В края на статията вж
Полимеразна верижна реакция (PCR)изобретен през 1983 г. от Кари Мълис (американски учен). Впоследствие той получава Нобелова награда за това изобретение. В момента PCR диагностиката е един от най-точните и чувствителни методи за диагностициране на инфекциозни заболявания.
Полимеразна верижна реакция (PCR)- експериментален метод на молекулярната биология, метод за значително увеличаване на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина (ДНК) в биологичен материал (проба).
PCR методът се основава на многократно удвояване на определен участък от ДНК с помощта на ензими при изкуствени условия (in vitro). В резултат на това се произвеждат количества ДНК, достатъчни за визуално откриване. В този случай се копира само секцията, която отговаря на зададените условия, и то само ако присъства в изследваната проба.
В допълнение към простото увеличаване на броя на ДНК копията (този процес се нарича амплификация), PCR позволява много други манипулации с генетичен материал (въвеждане на мутации, снаждане на ДНК фрагменти) и се използва широко в биологичната и медицинската практика, напр. , за диагностициране на заболявания (наследствени, инфекциозни), за установяване на бащинство, за клониране на гени, въвеждане на мутации и изолиране на нови гени.

Специфика и приложение

Провеждане на PCR

За извършване на PCR в най-простия случай са необходими следните компоненти:

• ДНК шаблон, съдържащ секцията на ДНК, която трябва да бъде амплифицирана;
• два праймера, комплементарни на краищата на желания фрагмент;
• термостабилна ДНК полимераза;
• дезоксинуклеотидни трифосфати (A, G, C, T);
• Mg2+ йони, необходими за работата на полимеразата;
• буферен разтвор.

PCR се извършва в термоциклер - устройство, което осигурява периодично охлаждане и нагряване на епруветките, обикновено с точност най-малко 0,1°C. За да избегнете изпаряването на реакционната смес, добавете масло с висока температура на кипене, като вазелин, в епруветката. Добавянето на специфични ензими може да увеличи добива на PCR реакцията.
Прогрес на реакцията

Обикновено PCR провежда 20 - 35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа. Двойноверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се разделят ДНК веригите. Този етап се нарича денатурация – разрушават се водородните връзки между двете вериги. Понякога, преди първия цикъл, реакционната смес се загрява предварително за 2 - 5 минути, за да денатурира напълно матрицата и праймерите.
След като нишките се разделят, температурата се понижава, за да позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване. Температурата на отгряване зависи от праймерите и обикновено се избира 4 - 5°C под тяхната температура на топене. Времето на сцената е 0,5 - 2 минути.

ДНК полимеразата репликира шаблонната верига, използвайки праймер като праймер. Това е етапът на удължаване. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните полимерази са най-активни при 72°C. Времето на удължаване зависи както от вида на ДНК полимеразата, така и от дължината на амплифицирания фрагмент. Обикновено времето за удължаване се приема за една минута на хиляда базови двойки. След като всички цикли са завършени, често се извършва допълнителна крайна стъпка на удължаване, за да се завършат всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 10-15 минути.
Подготовка на материала за изследване и транспортирането му до лабораторията

За успешен анализ е важно правилно да се вземе материал от пациента и да се подготви правилно. Известно е, че в лабораторната диагностика по-голямата част от грешките (до 70%) се допускат именно на етапа на подготовка на пробите. За вземане на кръв в лаборатория INVITRO в момента се използват вакуумни системи, които от една страна минимално нараняват пациента, а от друга страна позволяват материалът да бъде взет така, че да не влиза в контакт с персонал или среда. По този начин се избягва контаминация (замърсяване) на материала и се гарантира обективността на PCR анализа.

ДНК – дезоксирибонуклеинова киселина – е биологичен полимер, един от двата вида нуклеинови киселини, които осигуряват съхранение, предаване от поколение на поколение и осъществяване на генетичната програма за развитието и функционирането на живите организми. Основната роля на ДНК в клетките е дълготрайното съхранение на информация за структурата на РНК и протеините.

РНК-рибонуклеиновата киселина е биологичен полимер, подобен по своята химична структура на ДНК. Молекулата на РНК е изградена от същите мономерни единици – нуклеотиди като ДНК. В природата РНК обикновено съществува като единична верига. При някои вируси РНК е носител на генетична информация. В клетката той играе важна роля в преноса на информация от ДНК към протеина. РНК се синтезира върху ДНК шаблон. Този процес се нарича транскрипция. В ДНК има области, които съдържат информация, отговорна за синтеза на три вида РНК, които се различават по функциите, които изпълняват: информационна или информационна РНК (иРНК), рибозомна РНК (рРНК) и транспортна РНК (тРНК). И трите вида РНК по един или друг начин участват в протеиновия синтез. Информацията за протеиновия синтез обаче се съдържа само в иРНК.

