Олигонуклеотидът е къса част от нуклеинова киселина с дължина под 50 нуклеотида. През последните 20 години значението се разшири, за да включи всички химически синтезирани нуклеинови киселини, независимо от дължината. Първата публикация за целенасочен химичен синтез на олигонуклеотид се появява през 1955 г.

Оттогава всяка година се синтезират милиони олигонуклеотиди за използване в лаборатории по целия свят. Повечето изследвания изискват само малки количества ДНК. Необходими са много по-големи количества ДНК (10 µmol или повече) за използване в биофизични изследвания (ЯМР и рентгенова кристалография), така че за да се позволи синтеза на такива големи количества, са разработени методи за синтез в твърда фаза, които позволяват използване на олигонуклеотиди като лекарствени молекули (например антисенс олигонуклеотиди).

Синтезът на ДНК или РНК олигонуклеотиди се отнася до химическия синтез на фрагменти от нуклеинова киселина с определени химични структури или последователности в различни размери.

Фиг. 1. Структури на олигонуклеотиди.

Принципът на твърдофазния синтез е разработен за първи път и приложен към синтеза на полипептиди от Робърт Брус Мерифийлд, американски биохимик, който получава Нобелова награда за химия през 1984 г. за своето изобретение на твърдофазния пептиден синтез. Той осъзна, че ключът към успешния синтез е да се закрепи първият мономер към неразтворимото полимерно твърдо вещество. След това други мономери могат да бъдат свързани, един по един, към неподвижния краен край на растящия полимер. В края на синтеза завършената полимерна верига може да бъде отделена от неразтворимия полимер и пречистена. Този процес е оптимизиран през годините, за да бъде високоефективен и сега се е превърнал в основна техника, използвана в автоматизираните олигонуклеотидни синтезатори.

За да се осигури успешен синтез на олигонуклеотиди, са необходими следните условия:

• Всички реагенти трябва да са разтворими в неводни разтворители.
• Амино и хидроксилните групи на нуклеотидните бази и въглехидратните остатъци трябва да бъдат блокирани по подходящ начин.
• Защитните групи, въведени по време на синтеза, трябва да бъдат стабилни при условия на удължаване на веригата по време на образуването на междунуклеотидна фосфодиестерна връзка.
• Защитните групи трябва да бъдат достатъчно лабилни, така че да могат да бъдат отстранени в края на синтеза, без да се увреждат реакционните продукти.

Функции на олигонуклеотидите и перспективи за тяхното приложение

Понастоящем олигонуклеотидите и техните аналози се използват широко в различни области, като медицина и молекулярно-биологични изследвания, и също така се считат за обещаващи терапевтични средства и сонди за молекулярна диагностика.

През последните 20 години само два вида аналози на нуклеинова киселина с формално електрически неутрален скелет, пептидни нуклеинови киселини и фосфодиамидни морфолино олигонуклеотиди, са относително добре проучени. Аналозите и на двата вида са способни на комплементарно свързване с естествени молекули на ДНК и РНК и затова са намерили приложение както в молекулярната биология, така и в частност в медицината като потенциални лекарства.

Освен това с развитието на ДНК технологиите стана възможно да се изследва експресията на известни гени, да се определят мутации в геномите на различни организми и да се диагностицират редица инфекциозни заболявания. При решаването на тези проблеми най-обещаващо е използването на ДНК чипове, които представляват малки плочи с отложени на повърхността ДНК фрагменти.

Методът за създаване на ДНК чипове съчетава методи, базирани на целенасочен синтез на олигонуклеотиди директно върху повърхността на чипа. Синтезът се извършва чрез поетапно добавяне към нарастващата олигонуклеотидна верига на нуклеотиди, съдържащи лабилна защитна група в 5'-края, чието отстраняване е възможно под действието на светлинно лъчение, електрическо напрежение или по време на киселинна хидролиза.

Доказано е също, че в зависимост от избрания целеви ген, генно-насочените олигонуклеотиди имат значително разнообразие от модулиращи ефекти върху туморните тъкани, вариращи от забавяне и спиране на пролиферацията на туморни клетки и завършващи с потискане на техните инвазивни свойства.

Противораковите лекарства на базата на нуклеинови киселини са силно специфично средство за модулиране на генната експресия. Потискането на редица гени, които са необичайно свръхекспресирани по време на неопластична трансформация, може да бъде постигнато с лекарства на базата на нуклеинови киселини като антисенс олигонуклеотиди (asON). Най-общо механизмът на потискане на генната експресия се състои в тяхното комплементарно свързване към целевата иРНК, след което целевата иРНК или се разцепва, или нейният процес на транслация се блокира.

asON са синтетични едноверижни ДНК с дължина 15-20 нуклеотида. Наскоро бяха получени asONs, които могат да предотвратят транспортирането на сплайсирана иРНК от ядрото към цитоплазмата, както и asONs, които в резултат на блокиране на мястото на сплайсинг в пре-mRNA могат да доведат до експресия на алтернативен протеинов вариант.

Поради факта, че естествените олигодезоксирибонуклеотиди в клетъчна култура и при условия in vivo претърпяват бързо разграждане под действието на нуклеази, в структурата на asON се въвеждат различни химични модификации, за да се увеличи тяхната стабилност.

Химичен синтез на олигонуклеотиди

Твърдофазовият синтез се използва широко в пептидния синтез, олигонуклеотидния синтез, олигозахаридния синтез и комбинаторната химия. Химическият синтез в твърдо състояние е изобретен през 60-те години на миналия век от Брус Мерифийлд и е удостоен с Нобелова награда за химия през 1984 г.

Твърдофазовият синтез се извършва върху твърда подложка, между филтри, в колони, които позволяват преминаването на всички реагенти и разтворители. Синтезът в твърда фаза има редица предимства пред синтеза в разтвор:

 осигурява висока скорост на реакция

 Примесите и излишните реагенти се отмиват, така че не е необходимо почистване след всяка стъпка

 процесът е податлив на автоматизация на компютърно контролирани твърдофазни синтезатори.

Твърдите носители (наричани също смоли) са неразтворими във вода частици, обикновено с диаметър 50-200 µm, към които е прикрепен олигонуклеотид по време на синтеза.

Има доказателства, че един от най-ефективните материали, които могат да се използват като твърда опора, е порестото стъкло. Той е доста твърд и не може да се надуе. В дълбоките му пори се извършва синтеза на олигонуклеотиди. Стъклото съдържа 500 Å (50 nm) пори, които са подходящи за синтеза на къси олигонуклеотиди. Въпреки това, той е слабо подходящ за синтеза на олигонуклеотиди с дължина над 40 бази. Това се дължи на факта, че нарастващият олигонуклеотид блокира порите и намалява дифузията на реагентите през матрицата.

Твърдите подложки за конвенционален олигонуклеотиден синтез обикновено се правят със зареждане от 20-30 µmol нуклеозид на грам смола. Синтезът на олигонуклеотиди при по-високи натоварвания става по-малко ефективен поради пространствено препятствие между съседни ДНК вериги, прикрепени към смолата.

Етапи на химичен синтез на олигонуклеотиди

Олигосинтезата на фосфорамидат протича в посока 3' към 5' (обратно на посоката 5' към 3' на биосинтезата на ДНК при репликацията на ДНК). Един нуклеотид се добавя на цикъл на синтез.

Ориз. 2. Цикъл на синтез на фосфорамидат олигонуклеотид

В началото на олигонуклеотидния синтез първият нуклеозид е предварително прикрепен към смолата (носител) и се избират колони за синтез A, G, C или T в зависимост от нуклеозида в 3' края на желания олигонуклеотид. Закотвеният нуклеозид има 5'-DMT защитна група (DMT=4,4'-диметокситритил), чиято роля е да предотвратява полимеризацията и тази защитна група трябва да бъде отстранена (детритилиране). Механизмът на детриализация е показан на фигура 3.

Фиг.3. Защитен механизъм за премахване на група.

След детритилиране, закотвеният нуклеозид е готов да реагира със следващата база, която се добавя като нуклеозиден фосфорамидатен мономер. Голям излишък от съответния нуклеозид се смесва с активатор (тетразол или негови производни). Диизопропиламино групата на нуклеозида се протонира от активатора и по този начин се превръща в силно отделима група. Той бързо се измества от 5'-хидроксилната група на свързания нуклеозид, създавайки фосфитен триестер (фиг. 4).

Фиг.4. Механизмът на протониране от активатор.

Нуклеозидните фосфорамидити са доста стабилни в инертна атмосфера и могат да се произвеждат в големи количества, да се изпращат по целия свят и да се съхраняват като сухо твърдо вещество няколко месеца преди употреба.

Въпреки това, дори при високопрецизна работа по синтез на олигонуклеотиди, остава възможността да има няколко нереагирали 5'-хидроксилни групи, които ще бъдат налични за участие в следващия етап. Ако подобно разрушаване не бъде спряно, те ще се натрупват с всеки следващ цикъл и крайният продукт ще бъде сложна смес от олигонуклеотиди, повечето от които ще носят неправилна генетична информация.

Следователно методът на ацетилиране на 5'-хидроксилните групи ги прави инертни по отношение на последващата реакция. Това е необходимо и за минимизиране на примесите.

Триестерният фосфит (P(III)), образуван в етапа на добавяне, е нестабилен към киселини и трябва да бъде превърнат в стабилна форма (P(V)). Това се постига благодарение на окисляването на йода в присъствието на вода и пиридин (фиг. 5). Полученият фосфотриестер всъщност е ДНК ос, защитена от 2-цианоетилова група. Цианоетиловата група предотвратява нежелани реакции с фосфор по време на следващите цикли на синтез.

Фиг.5. Механизмът на окислителния етап.

След това DMT защитната група в 5' края на ДНК веригата трябва да бъде отстранена, така че първичната хидроксилна група да може да реагира със следващия нуклеотиден фосфорамидат. Реакцията на премахване на защитата с трихлороцетна киселина в дихлорометан е бърза. Цикълът се повтаря веднъж за всяка база, докато се получи желаният олигонуклеотид.

След това трябва да отделите синтезирания олигонуклеотид от твърдата подложка. В този случай се използва сукцинил. Разделянето е възможно при третиране с концентриран воден разтвор на амоняк при стайна температура в продължение на един час (фиг. 6).

Фиг.6. Механизъм на отделяне на олигонуклеотид от твърд носител в концентриран воден разтвор на амоняк.

Реакцията на разцепване се извършва автоматично на някои синтезатори и разтворът на амоняк, съдържащ олигонуклеотида, влиза в стъклен флакон. Като алтернатива смилането може да се извърши ръчно чрез вземане на колоната от синтезатора и изплакване в спринцовки, съдържащи амониев хидроксид.

Олигонуклеотидът се разтваря в концентриран воден разтвор на амоняк и последващото нагряване позволява отстраняването на защитните групи от хетероциклични основи и фосфати. След това водният разтвор се отстранява чрез изпаряване и олигонуклеотидът е готов за пречистване.

В допълнение към защитната група на DMT, допълнителни защитни групи са необходими и за аденин, цитозин и гуанин (фиг. 7). Това обаче не е необходимо за тимина.

Фиг.7. Структури на защитни групи, обикновено използвани за защита на аденин, цитозин и гуанин бази по време на фосфорамидатния синтез на ДНК олигонуклеотиди.

заключения

1. Изкуствено синтезираните олигонуклеотиди се използват все повече в различни области на науката и методите за тяхното получаване все повече се подобряват, което прави възможно синтезирането на достатъчен брой олигонуклеотиди за лабораторни експерименти и за създаване на терапевтични лекарства.

2. Към днешна дата най-разпространеният метод за синтез на олигонуклеотиди е методът на твърдофазов синтез, който може значително да ускори процеса на получаване на олигонуклеотиди, както и да намали количеството на изразходваните реагенти.

Купрюшкин, М. С. Фосфорилгуанидини. Нов клас аналози на нуклеинова киселина / M.S. Купрюшкин, Д.В. Пишни, Д.А. Стеценко // Acta Naturae (руска версия). - 2014. - № 4 (23). - С.123-125.

Гарафутдинов, Р. Р. Химически аспекти на създаването на ДНК чипове / Р. Р. Гарафутдинов, И.С. Шепелевич, А.В. Чемерис, Р.Ф. Талипов // Бюлетин на Башкирск. университет - 2005. - № 1. - С.49-54.

Patutina, O. A. Най-новите подходи за лечение на онкологични заболявания: противоракови лекарства на базата на генно-насочени нуклеинови киселини / O.A. Патутина, Н.Л. Миронова, В.В. Власов, М.А. Зенкова // Acta Naturae (руска версия). - 2009. - № 2. - С.47-66.

Родригес, А.А. Превръщане на аденин в 5-амино-4-пиримидинилимидазол, причинено от ацетилно затваряне по време на синтез на олигонуклеотиди в твърда фаза / A.A. Родригес, И. Седило, А.К. McPherson// Bioorg Med Chem Lett. - 2016. - С. 30653-9.

Прегледи на публикации: Моля Изчакай

Резюме

Обзорът разглежда фармакокинетичните характеристики на различни антисенс олигонуклеотидни препарати. Сравнена е фармакокинетиката на лекарства от първо и второ поколение. И също така разгледа ефекта върху фармакокинетиката на химическата модификация на молекулата.

Ключови думиКлючови думи: антисенс олигонуклеотиди, фосфотиоатни олигодезоксинуклеотиди, фармакокинетика

Въведение

Фармакокинетичните свойства на антисенс олигонуклеотидите (ASO) се разбират най-добре, когато се вземат предвид техните физични и химични свойства. Параметри като заряд, молекулно тегло и амфипатична природа на фосфотиоатните ACO имат подчертан ефект върху тяхната фармакокинетика. Химическата структура, по-специално фосфотиоатната група и 2'-метоксиетил (MOE), има особено значим ефект върху фармакокинетичните свойства на ASO.

Абсорбцията, разпределението, метаболизмът и екскрецията на първо поколение фосфотиоатни олигодезоксинуклеотиди (ODNs) са широко изследвани при лабораторни животни и в клинични проучвания. Характеристиките на фармакокинетиката на фосфотиоатните ASO препарати са следните: парентерално приложен фосфотиоат ODN бързо се намират в кръвната плазма, където се свързват с хидрофилните области на плазмените протеини и по този начин избягват гломерулната филтрация. Тези хидрофилни региони се различават от другите хидрофилни региони, към които се свързват липофилните лекарства, и по този начин има малка конкуренция за свързване с плазмен протеин за ASO. Плазмената кинетика се характеризира с кратка фаза на разпределение (от порядъка на няколко часа), последвана от фаза на елиминиране с полуживот дни или седмици. Началната фаза на разпределение задължително включва свързването на ASO с протеини и разпределението на тези комплекси в тъканите на черния дроб, бъбреците, лимфните възли, костния мозък и далака, които са местата на най-активно свързване и натрупване на ASO . Ясно е, че фазата на елиминиране на ASO поради първоначалното свързване на протеина се определя от началния етап на неговото разпределение. Поради възможното насищане на протеини , площта под фармакокинетичната крива (AUC) се увеличава с увеличаване на дозата, тъй като ASO вече не се свързва с протеини след тяхното насищане, а навлиза в кръвния поток в свободна форма. След свързване ASO навлиза в клетките по градиент на концентрация от извънклетъчното пространство през клетъчната мембрана във вътреклетъчното пространство, вероятно с помощта на протеин носител. ASO в клетките се свързват с наличните мишени, но главно ASO в клетките най-вероятно се свързват с вътреклетъчни протеини. В клетката повсеместните нуклеази, но не и ензимите на цитохром Р450, метаболизират ASO препаратите. Тъй като ензимите на цитохром Р450 обикновено метаболизират лекарства с малка молекула, ASO не се конкурират в метаболитните процеси с конвенционалните съединения с малка молекула, намалявайки риска от лекарствени взаимодействия. Екскрецията на ASO в урината в крайна сметка е резултат от метаболизма в тъканите и установяването на равновесие на метаболитите и естествените вещества извън тъканите и в системното кръвообращение. Тези процеси при лабораторни животни и хора са много сходни, поради което не е възможно да се установи междувидова корелация между лабораторни животни и хора.

Понастоящем ASO конфигурацията от „второ поколение“, която включва MOE групи на 2" позиция на нуклеотиди в 3" и 5" краища, е най-широко използвана в клиничните изпитвания. Тази конфигурация е по-усъвършенствана структура в сравнение с немодифицираните фосфотиоатни ODNs , които са антисенс лекарства от първо поколение. Това се дължи на неговата повишена ефикасност, намалена токсичност и увеличен полуживот. Много фактори, свързани с прехода от първо към второ поколение на ASO, са пряко свързани с подобряването на тяхната фармакокинетика.

Характеристики на химичната структура на ASO

Фосфотиоатен скелет

Най-ранните опити за създаване на лекарства с антисенс активност бяха свързани с използването на немодифицирана ДНК, която, за съжаление, беше много податлива на разграждане от нуклеаза. Както се оказа, повсеместните нуклеази разцепват фосфодиестеразните връзки на нативната ДНК, което води до времето на полуразпад на немодифицираните ASOs от минути. Това бързо разграждане е основна характеристика на фармакокинетичния профил на немодифицирани антисенс ДНК. Промяната на фосфодиестерния скелет на ДНК до фосфотиоат драстично променя фармакокинетичния профил на ASO. В тези препарати фосфотиоатната структура замества един серен атом във фосфодиестерните връзки с един немостов кислороден атом. Тази структура повишава устойчивостта на ASO към нуклеази и в резултат на това подобрява техните кинетични свойства.

Фосфотиоатна хиралност

Проучванията показват, че тиирането на диестерния скелет на ACO не само повишава неговата устойчивост към нуклеази, но също така допринася за появата на хиралност, тоест възможността за съществуване на стереоизомери, при всяка фосфотиоатна връзка, което води до факта, че че във всеки 20-mer ACO има 219 Sp или Rp стереоизомера. Комбинацията от резистентност към нуклеаза и повишено протеиново свързване оказва силно влияние върху фармакокинетиката на ASO. Увеличаването на стабилността на фосфотиоат ASO води до факта, че полуживотът на лекарството от плазмата се увеличава до 30-60 минути в сравнение с полуживота на фосфодиестер ASO, който е 1-2 минути.

Резистентността към нуклеаза и хиралността, дължащи се на заместването на фосфодиестер с фосфотиоатни връзки, си струва да се обсъдят, тъй като физическите свойства, свързани с тази структурна характеристика, са важни както за ASO от първо, така и за второ поколение. Устойчивостта към нуклеази на фосфотиоат ASO възниква поради близостта на сярата върху немостовия кислород в активното място на екзонуклеазата до металния йон. Тази близост може да причини изместване на металния йон от активния център. Този ефект беше демонстриран в 3'–5' ДНК полимеразен екзонуклеазен модел. Рентгеновите кристалографски данни подкрепят тази хипотеза за изместването на металния йон. Очевидните разлики в чувствителността на стереоизомерите към екзонуклеазната активност на ДНК полимеразата са в съответствие с предложената конформация на ODN фосфотиоатните стереоизомери в активното място. Вероятно хиралността на фосфоротиоатните връзки може да взаимодейства с други нуклеази по същия начин, т.е. чрез изместване на метални йони, въпреки че различните екзонуклеази могат да показват различни предпочитания за Rp и Sp връзки в зависимост от естеството на активното място на ензима.

Алтернативно, сярата може просто да заеме мястото на кислорода в диестерните връзки. Разликите в способността на сярата да поеме отрицателен заряд, в сравнение с кислорода, позволяват да се предвидят промени в активния център. Тази промяна най-вероятно се дължи на хидролизата на фосфодиестерните връзки и може да се дължи на образуването на преходен петвалентен фосфор с два отрицателно заредени кислородни атома. Заместването на един от екваториалните кислородни атоми със сяра ще има отрицателни ефекти върху ензимната активност: (1) свързването на водата е намалено, което стабилизира локалния отрицателен заряд на атомите, което затруднява получаването на втори отрицателен заряд на сярата; и (2) намалено свързване на Mg2+ към сярата. Има доказателства за последния ефект в изследванията на нивото на рибозимно разцепване на диастереомерни фосфоротиоатни включвания, когато добавянето на Mg 2+ инхибира ефектите на разцепване на фосфоротиоатните рибозими. Освен това е показано, че има известно намаляване на нуклеазната активност в скелетните области по-далеч от фосфотиоатните връзки, което предполага предаване на хиралния ефект. Това явление се обяснява най-добре с промените в подреждането на водните молекули около фосфотиоатния скелет в сравнение с фосфодиестерния скелет.

Стереоспецифичните ефекти върху нуклеазната активност значително влияят върху фармакокинетиката на фосфоротиоатните ASO и това се проявява най-ясно в скоростта на метаболизма на фосфоротиоатните ASO от първо поколение в кръвната плазма. Скоростта на пълно елиминиране на ASO от плазмата намалява, което предполага забавяне на метаболизма. Тези промени в скоростта не могат да бъдат обяснени само по отношение на кинетиката от първи ред, но те могат да бъдат обяснени с разликите в чувствителността на Rp и Sp връзките.

Стереоспецифичните разлики в екзонуклеазната активност са по-малко важни за ASO от второ поколение. Това се дължи на факта, че ASO от второ поколение имат 2" модификации в 3" и 5" краищата, които предотвратяват тяхното разцепване от екзонуклеаза. Използвайки ендонуклеаза, изолирана от патогена Serratia marcescens, ефектите от хиралността на фосфоротиоатните връзки По същия начин като екзонуклеазите, той е един от немостовите кислороди за хидролизата на фосфодиестерните връзки.В диастереомера сярата е локализирана в непосредствена близост до Mg 2+, в резултат на което активността на Тъй като ендонуклеазата Serratia има значителни прилики с някои ендонуклеази на бозайници, трябва да се приеме, че този механизъм може да бъде широко приложим. Как стереохимичните характеристики на фосфоротиоатните връзки влияят върху действието на други ендонуклеази е Въпреки това, ако приемем, че реакцията протича по схема, подобна на ендонуклеазата на Serratia, можем да предположим, че активното място ще съдържа метален йон (вероятно Mg 2+) и сярата ще повлияе на действието на нуклеазите , когато е ориентиран към металния йон. Ако ендонуклеазите са чувствителни към хиралност, това може да има важни последици за развитието на проблема за създаване на ефективни лекарства от второ поколение. Освен ефекта на хиралността върху лекарствата от първо поколение, хиралният ефект върху метаболизма на лекарствата от второ поколение може да доведе до забавяне на техния метаболизъм. Така, например, може да се приеме, че бързо метаболизиращите се стереоизомери ще бъдат селективно унищожени, оставяйки функциониращи само бавно метаболизирани изомери.

ASO свързване с протеини

Установено е, че в сравнение с ASO с фосфодиестерен скелет, фармакокинетиката на фосфотиоатните структури е значително повлияна от тяхното свързване с протеини. Химическата основа за повишено протеиново свързване е повишената липофилност на фосфотиоатните връзки в сравнение с фосфодиестерните връзки. Тъй като молекулярните взаимодействия с водата се определят от формата и функцията на макромолекулите във воден разтвор, дори малки промени в скелетната липофилност по цялата дължина на ACO могат да имат последствия за взаимодействието на олигомера с вода и макромолекули като протеини.

На първо приближение фосфотиоатните ODN се свързват с клетъчните протеини по-произволно от фосфодиестерните ODN. Защо фосфотиоатните ASOs се свързват по-добре с протеините не е напълно разбрано. Възможните обяснения предполагат повишена липофилност и комплексообразуване с метални йони.

Значението на свързването с плазмените протеини за фармакологията, фармакокинетиката и токсикологията на фосфотиоатните ASO (както първо, така и второ поколение) не може да бъде надценено. На ниво микромоларна концентрация, повече от 90% от фосфотиоатните ODN са свързани в плазмата. Съществуват специфични разлики в процента и силата на свързване с протеини, както и качествени разлики в свързването на ASO със специфични протеини при различните видове. Свързването на фосфотиоатните ASO с циркулиращите протеини предпазва тези съединения от филтриране от бъбречните гломерули и екскретиране в урината. В случай на насищане, например, когато се прилага голяма доза ASO, уринарната екскреция на ASO с пълна дължина се засилва. Поради разликите във видовете насищането при различните видове се определя от различни концентрации на ASO. Например, миши плазмени протеини имат по-нисък афинитет към ASO от тези на плъхове или хора. Следователно ефектът на насищане на процеса на свързване на ASO с плазмените протеини при мишки се проявява при по-ниски концентрации в сравнение с други видове. Видовите разлики в свързването с плазмените протеини са важен фактор за различията в междувидовата фармакокинетика.

Нуклеазната резистентност и протеиновото свързване, които са характерни за ASO с фосфотиоатни връзки, също променят фармакокинетиката на ASO терапията. Допълнителните химични структури, характерни за второто поколение създадени лекарства, внасят други промени в тяхната фармакокинетика.

Метоксиетил производни на ACO

ASO от второ поколение са разработени, за да подобрят някои от характеристиките на ODN от първо поколение. По този начин фосфотиоатните структури, добавени към MOE групите в позиции 2", повишават тяхната устойчивост към нуклеази и променят ефективността на свързване с протеини.

MOE резистентност към нуклеази

Показано е, че структурата на MOE влияе на устойчивостта на ASO към нуклеази. Докато фосфотиоатните структури намаляват екзонуклеазната активност, структурата на 2" позиция на практика елиминира екзонуклеазната активност. Нуклеазната резистентност може да бъде резултат от (1) заместване на 2" водород с MOE, (2) пространствени ефекти на MOE или (3) образуване на твърда водна обвивка около скелета на ASO. Каквито и да са причините за резистентност към нуклеази, присъствието на групата MOE прави ASO, променени в позиция 2", практически имунизирани срещу ефектите на циркулиращите и повечето клетъчни нуклеази. Централната област на скелета на ASO, състояща се от дезоксифосфотиоати, не е почти толкова устойчиви на нуклеазно-медиирани разцепвания.Разликите в ASO от първо и второ поколение в местата, подложени на метаболизъм, също определят разликите в метаболитните модели.

