Endopeptidaza koja hidrolizira peptide i proteine.

Himotripsin (EC 3.4.21.1) se sintetiše u pankreasu u obliku proenzima himotripsinogen A i himotripsinogen B i u tom obliku, kao deo soka pankreasa, ulazi u duodenum, gde se pod uticajem tripsina, himotripsinogeni pretvaraju u α -, β- i π- himotripsini.

Kimotripsin prvenstveno cijepa veze koje formiraju COOH grupe aminokiselina koje imaju hidrofobne bočne lance i ima širu specifičnost djelovanja od tripsina. Kimotripsin, na primjer, za razliku od tripsina, zgrušava mlijeko.

Kimotripsin je najaktivniji pri pH od 7,5 do 8,2.

Ispitivanje se provodi tri dana nakon prestanka uzimanja svih oralnih enzimskih preparata. Poželjno je uzeti malu količinu (1 g) od dnevne količine stolice. Princip metode se zasniva na cijepanju N-acetil-tirozin-etil estera pomoću kimotripsina da se formiraju kiseli produkti, koji se titriraju alkalijom. U slučaju teških poremećaja egzokrine funkcije pankreasa, test otkriva značajno smanjenje sadržaja kimotripsina. Istovremeno, s umjerenim funkcionalnim oštećenjima, uočen je prilično značajan broj lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata. S tim u vezi, određivanje fekalnog kimotripsina većina autora prepoznaje kao indikativni test za identifikaciju izraženih egzokrinih poremećaja funkcije pankreasa različite prirode (Sablin O.A. et al.).

Stručne medicinske publikacije koje se bave ulogom kimotripsina u gastroenterologiji

• Sablin O.A., Grinevič V.B., Uspensky Yu.P., Ratnikov V.A. Metode za proučavanje egzokrine funkcije // U knjizi. Funkcionalna dijagnostika u gastroenterologiji. Sankt Peterburg, 2002.


• Kalinin A.V. Poremećaji kavitetne probave i njihova medikamentozna korekcija // Kliničke perspektive u gastroenterologiji i hepatologiji. – 2001. – br. 3. - Sa. 21–25.


• Sablin O.A., Butenko E.V. Enzimski preparati u gastroenterologiji // Consilium-Medicum. – 2004. – Svezak 6. – Br. 1. Gastroenterologija.

Na web stranici u odjeljku „Literatura“ nalazi se pododjeljak „Izlučivanje, probava u gastrointestinalnom traktu“, koji sadrži članke za zdravstvene radnike na ovu temu.

kimotripsin -lijek

Himotripsin je međunarodno nezaštićeno ime (INN) lijeka; prema ATC-u je uključen u grupe:

• "B06 Ostali hematološki preparati", gde mu je dodeljena šifra "B06AA04 kimotripsin"
• “S01 Lijekovi za liječenje očnih bolesti”, šifra “S01KX01 himotripsin”

Himtoripsin je i trgovački naziv lijeka (vidi ilustraciju desno), INN šifra “D03BA Proteolitički enzimi”, koja ima sljedeće indikacije za upotrebu: tromboflebitis, parodontalna bolest (upalno-distrofični oblici), osteomijelitis, sinusitis, upala srednjeg uha , iritis, iridociklitis, katarakte intrakapsularne ekstrakcije, krvarenje u prednjoj očnoj komori, oticanje periorbitalnog područja nakon operacija i povreda; traheitis, bronhitis; empiem pleure, eksudativni pleuritis; opekotine, gnojne rane, čireve od proleža. LS-00125

Trgovački naziv lijeka: Chymotrypsin

Međunarodni nevlasnički naziv:

Chymotrypsin

Oblik doziranja:

Liofilizat za pripremu rastvora za injekcije i lokalnu upotrebu.

spoj:

1 bočica sadrži himotripsin kao aktivnu supstancu - 10 mg.

Opis: Liofilizirana porozna masa u obliku tableta, grudica ili sjajnih bijelih pahuljica.

Farmakoterapijska grupa:

proteolitičko sredstvo.

