Вид - набор от микроорганизми, които имат общ еволюционен произход, близък генотип (висока степен на генетична хомология, обикновено повече от 60%) и възможно най-близки фенотипни характеристики. Щам - изолирана култура от даден вид бактерии ("специфична проба от даден вид") Колония - изолирана видима за окото структура, образувана в резултат на размножаване и натрупване на м/о за определен период на инкубация и от една родителска клетка или от няколко еднакви клетки.

Методи за лабораторна диагностика Ø Микроскопски - откриване на m / o директно в клиничен материал Ø Бактериологичен - откриване на m / o чрез инокулация на материал върху хранителни среди Ø Биологичен - изолиране на m / o от предварително заразено лабораторно животно Ø Серологично - откриване на специфични имунни антитела в кръвния серум на пациента Ø Алергични - поставяне на кожно-алергични тестове (тясно специфични - туберкулоза, туларемия и др.)

Ø Културен - естеството на растежа на микроорганизма върху хранителни среди. Ø Биохимични - способността да ферментират различни субстрати (въглехидрати, протеини и аминокиселини и др.), да образуват различни биохимични продукти в процеса на живот поради активността на различни ензимни системи и метаболитни особености. Ø Антигенни – зависят основно от химичния състав и структурата на клетъчната стена, наличието на флагели, капсули, разпознават се по способността на макроорганизма (гостоприемника) да произвежда антитела и други форми на имунен отговор, откриват се при имунологични реакции.

Физиологични методи на въглехидрати (автотрофи, хетеротрофи), азот (аминоавтотрофи, аминохетеротрофи) и други видове хранене, тип дишане (аероби, микроаерофили, факултативни анаероби, стриктни анаероби). Ø Подвижност и видове движение. Ø Способността за спорообразуване, естеството на спора. Ø Чувствителност към бактериофаги, фаготипизиране. Ø Химичният състав на клетъчните стени – основни захари и аминокиселини, липиден и мастнокиселинен състав. Ø Протеинов спектър (полипептиден профил). Ø Ø Чувствителност към антибиотици и други лекарства. Ø Генотипна (използване на методите на геносистематиката).

Бактериологичният метод включва инокулация на клиничен материал върху изкуствени хранителни среди, изолиране на чисти култури от микроби и последващата им идентификация.

Бактериологичните методи се използват: при диагностика на инфекциозни заболявания; Ш При профилактични прегледи за носителство на бактерии от чревната група, дифтериен бацил и др.; III при изследване на санитарно-хигиенното състояние на обекти на околната среда (вода, въздух, почва, храна и др.) И тяхното изследване според епидемиологичните показания за инфекция с патогенни видове микроорганизми. У

Физиологични характеристики Връзка с температурата Дишане Хранене Ензими Метаболизъм на протеини и аминокиселини (желатиназа, колагеназа, декарбоксилази, уреаза) Други ензими (хемолизини, липази, лецитиназа, ДНКаза) Метаболитни крайни продукти (хроматография) AMP устойчивост/чувствителност

Елементите, които са основно необходими за растежа на микроорганизмите и трябва да бъдат включени в състава на хранителната среда, се определят от химичния състав на микробните клетки, който по принцип е еднакъв във всички живи организми. Основната част от общата клетъчна маса е представена от вода (80 - 90%) и само 10 - 20% е сухо вещество. Според количественото съдържание в сухото вещество се разграничават макро- и микроелементи. Първите включват: въглерод, кислород, азот, водород, сяра, фосфор, калий, натрий, магнезий, калций, желязо. Микроелементите са манган, молибден, цинк, мед, кобалт и др., повечето от които са необходими в следи. Поради тази причина микроелементите не се добавят към състава на много среди, тъй като нуждата от тях може да бъде задоволена от примеси в соли на макроелементи. Освен това не всички микроорганизми се нуждаят от микроелементи. 14

За разлика от животинските и растителните организми, микроорганизмите се характеризират с разнообразие от видове хранене, които се разграничават по три основни критерия - източник на въглерод, източник на енергия и донор на електрони (водород). В зависимост от естеството на източника на въглерод всички микроорганизми се разделят на 2 големи групи - автотрофи, използващи въглероден диоксид, и хетеротрофи, изискващи готови органични вещества за растеж и размножаване. Като се има предвид разнообразието от източници на енергия и донори на електрони, тези групи се подразделят на подгрупи, в резултат на което са идентифицирани 8 вида хранене в микроорганизмите. Всеки вид хранене е характерен за определени микроорганизми и отразява техните физиологични и биохимични свойства. Повечето микроорганизми, включително патогени, имат вид хранене, при което органичните вещества са източник на въглерод, енергия и донори на електрони. 16

