Преки и непреки вирусологични методи на изследване. Вирусологични методи на изследване в микробиологията. Лабораторна диагностика на вирусни инфекции

Основните методи, използвани в диагностиката на вирусните заболявания, са култивирането и идентифицирането на вируси.

За да се докаже вирусната етиология на заболяването, е необходимо вирусът да се изолира от тялото на болна риба, да се прехвърли върху клетъчна култура или чувствителна риба, да се възпроизведе болестта в здрави риби от същия или сродни видове и повторно изолирайте същия вирус от опитни животни.

Използват се няколко допълващи се метода за идентифициране на вируси: електронна микроскопия на вируса, изследване на неговите физикохимични свойства, откриване на характерни морфологични промени в заразените клетки и симптоми при заразени животни, различни имунологични методи.

Вирусите се изолират главно върху еднослойни първични или трансплантирани клетъчни култури, като във всеки случай се избират култури, които са чувствителни към даден вирус. За получаване на първични култури от рибни клетки най-често се използват половите жлези на женски шаран или каракуда. Гонадите трябва да бъдат II или II-III етап на зрялост според скалата на Киселевич. Такива полови жлези не съдържат видими с просто око яйца. В противен случай съдържанието на яйцата ще повлияе неблагоприятно на растежа на клетките. По утвърдения метод се приготвят клетъчни култури от гонади на шаран и каракуда.

Като непрекъснати култури най-широко приложение намират следните клетъчни линии: FHM - от тъканите на опашното стъбло на дебелоглавата мивка; RTG - от половите жлези на дъгова пъстърва; EPC - от израстъци от шарка по кожата на шарана. Тези линии се поддържат в специализирани лаборатории за изследване на болести по рибите на ветеринарни и рибарски научноизследователски институти, където могат да бъдат заявени и получени.

При диагностицирането на добре проучени вирусни заболявания се изследват органите и тъканите, където е концентриран патогенът.

При заболявания на рибите, информацията за които е недостатъчна, най-засегнатите органи се подлагат на вирусологично изследване. Остъргвания от кожата и хрилете, парчета от тези органи, заедно със слуз, се поставят в стерилни флакони с 2-3 ml стерилен физиологичен или буферен разтвор. Вземането на проби от вътрешните органи се извършва при строго асептични условия.

В случаите, когато е невъзможно бързо да се изследва материалът, той се съхранява за не повече от един ден в хладилник при температура не по-висока от 5 ° C. Замразеният материал може да се съхранява за по-дълго време.

Патологичният материал, предназначен за изследване, се раздробява в хомогенизатор или се смила в порцеланов хаван с кварцов пясък. От натрошените тъкани се приготвя 10% суспензия в разтвори на Hank's, Earl's, буфер или физиологичен разтвор и се центрофугира 10-15 минути при 2000-3000 rpm, супернатантата се изсмуква с пипета и се поставя в стерилни флакони. Ако суспензията не е стерилна, приготвените материали се филтрират през мембранни филтри с диаметър на порите 0,2-0,45 µm или се третират с антибиотици (пеницилин 1000 IU/ml и стрептомицин 1000 µg/ml).

Приготвя се 20% суспензия от чревното съдържимо в стерилна дестилирана вода и се центрофугира за 10-15 минути при 2000 rpm. Супернатантата се центрофугира отново при 4000-5000 rpm за 30 минути. След това супернатантата се аспирира в стерилен флакон и се третира с антибиотици. За 1 ml добавете 1000 µg/ml стрептомицин и 1000 IU/ml пеницилин. Сместа се държи 2-3 часа при: стайна температура. Всички материали са тествани за бактериална стерилност чрез инокулация върху BCH и MPA. Подготвените материали се използват незабавно за работа или в краен случай се съхраняват в замразено състояние (при температура минус 20 ° C).

Инфекция на клетъчна култура. За инфекция се използват тръби с добър клетъчен монослой или зона на растеж около експланта. Хранителната среда се изсмуква и във всяка епруветка се добавят 0,2-0,3 ml от тестовата суспензия. В същото време към епруветките се добавят 0,8-0,9 ml хранителна среда с 2-3% серум.

Материалът, приготвен от всяка проба, се заразява с тъканна култура в 4-6 епруветки. От всяка серия изследвания се оставят същия брой епруветки като контроли, като към тях се добавя 1 ml хранителна среда. Епруветките се оставят на стайна температура за 1-2 часа за адсорбция на вируса върху клетките, след което супернатантната течност се изсмуква с пипета и към първоначалния обем се добавя поддържаща хранителна среда.

Инфектираните и контролните клетъчни култури се инкубират при температура 22-26°C и се изследват ежедневно под микроскоп с ниско увеличение за откриване на възникващи морфологични промени в клетките. При тежка клетъчна дегенерация културалната течност се аспирира и се правят пасажи, а при липса на цитопатогенен ефект (CPE) се извършват два последователни пасажа. За да направите това, използвайте културалната течност заедно с клетъчната фракция, унищожена чрез многократно замразяване и размразяване. Супернатантът от центрофугираната клетъчна маса се използва за заразяване на свежи култури. CPP след третия пасаж се отчита като специфично действие на вирусния агент.

