Методи за въвеждане на рекомбинантна ДНК в клетка. Нов метод за доставяне на ДНК до ембрионални стволови клетки. Методи за доставяне на ДНК ваксини в клетките
Една от най-обещаващите възможности за системи за доставяне на гени в клетките са полиплексите - комплекси от пренесена ДНК и катионни полимери от различно естество. Тази статия описва свойствата на полиплексите, базирани на няколко вида катионни полимери, техния транспорт в ядрата на целевите клетки, както и един от подходите за лечение на злокачествени новообразувания с помощта на тези конструкции.
Въведение
Генната терапия е лечение на наследствени, онкологични и други заболявания чрез въвеждане на необходимия генетичен материал в клетките на пациента, за да се променят специфично генните дефекти или да се придадат нови функции на клетките [Gorbunova et al., 1997]. За да се достави ДНК или РНК до целевите клетки, се създават носители (вектори), за да се осигури високо ниво на трансфекция, т.е. трансфер на екзогенна (чужда) ДНК или РНК в определени видове клетки. Освен това векторите трябва да гарантират защитата на генетичната информация, т.к При in vivo условия чуждата ДНК е нестабилна поради бързо разграждане от серумни нуклеази, ензими, които разграждат нуклеиновите киселини.
Видове преносители на генетичен материал
В природата съществуват специализирани структури за доставяне на генетична информация до клетките – вируси. Поради това те започнаха да се използват като преносители на гени. В същото време използването на вирусни вектори има редица ограничения. Първо, това е малкият капацитет на трансферирания генетичен материал и присъщата клетъчна специфичност на вирусите. Второ, това е възможността вирусите да се върнат към дивия тип в резултат на рекомбинация по време на преминаването на същия тип инфекция. Трето, протеините на вирусните частици са силно имуногенни, в резултат на което многократното им приложение предизвиква имунен отговор. И накрая, масовото производство на вирусни вектори все още е доста проблематично и скъпо. В момента активно се разработват различни варианти за невирусни носители на базата на катионни липиди и катионни полимери. Тези катионни молекули са в състояние спонтанно да образуват самосглобени нанокомплекси с отрицателно заредена ДНК молекула чрез електростатични взаимодействия. Самосглобените комплекси, състоящи се от катионни липиди и ДНК, се наричат липоплекси; тези, състоящи се от катионни полимери и ДНК, се наричат полиплекси.
Катионни полимери, използвани за създаване на полиплекси
Голям брой катионни полимери или поликатиони са предложени за целите на генната терапия и биотехнологиите. Поликатионите кондензират ДНК в компактни нанокомплекси, осигурявайки стабилност на ДНК и защита от нуклеази. Като ДНК-свързващи полимери могат да служат катионни протеини, синтетични хомополимери на аминокиселини (полилизини, полиаргинини), хитозанов полизахарид, полиетиленимин, дендримери с различни състави и други модифицирани полимери. Степента на уплътняване на ДНК се определя от общия заряд на комплекса, който от своя страна зависи от съотношението на броя на положителните полимерни групи към броя на отрицателните фосфатни групи на ДНК. Обикновено в състава на полиплексите поликатионът присъства в излишък, в резултат на което се образуват наноразмерни комплекси (от няколко десетки до няколкостотин nm), които са разтворими във вода и са положително заредени (фиг. 1, 2 ). В противен случай комплексите ще бъдат нестабилни.
Ориз. 1. Схема на образуване на полиплекси от катионни полимери и кръгова ДНК молекула (плазмид). Ориз. 2. Изображение на полиплекси върху субстрат, получено с помощта на трансмисионна електронна микроскопия (разделение на скалата 200 nm).
Един от първите поликатиони, използвани за доставяне на гени, беше поли-L-лизин (PL, Фиг. 3), който поради своята пептидна природа е биоразградим, което го прави изключително удобен за използване in vivo. Често, за да се елиминират нежеланите ефекти, свързани с висока плътност на повърхностния заряд, се използва съполимер на PL с полиетилен гликол (PEG). В резултат на тази модификация повърхностният заряд на комплекса намалява, което предотвратява неспецифичната адсорбция на отрицателно заредени серумни протеини върху полиплексите и също така намалява цитотоксичността на комплексите.
Полиетилениминът (PEI, фиг. 3) се счита за един от най-обещаващите варианти за поликатиони за създаване на полиплекси на негова основа. PEI се синтезира в две форми: линейна и разклонена. PEI има голям брой амино и имино групи, способни на протониране, в резултат на което проявява буферни свойства при физиологични условия. Полиплексите, базирани на PEI, се характеризират с по-ефективна трансфекция и защита от действието на нуклеази в сравнение с други поликатиони, което е свързано с висока плътност на заряда върху PEI и по-компактно нагъване на ДНК. Силният положителен заряд води до токсичността на PEI, което, заедно с липсата на биологично разграждане на PEI, са ограничаващи фактори за използването на PEI in vivo. За да се намали цитотоксичността, PEI е модифициран с полиетилен гликол, който има ниска токсичност и висока хидрофилност.
Ориз. 3. Катионни полимери, използвани за създаване на полиплекси, и.
Друг представител на поликатиони, използвани при доставянето на генетична информация, са полиамидоамините (PAMAM, фиг. 3). Тези съединения са силно разклонени дендримери. Благодарение на разклоняването, PAMAM имат голяма гъвкавост, те компактират ДНК в по-добра степен, а полиплексите, базирани на тях, са по-стабилни от всички останали. Неговите свойства имат много общо с PEI.
Хитозаните (фиг. 3) са полизахариди, изградени от D-глюкозамин и N-ацетил-D-глюкозамин, свързани с (1>4) гликозидни връзки. В зависимост от молекулното тегло и степента на деацетилиране, хитозаните образуват стабилни комплекси с различни размери с пренесената ДНК. Малки, или обратното, твърде големи хитозанови полимери водят до намаляване на експресията на прехвърления ген. Основното предимство на полиплексите на базата на хитозан е биоразградимостта.
Ефективността на доставяне на полиплексите се влияе от много фактори: молекулно тегло, степен на разклоняване, полимеризация и тип на полимера, размер на частиците, йонна сила на разтвора, повърхностни заряди на комплексите, както и експериментални условия. Оптималният подход трябва да вземе предвид всеки от тези фактори и тяхното влияние върху свойствата на комплекса, поглъщането на комплексите от целевите клетки и токсичността.
Има няколко подхода за осигуряване на специфичността на действието на полиплексите върху целевите клетки. Един от тях включва целенасочена доставка на нанокомплекси до определени типове клетки. Този подход е свързан с добавянето на компоненти (лиганди) към полиплексите, рецепторите за които присъстват в големи количества на повърхността на целевите клетки. Като специфични лиганди се използват различни протеини, захари, пептиди, антитела и др. Друга стратегия е да се използват транспортируеми гени, които биха били активни само в определени клетки, докато доставката на комплексите се извършва неспецифично, тоест до всякакви клетки.
Проникване на полиплекси в прицелните клетки
Процесът на доставяне на генетичен материал включва два етапа: извънклетъчен (път от мястото на инжектиране до целевите клетки) и вътреклетъчен (взаимодействие с целевите клетки, ендоцитоза, излизане от ендозоми, доставка до ядрото). Вътреклетъчните транспортни пътища на полиплексите са представени на фигура 4.
Първата бариера, която полиплексът трябва да преодолее по пътя си към клетката-мишена, е кръвта и извънклетъчната матрица. Ето защо е необходимо да се подберат такива физикохимични параметри на комплекса, за да се повиши неговата стабилност, да се избегнат неспецифични взаимодействия и възможността за имунен отговор. Първо, ДНК в полиплекс трябва да бъде защитена от действието на извънклетъчните нуклеази. Второ, отрицателно заредените кръвни серумни протеини (албумин, фибриноген, имуноглобулини и др.), Както и извънклетъчните матрични протеини (колагени) могат да се адсорбират върху повърхността на заредени нанокомплекси, което води до промяна в повърхностния заряд на полиплексите , което води до увеличаване на размера на комплексите и до тяхното агрегиране. Когато полиплексите се въвеждат в тялото, те частично се натрупват в тъканите и се подлагат на фагоцитоза. Поради тези причини често се използва локално приложение на полиплекси (например в тумор при рак) въз основа на тяхното неспецифично взаимодействие с тъканните клетки.
Ориз. 4. Вътреклетъчни пътища за транспорт на полиплекси.
Полиплексите първо се адсорбират към плазмената мембрана, поемат се от ендоцитоза, след което трябва да напуснат ендолизозомите и да преминат ядрената обвивка, за да влязат в ядрото. Има и алтернативни транспортни маршрути, които не винаги водят до доставка на комплекси до ядрото. В допълнение, експресията на прехвърления ген изисква дисоциация на полиплекса в катионен полимер и свободна ДНК.
Следващият етап от доставянето на генетичен материал до целевите клетки е тяхното взаимодействие с плазмената мембрана и абсорбцията от клетката. Както беше отбелязано по-горе, свързването на полиплексите към клетките в отсъствието на лиганд възниква неспецифично в резултат на електростатично взаимодействие с отрицателно заредената плазмена мембрана. В повечето случаи такива полиплекси се абсорбират чрез неспецифична адсорбционна ендоцитоза. Чрез включване на лиганд в комплекса, усвояването може да се постигне чрез клатрин-зависима рецептор-медиирана ендоцитоза. Други пътища на поемане зависят от типа клетка и включват фагоцитоза и кавеолин-зависима ендоцитоза. Една стратегия за подобряване на клетъчното доставяне на полиплекси включва използването на вирусни входни пептиди, като TAT пептида, първо изолиран от HIV-1 вируса. Използването на тези последователности гарантира, че конструкциите влизат в клетката и доставят полиплексите в клетъчното ядро.
Един от най-важните етапи в транспортния път на полиплексите е тяхното излизане от ендозоми. Както е известно, ендозомите са система от тръби и везикули, която е необходима за сортиране на абсорбираните макромолекули. Сортиращите ендозоми са разположени по-близо до плазмената мембрана. Поради работата на протонните помпи, тяхното pH намалява (около 6,5 в сортиращите ендозоми). По-нататъшният транспорт може да продължи или по пътя на рециклиране с освобождаване на абсорбирани молекули в екстрамембранното пространство, или по протежение на литичния път, когато настъпва допълнително подкисляване на околната среда в късните ендозоми и макромолекулите навлизат в лизозомите. В лизозомите съдържанието се подкислява до pH 5 и абсорбираните молекули се разграждат от хидролитични ензими, които се активират при ниско pH. Продуктите от разграждането се отстраняват от клетката чрез екзоцитоза или се прехвърлят в цитоплазмата, където се използват като строителен материал.
Смята се, че базираните на PEI полиплекси, поради техните свойства, са способни да излизат от ендозоми поради така наречения „ефект на протонна гъба“. Тази хипотеза се основава на факта, че катионните полимери, поради наличието на непротонирани вторични и третични амини, създават буферен ефект, в резултат на което H±ATPase, която изпомпва протони в ендозоми, започва да работи по-активно. В този случай хлорните аниони се натрупват вътре в ендозомите. В резултат на това възниква подуване и лизис поради рязко повишаване на осмотичното налягане, което позволява на полиплексите да навлязат в цитозола непокътнати. Предложен е друг механизъм за излизане от ендозоми за полиплекси, който включва дестабилизиране на ендозомалната мембрана поради високата повърхностна плътност на заряда на нанокомплексите. Комплексите, базирани на PL и хитозан, не предизвикват ефекта на „протонната гъба“ и са по-малко способни да дестабилизират ендозомната мембрана, което води до много по-ниска ефективност на трансфекция.
След като напуснат лизозомите, полиплексите се оказват в перинуклеарното пространство, след което комплексът се дисоциира на свободен поликатион и ДНК. Смята се, че това се дължи на конкуренцията за катионни групи между фосфатните групи на ДНК и съединения с ниско молекулно тегло и аниони на цитоплазмата. В някои случаи дисоциацията на комплекса очевидно се случва в ядрото. Основната бариера пред пътя на плазмидната ДНК в клетъчното ядро е двойната ядрена обвивка. За да доставят макромолекули в ядрото, те включват последователност за ядрена локализация (NLS), която в комбинация с α- и β-импортини ще бъде разпозната от комплекса на ядрените пори (NPC) и активно ще проникне в ядрото. Само малки молекули могат да преминат през NPC чрез пасивна дифузия (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.