ATX kod: D03BA

Farmakološka svojstva.
Himotripsin je proteolitički enzimski preparat koji se dobija iz pankreasa goveda. Hidrolizira proteine ​​i peptone sa stvaranjem peptida relativno male molekularne težine, cijepa veze nastale ostacima aromatičnih aminokiselina (tirozin, triptofan, fenilalanin, metionin).
U medicinskoj praksi primjena kimotripsina temelji se na specifičnoj sposobnosti razgradnje nekrotičnog tkiva i fibrinoznih formacija, ukapljivanja viskoznih sekreta i eksudata, a kada se primjenjuje intramuskularno, ima protuupalni učinak.

Indikacije za upotrebu.
Suppurativne bolesti respiratornog sistema (traheitis, bronhitis, bronhiektazije, pneumonije, apscesi pluća, atelektaze, eksudativni pleurisi, bronhijalna astma).
U liječenju opekotina, dekubitusa, gnojnih rana, tromboflebitisa.
U oftalmologiji - za svježu opsežnu trombozu centralne retinalne vene, akutnu opstrukciju centralne retinalne arterije, zamućenja staklastog tijela traumatskog i upalnog porijekla, ekstrakciju katarakte.
U otorinolaringologiji - za gnojni sinusitis, subakutni laringotraheitis, nakon traheostomije radi lakšeg uklanjanja gustog viskoznog eksudata, za akutni, subakutni, gnojni, kronični otitis srednjeg uha i eustahitis sa viskoznim eksudatom.

Kontraindikacije
Preosjetljivost na kimotripsin, maligne neoplazme, plućna tuberkuloza (otvoreni oblik), kronična srčana insuficijencija II - III stepena, distrofija i ciroza jetre, virusni hepatitis, pankreatitis, hemoragijska dijateza, plućni emfizem sa respiratornom insuficijencijom.
Ne ubrizgavati u šupljine koje krvare niti nanositi na ulcerirane površine malignih tumora kako bi se izbjeglo širenje malignog procesa.

Pažljivo.
Pleuralni empiem tuberkulozne etiologije (resorpcija eksudata u nekim slučajevima može doprinijeti razvoju bronhopleuralne fistule).

Upotreba tokom trudnoće i dojenja
Nema podataka o upotrebi lijeka tijekom trudnoće i dojenja.

Način primjene i doza.
Za intramuskularnu primenu, rastvoriti neposredno pre upotrebe 0,005 g leka u 1-2 ml sterilne 0,9% rastvora natrijum hlorida ili 0,5-2% rastvora prokaina. Tok tretmana je 6-15 injekcija.
Za respiratorne bolesti, lijek se koristi intramuskularno u dozama od 5-10 mg dnevno tijekom 10-12 dana, može se kombinirati s upotrebom kimotripsina u aerosolu u 5% vodenoj otopini u količini od 3-4 ml. Nakon 7-10 dana, tretman se može ponoviti.
Pri liječenju opekotina i rana, himotripsin u dozi od 20 mg se otopi u 20 ml 0,25% otopine prokaina i ubrizgava ispod kraste tankom iglom s nekoliko injekcija. Sterilne maramice navlažene rastvorom od 0,025-0,05 g himotripsina u 10-50 ml 0,25% rastvora prokaina stavljaju se na gnojne površine rane 8 sati. Za liječenje gnojnih rana, intramuskularne injekcije lijeka kombiniraju se s lokalnim liječenjem rane tamponima navlaženim 5% vodenom otopinom kimotripsina.
Za tromboflebitis, lijek se propisuje intramuskularno u dozi od 5-10 mg dnevno tijekom 7-10 dana.
Prilikom ekstrakcije katarakte, himotripsin u razrjeđenju 1:5000 se ubrizgava u zadnju očnu komoru, nakon čega slijedi ispiranje prednje očne komore s 0,9% otopinom natrijum hlorida 4 minute nakon primjene lijeka.
U liječenju tromboze centralne retinalne vene, akutne opstrukcije centralne retinalne arterije, subkonjunktivalno se primjenjuje himotripsin, 0,2 ml 5% otopine pripremljene sa 1% otopinom prokaina, 1-2 puta sedmično.
Kod sinusitisa, lijek se daje u odgovarajuću šupljinu u količini od 5-10 mg u 3-5 ml 0,9% otopine natrijum hlorida nakon punkcije i ispiranja šupljine.
Za otitis se ukapa u uho 0,5-1 ml 0,1% rastvora himotripsina u 0,9% rastvoru natrijum hlorida. Prilikom mikrooperacija na uhu, za omekšavanje fibrinoznih formacija u srednjem uhu, tokom operacije se u šupljinu ubrizgava 0,1% rastvor himotripsina. Istovremeno, himotripsin treba davati intramuskularno u dozi od 2,5-5 mg 1-2 puta dnevno. Lijek se razrijedi u 1-2 ml 0,25-0,5% otopine novokaina ili 0,9% otopine natrijum hlorida.