Нуждите на микроорганизмите от източници на органичен въглерод са много разнообразни. Някои видове са "всеядни" и могат да консумират вещества с различен химичен характер, други са по-селективни и използват само някои от тях. Спецификата на набора от органични съединения, характерни за всеки тип микроорганизми, се взема предвид при създаването на елективни и диференциални диагностични среди, широко използвани в санитарната и клиничната микробиология за бързо идентифициране на определени групи микроорганизми. При избора на въглеродсъдържащ субстрат трябва да се има предвид, че усвояемостта на органичните вещества до голяма степен зависи от техните свойства - разтворимост, степен на окисление на въглеродните атоми, пространствена конфигурация и полимеризация на техните молекули. Обикновено микроорганизмите асимилират определени оптични изомери - захари, принадлежащи към D-серия, аминокиселини - към L-серия. Много малко микроорганизми имат ензими, които превръщат един оптичен изомер в друг. Биополимери като нишесте, полизахариди, протеини, мазнини могат да се използват само от микроорганизми, които синтезират определени хидролитични ензими - амилази, протеази, липази под формата на екзоензими, т.е. ензими, секретирани от клетката в околната среда. 17

За преобладаващата част от хетеротрофните микроорганизми въглехидратите, аминокиселините, протеините и органичните киселини са основните лесно достъпни източници на въглерод и енергия. Когато се характеризира нуждата на микроорганизмите от органични източници на въглерод, трябва да се отбележи, че най-високата степен на хетеротрофия е присъща на патогенните микроорганизми, които са се адаптирали към живот в човешки и животински организми. Съставът на хранителните среди за тяхното отглеждане е особено сложен. Те съдържат протеини или продукти от тяхната плитка хидролиза (пептиди), витамини, фрагменти от нуклеинови киселини и др. За приготвянето на такива среди се използват различни видове хидролизати и месни екстракти, кръв или серум, дрожди и растителни екстракти и много други. използвани. Тези среди са подходящи за култивиране на голямо разнообразие от видове и са особено полезни в случаите, когато нуждата на микроба от растежни фактори е неизвестна или се нуждае от много растежни фактори едновременно. Недостатъкът на такива среди е трудността или невъзможността за постигане на тяхната стандартизация поради нестандартност и ограничена контролируемост на състава и свойствата на суровината. 18

Конструктивният метаболизъм на микроорганизмите обикновено е насочен към синтеза на четири основни вида биополимери - протеини, нуклеинови киселини, полизахариди и липиди. За биосинтезата на протеини и нуклеинови киселини най-важният елемент, в допълнение към въглерода, е азотът. Най-достъпният източник на азот за повечето микроорганизми са амониеви йони, които те могат да получат от соли на органични и неорганични киселини, аминокиселини, протеини и други азотсъдържащи вещества. За голяма група бактерии, главно патогени, са необходими азотсъдържащи органични вещества като източници на азот. Ако аминокиселините са такъв източник на азот, микроорганизмите могат да ги използват директно за синтеза на протеини или предварително да извършат тяхното дезаминиране, а освободените в този случай аминогрупи могат да се използват за синтеза на собствени аминокиселини, протеини. 19

Някои микроорганизми обаче изискват определени аминокиселини за растеж, които не могат да синтезират сами. Микроорганизмите, които се нуждаят от такива "незаменими" аминокиселини, включват Staphylococcus aureus, хемолитичен стрептокок, млечнокисели бактерии и някои други. В зависимост от физиологичните характеристики на микробите, броят на "незаменимите" аминокиселини е различен - за Staphylococcus aureus в хранителната среда са необходими само триптофан и цистин, а за хемолитичен стрептокок - 17 аминокиселини. Протеините, като източници на азот, са достъпни само за онези микроорганизми, които образуват протеолитични ензими, освободени в околната среда (т.е. в екзоформата). Под действието на тези ензими белтъчините се разграждат до по-нискомолекулни вещества – пептони и аминокиселини. 20

Енергийният метаболизъм на микроорганизмите, както и конструктивният, се характеризира с различни биохимични механизми. При този метаболизъм се разграничават три основни вида - аеробно дишане, анаеробно дишане и ферментация, най-разпространеният от които е аеробното дишане. В този процес органичната материя се окислява до въглероден диоксид и вода с максимално освобождаване на енергия, съдържаща се в това вещество. Много микроорганизми с аеробно дишане са стриктни аероби, но някои от тях са факултативни аероби, тъй като те също могат да образуват АТФ при анаеробни условия чрез ферментация. Някои микроорганизми, главно бактерии, получават енергия при анаеробно дишане, т.е. в резултат на окисление на вещества, при което не кислородът, а неорганичните съединения действат като акцептори на електрони. И така, някои видове от рода Bacillus, E. coli извършват анаеробно дишане, по време на което нитратите (NO 3) се редуцират до амоняк; Clostridium aceticum окислява молекулярния водород, използвайки въглероден диоксид като акцептор на електрони. 21

Най-простият метаболитен тип енергиен метаболизъм е ферментацията. Процесите на ферментация протичат при анаеробни условия и са съпроводени с отделяне на енергия. Основният субстрат за ферментация са въглехидратите, но бактериите могат да ферментират органични киселини, включително аминокиселини, както и пурини и пиримидини. Известни са много видове ферментация, всяка от които се предизвиква от определена група микроорганизми и в съответствие с механизма се съпровожда с образуването на специфични крайни продукти. Крайните продукти на ферментацията обикновено са различни органични киселини - млечна, оцетна, янтарна, лимонена и др., както и алкохоли (етилов, бутилов, пропилов), въглероден диоксид и водород. Според изхода на основния краен продукт се разграничават и съответните видове ферментация. Поради факта, че по време на ферментацията няма пълно окисляване на субстрата и в средата се отделят частично окислени вещества, които все още съдържат енергия - органични киселини, алкохоли и др., общият добив на АТФ при този процес на 1 mol ферментирала субстрат е значително (~ 30 пъти) е по-ниска, отколкото по време на метаболизма на същия субстрат в процесите на дишане. 22