Механизми на действие на терапевтичните гени
След като плазмидът влезе в ядрото, започва експресията на терапевтичния ген. За да се придаде специфичност на действието на полиплексите, терапевтичният ген в плазмида се поставя под контрола на промотор (регионът на гена, върху който РНК полимеразата се приземява преди транскрипция), който е активен само в туморни тъкани. Примерите включват промотора на гена за антиапоптотичния протеин сурвивин или гена за ензима теломераза. Генът на вируса на херпес симплекс тимидин киназа (HSVtk), който има способността да фосфорилира антихерпесните съединения ацикловир и ганцикловир, може да се използва като терапевтичен ген. Тези съединения се инжектират в тумора след известно време. След това клетъчните кинази (фосфорилиращи ензими) превръщат фосфорилирания ацикловир или ганцикловир в трифосфати, които могат да бъдат включени в новосинтезираната ДНК по време на удвояването по време на клетъчното делене и да прекратят нейния синтез. В резултат клетките, в чиито ядра е навлязъл генът на тимидин киназата, се разрушават в присъствието на тези вещества. В този случай умират делящите се клетки, а не почиващите, които не синтезират ДНК и не включват ганцикловир или ацикловир. Този механизъм на действие на терапевтичен ген може да се използва за генна терапия на ракови тумори, чиито клетки се делят бързо.
Библиография:
- Горбунова В.Н., Баранов В.С. Въведение в молекулярната диагностика и генната терапия на наследствените заболявания. С.-Пб., “Специална литература”, 1997, стр.287.
- Dunlap D.D., Maggi A., Soria MR, Monaco L. Наноскопична структура на ДНК, кондензирана за доставка на ген. //Nucl. Киселини. Res., 1997, том. 25, 3095–3101.
- Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Текущо състояние на системите за доставка на полимерни гени. // Адв. Лекарство Deliv. Rev., 2006, том. 58, 467–486.
- Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. и Stayton P. S. Проектиране и разработване на полимери за доставка на гени. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, том. 4,581.
- Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. Вътреклетъчно маршрутизиране на плазмидна ДНК по време на невирусен генен трансфер. // Адв. Лекарство Deliv. Rev., 2005, том. 57, 755–767.
- Maxfield F.R. и McGraw T.E. Ендоцитно рециклиране. // Nature Rev. Mol. клетка. биол., 2004, кн. 5, 121–132.
- Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. и Topal M.D. Вмъкване и удължаване на ациклични, дидезокси и ara нуклеотиди от herpesviridae, човешки алфа и човешки бета полимерази. // J. Biol. Chem., 1988, том. 263, 3898–3904.
Дуриманов Михаил, студент от Биологическия факултет на Московския държавен университет
Статията е лауреат на конкурса за популярна наука на конференцията Ломоносов 2009 (Биологически факултет, секции „Нанобиотехнологии“, „Биоинженерство“, „Биофизика“.
Въведение
1 Основни групи генно инженерни ензими
1.1 Рестрикционни ензими
1.1.1 Механизъм на действие на рестрикционните ензими
1.1.2 Изграждане на рестрикционни карти
1.3 Лигази
2 Въвеждане на нов ген в клетка
2.1 Регулиране на генната експресия в прокариотите
2.2 Методи за директно въвеждане на ген в клетка
2.3 Въвеждане на гени в клетки на бозайници
2.4 Генетична трансформация на соматични клетки на бозайници
2.5 Генна терапия
2.6 Производство на трансгенни животни
Заключение
Библиография
Въведение
Генното инженерство е in vitro изграждане на функционално активни генетични структури (рекомбинантна ДНК), или с други думи, създаването на изкуствени генетични програми (Баев А. А.). Според Е. С. Пирузян генното инженерство е система от експериментални техники, които позволяват да се конструират изкуствени генетични структури в лаборатория (in vitro) под формата на така наречените рекомбинантни или хибридни ДНК молекули.
Говорим за насочено, по предварително зададена програма, изграждане на молекулярно-генетични системи извън тялото с последващото им въвеждане в живия организъм. В този случай рекомбинантната ДНК става неразделна част от генетичния апарат на реципиентния организъм и му придава нови уникални генетични, биохимични и след това физиологични свойства.
Целта на приложното генно инженерство е да се проектират такива рекомбинантни ДНК молекули, които, когато бъдат въведени в генетичния апарат, биха придали на тялото свойства, полезни за хората.
Рекомбинантната ДНК технология използва следните методи:
Специфично разцепване на ДНК чрез рестрикционни нуклеази, ускоряващо изолирането и манипулирането на отделните гени;
Бързо секвениране на всички нуклеотиди в пречистен ДНК фрагмент, което дава възможност да се определят границите на гена и кодираната от него аминокиселинна последователност;
Конструиране на рекомбинантна ДНК;
Хибридизация на нуклеинова киселина, която позволява откриването на специфични РНК или ДНК последователности с по-голяма точност и чувствителност, въз основа на тяхната способност да свързват комплементарни последователности на нуклеинова киселина;
ДНК клониране: in vitro амплификация с помощта на полимеразна верижна реакция или въвеждане на ДНК фрагмент в бактериална клетка, която след такава трансформация възпроизвежда този фрагмент в милиони копия;
Въвеждане на рекомбинантна ДНК в клетки или организми.
История на генното инженерство
Генното инженерство се появи благодарение на работата на много изследователи в различни клонове на биохимията и молекулярната генетика. В продължение на много години протеините се смятаха за основния клас макромолекули. Имаше дори предположение, че гените са от протеинова природа. Едва през 1944 г. Ейвъри, Маклауд и Маккарти показват, че ДНК е носител на наследствена информация. От този момент нататък започва интензивно изследване на нуклеиновите киселини. Десетилетие по-късно, през 1953 г., Дж. Уотсън и Ф. Крик създават двуверижен ДНК модел. Тази година се смята за рождена година на молекулярната биология.
В началото на 50-те и 60-те години свойствата на генетичния код са изяснени, а в края на 60-те години неговата универсалност е потвърдена експериментално. Имаше интензивно развитие на молекулярната генетика, обект на която бяха E. coli, нейните вируси и плазмиди. Разработени са методи за изолиране на високопречистени препарати от непокътнати ДНК молекули, плазмиди и вируси. ДНК на вируси и плазмиди се въвежда в клетките в биологично активна форма, осигурявайки нейната репликация и експресия на съответните гени. През 70-те години бяха открити редица ензими, които катализират реакциите на преобразуване на ДНК. Специална роля в развитието на методите на генното инженерство принадлежи на рестрикционните ензими и ДНК лигазите.
Историята на развитието на генното инженерство може да бъде разделена на три етапа. Първият етап е свързан с доказване на принципната възможност за получаване на рекомбинантни ДНК молекули in vitro. Тези работи се отнасят до производството на хибриди между различни плазмиди. Доказана е възможността за създаване на рекомбинантни молекули с помощта на първоначални ДНК молекули от различни видове и щамове бактерии, тяхната жизнеспособност, стабилност и функциониране.
Вторият етап е свързан с началото на работата по получаване на рекомбинантни ДНК молекули между хромозомните гени на прокариотите и различни плазмиди, доказващи тяхната стабилност и жизнеспособност.
Третият етап е началото на работата по включването на еукариотни гени, предимно животни, във векторни ДНК молекули (ДНК, използвана за генен трансфер и способна да бъде интегрирана в генетичния апарат на реципиентната клетка).
Формално рождената дата на генното инженерство трябва да се счита за 1972 г., когато в Станфордския университет P. Berg, S. Cohen, H. Boyer и сътрудници създадоха първата рекомбинантна ДНК, съдържаща ДНК фрагменти от вируса SV40, бактериофага и E. coli .
1 Основни групи генно инженерни ензими
Генното инженерство е наследник на молекулярната генетика, но дължи раждането си на успехите на генетичната ензимология и химията на нуклеиновите киселини, тъй като ензимите са инструментите за молекулярна манипулация. Докато понякога можем да работим с клетки и клетъчни органели, използвайки микроманипулатори, дори и най-малките микрохирургични инструменти няма да помогнат, когато работим с ДНК и РНК макромолекули. Какво да правя? Ензимите действат като „скалпел”, „ножица” и „конец за зашиване”.
Само те могат да намерят определени нуклеотидни последователности, да „изрежат“ там молекула или, обратно, да „закърпят“ дупка в ДНК верига. Тези ензими работят в клетките от дълго време, извършвайки работа по репликация на ДНК (удвояване) по време на клетъчното делене, възстановяване на повреди (възстановяване на целостта на молекулата), в процесите на четене и прехвърляне на генетична информация от клетка в клетка или вътре клетката. Задачата на генния инженер е да избере ензим, който да изпълнява възложените задачи, тоест да може да работи с определена част от нуклеиновата киселина.
Трябва да се отбележи, че ензимите, използвани в генното инженерство, нямат видова специфичност, така че експериментаторът може да комбинира ДНК фрагменти от произволен произход в последователност по свой избор в едно цяло. Това позволява на генното инженерство да преодолее видовите бариери, установени от природата, и да извърши междувидово кръстосване.
Ензимите, използвани при изграждането на рекомбинантна ДНК, могат да бъдат разделени на няколко групи:
Ензими, които произвеждат ДНК фрагменти (рестриктази);
Ензими, които синтезират ДНК върху ДНК матрица (полимерази) или РНК (обратни транскриптази);
Ензими, които свързват ДНК фрагменти (лигази);
Ензими, които позволяват промени в структурата на краищата на ДНК фрагменти.
1.1 Рестрикционни ензими
Общоприето е, че термините "рестриктазен ензим", "рестриктазна ендонуклеаза" и "сайт-специфична ендодеоксирибонуклеаза" са синоними.
Всички бактериални рестрикционни ендонуклеази разпознават специфични, доста къси ДНК последователности и се свързват с тях. Този процес е придружен от разрязване на ДНК молекулата или на самото място на разпознаване, или на друго място, което се определя от вида на ензима. Наред с рестрикционната активност, бактериалният щам има способността да метилира ДНК; Този процес се характеризира със същата специфичност на ДНК последователността като рестрикцията. Метилазата добавя метилови групи към аденинови или цитозинови остатъци на същото място, където се свързва рестрикционният ензим. В резултат на метилирането мястото става устойчиво на рестрикция. Следователно метилирането предпазва ДНК от разрязване.
Има 3 основни класа рестрикционни ензими: 1, 2 и 3.
Всички рестрикционни ензими разпознават строго определени последователности върху двойноверижна ДНК, но рестрикционните ензими от клас 1 правят прекъсвания в произволни точки в молекулата на ДНК, а рестрикционните ензими от клас 2 и 3 разпознават и разцепват ДНК в строго определени точки в рамките на местата за разпознаване или на място на фиксирано разстояние от тях.
Ензимите от тип 1 и 3 имат сложна структура на субединици и имат два вида активност - модифицираща (метилираща) и АТФ-зависима ендонуклеаза.
Ензимите от клас 2 се състоят от 2 отделни протеина: рестрикционна ендонуклеаза и модифицираща метилаза; следователно само ензими от клас 2 се използват в генното инженерство. Те изискват магнезиеви йони като кофактори.
Понастоящем са изолирани повече от 500 рестрикционни ензими от клас 2, но сред ензимите, изолирани от различни микроорганизми, има такива, които разпознават същите последователности в ДНК. Такива двойки или групи се наричат изошизомери. Прави се разлика между истинската изошизомерия, когато ензимите разпознават една и съща нуклеотидна последователност и разрушават ДНК в едни и същи точки, и фалшивата, когато ензимите, разпознавайки едно и също място в ДНК, произвеждат разкъсвания в различни точки в рамките на едно и също място.
Повечето рестрикционни ензими от клас 2 разпознават последователности, съдържащи от 4 до 6 нуклеотидни двойки, следователно рестрикционните ензими се разделят на малки и големи. Рестрикционните ензими с малък разрез разпознават тетрануклеотиди и въвеждат много повече прекъсвания в молекулите от рестрикционните ензими с голям разрез, които разпознават последователност от шест нуклеотидни двойки. Това се дължи на факта, че вероятността за поява на определена последователност от четири нуклеотида е много по-висока от тази на последователност от шест нуклеотида. Например, в ДНК на бактериофаг Т7, състояща се от 40 000 базови двойки, липсва последователност, разпозната от рестрикционния ензим R1 от Е. coli.
Рестрикционните ензими Hpa II и Alu (от Arthrobacter luteus) са дребноразделящи се, а Eco R I (от Escherichia coli) и Hind III са едроразделящи. Ако приемем, че местата за разпознаване на рестрикционни ензими са произволно разпределени по веригата на ДНК, тогава целта за ензими, разпознаващи последователност (място) от четири нуклеотида, трябва да се появи средно веднъж на всеки 256 базови двойки, а за ензими, разпознаващи шест нуклеотида - на всеки 4096 бази двойки. Ако рестрикционното място е вътре в гена, тогава лечението с ДНК рестрикционен ензим ще доведе до неговото инактивиране. Вероятността от такова събитие е много висока, когато се третират с рестрикционни ензими с малък разрез и незначителна, когато се използват ендонуклеази с голям разрез. Следователно, за да се получи непокътнат ген, разцепването се извършва последователно с няколко рестрикционни ензима с голям разрез или се използва техниката на "недостатъчно ограничаване", т.е. ограничението се извършва при условия, при които разцепването се случва само на едно място.
8860 0
Понастоящем са известни около 40 различни метода за доставяне на рекомбинантна ДНК в клетките, които решават проблема с преминаването през плазмената мембрана по различни начини. Все още няма унифицирана класификация на методите за доставяне на рекомбинантна ДНК в клетките. Всеки автор на рецензия класифицира по свой начин, може би защото за много емпирично открити методи механизмът за преодоляване на мембраната все още не е ясен, например за трансформация. Съществува и несигурност по отношение на терминологията, което не е изненадващо в една бързо развиваща се нова област на науката и практиката.