Нуклеотидите са основната повтаряща се единица в молекулите на нуклеинова киселина, продукт на химическа комбинация от азотна основа, петвъглеродна захар (пентоза) и една или повече фосфатни групи. Нуклеотидите, присъстващи в нуклеиновите киселини, съдържат една фосфатна група. Наименуват се според съдържащата се в тях азотна основа - аденин (А), съдържащ аденин, гуанин (G) - гуанин, цитозин (С) - цитозин, тимин (Т) - тимин, урацил (U) - урацил. ДНК съдържа 4 вида нуклеотиди - A, T, G, C, РНК също съдържа 4 вида - A, U, G, C. Захарта във всички нуклеотиди на ДНК е дезоксирибоза, РНК - рибоза. Когато се образуват нуклеинови киселини, нуклеотидите се свързват, за да образуват захарно-фосфатен скелет на молекулата, от едната страна на който има бази.

Праймерът е къса ДНК, използвана за репликиране на шаблонната верига. Всеки от праймерите е комплементарен към една от нишките на двойноверижния шаблон, рамкирайки началото и края на амплифицираната област.

Литература

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение. пер. от английски - М.: Мир, 2002. - 589 с., илюстрация. ISBN 5-03-003328-9
2. Щелкунов С.Н. Генно инженерство - Новосибирск: Сибирск. Унив. издателство, 2004. - 496 с.; аз ще. ISBN 5-94087-098-8
3. Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи - М.: Наука, 2005 - В 2 тома - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацията в този раздел не може да се използва за самодиагностика и самолечение. В случай на болка или друго обостряне на заболяването, диагностичните изследвания трябва да се предписват само от лекуващия лекар. За да поставите диагноза и правилно да предпишете лечение, трябва да се свържете с Вашия лекар.

Полимеразна верижна реакция (PCR) е високоточен метод в областта на диагностицирането на наследствени патологии, инфекции, вирусни заболявания на всеки етап (остър или хроничен), както и - на ранен етап - преди явни прояви на заболяването чрез идентифициране на патогени въз основа на тяхната ДНК, РНК, които са генетичен материал, в проби, получени от пациента. И днес ще говорим за същността, диагностичните етапи и принципите на методите на полимеразна верижна реакция (PCR), както и за неговата цена.

Какво е полимеразна верижна реакция

В основата на анализа е амплификацията (удвояването) - създаването на много копия от къс участък от ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина), който представлява човешкия генетичен комплекс. Изследването изисква много малко количество физиологична субстанция (храчки, изпражнения, епителни изстъргвания, простатен сок, кръв, сперма, амниотична течност, слуз, плацентарна тъкан, урина, слюнка, плеврална течност, цереброспинална течност). В този случай, например, дори един вреден микроб може да бъде открит в пикочно-половия тракт на пациента.

Техниката PCR (полимеразна верижна реакция) е разработена от американския учен К. Мълис, получил Нобелова награда през 1993 г.

Активно използвани:

• при ранна диагностика на инфекции, генетични;
• при съдебномедицинска експертиза, когато има изключително малко количество ДНК на разположение за изследване;
• във ветеринарната медицина, фармацевтиката, биологията, молекулярната генетика;
• за идентифициране на лице по ДНК, потвърждаване на бащинство;
• в палеонтологията, антропологията, екологията (при наблюдение на качеството на продуктите, факторите на околната среда).

Това видео ще ви разкаже подробно какво е полимеразна верижна реакция:

На кого се предписва?

Полимеразната верижна реакция в диагностиката на инфекциозни заболявания е един от най-надеждните методи с особена точност и надеждност. Например, надеждността на PCR анализа за хламидия и много други патогени е близо до 100% (абсолютно). Най-често процедурата за полимеразна верижна реакция се предписва на пациенти, които имат затруднения при идентифицирането на специфичен патоген по време на диагностицирането.

Използва се лабораторен PCR тест:

• за откриване на патогени, които причиняват инфекции на пикочните и гениталните органи, които трудно се идентифицират с помощта на култура или имунологични методи;
• за повторна диагностика на ХИВ в началния етап в случай на положителен, но съмнителен резултат от първоначалния тест (например при новородени от родители, заразени със СПИН);
• за идентифициране на рак на ранен етап (изследване на онкогенни мутации) и индивидуално коригиране на режима на лечение за конкретен пациент;
• с цел ранно откриване и евентуално лечение на наследствени патологии.

По този начин бъдещите родители правят тест, за да разберат дали са носители на генетична патология; при децата PCR определя вероятността от излагане на заболяване, предавано по наследство.

• за откриване на патологии на плода в ранните етапи на бременността (отделните клетки на растящия ембрион се изследват за наличие на възможни мутации);
• при пациенти преди органна трансплантация - за "тъканно типизиране" (определяне на тъканна съвместимост);
• за идентифициране на опасни патогенни организми в дарената кръв;
• при новородени - за идентифициране на скрити инфекции;
• за оценка на резултатите от антивирусно и антимикробно лечение.

Защо да се подложите на такава процедура?