При оценка на метаболитни модели с помощта на капилярна гел електрофореза (CGE) или течна хроматография/масспектрометрия (LC/MS), не са открити метаболити, които са по-къси с един нуклеотид. Най-вече са открити метаболити, разцепени в дезокси мястото (вероятно от ендонуклеази), по-нататъшният път на метаболизма е да се намали размерът на продуктите на разцепване. Резистентността към екзонуклеаза и бавният метаболизъм под въздействието на активни ендонуклеази води до образуването на съединения, характеризиращи се с дълъг полуживот .

Свързване на MOE с протеини

Експериментални проучвания показват, че фосфотиоатните ASOs с 2'-MOE структури имат по-нисък афинитет към плазмените протеини в сравнение с немодифицираните фосфотиоатни ASOs около 18 до около 40 μM. В същото време, в напълно заместената MOE структура на ASO, афинитетът към плазмените протеини само леко намалява. Защо увеличаването на броя на MOE структурите в олигонуклеотид не засяга по-нататъшното намаляване на афинитета към плазмените протеини не е ясно, но това може да се дължи на характеристиките на вторичната структура на ASO.

Намаляването на протеиновия афинитет, свързан с MOE структурите, може да бъде оправдано от някои физични свойства. Вероятно най-значимият физически фактор, който отличава модифицираните MOE ASO от немодифицираните, е наличието на водна молекулярна обвивка, която възниква от страничната верига на MOE. MOE заместителите във въглеводородния скелет "хелират" водните молекули (и евентуално метални йони), образувайки водна обвивка и намалявайки потенциалния контакт между "лепкавите" серни молекули и плазмените или клетъчните протеини. Степента на свързване на ASO с протеините е обратно пропорционална на тяхната екскреция в урината. Въвеждането на фосфотиоатни връзки и 2'-MOE заместители променя протеиновото свързване и в резултат на това променя свойствата на ASO.

Абсорбция, разпределение, метаболизъм и екскреция на ASO

Всмукване

Парентерален начин на приложение на ASO

Проучванията установяват, че поради молекулното тегло (около 7000 D) и отрицателните заряди на ASO, абсорбцията на тези лекарства от стомашно-чревния тракт е ограничена. Ето защо обикновено се използва парентералният път на тяхното приложение. Подкожна, интравенозна инфузия или интравитреална инжекция се използва за прилагане на лекарства от първо поколение. По-ниската провъзпалителна активност на ASO от второ поколение ги прави по-подходящи за подкожно приложение. Фармакокинетиката на тези лекарства в плазмата при подкожни инжекции и интравенозни инфузии е сравнима. Изследвания върху лабораторни животни показват, че в крайна сметка разпределението на ASO също е сравнимо в различни органи, с изключение на мястото на инжектиране и лимфните възли.

След подкожно приложение както първото, така и второто поколение ASO се абсорбират бързо от мястото на инжектиране в системното кръвообращение. В клинични проучвания, след подкожно приложение на ASO от второ поколение, времето за достигане на максимална концентрация (Tmax) варира от 1,5 до 4,7 часа в дозовия диапазон от 25 до 200 mg при постоянен обем от 1 ml. Бионаличността на подкожната доза варира от 36 до 82% от приложената доза. Предклиничните и клиничните проучвания показват, че бионаличността на ASO нараства с концентрация.

Кинетиката на ASO на мястото на инжектиране може да повлияе на локалния отговор, както и на тяхната системна кинетика и разпределение. Намаляването на концентрацията на ASO на мястото на инжектиране хипотетично намалява локалния отговор на инжектирането. Един подход за намаляване на концентрацията на ASO на мястото на инжектиране е разреждането на разтвора и в резултат на това увеличаване на повърхността на абсорбция от подкожното депо. Теоретично, разреждането на разтворите и голямата повърхност на засмукване трябва да намалят локалната концентрация и да намалят локалните реакции. Същите ефекти могат да се очакват при повишаване на системната абсорбция. Следователно промените в дозата и обема могат да се разглеждат като потенциални променливи. Но дори и днес подкожните инжекции с малки обеми и относително високи концентрации демонстрират висока бионаличност на приложения материал.

Местна администрация на ASO

Проучване на различни методи за приложение на ASO показва, че техните аерозолни форми, ректално приложение и интравитреални инжекции се използват като средства за локално приложение. За лечение на белодробни заболявания е възможно да се създадат относително високи концентрации на ASO в белите дробове с помощта на аерозоли.

Кинетиката на първо поколение ODN е изследвана при мишки. Установено е, че кинетиката на такива лекарства е дозозависима, клирънсът е белодробен с полуживот около 2 часа. За разлика от това, проучванията на модифицирани MOE ASO от второ поколение показват полуживот от повече от 4 дни. Както при други локални лечения, предимството на инхалацията е способността да се създават високи локални концентрации в тъкани, които обикновено не натрупват приложените вещества. В белите дробове ASO обикновено не се натрупва след парентерално приложение. Локалното приложение също рядко причинява системни ефекти. Например, когато ASO се прилага на маймуни в доза от 0,1 mg/kg чрез инхалация (три дози за 1 седмица), концентрацията на лекарството в белите дробове е приблизително 1 μg/g. Но при същите тези маймуни концентрацията в черния дроб и бъбреците е приблизително 5% от концентрацията в белите дробове, което показва значително по-малък системен ефект.

Литературните данни показват, че ректалното приложение на ASO се използва успешно за лечение на улцерозен колит. За разлика от инхалациите, при които могат да се използват малки количества от инжектираното вещество, използваната за лечение клизма може да съдържа до 240 mg от веществото (аликафорсен) от първо поколение. В този случай ректалният епител е изложен на инжектираната субстанция, но поради лошата пропускливост на силно заредените ODN има минимална абсорбция на лекарството, както и общ системен ефект. Изчисленията показват, че концентрацията на ASO в чревния епител 12 часа след приложението е 20 µg/g. Бионаличността при хора варира от 0,03 до 2,14%, а максималната концентрация на ASO, определена в плазмата, е само 0,126 µg/ml. Липсата на значителна системна абсорбция и високата локална концентрация на лекарството имат положителен ефект върху лечението.

Изследвани са интравитреални инжекции на ASO препарати от първо и второ поколение. В този случай веществата се инжектират в окото в много малки количества. Благодарение на изолирането на мястото на инжектиране, системните ефекти на лекарството са намалени в още по-голяма степен. В окото, стъкловидното тяло и ретината ASO навлиза с различни скорости: той навлиза в стъкловидното тяло по-бързо в сравнение с ретината. Както локалният метаболизъм, така и дифузията от окото допринасят за елиминирането на лекарството. Както вече беше отбелязано, поради малките количества, системният ефект на приложеното лекарство е минимален. Механизмът на системно разпределение обаче е подобен на повечето други лекарства.

Ентерално приложение на ASO

Отбелязаната стабилност на ASO от второ поколение към нуклеази осигурява стабилността на лекарството в червата, което прави възможно по-нататъшното му усвояване. Въпреки това, размерът на молекулата и зарядите на ACO ограничават абсорбцията на лекарството. След абсорбция от червата кинетиката на ASO е подобна на тази при парентералното му приложение. Въпреки че черният дроб е едно от основните места за натрупване на ASO, ефектът на първото преминаване през черния дроб не е важен фактор, влияещ върху кинетиката на лекарството ASO.

Разпределение на ASO в тялото

Ролята на перфузията и тъканния афинитет

Разпределението на ASO и други лекарства зависи от пропускливостта, интензивността на кръвоснабдяването, свързването с плазмените протеини, тъканите и клетките. Доказано е, че разпределението на фосфотиоатните ASO от първо и второ поколение в тъканите с техните множество отрицателни заряди и свързването им с протеини е най-малко зависимо от кръвоснабдяването и много повече зависи от факторите, влияещи върху транспорта им в клетката.

Вътрешното разпределение от плазмата към тъканите е относително бързо, елиминационният полуживот е 30-90 минути след интравенозно приложение. Полуживотът на ASO след подкожно приложение е по-дълъг отколкото след интравенозно приложение. Тази разлика се дължи на времето, необходимо за абсорбция, а не на други разлики във фармакокинетиката.

Проучването на кинетиката на лекарства от първо и второ поколение отбеляза леките разлики. По-голямата стабилност към второ поколение ASO нуклеази се компенсира от по-ниското им свързване с протеини. Заедно с това, фармакокинетичните профили на лекарства от 1-во и 2-ро поколение са подобни или почти неразличими, когато сумата от нативния ASO и неговите метаболити (общ ASO) от първото поколение се сравнява с интактното лекарство от второ поколение (ISIS 13650). В противен случай по-бързото унищожаване на ASO от екзонуклеази би съкратило полуживота на лекарствата от първо поколение в сравнение с тези от второ поколение. Разпределението на лекарствата от двете поколения зависи от дозата.

Както е отбелязано по-горе, след абсорбция от мястото на инжектиране или червата, ASOs се свързват с плазмените протеини. Два плазмени протеина, които специфично се свързват с фосфотиоатни ASO, са албумин и алфа-2-макроглобулин. Друг общ протеин, киселинният гликопротеин, не свързва ASO. Свързването с протеини е много важно за разпределението на ASO в прицелната тъкан. Химическите структури, които намаляват свързването, водят до значително намаляване на концентрацията на лекарството в тъканите, повишават степента на неговата филтрация през бъбречните гломерули и екскреция в урината. Това явление може да се наблюдава при използване на ASO с диестерни връзки в скелета на препарата или в присъствието на MOE структура. Намаляването на афинитета на диестери и MOE структури (или и двете) към протеини позволява на ASO да циркулира по-свободно в кръвния поток, което води до интензифициране на неговата екскреция в урината.

Във всички проучвания с парентерални ASO от първо и второ поколение не наблюдавахме линеен клирънс на ASO от плазмата. Клирънсът намалява с увеличаване на дозата на лекарството и следователно неговата бионаличност е по-голяма, отколкото би се очаквало от приложената доза. Тъй като първоначалният клирънс се дължи на разпределението на ASO в тъканите и в същото време се наблюдава абсорбцията на лекарството от тъканите, може да се предположи възможността за тяхното насищане с ASO. Изследването на процеса на насищане в резултат на въвеждането на ASO може да се извърши с помощта на чернодробни фагоцити. Когато свързването на ASO към клетките на Купфер достигне насищане, ще започне намаляване на афинитета. Последващото приложение на ASO на мишки подобрява разпределението на ASO към нефагоцитни чернодробни клетки и в резултат на това фармакологичната активност в хепатоцитите се подобрява в сравнение с контролата. Обратно, при плазмени концентрации под 1 µg/ml, ASO се свързва по-активно с клетките на Купфер и се натрупва по-малко в хепатоцитите.

Изследването на процеса на свързване на ASO с плазмените протеини показа, че този ефект е придружен от бързо разпределение на комплекса в тъканите по клетъчната повърхност. Въпреки че точните механизми на клетъчно свързване не са установени, може да се приеме, че ASO се свързват с плазмените протеини или с клетъчните протеини, докато има свободни места на свързване. След това свързаните ASOs се разпределят по градиента на концентрация през клетъчната мембрана чрез обмен на извънклетъчен протеин с вътреклетъчен.

По този начин движещата сила на навлизането на ASO в клетките е концентрационният градиент. Описано е совалковото движение на ASO между цитоплазмата и ядрото. Като цяло е ясно, че протеиновото свързване улеснява движението на ACO през бариери, които обикновено инхибират движението на силно заредени хидрофилни молекули. Този мембранен совалков механизъм остава хипотеза за ASO, но преди това е описан за органометални съединения. Транспортът на ASO от екстрацелуларния матрикс към вътреклетъчното пространство се визуализира в черния дроб на мишки с помощта на имунохистохимични методи и в бъбреците на плъхове с помощта на витална микроскопия с флуоресцентен етикет за второ поколение ASO (S. Henry, B. Molitoris).

Идентичността на протеините, които контролират транспорта на ASO от извънклетъчното към вътреклетъчното пространство, не е известна, но се смята, че свързването на комплекса протеин-ASO към клетката се осъществява с помощта на фагоцитния рецептор. Тъй като фагоцитите, като клетките на Купфер, тъканните макрофаги и клетките на проксималните тубули, имат висок афинитет към ASO, може да се мисли за възможността за намиране на такива рецептори на тяхната клетъчна повърхност.

Въпреки това, клетъчното разпределение и фармакодинамиката на ASO в трансгенни мишки без SR-A I/II фагоцитен рецептор не се различават от тези на контролните сингенни животни. По този начин този рецептор, известен като Scavenger рецептор, изглежда не е отговорен за усвояването на комплекса от черния дроб и бъбреците. Ролята на други акцепторни структури, участващи в процесите на ендоцитоза на ACO-протеиновия комплекс, не е проучена.

Мембранни протеини, които функционират като носители , присъстват във всички организми. Основните носители на лекарства са: ABC ( ATP-свързващи касетни транспортери)и SLC (семейство носители на разтворени вещества). Известно е, че скоростта на пренос на вещества през биологични мембрани с помощта на процеси, медиирани от транспортери, се характеризира с насищане. Описани са няколко члена на семейството SLC с известни характеристики , главно за транспортиране на нуклеозиди, нуклеозидни захари и фосфатни захари. Има мнение, че бъдещите изследвания най-вероятно ще се отнасят до процесите на междумембранен транспорт на ASO.

Ясно е, че в допълнение към горните разлики в натрупването на структури, създадени от различни органи и тъкани и зависимостта на клирънса и разпределението на такива съединения от тяхната доза, разпределението на ASO в тъканите се влияе от транспортните системи, характеристики на кръвния поток на индивидите, възможното време на престой на лекарството в тялото и накрая насищането на тъканите с ASO. Въпреки значителната роля на тези фактори в процесите на тъканно разпределение на ASO, се смята, че първоначалното свързване на ASO към клетъчната повърхност е един от определящите фактори в анализираните механизми. Това заключение се основава на факта, че черният дроб и бъбреците са първоначалните места на свързване на ASO с известно допълнително натрупване през първите 24 часа след приложението на ASO. При изследване на параметрите на разпределение на ASO в черния дроб и бъбреците е показано частично увеличение на концентрацията на лекарството в органите през първите 24 часа. Това се случва по време на период на клетъчно и субклетъчно преразпределение на ASO, но вероятно органите за първично разпределение трябва да натрупат повече материал с течение на времето поради по-големия афинитет на тези органи към ASO. Протеините, отговорни за този афинитет, може да съдържат хепарин-подобни свързващи места за ламинин и фибриноген и фибробластен растежен фактор (FGF). Ранното взаимодействие на ASO с клетката може да се дължи на свързването на тези протеини, но природата на тези протеини, както е отбелязано по-горе, е малко проучена.

Като се има предвид значението на комбинацията от специфични места за свързване на ASO с клетки в разпределението на лекарството в тялото, трябва да се отбележи и такъв важен фактор като различно кръвоснабдяване на различни органи, чиято възможност да повлияе на различното разпределение на фосфотиоат ASO е очевидно. Според различни автори работата с десетки серии от вещества както от първо, така и от второ поколение показва тяхното сходно разпределение и забележимо подобно разпределение при индивиди от различни видове. Бъбреците, черният дроб, лимфните възли, далака и костния мозък са органите, които натрупват най-голямо количество ASO и техните метаболити. Фактът, че белите дробове и сърцето не натрупват ASO показва, че за да се обясни изразеното натрупване на ASO в черния дроб и бъбреците не е достатъчно само едно обяснение за тяхното добро кръвоснабдяване. Например, зоните с най-добро кръвообращение в бъбреците са гломерулите и те не са зоните, съдържащи повече ASO. Напротив, в проксималните тубули кръвообращението е по-малко активно. Въпреки това, клетките на проксималните тубули се характеризират с голям брой активно фагоцитни клетки, натрупват свободни ASO, както и ASO, свързани с протеини, които обикновено се реабсорбират в проксималните тубули. В резултат на това бъбречната кора и проксималния тубуларен епител съдържат най-високата концентрация на фосфотиоатни ASO, както първо, така и второ поколение.

Трябва също така да се отбележи, че кръвоснабдяването (ml/g тъкан) на черния дроб е приблизително 20% от това на бъбреците. 4-5-кратни разлики в перфузията между бъбреците и черния дроб не водят до 4-5-кратни разлики в концентрацията на ASO в тези органи. Фенестрираните капиляри увеличават площта на контакт между ASO и кръвния поток и следователно това може да компенсира недостатъчната перфузия на черния дроб спрямо бъбреците.

Свързване на ASO с плазмените протеини по време на разпределение

Въпреки че насищането на клетките с ASO в крайна сметка засяга тяхното разпределение в органите, свързването на ASO с плазмените протеини може да промени разпределението в бъбреците и черния дроб в различни серии. Има серийни разлики в протеиновото свързване. С намаляване на свързването на ASO с плазмените протеини, натрупването им в черния дроб намалява и натрупването им в бъбреците се увеличава. Обратно, при по-високо свързване, концентрацията на ASO в свободна форма в кръвния поток ще бъде в по-малко количество, ще се натрупва по-малко в бъбреците и повече в други органи. Съществува обратна връзка между степента на свързване на ASO с протеина и тяхното натрупване в бъбреците на плъхове и маймуни след многократно интравенозно и подкожно приложение.

Свързването с протеин може да се използва като критерий за избор на ASO за клинични изпитвания. Към днешна дата определянето на свързването с протеини е емпиричен процес без начин да се предвиди коя серия ще се свърже повече или по-малко с протеините.

Разпределение на ASO в други органи

Независимо от последователността на разпределение на фосфотиоатните ASO от първо и второ поколение, се наблюдава характерен модел на локализиране на тези лекарства в бъбреците и черния дроб, както и в далака и лимфните възли, костите и в цитоплазмата на адипоцитите. Натрупването на ASO в лимфоидната тъкан може да се обясни отчасти с фагоцитната активност на хистиоцити и други мононуклеарни клетки. Възможно е да се визуализира ASO в хистиоцитни фаголизозоми и тъкани на макрофаги, като се използва оцветяване с хематоксилин. Доказано е, че ASO претърпяват ендоцитоза, локализират се в ендозоми и остават в тези структури. Концентрацията на ASO във фаголизозомите често е такава, че може да се определи чрез оцветяване с хематоксилин (почти като ядрена ДНК). ASO във фаголизозомите вероятно съставлява по-голямата част от ASO, натрупан в далака и лимфоидните органи. В допълнение, фагоцитно активните клетки на костите и костния мозък натрупват ASO в тези тъкани, което се потвърждава от наличието на базофилни гранули в техните клетки.

Мускулите (както скелетните, така и сърдечните) не съдържат значителни количества ASO. Въпреки това, внимателното изследване на мускулите с помощта на имунохистохимични или авторадиографски методи разкрива съдържание на ASO във фаголизозомите на макрофагите на мускулната строма и това натрупване може частично да повлияе на измерването на концентрацията на ASO в мускулите и сърцето.

Натрупването на ASO в цитоплазмата на адипоцитите е значимо от терапевтична гледна точка. Особено защото, за разлика от повечето вещества, натрупани в адипоцитите, ASO са хидрофилни. Имунохистохимичните методи ясно показват, че ASO се намира в цитоплазмената фракция на адипоцитите, докато ASO почти липсва в мастната вакуола. Интензитетът на оцветяване показва значително натрупване на веществото в цитоплазмата. Например, при маймуни след 13 седмици лечение с ISIS 113715 в доза от 10 mg/kg/седмично, концентрацията в черния дроб е 301 ± 88,1 μg/g, но само 37,3 ± 14,4 μg/g в мастната тъкан в същите животни.

Като се има предвид, че немасленият компонент съставлява 10% от общата мастна маса, корекцията на концентрацията на ASO, като се вземе предвид този показател, показва сравнимостта на концентрацията му с тази в черния дроб. Значителни концентрации на ASO в адипоцитите показват, че те могат да се използват за лечение на генетични заболявания на този тип клетки: източници на хормони и цитокини. Така беше установено, че фармакологично активните концентрации на ASO се регистрират в адипоцитите на мишки, когато ISIS 113715 се прилага в доза от 25 mg/kg два пъти седмично и намаляват експресията на PTP-1B целевия ген както в черния дроб, така и в адипоцити. Подобни наблюдения са направени при маймуни, третирани с ASO ISIS 113715. Тъй като биопсията на подкожната мазнина може да се извърши клинично и тъй като активните ASO се натрупват в мазнините, мазнините могат да се използват за биопсия и директно измерване на фармакологичните ефекти (намаляване на иРНК) и тъканната концентрация на лекарството в човешки тъкани.

Фосфотиоатните ASO също се разпределят в други тъкани. Имунохистохимичните изследвания показват, че ендотелните клетки натрупват ASO в концентрации, достатъчни да намалят нивата на иРНК, което ги прави потенциална цел за фармакологична интервенция. В някои тъкани техните концентрации не са достатъчно високи за фармакологичен ефект. Например, зрелите лимфоцити не натрупват ASO и антисенс активността е ограничена от Т клетките.

Костните клетки, особено фагоцитно активните остеобласти, могат да натрупват ASO и този ефект може да се използва за терапевтични цели. В допълнение, островните клетки на панкреаса също натрупват ASO. Както първото, така и второто поколение ASO са силно заредени, хидрофилни молекули, които не преминават кръвно-мозъчните или кръвно-тестикуларните бариери. Въпреки това, както в мускулите, макрофагите, съдържащи откриваеми ASO, са локализирани в интерстициалната област на тестисите. Яйчниците не са разделени от бариера, така че ASO може да бъде количествено измерен в яйчниците и визуализиран чрез имунохистохимия в стромата.

Ограниченото разпределение на плазмения ASO в мозъчни клетки и кардиомиоцити прави тези тъкани малко вероятни мишени за антисенс интерференция, въпреки че селективното инхибиране или експресия на определени протеини на йонни канали в мозъка и мускулите може да бъде терапевтично полезно. Въпреки това, ограниченото разпространение на ASO в тези тъкани може да се разглежда като предимство. Липсата на значителни концентрации на ASO в мозъка и сърцето намалява риска от увреждане на централната нервна система (ЦНС) и намалява проявата на нежелани сърдечни ефекти. Както беше отбелязано по-рано, директното прилагане към структурите на ЦНС, по-специално мозъка, чрез интратекална, интравентрикуларна инфузия или инжекция причинява разпределение на ASO в централната нервна система и може да бъде полезно терапевтично.

По време на бременност плодът е доста добре защитен от ефектите на антисенс лекарствата. Проучването на трансплацентарната кинетика на ASO не разкрива натрупването му в плода; при гризачи в плацентата е отбелязано ниско ниво на ASO. Тези резултати са последователно повторени в изследване за тератогенност на различни ASO от второ поколение при мишки, плъхове и зайци. Плацентата, въпреки че е силно перфузирана, не е орган с високо натрупване на ASO.

Като цяло представените факти показват, че разпространението на ASO е един от ключовите фактори, които определят тежестта на активността на ASO. Разликите в разпределението на ASO изглежда са свързани до голяма степен с тъканния тропизъм за тези лекарства и, в по-малка степен, с перфузията.

Метаболизъм

Антисенс лекарствата от първо и второ поколение се метаболизират от нуклеази, а не от оксидазни системи от тип цитохром Р450, които се използват за метаболизиране на конвенционалните липофилни лекарства с малка молекула. ASO не е нито субстрат за изоензимите на цитохром Р450, нито индуцира или инхибира тяхната активност при клинично значими концентрации. Медиираното от екзонуклеаза ASO разцепване, което е основният път за метаболизъм и изчистване на фосфотиоатни ODN от първо поколение, е вторично спрямо ASO от второ поколение. Екзонуклеазната активност е ограничена от два фрагмента: един MOE в 3' края и друг MOE в 5' края.

Ензими, отговорни за метаболизма на ASO

Не са известни специфични ензими, които метаболизират ASO от второ поколение. Нуклеазите са повсеместни и е възможно да се открият разградени метаболити на ASO в повечето тъкани. Чернодробните и бъбречните хомогенати са в състояние да метаболизират второ поколение ASO in vitro без добавяне на екзогенни енергийни източници като никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) или аденозин 5-трифосфат (ATP). Първоначалното разцепване води до два продукта, всеки характеризиращ се с 5" и 3" MOE защитен край. Тези метаболити не се свързват с протеини и по този начин се екскретират от тъканите. Тъй като метаболитите се отстраняват по-бързо, отколкото се образуват, практически няма натрупване на метаболити в тъканите. По този начин не е възможно да се използва определянето на количеството на метаболитите в тъканите като индекс на ASO метаболизма в тъканите.

Тъй като скоростта на елиминиране на ASO от тъканите зависи от техния метаболизъм, разликите в метаболизма на ASO в различни тъкани могат да бъдат оценени въз основа на полуживота на тези лекарства от характеризираните тъкани. Въз основа на данни за четири ASO от второ поколение се заключава, че поведението на членовете на този клас е подобно, но има леки разлики в техния полуживот от черния дроб и бъбреците на маймуни, третирани с лекарството в продължение на 4-13 седмици . Доказано е, че полуживотът на препаратите ACO ISIS 104838 и 112989 от черния дроб и бъбреците е много сходен. Тези данни предполагат, че за някои серии от ASO няма значителни разлики в скоростта на метаболизма в различните органи. Въпреки това, разликите в тъканния полуживот са идентифицирани за ISIS 107248, 113715 и 301012. Наблюдаваните разлики в скоростта на метаболизъм на ASO лекарства в черния дроб и бъбреците показват, че може да има разлики в скоростта на метаболизъм в различните тъкани , или по-сложна кинетика за някои продуктови серии или резултатите просто отразяват малък брой проби, взети за ограничен период от време.

Подробно изследване на процеса на екскреция на ASO от второ поколение показва наличието на различна скорост на екскрецията им от различни видове чернодробни клетки. Тъй като някои видове клетки, като проксималните тубулни клетки на бъбречната кора, са склонни да съдържат ASO във фаголизозомите, този тип поглъщане вероятно обяснява разликите в скоростите на метаболизма на лекарствата в различните тъкани. В допълнение, вероятно е специфични последователности в структурата на ASO скелета да се характеризират с различна чувствителност към разцепване от ендонуклеази.