Специална роля принадлежи на Робърт Кох. След като постулира необходимостта от изолиране на чиста култура на микроб, той определя необходимостта от създаване на условия за решаване на този проблем. Най-важното от тях е хранителната среда, върху която може да се получи растеж на микроорганизма. Въвеждането на плътни хранителни среди в микробиологичната практика през 1881 г. се свързва с името на Кох. Самата идея за тяхното използване възниква по-рано и принадлежи на немския изследовател Бредфелд. Освен това още през 1877 г. Шрьотер култивира бактерии върху резени картофи, което също може да се тълкува като използване на хранителна среда. Заслугата на Кох се крие в дълбокия научен подход към проблема, широкото използване на хранителни среди в собствените му изследвания. Той също така предложи първия втвърдител, желатин, като компонент на плътна среда. 25

Агар-агарът, познат на съвременните микробиолози, е въведен от Фрост в ежедневната практика много по-късно, през 1919 г., въпреки че би било справедливо да припомним, че през 1881 г. немският изследовател Хесе предложи агар-агар. Освен това през 1913 г. руският микробиолог V. L. Omelyansky, отдавайки почит на хранителните среди с желатин, отбелязва, че агарните хранителни среди са за предпочитане в случаите, когато микробът втечнява желатина. Идеите и практическата дейност на Кох се развиват интензивно в края на 19 и първата четвърт на 20 век. През този период изследователи от редица страни предложиха хранителни среди за различни цели, чиято роля за практическата микробиология беше и остава много важна. Съвременният микробиолог всеки ден в работата си припомня техните имена. През тези няколко години японецът по произход Ш. Ендо предложи своя агар за диференциация на ентеробактерии, австриецът Е. Левенщайн - среда за микобактерии, англичанинът А. Мак. Konki - селективна и диференциална диагностична среда за чревни микроорганизми, немски T. Kitt и италиански D. Tarozzi - среда за облигатни анаеробни бактерии, французин R. Saburo, чех F. Capek и американец A. Doks - среда за гъбички, бразилски R. Hottinger – многофункционална среда на основата на преварено месо и др. 26

Общи изисквания Съдържание на всички елементи за изграждане на микробна клетка Достатъчна влажност Осигуряване на изотоничност Определена концентрация на водородни йони Редокс потенциал Стерилност

Основните фази на растежа на периодичната култура: начална (лаг-) - 1, експоненциална (аболологаритмична) - 2, стационарна - 3 умираща - 4 (фиг. 12) 12. Основни фази на растеж на микробната популация върху течни хранителни среди.

Характерът на растежа на микроорганизмите върху течни хранителни среди Ø Ø Ø Растеж на бактерии с равномерна мътност на средата, чийто цвят не се променя или се променя в съответствие с цвета на водоразтворимия пигмент, образуван в културата на микробът; Долен растеж на бактерии - образуване на утайка (оскъдна или обилна, ронлива, хомогенна, влакнеста и др.); Париетален растеж със запазване на прозрачността на хранителната среда; Повърхностен растеж на бактерии - филм върху повърхността на средата (тънък, деликатен, безцветен или влажен, дебел, ясно видим с невъоръжено око, плътен сух с набръчкана и понякога брадавична повърхност); Цветът на филма, подобно на хранителната среда, зависи от пигмента, произведен от растящата култура на микроба.

Естеството на растежа на микроорганизмите върху полутечни хранителни среди Изследваната култура се инокулира в колона от 0,2 - 0,5% полутечен агар. Определя се способността на микроорганизма да се движи - разпространение от мястото на посяване (инжектиране) в средата чрез инжектиране в непосредствена близост до стената на епруветката.

Сряда Ендо Диференциално-диагностичен Състав: Основа - хранителен агар Диф. фактор - лактоза Индикатор - основен фуксин, обезцветен с натриев сулфит Растеж на лактоза + колонии с червен цвят с метален блясък

Сряда Плоскирев Селективен, диференциално диагностичен Състав: Основа - хранителен агар Елективен фактор - жлъчни соли, брилянтно зелено, йод Диф. фактор - лактоза Индикатор - неутрално червено Растеж на колонии лактоза + боровинки

Солен агар Селективна среда Състав: Основа - хранителен агар Селективен фактор - сол 10% Индикатор - няма Растеж на устойчиви на сол колонии

Жълтъчно-солев агар (Чистович) Елективен, диагностичен Състав: Основа - хранителен агар Елективен фактор - сол 10% Диф. фактор - яйчен жълтък Индикатор - няма Растеж на устойчиви на сол колонии + помътняване около колониите поради лецитовителазна активност

Тетратионатна среда на Мюлер-Кауфман Средата е предназначена за селективно обогатяване при откриване на бактерии от рода Salmonella Състав: Основа - хранителен бульон Елективен фактор - сол на селиновата киселина Индикатор - няма Растеж на бактерии, устойчиви на натриев селин