Степента на увреждане на клетъчния монослой се оценява по 4-кръстосаната система; "+" - щети до 25%, "+ +" - до 50%, "+ + +" - до 75% и "+ + + +" - до 100% от монослоя.

При някои вирусни заболявания на рибите в клетките (цитоплазмата на ядрото) на различни органи и тъкани се появяват телца за включване. Материалът за изследване на вирусни включвания са заразени тъканни култури, изстъргвания и петна-отпечатъци от органи и тъкани, посочените материали се фиксират преди оцветяване съгласно общоприетите методи, като се използват течности Dubosque-Brazil-Bouena, Bouena, Carnoy или 10% неутрален разтвор на формалин.

Вирусните включвания се оцветяват по различни методи: според Muromtsev, ruby, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa и др.

Титруване на вируса- количествено определяне на вирусната активност. Вирусният титър се изразява като брой инфекциозни единици, съдържащи се в единица обем вирусна суспензия. За инфекциозна единица на вируса се приема такава доза, която причинява инфекция на 50% от заразените с него чувствителни обекти. Тази доза вирус се нарича инфекциозна и се обозначава с ID 50.

Клетъчните култури се използват главно като чувствителни обекти при титруване на рибни вируси. Титруването в клетъчната култура се извършва според цитопатогенния ефект на вирусите. В този случай ID 50 се нарича тъканна цитопатогенна доза (TCD 50), а вирусният титър се изразява като количество TCD 50 в 1 ml вирусна суспензия. Титърът на вируса се определя чрез метода на окончателното разреждане. Съгласно този метод чувствителните клетъчни култури инжектират определен обем вирусна суспензия в последователно нарастващи разреждания и, като се вземе предвид резултатът за всяка инжекция като положителен (ако CPE присъства) или отрицателен, ако CPE липсва), крайната точка на титруване се изчислява - 1 TCD 50 .

За титруване на вируси, които дават изразен CPP, се използва и плаковият метод. В този случай монослой от клетки, заразени с вируса, се излива със смес от хранителна среда с агар, за да се предотврати прехвърлянето на вируса към други клетки, които са значително отдалечени от първоначално заразените и да могат да заразят първоначалните огнища на инфекция на плаката).

Всяка плака възниква от една инфекциозна единица, която се обозначава като PFU (плакообразуваща единица), а титърът на вируса се изразява като брой PFU за единица обем от суспензията.

Реакция на неутрализация(PH) в клетъчна култура.

Реакцията се основава на свързването на антиген с антитела на хомоложен антисерум. Реакцията се използва за идентифициране на патогени при диагностицирането на заболявания с вирусна етиология. Позволява ви да определите чрез известни антитела неизвестен вирусен антиген или чрез известен (стандартен) антиген - неизвестни антитела в серума на болна или възстановена риба.

Определянето на изолирания вирус в реакцията на неутрализация се извършва с помощта на набор от диагностични хиперимунни антисеруми (антитела) на антигени (вируси), хомоложни на тях.

Хиперимунните антисеруми се получават чрез заразяване на лабораторни животни (например зайци) с известни щамове на вируси, които причиняват заболявания на рибите. Получените антисеруми определят титрите на специфични антитела. За работа се вземат антисеруми, съдържащи антитела във високи титри.

Редът на реакцията.

1. Инактивиране на нормален и хиперимунен серум чрез нагряване при 56°C за 30 минути.

2. Приготвяне на разреждания на реакционните съставки. Антигенът и серумът се разреждат с хранителна среда без серум и антибиотици, като се започне от 1: 5, 1: 50, 1: 500 и докато се получи разреждане със съдържание по-малко от 1 TCD 50 / 0,2 ml. Хиперимунният серум се разрежда 1: 2 или 1: 5. При нисък титър серумът се използва неразреден. Нормалният серум се разрежда по същия начин като хиперимунния серум.

3. Изложение на реакцията. Три реда стерилни епруветки се поставят в стелаж. В първия ред се излива разреден хиперимунен серум, във втория - разреден нормален серум, а в третия - хранителна среда. Всяка съставка се добавя в обем от 0,5 ml.

Готовите разреждания на вируса се прехвърлят по 0,5 ml в съответните епруветки от всеки от трите реда, като вирусът от всяко разреждане I се пренася с отделна пипета, като се започне от най-високото разреждане. Така във всеки ред епруветки се получават серийни 10-кратни разреждания на вируса: 10-1, 10-2 и т.н.

За да се контролира токсичността на серума, 0,5 ml от приготвения разтвор на хиперимунен серум се добавя в отделна епруветка и след това се добавя равно количество хранителна среда. Същото се прави и с нормален серум.

