosintetiziranih (dugačkih šablonskih) lanaca, ponovo se denaturira i potom žari prajmerima. Tokom sinteze u ovoj rundi, ponovo se sintetišu "dugi šabloni", kao i određeni broj lanaca sa prajmerom na jednom kraju i sekvencom komplementarnom drugom prajmeru na drugom ("kratki šabloni"). Tokom treće runde, svi heterodupleksi koji su ranije formirani se istovremeno denaturiraju i žare prajmerima, a zatim se repliciraju. U narednim krugovima ima sve više “kratkih matrica”, a do 30. kruga njihov broj je već 10 6 puta veći od broja početnih lanaca ili “dugih matrica”.

Količina specifičnog produkta reakcije (ograničena prajmerima) teoretski raste proporcionalno 2n, gdje je n broj reakcionih ciklusa. U stvarnosti, efikasnost svakog ciklusa može biti manja od 100%, tako da u stvarnosti:

gdje je P količina proizvoda, E je prosječna efikasnost ciklusa.

Povećava se i broj “dugih” DNK kopija, ali linearno, pa u produktima reakcije dominira određeni fragment. Rast potrebnog proizvoda je eksponencijalno ograničen brojem reagensa, prisustvom inhibitora i stvaranjem nusproizvoda.

PCR je vrlo osjetljiva metoda, stoga, ako test uzorak sadrži čak i neznatnu količinu DNK koja je slučajno prešla iz jedne reakcijske smjese u drugu, mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati. Zbog toga je neophodna pažljiva kontrola svih rastvora i staklenih predmeta koji se koriste za PCR.

Osnovni principi odabira prajmera.

Prilikom kreiranja PCR test sistema, jedan od glavnih zadataka je ispravan odabir prajmera, koji mora ispunjavati niz kriterija:

1. Prajmeri moraju biti specifični. Posebna pažnja se poklanja 3" krajevima prajmera, jer upravo od njih Taq polimeraza počinje da dovršava komplementarni DNK lanac. Ako je njihova specifičnost nedovoljna, onda je vjerovatno da će se u epruveti sa reakcijska smjesa, odnosno sinteza nespecifične DNK (kratki ili dugi fragmenti). Vidljivo je na elektroforezi u obliku teških ili lakih dodatnih traka. Ovo ometa procjenu rezultata reakcije, jer je lako pobrkati specifične proizvod amplifikacije sa sintetizovanom stranom DNK.. Neki od prajmera i dNTP-a troše se na sintezu nespecifične DNK, što dovodi do značajnog gubitka osetljivosti.

2. Prajmeri ne bi trebalo da formiraju dimere i petlje, tj. stabilne dvostruke niti ne bi trebale nastati kao rezultat žarenja prajmera za sebe ili jedan za drugog.

Što vam omogućava da otkrijete male količine, ili bolje rečeno, određene njegove fragmente u biološkom materijalu i umnožite ih mnogo puta. Zatim se vizualno identifikuju gel elektroforezom. Reakciju je 1983. razvio K. Mullis i uvrštena je na listu izuzetnih otkrića posljednjih godina.

Koji su mehanizmi PCR-a

Cijela tehnika se zasniva na sposobnosti nukleinskih kiselina da se samostalno repliciraju, što se u ovom slučaju provodi umjetno u laboratoriji. Reprodukcija DNK može započeti ne u bilo kojoj regiji molekule, već samo u područjima s određenim nukleotidnim nizom - početnim fragmentima. Da bi lančana reakcija polimeraze započela, potrebni su prajmeri (ili DNK sonde). To su kratki fragmenti lanca DNK sa datom sekvencom nukleotida. Oni su komplementarni (tj. odgovaraju) početnim lokacijama

Naravno, da bi stvorili prajmere, naučnici moraju proučiti nukleotidnu sekvencu onoga koji je uključen u tehniku. Upravo ove DNK sonde daju specifičnost reakcije i njenog pokretanja. neće raditi ako uzorak ne sadrži barem jedan molekul željene DNK. Općenito, gornji prajmeri, skup nukleotida i DNK polimeraza stabilna na toplinu su potrebni za izvođenje reakcije. Potonji je enzim koji katalizira reakciju sinteze novih molekula nukleinske kiseline na bazi uzorka. Sve ove supstance, uključujući i biološki materijal u kojem treba detektovati DNK, kombinuju se u reakcionu smešu (otopinu). Postavljen je u poseban termostat, koji vrši vrlo brzo zagrevanje i hlađenje u zadatom vremenu – ciklusu. Obično ih ima 30-50.

Kako se ova reakcija dešava?

Njegova suština je da se tokom jednog ciklusa prajmeri vežu za željene dijelove DNK, nakon čega se pod djelovanjem enzima udvostručuju. Na osnovu dobijenih DNK lanaca sintetizira se sve više i više identičnih fragmenata molekula u narednim ciklusima.

Lančana reakcija polimeraze teče uzastopno; razlikuju se sljedeće faze. Prvi se odlikuje udvostručavanjem količine proizvoda tokom svakog ciklusa grijanja i hlađenja. U drugoj fazi, reakcija se usporava jer je enzim oštećen i također gubi aktivnost. Osim toga, rezerve nukleotida i prajmera su iscrpljene. U posljednjoj fazi - platou - proizvodi se više ne akumuliraju jer su reagensi nestali.

Gdje se koristi?

Bez sumnje, lančana reakcija polimeraze ima široku primjenu u medicini i nauci. Koristi se u općoj i specijalnoj biologiji, veterini, farmaciji, pa čak i ekologiji. Štoviše, u potonjem to rade kako bi pratili kvalitetu hrane i ekoloških objekata. Lančana reakcija polimerazom se aktivno koristi u forenzičkoj praksi za potvrđivanje očinstva i identifikaciju identiteta osobe. U sudskoj medicini, kao i u paleontologiji, ova tehnika je često jedini izlaz, jer je obično izuzetno mala količina DNK dostupna za istraživanje. Naravno, metoda je našla vrlo široku primjenu u praktičnoj medicini. Neophodan je u oblastima kao što su genetika, zarazne bolesti i onkološke bolesti.