Солен бульон Елективна среда Съставки: Основа - хранителен бульон Елективен фактор - 6,5% Na. Cl Индикатор - няма Растеж на устойчиви на сол микроорганизми

Естеството на растежа на микроорганизмите върху плътни хранителни среди. Основни признаци: ü Размер - пунктиран (≤ 1 mm) - голям (4 - 6 mm и повече); ü Форма - правилна (кръгла); неправилен (амебоиден), ризоиден; ü Контурите на ръба - равномерни или неравномерни (назъбени, вълнообразни и др.) ü Релефът на колониите (куполни, плоско-изпъкнали, колонии с вдлъбнат център и др. ü Повърхността на колонията (матова или лъскава ( S-R-форми); ü Цветът на колонията (пигментация); ü Структурата на колонията (фини или едрозърнести); ü Консистенция (вискозна, слузеста, пастообразна и др.

Пигментно образуване на бактерии Червено-кафяво (продигиозин) Serratia marcessens Жълто-оранжево, (каротеноиди) Staphylococcus, Sarcina, M. tuberculosis generas Черно, кафяво (меланин) B. cubtilis, гъбички Candida Син (пиоцианин) P. aeruginosa Флуоресцентно жълто-зелено ( pyoverdin ) Род Vibrio

Изолиране на чисти култури: инокулация върху селективна среда Baid-Parker селективна среда за стафилококи. Растеж на микроорганизми, устойчиви на калиев телурит. Те го превръщат в метален телур и превръщат колонията в черна.

Изолиране на чисти култури: филтриране през мембранни филтри Микроорганизми върху филтъра Метални клетки за ядрени филтри

Бактериологичният метод за изследване на патологичния материал за изолиране и идентифициране на микобактерии включва 3 метода: бактериоскопски, културен и биологичен / R.V. Tkzova, 1983; И. И. Румачик, 1987, 1993; КАТО. Донченко, 1989; Ю.Я. Касич, 1990; А.Х.Найманов, 1993; Л. П. Ходун, 1997/. Периодът на бактериологично изследване не трябва да надвишава 3 месеца.

Като се има предвид, че макроскопските туберкулозни промени в органите и тъканите на говедата са причинени от причинителя на туберкулозата по говедата, няма смисъл да се изследва бактериологично такъв материал. Ако такъв материал бъде доставен в лабораторията за изследване, тогава се извършва комисионна проверка и се съставя акт. Материалът е безвреден.

Бактериоскопското (микроскопско) изследване на материала се състои в приготвяне на 2 петна-отпечатъка от всеки орган (или части от орган със съмнителни промени в туберкулоза) и лимфен възел, доставени за изследване, изсушаването им на въздух, фиксирането им върху пламъка на алкохолна лампа, оцветяване по Cyl-Nielsen и разглеждане на оцветени петна под микроскоп, с най-малко 50 зрителни полета във всяко петно. Необходимо е да се подготвят най-малко 20 петна-отпечатъци от материала от един труп. В допълнение, петна за микроскопия също се приготвят от суспензия от материал, засят върху хранителни среди.

Оцветяването на петна по Ziehl-Neelsen е селективно за откриване на микобактерии: на син фон от оцветени тъкани или чужда микрофлора, микобактериите се виждат като червени, розови или рубиненочервени пръчици. Най-добре е петната да се разглеждат под бинокулярен микроскоп при увеличение 1,5 (дюза) x 7 (окуляр) x 90 или 100 (обектив).

Методът се използва като сигнал, тъй като наличието или отсъствието на микобактерии в намазките абсолютно не влияе върху хода на по-нататъшното изследване и дори положителното заключение от бактериоскопията няма правно значение (с изключение на птиците). Материалът трябва да бъде проучен допълнително.

Лабораторна диагноза туберкулоза при птици се счита за установена, ако от тестовия материал се изолира култура от птичи микобактерии (от папагали - човешки или птичи видове), се получи положителен резултат от биоанализа, както и ако се открият микобактерии в намазки от патологичен материал по време на микроскопско изследване (клауза 7.3 .2 инструкции).

Необходимо е също така да се обърне внимание на факта, че отнема много време за приготвяне на натривки за отпечатъци, тяхното фиксиране и преглед и е много рядко да се открият микобактерии в тях, дори в намазки от суспензия от посевен материал. Следователно, за да спестите работно време и пари при изследване на материал от животни, които не са имали промени по време на клането, препоръчително е да се ограничим до подготовката и разглеждането на намазки само от суспензия от материал, засят върху хранителни среди. Това няма да доведе до увреждане при диагностицирането на туберкулоза, тъй като изследването на материала продължава по-нататък.

В допълнение към конвенционалната светлинна микроскопия може да се използва флуоресцентна микроскопия. Намазките се приготвят по същия начин, фиксират се и се оцветяват със смес от флуорохроми. Оцветените петна се разглеждат под флуоресцентен микроскоп. Методът е по-чувствителен, но по-малко специфичен и следователно не е много приемлив, особено в практическите лаборатории.