Всеки метод за доставяне на чужда ДНК в клетките има свои собствени характеристики, предимства и недостатъци по отношение на клетъчното оцеляване, ефективността на администриране, гъвкавостта и възможностите за техническо изпълнение. Изборът на метод зависи от вида на клетките гостоприемници и вида на използвания вектор, както и от личните предпочитания и възможности на експериментатора. Някои от най-известните методи за доставяне на ДНК до целевите клетки са обсъдени подробно по-долу.
Трансформацията в нейния най-общ смисъл е процесът на въвеждане на свободна ДНК в клетка. В по-тесен смисъл терминът се прилага главно за бактерии, като се обозначава процесът на поглъщане на рекомбинантна ДНК от компетентни клетки, предизвикан от температурен фазов преход на клетъчната мембрана. Е. coli е най-често срещаният организъм при работа с рекомбинантна ДНК и за да се осигури въвеждането на плазмидна ДНК в клетките, клетките се инкубират с ледено студен разтвор на CaCl2 и ДНК и след това се подлагат на топлинен шок при 42°C за ~1 минута .
Очевидно в резултат на такова лечение настъпва локално разрушаване на клетъчната стена. Ефективност на трансформация, която се определя като брой трансформанти на 1 μg добавена ДНК,
в този случай е приблизително 10 000 - 10 000 000. Ефективността на този метод е ниска, приблизително по-малко от 0,1% от клетките се трансформират, но този недостатък се компенсира чрез използването на схеми за селекция, които позволяват бързо идентифициране на желаните клонове.
Клетките, които могат да абсорбират чужда ДНК, се наричат компетентни. Делът на тези клетки в популацията обикновено е много малък, но може да бъде увеличен с помощта на специална хранителна среда, условия на култивиране и химически индуктори на компетентност (избрани, като правило, емпирично). Често използван етап в подготовката на компетентни клетки е производството на сферопласти - клетки частично или напълно (протопласти) без външна твърда клетъчна стена.
Например, това е единственият начин за ефективна трансформация на много грам-положителни бактерии от родовете Bacillus, Listeria, Streptomyces и др. Някои методи за трансформация на дрожди също включват етапите на ензимно отстраняване на клетъчната стена на дрождите с помощта на глюкозидази. За организми, които са устойчиви на химически индуктори на компетентност или им липсва естествена компетентност, се използват други системи за доставяне на ДНК.
Конюгация. Има бактериални плазмиди (конюгативни плазмиди), които имат способността да създават междуклетъчни контакти, чрез които преминават от една клетка в друга. Образуването на контакти между донорните и реципиентните клетки се осигурява от конюгативните свойства на плазмидите, а самият трансфер на ДНК се осигурява от мобилизационните свойства. В този случай конюгативният плазмид може да носи със себе си нормален плазмиден вектор, разположен в същата клетка.
По този начин е възможно да се трансформират реципиентни клетки, които трудно се трансформират по друг начин. Например, показан е мобилизационен трансфер на совалковия вектор pAT187 с широк кръг гостоприемници от Е. coli в различни грам-положителни бактерии (род Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), макар и с много по-ниска ефективност, отколкото при трансфер между различни щамове на E. coli.
Освен това наскоро беше демонстрирана възможността за конюгативен трансфер на ДНК от бактериални клетки към култивирани животински клетки. По време на процеса на конюгация се прехвърля само една верига от донорния плазмид, върху която след това се синтезира втората верига. Това води до това, че конюгативно пренесеният плазмид не се атакува от рестрикционните ензими на гостоприемника. Ефективността на този метод за бактериите е сравнима с трансформацията.
Вирусна инфекция. За въвеждане на вектори, базирани на вируси, широко се използва естественият инфекциозен път на инфекция на клетката гостоприемник, който зависи от вида на вируса.
Методи за перфорация. Един от популярните методи за въвеждане на нуклеинови киселини в прицелните клетки е електропорацията - временно създаване на пори в двуслойна липидна мембрана под краткотрайно въздействие на електрическо поле. Това е универсален физически метод за трансформация, чиято техника е разработена за почти всички видове клетки.
При работа с Е. coli приготвената клетъчна суспензия (~50 μl) и ДНК се поставят между електродите и се подава единичен токов импулс с продължителност ~4,5 ms при напрежение 1,8 kV, разстоянието между електродите е 1 mm. След такова третиране ефективността на трансформация нараства до 109-1011 за малки плазмиди (~3-6 kb) и до 106 за големи (~135 kb). Подобни условия се използват за въвеждане на BAC вектора в Е. coli.
Електропориращият ефект на разряд с високо напрежение върху двуслойна липидна мембрана изглежда зависи от нейния радиус на кривина. Следователно малките бактериални клетки ефективно абсорбират ДНК при много по-висока напрегнатост на полето (12-18 kV/cm), отколкото големите животински и растителни клетки, които ефективно абсорбират ДНК при напрегнатост на полето от 1-2 kV/cm. Електропорацията е най-простият, ефективен и възпроизводим метод за въвеждане на ДНК молекули в клетките, който обаче изисква специално електропораторно устройство.
Други перфорационни методи за доставяне на ДНК в клетките: ултразвук на клетки, изстъргване на клетки от субстрата в присъствието на екзогенен материал, центрофугиране на клетки в среда с ДНК в комбинация с електропорация, осмотична перфорация на плазмената мембрана, разрушаване на клетки с лазер микролъч, използване на порообразуващия токсин стрептолизин-О.
Трансфекция. Първоначално този термин означаваше въвеждането на вирусна ДНК в клетките, сега значението му се разшири до въвеждането на всякаква чужда ДНК в еукариотните клетки. Терминът „трансформация“, който се отнася до процеса на въвеждане на ДНК в клетка за прокариоти и дрожди, се оказа неудобен за използване, тъй като по отношение на животинските клетки трансформацията е превръщането на нормалните клетки в ракови. В тесен смисъл трансфекцията се отнася главно до въвеждането на ДНК в еукариотни клетки с помощта на различни химически реагенти.
Един от първите разработени методи за ефективна трансфекция е инкубиране на ДНК с DEAE-декстран. Получената ефективност е сравнима с бактериалната трансформация и достига 106 трансфектанти на μg ДНК.
Механизмът на действие на DEAE-декстран не е напълно установен, но е известно, че той се свързва с ДНК и клетъчната мембрана, стимулирайки пиноцитозата (фиг. 2.8), въпреки че не се поема от клетките. Недостатъците на метода включват токсичността на DEAE-декстран за някои видове клетки, зависимостта на ефективността от качеството на лекарството и много ниската честота на получаване на стабилни трансфектанти.
Ориз. 2.8. Схема за въвеждане на ДНК като част от различни комплекси в клетката чрез ендоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематично представяне на частица от нелипиден поликатион в дендроформа със свързана ДНК, чийто отрицателен заряд е компенсиран от катионен полимер (b)
Ефективността на трансфекцията се повишава 10-100 пъти чрез инкубиране на клетки с утаена от калциев фосфат ДНК. Плътните частици от калциевата ДНК утайка се абсорбират от клетката чрез фагоцитоза (фиг. 2.8), но само малка част от проникналите молекули достигат до ядрото и се интегрират в хромозомната ДНК. Методът с калциев фосфат е по-ефективен и по-евтин, но причинява разкъсване на ДНК молекулите, което превръща кръговите молекули в линейна форма, понякога неинфекциозна в случай на вирусна трансфекция. В допълнение, условията за трансфекция с калциев фосфат трябва да бъдат избрани индивидуално за всяка целева клетка.
По време на търсенето на други реагенти за трансфекция беше открито, че полимерните молекули, носещи излишен катионен заряд, могат значително да повишат ефективността на трансфекцията. Полимерните катиони образуват стабилни комплекси с неутрализирани заряди с нуклеинови киселини, които могат да транспортират ДНК и РНК в клетката с висока ефективност, предпазвайки ги от действието на ендонуклеазите по пътя към ядрото (фиг. 2.9).
Ориз. 2. 9. Схема на ДНК транспорт в клетъчното ядро като част от поликатион-ДНК комплекс, свързан със специфичен лиганд чрез лиганд-медиирана ендоцитоза
Синтетичните нелипидни полимерни катиони в линейни или разклонени конформации (дендритна форма) могат да кондензират ДНК и РНК в относително малки частици, които след това се свързват с клетъчната мембрана и навлизат в клетката чрез неспецифична ендоцитоза. Понастоящем за трансфекция от групата на нелипидните поликатиони се използват главно полиетиленимин, полиамидоамини и дендримери на тяхна основа, катионни протеини като полилизин, протамин и хистони, както и различни търговски продукти, като PAMAM.
Революцията беше въвеждането в практиката на първия нискотоксичен катионен липид DOTMA (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезиран от Feigner (1987) и др. Ефективността на трансфекция при използване на катионен липид (фиг. 2.10) е приблизително 100 пъти по-голяма от всеки друг химичен реагент, с висок дял на стабилни трансгенни клетки.
Ориз. 2. 10. Структура на комплекса с ДНК (а) и общата структура на катионния липиден полимер (б). Катионните липидни полимери (линейни и разклонени), подобни по структура и свойства на фосфолипидите на клетъчната мембрана, образуват комплекси с ДНК под формата на многослойни катионни липозоми (а) чрез просто смесване на реагентите. Такива комплекси влизат в клетката чрез ендоцитоза или сливане с клетъчната мембрана през липидната част
В същото време в практиката беше въведен нов термин „липофекция“, който подчертава високата ефективност на генетичната трансформация на клетките, доближавайки липид-катионните комплекси до инфекциозните вирусни частици.
Въз основа на този успех бяха разработени множество вариации на тези съединения (липофектин, липофектамин, селфектин и др.).
Успоредно с това бяха разработени носители за доставяне на базата на фосфолипидни липозоми, пълни с ДНК или РНК.
Малки сфери от изкуствени мембрани могат да се слеят с плазмените мембрани на клетките или да бъдат поети от ендоцитоза, освобождавайки съдържанието в клетката. Ниската ефективност на липозомната трансфекция се повишава чрез въвеждането на фосфолипиди в структурата на липозомите, например кардиолипин и фосфатидилетаноламин, които заедно с двуслойните мембрани също образуват обърнати мицеларни структури, известни като кубични и хексагонални фази, способни да инициират мембрана синтез.
Липозомният метод е доста капризен и изисква внимателен подбор на всички условия за ефективна трансфекция на специфични клетки. В допълнение, процедурата на капсулиране, обикновено ултразвук, често уврежда големи ДНК молекули.
Нов етап в развитието на трансфекционните реагенти беше разработването на по-ефективно и целенасочено доставяне на нуклеинови киселини до специфични целеви клетки чрез въвеждане на различни лиганди в структурата на синтетични трансфекционни реагенти и липозоми за свързване към мембранни рецепторни протеини. Наличието на такива целеви групи (лиганди), разпознати от клетъчните рецептори, позволява използването на лиганд-медиирани механизми на ендоцитоза (виж Фиг. 2.9).
Като такива лиганди се използват протеини и пептиди, разпознати от рецепторите; олигозахариди, тъй като на повърхността на много животински клетки има лектини - рецепторни протеини, които ги свързват специфично; полизахариди. Процесите на взаимодействие с клетките на такива насочени ДНК (РНК)-трансфекционни реагентни комплекси са подобни на проникването на вирусни частици в клетката.
В момента биотехнологичните компании предлагат широка гама от различни реагенти за трансфекция - от най-простите и евтини до най-новите разработки, специализирани за различни видове клетки и задачи. Създаването на нови, още по-ефективни трансфекционни реагенти също продължава интензивно.
Микроинжектиране – клетъчната мембрана се пробива с микроигла и разтвор, съдържащ ДНК се инжектира в цитоплазмата на клетката или директно в ядрото, ако ядрото е достатъчно голямо (например ядрото на яйцеклетка). Микроинжектирането на ДНК в клетки на бозайници стана възможно с появата на устройство за производство на микропипети с диаметър 0,1-0,5 μm и микроманипулатор. Методът е много ефективен, делът на клетките със стабилна интеграция и експресия на инжектирани гени може да достигне 50%. Предимството на описания метод е също така, че ви позволява да въведете всякаква ДНК във всякакви клетки и не е необходим селективен натиск за поддържане на въведения ген в клетките.
Балистичната трансфекция, биобалистика или биолистика (бомбардиране с микрочастици), се основава на бомбардиране на клетки с микросфери с размер около 1-2 микрона, покрити с ДНК. Използват се микрочастици злато, волфрам (понякога фитотоксични), силикон и различни синтетични наносфери. Микрочастиците, покрити с ДНК, преминават през клетъчните слоеве и пренасят генетичния конструкт директно в органелите и клетъчните ядра. Създаденият за тази цел „генен пистолет“ или „генен пистолет“, разработен от Дж. Санфорд през 1987 г. за въвеждане на ДНК в зърнени култури, е подобен по дизайн на въздушните пистолети (фиг. 2.11).