Тъй като PCR е високоефективен диагностичен метод, даващ почти 100% резултат, процедурата се използва:

• за потвърждаване или отхвърляне на окончателната диагноза;
• бърза оценка на ефективността на терапията.

В много случаи PCR е единственият възможен тест за откриване на развиващо се заболяване, ако други бактериологични, имунологични и вирусологични диагностични методи са безполезни.

• Вирусите се откриват чрез PCR процедура веднага след заразяването и преди да се появят признаци на заболяване. Ранното откриване на вируса позволява своевременно лечение.
• Така нареченият „вирусен товар“ (или броят на вирусите в тялото) също се определя чрез ДНК анализ с помощта на количествен метод.
• Специфични патогени (напр. туберкулозен бацил на Кох) са трудни и отнема твърде много време за култивиране. PCR тестването позволява бързо откриване на минимални патогени (живи и мъртви) в удобни за тестване проби.

Използва се подробен ДНК анализ на патогена:

• да се определи неговата чувствителност към специфични видове антибиотици, което позволява незабавно лечение;
• за контрол на разпространението на епидемии сред домашните и дивите животни;
• за идентифициране и проследяване на нови инфекциозни микробни видове и патогенни подтипове, които са подхранвали предишни епидемии.

Видове диагностика

Стандартен метод

Анализът на полимеразна верижна реакция се извършва на базата на многократна амплификация (удвояване) на специфичен фрагмент от ДНК и РНК с помощта на специални праймерни ензими. В резултат на веригата за копиране се получава достатъчно количество материал за изследване.

По време на процедурата се копира само желаният фрагмент (съответстващ на зададените специфични условия) и ако действително присъства в пробата.

Това подробно видео с полезни диаграми обяснява как работи PCR:

Други методи

• PCR в реално време. При този тип изследвания процесът на идентифициране на даден ДНК фрагмент започва след всеки цикъл, а не след завършване на цялата верига от 30 - 40 цикъла. Този вид изследване ви позволява да получите информация за количеството на патоген (вирус или микроб) в тялото, т.е. да извършите количествен анализ.
• RT-PCR (режим на обратна транскрипция). Този тест се използва за търсене на едноверижна РНК за откриване на вируси, чиято генетична основа е РНК (например вирус на хепатит С, вирус на имунна недостатъчност). При това изследване се използва специален ензим – обратна транскриптаза и специфичен праймер, а на базата на РНК се изгражда едноверижна ДНК. След това втората ДНК верига се възстановява от тази верига и се извършва стандартната процедура.

Показания за задържане

PCR процедурата се използва в клиниката по инфекциозни болести, неонатология, акушерство, педиатрия, урология, гинекология, венерология, неврология, нефрология и офталмология.

Показания за изследване:

• определяне на риска от развитие на генетични аномалии при дете с вероятност от наследствени патологии;
• диагностициране на двамата родители при планиране на бременност или тежкото състояние на майката по време на продължаваща бременност;
• трудности при зачеването, идентифициране на причините за безплодие;
• подозрение за полово предавани инфекции в острия стадий и със симптоми на прехода им към хронични;
• откриване на причините за възпалителни процеси с неясен произход;
• незащитени случайни и редовни сексуални контакти;
• определяне на чувствителността на патогенен микроорганизъм към специфични антибиотици;
• пациенти със съмнение за латентна инфекция за откриване на патогени преди развитието на очевидни симптоми (предклинична диагноза);
• пациенти за потвърждаване на възстановяване след заболяване (ретроспективна диагноза);:

Диагностиката се използва и ако е необходимо точно да се идентифицират следните патогени:

• хепатитни вируси (A B C G), човешки имунодефицит, цитомегаловирус;
• Vibrio cholerae;
• вирус на херпес симплекс, херпетиформен вид;
• ретро - адено - и риновируси;
• вируси на рубеола, Епщайн-Бар, варицела (Зостер);
• парво и пикорновируси;
• бактерия Helicobacter pylori;
• Легионела, патогенни видове Escherichia coli;
• Стафилококус ауреус;
• патоген;
• клостридии, дифтерия и хемофилус инфлуенце;

Използва се и за определяне на инфекции:

• Инфекциозна мононуклеоза;
• борелиоза, листериоза, енцефалит, пренасян от кърлежи;
• кандидоза, причинена от гъбички Candida;
• инфекции, предавани по полов път - трихомониаза, уреаплазмоза, трепонема палидум, гарднерелоза, гонорея, микоплазмоза, хламидия;
• туберкулоза.

Противопоказания за

Тъй като процедурата не се извършва с пациента, без никакво въздействие върху тялото, а с биологичен материал, взет за изследване, няма противопоказания за PCR поради липса на потенциална опасност.

Въпреки това, след процедурата за колпоскопия не се събира биоматериал от цервикалния канал на матката. Предаването на петна и изстъргвания за анализ е разрешено само 4-6 дни след края на менструацията и пълното спиране на изхвърлянето.

Безопасен ли е методът?