Културното изолиране на микобактерии върху хранителни среди е една от важните връзки в лабораторната диагностика на туберкулозата на съвременния етап. Въпреки това, хранителните среди, върху които е засят материалът (за 5-10 епруветки в съответствие с инструкциите), през първите 2-3 седмици имат частично или пълно поникване, като правило, поради нарушаване на стерилността по време на инокулацията на материала. Културите се изхвърлят точно по времето, когато е най-вероятно появата на първоначалния растеж на атипични микобактерии (да не говорим за проявата на първоначалния растеж на причинителя на туберкулозата, който показва растеж дори по-късно). В такива случаи културният метод за изолиране на микобактерии върху хранителни среди механично отпада. Това е една от основните причини за получаване на отрицателни резултати при бактериологичното изследване на материала. В резултат на това, след като не се получи растеж на колонии от микобактерии върху хранителни среди след инокулация на материала и лабораторните животни останаха живи в продължение на 3 месеца, стандартният отговор на лабораториите е следният: „Причинителят на туберкулозата не е изолиран“ или „ Изследването на материала за туберкулоза е отрицателно”. Въз основа на резултатите от проучванията причината за реакцията на говедата към туберкулин не е установена и това води до по-нататъшно неоправдано клане на значителен брой животни, които са отговорили на туберкулин във ферми, които са свободни от туберкулоза по говедата, което причинява големи икономически щети, нарушава се обръщаемостта и възпроизводството на стадото.

Предвид гореизложеното е необходимо да се даде приоритет на културния метод за изолиране на микобактерии от материала върху хранителни среди, като най-слабото звено в бактериологичната диагностика на туберкулозата в районните ветеринарни лаборатории.

Положителните резултати от културния метод за изолиране на микобактерии зависят главно от две обстоятелства: повишаване на надеждността на засяване на микобактерии от материала и спазване на условията за стерилност при работа в кутия.

Увеличаването на надеждността на засяването на микобактерии от материала, взет за изследване, зависи преди всичко от неговия качествен подбор, предсеитбена обработка и увеличаване на броя на епруветките на средата, върху която се извършва засяването.

Основните условия, спазването на които при засяване на материала върху хранителни среди гарантира растежа на колонии от микобактерии:

а) вземете материал за бактериологично изследване от заклани животни, които не са имали промени по време на клането, отделно от всеки труп и инокулирайте всяка проба (материал от всяко животно) върху 10-20 епруветки от средата по следната схема:

Лимфни възли на главата (субмандибуларни, фарингеални);

Бронхиални и медиастинални лимфни възли;

Мезентериални (мезентериални) лимфни възли;

Други лимфни възли (ако има подозрителни зони);

Органи (също ако е необходимо).

Резултатът е инокулация на материал от едно животно за 30-50 епруветки от средата. Това постига повишаване на надеждността на засяване на микобактерии с 3-5 пъти, тъй като без разделяне на пробите (съгласно инструкциите) се препоръчва материалът да се засява само върху 5-10 епруветки със средата от две глави на една ферма.

б) Непосредствено при бактериологично засяване на материала се изрязват парчета с нарушена морфологична структура на лимфен възел или орган (хиперплазия, индурация, точковидни и набраздени кръвоизливи и др.). Освен това е необходимо да изрежете всички променени области. Ако има много материал по обем в един хоросан, тогава той може да бъде разделен на две.

в) Спазвайте стриктно възприетата методика на работа, без да нарушавате режима на обработка и засяване на материала.

г) При хомогенизиране на материала, особено на лимфните възли, е необходимо да се използва стерилен пясък или ситно натрошено стерилно стъкло. Смелете материала колкото е възможно повече (до кремообразна консистенция) за по-добра екстракция на микобактериите от тестовия материал

д) Добавете физиологичен разтвор към хомогенизирания материал в хаванче в количеството, необходимо за инокулация на суспензия от материал върху хранителни среди и за биоанализ (средно до 0,5 cm3 в една епруветка и 1-2 cm3 за подкожна инфекция на едно морско свинче). Това количество физиологичен разтвор може да се изчисли предварително.

f) Прегледът на посевите на материала трябва да се извършва след 3, 5, 7, 10, 15 дни и след това веднъж седмично.

ж) Всяка колония от микроорганизми, отгледана върху средата (типична или нетипична, пигментирана или непигментирана, лигавична или суха и т.н.), трябва да бъде микроскопирана със селективно оцветяване по Ziehl-Neelsen.

Трябва да се обърне внимание на степента на измиване на материала от киселина (или основа), използвана за третиране на материала от замърсяване с чужда микрофлора. Остатъчната киселина винаги ще присъства в суспензията от посевния материал, но тя трябва да бъде сведена до минимум. Индикатор за това е възстановяването на първоначалния цвят на средата на 2-4-ия ден след засяване на материала. Ако цветът на средата не се възстанови, това показва повишено количество остатъчна киселина. Цветът на средата придобива синкав оттенък с различна интензивност. Растежът на (предполагаеми) микобактерии в този случай се забавя или изобщо няма да съществува, особено на причинителя на туберкулозата, тъй като е по-взискателен към режима на култивиране. Остатъчното количество киселина действа на микобактериите до известна степен бактериостатично.

