Тестът за свързване на комплемента е един от традиционните серологични тестове, използвани за диагностициране на много вирусни заболявания, и също така формира основата на някои други методи за откриване на антивирусни антитела. Въпреки че реакцията на неутрализация, инхибиране на хемаглутинация, индиректна хемаглутинация, ензимният имуноанализ превъзхожда реакцията на фиксиране на комплемента по отношение на чувствителността, простотата на техниката, ранното откриване на антитела и откриването на вирусни антигени, които нямат хемаглутиниращи свойства, обясняват широкото му използване във вирусологични изследвания.

Не изисква такава висока степен на концентрация и чистота на антигенните препарати, които са необходими за редица други имунологични реакции. В допълнение, груповата специфичност на комплемент-фиксиращите антигени на много вируси прави възможно използването на реакцията на комплементна фиксация в масовата диагностика: тази реакция не разкрива разлики в щамовете и е от особена стойност при изучаването на антигенните връзки между вирусите.

Самото име до голяма степен отразява същността на метода, който се състои от две отделни реакции. На първия етап в реакцията участват антигени и антитела (един от тези компоненти е известен предварително), както и комплемент в титрирано количество. Ако антигенът и антителата съвпадат, техният комплекс се свързва с комплемента, който се открива на втория етап с помощта на индикаторна система (смес от овчи еритроцити и антисерум към тях). Ако комплементът е свързан по време на взаимодействието на антигена и антителата, тогава не настъпва лизис на овчи еритроцити (положителна реакция на фиксиране на комплемента). При отрицателна реакция на фиксиране на комплемента, несвързаният комплемент допринася за хемолиза, която се използва за оценка на резултатите от реакцията.

Основните компоненти на реакцията на фиксиране на комплемента са антигени (известни или откриваеми), антитела (известни антисеруми или тестови серуми), комплемент, хемолитичен серум и еритроцити на овен; като разредител се използва изотоничен разтвор на натриев хлорид (pH 7,2-7,4) или различни буферни разтвори. Антигените и серумите могат да имат антикомплементарност, т.е. способността да адсорбира комплемента, което забавя хемолизата и изкривява резултата от реакцията.

Антигените за CSC се приготвят от органи на заразени животни, алантоична или амниотична течност на заразени пилешки ембриони, както и културална течност след култивиране на вируси в тъканни клетъчни култури. Антигенните препарати винаги съдържат много баластни вещества от животински клетки или тъканни култури, които също могат да изкривят резултатите от реакцията.

Получените вирусни антигени се инактивират, определя се работната доза, както и антикомплементарните и хемолитични свойства. След това антигенът се титрува в присъствието на комплемент.

Вторият основен компонент във формулирането на реакцията е комплементът. Този термин се отнася до сложна система от протеини и фактори, присъстващи в кръвта на животни и хора. Обикновено серумът от морско свинче се използва в реакцията на свързване на комплемента. Активността (титърът) на комплемента е най-малкото му количество, в присъствието на което хемолизинът причинява пълна хемолиза на използваната хемолитична система.

За да се открият комплемент-свързващи антитела към вируси, се извършва задължително инактивиране на серума, за да се елиминира комплементът при 560°С за 30 минути. Като референтни серуми обикновено се използват серуми от имунизирани животни. Освен това за имунизация се използват вирусни антигени, внимателно пречистени от тъканни примеси, тъй като в противен случай възниква изразена неспецифична реакция.

Задължителен компонент на реакцията на свързване на комплемента е хемолитичната система, която включва еритроцити от коч и хемолитичен серум, получен чрез хиперимунизация на зайци с еритроцити от коч.

За установяване на реакцията на свързване на комплемента се използват следните модификации: микрометодът на фиксиране на комплемента в микротитъра на системата Takachi, дългосрочната реакция на свързване на комплемента, индиректната реакция на свързване на комплемента, реакцията на фиксиране на комплемента в гела, комплементът реакция на фиксиране по метода на микрокапките, реакцията на фиксиране на комплемента на твърда основа.

Въпреки че чувствителността на реакцията на свързване на комплемента е ниска, тя има висока специфичност. В тази връзка той се използва широко за диагностика на вирусен пневмоентерит при млади говеда.