Бактериалните екзонуклеази показват висока степен на специфичност за нуклеотидната последователност в ASO гръбнака, вероятно за защита срещу вируси. Голяма част от активността на нуклеазите в клетките на бозайниците е свързана с механизмите на транскрипция и възстановяване на ДНК и по този начин видовата специфичност на бозайниците може да се различава от тази на бактериалните ендонуклеази. Не е известно дали процесите на репликация и действието на ензимите, свързани с феномена на възстановяване, са еднакво отговорни за катаболизма на тези синтетични ASO. При високи концентрации на ssDNA, ASO могат ефективно да се конкурират с естествения субстрат. Много ензими от семейството на нуклеазите са способни да катаболизират ASO. Определянето на специфични ензими, участващи в метаболизма на ASO, не е критично за разработването на антисенс лекарства, но по-доброто разбиране на метаболитните пътища ще бъде полезно за разработването на нови технологии.

ASO метаболити

Разликите в метаболизма на ASO от първо и второ поколение са доста очевидни при сравняване на метаболитния профил с CGE. Когато проби от тъкан или урина се анализират в LC/MS детектор, природата на метаболитните процеси става по-ясна. Обикновено фосфоротиоатните ODN от първо поколение се метаболизират в каскада от ASO метаболити, всеки от които се различава с един нуклеотид в резултат на разцепване на единичен нуклеотид от екзонуклеаза. По този начин, след въвеждането на 20-mer, тоест състоящ се от 20 нуклеотида, ODN от първо поколение, плазмата и тъканите съдържат семейства от последователно съкратени ASO, като се започне от 19-mer и по-нататък до кратък ASO.

Първоначално разцепване в метаболизма на ASO от второ поколение, медиирано от
ендонуклеази, води до образуването на две ASO, едната с 3' края на MOE, а другата с 5' края на MOE. Разцепването на продукти с незащитени краища може да се извърши или от 5'-екзонуклеаза, или от 3'-екзонуклеаза. Резултатите от комбинираната ендо- и екзонуклеазна активност са каскада от верижно съкратени продукти на разцепване, много, ако не всички, от които могат да бъдат открити в урината, събрана от опитни животни или хора. Урината на третирани животни или пациенти, лекувани с ASO от второ поколение, може да съдържа метаболити, които варират от два възможни 15-mer до два възможни 5-mer MOE и множество комбинации от всеки от междинните метаболити.

Метаболити, по-къси от дължината на краищата на MOE, ще присъстват в тъканите, ако самите краища на MOE са субстрати за нуклеази. Тези метаболити обикновено не се откриват чрез масов спектрален анализ, което предполага, че по правило няма MOE мононуклеотиди, освободени по време на метаболизма. Има обаче някои изключения от това обобщение. За ограничен брой нуклеотидни последователности , второ поколение ASO единични нуклеотидни подстригвания, наблюдавани в тъкани и плазма – CGE или LC/MS: метаболитите изглежда са резултат от екзонуклеазно разграждане. Тези метаболити могат да се наблюдават при първоначалното разпределение. Предполага се, че те бързо се появяват в кръвната плазма. MOE мононуклеотидите, които се образуват по време на метаболизма, не са субстрати за фосфорилиране и следователно е малко вероятно да бъдат включени в нуклеотидните трифосфати и в крайна сметка в ендогенните нуклеотиди. MOE мононуклеотидите не инхибират ензимите, отговорни за синтеза на ДНК. По този начин, MOE мононуклеотидите, ако се образуват, не трябва да се включват в ендогенни нуклеотиди.

Централната част на дезоксинуклеотидите от второ поколение ASO е обект на екзонуклеазно разцепване, което води до освобождаване на един нуклеотид. Монодезоксинуклеотидите, които се получават чрез екзонуклеазно разцепване, са идентични с ендогенните нуклеотиди, с изключение на тиофосфатната група, която теоретично може да присъства. Въпреки това, тиофосфатната група е лабилна към окисление и загуба на сяра, което прави крайната фосфатна група идентична с ендогенните нуклеотиди. Следователно, за разлика от MOE мононуклеотидите, всеки освободен дезоксинуклеотид ще бъде естествено включен във вътреклетъчното депо на ендогенни нуклеотиди. Нуклеотиди, които задържат тиофосфатни групи, ще бъдат субстрати за добавяне на една или две фосфатни групи, което води до смесени нуклеотидни тиофосфатни ди- или трифосфати. Фосфорилирането е възможно, но наличието на алфа тиофосфат прави реакциите термодинамично неблагоприятни.

Заключение

Значението на изследването на фармакокинетиката на данни и лекарства, подобни на описаните, както и създаването на модели върху различни животински видове за пълно разбиране на процесите, протичащи в организма след приема на лекарствата, е очевидно. В Русия също се провеждат проучвания на такива лекарства.

Литература

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. Изпитване фаза I на ISIS 2503, антисенсивен инхибитор на H-ras, в комбинация с гемцитабин при пациенти с напреднал рак. // клиника. Cancer Res. 2003 том. 9, #1. стр. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) е ODN-свързващ протеин. // Nat. Med. 1997 том. 3, № 4. С. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Свързване на фосфоротиоатни ODN с основен фибробластен растежен фактор, рекомбинантен разтворим CD4, ламинин и фибронектин независимо от P-хиралността. // Nucl. Киселини Res. 1995 том. 23, № 21. С. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. и др. In vitro съдба на фосфоротиоатни антисенс ODNs: преобладаващо поглъщане от рецептори за почистване на ендотелни клетки. // Nucl. Киселини Res. 1997 том. 25, № 16. С. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. и др. Модулиране на свързването с плазмени протеини и in vitro усвояване на фосфоротиоатни ODN от чернодробни клетки чрез конюгиране на холестерол. // Nucl. Киселини Res. 2000 том. 28, № 14. С. 2717.

6. Браун D.A., Kang S.H., Грязнов S.M. и др. Ефект на фосфоротиоатна модификация на ODNs върху специфично протеиново свързване. // J. Biol. Chem. 1994 том. 269, № 43. Р. 26801.

7. Бътлър М., Крук Р.М., Греъм М.Дж. и др. Фосфоротиоатните ODNs се разпределят по подобен начин в мишки с нокаут на рецептора на чистач клас А и мишки от див тип. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2000 том. 292, № 2. С. 489.

8. Бътлър М., Хейс К.С., Чапел А., Мъри С.Ф., Якш Т.Л., Хуа X.Y. Спинално разпределение и метаболизъм на 2_-O-(2-метоксиетил)-модифицирани ASO след интратекално приложение при плъхове. // Неврология. 2005 том. 131, № 3. С. 705.

9. Бътлър М., Стекър К., Бенет К.Ф. Клетъчно разпределение на фосфоротиоатни ODN в нормални тъкани на гризачи. //Лаборатория. Инвестирам. 1997 том. 77, № 4. С. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Изхвърляне на 14C-маркирания фосфоротиоат ASO ISIS 2105 след интравенозно приложение на плъхове. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1993 том. 267, № 3. С. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. и др. Фармакокинетика на 14C-маркиран фосфоротиоат ASO, ISIS 2105, след интрадермално приложение на плъхове. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1994 том. 269, № 1. стр. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. и др. Фармакокинетични свойства на няколко нови ASO аналози при мишки. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1996 том. 277, № 2. С. 923.

13. Драйвър С.Е., Робинсън Г.С., Фланаган Дж., Шен У., Смит Л.Е.Х., Томас Д.У., Робъртс П.К. Базирано на ASO инхибиране на експресията на ембрионален ген. // Nat. Биотехнология. 1999 том. 17. С. 1184.

14. Eckstein F. Phosphorothioate ODNs: какъв е техният произход и какво е уникалното за тях? // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2000 том. 10, #2. Р. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Он-лайн HPLC електроспрей масспектрометрия на фосфоротиоатни ASO метаболити. // Анален. Chem. 1997 том. 69, № 3. С. 313.

16. Гиъри Р.С. Текуща оценка на PK/PD връзките за антисенс терапевтици. // Световен конгрес по фармация и фармацевтични науки, Ница, Франция, 2002 г.

17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. et al. Липса на фармакокинетично взаимодействие за ISIS 113715, 2_-O-метоксиетил модифициран антисенс олигонуклеотид, насочен към протеинова тирозин фосфатаза 1B информационна РНК, с перорални антидиабетни съединения метформин, глипизид или розиглитазон. // клиника. Pharmacokinet. 2006 том. 45, № 8. С. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Фармакокинетика и метаболизъм при мишки на фосфоротиоатен ASO антисенс инхибитор на експресията на C-raf-1 киназа.// Drug Metab. Dispos. 1997 том. 25, № 11. Р. 1272.

19. Гиъри Р.С., Лийдс Дж.М., Хенри С.П., Монтейт Д.К., Левин А.А. Антисенс олигонуклеотидни инхибитори за лечение на рак: 1. Фармакокинетични свойства на фосфоротиоатни ODN. // Противораково лекарство Des. 1997 том. 12, № 5. Р. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Независима от последователността плазмена и тъканна фармакокинетика за 3 антисенс фосфоротиоатни ASO: мишка към човек. // в Американската асоциация на фармацевтичните учени, Pharm. Изследвания, Plenum Press, Сиатъл, Вашингтон. 1996. Р. С.

21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. et al. Първо преминаване на чернодробна екстракция на частично модифицирани химерни антисенс олигонуклеотиди при кучета Бийгъл. // в годишната среща на Американската асоциация на фармацевтичните учени, Индианаполис, IN, 2000 г. P. 216.

22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L et al. Фармакокинетични свойства на 2_-О-(2-метоксиетил)-модифицирани ASO аналози при плъхове. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2001 том. 296, № 3. R. 890.

23. Гири Р.С., Ю Р.З., Левин А.А. Фармакокинетика на фосфоротиоатни антисенс ODN. // Curr. мнение Инвестирам. лекарства. 2001 том. 2, #4. Р. 562.

24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. et al. Фармакокинетика на тумор некрозис фактор-алфа фосфоротиоат 2_-O-(2-метоксиетил) модифицирани антисенс олигонуклеотиди: сравнение между видовете. // Drug Metab. Dispos. 2003 том. 31, № 11. С. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Мембранни транспортери и лекарствен отговор, в Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th ed., Brunton, LL, ed., McGraw-Hill, Ню Йорк, 2006. P. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Нокдаун на цитопротективния ген, клъстерин, за подобряване на хормоналната и хемочувствителността при рак на простатата и други видове рак. // Ann. NY Acad. наука 2005. Том 1058. P.1.

27. Gleave M., Miyake H. Използване на антисенс олигонуклеотиди, насочени към цитопротективния ген, клъстерин, за повишаване на андроген- и химио-чувствителността при рак на простатата. // World J. Urol. 23. 2005. № 1. стр. 38.

28. Глоувър Дж.М., Лийдс Дж.М., Мант Т.Г. и др. Фаза I на безопасност и фармакокинетичен профил на междуклетъчна адхезионна молекула-1 антисенс ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Там. 1997 том. 282, № 3. Р. 1173.

29. Греъм M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. и др. In vitro разпределение и метаболизъм на фосфоротиоат ASO в черния дроб на плъх след интравенозно приложение. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1998 том. 286, № 1. С. 447.

30. Гувакова M.A., Якубов L.A., Влодавски I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Фосфоротиоатните ODNs се свързват с основния фибробластен растежен фактор, инхибират свързването му с рецепторите на клетъчната повърхност и го отстраняват от местата на свързване с нисък афинитет върху извънклетъчния матрикс. // J. Biol. Chem. 1995 том. 270. P.2620.

31. Хенри С.П., Дени К.Х., Темплин М.В., Ю Р.З., Левин А.А. Ефекти на човешки и миши антисенс олигонуклеотидни инхибитори на ICAM-1 върху репродуктивната способност, феталното развитие и постнаталното развитие при мишки. // Вродени дефекти Res. Бдев. размножаване. Токсикол. 2004 том. 71, бр.6. С. 359.

32. Hua XY, Moore A., Malkmus S. et al. Инхибирането на експресията на спинална протеин киназа С алфа от антисенс олигонуклеотид отслабва толерантността, предизвикана от инфузия на морфин. // Неврология. 2002 том. 113, № 1. стр. 99.

33. Джаксън J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Инхибирането на ангиогенезата от антисенс олигонуклеотиди към клъстерин. // Ангиогенеза. 2005 том. 8, № 3. стр. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. и др. Мощно намаляване на аполипопротеин B и липопротеин холестерол с ниска плътност чрез краткотрайно приложение на антисензивен инхибитор на аполипопротеин B. // Circulation. 2006 том. 114, № 16. С. 1729.

35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Стереодиференция – ефектът на P хиралността на олиго(нуклеозидни фосфоротиоати) върху активността на бактериалната РНКаза Н. // Nucl. Киселини Res. 1995. Том 23, № 24. 5000 р.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Фармакокинетични свойства на фосфоротиоатни ASOs при хора, в Antisense Research and Applications, 1-во издание, Crooke, S.T., ed., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Сравнение на фармакокинетиката на подкожно и интравенозно приложение на фосфоротиоатен олигодезоксинуклеотид при маймуни cynomolgus. // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Том 10, № 6. Р. 435.

38. Левин А.А. Преглед на проблемите във фармакокинетиката и токсикологията на фосфоротиоатни антисенс олигонуклеотиди. // Biochim. Biophys. акта. 1999. Vol.1489, No.1. Р. 69.

39. Левин А.А., Гири Р.С., Лийдс Дж.М. и др. Фармакокинетиката и токсичността на фосфоротиоатните ASOs, в Biotechnology and Safety Assessment, 2nd ed., Thomas, JA, ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. P. 151.

40. Левин А.А., Хенри С.П., Бенет К.Ф. и др. Предклинично развитие на антисенс терапевтици, в Нова терапия от съвременната биотехнология: от лабораторно до тестване на хора, 1-во издание, Oxender D.L. и Post L.E., изд., Springer-Verlag, Хайделберг, Германия, 1998 г., стр. 131.

41. Левин А.А., Хенри С.П., Монтейт Д., Темплин М. Токсичност на антисенс олигонуклеотиди. // в Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., ed., Marcel Dekker, Ню Йорк, 2001. P. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. и др. Характеризиране на транспорта на ASO в живи клетки. //Процес. Natl. акад. наука САЩ. 1989 том. 86. С. 3474.

43. Лоренц П., Мистели Т., Бейкър Б.Ф., Бенет К.Ф., Спектор Д.Л. Нуклеоцитоплазмено преместване: ново in vitro свойство на антисенс фосфоротиоатни ODN. // Nucl. Киселини Res. 2000 том. 28, № 2. С. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Бионаличността и терапевтичната активност на alicaforsen (ISIS 2302) се прилага като ректална задържаща клизма на пациенти с активен улцерозен колит. // Ailment Pharmacol. Там. 2006 том. 23, № 10. Р. 1427.

45. Mou T.C., Грей D.M. Високият афинитет на свързване на фосфоротиоат-модифицирани олигомери за Ff ген 5 протеин се модерира чрез добавяне на С-5 пропин или 2_-О-метил модификации. // Nucl. Киселини Res. 2002 том. 30, № 3. Р. 749.

46. ​​​​Никлин П.Л., Крейг С.Дж., Филипс Дж.А. Фармакокинетични свойства на фосфоротиоати при животни - абсорбция, разпределение, метаболизъм и елиминиране, в Antisense Research and Applications, 1-во издание, Crooke, S.T., ed., Springer, Berlin, 1998. P. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Тъканно разпределение и физиологично базирана фармакокинетика на антисенс фосфоротиоат ASO ISIS 1082 при плъх. // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2001 том. 11, #1. стр. 15.

48. Phillips JA, Craig S.J., Bayley D. et al. Фармакокинетика, метаболизъм и елиминиране на 20-мерен фосфоротиоат ODN (CGP 69846A) след интравенозно и подкожно приложение. // Biochem. Pharmacol. 1997 том. 54, бр.6. Р. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Разполагане на ASOs в изолиран перфузиран бъбрек на плъх: участие на рецептори за почистване в тяхното бъбречно поглъщане. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1996 том. 279, № 1. стр. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Бейкър B.F. и др. Фаза I на изпитване на ISIS 104838, 2_-метоксиетил модифицирани антисенс олигонуклеотиди, насочени към тумор некрозис фактор-алфа. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2002 том. 303, № 3. Р. 1334.

51 Slim G., Gait M.J. Конфигурационно дефинирани фосфоротиоат-съдържащи олигорибонуклеотиди при изследване на механизма на разцепване на рибозими с глава на чук. // Nucl. Киселини Res. 1991 том. 19, № 6. Р. 1183.

52. Снайдер Р.М., Мирабели К.К., Крук С.Т. Клетъчна асоциация, вътреклетъчно разпределение и изтичане на ауранофин чрез последователни реакции на обмен на лиганд. // Biochem. Pharmacol. 1986 том. 35, № 6. С. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. и др. Майчино и фетално разпределение на фосфоротиоат ASO при плъхове след интравенозна инфузия. // Вродени дефекти Res. Бдев. размножаване. Токсикол. 2006 том. 77, № 1. стр. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Инхибиране на дезоксирибонуклеази от фосфоротиоатни групи в олигодезоксирибонуклеотиди. // Nucl. Киселини Res. 1988 том. 16, #24. Р. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Фармакокинетика и ефект на първо преминаване през черния дроб на антисенс олигонуклеотид (ISIS 2302) при плъхове. // в годишната среща на Американската асоциация на фармацевтичните учени, Индианаполис, IN, 2000 г. P. 216.

56. Темплин М.В., Левин А.А., Греъм М.Дж. и др. Фармакокинетичен и токсичен профил на фосфоротиоат ASO след инхалационно доставяне в белия дроб при мишки. // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2000 том. 10, № 5. Р. 359.

57. Теплова М., Минасов Г., Терешко В. и др. Кристална структура и подобрени антисенс свойства на 2_-O-(2-метоксиетил)-РНК. // Nat. Структура. Biol. 1999. Том 6, № 6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. и др. Проучване фаза I/II на LY900003, антисенс инхибитор на протеин киназа С-алфа, в комбинация с цисплатин и гемцитабин при пациенти с напреднал недребноклетъчен рак на белия дроб. // клиника. Cancer Res. 2004 том. 10, № 18 Pt 1. P. 6086.

59. Уатанабе Т.А., Гири Р.С., Левин А.А. Свързване с плазмен протеин на антисенс олигонуклеотид, насочен към човешки ICAM-1 (ISIS 2302). // ASO. 2006 том. 16, № 2. стр. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Хидратация на едноверижни фосфодиестерни и фосфоротиоатни олигодезоксирибонуклеотиди. // Nucl. Киселини Res. 1996 том. 24, № 16. Р. 3261.

61. Уилсън Д.М. Трето, абазичната ендонуклеазна активност на Ape1 се регулира от концентрациите на магнезий и калий и е устойчива на алтернативни ДНК структури. // J. Mol. Biol. 2005 том. 345, № 5. С. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. et al. Стереообогатени фосфоротиоатни ODN: синтез, биофизични и биологични свойства. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Т.8, №1. Р. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Разработване на ултрачувствителен неконкурентен хибридизационно-лигиращ ензимно-свързан имуносорбентен анализ за определяне на фосфоротиоат ODN в плазма. // Анален. Biochem. 2002 том. 304, № 1. стр. 19.

64. Ю Р.З., Гиъри Р.С., Лийдс Дж.М. и др. Сравнение на фармакокинетиката и тъканното разположение на антисенс фосфоротиоат ASO, насочен към човешка Haras иРНК при мишка и маймуна. // J. Pharm. наука 2001 том. 90, #2. стр. 182.

65. Ю Р.З., Гири Р.С., Левин А.А. Приложение на нови количествени биоаналитични методи за фармакокинетични и фармакокинетични/фармакодинамични оценки на антисенс олигонуклеотиди. // Curr. мнение наркотици дисков. разработка 2004 том. 7, #2. Р. 195.

66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. et al. Кръстосано видово фармакокинетично сравнение от мишка към човек на второ поколение антисенс олигонуклеотид ISIS 301012, насочен към човешки аполипопротеин B-100. // Drug Metab. Dispos. 2007 том. 35. С. 460.

67. Ю Р.З., Джан Х., Гири Р.С. и др. Фармакокинетика и фармакодинамика на антисенс фосфоротиоат ASO, насочен към Fas mRNA при мишки. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2001 том. 296, № 2. С. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. и др. PTP1B антисенс олигонуклеотид понижава PTP1B протеина, нормализира кръвната глюкоза и подобрява инсулиновата чувствителност при мишки с диабет. //Процес. Natl. акад. наука САЩ. 2002 том. 99, #17. С. 1137.

Лекарство за гените

Дългогодишната мечта на лекарите е да имат на разположение вещества, които да действат върху определени гени, т.е. основната причина за много заболявания. Всъщност въз основа на такива вещества е възможно да се създадат лекарства - истински "магически куршуми", които могат да повлияят на наследствения материал на различни инфекциозни агенти, без да навредят на човешкото тяло, както и да потиснат активността на онкогените, отговорни за растежа на злокачествените клетки. Създаването на такива вещества, които имат пряк ефект върху генетичния материал, е една от основните задачи на молекулярната биология, тъй като те могат да бъдат използвани за изследване на функциите на гените и в крайна сметка да контролират работата на последните.

Но как можете да промените желаната генетична програма? В края на краищата всички гени имат подобен химичен състав и структура: разликите между тях се свеждат само до реда на редуване на четири мономерни блока - нуклеотиди A, T, G, C. За да действа върху определен ген, молекулата на веществото трябва по някакъв начин да разпознае тази нуклеотидна последователност - задачата, на пръв поглед, нерешима.

Но група сибирски химици, които дойдоха в новосибирския Академгородок в първите години от създаването му, смятаха друго. Въз основа на принципа на молекулярно разпознаване, използван от самата природа, служителите на Института по органична химия на Сибирския клон на Академията на науките на СССР (Новосибирск) групи Н. И. Гринева и Д. Г. Първата работа върху олигонуклеотидите е публикувана от сибирски химици през 1967 г. - тази дата днес се счита за официална дата на появата на ново направление в молекулярната биология и фармакология.

Те бяха първите

Изпълнението на този необичаен по своята смелост проект (по това време дори не е планирано да се извършват подобни изследвания никъде по света) в началния етап беше извършено от малка група млади служители, докторанти и студенти от НСУ. Трябваше да започнем практически от нулата, тъй като по това време те все още не знаеха как да синтезират олигонуклеотиди в забележими количества; не е имало технически инструменти, необходими за работа с малки количества нуклеинови киселини и ефективен метод за определяне на тяхната последователност. Нашите химици успяха да разрешат тези проблеми благодарение на интердисциплинарността - един от принципите, които са в основата на дейността на Сибирския клон.

NIOC организира производството на нуклеинови киселини, разработи методи за химичната им модификация; съвместно със служители на Института по ядрена физика беше възможно да се създадат устройства за анализ на нуклеинови киселини и манипулиране с техните малки количества и заедно с химици от Московския държавен университет те започнаха работа по създаването на автоматични синтезатори на олигонуклеотиди. В резултат на това практически всички необходими аналитични методи и инструменти бяха на разположение на учените - биологичните изследвания можеха да започнат.

Експерименти, проведени първо върху прости модели и след това върху естествени нуклеинови киселини, показаха, че олигонуклеотидите наистина взаимодействат с целевите нуклеинови киселини с висока степен на селективност. В случай, когато реактивни групи са прикрепени към олигонуклеотидите, възниква целенасочена химична модификация на целевите нуклеинови киселини. Освен това за първи път беше демонстрирано, че тези реактиви могат да се използват за потискане на вирусни инфекции при животните и е доказана възможността за въвеждането им в тялото през кожата и лигавиците и др.

Ранните публикации за биологичните ефекти, произвеждани от олигонуклеотидите, предизвикаха голям интерес сред специалистите по света. През 1988 г. в Академгородок се провежда първият в света симпозиум за генно-насочени вещества на базата на фрагменти от нуклеинова киселина. Учени от САЩ, Франция, а след това и други страни се присъединиха към работата по създаването на такива лекарства; Появиха се десетки компании с цел създаване на терапевтични лекарства на базата на олигонуклеотиди.

Допълнителна медицина

Така наречените антисенс олигонуклеотиди, предназначени за селективно инактивиране на вирусни РНК и някои клетъчни РНК, станаха първите от генно-насочените лекарства. Първоначално се предполагаше, че реактивни групи ще бъдат прикрепени към тези олигонуклеотиди, които трябва химически да модифицират или унищожат целевите нуклеинови киселини. Оказа се обаче, че прикрепването на олигонуклеотиди към целевата РНК само по себе си има толкова силен ефект върху нея, че може да провокира разрушаването й от клетъчни ензими.

Д. Г. КНОРЕ - академик на Руската академия на науките, специалист в областта на химическата кинетика, молекулярната биология и биоорганичната химия. Ръководител на лабораторията по химия на природните полимери (1960-1984), отдел по биохимия и лаборатория по химия на нуклеиновите киселини (1970-1984) на Института по органична химия на Сибирския клон на Академията на науките на СССР, директор на института по биоорганична химия на Сибирския клон на Академията на науките на СССР и Сибирския клон на Руската академия на науките (1984-1996). Антисенс подходите, базирани на използването на нуклеотиди и нуклеинови киселини за потискане на биологичната активност на нуклеиновите киселини, предлагат интересни перспективи в случаите, когато е необходимо да се потисне внедряването на нежелана информация в живите организми. На първо място, отваря се перспективата за създаване на ново поколение антивирусни и противотуморни лекарства. Такива лекарства имат едно неоспоримо предимство пред другите... Всички олигонуклеотиди, независимо от целта, към която са насочени, могат да бъдат създадени по една единствена технология. Трябва да се променя само последователността на нуклеотидите. По-специално във вирусологията и онкологията често трябва да се сблъскате с такова явление като появата на лекарствена резистентност. Това се случва най-често, защото една вирусна частица или една ракова клетка има мутация, която води до такава резистентност. Във всеки друг случай трябва да се започне емпирично търсене на ново лекарство. В случай на антисенс ефекти е необходимо само да се определи коя промяна в структурата на вирусния геном или онкогена е довела до появата на резистентност. След това веднага става ясно как да се създаде ново лекарство, използвайки същата унифицирана технология *.