Nuspojava
Mogu se javiti alergijske reakcije, povišena tjelesna temperatura do subfebrilne i tahikardija.
Nakon inhalacijske primjene: povremeno se zapaža iritacija sluzokože gornjih disajnih puteva i promuklost.
Kod subkonjunktivalne primjene moguća je iritacija i oticanje konjunktive; u takvim slučajevima preporuča se smanjiti koncentraciju korištene otopine.
Nakon intramuskularne injekcije, bol i hiperemija se mogu javiti na mjestu injekcije.

Interakcija s drugim lijekovima.
Nije opisano.

Obrazac za oslobađanje
Liofilizat za pripremu rastvora za injekcije i lokalnu upotrebu 10 mg (bočice od 5 ml). 10 boca zajedno sa uputstvom za upotrebu u kartonskoj kutiji.

Uslovi skladištenja
Na suvom mestu, zaštićeno od svetlosti, na temperaturi ne višoj od +10°C. Rastvori kimotripsina su nestabilni: mogu se čuvati 24 sata na temperaturi od 2-5°C.

Čuvati van domašaja djece.
Najbolje do datuma
3 godine. Ovaj lijek se ne smije koristiti nakon datuma navedenog na pakovanju.

Uslovi izdavanja iz apoteka:

Na recept.

Naziv i adresa proizvođača
Proizvođač: Rusija, 196158, Sankt Peterburg, Moskovska magistrala, 13 Samson-Med LLC

Rusko ime

Chymotrypsin

Latinski naziv supstance Chymotrypsin

kimotripsin ( rod. Chymotrypsini)

Farmakološka grupa supstance himotripsin

Tipični klinički i farmakološki članak 1

Farmaceutsko djelovanje. Proteolitički agens proteinske prirode. Dobija se iz pankreasa goveda. Kada se primjenjuje intramuskularno, djeluje protuupalno; kada se primjenjuje lokalno, razgrađuje nekrotično tkivo i fibrinozne formacije; razrjeđuje viskozne sekrete, eksudat, krvne ugruške. Hidrolizuje proteine ​​i peptone sa stvaranjem peptida male molekularne težine, razgrađuje veze koje formiraju ostaci aromatičnih aminokiselina (tirozin, troptofan, fenilalanin, metionin).

Indikacije. Tromboflebitis, parodontalna bolest (upalno-distrofični oblici), osteomijelitis, sinusitis, otitis, iritis, iridociklitis, intrakapsularna ekstrakcija katarakte, krvarenje u prednjoj očnoj komori, oticanje periorbitalnog područja nakon operacija i povreda; traheitis, bronhitis; empiem pleure, eksudativni pleuritis; opekotine, gnojne rane, čireve od proleža (primjenjivati ​​lokalno).

Kontraindikacije. Preosjetljivost, maligne neoplazme, dekompenzirani oblici plućne tuberkuloze, stadijum II-III CHF, distrofija i ciroza jetre, infektivni hepatitis, pankreatitis, hemoragijska dijateza, plućni emfizem sa respiratornom insuficijencijom. Ne ubrizgavati u šupljine koje krvare ili nanositi na ulcerisane površine malignih tumora.

Pažljivo. Pleuralni empiem tuberkulozne etiologije (resorpcija eksudata može doprinijeti razvoju bronhopleuralne fistule).

Doziranje. Lokalno. Sterilne maramice navlažene otopinom 25-50 mg kimotripsina u 10-50 ml 0,25% otopine prokaina stavljaju se na gnojne površine rane 8 sati.

IM, odrasli - 2,5 mg 1 put dnevno; rastvoriti neposredno pre upotrebe 5 mg u 1-2 ml sterilnog 0,9% rastvora NaCl ili 0,5-2% rastvora prokaina. Tok tretmana je 6-15 injekcija.

Nuspojava. Alergijske reakcije, povišena tjelesna temperatura do subfebrilne, tahikardija.