Разклатете добре епруветките със смесите и инкубирайте при стайна температура за 1 час. След това инфектирайте клетъчната култура с всяко разреждане на вируса (0,2 ml на епруветка) с хиперимунни нормални серуми и хранителна среда, 4 епруветки с клетъчна култура. Успоредно с това поставете контроли върху токсичността на използваните клетки и контролни проби от клетъчна култура.

Епруветките с клетъчна култура се инкубират в термостат при оптимална температура за възпроизвеждане на този вирус и се изследват ежедневно под микроскоп с ниско увеличение, за да се открие CPE на вируса. Резултатите се въвеждат в таблицата (Таблица 11).

Вирусният титър се изразява като брой инфекциозни единици, съдържащи се в обемна единица на вирусната суспензия. Намерете индекса на неутрализация (IN). Съответства на максималното количество ID 50, което може да бъде неутрализирано от хиперимунен серум. Изчисляването на IN се извършва по формулата: lgIN = lgT 1 -lgT 2, където T 1 - титър на вируса в присъствието на нормален серум; Т 2 - вирусен титър в присъствието на хиперимунен серум. Стойността на IN се намира от таблицата на антилогаритмите. Обичайно е стойността на IN до 10 да се счита за отрицателна, от 10 до 49 - съмнителна, 50 или повече - положителен резултат.

Резултатите от реакцията могат да се считат за надеждни само ако хиперимунният серум се тества за специфична неутрализираща активност. За да направите това, предварително определете титъра на неутрализиращи антитела в този серум или неговия неутрализационен индекс в реакция с хомоложен вирус.

Изолиране на плака на рабдовируси. Този метод е специфичен, използва се за изолиране, предварително типизиране и селекция на рабдовируси на шаран и пъстърва при наличие на специфични имунни серуми за идентифициране на вируса.

Заоблени колонии (плаки) се образуват в клетъчни култури под агарово покритие при наличие на вирус в тестовия материал.

При асептични условия тъканта на бъбреците, черния дроб, далака и течността от коремната кухина се събират с пипета на Пастьор, прехвърлят се във флакон със среда, съдържаща 500 IU (mcg) / ml антибиотици в съотношение 1: 10. инкубират се 60-90 минути при температура 18-22 °C, след което се центрофугират при 2-3 хиляди rpm за 10 минути. Супернатантата се разрежда с хранителна среда 1:10 (разреждане 1:100). И двете разреждания на супернатанти се използват за заразяване на клетъчни култури.

За изследването се избира 3-дневна непрекъсната клетъчна култура, отглеждана в дюшеци с добре дефиниран монослой в размер на 2 дюшека за всяко разреждане на патологичния материал и 2 дюшека за контрол. Хранителната среда се отстранява от флаконите и се добавят 2 ml от средата без фетален серум. След това се добавят 0,2 ml от изследвания патологичен материал и се оставят за адсорбция на вируса за 60 минути при оптимална температура за вируси, които заразяват рибите (за шаранови вируси - 24-26 ° C и за вируси на пъстърва - 16-18 ° C ).

Контролът се поставя в 2 дюшека с клетъчни култури от 0,2 ml, съдържащи 100 TCD 50 /ml известен вирус, и 2 - 0,2 ml хранителна среда без вирус.

След 60 минути течността от флаконите се отстранява. На стената, противоположна на монослоя, 5 ml агарово покритие, загрято до 40-42 ° C (при изолиране на HCV вируса - не повече от 38 ° C), се въвежда във флакон от 50 ml. Матраците са обърнати еднослойно надолу, покрити с черна хартия. След 15-20 минути дюшеците се прехвърлят за инкубация при оптимална температура за изследваните вируси. Матраците се поставят с агар нагоре. При неизвестен вирус културите се държат при две температурни условия - 14-18 и 22-24°C.

Заразените клетъчни култури се разглеждат на бял фон. Ако има вирус в изследвания материал в клетъчната култура, първо се появяват прозрачни точки върху розово-матовия фон на културата. В бъдеще те се увеличават по размер, образувайки кръгли прозрачни колонии - плаки, чието присъствие показва наличието на рабдовируси в патологичния материал.

С пипета на Пастьор се събира парче плака на границата на засегнатата и незасегнатата част, така че в нея да попадне не само агарът, но и клетъчният слой. Избраното парче се поставя в епруветка с 1 ml от хранителната среда, замразява се при минус 20°C и се инкубира за 60 min. В случай на голям брой плаки (целият клетъчен слой е прозрачен), изследванията се повтарят в разреждания 10 -3 и 10 -4.

Плаки с диаметър 3-8 mm от рабдовирус на шаран върху непрекъсната култура на EPC и FHM, инкубирани при температура 24-26°C, се появяват на 4-7-ия ден.

При липса на плаки и наличие на CPD в клетъчни култури се извършват допълнителни изследвания на съдържащата вирус културална течност в разреждания от 10 -2 -10 -3 (2-3 пасажа). Като допълнителни методи за идентифициране на вируси се използват: методът на флуоресцентните антитела; определяне на чувствителността на вируса към хлороформ, етер, рН стойност, нагряване; електронно микроскопско изследване на морфологията на вируса.