* Образователен вестник на Сорос. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Интерфериращите РНК, къси двуверижни комплекси от РНК олигонуклеотиди, се оказаха най-мощното средство за "изключване" на гените. Когато такъв комплекс се въведе в клетка, една от веригите се свързва с неговата комплементарна последователност в информационната РНК на клетката. Това служи като сигнал за започване на работата на група ензими, които разрязват РНК, свързана с олигонуклеотиди. В резултат на това изчезва програмата за синтез на определен протеин.

През 2006 г. двама американски изследователи получиха Нобелова награда за физиология или медицина за обяснение на механизма на РНК интерференция. Създаването на регулатори на генната експресия на базата на интерфериращи РНК разкри големи възможности за получаване на широка гама от високоефективни нетоксични лекарства, които потискат експресията на почти всички гени, включително туморни и вирусни.

Правилни мутации

Вниманието на специалистите отдавна е привлечено от методи за мутагенно действие върху ДНК с помощта на олигонуклеотиди или техни производни. Ако успее, това, което днес изглежда като фантазия, може да се превърне в реалност: корекцията на дефектни генетични програми.

Вече е експериментално доказано, че точковите мутации могат да бъдат въведени в генетични програми с помощта на къси олигонуклеотиди. Как да го направим? Мутагенни олигонуклеотиди, съдържащи "грешни" нуклеотидни блокове, се въвеждат в клетката, където се комбинират с ДНК. В резултат на това в някои части на нуклеотидните последователности се появяват „грешни“, т.е. некомплементарни базови двойки, които се възприемат от системата за възстановяване („ремонт“) на клетъчната ДНК като увреждане. Нуклеотидите в такава двойка се заменят с репаративни ензими по такъв начин, че тя става „правилна“, допълваща се. В този случай заместването може да се случи както в олигонуклеотидната последователност, така и в самата клетъчна ДНК.

В последния случай имаме работа с промяна в генетичната програма, т.е. с мутация. И въпреки че ефективността на такъв процес на мутация като цяло е ниска, тя може да се използва във връзка с новите клетъчни технологии. Например, стволовите клетки на пациент с някакво наследствено заболяване могат да бъдат третирани със селективен мутаген и след това онези от тях, в които е настъпила желаната мутация (т.е. клетки с „коригирана“ генетична програма), могат да бъдат избрани, умножени и въведени в тялото.

1967 Публикувана е първата работа върху олигонуклеотидите, генно-насочени биологично активни вещества

По този начин съществуващите в момента олигонуклеотиди са в състояние да регулират „работата“ на гените на различни нива. По този начин гореспоменатите антисенс олигонуклеотиди и интерфериращи РНК работят на етапа на протеинов синтез, действайки върху информационни РНК - информационни молекули, в които се сглобяват полипептидни вериги. Антигенните олигонуклеотиди, които образуват комплекси с ДНК, потискат генната експресия - образуването на самите информационни РНК, а аптамерните олигонуклеотиди, подобно на антителата, могат да образуват връзки с определени протеини, блокирайки ги. В допълнение, някои олигонуклеотиди са в състояние да стимулират имунната система - днес те се използват като компоненти на ваксини.

Понастоящем разработването и синтезът на олигонуклеотиди и техните аналози се извършват от големи изследователски и индустриални сектори. Така миналата година обемът на пазара само за олигонуклеотиди, предназначени за изследователски цели, надхвърли 800 милиона долара! Сега са разработени и синтезирани десетки нови видове химически модифицирани олигонуклеотиди и се тестват редица антивирусни и противовъзпалителни лекарства на тяхна основа. Изследвания от този вид в Русия в момента се извършват главно в Института по химическа биология и фундаментална медицина на Сибирския клон на Руската академия на науките, където работят ученици и последователи на академик Д. Г. Кноре.

Ето как плодотворността на идеята, възникнала в сибирския клон преди четиридесет години, беше доказана от самия живот. Използвайки къси фрагменти от нуклеинови киселини като основни структури за създаване на генно-насочени биологично активни вещества, е възможно бързо да се разработят и въведат в производство специфични лекарства срещу почти всеки вирус. За да направите това, е необходимо само да дешифрирате нуклеотидната последователност на вирусните гени, което е лесно да се направи с помощта на съвременните технологии. Този универсален подход има голямо бъдеще: резултатите от проучвания през последните години, по-специално върху насочената към място мутагенеза, ни позволяват да разчитаме на появата на ефективни лекарства в близко бъдеще за борба с болести, които все още се считат за нелечими.

Въведение

Разработването на таргетни лекарства е приоритетна задача на съвременната молекулярна биология, биоорганична химия и медицина. В момента има голям брой произведения, отразяващи различни подходи за решаване на този проблем. Поради редица причини най-обещаващият подход се основава на избора на патогенна протеинова иРНК като мишена и използване на свойството на комплементарност при взаимодействието на нуклеиновите киселини една с друга. Към днешна дата се работи в три направления:

Антисенс олигонуклеотиди;

Рибозими и ДНКзими;

SiRNA и miRNA.

Тези методи се основават на използването на къси молекули нуклеинова киселина (17 - 70 nt) с последователност, която е частично или напълно комплементарна на целевото място на иРНК. Общите принципи на действие на такива агенти ги обединяват и в областта на възникващите проблеми, сред които най-острите са доставката в клетката, устойчивостта на действието на нуклеазите и ефективността на взаимодействие с целевата иРНК. Химическите модификации на NC агентите помагат за частично или пълно решаване на много от тези проблеми и повишават ефективността на агентите.

Изследването на механизмите на потискане на генната експресия с помощта на комплементарни взаимодействия изисква използването на методи за анализ, които позволяват недвусмислено определяне на антисенс ефекта на олигонуклеотидите.

Целта на тази работа е да се разработи метод за потискане на експресията на EGFP гена в клетки с помощта на конюгати на олигонуклеотида с пирен.

Антисенс олигонуклеотидни модификации (преглед на литературата)

Разработването на лекарства, които позволяват на генно ниво да се предотврати развитието на заболявания, причинени от експресията на патогенни протеини (вирусни, онкогенни продукти) или протеини, които предотвратяват неговото излекуване (MDR), доведе до появата и развитието на антисенс технология. Принципът на антисенс технологията е прост: антисенс олигорибонуклеотидите причиняват потискане на експресията на таргетния ген по специфичен за последователността начин, използвайки способността на олигонуклеотидите да хибридизират към таргетната иРНК чрез взаимодействия на Watson-Crick. Олигонуклеотидът, свързвайки се с целевата РНК, предотвратява по-нататъшната й обработка. Експериментите върху клетъчни култури показват, че използването на олигодезоксирибонуклеотиди (наричани по-нататък ODN) с дължина 20–30 nt, комплементарни на иРНК региона, значително намалява нивото на експресия на протеина, който кодира. Развитието на метода показва редица причини, водещи до намаляване на ефективността на ODN: кратък живот на ODN в серума, ниска ефективност на проникване (транспорт) в клетката и недостатъчна ефективност на свързване със структурирани РНК фрагменти.

Развитието на органичната химия, по-специално химията на нуклеиновите киселини, позволява да се търсят начини за решаване на възникващи проблеми чрез въвеждане на различни химични модификации на ODN. Както азотните бази, така и захарно-фосфатният скелет могат да бъдат подложени на химическа модификация, което води до повишаване на неговата резистентност към ODN нуклеаза и ефективността на неговото свързване към комплементарната последователност. Прави се опит да се повиши ефективността на доставката на ODN в клетката чрез въвеждане на различни групи в нейния състав в един от краищата, които улесняват преминаването през мембраната.

Основно се разграничават два механизма на действие на антисенс олигонуклеотидите: спиране на транслацията поради свързване на регулаторната област и разцепване на РНК в хетеродуплекса РНК-ДНК. Поддържащите модификации могат да имат различно въздействие върху един или друг механизъм, което трябва да се вземе предвид при избора на опция за модификация.

1.1 Механизъм на действие на антисенс олигонуклеотидите

Когато антисенс олигонуклеотид взаимодейства с иРНК, настъпват две събития: пространствено блокиране и разцепване на таргетната иРНК от RNase H. За някои олигонуклеотиди се случват и двете събития (RNase H-компетентни олигонуклеотиди), за други само пространствено блокиране (RNase H-независими ). Тези два варианта се основават на различни клетъчни механизми. Най-широката гама от молекулярни механизми се използва при използване на втория вариант. Това се постига чрез адресиране на олигонуклеотиди към специфични регулаторни последователности както в пре-mRNA, така и в mRNA. В случай на пре-mRNA, адресирането на ODN към граничната област между интрон и екзон нарушава сплайсинга, което води или до неговото прекъсване, или до образуването на mRNA, кодираща нефункционален протеин (виж Фиг. 1). Друго обещаващо място за свързване на ODN в пре-mRNA е 5' крайната област. Взаимодействието на ODN с тази област води до блокиране на затварянето.

Когато ODN взаимодейства с иРНК, неговата транслация се нарушава, а оттам и протеиновия синтез, поради блокиране на движението на рибозомата по протежение на иРНК или дори нейното сглобяване, в зависимост от позицията на мястото на свързване.

Фиг. 1.

RNase H-компетентни ODNs могат да бъдат адресирани до всяка област на пре-mRNA и mRNA, тъй като тяхното действие се основава на активирането на RNase H, чийто субстрат е RNA в състава на RNA-DNA дуплекси. Въпреки това, много химически модифицирани антисенс олигонуклеотиди не са в състояние да включат този механизъм поради високата пространствена специфичност на RNase H. Това се дължи на факта, че повечето модификации водят до промяна в параметрите на спиралата на дуплекса ODN-RNA, и те престават да бъдат субстрати за РНКаза H.

Антисенс олигонуклеотидите от второ поколение - модифицирани на 2" позиция на захарния остатък, не са субстрати на РНКаза Н, следователно трябва да се търсят други разцепващи агенти (изкуствени РНКази). Редица малки молекули (интеркалатори, поликатиони) са способни за разцепване на целевата РНК води до разцепване на желаните региони на целевата РНК.Такива групи са метални комплекси, амини, олигопептиди и молекулни структури с групи на активния център на нуклеазите (имидазолов пръстен, COO - -, NH2 групи, гуанидин).

1.2 Антисенс олигонуклеотидни модификации

1.2.1 Стратегии за разработване на химични модификации на олигонуклеотиди

Въз основа на натрупаните данни за употребата на антисенс олигонуклеотиди са формулирани редица критерии, на които ODN трябва да отговаря, за да бъде ефективен терапевтичен агент:

устойчивост на нуклеази

висок афинитет към целта

Образуване на субстрат на РНКаза Н

различни механизми на действие (влияние на алтернативен сплайсинг, спиране на транслацията)

нетоксичност и специфичност

Възможност за неспецифично свързване с протеини за транспорт

Лесен синтез, патентоспособност, полза

Родните ODN не са в състояние да задоволят напълно всички изброени критерии. Основните ограничения са слаба нуклеазна резистентност и недостатъчно стабилни ODN-RNA комплекси. Въвеждането на химични модификации в ODN за всички или отделни нуклеотиди може до голяма степен да елиминира съществуващите недостатъци. Модификациите на ODN се извършват при фосфатната група, захарозния остатък, азотната основа или при крайните фосфатни остатъци. За да се увеличи нуклеазната резистентност, най-често се извършва модификация на фосфатната група и дезоксирибозния остатък. Увеличаване на ефективността на свързване се получава поради модификацията на азотните основи, както и дезоксирибозния остатък. За да се увеличи ефективността на свързване с протеини и да се подобри транспорта, се извършва конюгация с лиганди от различно естество. В някои случаи прикрепените химически конструкции действат като катализатори за фосфодиестерни връзки в РНК.

1.2.2 Модификации на фосфатните групи

Разцепването на фосфодиестерните връзки в ДНК от нуклеази става чрез ефективно свързване в активния център и използване на киселинно-алкалните свойства на фосфатната група. Един от начините да се увеличи устойчивостта на ODN връзките към действието на нуклеазите е да се промени електронната конфигурация на фосфатната група. За да направите това, един от несвързаните кислородни атоми се заменя с атом на друг елемент. Сярата е един от първите използвани такива елементи, в резултат на което са получени фосфоротиоати (модифицирани антисенс олигонуклеотиди от първо поколение; виж фиг. 2, II).

Ориз. 2.

Фосфоротиоатите показват висока устойчивост към действието на нуклеазите, но тази модификация значително повишава токсичността на ODN.

Чрез заместване на несвързания кислороден атом на фосфатната група с метилова група се получават метилфосфонати (виж фиг. 3, III), които проявяват висока устойчивост към действието на нуклеазите. Модификацията често се извършва само в крайните нуклеотиди, което води до намалена токсичност.

Ако заместим кислородния атом на фосфата с BH 3 - се получават боранофосфати. Остатъкът -BH 3 - е изоелектронен на кислородния атом във фосфодиестерните връзки, поради което боранофосфатите запазват отрицателния си заряд, силно са разтворими във вода и образуват комплекси с целевата РНК. Освен това този остатък е изоелектронен и изостеричен на метиловата група, поради което от тях трябва да се очакват свойства, подобни на тези на метилфосфонатите, като устойчивост към нуклеази.

Ориз. 3.

1.2.3 Модификации на захарния остатък

Модификациите на фосфодиестерните връзки нямат значителен ефект върху стабилността на хетеродуплекса ДНК-РНК. Следователно, в допълнение към модифицираните олигодезоксинуклеотиди, представляват интерес т. нар. второ поколение модифицирани антисенс олигонуклеотиди - това са олигорибонуклеотиди, заместени в 2"-хидроксилната група на рибозния остатък. Такава модификация също повишава устойчивостта към нуклеази. Въпреки че РНК е много по-малко устойчиви на влияния на околната среда в сравнение с ДНК поради наличието на 2"-ОН група, именно модификациите на тази група правят възможно получаването на стабилни продукти, които проявяват по-малко токсичност в сравнение с фосфонатите. Също така, второ поколение модифицирани антисенс олигонуклеотиди често включват олигонуклеотиди с модифициран скелет от не-захарно-фосфатна природа, например, пептидни нуклеинови киселини, които също проявяват резистентност към нуклеаза и образуването на термодинамично стабилни хибриди с целеви иРНК молекули.

Фиг.4. Второ поколение модификации: V - 2 "-О-алкил-РНК, VI - LNA, VII - Морфолино, VIII - PNA.

Анализът на данните за използването на редица производни на 2'-O-алкил РНК, съдържащи от една до пет метиленови единици в алкилния радикал, показа, че с увеличаване на броя на метиленовите единици резистентността на модифицирания олигонуклеотид към действието на нуклеазите (пентокси > пропокси > метокси > деокси) се увеличава.Тази зависимост може да се обясни със пространствената недостъпност на нуклеотида, когато е прикрепен по-голям заместител.Въпреки това, пространственото препятствие, причинено от наличието на обемисти заместители, намалява ефективността на образуването на комплементарни комплекси с целевата иРНК, следователно най-високият афинитет към целта се постига при използване на малки заместители. 2 "-О-метилирани фосфоротиоати (Me-S-ODN), S-ДНК и немодифицирана ДНК, се оказа, че точката на топене (T m) на хетеродуплексите ДНК-РНК нараства в следния ред: Me-S-ODN - РНК > нормална ДНК - РНК > S-ODN - РНК. Недостатъкът на тази модификация е, че РНКаза Н не може да разцепи целевата иРНК в комплекса РНК-РНК. Като следствие от този недостатък, такива олигонуклеотиди са по-малко мощни инхибитори на генната експресия в сравнение с немодифицираните.

2"-катионните модификации водят до образуването на цвитерионни олигонуклеотиди. Такива олигонуклеотиди, в допълнение към образуването на по-стабилни хетеродуплекси, в сравнение с немодифицираните, имат по-голяма способност да проникват през биологичните мембрани и висока стабилност срещу нуклеази поради техния заряд. 2 '-O-етил]Олигонуклеотиди (2"-O-DMAEOE, виж Фиг. 5), поради ефекта на заряда, образуват хетеродуплекси с целевата РНК с точка на топене с 2 °C по-висока в сравнение с немодифицираните олигонуклеотиди. Цвитерионните олигонуклеотиди запазват компетентността на RNase H, ако модификациите са разпръснати по цялата дължина на олигонуклеотида.

Ориз. 5.2 „-O-DMAEOE

Конформационно ограничените "заключени" нуклеинови киселини (заключени нуклеинови киселини, LNA) са модифицирани нуклеинови киселини, имащи поне един мономер с бициклична фураноза като захарен остатък (виж Фиг. 4, VI). Те имат висок афинитет към комплементарната последователност (точката на топене на дуплекса се повишава с 6 °C, когато един нуклеотид се модифицира), което е както предимство (ефективно свързване на мишената), така и недостатък (образуване на фиби). Такъв афинитет трябва да се вземе предвид при проектирането на LNA. Изследвания при мишки показват, че LNA е с ниска токсичност.

Пептидните нуклеинови киселини (PNA) са аналози на нуклеиновите киселини, в които захарно-фосфатният скелет е заменен от псевдопептиден N-(2-аминоетил)-глицинов полимер. N-краят имитира 3'-края на олигонуклеотида, докато С-краят имитира неговия 5'-край (виж Фиг. 3, VII). PNA-RNA комплексите са по-стабилни от ДНК-ДНК и РНК-РНК комплексите. Въпреки факта, че PNA могат да свържат мишената както в антипаралелна (според Watson-Crick), така и в паралелна (според Hoogsteen) ориентация, по-стабилни комплекси се образуват с антипаралелна ориентация на PNA. Проучванията показват малка токсичност на PNA.

Морфолините (виж фиг. 3, VIII) са реагенти, които комбинират стабилност, устойчивост на нуклеази, ефективност, дълготрайна активност, водоразтворимост, висока специфичност и ниска токсичност. Молекулите имат неутрален заряд. Морфолините се произвеждат от Gene Tools, LLC ( http://www.gene-tools.com).

За да се поддържа компетентността на РНКаза Н, е необходимо средата на олигонуклеотида да съдържа най-малко 7 деоксинуклеотида; следователно се използват „смесени“ антисенс олигонуклеотиди, т.е. имащи различни модификации в различни връзки (LNA/DNA, LNA/RNA и т.н.). Също така към реакционната смес се добавят съединения, съдържащи групи, които причиняват разцепване на целевата иРНК поради сходството им с активния център на РНКаза Н, или не всички нуклеотидни единици са модифицирани (например само 3'- и 5'-краищата ). .

По този начин основните свойства на модифицираните със захар-фосфат антисенс олигонуклеотиди могат да бъдат обобщени в следната таблица:

Таблица 1. Сравнение на модификации на гръбнака на захарния фосфат.

Модификация	Нуклеазна стабилност	Целеви афинитет	Активиране на РНКаза Н	Нетоксичност

1.2.4 Модификации на азотните бази

Ефективната антисенс активност може да бъде трудна за постигане само с модификации на гръбнака на захарния фосфат. Модифицираните азотни бази повишават ефективността на антисенс ODN чрез увеличаване на афинитета към таргетната РНК (аминоаденозин, G-кламп) и скоростта на проникване през плазмената мембрана (катионни и цвитерионни групи).

Когато феноксазинът се добави към цитозиновия остатък, се получава така наречената G-скоба (виж Фиг. 6, X), която образува допълнителна водородна връзка с гуаниновия остатък, поради което точката на топене на ODN-RNA хибрида повишава се с 6–18 °C. Такава модификация обикновено се извършва в 3' края, което не нарушава компетентността на RNase H.

Когато аминогрупа се въведе в аденинов остатък (виж фиг. 6, XI), афинитетът към мишената също се увеличава поради образуването на допълнителна водородна връзка с тиминовия остатък.

Ориз. 6. Допълнителни водородни връзки между C и G скоба (X), между T и A NH2 (XI)

ODNs с катионни и цвитерионни групи, прикрепени към остатъци от азотни бази (например спермидин, Фиг. 7), поради техния положителен заряд, не само имат по-голям афинитет към мишената, но и подобрена способност да проникват в клетката и стабилност към действието на нуклеазите.

Ориз. 7.

Терминалните азотни бази се конюгират с големи флуоресцентни лиганди като флуоресцеин, за да се визуализира местоположението на ODN в клетката.

Фиг.8.

1.2.5 Присъединяване на обемисти заместители

Способността да прониква в клетката без да преминава през клетъчната мембрана е едно от качествата, които трябва да присъстват в един ефективен антисенс олигонуклеотид. Повечето от описаните по-горе модификации на нуклеотиди в ODN не влияят значително на ODN транспорта през клетъчната мембрана. Има няколко пътя за преминаване на молекулите през плазмалемата, но два са важни за ODN: дифузен, или нерецепторно медииран, и рецепторно медииран. Транспортът според първия вариант е затруднен от общия отрицателен заряд на ODN и тяхната хидрофилност. Използването на втория път е ограничено от недостатъчни данни за повърхностните протеини на клетъчната мембрана, отговорни за транспорта на нуклеинови киселини в клетката. Създаването на ODN конюгати с различни химични групи подобрява ефективността на транспорта по един или друг маршрут в зависимост от вида на химичната група и мястото на нейното свързване към ODN. Фигура 9 показва вариантите на линкер, които се използват при получаването на конюгати. Лигандите могат да бъдат прикрепени към азотни основи, крайни фосфати, фосфодиестерни (или подобни) връзки и захарни остатъци. Някои видове химични групи също позволяват визуализиране на компартментализацията чрез флуоресцентно откриване. антисенс реакция на олигонуклеотидна модификация

Фиг.9.

Частичната и дори пълна неутрализация на отрицателния заряд на ODN няма значителен ефект върху способността на ODN спонтанно да се транспортира в клетката. Прикрепването на различни обемисти хидрофобни лиганди, като тези, изобразени на Фигура 9, улеснява ODN транспорта през мембраната.

Фиг.10.

Холестеролните конюгати са добре проучени. Механизмът, който подобрява навлизането в клетката чрез добавяне на холестерол, все още не е напълно изяснен, въпреки че се предполага рецептор-медиирано включване на липопротеин. Холестеролните конюгати образуват мицели, което улеснява транспортирането им в клетката. Холестеролният остатък обикновено е прикрепен към крайните 5"- и 3"-фосфати и 3"-монохолестерил олигонуклеотидите са по-ефективни от 5"-монохолестерил олигонуклеотидите, а 5", 3"-бисколестерил олигонуклеотидите са най-ефективни. Например, 6 минути след инжектиране в кръвта на мишки, нивото в тъканите на 3'-моно-модифицирани фосфоротиоати е 4 пъти, а на 5'-моно- и 3,5'-бис-модифицирани - 7 пъти по-високо в сравнение с до немодифицирани фосфоротиоати.

Използват се мономери с 5"- или / и 3"-холестерил-заместен фосфат, олигонуклеотиди с лиганд, конюгиран с фосфодиестерна връзка преди 3"-терминалния нуклеозид, както и холестерил дендримери с лизин остатък като линкер (виж фиг. 11).

Фиг.11.

Синтезирани са олигонуклеотиди, конюгирани с други хидрофобни молекули (адамантан, пирен, ейкозанова киселина и др.) и са сравнени с тези на холестерола. Холестеролните конюгати показват оптимална липофилност, както и добра способност за натрупване в черния дроб.

Конюгацията с производни на пирен, в допълнение към подобряването на способността за транспортиране, представлява интерес поради способността им да флуоресцират. Бис-пирениловите производни са способни да образуват ексимери - бимолекулни комплекси, в които една молекула е в основно състояние, другата е във възбудено състояние. Такива комплекси са много чувствителни към пространствената среда; нивото на флуоресценция може да се използва, за да се прецени дали ODN е в състояние, свързано с целевата РНК или не:

Фиг.12.

Пептидните конюганти също се използват за подобряване на ефективността на транспорта в клетката. Към олигонуклеотидите, вкл. PNA, прикрепете пептид, способен да транспортира големи полярно заредени молекули през мембраната. Така пептидът Antennapedia има места за свързване на ДНК. PNA с прикрепения пептид Antennapedia не само ефективно навлиза в клетката, но и мигрира към ядрото.

Фиг.13.

Прикрепването към краищата на антисенс ODN молекули с големи планарни интеркалиращи молекули, като акридин (виж Фиг. 14), представлява интерес като повишаване на ефективността на разцепването на целевата РНК. Поради интеркалирането, взаимодействието между ODN и РНК се разхлабва локално. Поради увеличаването на разстоянието между ДНК и РНК, дължащо се на размера на молекулата на интеркалатора, молекулата на РНК „излиза“ от двойната спирала на хетеродуплекса. Катионите на тежките метали, например Lu 3+, координирани към азотните атоми на акридиновия остатък, катализират хидролизата на РНК без участието на РНКаза Н, а „зациклянето” като дестабилизираща структура ускорява този процес.

Ориз. 14.

1.3 Физикохимични аспекти на взаимодействие между олигонуклеотид и таргетна РНК

Ефективността на антисенс олигонуклеотидите се определя количествено чрез афинитета на ODN към целевата иРНК и ефективната константа на разцепване на последната.

Афинитетът на ODN към адресираната към него РНК (или свободната енергия на образуването на хетеродуплекс) описва стабилността на хибрида ДНК-РНК. r Жмогат да бъдат измерени калориметрично или изчислени теоретично. При изчисляване на свободната енергия на Гибс за образуване на хетеродуплекс се използва законът на Хес (свободната енергия на Гибс на сложна реакция не зависи от нейния път) и изчисленията на енергиите на образуване на вторични и третични структури съгласно „правилото на най-близкия съсед ” с помощта на програмата mfold, разработена от Zucker et al. Реакцията може да бъде представена по следния начин:

В тази схема M, O, H са целевата иРНК, съответно, антисенс ODN и ODN хетеродуплекс - РНК, като се вземат предвид техните вторични и третични структури, M u, O u, H u - целева иРНК, съответно, антисенс ODN и ODN heteroduplex - РНК, без да се взема предвид тяхната вторична и третична структура, un Ж (М) , un Ж (о) , un Ж (H)- свободни енергии на Гибс за поставянето им във вторична и третична структура, r g, r Ж (разгъната)са свободните енергии на ODN и mRNA хибридизация в сгънато и напълно денатурирано състояние, съответно.

un Ж (М) , un Ж (о) , un Ж (H)И r Ж (разгъната)може да се изчисли теоретично. Тогава свободната енергия на хибридизацията се намира съгласно закона на Хес:

Равновесната константа на хетеродуплексния процес на асоцииране К 1 може да се намери от изчислената свободна енергия на Гибс на процеса на хибридизация:

За да се оцени температурата на топене на хетеродуплекс, се използва и правилото за „най-близкия съсед“ и се изчислява с помощта на подходящите програми.