Nakon inhalacije: iritacija sluzokože gornjih disajnih puteva, promuklost.

Kod subkonjunktivalne primjene: iritacija i oticanje konjunktive (u ovom slučaju preporučuje se smanjenje koncentracije upotrijebljene otopine).

Kod intramuskularne injekcije: bol i hiperemija na mjestu injekcije.

Državni registar lijekova. Službeno izdanje: u 2 toma - M.: Medicinski savjet, 2009. - Tom 2, dio 1 - 568 str.; Dio 2 - 560 s.

Interakcije sa drugim aktivnim sastojcima

Trgovačka imena

Ime	Vrijednost indeksa Vyshkowski®

Chymotrypsin

enzim iz klase hidrolaze koji razgrađuje proteine ​​i peptide; Sadrži u sekretu pankreasa životinja i ljudi. Zajedno sa Tripsinom, učestvuje u razgradnji proteina hrane u tankom crijevu. Sintetiše se u ćelijama pankreasa u obliku proenzima himotripsinogen, koji se pod uticajem tripsina u crevima pretvara u aktivni X. Proces aktivacije uključuje cepanje jedne strogo definisane peptidne veze u molekulu himotripsinogena, što dovodi do konformacijsko preuređenje proteinske molekule i konačno formiranje aktivnog centra (vidi Aktivni centri) Krom Opisani su različiti oblici hroma (na primjer, A, B i C kod nekih sisara), koji se razlikuju po fizičko-hemijskim svojstvima i dijelom u specifičnosti supstrata. Ch. Bika su u kristalnom obliku dobili američki hemičari M. Kunitz i J. Northrop 1935., njegova molekulska težina je 25 000. Molekula se sastoji od 245 aminokiselinskih ostataka i presavijena je u kompaktnu globulu sa poluosama od 33 i 16.5 Å. Trodimenzionalna struktura X. (vidi. pirinač. ) ustanovili su engleski naučnik D. Blow i njegove kolege 1967. godine koristeći analizu difrakcije rendgenskih zraka. Višestruki oblici hroma takođe se mogu formirati tokom aktivacije kimotripsinogena (π, δ, α-oblici goveđeg hroma A). X. pripada grupi tzv. serinske proteinaze. Njegov aktivni centar uključuje ostatke serina a, kao i asparaginsku kiselinu i histidin, formirajući tzv. sistem prenosa naplate. Kao rezultat prijenosa protona sa serinskog ostatka na histidin i sa ovog na ostatak asparaginske kiseline, na ostatku serina pojavljuje se negativan naboj koji stječe sposobnost napada na karbonil ugljik hidrolizirane peptidne veze (vidi Peptidna veza). Krom djeluje u alkalnoj sredini (pH 7,0-8,5) i razgrađuje u proteinima i peptidima uglavnom veze koje formiraju aromatične aminokiseline - tirozin, fenilalanin, triptofan. X. je sposoban da podsiri mlijeko. Enzimi tipa X nalaze se kod nižih kralježnjaka i insekata.

Lit.: Northrop D., Kunitz M., Herriott R., Crystal Enzymes, trans. s engleskog, M., 1950; Mosolov V.V., Proteolitički enzimi, M., 1971.

V.V. Mosolov.

Trodimenzionalna struktura α-forme goveđeg himotripsina A prema Blowu: I - serinski ostatak aktivnog centra sa pripojenom tozilnom grupom; II - ostatak histidina aktivnog mjesta. Arapski brojevi su brojevi aminokiselinskih ostataka. NH 3 i CO 2 predstavljaju krajeve tri polipeptidna lanca (A, B i C) koji formiraju α-X molekul.

Velika sovjetska enciklopedija. - M.: Sovjetska enciklopedija. 1969-1978 .