Не е възможно отрицателно въздействие върху пациента по време на изолирано изследване на неговия биоматериал в лабораторията.

Подготовка за процедурата (доставяне на биологични вещества за анализ)

Всяка биологична течност, тъкан или телесни секрети служат като проба за PCR анализ, който открива ДНК на чужд патоген. Тестваното вещество се взема под формата на кръв от вена, изстъргване от ларинкса, носната кухина, уретрата, плевралната кухина, шийката на матката.

Преди диагностичната процедура лекарят обяснява на пациента какъв материал ще бъде събран:

1. При изследване за полово предавани инфекции се събират секрети от половите органи, урина и цитонамазка от уретрата.
2. При анализ за херпесни инфекции се вземат за анализ цитомегаловирус, мононуклеоза, урина и тампон от гърлото; за хепатит, токсоплазмоза се взема кръв от вена.
3. За да се диагностицират различни видове, се събира цереброспинална течност.
4. В пулмологията пробите за анализ са храчка и плеврална течност.
5. При провеждане на изследване на възможни вътрематочни инфекции по време на бременност за анализ се използват амниотична течност и плацентарни клетки.

Надеждността и точността на анализа зависи от стерилността на условията при вземане на материала. Тъй като PCR тестът е силно чувствителен, всяко замърсяване на тестваното вещество може да изкриви резултата.

Компетентната подготовка за доставката на биоматериал не създава никакви затруднения за пациентите. Има определени препоръки:

• при анализ за полово предавани инфекции:
  • изключване на интимни контакти 72 часа преди предаване на материала;
  • спрете да използвате всякакви вагинални продукти 3 дни преди това;
  • от вечерта на предишния ден не извършвайте хигиена на изследваната зона;
  • изключете уриниране 3-4 часа преди вземане на проба от уретрата;
• спрете приема на антибиотици един месец преди тестване за инфекции;
• кръвта се дарява сутрин преди ядене и пиене;
• Първата сутрешна проба от урина се събира в стерилен съд след обстоен интимен тоалет.

Прочетете по-долу как се извършва диагностиката с помощта на метода на полимеразна верижна реакция.

Как протича процедурата?

Когато се извършва PCR изследване, определени цикли се повтарят отново и отново в реактор (усилвател или термичен цикъл):

1. Първата стъпка е денатурация. Слюнка, кръв, биопсичен материал, гинекологични проби, храчки, в които се подозира наличието на ДНК (или РНК) на патоген, се поставят в усилвател, където материалът се нагрява и ДНК се разделя на две отделни вериги.
2. Втората стъпка е отгряване или леко охлаждане на материалаи добавяне на праймери към него, които могат да разпознаят желаните региони в ДНК молекулата и да се свържат с тях.
3. Третата стъпка е удължаване– възниква след прикрепване на 2 праймера към всяка от ДНК веригите. По време на процеса ДНК фрагментът на патогена е завършен и се образува неговото копие.

Тези цикли се повтарят като „верижна реакция“, като всеки път водят до удвояване на копия на специфичен ДНК фрагмент (например сегмента, където е програмиран специфичен вирус). В рамките на няколко часа се образуват много копия на ДНК фрагмента и се открива тяхното присъствие в пробата. След това резултатите се анализират и сравняват с данни от база данни за различни видове патогени, за да се определи вида на инфекцията.

Прочетете по-долу за декодирането на резултатите и заключението въз основа на PCR реакцията.

Декодиране на резултатите

Окончателният резултат от изследването се издава 1-2 дни след предаването на биологичния материал. Често - още на първия ден след анализа.

Качествен анализ

• Отрицателнарезултатът означава, че в предоставеното за изследване вещество не са открити следи от инфекциозни агенти.
• Положителенрезултатът означава откриване на патогенни вируси или бактерии в биологична проба с много висока степен на точност в момента на подаване на материала.

Ако резултатът е положителен, но не се откриват признаци на повишена инфекция, това състояние на тялото се нарича асимптоматично „здравословно носителство“. Най-често се наблюдава при вземане на биоматериал от определено място (цервикален канал, уретра, устна кухина) при вирусни заболявания. В този случай не се изисква лечение, но е необходимо постоянно медицинско наблюдение, тъй като има възможност за:

• разпространение на вируса от носители и заразяване на здрави хора;
• активиране на процеса и преминаване на болестта в хронична форма.

Въпреки това, ако кръвният тест е положителен, това показва, че инфекцията е поразила тялото и това вече не е състояние на носителство, а патология, която изисква незабавна специфична терапия.

Количествен анализ

Количественият резултат се определя от специалист специално за определен тип инфекция. Въз основа на него е възможно да се оцени степента на развитие и стадия на заболяването, което позволява своевременно да се предпише правилното лечение.

средна цена

Цените за полимеразна верижна реакция се определят от: вида на изследването, трудността при идентифициране на патогена, трудността при събиране на биологичен материал, вида на анализа (качествен или количествен) и нивото на цените в лабораторията.