Експериментално може да се намери ефективната константа на скоростта к ефгруби реакции на трансформация на иРНК М в условен продукт X (тази условност не засяга резултата от кинетичните изчисления, но значително ги опростява):

Константата на ефективната обща скорост на реакцията показва наблюдаваната скорост на разцепване на таргетната иРНК.

Механизмът на реакцията може да бъде представен със следната схема:

В тази схема Е е ензимът РНКаза Н, НЕ е неговият междинен комплекс със субстрата Н, К 1 - константа на хетеродуплексна асоциация, изчислена по формула (3).

За тази кинетична схема можем да съставим система от кинетични уравнения:

Където СЪС А- концентрация на вещество А, к аз - константа на скоростта на i-тата елементарна реакция.

Често измерван параметър е концентрацията на иРНК в разтвор (първоначална ° С M0и ток ° С М), Ето защо к еф брой спрямо матрицата:

Използване на квазистационарното приближение за междинния продукт HE и опростяване на израза за скоростта на реакцията wизползвайки уравнението на Михаелис-Ментен:

където е константата на Михаелис, е възможно да се трансформира изразът за скоростта на промяна в концентрацията на хетеродуплекса H:

Нека намерим израз за ефективната константа на скоростта на разцепване на целевата иРНК в два случая: когато процесът е ограничен от свързването на иРНК от антисенс ODN и е ограничен от каталитично разцепване на целевата иРНК в хетеродуплекса.

Случай 1. Ограничение чрез хибридизация.

В този случай процесът на разделяне е много по-бърз от хибридизацията. Следователно можем да приемем установяването на стационарна концентрация на хетеродуплекса Н, т.е.:

От друга страна, лесно е да се види (6), че:

Тоест в този случай изразът за скоростта на разцепване на иРНК съвпада по абсолютна стойност с израза за скоростта на реакцията (скоростта на образуване на условния продукт X). Използвайки това, ще трансформираме израза за скоростта на промяна в концентрацията на олигонуклеотида, ще видим, че неговата концентрация може да се счита за почти непроменена:

Използване на израз (14) и, като следствие, пренебрегване на приноса на члена к -1 СЪС з c намерете скоростта на разцепване на иРНК в нова форма и експресирайте к еф .

Случай 2. Ограничение чрез каталитично разцепване на субстрата.

В случай, че разделянето протича много по-бавно от образуването на хетеродуплекс, можем да приемем, че равновесието има време да се установи.

Равновесната концентрация на хетеродуплекса може да бъде пренебрегната в сравнение с константата на Михаелис в израза на скоростта:

Записване на израза за равновесната константа К 1 и уравнението на материалния баланс за M и O, получаваме достатъчно условия за решаване на уравнението:

Където [ А] - равновесна концентрация, СЪС А 0 - първоначалната концентрация на веществото.

Като вземем предвид (17) и (18), получаваме изразите за равновесните концентрации на Н и О:

Замествайки (21) в уравнението на Михаелис-Ментен (16), получаваме модифицирано уравнение за скоростта на реакцията:

Замествайки изрази (20), (21) и (22) в (12) и пропускайки тромавите междинни изчисления, получаваме израз за скоростта на каталитично разцепване на иРНК:

откъдето е лесно да се намери формулата за ефективната константа на скоростта на брутния процес:

Има много препятствия по пътя за създаване на лекарства, базирани на антисенс ODN: слаба способност за интернализиране, нестабилност на нуклеазата, токсичност и други. Химическите модификации могат да премахнат много от тези проблеми, но само частично и е трудно да се намери компромис между предимствата и недостатъците на всяка модификация. Въпреки това, много лекарства на базата на ODN са тествани. Първото лекарство на базата на ODN, Vitravene, насочено към борба с цитомегаловирусната инфекция при пациенти със СПИН.

ВЪВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ПРЕГЛЕД НА ЛИТЕРАТУРАТА.

1.1. Основни идеи и начини за създаване на таргетни противоракови лекарства 15 1.1.1. Таргетни лекарства в онкологията: лекарства на базата на моноклонални антитела и антисенс олигонуклеотиди.

1.2. Рецепторно-медиирана ендоцитоза и нейната роля в доставянето на биологично активни съединения до целевите клетки

1.3. Алтернативни системи за целенасочена доставка на противоракови лекарства за подобряване на ефективността на лечението на рак.

1.4. Тумор-специфични антигени като мишени за целево доставяне на противоракови лекарства

1.5. Целенасочена доставка на лекарства като част от конюгати с протеинови и пептидни векторни молекули.

1.6. Химерни протеини

1.7. Алфа-фетопротеинът и неговите рецептори като мишена за селективно доставяне на биологично активни вещества към туморните клетки.

1.7.1. Структура и функции на алфа-фетопротеина

1.7.2. Рецептори за алфа-фетопротеин.

1.7.3. Биологично активни фрагменти на алфа-фетопротеин

1.8. Целенасоченото доставяне на противоракови лекарства като основен подход за преодоляване на множествената лекарствена резистентност (MDR)

1.8.1. Феноменът на мултилекарствена резистентност на туморните клетки.

1.8.2. Съвременни подходи за преодоляване на мултилекарствената резистентност.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ.

2.1. Изолиране на естествен човешки алфа-фетопротеин и производство на рекомбинантни AFP фрагментни протеини.

2.1.1. Изолиране на човешки AFP

2.1.2. Получаване на рекомбинантен С-краен фрагмент на AFP (gAFP27)

2.1.3. Получаване на рекомбинантен PGA протеин

2.1.4. Получаване на рекомбинантен фрагмент от AFP AFP-3BC

2.2. Синтез на протеинови и пептидни конюгати с FITC, цитостатици и олигонуклеотиди.

2.2.1. Синтез на белязан с FITC AFP, mAb и С-терминални фрагменти на AFP hAFP27 и AFP-3BC.

2.2.2. Синтез на FITC-белязан AFP октапептид GIP8.

EMTPVNPG (GIP8) с доксорубицин.

2.2.4. Синтез на AFP конюгати с винбластин.

2.2.5. Синтез на AFP конюгати с фталоцианини

2.2.6. Синтез на AFP и GIP8 конюгати с есперамицин Aib (EsA).

2.2.9. Синтез на AFP конюгати с олигонуклеотиди.

2.2.10. Приготвяне на ON комплекси с протеини.

2.3. Клетъчни култури и условия на култивиране.

2.4. Оценка на рецепторното свързване и ендоцитозата на флуоресцентно белязани протеини, пептиди и конюгати с помощта на поточна цитометрия.

2.4.1. Оценяване на свързването на AFP и Mab към AFP рецептора.

2.4.2. Оценка на ендоцитозата на флуоресцентно белязан AFP, С-терминален фрагмент на AFP, AFP октапептид GIP8.

2.5. Оценка на ендоцитозата на протеинови и пептидни конюгати с DOX с помощта на поточна цитометрия.

2.6. Имуноцитохимични и имунохистохимични изследвания.

2.6.1. Изследване на експресията на AFP рецептори върху клетъчната повърхност.

2.6.2. Изследване на експресията на c-Myc, Bc1-2 и Pgpl70 протеини.

2.6.3. Имунохимично оцветяване на хистологични срезове.

2.7. Изследване на експресията на c-Myc, Bcl-2 и Pgpl70 в туморни клетки.

2.7.1. Изследване на експресията на c-Myc, Bcl-2 и Pgpl70 с помощта на Western blot.

2.7.2. Изследване на експресията на c-Myc, Bcl-2 и Pgpl70 в туморни клетки с помощта на поточна цитометрия.

2.8. Флуоресцентна микроскопия.

2.9. Определяне на цитостатичната активност на лекарства in vitro.

2.9.1. Определяне на жизнеспособността на клетките.

2.9.2. Определяне на инхибирането на пролиферативната активност на клетките.

2.9.3. Анализ на нивото на апоптоза с помощта на флуоресцентна микроскопия.

2.8.4. Определяне на фотоцитостатична и хемиоцитостатична активност на AFP конюгати с алуминиеви (A1Pc) и кобалтови (CoPc) фталоцианини.

2.9. Изследване на пролиферативната активност на клетките.

2.10. Анализ на клетъчния цикъл чрез поточна цитометрия.

2.11. Изследване на противотуморната активност на лекарства in vivo.

2.12. Статистическа обработка на резултатите.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛТАТИ И ТЯХНОТО ОБСЪЖДАНЕ.

3.1. Изследване на експресията на алфа-фетопротеиновия рецептор върху човешки туморни клетъчни линии.

3.1.1. Изследване на специфичността на mAb клонове към AFPR

3.1.2. Оценка на количеството AFPR върху in vitro култивирани човешки туморни клетки.

3.2. Имунохимично откриване на AFPR върху клетки и тъканни срезове

3.2.1. Изследване на експресията на AFP рецептори върху повърхността на туморни клетки с помощта на имуноцитохимия.

3.2.2. Имунохистохимично оцветяване на срезове от туморна тъкан

3.3. Изследване на свързване и ендоцитоза на флуоресцентно белязан AFP от туморни клетки in vitro.

3.3.1. Изследване на свързването на AFP с рецептора на повърхността на туморни клетки и нормални човешки лимфоцити от периферна кръв с помощта на поточна цитометрия.

3.3.2. Изследване на AFP ендоцитоза in vitro с помощта на поточна цитометрия и флуоресцентна микроскопия.

3.4. Използването на рецептор-медиирана ендоцитоза за таргетна доставка на противоракови лекарства - доксорубицин, винбластин, есперамицин, фталоцианини.

3.4.1. Анализ на интернализация на конюгати от туморни клетки in vitro

AFP с антибиотици/цитостатици на примера на доксорубицин.

3.4.2. Изследване на цитостатичната активност на протеинови конюгати с доксорубицин in vitro.

3.4.3. Изследване на антитуморната активност на AFP конюгати с DOX in vivo.

3.4.4. Изследване на фотоцитостатичната и хемиоцитостатичната активност на AFP конюгати с алуминиеви фталоцианини (A1Pc) и кобалт

3.4.5. Изследване на цитостатичната активност на AFP конюгатите с някои други противотуморни антибиотици (цитостатици).

3.4.6. Изследване на цитостатичната активност на AFP конюгати с esperamycin Ajb (EsA) in vitro.

3.4.7. Изследване на антитуморната активност на AFP конюгати с esperamycin Aib (EsA) in vivo.

3.5. Преодоляване на множествена лекарствена резистентност, причинена от експресията на MDR 1 ген, използвайки AFP конюгати с противоракови лекарства in vitro.

3.5.1. Характеризиране на резистентни клетъчни линии.

3.5.2. Анализ на интернализацията на DOX и неговите протеинови конюгати в резистентни клетъчни линии.

3.5.3. Изследване на цитостатичната активност на DOX-AFP конюгати срещу резистентни клетъчни линии.

3.6. Биологично активни фрагменти на AFP.

3.6.1. Рекомбинантен С-краен фрагмент на AFP (gAFP27).

3.6.2. Рекомбинантен С-краен фрагмент на AFP AFP-ZVS.

3.6.3. Биологично активен октапептид - AFP фрагмент

3.7. Целева доставка на антисенс олигонуклеотиди към туморни клетки.

3.7.1. Целенасочена доставка на антисенс олигонуклеотиди до туморни клетки под формата на техните конюгати с AFP.

3.7.2. Проучване на ефективността на доставката на ASON с помощта на нековалентни комплекси с AFP.

Препоръчителен списък с дисертации

• Създаване и изследване на свойствата на рекомбинантни човешки протеини с потенциален антитуморен ефект 2007 г., кандидат на химическите науки Савватеева, Людмила Владимировна

• Разработване на целеви противоракови лекарства на базата на пептидни вектори и антиангиогенни агенти 2007 г., доктор на биологичните науки Фелдман, Наталия Борисовна

• Използване на С-крайния домен на алфа-фетопротеин за целево доставяне на противоракови лекарства 2012 г., кандидат на биологичните науки Годованни, Артем Виталиевич

• Получаване и изследване на биологичната активност на конюгати на епидермален растежен фактор с противотуморни химиотерапевтични лекарства 2000 г., кандидат на биологичните науки Гуманов, Сергей Георгиевич

• Синтез на конюгати на човешки α-фетопротеин с противоракови лекарства за насочена доставка до туморни клетки 2001 г., кандидат на химическите науки Заболотнев, Дмитрий Викторович

Въведение в дипломната работа (част от резюмето) на тема "Използване на протеинови и пептидни вектори за селективно доставяне на противоракови лекарства и терапевтични олигонуклеотиди към туморни клетки"

Неотложността на проблема. Основните причини за недостатъчната ефективност на химиотерапевтичното лечение на онкологични заболявания са ниската бионаличност на противотуморните агенти за тумора, необходимостта от използване на високи дози лекарства и неселективния характер на тези лекарства. Ограниченото проникване на лекарства в биологично хетерогенни тумори води до оцеляване на част от туморните клетки, дори след продължително лечение с цитостатици. Лечението с високи дози, необходими за пълна ремисия, причинява тежки системни странични ефекти, което често принуждава пациентите да спрат лечението. В допълнение, дългосрочната употреба на химиотерапевтични средства е изпълнена с развитие на резистентност към множество лекарства, което прави използваните лекарства неефективни. Феноменът на лекарствена резистентност се основава на вътреклетъчни механизми от различно естество, като намаляване на транспорта на лекарства през плазмената мембрана, нарушение на нивото на онкогенна експресия, увреждане на системите за сигнална трансдукция и др. За повишаване на ефективността на туморна терапия, е необходимо да се увеличи селективността на действието на лекарствата. Тук могат да се разграничат две посоки: разработването на нови високоселективни лекарства и създаването на нови системи за регулиран транспорт на добре познати противотуморни съединения в таргетните клетки.

Селективността на действието на лекарството може да се увеличи чрез използване на таргетни агенти в системите за доставяне - молекули, които могат да се свързват със специфични детерминанти на клетъчната повърхност. По този начин използването на целевия компонент определя взаимодействието на системата за селективно доставяне със строго определени клетки и тъкани, по-специално туморни клетки. Физиологичните лиганди на рецептори на растежен фактор или онкофетални протеини могат да действат като целеви агенти или вектори; самите растежни фактори и онкофеталните протеини. Противораковото лекарство може да бъде свързано с вектора ковалентно за образуване на конюгат или нековалентно за образуване на силен комплекс. Свързването на целева молекула със специфичен рецептор на клетъчната повърхност индуцира процеса на рецепторно-медиирана ендоцитоза, която осигурява натрупването на лекарство от туморни клетки, чиято молекулярна мишена е разположена вътре в клетката.

Трябва да се отбележи, че в някои случаи използването на селективни системи за доставяне е единственият начин да се използва терапевтичният потенциал на някои силно токсични противотуморни антибиотици, например антибиотици от серията ендиин. Пример за това е лекарството Mylotarg, което е конюгат на калихемиацин Xi с хуманизирани антитела срещу CD33. В допълнение, използването на високоефективни системи за доставяне може значително да увеличи терапевтичния ефект на антисенс олигонуклеотидите, които, за съжаление, все още не са намерили приложение в клиничната практика.

Успешното решаване на проблема с целевия транспорт на лекарства на базата на рецепторно-медиирана ендоцитоза се определя преди всичко от избора на векторна молекула. Протеиновите вектори трябва да отговарят на редица основни изисквания, включително висок афинитет на векторите към съответните рецептори на повърхността на туморните таргетни клетки, висока стабилност, възможност за тяхната химическа модификация чрез конюгиране с химиотерапевтични лекарства без загуба на биологични свойства и наличие на протеини в препаративни количества. Най-точно на тези изисквания отговаря онкофеталният протеин алфа-фетопротеин. Важни фактори при проектирането на системи за селективно доставяне са също изборът на лекарство (цитостатично средство, фотосенсибилизатор, антисенс олигонуклеотид) и линкер, свързващ таргетните и цитостатичните компоненти. Скринингът на конструираните конструкции в системата in vitro и изследването на тяхното вътреклетъчно поведение дава възможност да се идентифицират най-оптималните варианти на системи за доставяне.

Целта на тази работа беше да се разработят принципи за създаване на системи за селективно доставяне на противоракови лекарства и терапевтични олигонуклеотиди до туморни клетки на базата на естествени и рекомбинантни протеини и пептиди и да се идентифицират модели, които определят тяхната ефективност. Цели на изследването:

Селекция на протеинови и пептидни векторни молекули за селективно доставяне на противоракови лекарства и антисенс олигонуклеотиди;

Създаване на конструкции за селективно доставяне на противоракови лекарства до целевите клетки на базата на алфа-фетопротеин и неговите пептидни фрагменти,

Изследване на интернализацията и вътреклетъчното разпределение на лекарствата в зависимост от вида на конструкцията за оптимизиране на системите за доставка;

Разработване на подходи за преодоляване на мултилекарствена резистентност с помощта на целеви системи за доставяне; Разработване на конструкции на базата на алфа-фетопротеин и епидермален растежен фактор за селективно доставяне на антисенс олигонуклеотиди и оценка на тяхната ефективност.

Научна новост и практическо значение.

Наличието на AFP рецептори е доказано както на повърхността на клетки от човешки туморни линии, така и върху хистологични срезове на човешки злокачествени тумори (яйчници, гърди, черен дроб, стомах, черва). На срезове от доброкачествени тумори и нормални тъкани, както и на повърхността на лимфоцити в покой, изолирани от кръвта на здрави доброволци, AFP рецепторът не е открит. Така AFP рецепторът може да се използва като туморен маркер за широк спектър от злокачествени тумори, а антителата към рецептора могат да се използват за диагностициране на тумори.

Формулирана и разработена е концепцията за система за целенасочена доставка на биологично активни съединения към целевите клетки, използваща AFP и неговите пептидни фрагменти като целеви мотив.

Разработени са методи, които позволяват in vitro експерименти в клетъчни култури да предскажат ефективността на лекарства със селективно действие.

За първи път беше установено, че рекомбинантният С-терминален фрагмент на AFP (от 357 до 590 a.a.) се свързва специфично с AFP рецептора, ендоцитизира се от туморни клетки като AFP и подобно на AFP инхибира индуцирания от естрадиол растеж на хормона -зависими туморни клетки. По този начин този рекомбинантен протеин може да се използва като векторна молекула в целеви системи за доставяне.

Създадени генни конструкции за индуцирана биосинтеза на С-терминални фрагменти на AFP в E. coli. Разработени са високоефективни методи за изолиране на рекомбинантни AFP фрагменти.

За първи път е показана способността на биологично активния фрагмент на AFP-октапептида GIP8 (472-479 а.а.) селективно да се свързва с повърхността на туморните клетки и да се интернализира от тях с висока ефективност, което отваря възможността за използване на GIP8 като вектор в целеви системи за доставка.

Доказана е ефикасността и селективността на антитуморната активност на AFP, AFP-ZVS и GIP8 конюгатите in vitro срещу широк спектър човешки туморни клетъчни линии. Изследвани са закономерностите на тяхната вътреклетъчна транслокация, демонстрирана е зависимостта на ефективността на действието на конюгата от лабилността на химичната връзка между протеина и цитостатика.

При използване на целеви системи за доставяне, базирани на AFP, беше открита възможността за преодоляване на мултилекарствената резистентност на туморните клетки поради активността на Pgpl70.

Високата антитуморна ефикасност на AFP конюгата с есперамицин Aib беше демонстрирана за първи път in vivo.

Разработени са системи за селективно доставяне на терапевтични олигонуклеотиди и е демонстрирана фундаменталната възможност и обещание за използване на протеинови вектори (AFP и епидермален растежен фактор) за тяхното целево доставяне до туморни клетки.

Основните разпоредби за защита:

1. AFP рецепторът е уникален тумор-специфичен антиген, който присъства на повърхността на туморните клетки и липсва в повечето нормални клетки.

2. Алфа-фетопротеиновият рецептор може да служи като мишена за селективна антитуморна терапия. Чрез специфично свързване към своя рецептор, алфа-фетопротеинът се интернализира от туморните клетки заедно с молекули от лекарствени съединения, ковалентно свързани с него, като по този начин се осигурява селективно доставяне на лекарства до туморните клетки.

3. Използването на целеви системи за доставяне на базата на алфа-фетопротеин прави възможно преодоляването на мултилекарствената резистентност на туморните клетки, причинена от ABC транспортерите на плазмената мембрана.

4. Рекомбинантни алфа-фетопротеинови фрагменти, съдържащи рецептор-свързващ мотив, могат да бъдат използвани в системи за селективно доставяне вместо естествения протеин с пълна дължина.

5. Използването на протеинови вектори (AFP и епидермален растежен фактор) може значително да увеличи ефективността на вътреклетъчното доставяне на антисенс олигонуклеотиди.

Личният принос на автора се състои в разработването на идеята, организацията и провеждането на експериментални изследвания, анализ, обобщение и интерпретация на получените резултати. Всички експерименти с клетъчни култури са извършени директно от автора. Апробация на работата.

Основните резултати от работата бяха докладвани на V Международен симпозиум по биология и клинична полезност на туморните маркери (1995 г., Барселона, Испания), XVI Intern.

Конгрес по клинична химия, (1996, Лондон), взаимозависимостта на туморната биология и клиничната онкология (1996, Коронадо, САЩ), стр. 121. Среща на Международното общество за онкоразвиваща се биология и медицина (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), Европейската конференция за ракови заболявания ECCO (1997, Франция), Руски национален конгрес "Човекът и лекарството" (2000, 2005, Москва), 37-ма годишна научна среща на Европейското дружество за клинични изследвания (2003, Верона, Италия), 1-ва конференция на EUFEPS за оптимизиране на доставката и формулирането на лекарства: Нови предизвикателства в доставката на лекарства (2003, Версай, Франция), 5-ти семинар на ISTC/Корея по биотехнологии (2004 г., Chungbuk, Корея), Световна конференция за магически куршуми (2004 г., Нюрнберг, Германия), Международна конференция по молекулярна медицина и биобезопасност (2005 г., Москва), III Московски международен конгрес „Биотехнологии: състояние и перспективи за развитие" (2005 г., Москва), Московска международна конференция "Биотехнологии и медицина" (2006 г., Москва), 19-та среща на Европейската асоциация за изследване на рака (EACR), Будапеща, Унгария, 1 -4 юли 2006 г., конференция " Нова технологична платформа за биомедицински изследвания (биология, здравеопазване, фармация)" (2006 г., Ростов на Дон), I Международна научно-практическа конференция "Постгеномни методи за анализ в биологията, лабораторията и клиничната медицина" (2010 г., Москва) .

Структура и обхват на дисертационния труд. Работата е представена на 256 машинописни страници и се състои от въведение, преглед на литературата, описание на методите на изследване, представяне и обсъждане на резултатите, заключение, заключения и списък с литература, който включва 406 източника. Дисертационният труд съдържа 94 фигури и 14 таблици.

Подобни тези по специалност "Биохимия", 03.01.04 код HAC

• Разработване на таргетни противоракови лекарства на базата на пептидни вектори и химиотерапевтични лекарства 2004 г. Доктор Ал-Названи Насър Салем

• Рекомбинантни фрагменти от човешки алфа-фетопротеин за създаване на таргетни лекарства 2012 г., кандидат на биологичните науки Шарапова, Олга Андреевна

• Конструиране на комплекси протеин-нуклеинова киселина за насочен транспорт на чужда ДНК в клетките 2010 г., кандидат на биологичните науки Татаринова, Олга Николаевна

• Синтез и изследване на транспортни форми на противоракови лекарства на базата на алфа-фетопротеин и полимерни наночастици 2000 г., кандидат на биологичните науки Бобрускин, Алексей Игоревич

• Получаване и изследване на антитуморния потенциал на антиангиогенни полипептиди и таргетни химиотерапевтични лекарства 2006 г., кандидат на биологичните науки Дигтяр, Антон Василиевич

Заключение за дисертация по темата "Биохимия", Посипанова, Галина Ароновна

1. Разработена е концепцията за система за целенасочена доставка на биологично активни съединения към туморни клетки, в която алфа-фетопротеинът (AFP) и неговите фрагменти се използват като целеви мотив.

2. Наличието на AFP рецептори е установено както на повърхността на клетки от човешки туморни линии, така и върху клетки от човешки злокачествени тумори (яйчници, гърди, черен дроб, стомах, черва). В срезове от доброкачествени тумори и нормални тъкани, както и на повърхността на лимфоцитите на здрави доброволци, AFP рецепторът не е открит.

3. Доказано е, че не само AFP, но и неговите рекомбинантни С-терминални фрагменти се свързват специфично с AFP рецептора и се ендоцитират от туморни клетки.

4. Установено е, че биологично активният фрагмент на AFP, октапептидът GIP8, селективно се свързва с неизвестен рецептор на повърхността на туморните клетки, интернализира се с висока ефективност и може да се използва като вектор в системи за целево доставяне.

5. Установено е, че конюгатите на противотуморни лекарства с AFP се натрупват селективно от таргетните клетки, имат изразен цитостатичен ефект върху туморните клетки и са с ниска токсичност за нормалните човешки клетки; ефективността на конюгатите се определя от лабилността на химичната връзка между протеина и цитотоксичния агент.

6. Използването на AFP-базирани целеви системи за доставяне прави възможно преодоляването на мултилекарствената резистентност на туморните клетки поради активността на Pgpl70.

7. Ефективността на транспорта на доксорубицин в туморните клетки в състава на конюгати с AFP значително надвишава ефективността на неговия транспорт в състава на конюгати с трансферин и серумен албумин.