Sinonimi:

Pogledajte šta je "Himotripsin" u drugim rječnicima:

kimotripsin... Pravopisni rječnik-priručnik

HIMOTRIPSIN, supstanca koja se proizvodi u tijelu koja pomaže u varenju hrane. Kimotripsin je enzim koji razgrađuje proteine. Proizvodi se u tankom crijevu složenim kemijskim reakcijama iz kimotripsinogena... Naučno-tehnički enciklopedijski rečnik

Digestivni enzim soka pankreasa; učestvuje u razgradnji proteina u crijevima. Proizveden kao neaktivni kimotripsinogen... Veliki enciklopedijski rječnik

Proteolitički enzim većine kralježnjaka koji učestvuje, zajedno sa tripsinom i drugim peptidazama, u razgradnji proteina u tankom crevu; sintetiziraju stanice pankreasa u obliku neaktivnog prekursora kimotripsinogena i ... ... Biološki enciklopedijski rječnik

Imenica, broj sinonima: 1 enzim (253) ASIS rječnik sinonima. V.N. Trishin. 2013… Rečnik sinonima

himotripsin- Proteolitički enzim kičmenjaka, sintetiziran u pankreasu u obliku prekursora kimotripsinogena. [Arefjev V.A., Lisovenko L.A. Englesko-ruski eksplanatorni rječnik genetskih pojmova 1995 407 str.] Teme genetika EN chymotripsin ... Vodič za tehnički prevodilac

I Kimotripsin proteolitički enzim; katalizira razgradnju proteina i peptida. Odnosi se na peptidne hidrolaze. Zajedno sa Tripsinom učestvuje u proteolizi proteina hrane u tankom crevu.Himotripsin prvenstveno razgrađuje nastale veze... ... Medicinska enciklopedija

Digestivni enzim soka pankreasa; učestvuje u razgradnji proteina u crijevima. Proizveden kao neaktivni kimotripsinogen. * * * CHYMOTRYPSIN CHYMOTRYPSIN, probavni enzim soka pankreasa; učestvuje u…… enciklopedijski rječnik

- (gr.chymoscok + tripsin) enzim koji razgrađuje proteine ​​hrane; koju proizvode ćelije pankreasa. Novi rječnik stranih riječi. od EdwART, 2009. chymotrypsin a, pl. Nema m. (… Rečnik stranih reči ruskog jezika

Himotripsin himotripsin [EC 3.4.21.1 2]. Proteolitički enzim kičmenjaka, sintetiziran u pankreasu u obliku prekursora kimotripsinogena. (

Serinske proteinaze.

Mehanizam djelovanja kimotripsina i karboksipeptidaze.

Ranije je spomenuto da je gušterača odgovorna za proizvodnju čitave grupe proteolitičkih enzima koji hidroliziraju peptidne veze koje formiraju različite aminokiseline. Enzimi uključeni u varenje proteina i njihova specifičnost za peptidne veze koje formiraju različite aminokiseline dati su u tabeli. 3.1. Najvažniji i najpotpunije proučavan predstavnik intestinalnih proteinaza koje pripadaju porodici serinske proteinaze, je himotripsin. Kimotripsin je digestivni enzim koji se sintetizira kao zimogen-acinarne ćelije pankreasa.

Tabela 3.1

Specifičnost supstrata gastrointestinalnih proteinaza

	Aktivni enzim	Zymogen	Aktivator	fissile
				peptidnu vezu
	karboksiproteinaze		automatska aktivacija,
	Pepsin A	Pepsinogen A	aktivni pepsin
	Serine
	proteinaze
	Tripsin	Tripsinogen	enterokinaza,
			Tripsin
	Chymotrypsin	Kimotripsinogen	Tripsin	Tyr, Phe, Trp, Met
	Elastase	Proelastase	Tripsin
	peptidaze
	karboksipeptidaza A	prokarboksipepti-		Val, Leu, Ile, Ala sa
	karboksipeptidaza B	prokarboksipepti-
	Aminopeptidaza	proaminopepti-		Eliminacija N-
				kraj
				bilansi (za
				osim Pro)

Unutar acinarnih ćelija, novosintetizovani proteinski molekuli se transportuju iz endoplazmatskog retikuluma do Golgijevog aparata, gde su okruženi proteinsko-lipidnom membranom - tako nastaju zimogene granule, koje u elektronskom mikroskopu izgledaju kao veoma gusta tela (sl. 3.3).

Rice. 3.3 Elektronski mikrograf granula zimogena u acinarnim ćelijama pankreasa (nakon crteža G. Paladea iz Strayer L., Biochemistry

„Mir“, M., tom 2, 1985).

Zymogen granule koje sadrže kimotripsinogen akumuliraju se na vrhu acinarne ćelije i zatim se oslobađaju u kanal koji vodi do duodenuma pod utjecajem hormonskog ili neuronskog signala.