Особено предимство на CSC е, че естеството на антигена, включен в него (корпускуларен или разтворим), няма значение, тъй като комплементът се свързва с Fc фрагмента на всяко антитяло, свързано с IgG и IgM, независимо от неговата специфичност на антитялото. В допълнение, CSC е много чувствителен: позволява откриване на количеството антитела 10 пъти по-малко, отколкото, например, в реакцията на утаяване. RSC е предложен през 1901 г. от J. Bordet и O. Zhang. Основава се на две свойства на комплемента:

1) способността да се свързва с комплекса "антиген + антитяло";

2) лизис на еритроцити, използвани за получаване на хемолитичен серум.

RSK се поставя на два етапа, като в него участват съответно две системи - експериментална, или диагностична, и индикаторна. Диагностичната система се състои от тестов (или диагностичен) серум, който се нагрява при 56 ° C в продължение на 30 минути, преди да се настрои реакцията за инактивиране на наличния в него комплемент и антигена.

Към тази система се добавя стандартно допълнение. Неговият източник е прясна или изсушена суроватка от морско свинче. Сместа се инкубира при 37°С за един час. Ако има антитела в тестовия серум, те ще взаимодействат с добавения антиген и получените комплекси антиген + антитяло ще свържат добавения комплемент. Ако в серума няма антитела, няма да настъпи образуването на комплекса антиген + антитяло и комплементът ще остане свободен.

На този етап от реакцията обикновено няма видими прояви на фиксация на комплемента. Следователно, за да се изясни въпросът дали е настъпила фиксация на комплемента или не, се добавя втора индикаторна система (инактивиран хемолитичен серум + еритроцити на овен) и сместа от всички компоненти на CSC отново се инкубира при 37 °C за 30-60 минути, след което се оценяват резултатите от реакцията. С помощта на смартфон (например такъв) можете да изчислите точното време за реакция. Ако комплементът е свързан на първия етап, в диагностичната система, т.е. има антитела в серума на пациента и комплементът е бил свързан от комплекса "антитяло + антиген", няма да има лизис на еритроцитите - RSC е положителен : течността е безцветна, утайка има на дъното на епруветката еритроцити.

Ако в серума няма специфични антитела и в диагностичната система не настъпи свързване на комплемента, т.е. RSK е отрицателен, тогава комплементът, който не се консумира в диагностичната система, се свързва с комплекса "еритроцити + антитела" на индикаторната система и настъпва хемолиза. : в епруветката "лакова кръв", без еритроцитна утайка. Интензитетът на CSC се оценява чрез четири кръстосана система, в зависимост от степента на забавяне на хемолизата и наличието на еритроцитна утайка. Реакцията е придружена от подходящи контроли: серумен контрол (без антиген) и антигенен контрол (без серум), тъй като някои серуми и някои антигени имат антикомплементарен ефект. Преди да зададете RSK, всички компоненти, участващи в него, с изключение на изследвания серум или антиген, се титруват внимателно.

Особено важно е да се въведе точната доза комплемент в реакцията, тъй като неговият дефицит или излишък може да доведе до фалшиви резултати. Титърът на комплемента е минималното количество, което при наличие на работна доза хемолитичен серум осигурява пълно разтваряне на еритроцитите. За поставяне на основния опит се взема доза комплемент, увеличена с 20-25% спрямо установения титър. Титърът на хемолитичния серум е неговото максимално разреждане, което, когато се смеси с равен обем от 10% разтвор на комплемента, напълно хемолизира съответната доза еритроцити в рамките на 1 час при температура 37 ° C.

Реакцията на индиректна хемолиза се използва като ускорен метод за откриване на специфични антитела. Еритроцитите се използват като носители на антигени. При наличие на специфични антитела в серума на пациента, сенсибилизираните еритроцити се лизират в присъствието на комплемент.

Не намерихте точната информация? Няма проблем! Използвайте търсенето в сайта в горния десен ъгъл.

61. Реакции на комплемента. Реакция на свързване на комплемента. Механизъм, компоненти, начини на настройка, приложение. Реакция на радиална хемолиза

Реакции, включващи комплемент

Реакции, включващи комплементвъз основа на активирането на комплемента от комплекс антиген-антитяло (реакция на фиксиране на комплемента, радиална хемолиза и др.).

Реакция на фиксиране на комплемента (RSK) се крие във факта, че когато съответстват един на друг, антигените и антителата образуват имунен комплекс, към който чрезФК -фрагмент от антитела се присъединява към комплемента (С), т.е. свързването на комплемента става с комплекс антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен (фиг. 13.8). RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, по време на образуването на комплекса антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не отговарят едно на друго (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.

RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман).

Тази реакция се използва за откриване на антитела в кръвния серум на пациенти с бактериални, вирусни, протозойни инфекции, както и за идентифициране и типиране на вируси, изолирани от пациенти. RSK се отнася до сложни серологични реакции, в които освен антиген, антитяло и комплемент участва и хемолитичната система, която разкрива резултатите от реакцията. CSC протича в две фази: първата е взаимодействието на антигена с антитялото с участието на комплемента, а втората е идентифицирането на степента на свързване на комплемента с помощта на хемолитичната система. Тази система се състои от еритроцити на коч и хемолитичен серум, получен чрез имунизация на лабораторни животни с еритроцити. Еритроцитите се третират - сенсибилизират чрез добавяне на серум към тях при температура 37 ° C за 30 минути. Лизисът на сенсибилизираните еритроцити на овен възниква само в случай на прикрепване към системата на хемолитичния комплемент. При липсата му еритроцитите не се променят. Резултатите от RSK зависят от наличието на антитела в тестовия серум. Ако серумът съдържа антитела, хомоложни на антигена, използван в реакцията, тогава полученият комплекс антиген-антитяло се свързва, свързва комплемента. Когато се добави хемолитична система, в този случай няма да настъпи хемолиза, тъй като целият комплемент се изразходва за специфичната връзка на комплекса антиген-антитяло. Еритроцитите остават непроменени, така че липсата на хемолиза в епруветката се записва като положителен RSK. При липса на антитела, съответстващи на антигена в серума, специфичният комплекс антиген-антитяло не се образува и комплементът остава свободен. Когато се добави хемолитична система, комплементът се прикрепя към нея и предизвиква еритроцитна хемодиаза. Разрушаването на червените кръвни клетки, тяхната хемолиза характеризира отрицателна реакция.

За стадиране на RSK са ви необходими: серум на пациента, комплемент, хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, както и изотоничен разтвор на натриев хлорид. Реакцията се поставя в серологични епруветки. Овчи еритроцити се получават от дефибринирана овча кръв чрез трикратно промиване с изотоничен разтвор на натриев хлорид. Хемолитичният серум се произвежда готов в ампули, на етикета на които е посочен неговият титър, т.е. максималното разреждане на серума, което все още причинява хемолиза, когато се добави към еритроцитите в присъствието на комплемент. Хемолитичният серум се получава чрез имунизиране на животни, като зайци, с еритроцити на овен. При настройка на реакцията серумът се използва в троен титър. Например, титърът на хемолитичния серум е 1: 1200, а работното разреждане е 1: 400. Като допълнение се използва пресен кръвен серум от морско свинче (в рамките на 24-48 часа) или сух комплемент в ампули. Преди да се настрои RSK, комплементът се разрежда 1:10 и се титрира, за да се установи титърът - най-малкото количество комплемент, което предизвиква хемолиза на еритроцитите, когато се комбинира с хемолитичната система, използвана в тази реакция. Като се имат предвид възможните антикомплементарни свойства на антигена, при установяване на реакцията се прави надбавка от 20-30% към установения работен титър на комплемента.
Антигенът за CSCs са суспензии на убити бактерии, екстракти, приготвени от тези суспензии, отделни химични фракции на микроби. Основното изискване за антигена е липсата на инхибиране на активността на комплемента. Не трябва да има антикомплементарни свойства. За да се разкрият тези свойства на антигена, комплементът се титрува допълнително в присъствието на антигена, използван в реакцията. Има определени схеми за настройка на RSC. Резултатите от реакцията се отчитат от наличието или отсъствието на хемолиза на еритроцитите в хемолитичната система. RSK се използва при диагностика на сифилис (реакция на Васерман), гонорея (реакция на Борде-Гангу), токсоплазмоза, рикетсиозни и вирусни заболявания.