От друга страна, при изследване на PCR е възможно да се идентифицират няколко патогена наведнъж при събиране на един вид материал за анализ. Това ви позволява да спестите други лабораторни изследвания.

Приблизителна цена на PCR анализ в рубли:

• гонокок, гарднерела, трихомонада вагиналис – от 180 бр
• хламидия трахоматис – от 190 бр
• папиломен вирус - от 380 до 500
• биоценоза на урогениталния тракт при жените (количествена и качествена оценка на микрофлората) - от 800.

Още по-полезна информация относно PCR теста се съдържа във видеото по-долу:

Генетика на бактериите. Информация за втори урок.

Полимеразна верижна реакция

Полимеразната верижна реакция е метод, който позволява многократно увеличаване (амплификация) на количеството на определени ДНК молекули в анализираната проба (включително в биологичен материал или чиста култура).

Основните предимства на PCR като диагностичен метод в микробиологията са много висока чувствителност, позволяваща откриване на изключително ниски концентрации на патогени в пробите, както и регулируема специфичност, позволяваща откриване или идентифициране на патогени на ниво род, вид или подвид. Основният недостатък на PCR произтича от неговата изключително висока чувствителност - много лесно е пробите да бъдат замърсени с ДНК от положителна контрола, друга проба или PCR продукт, което води до фалшиво положителна реакция. Това налага строги ограничения върху условията, при които се извършва PCR смесване и работа с готови PCR продукти.

Провеждане на PCR.Приготвя се реакционна смес, съдържаща следните компоненти:

Изолирана ДНК от тестовата проба,

буферен разтвор,

Mg2+ йони (необходими за функционирането на ензима),

Два праймера са едноверижни къси ДНК молекули (най-често с дължина от 18 до 24 нуклеотида), комплементарни на краищата на различни вериги на откриваната ДНК последователност.

Смес от дезоксинуклеотид трифосфати.

Топлоустойчива ДНК полимераза (най-често се използва Taq полимераза - полимераза, изолирана от Термус aquaticus).

След това тази реакционна смес се поставя в термоциклер, който по същество е програмируем термостат. Термоциклерът извършва 30-40 цикъла на температурни промени. Всеки от тези цикли се състои от три етапа (виж фиг. 1):

Денатурация (температура 94 o C) - водородните вериги се разкъсват и ДНК нишките се разминават.

Отгряване на праймери (температурата обикновено е около 50-60 o C) - праймерите се прикрепват към краищата на ДНК веригите. Като цяло, когато температурата се понижи, е енергийно по-благоприятно да се обединят отново оригиналните ДНК вериги от тестовата проба (ренатурация), но концентрацията на праймери в реакционната смес е много порядъци по-висока от концентрацията на ДНК от проба (поне в началните PCR цикли), така че реакцията на отгряване на праймера протича по-бързо от ренатурирането на ДНК. Температурата на отгряване се избира в зависимост от температурите на топене (денатурация) на праймерите.

Удължаване (температурата обикновено е 72 o C) - ДНК полимеразата завършва праймерите по матрицата на дългите ДНК вериги. Температурата съответства на оптималната работна температура на използваната ДНК полимераза.

Откриването на резултатите се различава в различните версии на PCR и е описано в раздела „Видове PCR“.

PCR динамика

В ранните PCR цикли, броят на двойноверижните ДНК молекули, чийто размер се определя от разстоянието между местата за кацане на праймера, се удвоява с всеки цикъл. Образува се и малко количество по-дълги ДНК молекули, което може да се пренебрегне (виж Фиг. 2).

По този начин, в ранните цикли, количеството на PCR продукта се описва с формулата m*2 n, където m е първоначалното количество от желаната ДНК в пробата, n е броят на циклите. След това реакцията достига плато. Това се дължи на натрупването на реакционния продукт, намаляване на концентрацията на праймери и дезоксинуклеотид трифосфати, както и поради повишаване на концентрацията на пирофосфат (виж Фигура 3).

Видове PCR

Конвенционален PCR

В тази версия на PCR настройката реакцията протича за предварително избран брой цикли (30-40), след което се анализира дали в реакционната смес е настъпило натрупване на двойноверижни ДНК молекули.

Тази възможност за извършване на PCR, когато се използва като диагностичен метод, е качествен метод. Положителната реакция показва наличието на поне следи от желаните ДНК молекули в пробата. Отрицателната реакция показва тяхното отсъствие. Количествената оценка на съдържанието на оригиналните ДНК молекули в пробата е невъзможна поради достигане на реакцията на плато.

Основният метод за откриване на наличието на продукт е електрофореза в агарозен или полиакриламиден гел. PCR продуктите се разделят в гел под въздействието на електрическо поле според молекулното им тегло. Към гела се добавя интеркалиращо багрило (флуоресциращо в състояние на двойноверижна ДНК - най-често етидиев бромид). По този начин, при облъчване с ултравиолетова светлина, ще бъде възможно да се види наличието или отсъствието на лента, съответстваща на ДНК с необходимото молекулно тегло. При извършване на PCR за диагностични цели винаги се използват контроли с положителна и отрицателна реакция, с които се сравняват пробите (виж фиг. 4).