Изследвания за диагностика на заболявания с вирусен характер. Това е необходимо, за да се идентифицира вирусът, да се проучи неговата биология и способността да засяга животински и човешки клетки. Така става възможно да се разбере патогенезата на вирусните заболявания и съответно да се избере правилният метод на лечение.

Каква е диагнозата?

в живите клетки. За да се изследва, е необходимо да се култивира на ниво експериментален организъм или За това в медицинската практика и микробиологията като цяло се провеждат вирусологични методи за изследване, които имат следните основни подходи:

• прав;
• непряк;
• серологични.

Материалът може да се изследва директно за наличие на нуклеинови киселини, вирусен антиген или, например, да се изолира и идентифицира вирусът от клиничен материал.

В допълнение към възможността за установяване на етиологията на заболяването, проследяване на терапевтичния ефект, вирусологичните методи на изследване играят важна роля в противоепидемичните мерки. За изолиране и използване на пилешки ембриони, лабораторни животни или клетъчни култури.

Как се изследват?

Най-бързият е директният метод. Тя ви позволява да откриете вирус, антиген или NA (нуклеинова киселина) в самия клиничен материал. Отнема от два часа до ден.

1. ЕМ - електронна микроскопия. Директно открива вируса.
2. IEM - имунна електронна микроскопия. Използва специфични антитела срещу вируси.
3. RIF - реакция на имунофлуоресценция. Използва антитела, свързани с багрилото. Такива вирусологични методи на изследване се използват широко като бързо декодиране на етиологията на ТОРС (остри респираторни вирусни инфекции), когато се вземат тампони от лигавицата на горните дихателни пътища.
4. ELISA - ензимен имуноанализ - определяне на вирусни антигени, подобен на RIF, но базиран на ензимно маркиране на антитела.
5. RIA - радиоимуноанализ. Използва радиоизотопно маркиране на антитела, за да осигури висока чувствителност при откриване на вирусен антиген.
6. Молекулярна - NK хибридизация или изолиране на вирусни геноми чрез PCR (полимеразна верижна реакция).
7. Цитология - рядко се използва, но при определени инфекции тези вирусологични методи на изследване са много ефективни. Изследват се биопсични материали, аутопсии и цитонамазки, обработени за оцветяване и анализ под микроскоп.

Какъв е смисълът на изследването?

За успешно изолиране на вируси се взема клиничен материал в съответствие с патогенезата и възможно най-рано. Често този процес изисква няколко пасажа, преди да се приложат определени вирусологични анализи.

Микробиологията е наука за микроскопични същества. А нейната сфера не е само медицината. Тя е фундаментална наука за селското стопанство, ветеринарната медицина, космическата и техническа индустрия, геологията.

Но разбира се, всичко е създадено за човека и неговото развитие на тази красива планета. Ето защо е много важно да откриете опасността навреме и да я неутрализирате. Вирусите са различни от бактериите. Това са структури, които влизат в тялото и предизвикват образуването на ново поколение. Те изглеждат като кристали и са насочени към контролиране на процеса на тяхното възпроизвеждане, въпреки че самите те не се хранят, не растат и не отделят метаболитни продукти.

Вирусът може да причини сериозно заболяване на всеки жив организъм, в който е попаднал. Освен това може да се развива. Ето защо вирусологичните методи на изследване в микробиологията трябва да се развиват и усъвършенстват, тъй като човешката цивилизация като цяло може да бъде застрашена.

материали

За откриване и идентифициране на вируси в медицината, като правило, те вземат:

• назофарингеален лаваж (респираторни инфекции);
• зачервяване и изпражнения (ентеровирусни инфекции);
• изстъргвания, съдържанието на везикулите (кожни лезии, лигавици, като херпес, варицела);
• зачервявания (екзантемични инфекции като морбили, рубеола);
• кръв, цереброспинална течност (арбовирусни инфекции).

Фази

Всички етапи на вирусологичния метод на изследване включват:

• събиране на материал;
• селекция, получаване на тестова система, определяне на нейната жизнеспособност;
• инфекция на тестовата система;
• вирусна индикация;
• определяне на вида на вируса.

По принцип патогенните вируси се различават по наличието на тъканна и типова специфичност. Вземете например полиовируса, който се възпроизвежда само в примати (в техните клетки). Съответно се използва специфична тъканна култура за изолиране на определен вирус. Ако говорим за неизвестен патоген, тогава би било препоръчително да се заразят едновременно три, а за предпочитане четири клетъчни култури.

Така може би един от тях ще бъде чувствителен. За да определите наличието на вируса в заразените култури, погледнете развитието на специфична клетъчна дегенерация, вътреклетъчни включвания, откриване на специфичен антиген, положителни тестове за хемаглутинация и хемадсорбция.

Всички вирусологични методи на изследване (директни и индиректни, серологични) трябва да бъдат избрани като най-подходящи за конкретен случай на предполагаема инфекция.