Реакцията на радиална хемолиза (RRH ) поставени в ямки от агар гел, съдържащ еритроцити от овен и комплемент. След добавяне на хемолитичен серум (антитела срещу еритроцити на коч) към ямките на гела, около тях се образува зона на хемолиза (в резултат на радиална дифузия на антитела). По този начин е възможно да се определи активността на комплемента и хемолитичния серум, както и антителата в кръвния серум на пациенти с грип, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи. За да направите това, съответните антигени на вируса се адсорбират върху еритроцитите и кръвният серум на пациента се добавя към ямките на гела, съдържащ тези еритроцити. Антивирусните антитела взаимодействат с вирусни антигени, адсорбирани върху еритроцитите, след което компонентите на комплемента се прикрепват към този комплекс, причинявайки хемолиза.

Реакцията е разработена от J. Bordet и O. Zhangu през 1901 г. Те откриват, че по време на образуването на комплекс антиген-антитяло възниква свързване на комплемента.

Образуваното съединение е фино диспергирано и не се определя визуално. За да открият адсорбцията (свързването) на комплемента, авторите използват индикаторна хемолитична система: овчи еритроцити и хемолитичен серум. Ако антигенът не съвпада с антитялото в тестовата система, имунният комплекс не се образува, комплементът остава свободен. Комплементът се адсорбира само върху комплекса антиген-антитяло; той не се адсорбира отделно върху антигена или антитялото. Следователно, когато към тест системата се добави хемолитична система, състояща се от готов комплекс антиген-антитяло (овчи еритроцити и антитела към тях), към този комплекс се присъединява комплемент, предизвиквайки хемолиза на овчи еритроцити - видим резултат.

Тестът за свързване на комплемента (CFR) се характеризира с висока чувствителност и специфичност. RSK се използва при серодиагностика на гонорея, сифилис, магарешка кашлица, всички рикетсиози и много вирусни заболявания. Подобно на други серологични тестове, RSK може да се използва и за серотипиране.

RSK е сложна серологична реакция. В него участват две антигенни системи – антитяло и комплемент.

За да настроите RSC, трябва:

Сложността на реакцията се дължи на броя на участващите съставки и най-вече на необходимостта да се определят точните им количествени съотношения. Следователно, поставянето на основния опит се предшества от титруване на неговите съставки.

Хемолитичният серум се приготвя при промишлени условия чрез 3-4-кратна интравенозна имунизация на заек с 50% суспензия от овчи еритроцити и се инактивира при 56 ° С за 30 минути. За неговото титриране се вземат последователно намаляващи дози (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% суспензия от еритроцити, комплемент 1:10 в равни обеми (но 0,5 ml). На етикета на ампулите с хемолитичен серум е посочен неговият титър - максималното разреждане, което осигурява пълен лизис на 3% суспензия от овчи еритроцити в присъствието на комплемент за един час при 37 ° C. За CSC се използва серумно разреждане, увеличено спрямо титъра 3 пъти.

Суспензия от овчи еритроцити 3% се получава от дефибринирана овча кръв чрез промиване с изотоничен разтвор на NaCl.

Комплементът - пресен или изсушен серум от морско свинче - се титрира преди експеримента: последователно намаляващи дози (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + хемолитична система (овчи еритроцити и хемолитичен серум). След инкубиране в термостат при 37°С се определя титърът на комплемента - най-високото разреждане, което предизвиква пълно лизиране на еритроцитите в присъствието на хемолитичен серум. Работната доза на комплемента трябва да бъде с 25% по-висока от титъра, т.к. активността на комплемента в експеримента може да бъде до известна степен потисната от други реакционни комплементи (антиген, серум).

Антиген - суспензия от убити микроорганизми, техни лизати, пълни антигени, хаптени, екстракти от тъканни липиди - понякога свързва комплемента дори при липса на имунен серум, така че също трябва да се титрира. Приемат се последователно намаляващи дози антиген + работна доза комплемент + хемолитична система. Титърът на антигена е неговата най-ниска доза, при която настъпва отчетлива хемолиза. За CSC вземете доза антиген, намалена наполовина спрямо титъра, за да избегнете фиксирането на комплемента.

Тестовият серум се инактивира при 56°C за 30 минути преди експеримента. Да инактивира собствения си комплемент.

Всички компоненти на реакцията на свързване на комплемента се вземат в равни обеми.

Изложение на основния опит.

След установяване на титъра и работните дози на всички съставки се поставя основния опит на RSK. В реакцията участват и титрувани серуми: очевидно здрави и очевидно болни (съответно отрицателни и положителни серуми). Освен тествания серум, контролните също се инактивират при 56°C за 30 минути.