Kimotripsinogen je predstavljen jednim polipeptidnim lancem od 245 aminokiselina. Lanac je stabiliziran sa pet disulfidnih mostova. Aktivacija kimotripsinogena odvija se pod djelovanjem tripsina, koji cijepa peptidnu vezu između arginina-15 i izoleucina-16.

Aktivni π-himotripsin koji nastaje u ovom procesu djeluje na druge molekule kimotripsinogena (slika 3.4).

Rice. 3.4 Šema koja ilustruje redosled faza aktivacije himotripsina

Zatim, π-himotripsin se podvrgava dodatnom proteolitičkom dejstvu himotripsina uz cepanje dva dipeptida Ser14-Arg15 i Thr147-Asn148 i formiranje stabilnog oblika enzima –α-himotripsina.

Budući da je kimotripsin jedan od najpotpunije proučavanih enzima, preporučljivo je detaljnije razmotriti njegovu strukturu i mehanizam djelovanja. Molekul α-himotripsina sastoji se od tri polipeptidna lanca povezana sa dvije međulančane disulfidne veze (slika 3.5).

Rice. 3.5 Molekul α-himotripsina ima dva međulančana disulfidna mosta i tri unutarlančane disulfidne veze.

Molekularna težina α-himotripsina je oko 25.000 Da. Molekul ima kompaktan elipsoidni oblik dimenzija 51 × 40 × 40 Å. Sve nabijene grupe, s izuzetkom tri potrebne za katalizu, nalaze se na površini molekula.

Ravnoteža reakcije hidrolize je gotovo potpuno pomjerena prema cijepanju peptidnih veza. Međutim, kimotripsin nije sposoban da hidrolizira svaku peptidnu vezu velikom brzinom. On djeluje selektivno na uspostavljene veze karboksilne grupe aromatskih kiselina i aminokiselina s velikim hidrofobnim radikalima, na primjer metionin.

Karakteristična karakteristika kimotripsina je njegova sposobnost da hidrolizira esterske veze. U suštini, veliki dio informacija o mehanizmu djelovanja kimotripsina dobijen je proučavanjem hidrolize.

estri.

Pokazalo se da himotripsin katalizira hidrolizu peptidnih i estarskih veza u dva različita koraka. Ovo je prvi put otkriveno proučavanjem kinetike hidrolize esterske veze n-nitrofenilacetata.

Analiza reakcije pokazala je da se oslobađanje jednog od proizvoda, n-nitrofenola, tokom hidrolize odvija u dva stupnja: prvo se eksplozivno oslobađa n-nitrofenol, a zatim nastaje sa

manja stacionarna brzina.

Općenito, proces hidrolize n-nitrofenilacetata svodi se na stvaranje kompleksa enzim-supstrat, zatim se esterska veza u supstratu cijepa i oslobađa n-nitrofenol, dok acetilna grupa supstrata ostaje kovalentno vezana. u aktivnom mjestu enzima. Zatim, voda napada kompleks acetil-enzim da bi formirao acetatni jon i regenerisani enzim (slika 3.6)

Rice. 3.6 Acilacija: formiranje kompleksa acetil-enzim kao intermedijera. Deacilacija: hidroliza intermedijera kompleksa acetil-enzim.

Brza početna faza oslobađanja n-nitrofenola povezana je sa formiranjem kompleksa acil-enzim prikazanog na Sl. 3.6 ikona

(*). Ovaj korak se naziva acilacija. Druga faza, tzv deacilacija, odgovara stacionarnom stupnju reakcije, što je također ograničavajuće. Pokazalo se da je kompleks acil-enzim toliko stabilan da se pod određenim uslovima može izolovati. Nakon što je ovaj intermedijarni kompleks acil-enzim izolovan u čistom obliku na pH 3, bilo je moguće okarakterisati mjesto na kojem se acil grupa vezuje za enzim. Pokazalo se da je acilna grupa povezana sa atomom kiseonika specifičnog serinskog ostatka

– serin-195 (Ser-195). Iz tog razloga se himotripsin klasifikuje kao serinske proteinaze. Ovaj ostatak serina pokazuje neobično visoku reaktivnost. Može se posebno označiti

organski fluorofosfat – diizopropil fluorofosfat (slika 3.7).