За запечатване на епруветките след инокулация на материала могат да се използват памучни и памучно-марлени запушалки, последвани от запълване с парафинови, безгумени и гумени с изрязан наклонен жлеб, кортикални и метални запушалки (затвори).

При определяне на видовата принадлежност на изолирана култура от микобактерии са известни много (около 300) различни теста: културно-морфологични, биологични, биохимични, серологични, определяне на лекарствена резистентност и др. Във ветеринарната практика обаче се използва техният минимум (виж ръководството). За лабораториите е достатъчно да се определи изолирана култура от микобактерии от следните видове: говеда, хора и птици, която се определя чрез биотест, и атипични микобактерии - разделени на групи според Runyon (1959): I - фотохромогенни (образуващи пигмент под въздействието на светлина), II - скотохромогенни (образуват пигмент независимо от излагането на светлина - както на тъмно, така и на светлина), III - нехромогенни (не образуват пигмент) или се наричат ​​още непигментирани (това включва също причинителя на туберкулозата по птиците), IV - бързорастящи микобактерии и устойчиви на киселина сапрофити.

За да направите това, е доста ефективно и икономически оправдано да се изследват свойствата на изолираната култура по съкратена схема, в която основното внимание се обръща на времето на появата на първичния растеж на колониите, образуването на пигменти, културата морфологични и тинкториални свойства при оцветяване по Ziehl-Neelsen. Особено важен е тестът за образуване на корда в първична или дори субкултура в комбинация с резултатите от биоанализ. За да се приготвят намазки от отглеждани колонии, препоръчително е да се правят едновременно както от колонии, така и от остатъци от суспендирано вещество и кондензат, т.е. от течната част на дъното на тубата.

В допълнение, лабораторният персонал има възможност не само да извършва контролно клане на животни, реагиращи на туберкулин, и да взема проби от материал за изследване, но и да взема проби за бактериологични изследвания по време на живота на животните (бронхиална или назална слуз, мляко, изпражнения, урина, ексудат, кръв и др.), както и проби от фураж, вода, обекти от околната среда за изолиране на микобактерии и по този начин косвено доказват причината за реакцията на говедата към туберкулин. При засяване на допълнителен материал и проби от обекти на околната среда се използват добре познати методи за концентриране на микобактерии: утаяване, флотация, флотация-утаяване и др.

Съкратена схема на диференциация на микобактерии с помощта на биоанализ

Основен метод за микробиологична диагностика и "златен стандарт" на микробиологията е бактериологичният метод.

Целта на бактериологичния методсе състои в изолиране на чиста култура на патогена от тестовия материал, натрупване на чиста култура и идентифициране на тази култура чрез набор от свойства: морфологични, тинкториални, културни, биохимични, антигенни, чрез наличие на фактори на патогенност, токсигенност и определяне на нейната чувствителност. към антимикробни лекарства и бактериофаги.

Бактериологичният метод на изследване включва:

1. инокулация на тестовия материал в хранителни среди

2. изолация на чиста култура

3. идентификация на микроорганизми (определяне на принадлежност към вид).

Изолирането и идентифицирането на чисти култури от аеробни и анаеробни бактерии включва следните изследвания:

I етап (работа с роден материал)

Цел: получаване на изолирани колонии

1. Предварителната микроскопия дава приблизителна представа за микрофлората

2. Подготовка на материал за изследване

3. Засяване върху плътни хранителни среди за получаване на изолирани колонии

4. Инкубация при оптимална температура, най-често 37°C, за 18-24 часа

II етап

Цел: получаване на чиста култура

1. Макроскопско изследване на колонии в пропусната и отразена светлина (характеристики на размера, формата, цвета, прозрачността, консистенцията, структурата, контура, повърхността на колониите).

2. Микроскопско изследване на изолирани колонии

3. Тестване за аеротолерантност (за потвърждаване наличието на строги анаероби в тестовия материал).

4. Засяване на колонии, характерни за даден вид, върху чиста среда за натрупване на култура или елективна среда и инкубиране при оптимални условия.

Етап III

Цел: Идентифициране на изолирана чиста култура

1. За идентифициране на изолираната култура чрез комплекс от биологични свойства се изследва следното:

морфология и тинкториални свойства

културни свойства (характер на растеж върху хранителни среди)

биохимични свойства (ензимна активност на микроорганизми)

Серологични свойства (антигенни)

Вирулентни свойства (способност да произвежда фактори на патогенност: токсини, ензими, защитни и агресивни фактори)

патогенност за животните

фаголизируемост (чувствителност към диагностични бактериофаги)

чувствителност към антибиотици

Други самостоятелни имоти

Етап IV (Заключение)

По изследваните свойства се прави заключение за изолираната култура

Първият етап от изследването.Изследването на патологичния материал започва с микроскопия. Микроскопията на оцветен нативен материал позволява да се установи приблизително съставът на микробния пейзаж на изследвания обект, някои морфологични характеристики на микроорганизмите. Резултатите от микроскопията на нативния материал до голяма степен определят хода на по-нататъшните изследвания и впоследствие се сравняват с данните, получени по време на инокулацията върху хранителни среди.