Косвените методи се основават на изолирането и идентифицирането на вируса. Те са трудоемки, дълги, но точни.

Серодиагностика

Тази диагноза се отнася до метод, основан на реакцията антиген-антитяло. Най-често се използват сдвоени кръвни серуми, взети на интервали от няколко седмици. Ако увеличението на титъра на антителата е 4 или повече пъти, реакцията се счита за положителна. За определяне на типовата специфичност на вируса се използва тест за неутрализиране на вируса. За да определите груповата специфичност, трябва да получите реакцията на фиксиране на комплемента.

Широко използвани са различни варианти на ензимен имуноанализ, реакция на инхибиране на хемаглутинацията, пасивна хемаглутинация, обратна пасивна хемаглутинация, RIF. Дори в генното инженерство е разработен метод за получаване на моноклонални антитела. Тясната специфичност на моноклоните може да бъде преодоляна чрез използване на няколко моноклонални антитела срещу различни вирусни детерминанти. По този начин се повишава специфичността и чувствителността на анализа при определяне на антигени.

Някои функции

Днес са създадени много различни тестови системи за имунологична диагностика на инфекции, произтичащи от навлизане на вирус в жив организъм.

По този начин вирусологичните методи на изследване са методи за изолиране на вируси, изучаване на техните свойства и установяване на тяхната етиологична връзка с определени заболявания.

Курсова работа

"Методи на клиничната вирусология"

Въведение

Лабораторната диагностика на вирусните инфекции се извършва предимно с помощта на електронна микроскопия, чувствителни клетъчни култури и имунологични методи. Като правило, всеки един метод се избира за диагностика в зависимост от стадия на вирусната инфекция. Така например и трите подхода могат да бъдат полезни при диагностицирането на варицела, но успешното използване на методите за микроскопия и клетъчни култури зависи от способността за събиране на задоволителни проби в относително ранен стадий на заболяването.

До голяма степен успехът на вирусната диагностика зависи и от качеството на получените проби. Поради тази причина персоналът на лабораторията трябва да участва пряко във вземането на необходимите проби. Характеристиките на пробите, както и методите за доставянето им в лабораторията са описани от Lennett, Schmidt, Krist et al.

Повечето от реактивите и инструментите, използвани в лабораторната диагностика, се предлагат от различни фирми. В повечето случаи един и същи реагент се произвежда едновременно от няколко компании. Поради тази причина ние не посочихме отделни фирми, освен ако реагентът не се доставя само от една фирма. Във всички останали случаи трябва да се обърнете към общия списък на доставчиците, посочен в табл. 1.

Ние не се стремим към изчерпателно описание на всички налични в момента методи за диагностициране на човешки вирусни инфекции. На първо място, описахме основните методи. С натрупването на опит в самостоятелната работа тези основни методи могат да се използват за решаване на по-сложни проблеми.

1. Електронна микроскопия

За електронно микроскопска диагностика на вирусни инфекции могат да се използват тънки срезове от засегнатата тъкан. Най-често срещаният материал за електронна микроскопия са изпражнения или течност.

Таблица 1. Списък на фирмите, доставящи реактиви и оборудване

Flow Laboratories: Gibco Europe: Услуги за тъканни култури: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK

везикули, които характеризират някои заболявания, като варицела. При анализа на такъв материал вирусите могат да бъдат открити чрез отрицателно оцветяване, което води до очертаване на компонентите на вириона с електронно-плътен материал. Методът е ефективен при високи концентрации на вирус в тестови проби, като например във фекалиите или везикулозната течност. В случаите, когато съдържанието на вирусни частици в пробите е ниско, вероятността за откриване на вируса може да се увеличи чрез концентриране на вируса чрез ултрацентрофугиране или чрез агрегирането му със специфични антитела. Последният метод също е удобен за идентифициране на вируси. Тук описваме електронномикроскопския метод за диагностициране на ротавирусна инфекция и метода на имуноелектронна микроскопия, използвайки примера за откриване на специфични антитела срещу парвовируси. Методите на електронната микроскопия са описани по-подробно от Field.

2.1 Директна електронна микроскопия на изпражнения

1. Краят на пастьоровата пипета се потапя в изпражненията и се събира достатъчно материал, за да се получи натривка от 1 cm.

2. Ресуспендирайте фекалната натривка в отрицателен електронен микроскоп, докато се получи полупрозрачна суспензия. Отрицателното контрастно оцветяване е 2% разтвор на фосфорноволфрамова киселина в дестилирана вода.

3. За да се получи електронен микроскопски препарат, капка суспензия се поставя върху решетка за електронен микроскоп, покрита с филм от въглерод-формвар. По време на тази операция мрежата се държи с чифт фини пинсети.

4. Лекарството се оставя във въздуха за 30 секунди.

5. Излишната течност се отстранява чрез докосване на ръба на стъклото с филтърна хартия.

6. Дрогата се изсушава на въздух.