RSK се извършва в две фази:

Фаза I - специфична - инкубиране на смес от антиген, антитяло и комплемент в термостат при 37°С за 30 минути.

Фаза II - индикатор - определяне на наличието на свободен комплемент в сместа чрез добавяне на хемолитична система (предварително поставена в термостат за 30 минути) и инкубиране в термостат при 37 ° С за 20 -30 минути.

Резултатите от експеримента се оценяват, като се отбелязва наличието или отсъствието на хемолиза във всички епруветки (виж таблицата). Реакцията се счита за положителна, когато хемолизата е напълно забавена, когато течността в епруветката е безцветна и еритроцитите се утаяват на дъното, отрицателна, когато течността е интензивно оцветена ("лакова кръв"). Степента на интензивност на хемолизата се оценява в зависимост от интензитета на цвета на течността и количеството еритроцитна утайка на дъното (+ + + +, + + +, + +, +).

Отчитане на резултатите от RSC.

Възможно е да се вземат предвид резултатите от експеримента (с тестовия серум) само ако всички контроли са преминали правилно.

В епруветка № 2 с положителен серум (съдържащ антитела към този антиген) не трябва да има хемолиза, т.к. комплементът е свързан в първата специфична система, а хемолитичната система остана без комплемент - еритроцитите се утаяват на дъното, супернатантата е прозрачна.

В епруветка № 3 с отрицателен серум, серум на здрав човек, който не съдържа антитела към този антиген, трябва да има хемолиза, тъй като в първата фаза на реакцията не се образува комплекс антиген-антитяло (поради до липсата на антитела към този антиген) и комплементът остава свободен. При добавяне на хемосистемата във втората фаза на реакцията, комплементът се адсорбира върху готовия имунен комплекс овешки еритроцити плюс антитела към тях; настъпва лизиране на овчи еритроцити (хемолиза).

Наличието на хемолиза в серумните и антигенните контроли (епруветки 4 и 5) показва, че техните дози са избрани правилно и че нито серумът, нито антигенът на комплемента се свързват сами. Комплементът, който остава свободен в специфичната система, се адсорбира от имунния комплекс на хемолитичната система и настъпва хемолиза.

Хемолизата в контрола на комплемента (епруветка № 6) показва активността на комплемента и правилния избор на неговата работна доза.

При контрола на хемолитичната система (епруветка № 7), при правилната работа на тази система, не трябва да има дори следи от хемолиза, т.к. липсва му допълнение.

При перфектни резултати от контрола можете да вземете предвид опита (епруветка № 1). Отсъствието на хемолиза се счита за положителен резултат. Това показва, че в тестовия серум са открити антитела срещу този антиген (човекът е болен). Когато антиген съответства на антитяло, се образува комплекс антиген-антитяло, който свързва комплемента (фаза I). С добавянето на хемолитична система няма да има хемолиза на еритроцитите във фаза II. Наличието на хемолиза е отрицателен резултат, което показва липсата на антитела към този антиген (човекът е здрав). Комплементът остава свободен и при добавяне на хемолитичната система се присъединява към комплекса еритроцит-хемолизин, причинявайки хемолиза.

Тест за свързване на комплемента (CFR) и дългосрочна реакция на свързване на комплемента (RDSC)

РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТ (RSK) И ДЪЛГОСРОЧНА РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТ (RDSK)

РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА ДОПЪЛНИТЕЛ, RSK, реакция на Bordet-Jangu [наречена на бактериолозите J. Bordet и O. Gengou, 1901], силно специфична и много чувствителна серологична. реакция, основана на свойството на комплекса антиген-антитяло да фиксира свободния комплемент.

Комплемент (комплементна система) (от лат. complementum - добавяне), група глобуларни протеини в кръвния серум на животни и хора, които са част от имунната система на организма. Когато в тялото навлязат бактерии или вируси, които го заразяват, определени токсини или когато се появят собствени трансформирани клетки, комплементът се активира, в резултат на което целевите клетки се лизират (унищожават) и токсините и вирусите се неутрализират. Следователно системата на комплемента се счита, заедно с макрофагите, за границата на имунната защита на организма.

Тази реакция се използва широко при идентифицирането на антигени и при серодиагностиката на инфекции, особено заболявания, причинени от спирохети (реакция на Васерман), рикетсии и вируси.

RSK е сложна серологична реакция. Включва комплемент и две системи антиген-антитяло. По същество това са две серологични реакции.