Ориз. 2.11. Въвеждане на рекомбинантна ДНК в листата на растенията с помощта на „генен пистолет“ за многократна употреба от Bio-Rad (a) и неговата обща схема (b). Хелиев импулс изхвърля микрочастици, покрити с ДНК или РНК от капсулата с пробата. Микрочастиците, носещи ДНК, се ускоряват и фокусират за максимално проникване в клетките, движейки се по ускорителния канал и по цевта на пистолета, докато при широкия изход хелиевият поток дифузно се отклонява настрани. Разделителният филтър поддържа оптималното разстояние за захващане на целта, като същевременно увеличава максимално отстраняването на хелий, за да минимизира вредните ефекти върху клетъчните повърхности
Дълбочината на проникване на микрочастиците като правило е малка - до 1 mm, но при специални условия на изпичане микрочастиците могат да проникнат в тъканите на дълбочина 4-5 mm и да прехвърлят гени, например, във влакната на набраздените мускули . Балистичната трансфекция е много ефективна дори когато дебелите клетъчни стени (дрожди, растения) са пречка за много други методи за доставяне и се използва включително тъкани, органи и дори цели организми. В момента се използва широко в генната терапия за производство на трансгенни животни и растения.
Това разнообразие от инструменти и методи за трансфекция се дължи на различни задачи, широк спектър от използвани целеви клетки и видове нуклеинови киселини, доставени на клетките, както и нуждите на обществото да получи все по-ефективни средства за доставяне на генетична информация до клетки, тъкани и цели организми. Особено внимание се обръща на разработването на реагенти и методи за трансфекция във връзка с невероятните перспективи на човешката генна терапия, която изисква целеви, високоефективни и безопасни средства за доставяне на гени.
Стабилно и преходно въвеждане на чужда ДНК в клетката. След въвеждането на рекомбинантна ДНК в еукариотна клетка, само малка част от нея попада в ядрото, тъй като ядрената мембрана е трудна бариера за чужда ДНК. В ядрото рекомбинантната ДНК може да бъде интегрирана в хромозомата или да съществува известно време в извънхромозомно състояние.
Съответно се прави разлика между стабилна трансфекция, когато рекомбинантна ДНК се интегрира в хромозомите на реципиентните клетки и става тяхна неразделна част, както и временна или преходна трансфекция, при която съществуват рекомбинантни ДНК молекули и се транскрибират в ядрата в екстрахромозомно състояние за кратко време. Стабилното наследяване на въведена чужда ДНК е основното условие за получаване на трансгенни организми за икономически цели.
Поради това се обръща специално внимание на разработването на методи за въвеждане на ДНК в клетки, водещи до производството на по-голяма част от стабилни трансформанти. В допълнение, голям процент стабилни трансформанти също прави възможно изоставянето на селективни и маркерни гени, които са баласт при създаването на трансгенни организми.
НА. Войнов, Т.Г. Волова
Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите, по-специално до метод за целево доставяне на ДНК в туморни и стволови клетки, експресиращи CXCR4 рецептора. Представеното изобретение може да се използва за целенасочено доставяне на генетични конструкции в стволови и злокачествени туморни клетки с цел коригиране на генни дефекти и предотвратяване на заболявания. Методът включва приготвяне на носители на генетични конструкции чрез включване в състава на молекулите носители, представляващи ДНК-свързваща последователност от осем лизинови аминокиселинни остатъка - KKKKKKKK, сигнални последователности. Свързването на сигналната последователност към ДНК-свързващата последователност се осъществява с помощта на линкерна област от две молекули на ε-аминохексанова киселина. След това се образуват комплекси ДНК/носител. След това се извършва ин витро трансфекция. Предложеното изобретение дава възможност да се повиши ефективността на доставяне на гена, който представлява интерес, към туморни и стволови клетки. 2 заплата f-ly, 4 ил.
Изобретението се отнася до генната медицина, генната терапия, биотехнологиите и фармацевтиката и може да се използва за целенасочено доставяне на генетични конструкции в стволови и злокачествени туморни клетки с цел коригиране на генни дефекти и предотвратяване на заболявания. Тъканната специфичност на доставянето на генни конструкции се осигурява чрез използването на сигнални последователности за CXCR4 рецептора, който се експресира в клетки от този тип.
Това, което отличава генната терапия от подходите на традиционната медицина, е нейният фокус върху борбата с причината за заболяването, а не със симптомите и последствията. В момента се разработват подходи за генна терапия за лечение или предотвратяване на широк спектър от човешки заболявания. Тези подходи могат да бъдат приложими за in vivo и ex vivo терапия. In vivo терапията се основава на директното въвеждане на генетични конструкции директно в телесните тъкани. Доставката може да бъде интравенозна с помощта на аерозолни пулверизатори или инжекции в специфични тъкани. Генната терапия ex vivo се основава на изолирането на специфичен тип клетки от тялото, въвеждането в тях на „терапевтичен“ генен конструкт, подбор на трансфектирани клетки и последваща реимплантация в пациента.
Има три основни направления в подходите за доставка на генетични конструкции, които се разработват в момента:
1) клониране като част от вирусни вектори;
2) използването на методи за физическа трансфекция;
3) използването на комплекси от плазмидни експресионни вектори и невирусни молекули-носители.
Вирус-медиираният трансфер е високоефективен метод за доставяне на ДНК до целевите клетки, тъй като проникването на модифицирания вирусен вектор е подобно на процеса, който се случва естествено, когато вирусният геном се прехвърли в клетките гостоприемници. Най-изследвани са векторите, създадени на базата на ретро-, адено- и адено-асоциирани вируси. Предимствата на вирусите включват, на първо място, комбинацията от свойствата на експресионен вектор и носител, възможността за специфично доставяне, способността за трансфектиране на делящи се и неделящи се клетки и способността за интегриране на ДНК в хромозомата за осигуряват дългосрочно изразяване. Поради тези предимства този подход все още се използва широко в изследванията за доставка на гени, въпреки че има някои недостатъци. Ретро- и адено-асоциираните вируси имат ограничен размер на клонирания ДНК фрагмент и риск от инсерционна мутагенеза, когато вирусът е интегриран в генома на гостоприемника. Сериозен недостатък на аденовирусните вектори е изразеният имунен отговор при високи дози и многократно приложение на аденовирусни конструкции (Walther W., Stein U. Viral vectors for gen transfer: a review of their use in the treation of human disease // Drugs. - 2000. - v.60 - P.249-271, RF патент № 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, публикуван 2005.05.20).
Инжектирането на голи плазмидни ДНК конструкции беше един от първите подходи в разработването на стратегии за лечение с генна терапия. Ниската ефективност на трансфекцията с използване на гола ДНК е подтикнала разработването на нови методи за доставяне на генетични конструкции. Изследвани са различни физически методи за доставяне на ДНК в клетките на тялото. Най-популярните сред тях са методът на балистична трансфекция и електропорацията, които се използват широко за трансфектиране на кожни и мускулни клетки. Методът на балистична трансфекция се основава на проникването в клетката на ДНК, отложена върху златни или волфрамови микрочастици. Трансфекцията се извършва под налягането на поток от сгъстен газ или течност. Методът на електропорация се основава на локална промяна в електрическия потенциал на клетъчната мембрана поради излагане на електрически ток. Електрическите импулси водят до образуването на пори в клетъчната мембрана, като по този начин я правят пропусклива за биомолекулите. За преодоляване на ниската ефективност на голата ДНК трансфекция in vivo се използва и методът на хидродинамичния шок - венозно или интраартериално приложение на плазмиден вектор в голям обем разтвор. Основните недостатъци на съществуващите методи за физическа трансфекция са ниската ефективност и локалността на ефекта от доставката на ДНК. Те позволяват на плазмида да преодолее клетъчната мембрана и да избегне включването в ендозомите, като по този начин предотвратява ензимното разграждане, но като правило не осигуряват дълготрайна устойчивост на въведените генетични конструкции (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other физични методи // Gene Ther.- 2004. - v.11, No. - 2004. - т. 245. - С. 185-196; Herweijer H., Wolff J. A. Напредък и перспективи: трансфер и терапия на гол ДНК ген // Генна терапия. - 2003. - т. 10, № 6. - С. .453-458).
Невирусните носители са алтернатива на вирусно-медиирания трансфер на генетични конструкции в клетки на бозайници. Невирусните носители се синтезират лесно и лекотата на тяхната модификация позволява да се направят промени в структурата и състава на молекулите, като по този начин се подобряват средствата за доставяне. Когато се използват невирусни носители, няма ограничения за размера на доставения експресионен вектор. В допълнение, те са по-малко токсични, в повечето случаи не предизвикват специфичен имунен отговор и са по-безопасни за използване in vivo в сравнение с вирусните вектори. Следователно въвеждането на генетичен конструкт, опакован в невирусни носители, може да се повтори. Изследването на невирусни носители се развива в посока на подобряване на трансфектиращите свойства на плазмидната ДНК чрез образуване на ДНК комплекси с различни синтетични съединения (липиди, олиго- и полипептиди, полимери и др.) (например RF патент № 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, публикувано 2008.10.20). Подобряването на невирусните носители до голяма степен зависи от подробното разбиране на бариерите пред проникването на ДНК в клетките на тялото (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an актуализация // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Вектори и системи за доставяне в генната терапия // Med Sci Monit. - 2005. - v. 11, No. 4. - P. 110-121; Wiethoff C.M., Middaugh CR. Бариери пред доставката на невирусен ген // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, No 2. - С.203-217).
Смята се, че невирусният носител трябва да има следните характеристики:
1) да бъде нетоксичен, компактен и да предпазва плазмидната ДНК от ензимно разграждане и да се екскретира от тялото след употреба;
2) осигуряване на проникването на плазмида в клетката чрез специфично свързване към плазмената мембрана на клетката:
3) имат способността да освобождават ДНК от ендозомния компартмент;
осигуряват дисоциация на ДНК от комплекса за последващ транспорт на плазмида в ядрото.
За целите на генната терапия най-предпочитаният метод за доставяне на генетични конструкции е техният тъканно-специфичен трансфер в клетките и тъканите на тялото.
Първата бариера за вътреклетъчното проникване на комплексите е плазмената мембрана. Повечето комплекси взаимодействат с клетъчната повърхност чрез електростатични сили. Възможен механизъм за свързване на комплексите с клетката е взаимодействието им с протеини на клетъчната повърхност – гликозаминогликани. Въпреки това, с този механизъм на проникване на комплекси, няма тъканно-специфичен трансфер на генни конструкции. В същото време проблемът за тъканно-специфичното доставяне на генетични конструкции е актуален за генната терапия на редица заболявания. За специфично взаимодействие с клетъчната повърхност, комплексите включват лиганди за рецептори на клетъчната повърхност. Сега са характеризирани редица интегринови пептидни лиганди. Те включват по-специално трипептидния фрагмент RGD (интегрините присъстват на повърхността на много клетки), трансферин (рецепторът му има повишена експресия в пролифериращи клетки), асиалорозомукоид (асиалогликопротеиновият рецептор има специфична експресия в чернодробните хепатоцити).
За специфично доставяне на генетичен материал до нервните клетки, Зенг и колеги предложиха да се използва носител, състоящ се от сигнална област за TrkA рецептора (80-108 аминокиселини от нервния растежен фактор) и ДНК-свързваща последователност от 10 лизинови аминокиселинни остатъка. Този носител, в присъствието на ендозомолитичния агент хлорохин, който насърчава освобождаването на комплекси от ендозомалното отделение на клетката, е в състояние да достави тъканно-специфично маркерния ген само до клетки с експресия на TrkA рецептора. Този носител може да се използва за лечение на генна терапия на различни неврологични заболявания, като епилепсия, болести на Паркинсон и Алцхаймер. Той обаче не е подходящ за доставяне на генетичен материал до други видове клетки (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S. Синтетичен пептид, съдържащ бримка 4 от нервен растежен фактор за насочена генна доставка // J Gene Med 2004; 6: 1247 -1256).
Човешките стволови клетки се считат за обещаващи средства за клетъчна и генна терапия на различни човешки заболявания. В същото време те са едни от най-трудните типове клетки за трансфектиране. При лечението на рак с генна терапия е необходимо да се осигури доставянето на гени директно до туморните клетки.
CXCR4 е рецептор за фактора на миграция на стволови клетки хемокин SDF-1α. CXCR4 се експресира в хемопоетични клетки, съдов ендотел и мускулни сателитни клетки. Високо ниво на експресия на този ген е отбелязано в повече от 20 вида ракови тумори (рак на гърдата, рак на простатата и др.), както и в мигриращи стволови клетки. Рецепторът CXCR4 също е способен да се свързва с вирусния хемокин vMIP-II (вирус на саркома на Капоши). По този начин, включването на сигнални последователности в молекулите на носителя за свързване към CXCR4 рецептора е обещаващ начин за създаване на системи за насочена доставка на ген към туморни и стволови клетки.