7. Ако е необходимо, жизнеспособният вирус се инактивира чрез облъчване на двете страни на решетката с ултравиолетова светлина с интензитет 440 000 μW-s/cm 2 . В този случай се използва късовълнова ултравиолетова лампа с филтър. Лампата трябва да е на разстояние 15 см от решетката; време на облъчване от всяка страна - 5 мин.

8. Ротавирусните вириони могат да бъдат характеризирани под трансмисионен електронен микроскоп с увеличение от 30 000 до 50 000.

2.2 Имуноелектронна микроскопия

Методът на имуноелектронна микроскопия, описан по-долу, е само един от многото такива имунологични методи. За изследване на вирус-специфични антитела освен това се използва метод, който включва свързване с микроскопична мрежа от протеин А. Работната концентрация на антивирусните антитела се определя чрез проба и грешка в диапазона от 1/10 до 1/1000. Посочената от нас концентрация, като правило, се използва в рутинна работа. За да се получат оптимални резултати от взаимодействието на антителата с вируса, серумът, съдържащ парвовирус, се титрира по същия начин.

1. 10 µl човешки парвовирусен антисерум, разреден 100-кратно с PBS. Разтворът се загрява на водна баня до 56°С.

2. Разтопете 10 ml 2% агароза в PBS по обичайния начин и охладете до 56°C на водна баня.

3. При 56°C смесете 1 ml разреден антисерум с 1 ml 2% агароза.

4. Прехвърлете 200 µl от получената смес в две ямки на 96-ямкова микротитърна плака.

5. Оставете агарозата да се втвърди при стайна температура. Плаката може да се съхранява при 4°C в продължение на няколко седмици, ако е запечатана с лепяща лента.

6. Добавете 10 µl серум, съдържащ парвовирус, към ямката, съдържаща сместа от агароза и антисерум.

7. Решетка за електронен микроскоп с предварително приготвено покритие от карбон-формвар се поставя с по-слабо блестящата страна върху капка серум.

8. Решетката се държи 2 часа при 37 °C във влажна камера.

9. С тънка пинсета мрежата се изважда и върху повърхността на мрежата, която е била в контакт със серума, се нанася капка 2% фосфорноволфрамова киселина.

10. След 30 s излишната боя се отмива, препаратът се изсушава и вирусът се инактивира.

Агрегираните вирусни частици се изследват под трансмисионен електронен микроскоп при увеличение от 30 000 до 50 000.

3. Идентифициране на вирусни антигени

Вирусите в тъканите или тъканните течности могат да бъдат идентифицирани чрез специфични за вируса протеини, като се използва реакцията антиген-антитяло. Продуктът от реакцията антиген-антитяло се тества за етикет, който се въвежда или директно в антивирусни антитела, или в антитела, насочени срещу вирус-специфични антитела. Антителата могат да бъдат маркирани с флуоресцеин, радиоактивен йод или ензим, който разцепва субстрата с промяна на цвета. В допълнение, реакцията на хемаглутинация се използва за идентифициране на вируса. В ежедневната практика описаните методи се използват основно за откриване на антигени на вируса на хепатит В в кръвта и за търсене на антигени на различни вируси, причиняващи различни респираторни заболявания.

Понастоящем много компании произвеждат еритроцитни, радиоактивни и ензимни диагностикуми, включително такива за откриване на вируса на хепатит В. Не смятаме за уместно да описваме методите за работа с тези диагностикуми: достатъчно е да следвате приложените инструкции. По-долу ще се спрем на имунофлуоресцентния метод за идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет.

3.1 Идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет чрез имунофлуоресценция

Методът за получаване на препарати от назофарингеален секрет е описан от Gardner и McQuilin. В лабораторни условия тази операция се извършва на два етапа. Първо се приготвя намазка от назофарингеална слуз върху предметно стъкло. Получените тампони могат да се съхраняват във фиксирано състояние при -20°C в продължение на много месеци. На втория етап петната се оцветяват за откриване на антигена на респираторния синцитиален вирус. За тази цел се използва методът на индиректната имунофлуоресценция.

3.1.1 Приготвяне на назофарингеален секрет

1. Слузта от специални форцепс се отмива с 1-2 ml PBS и се прехвърля в центрофужна епруветка.

2. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.

3. Супернатантата се изхвърля.

4. Клетъчната пелета се ресуспендира внимателно в 2-3 ml PBS, докато се получи хомогенна суспензия. За да направите това, използвайте пипета на Пастьор с широко гърло.

5. Получената суспензия се прехвърля в епруветка.

6. Добавете още 2-4 ml PBS към суспензията и разбъркайте чрез пипетиране. Отстраняват се големи съсиреци слуз.

7. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.

8. Супернатантата се отцежда, утайката се ресуспендира в такъв обем PBS, че получената суспензия лесно се отделя от стените на епруветката.

9. Получената суспензия се нанася върху маркираното предметно стъкло.

10. Стъклото се суши на въздух.

Фиксирайте в ацетон за 10 минути при 4°C.

12. След фиксиране стъклото отново се суши на въздух.