Rice. 3.7 Diizopropilfosfat (DPPP) inaktivira himotripsin formiranjem diizopropilfosforilnog derivata serina-195.

O povećanoj reaktivnosti serina-195 svjedoči činjenica da preostalih 27 serinskih ostataka u kimotripsinu uopće ne reagiraju s diizopropil fluorofosfatom (DPFP). Inače, himotripsin nije jedini enzim koji inhibira DPPP. Mnogi drugi proteolitički enzimi kao npr tripsin, elastaza,

trombin, bakterijski subtilizin također reagiraju specifično sa DPPP, potpuno gubeći aktivnost. Kao iu slučaju kimotripsina, ove proteinaze stupaju u interakciju sa DPPP preko jednog serinskog ostatka. Stoga je prikladno govoriti o postojanju cijele porodice serinske proteinaze.

Međutim, ne samo Ser-195 bočni radikal učestvuje u katalitičkim aktima kimotripsina. Pokazalo se da histidinski ostatak His-57 također igra važnu ulogu u aktivnom mjestu enzima. Njegovo učešće u katalizi bilo je moguće dokazati pomoću takozvane afinitetne oznake, koja se s jedne strane vezuje za himotripsin kao supstrat, a sa druge strane formira kovalentnu vezu sa određenom grupom u aktivnom centru.

Takva oznaka za kimotripsin je spoj tozil-L- fenilalanin hlorometil keton, čija je struktura prikazana na sl. 3.8.

Rice. 3.8 Struktura tozil-L-fenilalanin hlormetil ketona koji se koristi kao oznaka afiniteta za himotripsin (R – tozilna grupa).

Prisustvo oznake bočnog lanca koju predstavlja fenilalanin u molekulu osigurava njegovu specifičnu interakciju sa enzimom. Reaktivna grupa oznake, klorometil keton, stupa u interakciju samo sa His-57 ostatkom i alkilira jedan od atoma dušika u histidinskom prstenu. Interakcija takve oznake afiniteta sa kimotripsinom u potpunosti ga lišava enzimske aktivnosti. Postoji nekoliko dokaza o visokoj specifičnosti interakcije oznake s kimotripsinom:

− prvo, oznaka afiniteta je visoko stereospecifična. D-izomer oznake ne stupa u interakciju sa kimotripsinom;

− drugo, kompetitivni inhibitor hemtripsina, β-fenilpropionat, inhibira proces interakcije oznake sa proteinom;

- treće, stopa inaktivacije kimotripsina nakon dodavanja oznake je u istoj zavisnosti od pH kao i brzina katalize.

Šema interakcije tozil-L-fenilalanin hlormetil ketona sa His-57 prikazana je na Sl. 3.9.

Rice. 3.9 Alkilacija histidina-57 u himotripsinu nakon interakcije sa tozil-L-fenilalanin hlorometil ketonom.

Dakle, za ispoljavanje katalitičke aktivnosti kimotripsina, prisustvo ostataka Ser-195 i His-57 u aktivnom centru enzima je fundamentalno. Kao što se kasnije pokazalo, pored ovih ostataka u molekulu kimotripsina nalazi se i ostatak asparaginske kiseline - Asp-102. Analiza difrakcije rendgenskih zraka pokazala je da se sva tri ostatka nalaze jedan do drugog i stvaraju tzv. sistem prenosa naplate zbog činjenice da Asp-102 formira vodoničnu vezu sa His-57, koja je zauzvrat vodonično povezana sa Ser195 (slika 3.10).

Rice. 3.10 Sistem prijenosa naboja u aktivnom centru himotripsina u odsustvu supstrata (Blow D.M., Steitz T.A., X-ray difraction study of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39, 86-95).

Karboksilatni ion Asp-102 polarizuje imidazolnu grupu His-57, što povećava njenu sposobnost da izvrši vezivanje protona, a kada supstrat stupi u interakciju sa molekulom kimotripsina, Asp-102 i His-57 prihvataju proton hidroksilne grupe Ser-195.

Rice. 3.11 Sistem prijenosa naboja u aktivnom centru himotripsina u prisustvu supstrata. Kada se doda supstrat, dolazi do srednjeg vezivanja protona sa aspartatom-102 i histidinom-57 (Blow D.M., Steitz T.A., X-ray difraction study of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39, 86-95).