8. Високата антитуморна активност на AFP конюгата с есперамицин Aib in vivo беше показана с помощта на трансплантиран миши туморен модел (излекуване -30%, увеличение на продължителността на живота - 163%).

9. Конюгатът на GIP8 AFP фрагмента с доксорубицин селективно се натрупва в чувствителни и резистентни туморни клетъчни линии, има изразен цитостатичен ефект върху туморните клетки и е ниско токсичен за човешки мононуклеарни левкоцити.

Използването на протеинови вектори, базирани на AFP и епидермален растежен фактор за целенасочено доставяне на антисенс олигонуклеотиди към целевите клетки, се оказа обещаващо.

Заключение.

Тази работа е посветена на изследването на закономерностите в дизайна на целеви системи за доставяне на лекарства, базирани на протеинови вектори. Изследването на характеристиките на вътреклетъчната транслокация на изследваните лекарства, тяхното сравнение с биологичната активност срещу туморни и нормални клетки in vitro помага да се предвиди успехът на определена стратегия и по този начин да се оптимизира процеса на създаване на ефективни селективни противоракови лекарства.

Използването на таргетния компонент обуславя взаимодействието на САР със строго определени клетки и тъкани, като по този начин се осигурява селективност на лекарственото действие. Механизмът на рецептор-медиирана ендоцитоза насърчава натрупването на лекарство, чиято молекулярна цел е разположена вътре в клетката.

Сравнението на SAD, които са (векторен протеин)-линкер-(лекарство) конюгати, където серумен албумин, трансферин и алфа-фетопротеин са използвани като векторен протеин, показа предимството на последния както по отношение на способността за натрупване от тумора клетки и по отношение на цитотоксичната активност за тези клетки. Тези конюгати използват хидразид на 3-малеимидобензоена киселина като линкер и доксорубицин като лекарство. Споменатият линкер е киселинно лабилен и може да претърпи хидролиза в клетъчни отделения като ендозоми и лизозоми, като по този начин освобождава лекарството от SAD. Доксорубицин, антибиотик от групата на антрациклините, е ефективен и широко използван терапевтичен агент. Има два основни механизма, чрез които лекарството причинява клетъчна смърт: интеркалиране в ДНК, в резултат на което DOX се вмъква между два съседни нуклеотида, осигурявайки силно взаимодействие с ДНК и нарушавайки репликацията и транскрипцията; свързване и инхибиране на топоизомераза II. Поради наличието на хинонова група в структурата, DOX участва в редокс процеси, което води до образуването на свободни радикали, които предизвикват увреждане на ДНК и липидна пероксидация. Ефективността на DOX терапията зависи от вътреклетъчното му натрупване.

Свободният DOX, поради своята хидрофобност, бързо прониква в клетките и клетъчните ядра. Скоростта на поглъщане от клетките на DOX в състава на конюгата се определя от броя на специфичните рецептори на повърхността на целевите клетки и интензивността на рецептор-медиираната ендоцитоза.

Като векторни протеини (целеви компоненти), в допълнение към AFP, използвахме добре познатите транспортни протеини HSA и Trf, които са активно ендоцитирани от туморни клетки и се използват с различна степен на успех за интратуморно доставяне на лекарства (вижте Преглед на литературата, раздел 1.5). Въпреки това, AFP конюгатът с DOX значително превъзхожда подобни DOX конюгати с HSA и Trf както по отношение на ефективността на натрупване в туморните клетки, така и по отношение на цитотоксичната активност срещу тези клетки.

Изследването на експресията на AFP рецептора върху повърхността на клетки от човешки туморни линии и нормални лимфоцити от периферна кръв, както и върху хистологични срезове на ракови, доброкачествени и нормални тъкани, използвайки моноклонални антитела срещу AFPR, разкри преобладаващото присъствие на този рецептор в злокачествени туморни клетки. По-късно нашите резултати бяха потвърдени от изследване на R. Moro. По този начин AFPR може да служи като уникална мишена на повърхността на туморните клетки, а системите за доставяне, базирани на неговия естествен лиганд, AFP, могат да осигурят селективно доставяне на лекарство до тези клетки. Анализът на свързването и ендоцитозата на флуоресцентно белязан AFP предполага висока ефективност и специфичност на натрупването на AFP в активно пролифериращи туморни клетки и липсата на това натрупване на протеин в непролифериращи лимфоцити.

An in vitro study of the antitumor efficacy of a number of AFP-based conjugates, in which various cytostatics, antitumor antibiotics, antimetabolites, photosensitizers (doxorubicin, daunomycin, calicheamicin, bleomycin, esperamycin, cisplatin, carboxyphosphamide, vinblastine, methotrexate, phthalocyanines) were използвани като цитотоксични компоненти, демонстрират висока селективна антитуморна активност. AFP конюгатът с esperamycin Aib показа значителна ефикасност в in vivo моделни експерименти при лечението на мишки с експериментални тумори, предотвратявайки развитието на тумори и увеличавайки продължителността на живота на животните няколко пъти. Трябва да се отбележи, че този антибиотик, който принадлежи към ендиините, е изключително токсично съединение. Химическата структура на ендииновите антибиотици споделя общ елемент, често наричан "бойна глава", който е 10-членен ендиинов пръстен, съдържащ две ацетиленови връзки в а-позиции към двойната връзка или оксирановия пръстен. При физиологични условия и при определено активиране такава "бойна глава" претърпява пренареждане в реактивен дирадикал. Цитотоксичният ефект на есперамицин се дължи на индуцирането на едно- и двуверижни разкъсвания на ДНК. Клиничните изпитвания на това лекарство завършиха с неуспех поради високата му системна токсичност. Може би единственият начин да се използва потенциалът на този антибиотик е да се увеличи неговата селективност чрез химическо прикрепване към векторни молекули, осигурявайки целенасочена доставка до тумора, което направихме.

Трябва да се отбележи, че изборът на линкер, който свързва векторен протеин с цитотоксичен агент, е от особено значение при проектирането на CAD. Цитостатикът може успешно да бъде доставен до клетката-мишена, но ако не бъде своевременно отцепен от вектора, биологичният ефект или няма да се реализира, или ще бъде слабо изразен. Анализът на ефективността на конюгатите на AFP с DOKS, в който са използвани линкери, различни по своята лабилност, показва, че най-активни са конюгатите, при синтеза на които са използвани глутаралдехид и хидразид на 3-малеимидобензоена киселина. Цитотоксичната активност на AFP конюгатите с DOX корелира с натрупването на DOX в клетъчните ядра: колкото по-бързо се случи това, толкова по-активен беше конюгатът. Когато N-хидроксисукцинимид естер на 3-(2-дитиопиридил)пропионова киселина се използва като линкер, локализацията в DOX клетките е предимно цитоплазмена, дори един ден след приложението на конюгата. В същото време този конюгат показва много ниска активност (25 пъти по-ниска от свободния DOX). Очевидно силната дисулфидна връзка предотвратява бързото разцепване на DOX в ендозоми. В клетките ензимите, способни да възстановят дисулфидната връзка (тиол-протеин дисулфид редуктаза, тиол-протеин дисулфид редуктаза, тиоредоксин, глутаредоксин, гама-интерферон индуцируема лизозомна тиол редуктаза - GILT), са локализирани в микрозомната кухина, в структурите на Голджи комплекс; тиоредоксин и глутаредоксин катализират редукцията на дисулфидните връзки в ядрото и цитоплазмата; GILT - в късните ендозоми/лизозоми (оптимално pH 4-5). Възстановяването на дисулфидните връзки в протеините става в късните ендозоми/лизозоми след ограничена протеолиза от катепсини. Възстановяването на дисулфидната връзка чрез действието на тиол-протеин дисулфид редуктазата се забавя значително с намаляване на pH. Освобождаването на DOX от конюгати, в които антибиотикът е прикрепен към протеина чрез дисулфидна връзка, изглежда е доста бавно, което обяснява ниската цитотоксична активност на такива конюгати. Вторият фактор, който може да повлияе на ефективността на обсъждания конюгат, е модификацията на аминогрупата на захарния остатък на DOX при въвеждането на тиолова група, използвайки SPDP. Въпреки че редица проучвания демонстрират производството на активни конюгати DOX-антитяло, използвайки тази стратегия за синтез, други проучвания показват, че модификацията на DOX с амино захар намалява цитотоксичната активност на този антибиотик и води до загуба на цитотоксичната активност на антрациклина в конюгат.

Въпреки това, използването на SPDP в синтеза на AFP-EsA конюгати се оказа много ефективно. Наистина, цитотоксичността на конюгата при тестване in vitro е в по-голямата си част по-ниска от тази на свободния EsA. Въпреки това, в резултат на повишаване на селективността на действието на EsA в състава на конюгата, беше възможно да се постигне значителен успех при тестването на конюгата in vivo.

Получените резултати позволяват да се предвиди нивото на ефективност на таргетните лекарства на базата на протеинови векторни молекули. Ефективността на такива лекарства зависи не само от векторния протеин, но до голяма степен от вида на химичната връзка между протеина и антитуморния антибиотик. Тази връзка не трябва да бъде прекалено силна, тъй като това губи предимствата на целевото доставяне: въпреки високата вътреклетъчна концентрация на антибиотика, последният може да няма фармакологичен ефект, ако не достигне целта си. Но връзката не трябва да бъде твърде лабилна, тъй като лекарството трябва да запази целостта си, преди да взаимодейства с целевите клетки. В същото време, когато се създава целева конструкция, трябва да се вземе предвид, че разцепването на лекарството (антибиотик, цитостатик и др.) От протеиновата молекула най-вероятно ще се случи в ендозоми при стойности на рН 5,5-6 , тоест линкерът, който свързва AFP молекулата с лекарството, в идеалния случай трябва да бъде хидролизиран при посочените стойности на pH или да бъде субстрат на ендозомни ензими.

Най-важното свойство на синтезираните базирани на AFP конюгати е способността им да обръщат резистентност към множество лекарства поради активността на ABC транспортерите.

Получените резултати ни позволяват да заключим, че AFP може да се използва ефективно като целеви агент за доставяне на противотуморни лекарства до туморни клетки от различен произход.

Може би единственият значителен недостатък на естествения човешки AFP е източникът на неговата изолация: в препаративни количества AFP може да бъде изолиран само от абортивен материал. В кръвта от пъпна връв, биоматериалът, който използвахме, съдържанието на AFP е много по-ниско и всъщност това също не е най-добрият биологичен източник. Затова си поставихме задачата да получим рекомбинантен протеинов вектор - AFP фрагмент, съдържащ рецепторно-свързващо място, идентично с това в естествената молекула. Полученият рекомбинантен С-краен фрагмент на AFP (gAFP27) се свързва специфично с AFP рецептора на туморните клетки и е ендоцитизиран от тях подобно на човешкия AFP с пълна дължина. hAFP27 също така запазва някои други биологични свойства на протеина с пълна дължина. Използването на hAFP27 като вектор в SAD отваря възможността за практическо използване на потенциала на протеина като лиганд за AFPR.

Трансформираните клетки се характеризират с генни промени, свързани с регулирането на клетъчната пролиферация и апоптозата. Сред многобройните изследвания, посветени на разработването на нови селективни агенти за туморни клетки, специално място принадлежи на антисенс олигонуклеотидите. ASONs са един от клас нови агенти, способни да инхибират синтеза на специфични тумор-асоциирани протеини чрез свързване към иРНК, кодираща тези протеини, като по този начин блокират протеиновия синтез. Много модифицирани (по-специално тиофосфатни) ASON in vitro показаха убедително намаляване на експресията на целевия ген и се очакваше да бъдат успешни срещу широк спектър от тумори. Пречка, която намалява селективността на действието на ASON, е настоящата липса на адекватни и ефективни SAD на тези съединения в прицелните клетки, което е необходимо за реализиране на терапевтичния потенциал на ASON.

Трансформираните клетки се характеризират с генни промени, свързани с регулирането на клетъчната пролиферация и апоптозата. Сред многобройните изследвания, посветени на разработването на нови селективни агенти за туморни клетки, специално място принадлежи на антисенс олигонуклеотидите. Антисенс олигонуклеотидите са един такъв клас нови агенти, способни да инхибират синтеза на специфични тумор-асоциирани протеини чрез свързване към иРНК, кодираща тези протеини, като по този начин блокират протеиновия синтез. През последните десетилетия са разработени и тествани в предклинични и клинични проучвания няколко антисенси. Много от тях показаха убедително намаляване на експресията на целевия ген в in vitro системи и се очакваше да бъдат успешни при широк спектър от тумори. Въпреки това, поради генетичната хетерогенност на туморите, използването на антисенс като единствено лекарство не изглежда ефективно при лечението на заболявания. Антисенс терапиите, насочени към сигналните пътища, участващи в клетъчната пролиферация и апоптозата, са особено обещаващи, когато се комбинират с конвенционалните противоракови лечения.

Доставянето на тиофосфат A8(G) до туморните клетки под формата на конюгати с AFP се оказа изключително ефективно, тъй като направи възможно преодоляването на бариерата на цитоплазмената мембрана, която ограничава проникването на ABOI в клетките.Тази ефективност се прояви или под формата на директен цитостатичен ефект или под формата на сенсибилизация на таргетните клетки към действието на други противоракови лекарства.Установено е, че неспецифичната токсичност на някои последователности (G) не е пречка за използването на тези (G) , тъй като използването на векторна молекула в SAD ограничава тяхната токсичност към туморните клетки.Синтезът на конюгатите обаче се оказва много трудоемък процес, придружен от същата значителна загуба на протеин и ABOB.Алтернативни конструкции, които са нековалентни комплекси на протеини с ABOM, може да са по-технологично напреднали. OB, особено техните тиофосфатни аналози, имат висок отрицателен заряд и са в състояние да образуват силни комплекси с поликатионни молекули. За да се повиши ефективността на образуването на такива комплекси, в молекулите на рекомбинантните протеини (hAFP27 и EuR) беше въведена положително заредена последователност, което осигурява тяхното силно взаимодействие с LBM. Получените конструкции се оказаха успешни SBP, които не само значително повишават ефективността на натрупването на ABOB в клетки, характеризиращи се с повишено съдържание на рецептори за горните протеини, но също така защитават естествените фосфодиестерни GO от разграждане. Въпреки това, използването на митоген, който е EOP, като целеви компонент на SAD, ограничава обхвата на прилаганите ABO, предотвратявайки в някои случаи реализирането на биологичен ефект. Възможно е модификацията на рецептор-свързващия участък на EuR молекулата да помогне за решаването на този проблем, в резултат на което способността на рецептора да се активира (способността за автофосфорилиране) ще бъде загубена, но това не засяга способността на рецептора да бъде интернализиран след свързване с неговия лиганд.

Резултатите от експерименталните изследвания, представени в тази статия, показват високата ефективност и селективност на целеви системи за доставяне, базирани на алфа-фетопротеин, неговите фрагменти и модифициран епидермален растежен фактор.

Напредъкът в изследването на молекулярните механизми на патогенезата на заболяването и появата на нови методи в областта на молекулярната биология и биотехнологиите откриват възможности за разработване на нови лекарства, които селективно засягат различни сигнални пътища, характерни за туморните клетки, и по този начин възможността на целево индивидуално лечение, базирано на уникален комплекс от молекулярни мишени, произведени от тумора на пациента. Лекарствата могат да достигнат целта сами (напр. терапевтични антитела) или като част от системи за доставяне, насочени към специфични органи, засегнати от тумора, или директно на повърхността или в раковите клетки. Разбирането на клетъчната биология на тумора, изучаването на микросредата на туморните клетки ще позволи разработването на ефективни варианти за таргетни лекарства.

Списък с литература за дисертационно изследване Доктор на биологичните науки Посипанова, Галина Ароновна, 2013 г

1 Джайн Р.К. Доставяне на молекулярно и клетъчно лекарство към солидни тумори. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. Т. 46. № 1-3. С. 149-168.

2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Доставка на лекарства и транспорт до солидни тумори. // Pharm Res. 2003. Т. 20. № 9. С. 1337-1350.

3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. Преглед на клиничното развитие на ритуксимаб: първото моноклонално антитяло, одобрено за лечение на лимфом. // Semin Oncol. 1999. V. 26. No. 5 Suppl 14. P. 66-73.

4. Huhn D., von Schilling C „ Wilhelm M „ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W „ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab лечение на пациенти с В-клетъчна хронична лимфоцитна левкемия. // Кръв. 2001. Т. 98. № 5. С. 1326-1331.

5. Gribben J.G., Hallek M. Преоткриване на алемтузумаб: настоящи и нововъзникващи терапевтични роли. //Br J Haematol. 2009. Т. 144. № 6. С. 818-831.

6. Ravandi F., O "Brien S. Alemtuzumab при CLL и други лимфоидни неоплазми. // Cancer Invest. 2006. V. 24. No. 7. P. 718-725.

7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Алемтузумаб (Campath-IH) при лечението на хронична лимфоцитна левкемия. // Онкоген. 2007. Т. 26. № 25. P. 3644-3653.

8. Baselga J. Преглед на целевата терапия с EGFR. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. Т. 1. № 4. С. 218-219.

9. Fischgrabe J., Wulfing P. Целеви терапии при рак на гърдата: утвърдени лекарства и скорошни разработки. // Curr Clinic Pharmacol. 2008. Т. 3. № 2. С. 85-98.

10. Goldenberg M.M. Трастузумаб, получено от рекомбинантна ДНК хуманизирано моноклонално антитяло, ново средство за лечение на метастатичен рак на гърдата. // Clin Ther. 1999. Т. 21. № 2. С. 309-318.

11. Slamon D.J., Кларк G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Рак на гърдата при хора: корелация на рецидив и преживяемост с усилване на онкогена HER-2/neu. // Наука. 1987. V. 235. № 4785. С. 177-182.

12. Азим Х., Азим Х.А., младши Насочване към Her-2/neu при рак на гърдата: толкова лесно! // Онкология. 2008. Т. 74. № 3-4. С. 150-157.

13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado B., Gascon P. Механизъм на действие на анти-HER2 моноклонални антитела: научна актуализация на трастузумаб и 2C4. // Adv Exp Med Biol. 2003. В. 532. С. 253-268.

14. Stern M., Herrmann R. Преглед на моноклоналните антитела в терапията на рак: настояще и обещание. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. Т. 54. № 1. С. 11-29.

15. Gutheil J. Обещанието за моноклонални антитела за лечение на рак. // Crit Rev Oncol Hematol. 2001. Т. 38. № 1. С. 1-2.

16. Moiseenko B.M. Моноклонални антитела при лечението на злокачествени тумори. // Практическа онкология. 2003. Т. 4. № 3. Р. 148-156.

17. Guillemard V., Uri Saragovi H. Пролекарствени химиотерапевтици заобикалят р-гликопротеинова резистентност и убиват тумори in vivo с висока ефикасност и целево-зависима селективност. // Онкоген. 2004. Т. 23. № 20. P. 3613-3621.

18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Technology Insight: имуноконюгати на цитотоксични лекарства за лечение на рак. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. Т. 4. № 4. С. 245-255.

19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) за рецидивиращи CD30-позитивни лимфоми. // New England Journal of Medicine. V. 363. № 19. С. 1812-1821.

20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. Фаза I проучване на Trastuzumab

21. DM1, конюгат HER2 антитяло-лекарство, даван на всеки 3 седмици на пациенти с HER2-положителен метастатичен рак на гърдата. // Вестник по клинична онкология. Т. 28. № 16. P. 2698-2704.

22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: анти-CD33 имуноконюгат за лечение на остра миелоидна левкемия. // Expert Opin Biol Ther. 2008. Т. 8. № 4. С. 527-540.

23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O "Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. Ролята на гемтузумаб озогамицин в терапията на остра левкемия. // Br J Haematol. 2006. V. 132. No. 4. P 398-409.

24. Гао З., МакАлистър В.К., Уилямс Г.М. Репопулация на чернодробен ендотел от клетки, получени от костен мозък. // Ланцет. 2001. V. 357. № 9260. С. 932-933.

25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Калихеамицин гама II: противотуморен антибиотик, който разцепва специфично мястото на двойноверижната ДНК. // Наука. 1988. V. 240. № 4856. С. 1198-1201.

26. Reiter Y. Рекомбинантни имунотоксини в целева терапия с ракови клетки. // Adv Cancer Res. 2001. Т. 81. С. 93-124.

27. Goyal A., Batra J.K. Включването на чувствителен към фурин спейсер повишава цитотоксичността на риботоксин рестриктоцин, съдържащ рекомбинантни едноверижни имунотоксини. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.

28. Kreitman R.J. Рекомбинантни имунотоксини, съдържащи пресечени бактериални токсини за лечение на хематологични злокачествени заболявания. // Биолекарства. 2009. Т. 23. № 1. С. 1-13.

29. Джейн Р.К., Бакстър Л.Т. Механизми на хетерогенно разпределение на моноклонални антитела и други макромолекули в тумори: значение на повишеното интерстициално налягане. // Cancer Res. 1988. V. 48. No. 24 Pt 1. P. 7022-7032.

30. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Терапия с моноклонални антитела при солидни тумори. // Cancer Treat Rev. 2000. Т. 26. № 4. С. 269-286.

31. Brada M. BCL2 ген: текущо значение за клиничната онкология. // Eur J Рак. 1992. Т. 28. № 1. С. 270-272.

32. Yip K.W., Рийд J.C. Протеини от семейство Bcl-2 и рак. // Онкоген. 2008. Т. 27. № 50. P. 6398-6406.

33 Рийд J.C. Семейство протеини Bcl-2: стратегии за преодоляване на химиорезистентността при рак. //Adv Pharmacol. 1997. Т. 41. С. 501-532.

34 Рийд J.C. Bel-2 семейство протеини: регулатори на химиорезистентност при рак. // Toxicol Lett. 1995. Т. 82-83. С. 155-158.

35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen при лечението на метастатичен меланом. // Бъдещ онкол. 2007. Т. 3. № 3. С. 263-271.

36. Облимерсен: Augmerosen, BCL-2 антисенс олигонуклеотид Genta, G 3139, GC 3139, облимерсен натрий. // Лекарства Р Д. 2007. Т. 8. № 5. С. 321-334.

37. Manoharan M. Олигонуклеотидни конюгати като потенциални антисенс лекарства с подобрено усвояване, биоразпределение, насочена доставка и механизъм на действие. /"/ Antisense Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. No. 2. P. 103-128.

38. Abels C. Насочване към съдовата система на солидни тумори чрез фотодинамична терапия (PDT). // Photochem Photobiol Sci. 2004. Т. 3. № 8. С. 765-771.

39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. Механизми за директно увреждане на тумора на фотодинамичната терапия. // Acta Biochim Pol. 2005. Т. 52. № 2. С. 339-352.

40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Фотодинамична терапия (PDT): кратък преглед на клетъчните механизми и приложенията за изследване на рака за PDT. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. No. 1. С. 1-8.

41. Aveline B.M., Redmond R.W. Ексклузивни свободни радикални механизми за клетъчна фотосенсибилизация. // Фотохимия и фотобиология. 1998. Т. 68. № 3. С. 266-275.

42. Henderson B.W., Dougherty T.J. Как действа фотодинамичната терапия? // Photochem Photobiol. 1992. Т. 55. № 1. С. 145-157.

43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Нежелана реакция, характеризираща се с болка в гърдите, задух и синкоп, свързани с вертепорфин (visudyne). // Am J Ophthalmol. 2002. Т. 134. № 2. С. 281-282.

44. Cheng Y., A CS, Meyers JD, Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Високоефективно доставяне на лекарства с вектори от златни наночастици за in vivo фотодинамична терапия на рак. // J Am Chem Soc. 2008. Т. 130. № 32. P. 10643-10647.

45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Насочена фотодинамична терапия чрез рецепторно медиирани системи за доставяне. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. Т. 56. № 1. С. 53-76.

46. ​​​​Oleinick N.L., Evans H.H. Фотобиологията на фотодинамичната терапия: клетъчни цели и механизми. // Radiat Res. 1998. Т. 150. № 5 Доп. С. S146-156.

47. Розенкранц А.А., Янс Д.А., Соболев А.С. Целенасочена вътреклетъчна доставка на фотосенсибилизатори за подобряване на фотодинамичната ефективност. // Immunol Cell Biol. 2000. Т. 78. № 4. С. 452-464.

48. Розанова Торшина Н., Джан Дж.З., Хек Д.Е. Каталитична терапия на рак с порфирини и аскорбат. // Cancer Lett. 2007. Т. 252. № 2. С. 216-224.

49. Хорошева E.V., Герасимова G.K., Kaliya O.J1. Изследване на механизма на терафтален транспорт в туморни клетки

50. Руско биотерапевтично списание 2007. Т. 6. № 1. Р. 8.

51. Кулбачевская Н.Ю., Манзюк Л.В., Михайлова JI.M. Клинично и експериментално изследване на токсичността на противотуморната каталитична система "терафтал + аскорбинова киселина" ("TF + AA"). // Руско биотерапевтично списание. 2004. Т. 3. № 2. Р. 70.

52. Рави Кумар М.Н. Нано и микрочастиците като устройства за контролирано доставяне на лекарства. // J Pharm Pharm Sci. 2000. Т. 3. № 2. С. 234-258.

53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Наночастици и целеви системи за лечение на рак. // Adv Drug Deliv Rev. 2012.В.П.

54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Технологията, свързана с албумин с наночастици (nab), е обещаващ метод за доставяне на противоракови лекарства. // Скорошен Pat Anticancer Drim Dkrnv 9PP9 V P

55. Karmali P.P., Kotamraju VR, Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Насочване на вградени в албумин наночастици паклитаксел към тумори. //Наномедицина. 2009. V, 5. № 1. С. 73-82.

56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paclitaxel за рак на гърдата: нова формула с подобрен профил на безопасност и по-голяма ефикасност. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. Т. 7. № 7. С. 919-943.

57. Морено-Аспитиа А., Перес Е.А. Паклитаксел, свързан с албумин от наночастици (ABI-007): по-нова алтернатива на таксан при рак на гърдата. // Бъдещ онкол. 2005. Т. 1. № 6. С. 755-762.