За да доставят генетичен материал в клетки, експресиращи рецептора CXCR4, Le Bon и колегите му използваха синтетичен лиганд за този рецептор - AMD3100, който беше комбиниран с полиетиленимин или катионни липиди. Комплексите от генетичен материал с тези съединения не водят до значително повишаване на ефективността на доставяне на маркерен ген в CXCR4+ клетки в сравнение със съединения без сигнали. Носителите, използвани от Le Bon, не са ефективни, тъй като специфичното доставяне с тяхна помощ е възможно само с добавяне на вещество, което насърчава интернализацията на рецептора CXCR4 (форболов естер) към средата за трансфекция. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 конюгати като компоненти на насочени невирусни системи за доставяне на гени: Синтез и in vitro трансфекция Ефикасност на CXCR4-експресиращи клетки // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).
По този начин има нужда да се създаде носител на генетични конструкции, който може да осигури специфична доставка до CXCR4(+) клетки и да не засяга близките тъкани. Такъв метод е осигурен от настоящото изобретение.
Изобретението се основава на задачата да се разработи метод за специфично доставяне на генетични конструкции в клетки, експресиращи CXCR4 рецептора, при който чрез използването на носители на генетични конструкции, съдържащи сигнални последователности за CXCR4 рецептора, се повишава ефективността на постига се доставяне на интересуващия ни ген. Важно е да се отбележи, че синтезата на претендираните носители може да бъде извършена с помощта на всеки от известните методи за твърдофазов пептиден синтез.
Решението на посочения технически проблем се осигурява от факта, че в метода за целенасочено доставяне на ДНК в туморни и стволови клетки, експресиращи рецептора CXCR4, включващ подготовката на носители на генетични конструкции чрез включване в състава на молекулите на носителя, които е ДНК-свързваща последователност от осем лизинови аминокиселинни остатъка - KKKKKKKK, сигнални последователности, образуване на комплекси ДНК/носител, трансфекция in vitro, сигналната последователност е избрана от групата: фрагмент от 1 до 8 аминокиселини на N-терминала последователност на протеина SDF-1α - KPVSLSYR; фрагмент от 1 до 17 аминокиселини от N-терминалната последователност на SDF-1α протеина - KPVSLSYRCPCRFFESH, където аминокиселини 9 и 11 са заменени със серин; или фрагмент от 1 до 10 аминокиселини от N-терминалната последователност на вирусния хемокин vMIP-II - LGASWHRPDK; Свързването на сигналната последователност към ДНК-свързващата последователност се осъществява с помощта на линкерна област от две молекули на ε-аминохексанова киселина.
В този случай сигналната последователност може да бъде фрагмент от аминокиселини 1 до 8 от N-терминалната последователност на протеина SDF-1α-KPVSLSYR.
Или сигналната последователност може да бъде фрагмент от аминокиселини 1 до 17 от N-терминалната последователност на протеина SDF-1α - KPVLSSYRCPCRFFESH, където аминокиселини 9 и 11 са заменени със серин.
Фрагмент от аминокиселини 1 до 10 от N-терминалната последователност на вирусния хемокин vMIP-II - LGASWHRPDK, синтезиран от D-аминокиселини, може също да се използва като сигнална област.
Глицеролът или хлорохинът могат да се използват като компонент, който осигурява изхода на комплекси, състоящи се от носители и генетичен материал от ендозоми.
Плазмидната ДНК може да се използва като генетичен материал за носители.
Посоченият технически резултат в настоящото изобретение се постига чрез използването на олиголизинови молекули - KKKKKKKK (K8) като носител, конюгирани със сигнални последователности към CXCR4 рецептора от протеините SDF-1 или vMIP-II, а именно N-терминалната последователност на хемокина SDF-1 (c 1 до 8 аа) или N-крайната последователност на хемокина SDF-1 (от 1 до 17 аа, със заместване на 9 и 11 аа със серин) или N-терминалната последователност на вирусен хемокин vMIP-II (от 1 до 10 аа в D-конформация). Наличието на олиголизин KKKKKKKK в състава на носителя позволява на конюгатите да образуват комплекси с нуклеинови киселини, по-специално с плазмидна ДНК, поради електростатично взаимодействие.
Посоченият технически резултат се постига от три варианта на претендирания носител.
Посоченият технически резултат в първото изпълнение се постига чрез факта, че в късия CDP носител на базата на синтетични аналози на хемокина SDF-1, включващ катионен компонент, който е олиголизин К8, използван за кондензация на плазмидна ДНК, и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, в съответствие с Заявеното изобретение използва фрагмент (1-8 аа) от N-терминалната последователност на протеина SDF-1, който има структурата KPVSLSYR и има активността на агонисти на CXCR4 рецептор, като лиганден компонент, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKK и е прикрепен към лигандния компонент чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина (Ahx).
Посоченият технически резултат във втория вариант се постига с това, че в носител (дълъг CDP) на базата на синтетични аналози на хемокина SDF-1, включващ катионен компонент, който е олиголизин К8, използван за кондензация на плазмидна ДНК, и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, в съответствие с претендираното изобретение, фрагмент (1-17 аа; аа9 и аа11 са заменени със серин) от N-терминалната последователност на протеина SDF-1, който има структура KPVSLSYRSPSRFFESH и има активността на агонисти на рецептора CXCR4, се използва като компонент на лиганда, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKK и е свързан към компонента на лиганда чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина.
Посоченият технически резултат в третото изпълнение се постига чрез факта, че в носител (вирусен CDP) на базата на синтетични аналози на протеина на вируса на саркома на Капоши vMIP-II, включващ катионен компонент, който е олиголизин К8, използван за кондензация на плазмидна ДНК и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, в съответствие с заявеното изобретение, фрагмент (1-10 Daa - синтезиран от D-аминокиселини) от N-терминалната последователност на протеина vMIP-II, притежаващ структурата LGASWHRPDK и притежаваща активността на антагонисти на рецептора CXCR4, се използва като лиганден компонент, а катионният компонент на конюгата има структура KKKKKKKK и е прикрепен към лигандния компонент чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина .
И трите варианта на претендирания носител могат да бъдат синтезирани, като се използват известни методи за пептиден синтез, например твърдофазов Boc метод (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society 1963. V.85 (14), стр. 2149-2154).
Примери за конкретно изпълнение
Изобретението е илюстрирано с помощта на Фигура 1, която показва промяната в интензитета на флуоресценция на етидиев бромид с нарастващи съотношения на заряда носител/ДНК в къси CDP/ДНК, дълги CDP/ДНК и вирусни CDP/ДНК комплекси. Намаляването на интензитета на флуоресценцията показва увеличаване на плътността на образуваните комплекси. Достигането на плато на флуоресцентните криви показва, че комплексите са достигнали плътност, достатъчна за потушаване на флуоресценцията на етидиев бромид.
Фигура 2 показва зависимостта на луциферазната активност в HeLa клетки (CXCR4+) след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. В този случай бяха използвани комплекси, образувани при следните съотношения на заряда на носител/ДНК: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Експерименталните контроли бяха интактна молекула, ДНК, PEI/DNA 1/8 комплекси (положителна експериментална контрола беше търговският носител разклонен полиетиленимин 25 kDa - PEI) и комплекси, съдържащи ДНК и контролен пептид (СР). СР се различава от носителите в настоящото изобретение по липсата на сигнал за свързване към CXCR4 рецептора и е структурно олиголизин KKKKKKKK. Ефективността на доставяне на маркерния ген от носители на къс CDP, дълъг CDP и вирусен CDP е 10-100 пъти по-висока, отколкото при CP контрола.
Фигура 3 показва зависимостта на луциферазната активност в A172 клетки (CXCR4+) след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. Тук използвахме комплекси, образувани при следните съотношения на заряда на носител/ДНК: 9/1, 12/1. Интактна ДНК молекула, PEI/DNA 1/8 комплекси и комплекси, съдържащи ДНК и CP пептид, служат като експериментални контроли. Ефективността на доставяне на маркерния ген от носители на къс CDP, дълъг CDP и вирусен CDP е 10 пъти по-висока, отколкото при CP контрола.
Резултатите на Фигура 2 и Фигура 3 подкрепят специфичността на носителите в настоящото изобретение за CXCR4 рецептора.
Фигура 4 показва зависимостта на луциферазната активност в СНО клетки (CXCR4-) след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. Използвани са комплекси, образувани при следните съотношения на заряда носител/ДНК: 9/1, 12/1. Интактна ДНК молекула, PEI/DNA 1/8 комплекси и комплекси, съдържащи ДНК и CP пептид, служат като експериментални контроли. Ефективността на доставяне на маркерен ген чрез къси CDP, дълги CDP и вирусни CDP носители е почти същата като при използване на CP контрола.
Носителите със сигнал не са в състояние да осигурят значително по-високо ниво на доставка на генетичен материал в клетки без рецепторна експресия в сравнение с контролата.
Изпълнението на изобретението може да бъде обяснено по следния начин. Целта на настоящото изобретение е да осигури насочено доставяне на генетични конструкции в клетки, експресиращи CXCR4 рецептора, използвайки носители на генетичен материал, съдържащ сигнални последователности за този рецептор.
На първия етап се извършва образуването на комплекси на едно от изпълненията на носителя с генетичен конструкт, съдържащ гена, който представлява интерес. Образуваните комплекси се използват за доставяне на генетичен материал до съответните целеви клетки. Анализът на ефективността на клетъчното проникване се оценява с помощта на ензимни или имунохистохимични методи.
Образуването на комплекси се извършва в изотоничен разтвор. Предпочита се Hepes-буфериран манитол (Hepes-буфериран манитол). Размерът на получените комплекси е 170-230 nm.
Плазмидна ДНК се използва като генетични конструкции в едно изпълнение.
Плазмидната ДНК съдържа маркер (luc, lacZ) или терапевтичен ген (в зависимост от заболяването), под контрола на подходящи промотори и енхансери (CMV, SV40 и др.) и други елементи, необходими, например, за репликация в клетката гостоприемник или интегриране в генома. При лечение на рак чрез генна терапия могат да се използват гените HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, тимидин киназа и др.
В друго изпълнение, олигонуклеотиди, състоящи се от малка ДНК или РНК, комплементарни на специфична последователност в иРНК или нейния прекурсор, се използват като генетичен конструкт за потискане на синтеза на протеинов продукт или за отстраняване на екзон, носещ мутация от иРНК. Образуваните комплекси се използват за доставяне на генетичен материал в клетки, експресиращи CXCR4 рецептора. Навлизането на носещите комплекси от настоящото изобретение става предимно чрез рецептор-медииран транспорт чрез свързване към извънклетъчните домени на CXCR4 рецептора и последващо интернализиране на рецептора.
Дозата на носителите и генетичния материал се определя индивидуално и зависи от вида на клетките, количеството CXCR4 рецептор на тяхната повърхност и сложността на трансфектиране на тези клетки.
За да се увеличи ефективността на тези носители, клетъчната трансфекция за предпочитане се извършва с помощта на ендозомолитичен агент. Те включват глицерол, хлорохин и др. Тези вещества се добавят към трансфекционната среда непосредствено преди добавянето на комплексите към клетките. Те остават несвързани с комплексите и следователно не засягат тяхната структура.
Пептиди, други полимерни съединения и липозоми, които са способни да уплътняват нуклеинови киселини, могат да се използват като ДНК-свързваща част на носителя. В допълнение, те могат да имат ендозомолитични свойства (няма нужда да се използва допълнителен ендозомолитичен агент) и, когато е необходимо (например за доставяне на терапевтични или маркерни гени), доставят генетичен материал до ядрото.
При избора на условия за трансфекция, те са създадени, за да осигурят най-голяма ефективност на доставяне. За предпочитане е комплексите да се инкубират с клетки в продължение на 4 часа. Можете обаче да варирате това време от 3 до 6 часа. След времето на инкубация средата се сменя и клетките се оставят за 24-48 часа (в зависимост от типа на клетката и генетичния материал) за експресия на въведени конструкции с интересния ген или проява на терапевтичния ефект на олигонуклеотидите.
Анализът на ефективността на доставяне се извършва чрез ензимни или имунохистохимични методи, в зависимост от вида на въведената генна конструкция.
Пример 1. Образуване на комплекси ДНК/носител и изследване на процеса на образуване на комплекси.
Плазмидът pCLUC4, съдържащ гена на луциферазата на светулка под контрола на цитомегаловирусния промотор, беше използван като генетичен материал за целево доставяне на гени в клетките. Използвано е едно изпълнение на носача.
Разтвори на 1 μg ДНК в 40 μl 1X HBM буфер (5% w/v манитол, 5 mM Hepes, рН 7,5) и разтвори на носители, съответстващи на различни зарядови съотношения на ДНК/носител, се приготвят в равен обем буфер. Разтворът на носителя се добавя постепенно към епруветката Eppendorf, съдържаща ДНК разтвора, и се разбърква енергично в продължение на 20 секунди. Получената смес се оставя за 30 минути при стайна температура, за да завърши процеса на образуване на комплекса.