PCR в реално време

В тази версия на PCR, количеството на PCR продукта в реакционната смес се записва постоянно по време на протичането на реакцията. Това ви позволява да построите реакционна крива (вижте фиг. 3) и въз основа на нея да изчислите броя на желаните ДНК молекули в пробите.

Един тип PCR в реално време използва интеркалиращо багрило, което се добавя директно към реакционната смес (SYBRGreen се използва най-често). Друг тип е използването на един от видовете флуоресцентни сонди, които се свързват с място вътре в PCR продукта, което прави възможно увеличаването на специфичността на откриването (вижте Фигура 5).Флуоресцентното откриване се осъществява директно в устройството по време на реакцията.

В допълнение към възможността за количествено откриване, има и други предимства на PCR в реално време в сравнение с конвенционалната PCR. Този PCR вариант е по-опростен, по-бърз и не изисква отваряне на епруветки с PCR продукти, което намалява възможността от замърсяване на други проби. Основният недостатък е по-високата цена на усилвател с вградена способност за откриване на флуоресценция в сравнение с конвенционален.

Цифрова количествена PCR

Нова, скъпа и все още неразпространена версия на PCR, която позволява по-точно определяне на количеството ДНК в проба.В тази версия реакционната смес, съдържаща флуоресцентно багрило, се разделя на огромен брой микроскопични обеми (напр. , капчици в емулсия). След PCR се анализира в каква част от капките реакцията се е оказала положителна и съответно се наблюдава флуоресценция. Тази част ще бъде пропорционална на броя на търсените ДНК молекули в пробата.

PCR с обратна транскрипция

В този случай, преди един или друг вариант на PCR, се извършва реакция на обратна транскрипция (РНК към ДНК) с помощта на обратния ензим. По този начин този метод позволява качествено или количествено откриване на РНК молекули. Това може да се използва за откриване на РНК-съдържащи вируси или за определяне на нивото на транскрипция (количеството иРНК) на определен ген.

Снимка 1.Етапи на PCR. Грундовете са обозначени в червено.

Фигура 2.Натрупване на двойноверижни ДНК молекули, ограничено от праймери по време на PCR.

Фигура 3.Динамиката на PCR реакцията при различни начални концентрации на желаните ДНК молекули в пробата. (a) - най-високата концентрация (b) - междинна концентрация (c) - най-ниската концентрация

Фигура 4.Агарозна електрофореза на PCR продукти. K+ – положителна контрола (известно е, че желаната ДНК присъства). 1-7 – тест проби (от които 1-2 положителни, 3-7 отрицателни). K- – отрицателна контрола (желаната ДНК очевидно липсва). В много случаи, в допълнение към целевия продукт, се виждат по-леки неспецифични реакционни продукти (праймери-димери).

Фигура 5.Методи за откриване чрез PCR в реално време. (a) – интеркалиращо багрило – флуоресцира, когато се свърже с двойноверижна ДНК (b) – Сонда Taqman – флуоресценция възниква, когато сондата се разцепи от ДНК полимераза с 5’-3’ ендонуклеазна активност поради разделяне на флуорофора и гасителя. (c) – MolecularBeacon сонда – флуоресценция възниква, когато сондата се хибридизира с целевия фрагмент поради пространственото разделяне на флуорофора и гасителя (d) – LightCycler сонди – акцепторната флуоресценция възниква, когато сондите (съдържащи акцептор и донор) се хибридизират с целеви фрагмент поради резонансния трансфер на флуоресцентна енергия (FRET).

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Същността на метода PCR. ДНК полимераза

Полимеразната верижна реакция е експериментален метод на молекулярната биология, който позволява да се постигне значително увеличение на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина в биологичен материал. Този процес на увеличаване на броя на копията на ДНК се нарича усилване. Копирането на ДНК по време на PCR се извършва от специален ензим - полимераза.ДНК полимеразата (фиг. 3) е ензим, участващ в репликацията (усилване на ДНК в живите организми) на ДНК. Ензимите от този клас катализират полимеризацията на дезоксирибонуклеотиди по протежение на верига от ДНК нуклеотиди, които ензимът "чете" и използва като шаблон. Типът на новия нуклеотид се определя от принципа на комплементарност с шаблона, от който се чете.

ДНК полимеразата добавя свободни нуклеотиди към 3" края на сглобената верига. Това води до удължаване на веригата в посока 5"-3. Нито една от известните ДНК полимерази не е в състояние да създаде верига от нулата: те могат само да добавят нуклеотиди към вече съществуваща 3"-хидроксилна група. Поради тази причина ДНК полимеразата се нуждае буквар- къса последователност от нуклеотиди (обикновено 20-25), комплементарни на крайните участъци на гена, който се изследва - към които тя може да добави първия нуклеотид. Праймерите винаги се състоят от ДНК и РНК бази, като първите две бази винаги са РНК бази. Праймерите се синтезират от друг ензим - примаза. Друг ензим хеликаза- необходима е за развиване на двойната спирала на ДНК за образуване на едноверижна структура, която осигурява репликацията на двете вериги в съответствие с полуконсервативния модел на репликация на ДНК.