58. Bareford L.M., Swaan P.W. Ендоцитни механизми за целево доставяне на лекарства. // Разширени прегледи за доставка на лекарства. 2007. Т. 59. № 8. С. 748-758.

59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-зависима ендоцитоза. // Biochem J. 2004. V. 377. No. Pt l.P. 1-16.

60. Rodemer C, Haucke V. Clathrin/AP-2-зависима ендоцитоза: нова площадка за фармакологичния инструментариум? // Handb Exp Pharmacol. 2008. В. № 186. С. 105-122.

61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-зависима ендоцитоза. // Биохимичният журнал. 2004. V. 377. No. Pt 1. P. 1-16.

62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Допълнителни фактори в клатрин-зависимата ендоцитоза на синаптичните везикули. //Nat Rev Neurosci. 2000. Т. 1. № 3. С. 161-172.

63. Марш М., Макмеън Х.Т. Структурната ера на ендоцитозата. // Наука. 1999. V. 285. № 5425. С. 215-220.

64. Bareford L.M., Swaan P.W. Ендоцитни механизми за целево доставяне на лекарства. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. Т. 59. № 8. С. 748-758.

65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. Dynamin се самосглобява в пръстени, което предполага механизъм за пъпкуване на покрити везикули. // Природа. 1995. V. 374. № 6518. С. 190-192.

66. Ferguson SM, De Camilli P. Dynamin, ремоделираща мембраната GTPase. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. Т. 13. № 2. С. 75-88.

67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Цитоплазмен динеин-зависим везикуларен транспорт от ранни до късни ендозоми. // Вестник за клетъчна биология. 1993. V. 123. No. 6 Pt 1. P. 1373-1387.

68. Stahl P.D., Barbieri M.A. Мултивезикуларни тела и мултивезикуларни ендозоми: "вътрешностите и недостатъците" на ендозомния трафик. // Science "s STKE: среда за знания за сигнална трансдукция. 2002. V. 2002. № 141. P. pe32.

69. Piper R.C., Luzio J.P. Късни ендозоми: сортиране и разделяне в мултивезикуларни тела. // Трафик. 2001. Т. 2. № 9. С. 612-621.

70. Pillay CS, Elliott E., Dennison C. Ендолизозомна протеолиза и нейното регулиране. // Биохимичният журнал. 2002. V. 363. No. Pt 3. P. 417-429.

71. Ескелинен Е.-Л. Роли на LAMP-1 и LAMP-2 в лизозомната биогенеза и автофагия. // Молекулярни аспекти на медицината. 2006. Т. 27. № 5-6. С. 495-502.

72. Смарт E.J., Graf GA, McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman JA, Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Кавеолини, течно подредени домейни и сигнална трансдукция. // Mol Cell Biol. 1999. Т. 19. № 11. P. 7289-7304.

73. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. ​​​​Пътища на усвояване и последващ вътреклетъчен трафик при доставка на невирусен ген. // Pharmacol Rev. 2006. Т. 58. № 1. С. 32-45.

74. Lajoie P., Nabi I.R. Глава 3 Липидни салове, кавеоли и тяхната ендоцитоза. В: Kwang WJ, редактор. Международен преглед на клетъчната и молекулярната биология: Academic Press; 2010.p. 135163.

75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Клатрин- и кавеолин-1-независима ендоцитоза: навлизане на маймунски вирус 40 в клетки, лишени от кавеоли. // J Cell Biol. 2005. Т. 168. № 3. С. 477-488.

76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. Целенасочена вътреклетъчна доставка на терапевтици: преглед. // Die Pharmazie. 2007. Т. 62. № 9. С. 643-658.

77. Fenton C., Perry C.M. Гемтузумаб озогамицин: преглед на употребата му при остра миелоидна левкемия. //Наркотици. 2005. Т. 65. № 16. P. 2405-2427.

78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Нови CD20 моноклонални антитела за лечение на лимфом. // Journal of Hematology & Oncology. 2012. Т. 5. № 1. стр. 64.

79. Чари Р.В.Й. Целева терапия на рак: придаване на специфичност на цитотоксичните лекарства. // Сметки за химически изследвания. 2007. Т. 41. № 1. С. 98-107.

80. Casi G., Neri D. Конюгати антитяло-лекарство: основни понятия, примери и бъдещи перспективи. // Журнал за контролирано освобождаване: официален вестник на Обществото за контролирано освобождаване. 2012. Т. 161. № 2. С. 422-428.

81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren T., Venkatachalam T., Waddick K.G., Ростостев A., Myers D.E. Цитотоксична активност на епидермален растежен фактор-генистеин срещу клетки от рак на гърдата. // Clin Cancer Res. 1998. Т. 4. № 4. С. 901-912.

82. Рихова Б. Насочване на лекарствата към рецепторите на клетъчната повърхност. // Критични прегледи в биотехнологиите. 1997. Т. 17. № 2. С. 149-169.

83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Последни постижения в конюгатите на противоракови лекарства, насочени към тумор. // Биоорганична и медицинска химия. 2005. Т. 13. .№17. P. 50435054.

84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Вътреклетъчно доставяне на противоракови агенти на базата на пролекарство. // Разширени прегледи за доставка на лекарства. 2011. Т. 63. № 1-2. С. 3-23.

85. Сингх Й., Паломбо М., Синко П. Дж. Последни тенденции в дизайна на целеви противоракови пролекарства и конюгати. // Съвременна медицинска химия. 2008. Т. 15. № 18. С. 1802-1826.

86. Sanderson R.J., Hering M.A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. In vivo стабилност на лекарство-линкер на анти-CD30 дипептид-свързан ауристатин имуноконюгат. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. No. 2 Pt 1. P. 843-852.

87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Нелинейна фармакокинетика на терапевтични протеини в резултат на медиирана от рецептор ендоцитоза. // J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2009. Т. 36. № 3. С. 239-260.

88. Малянкар У.М. Тумор-свързани антигени и биомаркери при рак и имунна терапия. // Int Rev Immunol. 2007. Т. 26. № 3-4. С. 223-247.

89. Тюряева И.И. туморни антигени. // Цитология. 2008. Т. 50. № 3. Р. 189-209.

90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon T., van der Bruggen P. Пептид MAGE-A4, представен от HLA-A2, се разпознава от цитолитичните Т лимфоцити. // Eur J Immunol. 1999. Т. 29. № 10. P. 3329-3337.

91. Houghton A.N. Ракови антигени: имунно разпознаване на себе си и променено себе си. // J Exp Med. 1994. Т. 180. № 1. С. 1-4.

92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Ганглиозиди на нормални и неопластични човешки меланоцити. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. Т. 120. № 2. С. 500-504.

93. Tang CK, Katsara M., Apostolopoulos V. Стратегии, използвани за MUC1 имунотерапия: клинични проучвания при хора. // Expert Rev Vaccines. 2008. Т. 7. № 7. С. 963-975.

94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Роля на семейството HER рецептори в развитието и диференциацията. //J Cell Physiol. 2004. Т. 200. № 3. С. 343-350.

95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. Сигналната мрежа ErbB: хетеродимеризация на рецептора при развитие и рак. // ЕМБО Ж. 2000. Т. 19. № 13. P. 3159-3167.

96. Баришников А.Ю. Връзката между тумора и имунната система на организма. // Практическа онкология. 2003. Т. 4. № 3. Р. 127-130.

97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Карциноембрионален антиген като мишена на ваксината. // Expert Rev Vaccines. 2008. Т. 7. № 7. С. 987-993.

98. Singer JW, De Vries P., Bhatt R, Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis RA, Wallace S. Конюгиране на камптотецини с поли-(L-глутаминова киселина). // Ann N Y Acad Sci. 2000. В. 922. С. 136-150.

99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Цитофлуоресцентно откриване на адриамицин-митохондриални взаимодействия в изолирано, перфузирано сърце на плъх. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. № 1. С. 35-41.

100. Евдокимова V.N., Butterfield L.H. Алфа-фетопротеин и други тумор-асоциирани антигени за имунотерапия на хепатоцелуларен рак. // Expert Opin Biol Ther. 2008. Т. 8. № 3. P. 325336.

101. Абелев G.I., Eraiser T.L. Клетъчни аспекти на повторната експресия на алфа-фетопротеин в тумори. // Semin Cancer Biol. 1999. Т. 9. № 2. С. 95-107.

102. Mizejewski G.J. Структура и функция на алфа-фетопротеин: значение за изоформи, епитопи и конформационни варианти. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. Т. 226. № 5. С. 377-408.

103. Кастели С., Риволтини Л., Андреола Г., Караба М., Ренквист Н., Пармиани Г. Т-клетъчно разпознаване на антигени, свързани с меланома. // J Cell Physiol. 2000. Т. 182. № 3. С. 323-331.

104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. Ново семейство от гени, кодиращи антиген, разпознат от автоложни цитолитични Т лимфоцити върху човешки меланом. // J Exp Med. 1995. Т. 182. № 3. С. 689-698.

105. Люис Дж. Дж., Хаутън А.Н. Дефиниция на туморни антигени, подходящи за конструиране на ваксина. // Semin Cancer Biol. 1995. Т. 6. № 6. С. 321-327.

106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Лекарствено насочване при лечение на рак: активни даунорубицин-протеинови конюгати. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pt A. P. 291-298.

107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Туморна съдова пропускливост и EPR ефектът в макромолекулната терапия: преглед. // J Контролно освобождаване. 2000. Т. 65. № 1-2. С. 271-284.

108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Ранна фаза на туморно натрупване на макромолекули: голяма разлика в скоростта на изчистване между туморни и нормални тъкани. // Jpn J Cancer Res. 1998. Т. 89. № 3. С. 307-314.

109. Kratz F., Beyer U. Серумни протеини като лекарствени носители на противоракови агенти: преглед. // Drug Deliv. 1998. Т. 5. № 4. С. 281-299.

110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Приготвяне, характеризиране и in vitro ефикасност на албуминови конюгати на доксорубицин. // Biol Pharm Bull. 1998. Т. 21. № 1. С. 56-61.

111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Албуминови конюгати на противораковото лекарство хлорамбуцил: синтез, характеризиране и in vitro ефикасност. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. Т. 331. № 2. С. 47-53.

112. Асоциация по медицинска онкология на Германското онкологично дружество. // Clin Cancer Res. 1999. Т. 5. № 4. С. 753-759.

113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. Синтез, профил на разцепване и антитуморна ефикасност на албумин-свързващо пролекарство на метотрексат, което се разцепва от плазмин и катепсин B. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. Т. 340. № 8. С. 389-395.

114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Разработване и in vitro ефикасност на нови MMP2 и MMP9 специфични доксорубицин албуминови конюгати. // Bioorg Med Chem Lett. 2001. Т. 11. № 15. П. 2001-2006.

115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Лекарствено-полимерни конюгати, съдържащи киселинно разцепващи се връзки. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. Т. 16. № 3. С. 245-288.

116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung DE, Gitzel M. Пролекарства на антрациклини при химиотерапия на рак. // Curr Med Chem. 2006. Т. 13. № 5. С. 477-523.

117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. Фаза I и фармакокинетично изследване на (6-малеимидокапроил)хидразон производно на доксорубицин. // Clin Cancer Res. 2007. Т. 13. № 16. P. 4858-4866.

118. Kratz F., Mansour A., ​​​​Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Разработване на албумин-свързващи доксорубицин пролекарства, които се разцепват от специфичен за простатата антиген. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. Т. 338. № 10. С. 462-472.

119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. In vitro и in vivo изследване на албумин-свързващо пролекарство на доксорубицин, което се разцепва от катепсин B. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. Т. 64. № 2. С. 413-418.

120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Разработване на протеин-свързващи бифункционални линкери за ново поколение двойно действащи пролекарства. // Bioconjug Chem. 2009. Т. 20. № 2. С. 390-396.

121. Abu Ajaj K., Kratz F. Разработване на пролекарства с двойно действие за заобикаляне на резистентност към множество лекарства. // Bioorg Med Chem Lett. 2009. Т. 19. № 3. С. 995-1000.

122. Dautry-Varsat A. Рецепторно-медиирана ендоцитоза: вътреклетъчното пътуване на трансферин и неговия рецептор. // Биохимия. 1986. Т. 68. № 3. С. 375-381.

123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez JA, Helguera G., Penichet M.L. Трансфериновият рецептор част I: Биология и насочване с цитотоксични антитела за лечение на рак. // Clin Immunol. 2006. Т. 121. № 2. С. 144-158.

124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: структура, функция и потенциални терапевтични действия. // Drug Discov Today. 2005. Т. 10. № 4. С. 267-273.

125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Трансферин насочено доставяне на адриамицин към човешки клетки. // Anticancer Res. 1998. Т. 18. № 3А. С. 1423-1427.

126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. Адриамициновите конюгати на човешки трансферин свързват трансфериновите рецептори и убиват клетките K562 и HL60. // Arch Biochem Biophys. 1993. Т. 300. № 1. С. 356-363.

127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. Инхибиране на трансплазмения мембранен електронен транспорт от трансферин-адриамицин конюгати. // Biochim Biophys Acta. 1992. Т. 1105. № 1. С. 84-88.

128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Влияние на конюгацията на доксорубицин с трансферин върху усвояването на желязо от K562 клетки чрез рецептор-медиирана ендоцитоза. // Eur J Biochem. 1993. Т. 213. № 1. С. 427-436.

129 Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Механизъм на действие и спектър на клетъчни линии, чувствителни към конюгат доксорубицин-трансферин. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. Т. 41. № 2. P. 155160.

130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. Рецепторът за трансферин, част II: целево доставяне на терапевтични агенти в раковите клетки. // Clin Immunol. 2006. Т. 121. № 2. С. 159-176.

131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. In vitro цитотоксичност и in vivo разпределение на комплекс трансферин-платина (II). // J Pharm Sci. 1995. Т. 84. № 2. С. 216-221.

132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. Предварителна оценка на платинов трансферин (MPTC-63) като потенциално нетоксично лечение на рак на гърдата. // Откриване на рак Предишна. 1988. Т. 12. № 1-6. С. 469-480.

133. Head J.F., Wang F., Elliott R.L. Тайландските антинеопластични лекарства пречат на метаболизма на желязото в раковите клетки. //Adv Enzyme Regul. 1997. Т. 37. С. 147-169.

134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Синтез и in vitro ефикасност на трансферинови конюгати на противораковото лекарство хлорамбуцил. // J Med Chem. 1998. Т. 41. № 15. P. 2701-2708.

135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Туморно насочване въз основа на ефекта на повишена пропускливост и задържане (EPR) и механизма на рецептор-медиирана ендоцитоза (RME). // Int J Pharm. 2004. Т. 277. № 1-2. С. 39-61.

136. Франкел А.Е. Повишена сложност на имунотоксините. // Clin Cancer Res. 2002. Т. 8. № 4. С. 942-944.

137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Имунотоксинова терапия на хематологични злокачествени заболявания. // Semin Oncol. 2003. Т. 30. № 4. С. 545-557.

138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. Ефикасност на имунотоксини, насочени към рецептор на трансферин, в клетъчни линии на мозъчни тумори и педиатрични мозъчни тумори. // Cancer Res. 1993. Т. 53. № 6. С. 1348-1353.

139. Weaver M., Laske D.W. Трансферинов рецепторен лиганд-насочен конюгат на токсин (Tf-CRM107) за терапия на злокачествени глиоми. // J Neuroncol. 2003. Т. 65. № 1. С. 3-13.

140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. Понижаването на c-FLIP сенсибилизира DU145 раковите клетки на простатата към Fas-медиирана апоптоза. // Cancer Biol Ther. 2002. Т. 1. № 4. С. 401-406.

141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. Насочването на хлорин е6, медиирано от епидермален растежен фактор, селективно потенцира неговата фотодинамична активност. // Cancer Res. 2000. Т. 60. № 8. P. 2197-2202.

142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. EGF-рицин А конюгати: кинетични профили на цитотоксични ефекти и резистентни клетъчни варианти. // Функция на структурата на клетката. 1984. Т. 9. № 3. С. 203-212.

143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. Физико-химични изисквания за клетъчно усвояване на pAntp пептид. Роля на липидосвързващия афинитет. // Eur J Biochem. 2001. Т. 268. № 5. С. 1304-1314.

144. Vives E., Richard J.P., Rispal C., Lebleu B. TAT пептидна интернализация: търсене на механизма на влизане. // Curr Protein Pept Sci. 2003. Т. 4. № 2. С. 125-132.

145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Нови пептидни конюгати даунорубицин-носител, получени от сегменти на човешки калцитонин. // J Mol Recognit. 2003. Т. 16. № 5. С. 280-287.

146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. Инхибирането на теломерите и разрушаването на теломерите като процеси за насочване на лекарства. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. Т. 43. С. 359-379.

147. Chomczynski P., Sacchi N. Едноетапен метод за изолиране на РНК чрез екстракция с кисел гуанидиниев тиоцианат-фенол-хлороформ. // Аналитична биохимия. 1987. Т. 162. № 1. P. 156159.

148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Аденокарциномните клетки са насочени от новия химерен токсин GnRH-PE66 чрез специфични места за свързване на гонадотропин-освобождаващ хормон. // J Biol Chem. 1997. Т. 272. № 17. P. 11597-11603.

149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. Слят протеин на дифтериен токсин-епидермален растежен фактор е цитотоксичен за човешки мултиформени глиобластомни клетки. // Cancer Res. 2003. Т. 63. № 8. С. 1834-1837.

150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. Насочване към рецептора на епидермалния растежен фактор в клетъчни линии на рак на гърдата с рекомбинантен лиганден слят токсин (DAB389EGF). // Cancer J Sci Am. 1996. Т. 2. № 3. С. 175-180.

151. Turturro F. Denileukin diftitox: промяна на биотерапевтичната парадигма при лечението на заболявания, произтичащи от лимфоиди. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. Т. 7. № 1. С. 11-17.

152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox като нова таргетна терапия за лимфоидни злокачествени заболявания. // Cancer Invest. 2007. Т. 25. № 6. С. 495-501.

153. Duvic M., Talpur R. Оптимизиране на терапията с денилевкин дифтитокс (Ontak). // Бъдещ онкол. 2008. Т. 4. № 4. С. 457-469.

154. Фос Ф. Клиничен опит с денилевкин дифтитокс (ONTAK). // Semin Oncol. 2006. V. 33. No. 1 Suppl 3. P. SI 1-16.

155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. Нови терапии за хронична лимфоцитна левкемия. // Blood Rev. 2004. Т. 18. № 2. С. 137-148.

156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox като нова таргетна терапия при неходжкинов лимфом. // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. No. 2. P. 169-174.

157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: кратък клиничен преглед. // Expert Rev Anticancer Ther. 2005. Т. 5. № 1. С. 33-38.

158. Black J.H., McCubrey JA., Willingham MC., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. Дифтериен токсин-интерлевкин-3 слят протеин (DT(388)IL3) удължава преживяемостта без заболяване на левкемични имунокомпрометирани мишки. // Левкемия. 2003. Т. 17. № 1. С. 155-159.

159. Frankel A., Liu JS, Rizzieri D., Hogge D. Фаза I клинично проучване на дифтериен токсин-интерлевкин 3 протеин при пациенти с остра миелоидна левкемия и миелодисплазия. // Leuk лимфом. 2008. Т. 49. № 3. С. 543-553.

160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. IL-4 и IL-13 псевдомонас екзотоксини: нова надежда за терапия на мозъчен тумор. // Неврохирургичен фокус. 2006. Т. 20. № 4. П. Ел 1.

161. Терапия с и без темозоломид при новодиагностицирани злокачествени глиоми: Фаза 1 на проучване на крайните резултати за безопасност. //Неврохирургия. 2008.В.П.

162. Jarboe JS, Johnson KR, Choi Y., Lonser RR, Park J.K. Експресия на интерлевкин-13 рецептор алфа2 в мултиформен глиобластом: последици за целевите терапии. // Cancer Res. 2007. Т. 67. № 17. P. 7983-7986.

163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: нов прототип на човешки химерни протеини за таргетна терапия. // FEBS Lett. 1999. Т. 457. № 2. С. 271-276.

164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Механизъм на действие на интерлевкин-2 (IL-2)-Bax, индуциращ апоптоза химерен протеин, насочен срещу клетки, експресиращи IL-2 рецептор. // Biochem J. 2003. V. 370. No. Pt 1. P. 129-140.

165. Bergstrand C.G., Czar B. Демонстрация на нова протеинова фракция в серум от човешки плод. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. Т. 8. № 2. стр. 174.

166. Абелев Г.И., Перова С.Д., Храмкова Н.И., Постникова З.А., С.И.И. Ембрионален серумен а-глобулин и неговият синтез чрез трансплантирани миши хепатоми. // Биохимия. 1963. Т. 28. № 4. Р. 625-634.

167. Татаринов Ю.С. Откриване на ембрион-специфичен a-глобулин в кръвния серум на пациент с първичен рак на черния дроб. // Въпрос. пчелен мед. химия. 1964. Т. 10. Р. 90-91.

168. Абелев Г.И., Елгорт Д.А. Алфа-фетопротеин като имунологичен маркер на хепатоцелуларен рак и тератокарцином на тестисите и яйчниците. // Онкология. 1978. Т. 10. Р. 3-17.

169. Brock D.J., Bolton A.E., Monaghan J.M. Пренатална диагностика на аненцефалия чрез измерване на майчиния серумен алфафетопротеин. // Ланцет. 1973. Т. 2. № 7835. С. 923-924.

170. Aitken D.A., Crossley J.A. Дефекти на невралната тръба / алфа-фетопротеин / скрининг на синдрома на Даун. // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. No. 2. P. 113-120.

171. Deutsch H.F. Химия и биология на алфа-фетопротеина. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.t "t i ng. zjj-j1z.

172 Luft A.J., Lorscheider F.L. Структурен анализ на човешки и говежди алфа-фетопротеин чрез електронна микроскопия, обработка на изображения и кръгов дихроизъм. // Биохимия. 1983. Т. 22. № 25. P. 5978-5981.

173 Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake C., Ho S.K. Структури на специфични за болестта серумни алфа-фетопротеинови изоформи. // Br J Рак. 2000. Т. 83. № 10. С. 1330-1337.

174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. Наличието на мастни киселини в човешкия алфа-фетопротеин. // J Biol Chem. 1978. Т. 253. № 7. С. 2114-2119.

175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Тандемно подреждане на гените за албумин и алфа-фетопротеин в човешкия геном. // ген. 1984. Т. 32. № 3. С. 255-261.

176. Лазаревич Н.Л. Молекулярни механизми на регулация на генната експресия на алфа-фетопротеин. // Биохимия. 2000. Т. 65. № 1. Р. 139-158.

177. Jose-Estanyol M., Danan J.L. Специфичен за черния дроб фактор и ядрен фактор I се свързват с алфа-фетопротеиновия промотор на плъх. // J Biol Chem. 1988. Т. 263. № 22. P. 10865-10871.

178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Хепатоцитният ядрен фактор 3 облекчава медиираната от хроматин репресия на алфа-фетопротеиновия ген. // J Biol Chem. 1999. Т. 274. № 35. P. 25113-25120.

179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. Алфа 1-фетопротеиновият локус се активира от ядрен рецептор на Drosophila FTZ- F1 семейство. // Mol. клетка. Biol. 1996. Т. 16. № 7. P. 3853-3865.

180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 е репресор на експресията на а-фетопротеин в човешки хепатомни клетъчни линии. // Вестник за клетъчна и молекулярна медицина. 2008. Т. 12. № 6б. P. 2772-2780.

181 Van Reeth T, Gabant P, Szpirer C, Szpirer J. Стимулиране на алфафеиопроеиновия промотор чрез нелигандиран рецептор на тиреоиден хормон във връзка с протеиново деацетилиране. // Молекулярна и клетъчна ендокринология. 2002. Т. 188. № 1-2. С. 99-109.

182. Lienard P., De Mees C., Drnze PL, Dieu M., Dierick JF, Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Регулиране на алфа-фетопротеиновия промотор: Ku свързване и пространствена конформация на ДНК. // Биохимия. 2006. Т. 88. № 10. С. 1409-1417.

183. Mizejewski G.J. Биологични роли на алфа-фетопротеина по време на бременност и перинатално развитие. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. Т. 229. № 6. С. 439-463.

184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. Мястото на свързване на мастни киселини на човешки алфа-фетопротеин. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. Т. 196. № 3. С. 1049-1057.

185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Ефект на алфа-фетопротеин и албумин върху усвояването на полиненаситени мастни киселини от хепатомни клетки на плъх и фетални хепатоцити на плъх. // Biochim Biophys Acta. 1991. Т. 1086. № 1. С. 81-88.

186. Mizejewski G.J., Pass K.A. Мастни киселини, алфа-фетопротеин и кистозна фиброза. // Педиатрия. 2001. Т. 108. № 6. С. 1370-1373.

187. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Ефекти на тежките метали върху алфа-фетопротеина в майчините серуми и амниотичната течност на бременни мишки. // Токсикология. 1990. Т. 64. № 1. С. 19-32.

188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. Пречистен човешки алфа-фетопротеин инхибира стимулираното от фоликулостимулиращия хормон производство на естрадиол от свински гранулозни клетки в култура. // Mol Cell Endocrinol. 1993. Т. 94. № 1. С. 21-25.

189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Естрадиол-активираният алфа-фетопротеин потиска утеротропния отговор към естрогените. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. Т. 80. № 9. P. 2733-2737.

190. Jacobson H.I., Bennett JA, Mizejewski G.J. Инхибиране на естроген-зависим растеж на рак на гърдата чрез реакционен продукт на алфа-фетопротеин и естрадиол. // Cancer Res. 1990. Т. 50. № 2. С. 415-420.

191. Mizejewski G.J., Warner A.S. Алфа-фетопротеинът може да регулира растежа в матката на незрели и възрастни овариектомирани мишки. // J Reprod Fertil. 1989. Т. 85. № 1. С. 177-185.

192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Изследвания на присъщата антиутеротропна активност на миши алфа-фетопротеин. // Туморна биология. 1986. Т. 7. № 1. С. 19-36.

193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., .Agarwal A., Bennett JA, Andersen T.T. Хормони на бременността, алфа-фето протеин и намаляване на риска от рак на гърдата. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. P. 477-484.