Резултатите от комплексообразуването се анализират по метода на изместване с етидиев бромид. Флуоресценцията на етидиев бромид се измерва с помощта на многомодов четец за спектрално сканиране Varioscan Flash (Thermo, Финландия). Наблюдава се изместване на етидиев бромид при 590 nm излъчване (възбуждане при 544 nm) след добавяне на носител към ДНК (20 μg/ml), предварително инкубирана с интеркалиращия агент етидиев бромид (400 ng/ml). Изместването се изчислява по формулата (F-Ff)/(Fb-Ff), където Ff и Fb са интензитетите на флуоресценция на етидиев бромид съответно в отсъствие и присъствие на ДНК. Резултатите са представени на Фиг. 1.
Пример 2. Провеждане на трансфекция in vitro.
HeLa, A172 и CHO клетки се посяват в 48-ямкови културални плаки (Nunc) 24 часа преди трансфекцията при скорост от 50 000 клетки на ямка, съдържаща 500 μl стандартна културална смес, състояща се от DMEM културална среда (GIBCO), 10% фетален говежди серум (GIBCO), 2 mM глутамин, с добавяне на пеницилин (50 U/ml), стрептомицин (50 μg/ml) и 1 mM натриев пируват. Суспензия от комплексите се приготвя съгласно метода, описан в пример 1, при скорост от 2 μg ДНК на ямка на културална плака. 10 минути преди добавяне на суспензия от комплекси ДНК/носител, клетките се промиват няколко пъти с DMEM и към всяка ямка се добавят 500 μl среда, съдържаща 15% глицерол и 1.5% етанол. Трансфекцията се извършва чрез добавяне на суспензия от комплекси ДНК/носител към средата. След добавяне на комплексите, плаките с клетки се поставят в термостат с температура 37°C и 5% CO 2 за 4 часа. След времето за инкубация, клетките се промиват с DMEM и към всяка ямка се добавят 500 μl стандартна културална смес. Културалната плака се инкубира в термостат при 37°С и 5% СО2 за 48 часа, след което се открива експресия на маркерен ген.
Пример 3: Откриване на експресия на луциферазен ген след трансфекция in vitro.
Средата се отстранява от културалните плаки и клетките се промиват в 1x PBS (рН 7.2). 80 μl лизисен буфер (25 MM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; рН 7.8) се добавят към всяка ямка. 50 μl лизат се прехвърлят в полистиренови плаки с непрозрачни стени за измерване на луциферазната активност. Измерването беше извършено с помощта на многомодов четец за спектрално сканиране Varioscan Flash (Thermo, Финландия). Измерването беше извършено с помощта на разтвор на луциферазна флаш смес (20 mM трицин, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2,67 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 µM ATP, 270 µM ацетил коензим А, 470 µM луциферин). Всяко измерване се извършва за 10 секунди. Показанията на инструмента бяха получени в относителни светлинни единици (RLU). Експерименталните резултати бяха оценени в относителни светлинни единици за 1 mg общ протеин от клетъчни екстракти в ямка на културална плака. Общото количество протеин във всяка ямка се измерва с помощта на комплект за анализ на протеини (Bio-Rad), спрямо кривата на калибриране на говежди серумен албумин. Резултатите са представени на фигури 2, 3, 4.
ДНК ваксина(Също генна ваксина, ваксина с нуклеинова киселина)- генно инженерна конструкция, която след като бъде въведена в клетката, осигурява производството на патогенни протеини или туморни антигени и предизвиква имунен отговор. Въвеждането на ДНК ваксини в тялото се нарича генетична имунизация. ДНК ваксинацията има няколко предимства пред конвенционалните ваксини. По-специално е доказано, че такива ваксини осигуряват не само производството на антитела (хуморален имунитет), но и специфичен цитотоксичен отговор (клетъчен имунитет), който преди това беше постижим само с помощта на живи ваксини. Днес ДНК ваксините не се използват за лечение на хора, но се прогнозира, че генетичната имунизация ще помогне за преодоляване на редица заболявания.
История на създаването
Идеята за използване на ДНК фрагменти за ваксинация се появява през 50-те и 60-те години. След поредица от експерименти беше установено, че генетичната информация на ДНК запазва способността да се транскрибира и транслира след прехвърляне в друга клетка. През същата година беше открито, че инжектирането на животни с генома на полиомиелитния вирус стимулира производството на антитела. По-късно беше показано активиране на хуморален имунитет за ДНК молекули, получени от неинфекциозни агенти. От 90-те години на миналия век научните лаборатории започнаха все повече да изследват имуностимулиращите свойства на ДНК. През 1992 г. Танг и колегите му показаха, че генът на човешкия растежен хормон, вграден в плазмид, се експресира стабилно в тялото на мишката и синтезираният хормон се разпознава от имунната система като антиген и стимулира производството на антитела. Процесът на въвеждане на плазмидна ДНК за стимулиране на хуморалния имунитет беше наречен Tango "генетична имунизация". Въпреки това на следващата година друга група учени обявиха, че въвеждането на плазмид, кодиращ протеини на грипния вирус, предизвиква както хуморален, така и клетъчен отговор. Индуциране на двата клона на имунитета през една и съща година беше установено и за плазмид, съдържащ HIV гени. От 1995 г. започнаха да се появяват доказателства, че ДНК ваксинацията може да активира имунната система срещу рак. Преди около 20 години се проведоха първите клинични изпитвания на ДНК ваксини, които преди всичко трябваше да демонстрират безопасността на новия метод. На пациентите са инжектирани гени за ХИВ, грипен вирус, херпес, хепатит В и причинителя на маларията. Резултатите от всички тестове се оказаха доста обнадеждаващи: ДНК ваксините бяха последователно експресирани, провокираха имунен отговор и не предизвикаха сериозни странични ефекти, което послужи като тласък за по-нататъшното им изследване.
Дизайн на ДНК ваксина
Структурно, ДНК ваксината е нуклеотидна последователност, вградена във вектор, който кодира специфичен антиген или антигени. В генното инженерство векторът е молекула нуклеинова киселина, която служи за доставяне на генетичен материал в клетките и осигуряване на неговата репликация или експресия. Преди това вектори, базирани на вируси, са били използвани за транспортиране на гени в клетки: модифициран (отслабен) вирус на вариола, аденовируси и ретровируси. Вирусните вектори са доста ефективни, но имат значителна вероятност от развитие на странични ефекти поради относително високата имуногенност на самия вектор. Ето защо днес като вектор по-често се използва бактериален плазмид, малка стабилна кръгова ДНК молекула, способна на автономна репликация. Самият плазмид не предизвиква желания специфичен имунен отговор, за тази цел в него се вмъкват гени на имуногенни протеини. Също така, ДНК ваксината трябва да съдържа регулаторни последователности, необходими за генната експресия в еукариотните клетки. Готовата ДНК конструкция се доставя до бактериална клетка, където се увеличава броят на нейните копия. След това се изолират и пречистват плазмиди, които носят желаната инсерция.
Плазмиден векторен дизайн
Важен етап от създаването на ДНК ваксините е проектирането (конструирането) на вектора. Задължителните структури на плазмидния вектор са рестрикционни места, селективен маркер и началото на репликацията на ДНК ваксината в бактериалната клетка. За да се осъществи синтеза на антиген, ДНК ваксината трябва да съдържа промотор и сигнал за полиаденилиране. Промоторът е важен фактор за ефективността на ваксината, тъй като той определя силата на имунния отговор: колкото по-голяма е експресията на гена, кодиращ вирусния или туморния антиген, толкова по-силен е имунният отговор. Най-често използваният промотор е SV40 или цитомегаловирус (CMV). За да се стабилизират транскриптите на иРНК, в плазмида се вмъква сигнал за полиаденилиране, най-често получен от гена на говежди растежен хормон (BGH)или вирус SV40. Като селективни маркери се избират бактериални гени за резистентност към антибиотици, често генът за резистентност към канамицин. При проектирането на ДНК ваксини най-популярният произход на репликацията е Ешерихия коли.
Избор на ген за имунизация
Векторът е важен компонент на ДНК ваксина, но неговата имуногенност се определя от вмъкването - ДНК последователността, кодираща антигена. Сред вирусните антигени слетите протеини са най-подходящи за имунизация - това са относително консервативни протеини, които осигуряват проникването на вируса в клетката. За ваксиниране срещу грам-положителни бактерии е препоръчително да се вмъкнат в плазмидния вектор гените на онези бактериални протеини, които определят патогенезата на заболяването. Сред протеините на грам-отрицателните бактерии те имат висока имуногенност. За терапевтични противотуморни ДНК ваксини се използват маркерни протеини на ракови клетки.
Методи за доставяне на ДНК ваксини в клетките
Готовата ваксина трябва да бъде доставена в тялото на човек или животно, където нейната дестинация са антиген-представящи клетки (APC) - макрофаги, дендритни клетки, В-лимфоцити. Тук ще настъпи синтез и пост-транслационна модификация на антигена, след което той ще бъде вграден в клетъчната мембрана, за да привлече вниманието на имунната система. Основният проблем е доставянето на достатъчно количество плазмид към APC. Методите за доставяне на генетичен материал в клетките обикновено се разделят на 2 групи: вирусни и невирусни. Тъй като вирусните вектори имат редица значителни недостатъци, този раздел представя само невирусни методи за доставяне на ДНК ваксини.
Микроинжекция
В началото на 90-те години интрамускулните микроинжекции бяха най-разпространеният метод за въвеждане на ДНК в клетките поради простотата на метода. За целта ДНК се разтваря във вода или изотоничен разтвор и при необходимост се добавя адювант (вещество, което засилва имунния отговор). След това с помощта на тънка стъклена тръба разтворът се инжектира в мускулната тъкан, където ролята на APC се изпълнява от дендритни клетки. Веднъж попаднала в ядрото на дендритната клетка, ваксината започва да се експресира и настъпва синтез на антигенни протеини. С помощта на микроинжекции ДНК може да се инжектира подкожно в тимуса, черния дроб и туморната тъкан, но именно в мускулната тъкан се наблюдава най-дълготрайната (до една година) експресия на ДНК ваксината. Поради високата концентрация на Лангерхансови клетки (подтип дендритни клетки), кожата е привлекателна цел за ДНК ваксинация. За интрадермално (подкожно) приложение се използва набор от микроигли, чиято дължина е няколкостотин микрона. Има различни възможности за интрадермална ваксинация. По-лесно чрез разхлабване на роговия слой (външен слой на кожата, обикновено 10-20 микрона) с набор от микроигли, за да се увеличи неговата пропускливост за по-нататъшно локално инжектиране на ДНК разтвор. По-ефективно е използването на микроигли, покрити със суха ваксина, която се разтваря под кожата. Ефективността на този метод обикновено е ниска, тъй като ДНК първо навлиза в междуклетъчното пространство и едва след това се инкорпорира в клетките.
Електропорация
Електропорацията е традиционен подход за доставяне на ДНК в бактериални клетки и клетъчни култури, базиран на прилагането на електрически импулс. Този импулс създава пори в клетъчната мембрана, което улеснява навлизането на отрицателно заредена ДНК. Този метод е заимстван за доставяне на ДНК ваксини на животни и хора и може значително да увеличи ефективността на конвенционалната инжекция. Устройството за електропорация съдържа източник на електрически ток и мрежа за еднократна употреба, която се състои от спринцовка и електродни игли. Спринцовка инжектира ваксината в мускулната тъкан, а електродите създават електрическо поле, което улеснява навлизането на ДНК в миоцитите и дендритните клетки. Днес са разработени устройства, които могат да увеличат ефективността на ваксинацията с 1000 пъти в сравнение с конвенционалната инжекция. Електропорацията може да се използва както за интрамускулно, така и за подкожно приложение на ДНК ваксини. Недостатъците включват лека болка на мястото на инжектиране и необходимостта от специализирани устройства. Вместо електрическо поле може да се използва магнитно поле. Такива устройства работят на същия принцип, но в този случай процедурата е напълно безболезнена и причинява по-малко увреждане на клетките.
Действието на електрическото поле не само подобрява усвояването на ДНК ваксината от клетките, но и стимулира производството на имунен отговор. Използването на електропорация води до незначително увреждане на тъканите - развива се локален възпалителен процес. Увредените клетки освобождават хемокини, така че към тях се изпращат макрофаги, лимфоцити и дендритни клетки. Увеличаването на концентрацията на имунни клетки на мястото на приложение на ваксината повишава нейната ефективност.
Сонопорация
Сонопорацията е метод за прехвърляне на чужда ДНК в клетки с помощта на ултразвук. Ултразвукът повишава пропускливостта на клетъчната мембрана, в резултат на което екзогенната ДНК прониква по-лесно в клетката. Сонопорацията е използвана за първи път за прехвърляне на гени в клетки през 1986 г. Този метод се използва за въвеждане на ДНК молекули в клетките на роговицата, мозъка, костната тъкан, бъбреците, панкреаса, ембрионалната тъкан, скелетните и сърдечните мускули. В сравнение с други методи, сонопорацията е малко проучена, все още са необходими много усилия за повишаване на нейната ефективност, особено на ниво цял организъм.