Lokalizacija specifičnih mesta vezivanja supstrata i verovatna orijentacija hidrolizovane peptidne veze utvrđeni su kao rezultat analize rendgenske difrakcije kompleksa kimotripsina sa analozima supstrata. Konkretno, na primjeru proučavanja kompleksa kimotripsina sa analogom supstrata koji se ne može hidrolizirati - formil-L-triptofanom, pokazalo se postojanje u enzimu dubokog hidrofobnog

džep u blizini serina-195, koji po veličini odgovara bočnim radikalima aromatičnih aminokiselina (slika 3. 12).

Rice. 3.12 Šematski prikaz vezivanja formil-L-triptofana pomoću himotripsina.

Upravo prisustvo ovog dubokog džepa objašnjava specifičnost kimotripsina za aminokiseline sa aromatičnim ili drugim velikim hidrofobnim bočnim lancem. Analiza difrakcije rendgenskih zraka kompleksa kimotripsina sa analozima polipeptidnih supstrata otkrila je veliki broj vodoničnih veza između glavnih lanaca enzima i supstrata, koje se nalaze na isti način kao i u antiparalelnim slojevima β-lista.

Mehanizam katalitičkog djelovanja kimotripsina

Intenzivne i sveobuhvatne rendgenske difrakcije i biohemijske studije kimotripsina dovele su do definitivnog zaključka o mehanizmu njegovog katalitičkog delovanja. Kao što je već pomenuto, His-57 i Ser-195 su direktno uključeni u cepanje peptidne veze supstrata. Hidroliza ove veze počinje kada atom kiseonika OH grupe Ser-195 napadne ugljikov atom karbonilne grupe

hidrolizovana peptidna veza supstrata. Kao rezultat toga, veza između C i O atoma u karbonilnoj grupi postaje jednostruka i O atom dobiva negativan naboj. U ovom slučaju, četiri različita atoma povezana s ugljikom karbonilne grupe su raspoređena u obliku tetraedra. Obrazovanje takvih tetraedarski intermedijer ispostavilo se da je moguće zbog formiranja vodoničnih veza između negativno nabijenog atoma kisika (zvanog oksianion) i dvije NH grupe glavnog lanca enzima (slika 3.13).

Rice. 3.13 Tetraedarski intermedijer u reakcijama acilacije i deacilacije kimotripsina. Stabilnost intermedijera je osigurana vodoničnim vezama koje formiraju NH grupe glavnog lanca enzima.

Ovo područje himotripsina se zove oksianionska šupljina. U mehanizmu formiranja pomenutog intermedijera najvažniju ulogu igra transfer protona sa Ser-195 na His-57.

Rice. 3.14 Prva faza hidrolize peptida sa himotripsinom je acilacija. Formira se tetraedarski intermedijer. Amin komponenta supstrata se zatim brzo odvaja od enzima, a sam enzim se pretvara u međuproizvod, acil enzim.

Prenos protona je uveliko olakšan prisustvom sistema za prenos naelektrisanja. Ostatak Asp-102 striktno orijentiše poziciju histidin-57 imidazola i delimično neutrališe naelektrisanje koje se pojavljuje na ovom prstenu. Proton vezan parom His-Asp zatim odlazi do atoma dušika hidrolizirane peptidne veze, koja se kao rezultat razbija. U ovoj fazi, aminska komponenta supstrata je povezana vodoničnom vezom sa His-57, a kisela komponenta je povezana esterskom (kovalentnom) vezom sa Ser-195, čime se završava korak acilacije. Dakle, nakon acilacije kimotripsina, formira se srednje tetraedarsko jedinjenje (1), a zatim se aminska komponenta supstrata (2) brzo odvaja od enzima. Sam enzim se pretvara u međuprodukt katalize – acil enzim (3) (slika 3.14).

Rice. 3.15 Druga faza hidrolize peptida sa himotripsinom je deacilacija. Acil enzim se hidrolizira vodom. Deacilacija je u suštini obrnuta reakcija acilacije, ali voda zauzima mjesto aminske komponente supstrata.

U sljedećoj fazi, deacilaciji, aminska komponenta difundira iz enzima, a voda zauzima svoje mjesto u aktivnom centru.

U stvari, deacilacija je obrnuti proces od acilacije. Prvo, sistem prenosa naelektrisanja apstrahuje proton iz vode.