Първата система - основната - се състои от антиген и антитяло (едното е известно, другото не). Към него се добавя известно количество комплемент. Когато антигенът и антитялото на тази система съвпаднат, те ще свържат и свържат комплемента. Полученият комплекс е фино диспергиран и не се вижда.

реакция на свързване на комплемента серодиагностика

Образуването на този комплекс е известно с помощта на втора хемолитична или индикаторна система. Той включва овчи еритроцити (антиген) и съответния им хемолитичен серум (антитела), т.е. готов имунен комплекс. В тази система лизисът на еритроцитите може да настъпи само в присъствието на комплемент. Ако комплементът е свързан с първата система (ако антигенът и антитялото съответстват в него), тогава няма да има хемолиза във втората система - тъй като няма свободен комплемент. Липсата на хемолиза (съдържанието на епруветката е мътна или има еритроцитна утайка на дъното) се записва като положителен резултат от RSK.

Ако антигенът не съвпада с антитялото в първата система, тогава имунният комплекс не се образува и комплементът остава свободен. Оставайки свободен, комплементът участва във втората система, причинявайки хемолиза - резултатът от RSC е отрицателен (съдържанието на тръбите е прозрачно - "лакова кръв").

Компоненти на реакцията на фиксиране на комплемента:

1. Антиген - обикновено лизат, екстракт, хаптен; по-рядко суспензия от микроорганизми

2. Антитяло - серум на пациента

3. Комплемент - серум от морско свинче

4. Антиген - овчи еритроцити Хемолитична система

5. Антитяло - хемолизин към овчи еритроцити

6. Изотоничен разтвор

Подготовка на съставките

1. Серумът се разрежда 3 пъти по-малко от неговия титър. Пригответе общо разреждане на серума за целия експеримент, чийто обем се определя чрез умножаване на обема на серума в една епруветка (например 0,5 ml) по броя на епруветките, малко по-голям от броя им в експеримента. При приготвянето на всички компоненти на реакцията е необходим излишък от течност: част от нея остава по стените на епруветки, колби, пипети. Обеми от разреден хемолизин и суспензия от еритроцити, добавяйки серум към еритроцитите, разбъркват се старателно и се инкубират за 30 минути при 37°C (сенсибилизиране).

2. Овчи еритроцити. Приготвя се 3% суспензия от промити овчи еритроцити за целия брой епруветки в опита. За да се приготви хемолитична система, 30 минути преди въвеждането й в експеримента се смесват равни обеми еритроцити на овен с антитяло към тях.

3. Комплементът обикновено се разрежда 1: 10. Трябва да се титрира преди всеки експеримент. Титърът на комплемента е най-малкото му количество, когато се добави към хемолитичната система, пълната хемолиза настъпва в рамките на 1 час при 37°C.

4. Антигенът обикновено се получава готов с указание за титъра му, т.е. количеството, което след разреждане на антигена трябва да се съдържа в 1 ml. Например, при титър 0,4, той се разрежда в 0,96 ml изотоничен разтвор. В опита вземете количеството антиген, равно на половината от титъра (0,5 ml). Това е работната му доза. Пригответе общо разреждане на антиген за целия експеримент, като умножите 0,5 ml по броя на епруветките в експеримента.

5. Антитяло - серум на пациента. Пресният серум се инактивира преди експеримента, за да се унищожи присъстващият в него комплемент. За целта се загрява 30 минути при 56°C на водна баня или в инактиватор с термостат. Последният метод е за предпочитане: той елиминира възможността от прегряване

Изявление на реакцията на свързване на комплемента (RSC).

Реакцията се поставя в обем от 1 куб. cm (0,2 куб. cm от всеки компонент).

Тестовите серуми се изследват в разреждане 1: 5 и 1: 10 (дозата на серума е 0,04 cc и 0,02 cc със специфичен антиген, в разреждане 1: 5 с контролен антиген (за специфичност) и без антиген (за антикомплементарност).

Тестът и контролните серуми се инактивират в деня на реакцията в разредена форма при 56-65°C (в зависимост от вида на животното) за 30 минути. (също в RDSC).

И двата етапа на реакцията се провеждат на водна баня при 37-38 ° С, бактериолитичната система се държи 60 минути, вторият етап на реакцията (с хемолитичната система) е 20 минути.