Балистична трансфекция
Балистичната трансфекция се основава на обстрел (бомбардиране) на органи и тъкани с микрочастици от тежки метали (злато, волфрам) с диаметър 1-3 микрона, покрити с ДНК молекули. Въведена по този начин, ДНК ваксината се експресира в таргетните клетки, а техните продукти навлизат в кръвта. За осигуряване на ускорение на частиците се използва устройство, подобно на малките оръжия - генен пистолет или генно оръдие. Микрочастиците преминават през клетъчните мембрани и пренасят генетичния конструкт директно в клетъчното ядро. Дълбочината на проникване на микрочастиците обикновено е малка - до 1 mm, поради което методът се използва главно за трансфекция на кожа или съседна хрущялна тъкан. Специалните условия на изпичане позволяват на микрочастиците да проникнат на дълбочина 4-5 mm и да прехвърлят генни конструкции във влакната на набраздената мускулатура. Обикновено клетките, разположени директно в центъра на изстрела, умират, докато в зоната на 0,6-1 cm от центъра се намират най-успешно трансформираните клетки. Тази технология се нарича още биобалистика или биолистика.
Първият генен пистолет е създаден от група учени между 1983 и 1986 г. с цел трансформиране на растителни клетки. Това беше пистолет, проектиран около устройство за автоматично забиване на пирони. ДНК от репортерен (маркерен) ген се нанася върху волфрамова топка и се изстрелва в петриево блюдо. Експресията на репортерния ген показва ефективността на имунизацията. Днес за доставяне на ДНК се използват частици от злато или сребро, тъй като те не са токсични за клетките, за разлика от волфрама.
Под високо налягане
През 1999 г. бяха разработени устройства за инжектиране, които могат да прилагат ДНК ваксина без използването на игла. Такива устройства работят благодарение на силата на Лоренц: малък, мощен магнит създава значително налягане и активира бутало, което изхвърля лекарството със скоростта на звука. Чрез промяна на силата на тока можете да изберете дълбочината на инжектиране и да дозирате лекарствата. Процедурата е напълно безболезнена и преди е била използвана за прилагане на инсулин на пациенти с диабет и по време на широкомащабни ваксинации. Съществен недостатък на този метод е, че високото налягане може теоретично да промени структурата на молекулите, които се инжектират. Тази технология за инжектиране обаче продължава да се подобрява и днес са разработени устройства, които могат да доставят ДНК на дълбочина до 16 mm.
Съдържа жив бактериален вектор
Живите бактериални вектори са щамове Салмонела, Шигелаили листерия,които носят мутация в гени за биосинтеза или инвазия, които елиминират патогенността и способността да поддържат своята жизнеспособност в гостоприемника или околната среда. Но необходимите гени за имуногенни протеини са вмъкнати в бактериалния геном. Отслабената бактерия се въвежда в тялото орално (през устата, чрез поглъщане) или интраназално (чрез пръскане в носа), така че този метод на ваксинация не изисква никакво оборудване. В допълнение, такова приложение стимулира имунния отговор на лигавицата, което е важно, тъй като повечето патогени навлизат в тялото през устните и носните отвори. Заобикаляйки стомаха, отслабените бактерии навлизат в тънките черва. След това бактерията прониква в плаките на Peer - чревни лимфни възли. Веднъж попаднали в средата на петната на Пейер, бактериите стават мишена за макрофагите и се подлагат на фагоцитоза. В цитоплазмата на макрофага бактерията освобождава ДНК ваксината, след което ДНК навлиза в ядрото и бактерията се неутрализира от имунната система.
Опаковка в липозоми
Липозомите са сферични образувания (около 100 nm в диаметър), състоящи се от липиден двоен слой. Липозомите са кухи отвътре, които обикновено са пълни с разтворител, но могат да се използват за доставяне на различни вещества, включително ДНК ваксини. Тяхната хидрофобна обвивка им позволява да се слеят с клетъчните мембрани и да прехвърлят съдържанието си в клетката. Използването на липозоми започва през 1965 г. и това се превръща в мощен двигател за развитието на бионанотехнологиите.
Обещаващ метод за директно въвеждане на ДНК конструкт в целевите клетки е доставянето на генетичния конструкт като част от катионни липозоми, конструирани от положително заредени липиди. Катионните липозоми с отрицателно заредена ДНК молекула образуват ДНК-липиден комплекс - липоплекс. Предимствата на използването на такива комплекси са способността да носят голямо количество информация, неинфекциозност, освен това те са прости и евтини за производство. През 2003 г. бяха създадени изключително малки - милимикронни липозоми, покрити с полимер полиетилен гликол, които са способни да пренасят терапевтична ДНК през кръвно-мозъчната бариера и да я доставят до невроните в мозъка, което преди беше невъзможно.
Състои се от полиплекс
За въвеждане на големи ДНК конструкции (> 10 kb) в клетката се използват полиплекси - системи, състоящи се от положително заредени полимери (поликатиони) и отрицателно заредени ДНК молекули. Размерът на такива комплекси е по-малък от 100 nm, което, от една страна, ги излага на смилане от макрофаги (така реагират на частици, по-големи от 200 nm), а от друга страна, те са достатъчно големи, за да не се филтрира в бъбреците.
Поликатионите кондензират молекулата на ДНК в комплекси, като по този начин осигуряват нейната стабилност и защита от действието на нуклеазите. Като ДНК-свързващи полимери могат да служат катионни протеини, синтетични хомополимери на аминокиселини (полилизини, полиаргинини), хитозанов полизахарид и полиетиленамин. Обикновено в полиплекса поликатионът присъства в излишък, в резултат на което комплексът е разтворим и положително зареден. Ако лигандът е прикрепен към полиплекс към специфичен клетъчен рецептор, тогава ДНК ваксината може да бъде насочена към специфичен клетъчен тип. Процесът на доставяне на генетичен материал като част от полиплекс включва два етапа: извънклетъчен (път от мястото на инжектиране до целевите клетки) и вътреклетъчен (взаимодействие с целевите клетки, ендоцитоза, излизане от ендозоми, доставка до ядрото). Първата бариера, която комплексът трябва да преодолее, е кръвта и извънклетъчната матрица. Следователно, такива физикохимични параметри на полиплекса са избрани, за да се повиши неговата стабилност, да се избегнат нежелани взаимодействия с кръвни протеини и имунни реакции, причинени от химическата природа на поликатиона. Веднъж попаднал в целевите клетки, полиплексът се абсорбира от плазмената мембрана, поглъща се от ендоцитоза, след което трябва да напусне ендозома и да се дисоциира в катионен полимер и ДНК молекула. Свободната ДНК се изпраща към ядрото, а полимерните катиони напускат клетката и се изхвърлят от тялото.
| Характеристики на най-разпространените методи за доставяне на ДНК ваксини | ||
| Метод | Предимства | недостатъци |
| Интрамускулни или подкожни инжекции |
|
|
| Електропорация |
|
|
| Ген пистолет |
|
|
| Инжектиране под високо налягане |
|
|
| Опаковка в липозоми |
|
|
Механизъм на развитие на имунния отговор
Синтезираният в клетката антиген се подлага на обработка, след което се представя на имунокомпетентни клетки. Обработката е разцепване на антигенен протеин на имуногенни пептидни фрагменти. Представяне означава представянето на антигенен фрагмент, комбиниран с молекули на главния комплекс за хистосъвместимост (МНС) на имунокомпетентни клетки. Има два най-значими класа от тези молекули: MHC клас I (MHC-I) и MHC клас II (MHC-II). За да се свърже с молекули от всеки клас, антигенът се приготвя в специализирани отделения на клетката. Ендогенните антигенни протеини се изпращат за разграждане до протеазомата, след което се представят в комплекс с MHC-I на клетъчната повърхност. Тук, когато се срещнат, те се разпознават от CD8 + Т клетки (Т клетки убийци), които осъществяват цитотоксичен имунен отговор. Екзогенните протеини се разцепват от лизомни протеази, включени в MHC-II и разпознати от CD4 + Т-клетъчни (Т-хелперни) рецептори. Последните предизвикват както клетъчни, така и хуморални отговори.
Представяне на антиген чрез MHC-I пътя
ДНК ваксинацията включва ендогенен синтез на антиген, така че този път е преобладаващ. Обработката на антигена по пътя на MHC-I протича на няколко етапа. Протеинът, синтезиран в ядрото, се транспортира в цитоплазмата и се разцепва от протеазомата на къси пептиди - епитопи, които се прехвърлят в ендоплазмения ретикулум (ER) чрез специални антигенни транспортни протеини (TAP, транспортер, свързан с обработката на антигена). В ER всеки епитоп се комбинира с MHC-I молекула, след което образуваният комплекс се изпраща към апарата на Голджи (AG) за гликозилиране. Оттам комплексът във везикулата се насочва към плазмената мембрана. След като везикулата се слее с плазмалемата, комплексът се появява на клетъчната повърхност, където се разпознава от Т-килерните рецептори, които имат цитотоксична активност.
Представяне на антиген чрез MHC-II пътя
Основният източник на пептиди, които се свързват с MES-II, са екзогенни протеини, които влизат в клетката чрез ендоцитоза. Въпреки това е показано, че някои вътреклетъчни протеини могат също да присъстват в комплекс с MChS-II. В този случай новосинтезираните протеини, след като навлязат в цитоплазмата, се прехвърлят в лизозомите, където антигенът се разцепва под действието на киселинни протеази. След това лизозомата, съдържаща епитопите, се слива с везикула, която носи молекулата MES-II. В обединения везикул се образува комплекс епитоп-MCS-II; след сливането на везикула с плазмалемата, той се транспортира до клетъчната повърхност. Тук този комплекс се разпознава от Т-хелперните рецептори, което води до тяхното активиране. Това води до стимулиране както на клетъчния (активиране на Т-клетки убийци), така и на хуморалния имунитет (активиране на В-лимфоцити).
Традиционната ваксинация с разтворими протеинови антигени има за цел да мобилизира Т хелперните клетки. Сравнително ниският отговор на Т хелперните клетки е един от недостатъците на ДНК ваксините. Освен това сегашното поколение ДНК ваксини не е в състояние да индуцира производството на високи титри на антитела. За да се увеличи активирането на Т-хелперните клетки, антигенът трябва да бъде пренасочен към MES-II пътя. За целта в ДНК ваксината е вграден сигнал за лизозомна локализация; синтезираният антиген ще бъде изпратен до лизозомите, което означава, че ще поеме пътя на MES-II
Стратегии за подобряване на ефикасността на ДНК ваксината
Основен въпрос относно бъдещето на ДНК ваксините е повишаването на тяхната ефективност. В момента се провеждат голям брой проучвания за оптимизиране на разработените ДНК ваксини. Търсенето на решение се извършва в две посоки: повишаване на експресията на ваксината и повишаване на имуногенността на кодирания антиген.
Оптимизиране на транскрипционните елементи
Важен компонент на ДНК ваксината е промоторът. Бактериалните промотори не са подходящи за експресия на антиген в клетки на бозайници, така че вместо тях са използвани промотори на онкогенни вируси. Сега, за да се подобри безопасността на ваксините, те са заменени с промотори от неканцерогенни обекти, например човешки цитомегаловирус (CMV). За повечето ДНК ваксини този промотор е оптималният избор: той е силно експресиран в широк диапазон от клетки. За генна експресия в специфични тъкани е обещаващо да се използват промотори, специфични за този тип тъкан. Например, използването на мускулен CPK промотор, когато се прилага, води до десетократно увеличение на синтеза на антитела и индукция на Т-клетъчен отговор, отколкото използването на подобна ДНК ваксина с CMV промотор. Промоторът на гена desmin, който кодира един от цитоскелетните протеини, също показа висока ефективност в миоцитите. За да се увеличи експресията на ДНК ваксината в кератиноцитите (клетките на епителната тъкан), се използват промотори на гена металотионеин (белтък, свързващ тежки метали) или гена 3 на витамин D хидроксилазата.
Нивото на започване на транскрипцията обикновено се повишава отзадакаунт за използване мощен промотор и подобрител,и характеристиките за прекратяване могат да се превърнат в ограничаващ фактор. Ефективността на полиаденилирането и обработката на първичния РНК транскрипт варира в зависимост от последователността на полиА сигнала. Тоест, последователността на полиаденилиране засяга синтеза на антиген. Например, широко използваният полиА сигнал на вируса SV40 има по-ниска ефективност от сигнала за полиаденилиране на заешкия β-глобинов ген или гена на говеждия растежен хормон.
За ефективна транслация иРНК на бозайници трябва да премине през т.нар Козак последователност.Вмъкването на тази последователност в ДНК конструкт може значително да повиши нивото на синтеза на антиген. За да се попречи на РНК полимеразата да прескочи стоп кодона на гена и да се осъществи синтеза на удължен протеин, който след това няма да може да придобие правилното сгъване, генът може да бъде прекратен двойна стоп линия.