194. Mizejewski G.J. Биологична роля на алфа-фетопротеина при рак: перспективи за противоракова терапия. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. Т. 2. № 6. С. 709-735.

195 Li M.S., Li P.F., He SP., Du G.G., Li G. Насърчаващият молекулярен механизъм на алфа-фетопротеин върху растежа на човешка хепатомна клетъчна линия Bel7402. // World J Gastroenterol. 2002. Т. 8. № 3. С. 469-475.

196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He SP., Du G.G., Li G. Вътреклетъчният механизъм на алфа-фетопротеин, насърчаващ пролиферацията на NIH 3T3 клетки. // Cell Res. 2002. Т. 12. № 2. P. 151156.

197 Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Подобряване на пролиферацията на HeLa клетки от алфа-фетопротеина. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Шанхай). 2002. Т. 34. № 6. С. 769-774.

198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Алфа-фетопротеин: нов член на вътреклетъчния сигнал молекули в регулирането на PI3K/AKT сигнализирането в човешки хепатомни клетъчни линии. // Int J Рак. В.П.

199. Chakraborty M., Mandal C. Имуносупресивен ефект на човешки алфафетопротеин: изследване на кръстосани видове. // Имунол Инвест. 1993. Т. 22. № 5. С. 329-339.

200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives AR, Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. (алфа)-фетопротеинът уврежда APC функцията и индуцира тяхната апоптоза. // J Immunol. 2004. Т. 173. № 3. С. 1772-1778.

201 Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Облекчаване на автоимунно невровъзпаление чрез рекомбинантен човешки алфа-фетопротеин. // Exp Neurol. 2006. Т. 198. № 1. С. 136-144.

202. Черешнев Б.А., Родионов С.Ю. Черкасов В. А., Малютина Н. Н., Орлов О. А. Алфа-фетопротеин. Екатеринбург: Уралски клон на Руската академия на науките; 2004 г.

203 Dudich E. MM-093, рекомбинантен човешки алфа-фетопротеин за потенциално лечение на ревматоиден артрит и други автоимунни заболявания. // Curr Opin Mol Ther. 2007. Т. 9. № 6. С. 603-610.

204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. Инхибирането на апоптозата от алфа-фетопротеин (AFP) и ролята на AFP рецепторите в антиклетъчното стареене. // Anticancer Res. 1994. Т. 14. № 6Б. P. 2429-2438.

205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. Химиотерапевтична ефикасност на конюгатите протеин-доксорубицин върху мултирезистентна клетъчна линия на хепатом на плъх in vitro. // Br J Рак. 1993. Т. 67. № 2. С. 274-278.

206. Lubgan D., Jozwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. Конюгатът на доксорубицин-трансферин селективно преодолява множествената лекарствена резистентност в клетките на левкемия. // Cell Mol Biol Lett. 2009. Т. 14. № 1. С. 113-127.

207. Сарти Д.А., Крандъл Б.Ф., Уинтър Дж., Робъртсън Р.Д., Кабак Н.М., Карп Л.Е. Корелация на бипариеталните и феталните диаметри на тялото: 12-26 гестационна седмица. // AJR. Американско списание по рентгенология. 1981. Т. 137. № 1. С. 87-91.

208 Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus P.E., Giaccone G. Topoisomerase Ilalpha и други маркери за лекарствена резистентност при напреднал недребноклетъчен рак на белия дроб. // Рак на белия дроб. 2001. Т. 32. № 2. С. 117-128.

209 Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Вродена контрактурна арахнодактилия, кератоконус и вероятен синдром на Марфан в същото родословие. // Вестник по педиатрия. 1981. Т. 98. № 4. С. 591-593.

210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Изследвания на късна репликация в човешка X/13 транслокация: корелация с автозомна генна експресия. // Цитогенетика и клетъчна генетика. 1981. Т. 29. № 4. С. 215-220.

211 Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Поемане на радиомаркиран алфа-фетопротеин от карциноми на млечната жлеза на мишка и неговата полезност при туморна сцинтиграфия. // Cancer Res. 1984. Т. 44. № 11. P. 5314-5319.

212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Роля на динамин в образуването на покрити с клатрин везикули. // Симпозиуми на Cold Spring Harbor по количествена биология. 1995. Т. 60. С. 235-242.

213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Усвояване на алфафетопротеин от клонирани клетъчни линии, получени от индуциран от никел рабдомиосарком на плъх. // Br J Рак. 1983. Т. 48. № 2. С. 261-269.

214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. Усвояването на алфа-фетопротеин от C-1300 миши невробластомни клетки. // Br J Рак. 1985. Т. 51. № 6. С. 791-797.

215. Villacampa MJ, Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Алфа-фетопротеинови рецептори в клетъчна линия на човешки рак на гърдата. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. Т. 122. № 3. С. 1322-1327.

216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Клетъчно-типови специфични рецептори за алфа-фетопротеин в миша Т-лимфомна клетъчна линия. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. Т. 82. № 10. P. 3301-3305.

217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Изолиране и частична характеристика на специфичен алфа-фетопротеинов рецептор върху човешки моноцити. // J Clin Invest. 1992. Т. 90. № 4. С. 1530-1536.

218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Активиране на алфа-фетопротеин (AFP)/рецепторна автокринна верига в НТ-29 клетки на човешки карцином на дебелото черво. // Int J Рак. 1991. Т. 49. № 3. P. 425430.

219. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Експресия на алфа-фетопротеинови рецептори от човешки Т-лимфоцити по време на бластна трансформация. // Mol Immunol. 1989. Т. 26. № 9. С. 851-857.

220. Biddle W., Sarcione E.J. Специфичен цитоплазмен алфа-фетопротеин свързващ протеин в MCF-7 човешки ракови клетки на гърдата и първична тъкан от рак на гърдата. // Лечение на рак на гърдата. 1987. Т. 10. № 3. С. 279-286.

221. Mizejewski G.J. Алфа-фетопротеин свързващи протеини: последици за трансмембранното преминаване и субклетъчна локализация. // Life Sci. 1995. Т. 56. № 1. С. 1-9.

222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Моноклонални антитела, насочени срещу широко разпространен онкофетален антиген: алфа-фетопротеиновия рецептор. // Tumor Biol. 1993. Т. 14. № 2. С. 116-130.

223. Каневски В., Позднякова Л.П., Аксенова О.А., Северин С.Е., Катуков В., Северин Е.С. Изолиране и характеризиране на AFP-свързващи протеини от туморни и фетални човешки тъкани. // Biochem Mol Biol Int. 1997. Т. 41. № 6. С. 1143-1151.

224 Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Специфично поемане на алфа-фетопротеин и албумин от хепатомни клетки на плъх Morris 7777. // Tumor Biol. 1999. Т. 20. № 1. С. 52-64.

225. Mizejewski G.J., MacColl R. Алфа-фетопротеин инхибиторни пептиди на растежа: потенциални водещи за терапия на рак. // Mol Cancer Ther. 2003. Т. 2. № 11. С. 1243-1255.

226. Mizejewski G.J., Dias JA, Hauer CR, Henrikson KP, Gierthy J. Синтетични пептиди, получени от алфа-фетопротеин: анализ на естроген-модифициращ регулаторен сегмент. // Mol Cell Endocrinol. 1996. Т. 118. № 1-2. С. 15-23.

227 Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Алфа-фетопротеинът инхибира метаморфозата на жаба: последици за запазването на протеиновия мотив. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. Т. 124. № 1. С. 39-45.

228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Ефект на алфа-фетопротеин и производни пептиди върху инсулин- и естроген-индуцирана фетотоксичност. // Фетална диагностика Ther. 2003. Т. 18. № 5. С. 360-369.

229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett JA, Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Изследвания върху пептид, инхибиращ растежа, получен от алфа-фетопротеин и някои аналози. // J Pept Res. 2001. Т. 57. № 1. С. 29-38.

230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Проучвания върху аналози на пептид, получен от алфа-фетопротеин, притежаващ антирастежни свойства. // J Pept Res. 2001. Т. 57. № 6. С. 539-546.

231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Проучване на функционалните активности на пептиди, инхибиращи растежа, получени от алфа-фетопротеин: преглед и перспективи. // Curr Protein Pept Sci. 2006. Т. 7. № 1. С. 73-100.

232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. Преглед на пептида за инхибиране на растежа като биотерапевтичен агент за туморен растеж, адхезия и метастази. // Cancer Metastasis Rev. 2005. Т. 24. № 3. С. 441-467.

233. Vakharia D., Mizejewski G.J. Човешките алфа-фетопротеинови пептиди свързват естрогенния рецептор и естрадиола и потискат рака на гърдата. // Лечение на рак на гърдата. 2000. Т. 63. № 1. С. 41-52.

234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Изследвания върху 99mTc-маркиране на модифицирания фрагмент на човешки алфа-фетопротеин (P149-QY). // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2008. Т. 275. № 1. С. 101-107.

235. Линтън К. Дж., Хигинс К. Ф. Протеините на Escherichia coli ATP-свързваща касета (ABC). // Mol Microbiol. 1998. Т. 28. № 1. С. 5-13.

236. Дийн М., Ржецки А., Аликметс Р. Суперсемейството транспортер на човешка ATP-свързваща касета (ABC). // Genome Res. 2001. Т. 11. № 7. С. 1156-1166.

237. Dean M., Annilo T. Еволюция на ATP-свързващата касета (ABC) транспортер суперсемейство в гръбначни. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. Т. 6. С. 123-142.

238. Riordan J.R., Ling V. Пречистване на P-гликопротеин от везикули на плазмената мембрана на клетъчни мутанти на яйчник на китайски хамстер с намалена пропускливост на колхицин. // J Biol Chem. 1979. Т. 254. № 24. P. 12701-12705.

239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC transporters: the power to change. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. Т. 10. № 3. С. 218-227.

240. Choi C.H. ABC транспортерите като механизми за резистентност към множество лекарства и разработването на хемосенсибилизатори за тяхното обръщане. // Cancer Cell Int. 2005. Т. 5. С. 30.

241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Трансмембранен транспорт на ендо- и ксенобиотици от ATP-свързващи касети на бозайници, мултирезистентни протеини. // Physiol Rev. 2006. Т. 86. № 3. С. 849-899.

242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, химиотерапия и ремоделиране на хроматин. // Cancer Biol Ther. 2004. Т. 3. № 9. С. 819-824.

243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. Транскрипционни регулатори на човешкия ген за множествена лекарствена резистентност 1: скорошни изгледи. // Biochem Pharmacol. 2002. Т. 64. № 5-6. С. 943-948.

244. Breier A., ​​​​Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-гликопротеин-последствия от метаболизма на неопластични клетки и терапия на рак. // Curr Лекарствени цели за рак. 2005. Т. 5. № 6. С. 457-468.

245. Доз Ф., Руузен Н., Розенблум М.Л. Металотионеин и противоракови агенти: ролята на металотионеин в химиотерапията на рака. // J Neuroncol. 1993. Т. 17. № 2. С. 123-129.

246. Lazo JS, Basu A. Експресия на металотионеин и преходна резистентност към електрофилни антинеопластични лекарства. // Semin Cancer Biol. 1991. Т. 2. № 4. С. 267-271.

247. Chen A.Y., Liu L.F. ДНК топоизомерази: основни ензими и летални цели. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. Т. 34. С. 191-218.

248. Makin G. Насочване към апоптоза при химиотерапия на рак. // Експертно мнение за целите. 2002. Т. 6. № 1. С. 73-84.

249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2-ри, Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,

250. RAPPAG \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct lomlag nolle +A Lionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/YCH/I VI 1U11VUU11 JVllJiU^VJ l/l WUJl W14J.11/ W1. X*A/1/WHO IU WlOUllUlill WlUlUlill пентоксифилин // Cancer Res. 1995. V. 55. No. 8. P. 1649-1654.

251. Саркар Р., Джайн Р.К., Пури П. Мелазма при индийски мъже. // Dermatol Surg. 2003. Т. 29. № 2. стр. 204.

252. Smith DJ, Ng H., Kluck R.M., Nagley P. Митохондриалната врата към клетъчната смърт. // IUBMB Живот. 2008. Т. 60. № 6. С. 383-389.

253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Митохондриални носители и пори: ключови регулатори на митохондриалната апоптотична програма? // Апоптоза. 2007. Т. 12. № 5. С. 869-876.

254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. Преглед на литературата на молекулярни маркери, предсказващи клиничния отговор на цитотоксична химиотерапия при пациенти с рак на гърдата. // Int J Clin Oncol. 2009. Т. 14. № 2. С. 112-119.

255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. Ролята на членовете на семейството на Bcl-2 в туморогенезата. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. № 2-3. С. 229-249.

256 Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. Клинични проучвания на Bcl-2 и полза от лечението при пациенти с рак на гърдата. // Endocr Relat Cancer. 1999. Т. 6. № 1. С. 61-68.

257. Adams JM, Cory S. Bcl-2-регулирана апоптоза: механизъм и терапевтичен потенциал. // Curr Opin Immunol. 2007. Т. 19. № 5. С. 488-496.

258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Директно наблюдение на цитозинов аналог, който образува пет водородни връзки с гуанозин: гуанидино G-скоба. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. Т. 41. № 1. С. 115-117.

259 Cowling V.H., Cole M.D. Механизъм на транскрипционно активиране от онкопротеините Myc. // Semin Cancer Biol. 2006. Т. 16. № 4. С. 242-252.

260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Терапевтика на рака: насочена към тъмната страна на Myc. // Eur J Рак. 2005. Т. 41. № 16. P. 2485-2501.

261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. Нетранскрипционен контрол на репликацията на ДНК от c-myc. // Природа. 2007. V. 448. № 7152. С. 445-451.

262. Spencer C.A., Groudine M. Контрол на регулацията на c-myc в нормални и неопластични клетки. // Adv Cancer Res. 1991. Т. 56. С. 1-48.

263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. MYC онкогени и човешки неопластични заболявания. //Онкоген. 1999. Т. 18. № 19. P. 3004-3016.

264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Паракринна регулация на ангиогенезата и диференциацията на адипоцитите по време на in vivo адипогенезата. // Circ Res. 2003. Т. 93. № 9. P.e88-97.

265. Сиърс Р.К. Жизненият цикъл на C-myc: от синтез до разграждане. // Клетъчен цикъл. 2004. Т. 3. № 9. С. 1133-1137.

266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., ​​​​Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. Отговори на антиангиогенезно лечение на спонтанни автохтонни тумори и техните изотрансплантати. // Cancer Res. 2003. Т. 63. № 4. С. 747-751.

267 Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc е метастазен ген за недребноклетъчен рак на белия дроб. //PLOS One. 2009. Т. 4. № 6. P.e6029.

268. Ахмед Ф.Е. Молекулярни маркери, които предсказват отговора на терапията с рак на дебелото черво. // Expert Rev Mol Diagn. 2005. Т. 5. № 3. С. 353-375.

269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. Цели надолу по веригата на сигнализиране на растежен фактор и естроген и ендокринна резистентност: потенциалните роли на c-Myc, циклин Dl и циклин Е. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12 Допълнение 1. P. S47-59.

270. Блекбърн Е.Х. Теломери: структура и синтез. // J Biol Chem. 1990. Т. 265. № 11. P. 5919-5921.

271. Оловников А.М. Теория на маргинотомията. Непълното копиране на границата на шаблона при ензимния синтез на полинуклеотиди и биологичното значение на феномена. // J Theor Biol. 1973. Т. 41. № 1. С. 181-190.

272. Wright W.E., Shay J.W. Двустепенният механизъм, контролиращ клетъчното стареене и обезсмъртяване. // Exp Gerontol. 1992. Т. 27. № 4. С. 383-389.

273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Telomere architecture. // EMBO Rep. 2002. Т. 3. № 12. С. 1139-1145.

274. Liu J.P. Изследване на молекулярните механизми в регулацията на теломеразната активност. // FASEB J. 1999. Т. 13. № 15. P. 2091-2104.

275 Wu KJ, Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Директно активиране на TERT транскрипция от c-MYC. // Nat Genet. 1999. Т. 21. № 2. P. 220224.

276. Tian X., Chen B., Liu X. Теломера и теломераза като мишени за лечение на рак. // Appl Biochem Biotechnol. Т. 160. № 5. С. 1460-1472.

277 Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Липозомният състав е важен за задържането на липозомен родамин в свръхекспресиращи Р-гликопротеин ракови клетки. // Drug Deliv. 2009. Т. 16. № 5. С. 261-267.

278 Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Липозомен капсулиран даунорубицин за PGP-свързана мултилекарствена резистентност. // Br J Haematol. 1999. Т. 106. № 1. С. 92-99.

279 Morinaga T., Sakai M., Wegmann T. G., Tamaoki T. Първични структури на човешки алфа-фетопротеин и неговата иРНК. // Сборници на Националната академия на науките на Съединените американски щати. 1983. Т. 80. № 15. P. 4604-4608.

280. Богуш Т., Робърт Дж. Сравнителна оценка на вътреклетъчното натрупване и ДНК свързването на идарубицин и даунорубицин в чувствителни и мултирезистентни човешки левкемични клетки K562. // Anticancer Res. 1996. Т. 16. № 1. С. 365-368.

281. Cartier R., Reszka R. Използване на синтетични пептиди, съдържащи сигнали за ядрена локализация за невирусни системи за трансфер на гени. // Джийн Тер. 2002. Т. 9. № 3. С. 157-167.

282. Collas P., Alestrom P. Сигнали за ядрена локализация: движеща сила за ядрен транспорт на плазмидна ДНК в риба зебра. // Biochem Cell Biol. 1997. Т. 75. № 5. С. 633-640.

283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Фактори, влияещи върху способността на пептидите на последователността на ядрената локализация да подобрят доставката на невирусен ген. // Химия на биоконюгатите. 2003. Т. 15. № 1. С. 152-161.

284. Пракаш Т.П., Кавазаки А.М., Фрейзър А.С., Васкес Г., Манохаран М. Синтез на 2'-0-2-[(N,N-диметиламино)окси.етил] модифицирани нуклеозиди и олигонуклеотиди // J Org Chem. 2002. Т. 67. № 2. С. 357-369.

285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Цитотоксични ефекти на конюгат доксорубицин-трансферин в мултирезистентни KB клетки. // Biochem Pharmacol. 1996. Т. 51. № 4. С. 489-493.

286. Lemieux P., Page M. Чувствителност на мултирезистентни MCF-7 клетки към трансферин-доксорубицин конюгат. // Anticancer Res. 1994. Т. 14. № 2А. С. 397-403.

287 Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Клетъчно натрупване и цитотоксичност на макромолекулни платинови комплекси в резистентни на цисплатин туморни клетки. // J Контролно освобождаване. 2008. Т. 131. № 2. С. 100-106.

288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Чувствителност на мултирезистентни KB-C1 клетки към конюгат антитяло-декстран-адриамицин. // Anticancer Res. 1989. Т. 9. № 3. С. 637-641.

289. Читамбар C.R. Галиеви съединения като антинеопластични средства. // Curr Opin Oncol. 2004. Т. 16. № 6. С. 547-552.

290. Ehrlich P. Частичната функция на клетките. (Обръщение за Нобелова награда, дадено на 11 декември 1908 г. в Стокхолм). // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. Т. 5. № 2. С. 67-86.

291 Butcher E.C., Weissman I.L. Директно флуоресцентно маркиране на клетки с флуоресцеин или родамин изотиоцианат. I. Технически аспекти. // J Immunol Methods. 1980. Т. 37. № 2. P. 97108.

292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. Количествено определяне чрез поточна цитофлуориметрия на HLA клас I молекули на повърхността на миши клетки, трансформирани от клонирани HLA гени. // J Immunol Methods. 1983. Т. 61. № 3. С. 301-315.

293. Fenton C., Perry C.M. В центъра на вниманието на гемтузумаб озогамицин при остра миелоидна левкемия. // BioDrugs: клинична имунотерапия, биофармацевтика и генна терапия. 2006. Т. 20. № 2. С. 137-139.

294 Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Рецепторно-медиирана ендоцитоза и рециклиране на алфа-фетопротеин в човешки В-лимфомни и Т-левкемични клетки. // Int J Рак. 1991. Т. 47. № 1. С. 110-117.

295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Активиране на алфа-фетопротеин/рецепторен път в човешки нормални и злокачествени периферни кръвни мононуклеарни клетки. // Левкемия. 1993. Т. 7. № 11. С. 1807-1816.

296. Biaglow J.E., Miller R.A. Системата тиоредоксин редуктаза/тиоредоксин: нови редокс цели за лечение на рак. // Cancer Biol Ther. 2005. Т. 4. № 1. С. 6-13.

297. Arunachalam B., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Ензимна редукция на дисулфидни връзки в лизозоми: характеризиране на индуцирана от гама-интерферон лизозомна тиол редуктаза (GILT). // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Т. 97. № 2. С. 745-750.

298. Kooistra T., Millard P.C., Lloyd J.B. Роля на тиолите в разграждането на протеини от катепсини. // Biochem J. 1982. V. 204. No. 2. С. 471-477.

299 Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Разцепване на дисулфидни връзки в ендоцитирани макромолекули. Обработка, която не е свързана с лизозоми или ендозоми. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx y y V/. t ^ ■ v<-л. л. » x w I vy v x v f w

300. Бенет Дж.А., Семенюк Д.Дж., Джейкъбсън Х.И., Мургита Р.А. Сходство между естествения и рекомбинантния човешки алфа-фетопротеин като инхибитори на естроген-зависим растеж на рак на гърдата. // Лечение на рак на гърдата. 1997. Т. 45. № 2. С. 169-179.

301. DiMarco A. Adriamycin (NSC-123127): начин и механизъм на действие. // Cancer Chemother. Представител 1975. Т. 6. С. 91-106.

302. Хамза А., Сарма М.Х., Сарма Р.Х. Правдоподобно взаимодействие на алфа-фетопротеинов циклопептид с G-протеин-свързан рецепторен модел GPR30: докинг изследване чрез молекулярна динамика, симулирано отгряване. // J Biomol Struct Dyn. 2003. Т. 20. № 6. С. 751-758.

303 Tan W., Loke Y.H., Stein C.A., Miller P., Colombini M. Фосфоротиоатните олигонуклеотиди блокират VDAC канала. // Biophys J. 2007. V. 93. No. 4. С. 1184-1191.

304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. Фармакологична цел на G3139 в меланомни клетки може да бъде митохондриалният VDAC. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. No. 19. P. 7494-7499.

305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein CA, Colombini M. Фосфоротиоатните олигонуклеотиди намаляват пропускливостта на митохондриалната външна мембрана за ADP. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. Т. 292. № 4. P. C1388-1397.

306. Carpenter G., Cohen S. Епидермален растежен фактор. // Annu Rev Biochem. 1979. Т. 48. С. 193-216.

307. Saeki T., Takashima S., Tachibana M., Koga M., Hiyama E., Salomon D.S., Holland J.F., Ohnuma T. Инхибиторен ефект на имитиращи теломерите фосфоротиоатни олигодезокси нуклеотиди (S-ODNS) върху човешки туморни клетъчни линии . // Онкология. 1999. V. 57 Suppl 2. P. 27-36.

308. Page T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. Цитотоксичните ефекти на едноверижни теломери имитират OMA-BL1 клетки. // Exp Cell Res. 1999. Т. 252. № 1. С. 41-49.

309. Berkers JA, van Bergen en Henegouwen PM, Boonstra J. Три класа рецептори на епидермален растежен фактор върху HeLa клетки. // J Biol Chem. 1991. Т. 266. № 2. С. 922-927.

310. Кронинг Р., Джоунс Дж.А., Хорн Д.К., Чуанг К.С., Санга Р., Лос Г., Хауъл С.Б., Кристен Р.Д. Повишаване на лекарствената чувствителност на човешки злокачествени заболявания чрез епидермален растежен фактор. // Br J Рак. 1995. Т. 72. № 3. С. 615-619.

311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Молекулярни прояви и молекулярни детерминанти на покриване на теломерите. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. Т. 65. С. 253-263.

312. Collas P., Alestrom P. Сигналите за ядрена локализация усилват предаването по зародишна линия на трансген в риба зебра. // Transgenic Res. 1998. Т. 7. № 4. С. 303-309.

313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Нов пептиден вектор за ефективно доставяне на олигонуклеотиди в клетки на бозайници. // Nucleic Acids Res. 1997. Т. 25. № 14. P. 2730-2736.

314 Sinha B.K., Politi P.M. Антрациклини. // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1990. Т. 11. С. 45-57.

315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Есперамицини, клас мощни антитуморни антибиотици: механизъм на действие. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. Т. 86. № 1. С. 2-6.

316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Селективна цитотоксичност на адриамицин имуноконюгат на моноклонално антитяло MSN-1 към ендометриален аденокарцином in vitro и in vivo. // Oncol Rep. 2000. Т. 7. № 5. С. 1099-1106.

317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. Ефективност на имуноконюгат на адриамицин, който разпознава продукта C-erbB-2 върху клетъчни линии на рак на гърдата. // SurgToday. 1996. Т. 26. № 7. С. 501-507.

318. Ямамото К., Актън Е.М., Хенри Д.У. Антитуморна активност на някои производни на даунорубицин при функциите на амино и метилкетон. // Вестник по медицинска химия. 2002. Т. 15. № 8. С. 872-875.

319. Arnon R., Sela M. In vitro и in vivo ефикасност на конюгати на дауномицин с антитуморни антитела. // Immunol Rev. 1982. Т. 62. С. 5-27.

320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. Ковалентното свързване на дауномицин и адриамицин с антитела, със запазване на активността на лекарството и антитялото. // Cancer Res. 1975. Т. 35. № 5. С. 1175-1181.

321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. Бъдещето на антисенс терапията: комбинация с противоракови лечения. // Онкоген. 2003. Т. 22. № 42. P. 6579-6588.

Моля, имайте предвид, че научните текстове, представени по-горе, са публикувани за преглед и са получени чрез разпознаване на текст на оригинална дисертация (OCR). В тази връзка те могат да съдържат грешки, свързани с несъвършенството на алгоритмите за разпознаване. В PDF файловете на дисертациите и резюметата, които предоставяме, няма такива грешки.