При достатъчно съдържание на патогенни микроорганизми в пробата, инокулацията се извършва върху плътна хранителна среда (за получаване на изолирани колонии). Ако има малко бактерии в тестовия материал, тогава инокулацията се извършва върху течна хранителна среда за обогатяване. Хранителните среди се подбират според изискванията на микроорганизмите.

Култивирането на микроорганизми е възможно само при създаване на оптимални условия за тяхната жизнена дейност и спазване на правилата, които изключват замърсяване (случайно замърсяване от чужди микроби) на тестовия материал. В епруветка, колба или петриево блюдо могат да се създадат изкуствени условия, които изключват заразяване на културата от други видове. Всички прибори и хранителни среди трябва да бъдат стерилни и след инокулация на микробен материал, защитени от външно замърсяване, което се постига с помощта на запушалки или метални капачки и капаци. Манипулациите с изпитвания материал трябва да се извършват в зоната на пламъка на спиртна лампа, за да се изключи замърсяването на материала от външната среда, както и за да се спазват правилата за безопасност.

Посяването на материала върху хранителни среди трябва да се извърши не по-късно от 2 часа от момента на събирането им.

Вторият етап на изследването.Изследване на колонии и изолиране на чисти култури. След един ден инкубация колониите растат върху плочите, като при първия удар растежът е непрекъснат, а при следващия - изолирани колонии. Колонията е колекция от микроби от един и същи вид, които са израснали от една клетка. Тъй като материалът най-често е смес от микроби, растат няколко вида колонии. Различните колонии се маркират с молив, като се очертават с кръг от страната на дъното и се изследват (Таблица 11). Първо, проучете колониите с просто око: макроскопични признаци. Съдът се гледа (без да се отваря) от дъното на пропускаща светлина, отбелязва се прозрачността на колониите (прозрачен, ако не улавя светлина; полупрозрачен, ако частично улавя светлина; непрозрачен, ако светлината не преминава през колония), измерете (в mm) размера на колониите. След това изучават колониите от страната на капака, отбелязват формата (правилна кръгла, неправилна, плоска, изпъкнала), естеството на повърхността (гладка, лъскава, матова, грапава, набръчкана, мокра, суха, лигавица), цвят (безцветен, оцветен).

Таблица 11. Схема на изследване на колонии

№	знак	Възможни характеристики на колонията
1.	форма	Плосък, изпъкнал, куполообразен, вдлъбнат, кръгъл, розетков, звездообразен
2.	Размер, мм	Голям (4-5 mm), среден (2-4 mm), малък (1-2 mm), джудже (< 1 мм)
3.	Повърхностна природа	Гладка (S-форма), грапава (R-форма), мазна (M-форма), набраздена, неравна, матова, лъскава
4.	Цвят	Безцветен, боядисан
5.	Прозрачност	Прозрачни, непрозрачни, полупрозрачни
6.	Естеството на ръбовете	Гладка, назъбена, с ресни, влакнеста, назъбена
7.	Вътрешна структура	Хомогенна, гранулирана, разнородна
8.	Последователност	Вискозен, лигав, ронлив
9.	Емулгиране в капка вода	Добро Лошо

Забележка: Изследват се 5-7 точки при малко увеличение на микроскопа.

Можете да видите разликата между колониите още по-добре, когато ги увеличите. За да направите това, затворена чиния се поставя с главата надолу върху предметна маса, кондензаторът се спуска леко надолу, използва се малко увеличение на обектива (x8), като се движи чинията, микроскопичните признаци се изследват в колониите: естеството на ръб (гладък, вълнообразен, назъбен, назъбен), структура (хомогенна, зърнеста, влакнеста, хомогенна или различна в центъра и по периферията).

След това се изследва морфологията на микробните клетки от колониите. За целта се правят петна от част от всяка от маркираните колонии, оцветени по Грам. Когато вземате колонии, обърнете внимание на консистенцията (суха, ако колонията се рони и е трудна за вземане; мека, ако се хваща лесно на примката; лигава, ако колонията достига до примката; твърда, ако е част от колонията не се взема от цикъла, само цялата колония може да бъде премахната) .

При преглед на петна се установява, че колонията е представена от един вид микроб, следователно могат да се изолират чисти култури от бактерии. За да направите това, от изследваните колонии се извършва повторно засяване върху наклонен агар. При повторно засяване от колонии трябва да се внимава да се вземат точно предвидените колонии, без да се докосва примката на близките колонии. Епруветките се подписват и се инкубират в термостат при 37°C за 24 часа.

Третият етап на изследване.Идентифициране на изолираната култура. Идентификация на микробите - определяне на системното положение на изолираната от материала култура спрямо вида и варианта. Първото условие за надеждността на идентификацията е безусловната чистота на културата. За идентифициране на микроби се използва набор от признаци: морфологични (форма, размер, наличие на камшичета, капсули, спори, относителна позиция в намазка), тинкториални (връзка с оцветяване по Грам или други методи), химически (съотношение гуанин + цитозин в ДНК молекула), културни (изисквания към хранителни вещества, условия на култивиране, скорост и естество на растеж върху различни хранителни среди), ензимни (разцепване на различни вещества с образуването на междинни и крайни продукти), серологични (антигенна структура, специфичност), биологични (вирулентност за животни, токсичност, алергенност, ефект на антибиотици и др.).