Контроли на основния RSK опит:

положителен серум, разреден 1:5 без антиген и с контролен антиген; в разреждания от 1: 5 до неговия титър със специфичен антиген;

отрицателен серум в разреждания 1:5 и 1:10 със специфичен антиген, в разреждане 1:5 с контролен антиген и без антиген - специфични и контролни антигени в двойна доза - за антикомплементарност (комплемент +) и за хемотоксичност (комплемент );

хемолитична система за хемотоксичност (комплемент).

Отчитане на резултатите. В контролите дори не трябва да има следи от хемолиза, тъй като едната от тях няма комплемент, а другата не съдържа хемолизин. Контролите показват липсата на реакции на хемотоксичност (способност за спонтанно лизиране на еритроцитите) в компонентите.

В експеримента активността на комплемента може да намалее поради неговата неспецифична адсорбция от други компоненти на реакцията, следователно за експеримента количеството на комплемента се увеличава: взема се дозата, следваща титъра. Това е работната доза.

Има различни опции за поставяне на RSC: класически. методът на настройка под формата на макро- и микроварианти, реакцията на дългосрочно фиксиране на комплемента (RDSC) в студа, методът на количествата. RSK за 50% хемолиза на сенсибилизирани еритроцити и др. За диагностика на редица заболявания се използва по-чувствителен метод - RDSK.

Изявление на реакцията на дългосрочно фиксиране на комплемента (RDSC).

Първата фаза на реакцията се провежда в хладилник при 2-6°С за 16-18 часа, втората фаза на водна баня за 20 минути при 37-38°С.

Комплементът се използва в работно разреждане 1:25 или 1:30 (при определяне на работното му разреждане).

През първия ден серумите и антигенът се бутилират за основния експеримент. Реакцията се поставя в обем от 1 куб. cm (0,2 куб. cm от всеки компонент). Контролите на RDSC са същите като при настройката на RSC.

След това, допълнение от 0,2 куб. см, в зависимост от работното му разреждане, епруветките се разклащат и се поставят в хладилник за 16-18 часа. при 2-6°C.

На следващия ден решетките с първата фаза се изваждат от хладилника и след като престоят 20-30 мин. при стайна температура хемолитичната система се излива във всички епруветки в доза (в дадения пример 0,6 куб. см). Решетките се разклащат и се поставят на водна баня за 20 минути. при 37-38°С.

Схемата на основния експеримент RDSC е представена в таблица 3.

Отчитането на резултатите от RSC, RDSC се извършва два пъти: първият път - веднага след водната баня, вторият - след като еритроцитите се утаят на дъното на епруветката (3-4 часа след водната баня) или следващият ден при съхранение в хладилник от 2° до 6°C.

За обективно определяне на резултатите от реакцията се препоръчва да се оцени процентът на хемолизата. За целта от реакцията се избират 5 епруветки с пълна (100%) хемолиза и течността от тях се излива в една епруветка. От него се приготвят разреждания с по-нисък процент на хемолиза, така наречената скала „Стандарт“.

Степента на хемолиза в епруветките с тестовите серуми се определя чрез сравнение със степента на хемолиза в "стандартни" епруветки и процентът на хемолизата се изразява в кръстове.

Степента на забавяне е обратно пропорционална на процента на хемолиза на еритроцитите:

++++ (4 кръста) - няма хемолиза, супернатантната течност е прозрачна, безцветна;

+++ (3 кръста) - хемолиза на 25% от еритроцитите;

++ (2 кръста) - хемолиза на 50% от еритроцитите;

+ (1 кръст) - хемолиза на 75% от еритроцитите;

(минус) - пълна хемолиза на еритроцитите, без утайка, течността е интензивно оцветена с хемоглобин.

Оценка на резултатите от RSK, RDSK.

Тестовите серуми се оценяват в разреждания 1: 5 и 1: 10 (0,04 cc, 0,02 cc) с пълна хемолиза на еритроцитите в контролен серум без антиген и с контролен антиген.

Положителната реакция се оценява, когато хемолизата на еритроцитите се забави с 3-4 кръста в разреждане 1: 10.

Съмнително - със забавяне на хемолизата на еритроцитите с 1 кръст в разреждане на серума 1: 10 и от 2 до 4 кръста в разреждане 1: 5.

Отрицателен - с пълна хемолиза на еритроцитите в серумни разреждания 1: 5 и 1: 10.