Някои ДНК полимерази също имат способността да коригират грешки в новосглобената ДНК верига. Ако бъде открита неправилна двойка нуклеотиди, ДНК полимеразата се връща една стъпка назад, елиминира неправилния нуклеотид от веригата, след което вмъква правилния на негово място, след което репликацията продължава както обикновено.

Провеждане на PCR

Полимеразна верижна реакция (PCR) е метод за усилване на ДНК, който може да се използва за изолиране и умножаване на специфична ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността за получаване на огромен брой копия на една строго определена област на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За провеждане на полимеразна верижна реакция трябва да бъдат изпълнени редица условия. За извършване на PCR в най-простия случай са необходими следните компоненти:

ДНК матрица, съдържаща частта от ДНК, която трябва да бъде амплифицирана.

Два праймера, допълващи краищата на желания фрагмент. (Двойка изкуствено синтезирани олигонуклеотиди, обикновено вариращи по размер от 15 до 30 bp, идентични на съответните участъци от таргетната ДНК. Те играят ключова роля в образуването на продукти от реакцията на амплификация. Правилно подбраните праймери гарантират специфичността и чувствителността на тестовата система.)

Термостабилна ДНК полимераза. Полимеразата, използвана при PCR, трябва да остане активна при високи температури за дълго време, затова се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus (Taq полимераза) и др.

Дезоксинуклеотидни трифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ йони, необходими за функционирането на полимеразата.

Буферен разтвор, който осигурява необходимите условия за реакция - pH, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, серумен албумин.

За да избегнете изпаряването на реакционната смес, добавете масло с висока температура на кипене, като вазелин, в епруветката. Ако използвате устройство с отопляем капак, това не е задължително.

Добавянето на пирофосфатаза може да увеличи добива на PCR реакцията. Този ензим катализира хидролизата на пирофосфат, страничен продукт от добавянето на нуклеотидни трифосфати към растящата ДНК верига, към ортофосфат. Пирофосфатът може да инхибира PCR реакцията.

За да се умножи броят на копията на оригиналната ДНК, е необходима циклична реакция. По правило всеки от последователно повтарящите се PCR цикли се състои от три етапа:

1. Денатурация или "стопяване" на ДНК.Двойноверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96 °C (или до 98 °C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, така че ДНК веригите да се разделят. Този етап се нарича денатурация, тъй като водородните връзки между двете ДНК вериги се разкъсват. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимеразата), реакционната смес се загрява предварително за 2 - 5 минути, за да денатурира напълно матрицата и праймерите. Тази техника се нарича горещ старт, ви позволява да намалите количеството на продуктите на неспецифичната реакция.

2. Отгряване - свързване на праймери с матрична ДНК. След като веригите се разделят, температурата бавно се понижава, за да позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Температурата на отгряване зависи от състава на праймерите и обикновено се избира при 50-65°C. Времето на етапа е 20 - 60 секунди. Неправилният избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на праймерите към шаблона (при твърде висока температура) или до свързване на неправилно място и поява на неспецифични продукти (при твърде ниска температура).

3. Синтез (удължение на веригата).ДНК полимеразата репликира шаблонната верига, използвайки праймер като праймер. Полимеразата започва синтеза на втората верига от 3" края на праймера, който се е свързал с шаблона и се движи по шаблона. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните Taq и Pfu полимерази са най-активни при 72 ?C.Времето за синтез зависи от вида на ДНК полимеразата и от дължината на амплифицирания фрагмент.Обикновено времето за удължаване се приема за една минута на хиляда базови двойки.След приключване на всички цикли често се извършва допълнителен етап крайно удължение, за завършване на всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 7-10 минути.

Впоследствие етапите на денатурация, отгряване и удължаване се повтарят многократно (30 или повече пъти). При всеки цикъл броят на синтезираните копия на ДНК фрагмент се удвоява.

Всички реакции се провеждат в епруветки, потопени в термостат. Промяната на температурния режим и поддържането му се извършва автоматично.

За да разберете точно как специфичен ДНК сегмент се амплифицира по време на PCR, трябва ясно да си представите позицията на всички праймери и техните комплементарни последователности в амплифицираните нишки във всеки кръг. В първия кръг всяка от новосинтезираните вериги има много по-голяма дължина от разстоянието от 3"-хидроксилната група на нейния праймер до крайния нуклеотид на последователността, комплементарна на втория праймер. Такива вериги се наричат ​​"дълги шаблони" ; върху тях ще се извърши по-нататъшен синтез.