13. Получените препарати се оцветяват веднага или се съхраняват при -20 °C.

3.1.2. Техника на оцветяване

1. Отпечатайте и разредете търговски антисерум срещу RSV в PBS до препоръчителната работна концентрация.

2. Нанесете една капка антисерум върху приготвения препарат с пастьорова пипета.

3. Лекарството се поставя във влажна камера.

4. Препаратът се инкубира 30 минути при 37 °C.

5. Пробите се промиват внимателно с PBS, за да се отстранят излишните антитела в специален резервоар.

6. Пробите се промиват на три смени с PBS за 10 минути всяка.

7. Изсушете пробите, отстранете излишния PBS с филтърна хартия и изсушете на въздух.

Вирусологични методи на изследване— методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, как те проникват в клетката и характеристиките на възпроизвеждането на вируси, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и кодираните от тях протеини с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусна инфекция.

Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект, образуване на вътреклетъчни включвания и др.) .

При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при приготвянето на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканната и клетъчната култура. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (по-често бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в т. нар. матраци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, вирусната суспензия се въвежда в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя свежа хранителна среда, обикновено без серум.

Клетките от повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани и се наричат ​​вторични култури. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. При серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат монослойни и суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на бъркалки. Има над 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.

Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да се култивират в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).

В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промяна в клетъчната морфология, цитопатично действие, което може да бъде специфично, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; определяне на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез откриване на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или клъстери от нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Изолирането на вируси е трудоемък и продължителен процес. Провежда се, за да се определи вида или варианта на вируса, циркулиращ сред населението (например за идентифициране на сероварианта на грипния вирус, дивия или ваксиналния щам на полиомиелитния вирус и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вирус, получена от един вирион, се нарича вирусен клонинг, а процесът на получаването му се нарича клониране.

За изолиране на вируси се използва инфекция на податливи лабораторни животни, пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вирус обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация (цитопатичен ефект), образуване на симпласти и синцитии, откриване на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (при хемаглутиниращи вируси) и др. . Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.

За изолирането на редица вируси, като например грипните вируси, се използват пилешки ембриони, за изолирането на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси се използват новородени мишки. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични тестове и други методи.

При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на течността, съдържаща вируса, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на унищожени от вируса клетки на еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се идентифицират чрез оцветяване на културата с витални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират боята и затова се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици в 1 мл.

Пречистването и концентрирането на вирусите обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в градиенти на концентрация или плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.

Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусните инфекции се основава на експресни методи, които позволяват получаване на отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните стадии след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация, откриване на антитела от клас lgM и др.

Електронната микроскопия на отрицателно оцветени вируси позволява диференциране на вирусите и определяне на тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е достатъчно висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се прави разлика между вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този недостатък се елиминира чрез използване на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси, когато специфичен серум се добавя към вирусни частици, докато се получава едновременна концентрация на вирусни частици, което прави възможно тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За целите на експресната диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.

Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по отношение на чувствителността. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни вериги на ДНК или РНК (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта на молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.

Антителата от клас lgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва нова инфекция. Антитела от клас IgM се откриват чрез имунофлуоресценция или ензимен имуноанализ, като се използват анти-m антисеруми (анти-IgM тежковерижни серуми).

Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методи на изследване ): реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се подобряват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика, за да се определи увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема в първите дни след заболяването, вторият - след 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас lgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас lgC персистират няколко години, а понякога и цял живот.

За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел с последващ имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и дава възможност за идентифициране на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на HIV инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимен имуноанализ се дължат на наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациенти срещу вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването, а при анализа на популациите - променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.

Вирусологичните изследвания в клиниката на инфекциозните заболявания стават все по-важни, което се дължи главно на увеличаването на дела на инфекциите с вирусна природа, чиято клиника не винаги е типична. В същото време не са разработени бързи и надеждни методи за вирусологична диагностика за всички инфекциозни заболявания, много от тях са трудоемки, изискват специални условия, опитни животни, хранителни среди и обучен персонал. В момента се използват 3 основни вида изследвания за диагностициране на вирусни инфекции.
1. Микроскопско изследване на инфекциозен материал с цел идентифициране на вирусен антиген или патогномонични промени в тъканите. За диагностични цели се използва директно микроскопско изследване на инфекциозен материал от пациенти за ограничен брой вирусни инфекции (бяс, варицела, жълта треска, херпес и др.). Методът, основан на откриването на вирусен антиген с помощта на флуоресцентни антитела, получи по-широко приложение. Методът на имунофлуоресценцията може да бъде надежден само при стриктно спазване на всички технически изисквания.
2. Вирусологични методи.
3. Серологични изследвания за определяне на повишаването на титъра на антителата в хода на заболяването. Серологичните методи за изследване са по-достъпни в лабораторията.
За тези изследвания е необходимо да се вземе кръвен серум в острия период на заболяването и по време на периода на възстановяване (сдвоени серуми). Кръвните проби за серологични изследвания се вземат стерилни без антикоагуланти и консерванти.
Основните етапи на вирусологичното изследване са изолирането на вируси, тяхната идентификация и характеризиране на основните биологични свойства. В момента няма единен метод за изолиране на различни групи вируси. Това се дължи преди всичко на разнообразието от техните свойства и особеностите на култивиране извън организма гостоприемник. За изследването се използват биосубстрати (измивки от лигавиците, кръв и нейните компоненти, цереброспинална течност, урина и изпражнения, биопсични проби от органи и тъкани или техни парчета, взети по време на аутопсия), които се подлагат на специална обработка, последвана от преминаване на Материалът. Взетият за изследване материал трябва да се съхранява при температура от -20 °C до -70 °C. В зависимост от предварителната диагноза, обработката на материала има свои собствени характеристики, но във всички случаи се предполага, че се получава субстрат, който е максимално пречистен от примеси от слуз, клетки от органи и тъкани или техни фрагменти, бактерии. Това се постига чрез хомогенизиране на изследвания материал в специален апарат или смилане в порцеланов хаван на студено с кварцово стъкло (парчета от органи и тъкани) с добавяне на стерилно охладен (+4 С) 0,9 %