Когато проектират ДНК ваксина, те също се опитват оптимизира своите кодони.Процедурата на оптимизиране означава замяна на кодони в генната последователност по такъв начин, че аминокиселинната последователност на протеина да остане непроменена, но ефективността на транслацията на неговата иРНК се увеличава. Причината е, че повечето аминокиселини са кодирани от повече от една граница. Всеки кодон има своя собствена тРНК и представянето на различни тРНК в клетката не е еднакво и също варира в зависимост от вида на организма. Кодоните се избират по такъв начин, че присъствието на желаната тРНК да не се превръща в ограничаващ фактор по време на синтеза на антиген.
Оптимизиране на антигена
Въпреки че силата на имунния отговор корелира с нивото на експресия на ДНК ваксината, за всеки антиген има определено плато, след което увеличаването на количеството антигенен протеин увеличава производството на антитела. В същото време може да се постигне по-силен имунен отговор чрез оптимизиране на антигена. Например от комбиниране на антиген с лиганд към специфичен рецептор на антиген-представяща клетка.Такъв лиганд може да бъде маркерният протеин CD40, извънклетъчният домен на Fms-подобна тирозин киназа-3 или Т-килърен антиген-4. Поради взаимодействието лиганд-рецептор, ефективността на поемане на антигенния протеин от APC се увеличава.
Улесняване на разграждането на антигена в протеазомата или лизозоматасъщо така стимулират имунния отговор. За да се подобри протеиотичното разцепване на антигена, в неговата последователност се вмъква сигнал за убиквитиниране Грешка в цитата: Неправилно извикване: Референтен таг без заглавие трябва да има вход.Използването на ДНК ваксини, които кодират вместо целия антиген няколко епитопа с различен произход,ви позволява значително да разширите спектъра на имунния отговор.
Комбинацията е ефективна за противотуморни ДНК ваксини "туморен антиген + вирусен или бактериален антиген."Например, комбинирането на туморен антиген с епитоп на тетаничен токсин значително повишава активирането на Т клетки убийци срещу ракови клетки.
Включване на адюванти
Когато се използват традиционни ваксини, се добавят адюванти за засилване на имунния отговор. ДНК ваксината има бактериален произход, така че самата тя е имуностимулатор. За засилване на имунния отговор в ДНК ваксината се вмъкват адювантни гени или се използва допълнителен плазмид, който кодира имуностимулиращи протеини.
Имуностимулиращ ефект на бактериални CpG динуклеотиди
Функцията на плазмида не се ограничава до доставянето на гени в клетките. Още през 1893 г. е открито, че смес от бактериални лизати намалява прогресията на раковите тумори, но едва през 1983 г. е установено, че имуностимулиращите свойства на лизата се дължат на бактериални ДНК молекули. През 1995 г. беше показано, че имунната стимулация се причинява от CpG мотиви в бактериална ДНК. В бактериите, както и в ДНК вирусите, тези мотиви са неметилирани. В човешкото тяло и висшите примати, напротив, цитозинът в повечето CpG динуклеотиди съдържа метилова група. Следователно, неметилираните CpG мотиви се възприемат от човешкото тяло като свързани с патогени молекулярни модели (PAMP). Съединенията на Rumry се разпознават от Toll-подобни рецептори, които в зависимост от вида на лиганда се разделят на няколко вида. Неметилираните CpG мотиви се разпознават от рецептора TLR-9, разположен върху мембраните на ендоплазмения ретикулум на В лимфоцити, дендритни клетки и естествени клетки убийци. Свързването на рецептора с неметилирани CpG мотиви предизвиква каскада от реакции, в резултат на което се индуцира синтеза на провъзпалителни цитокини - интерферон-1 и IL-12.
Експресия на цитокини и други имуномодулатори
За ДНК ваксинация цитокиновите гени най-често се използват като адюванти. Цитокините са клас протеинови молекули, които регулират междуклетъчните и междусистемните взаимодействия в организма, по-специално функционирането на имунната система. Всички цитокини, а повече от 30 от тях са известни, могат да модулират имунния отговор. Цитокините IL2, IL-12, интерферон γ, IL-15, IL-18 и IL-23 имат стимулиращ ефект върху Т хелперните клетки от клас 1. Цитокините, които модулират действието на Т-хелперните клетки от втория клас, включват: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13. Типът цитокин се избира според вида на имунния отговор, който искат да подобрят.
Увеличаването на имунния отговор може да се постигне с помощта на хемокини. Хемокините са семейство цитокини, които са способни да индуцират хемотаксис на клетки, чувствителни към тях, включително имунни клетки. По-специално, рецептори за хемокини се намират в антиген-рецептивни клетки за хемокини. Свързването на хемокин към неговия рецептор води до ендоцитоза на комплекса антиген-хемокин в APC. Тази стратегия се използва ефективно както при разработването на антивирусни ДНК ваксини, така и на противотуморни ваксини.
Адювантната функция може да се изпълнява и от протеина HSP70 (протеини на топлинен шок). Имуностимулиращият ефект на HSP70 се основава на способността му да навлиза в извънклетъчното пространство и да се свързва с APC рецепторите. Механизмът на транспортиране на HSP70 навън все още не е напълно изяснен, но най-вероятно има няколко пътя: екзоцитоза, секреция навън или излизане през канала. Свързването на HSP70 с неговия рецептор води до активиране на дендритни клетки, медиира представянето на антиген и стимулира производството на хемокини. Тъй като антигенът е слят с HSP70, той също навлиза в извънклетъчното пространство и следователно може да бъде представен чрез MES-II пътя и да активира В клетките. За да се избегнат автоимунни реакции, ДНК ваксините използват бактериалния ген HSP70.
Предимства и недостатъци на ДНК ваксините
Методът на ДНК ваксинация има редица предимства, най-важното от които е задействането както на хуморален, така и на клетъчен имунен отговор. Базираните на ДНК ваксини осигуряват дълготрайна експресия на антиген и следователно устойчив имунен отговор. Допълнителни фактори, допринасящи за развитието на ДНК имунизацията, включват простотата и ниската цена на производството на ваксина.
| Предимства | недостатъци |
|---|---|
|
|
Приложение на ДНК ваксини
Първите клинични изследвания на ДНК ваксините, заедно с безопасността на новия метод, показаха неговата ниска ефективност. Осъзнавайки обещанието за ДНК имунизация, научните лаборатории, заедно с биотехнологичните компании, съсредоточиха усилията си върху оптимизирането на новия метод и в рамките на няколко години беше постигнат значителен напредък. През 2005 г. първата ДНК ваксина получи одобрение от FDA. Администрация по храните и лекарствата)за използване върху животни. Към 2013 г. повече от сто ДНК ваксини са в клинични изпитвания и четири ДНК ваксини са лицензирани за употреба при добитък.
ДНК ваксини във ветеринарната медицина
И четирите одобрени от FDA ваксини са базирани на плазмид. За три от тях препоръчаният от производителя начин на приложение е интрамускулно; за ваксината LifeTide® това е инжекция, комбинирана с електропорация. Ако другите ваксини са насочени към активиране на имунната система, то за ваксината LifeTide® имуностимулиращият ефект е допълнителен. Продуктът на ваксината е соматолиберин, хормон, който стимулира хипофизната жлеза да освобождава растежен хормон и пролактин. Действието на последните два хормона при свинете води до увеличаване на теглото на животните и увеличаване на броя на котилата. В същото време въвеждането на плазмид, кодиращ соматолиберин, при животни стимулира производството на Т-лимфоцити, естествени клетки убийци, и следователно повишава имунната устойчивост на организма.
| Търговско наименование на ваксината | Година на лицензиране | Мишена | Животно | Ваксинен продукт | Целта на създаването на ваксина |
|---|---|---|---|---|---|
| West Nile-Innovator® (САЩ) | 2005 | Западнонилски вирус | Коне | Структурен протеин на PreM-E вируса | Защита срещу вируса |
| Apex-IHN® (Канада) | 2005 | Причинител на инфекциозна некроза на хемопоетична тъкан | Риба от семейство Сьомгови | Вирусен гликопротеин | Повишаване на количеството и качеството на храната за рибки |
| LifeTide® SW 5 (Австралия) | 2008 | Хормон на растежа | Свине и друг добитък | Свински соматолиберин | Увеличен размер на котилото при свине майки; значително намалява намаляването на перинаталната смъртност и заболеваемост |
| ONCEPT® (САЩ) | 2010 | Меланом | кучета | Човешки тирозинази | Като алтернатива на лъчетерапията и хирургията при лечение на меланом |
Перспективи за ДНК ваксинация
Антитуморни ДНК ваксини
Докато индукцията на клетъчни и хуморални имунни отговори е убедително демонстрирана за чужди антигени, свързани с инфекциозни заболявания, използването на ДНК ваксини за лечение на рак досега е по-малко успешно. Индуцирането на ефективен противотуморен имунитет е предизвикателство. Клиничните проучвания потвърждават общата безопасност и ниската токсичност на противотуморните ДНК ваксини, но ефективността на имунния отговор, който те провокират, е слаба, а антитуморната активност в някои случаи като цяло е под въпрос.
ДНК ваксини срещу вирусни и бактериални патогени
ДНК ваксина срещу кариес
Причината за кариеса е локална промяна на pH в резултат на ферментация (гликолиза) на въглехидрати, извършвана от бактерии. Учени от Института по вирусология в Ухан (Китай) разработиха ДНК ваксина, насочена срещу един от причинителите на кариес - Streptococcus mutans.Ваксината е базирана на плазмид и кодира два протеина: повърхностен протеин Св. mutans PAcи флагелин, получен от бактерии салмонела,който действа като адювант. На етапа на предклиничните изследвания ваксината се прилага през носа на лабораторни гризачи, след което при животните се проверява нивото на имуноглобулин G в кръвния серум и секреторния имуноглобулин А в слюнката. След проучванията учените установиха, че нивото на имунните протеини в кръвта и слюнката се повишава, но по-важното е, че растежът на колониите е инхибиран Streptococcus mutansвърху зъбния емайл. Тоест зъбите на ваксинираните животни са били по-добре защитени от кариес.
ДНК ваксини и лечение на автоимунни заболявания
ДНК ваксина срещу диабет тип 1
Диабет тип 1 се характеризира със загуба на произвеждащи инсулин бета клетки, разположени в Лангерхансовите острови на панкреаса. Основната причина за загуба на бета клетки е автоимунно увреждане от Т клетки убийци. За да предпазят бета клетките от свръхактивна имунна система, учени от университетите Станфорд (САЩ) и Лайден (Холандия) разработиха ДНК ваксината BHT-3021. Ваксината се основава на плазмид и кодира прекурсор на инсулин, проинсулин. Това е ретроактивна ваксина: ако конвенционалните ваксини трябва да активират имунните отговори, тогава BHT-3021, напротив, неутрализира цитотоксичния ефект на Т-клетките убийци, насочени срещу Лангерхансовите острови.
В първата фаза на клиничните изпитвания BHT-3021 показа своята ефективност при група от 80 души. Половината от тях са получавали интрамускулни инжекции BHT-3021 на всеки седем дни в продължение на 12 седмици, а другата половина са получавали плацебо. След този период групата, която е получила ваксината, показва повишаване на нивата на С-пептид в кръвта, което показва възстановяване на функцията на бета клетките. Не са докладвани сериозни странични ефекти при нито един от участниците. Ефектът от ваксината продължава 2 месеца.
Подобни статии
-
Когато съпругът е против детето, как да забременеете без негово знание?
Понякога може да забременеете поради небрежност. За да не се случи това, е важно да знаете как можете да заченете дете случайно и какви средства можете да използвате, за да избегнете нежелана бременност. Също така в тази статия можете да намерите информация за...
-
Какви камъни и амулети са подходящи за Телец според хороскопа и датата на раждане Талисман на слон за Телец
Април-май Телците (21.04 - 20.05) са премерени, непридирчиви и изключително продуктивни! Тяхната завидна упоритост може да подлуди околните, но те знаят точно какво правят и защо им трябва. Сред положителните качества...
-
Ограничения за достъп до данни в 1c роли
Всички настройки на потребителските права, които ще направим в рамките на тази статия, се намират в раздел 1C 8.3 „Администриране“ - „Настройки на потребител и права“. Този алгоритъм е подобен в повечето конфигурации на...
-
1c стартира тънък клиент вместо дебел
Платформи: 1C:Enterprise 8.3, 1C:Enterprise 8.2, 1C:Enterprise 8.1 Конфигурации: Всички конфигурации2012-11-16 21362 Както знаете, клиентите не ви позволяват да изберете база данни. Те се стартират чрез указване на специални...
-
Очевидност на известни методи за кражба на ток Как да разберем кой краде ток
Повишаването на енергийните тарифи е една от поразителните характеристики на задълбочаващата се икономическа криза. В контекста на това от първостепенно значение стават кражбите на електроенергия и проблемите, свързани с разкриването й. Методи за разкриване на кражби...
-
Характеристики на инсталиране на контакти и ключове на различни повърхности
Поздрави на всички читатели на нашия блог Днес, скъпи читатели, искам да покрия темата за това как да инсталирам гнезда. Тази процедура е много често търсена при подмяна на стар контакт с нов в случай на повреда, когато...