Във втория кръг двойноверижната ДНК, състояща се от подобни и новосинтезирани (дълги шаблонни) вериги, отново се денатурира и след това се отгрява с праймери. По време на синтеза в този кръг отново се синтезират "дълги шаблони", както и редица вериги с праймер в единия край и последователност, комплементарна на втория праймер в другия ("къси шаблони"). По време на третия кръг, всички хетеродуплекси, образувани по-рано, се денатурират едновременно и се отгряват с праймери и след това се репликират. В следващите кръгове има все повече и повече „къси матрици“, а към 30-ия кръг броят им вече е 10 6 пъти по-голям от броя на първоначалните вериги или „дългите матрици“.

Количеството специфичен реакционен продукт (ограничен от праймери) теоретично нараства пропорционално на 2n, където n е броят на реакционните цикли. В действителност ефективността на всеки цикъл може да бъде по-малка от 100%, така че в действителност:

където P е количеството продукт, E е средната ефективност на цикъла.

Броят на „дългите” ДНК копия също се увеличава, но линейно, така че специфичен фрагмент доминира в продуктите на реакцията. Растежът на необходимия продукт е експоненциално ограничен от броя на реагентите, наличието на инхибитори и образуването на странични продукти.

PCR е много чувствителен метод, следователно, ако тестовата проба съдържа дори незначително количество ДНК, което случайно е преминало от една реакционна смес в друга, могат да се получат фалшиво положителни резултати. Това налага внимателно да се контролират всички разтвори и стъклария, използвани за PCR.

Основни принципи на избор на грунд.

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

1. Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3 "края на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава най-вероятно ще се появят нежелани процеси в епруветката с реакционната смес , а именно синтеза на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ленти. Това затруднява оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен амплификационен продукт със синтезирана чужда ДНК. Някои праймери и dNTPs се изразходват за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на чувствителност.

2. Грундовете не трябва да образуват димери и бримки, т.е. стабилни двойни вериги не трябва да се образуват в резултат на праймери, отгрявани сами по себе си или един с друг.

Което ви позволява да откриете малки количества или по-скоро определени фрагменти от него в биологичен материал и да ги умножите многократно. След това те се идентифицират визуално чрез гел електрофореза. Реакцията е разработена през 1983 г. от К. Мулис и е включена в списъка на изключителните открития от последните години.

Какви са механизмите на PCR

Цялата техника се основава на способността на нуклеиновите киселини да се репликират независимо, което в случая се извършва изкуствено в лаборатория. Възпроизвеждането на ДНК може да започне не във всяка област на молекулата, а само в области с определена нуклеотидна последователност - начални фрагменти. За да започне полимеразната верижна реакция, са необходими праймери (или ДНК проби). Това са къси фрагменти от ДНК верига с дадена нуклеотидна последователност. Те са комплементарни (т.е. съответстващи) на началните места

Разбира се, за да създадат праймери, учените трябва да проучат нуклеотидната последователност на този, който участва в техниката. Именно тези ДНК сонди осигуряват специфичността на реакцията и нейното започване. няма да работи, ако пробата не съдържа поне една молекула от желаната ДНК. Като цяло, горните праймери, набор от нуклеотиди и термостабилна ДНК полимераза са необходими за извършване на реакцията. Последният е ензим, който катализира реакцията на синтез на нови молекули нуклеинова киселина въз основа на пробата. Всички тези вещества, включително биологичния материал, в който трябва да се открие ДНК, се комбинират в реакционна смес (разтвор). Поставя се в специален термостат, който извършва много бързо нагряване и охлаждане в рамките на зададено време - цикъл. Обикновено има 30-50 от тях.

Как се случва тази реакция?

Същността му е, че по време на един цикъл праймерите се прикрепят към желаните участъци от ДНК, след което се удвояват под действието на ензим. На базата на получените ДНК вериги в следващите цикли се синтезират все повече и повече идентични фрагменти от молекулата.

Полимеразната верижна реакция протича последователно, като се разграничават следните етапи. Първият се характеризира с удвояване на количеството продукт по време на всеки цикъл на нагряване и охлаждане. Във втория етап реакцията се забавя, тъй като ензимът е повреден и също губи активност. В допълнение, резервите от нуклеотиди и праймери са изчерпани. На последния етап - плато - продуктите вече не се натрупват, защото реагентите са свършили.

Къде се използва?

Несъмнено полимеразната верижна реакция се използва широко в медицината и науката. Използва се в общата и специалната биология, ветеринарната медицина, фармацията и дори екологията. Освен това в последните те правят това, за да наблюдават качеството на храната и обектите на околната среда. Полимеразната верижна реакция се използва активно в съдебната практика за потвърждаване на бащинството и идентифициране на самоличността на дадено лице. В криминалистиката, както и в палеонтологията, тази техника често е единственият изход, тъй като обикновено много малко ДНК е достъпно за изследване. Разбира се, методът е намерил много широко приложение в практическата медицина. Необходимо е в области като генетика, инфекциозни и онкологични заболявания.