разтвор на натриев хлорид до получаване на 10-30% суспензия и последващо центрофугиране при 1500-3000 rpm за 10-15 минути. Така полученият супернатант се използва за по-нататъшни изследвания.
Преди интензивното развитие и въвеждане в широката практика на метода на тъканно и клетъчно култивиране се използва заразяване на опитни животни или пилешки ембриони. Тези методи се използват и днес. Откриването на вируси с помощта на животни е най-подходящо в случаите, когато е възможно да се възпроизведе в експеримента типична картина на инфекциозно заболяване или неговите отделни прояви. По този начин патогените на групите арбовируси и Coxsackie могат да бъдат открити чрез инфекция в мозъка на кърмачки, грип - чрез инфекция на пилешки ембриони или интраназално приложение на тестовия материал на мишки. През последните години вирусологичните лаборатории най-широко използват метода на клетъчно-тъканни култури, който позволява да се изолират аденовируси, херпесни вируси, респираторен синцитиален вирус, миксовируси и други и да се извърши етиологична диагностика на заболяването още при първите етапи на изследването. Основа за това са добре проучените цитологични особености на взаимодействието на повечето вируси и клетки. По този начин, инфекцията на HeLa, Hep-2 клетки с материал, съдържащ аденовирус тип 2, води още на 3-ия ден до промяна в модела на растеж на клетъчния монослой и до появата на типични клетки под формата на гроздови чепки и т.н. , които са добре дефинирани в обичайния светлинен микроскоп при ниско увеличение.
От изключително значение за етиологичната диагноза на инфекциозно заболяване е стандартизирането на изолирането на вируса от тестовия материал, което на този етап от работата включва използването на генетично чисти линейни животни, като се вземат предвид техните фенотипни (предимно възрастови) характеристики. Това се дължи преди всичко на факта, че експериментални животни от различни генетични линии и възрасти са податливи на вируси в различна степен. По този начин, по време на интрацеребрална инфекция на мишки с невротропния WSN щам на грипния вирус, BALB/c, A, CBA и безпородни животински линии показват най-висока чувствителност, същият модел е установен в случаите на интраназално приложение на тестовия материал. От съществено значение за окончателните резултати от изолирането на вируса е предварителното изследване на животни, пилешки ембриони, клетъчни и тъканни култури за латентни вирусоносители. Много широко използвани в лабораторната практика, пилешките ембриони могат да бъдат заразени с вируси на птичи левкемия, птичи енцефаломиелит, инфекциозен синузит, пситакоза, нюкасълска болест, патогени на някои бактериални инфекции (паратиф и др.), както и микоплазма. Още по-голям брой бактериални и особено вирусни агенти са способни спонтанно да инфектират клетъчни и тъканни култури и да оцелеят в тях. Тяхното присъствие значително влияе върху оценката на изследвания материал. Някои видове микоплазми в клетъчна култура
може да предизвика хемаглутинация и хемадсорбция и дори да образува плаки под агарното покритие, подобно на образуваните вируси. Не малко значение има и замърсяването на клетъчни култури от един вид от други, най-често това е свързано с HeLa клетки и се наблюдава при работа с различни видове култури в едно помещение, при недобра обработка на лабораторна стъклария и др. наличие на замърсяване на клетъчни култури или инфекция на животни с бактериални агенти, като по правило се проявява доста ясно (промени в модела на растеж на клетъчния монослой, свойствата на хранителната среда, смърт на пилешки ембриони или животни с определени симптоми и т.н.) и не представлява особени затруднения при оценката на резултатите. Ситуацията е по-сложна при латентни форми на инфекция, където е необходимо използването на серологични и други методи. Тези указания трябва да се вземат предвид в работата на вирусолог, особено при провеждане на етиологична диагностика на неясни случаи на заболяването.