За биохимична диференциация способността на бактериите да ферментират въглехидрати с образуването на междинни и крайни продукти, способността за разграждане на протеини и пептони и изследване на редокс ензими.

За изследване на захаролитичните ензими изолираните култури се инокулират в епруветки с полутечна среда, съдържаща лактоза, глюкоза и други въглехидрати и полиоли. При полутечни среди инокулацията се извършва чрез инжектиране в дълбочината на средата. При засяване чрез инжектиране епруветката със средата се държи под ъгъл, запушалката се отстранява и ръбът на епруветката се изгаря. Материалът се взема със стерилна примка и с него почти до дъното се набожда колонка с хранителна среда.

За определяне на протеолитичните ензими изолираната култура се инокулира върху пептонна вода или MPB. За да направят това, те вземат епруветка с инокулация по-близо до себе си и епруветка със средата - по-далеч от себе си. И двете епруветки се отварят едновременно, като се захващат запушалките им с малкия пръст и ръба на дланта, краищата на епруветките се изгарят, малко култура се улавя с калцинирана охладена примка и се прехвърля във втората епруветка , стрива се в течна среда върху стената на епруветката и се измива със средата.

При сеитба и повторно засяване трябва да се обърне внимание на спазването на правилата за стерилност, за да не се замърсят техните култури с чужда микрофлора, а също и да не се замърсява околната среда. Епруветките се етикетират и се поставят в термостат за инкубиране при температура 37°C за един ден.

Заключение

Отчитане на резултатите. Заключение от изследването. Резултатите от идентификацията се вземат предвид и въз основа на съвкупността от получените данни, въз основа на класификацията и характеристиките на типовите щамове, описани в ръководството (ръководство на Bergy, 1994-1996), се определя типът на изолираните култури.

3. Видове микроскопски препарати. Етапи на подготовка на фиксирана цитонамазка. Прости методи за оцветяване.

4. Диференциално диагностични методи за оцветяване на микроби. Оцветяване по Грам, механизъм и техника на оцветяване.

5. Морфология на бактериите. Разлики между прокариоти и еукариоти. Основни форми на бактерии.

6. Структура и функции на повърхностните образувания на бактериална клетка. Капсула. Методи за откриване.

7. Устройство и функции на клетъчната стена на Грам-положителните и Грам-отрицателните бактерии. Форми на бактерии с дефекти на клетъчната стена.

8. Цитопазматични структури на бактерии, функции, методи за откриване. Киселинно устойчиви микроби. Метод на оцветяване.

9. Почиващи форми на микроби. Спорообразуване при бактерии, етапи, методи за откриване на спори.

10. Подвижност на бактериите, методи за откриване на подвижността.

11. Принципи на таксономията на микробите. Систематичното разположение на микробите. таксономични категории. Понятието и критериите на типа.

12-16. Систематично разположение и морфология на спирохети, актиномицети, микоплазми, рикетсии, хламидии. Методи на изследване.

18. Дихателен апарат на бактериите. Пътища на биологично окисление. Класификация на микробите на тази основа

19 Начини за размножаване на микробите. Механизъм и фази на клетъчното делене.

20. Характеристики на бактериологичния метод на изследване

21. Хранителни среди за аероби и анаероби. Изисквания към хранителните среди, класификация.

22. Методи за изолиране на чисти култури от аероби.

23. Методи за изолиране на чисти култури от анаероби.

24. Идентификация на микроорганизми морфологични, културни, серологични, биологични, генетични.

26. Генетичен апарат на бактерии (хромозоми, плазмиди) характеристика на бактериални транспозони. Биологичната роля на плазмидите.

27. Видове бактериална изменчивост. Фенотипна и генотипна изменчивост. Концепцията за изменчивост на населението.

28. Мутационна изменчивост. генетична рекомбинация. Практическото значение на изменчивостта на микроорганизмите. Концепцията за генното инженерство и биотехнологията.

29. Молекулярна диагностика. Мишена. Задачи. Методи.

30. Молекулярна хибридизация. полимеразна верижна реакция.

31. Учението за инфекцията. Условия за възникване на инфекциозен процес. признаци на инфекциозни заболявания. Видове инфекции.

32. Ролята на микроорганизма в инфекциозния процес. Патогенност и вирулентност Фактори на патогенност.

33. Ролята на макроорганизма, физическата и социалната среда в инфекциозния процес.

34. Биологичен метод на изследване на проблема, етапи на оценка.

35. Химиотерапия и химиопрофилактика. Класификация на дефиницията на антибиотиците.

36. Механизмът на действие на антибиотиците.

37. Страничен ефект на антибиотиците.

38. Резистентност на микроорганизмите към антибиотици.

39 Методи за изследване на чувствителността на микробите към антибиотици.

40. Екология на микроорганизмите. Видове екологични връзки.

41. Характеристики на нормалната човешка микрофлора и нейната биологична роля. Методи на изследване. Гнотобиология. Дисбактериоза. Причини за развитие, принципи на корекция.

42 Стерилизация, дезинфекция. Дефиниране на понятия, методи за изпълнение.

43. Асептика, антисептика. Дефиниция на понятията. Начини за провеждане.

20. Характеристики на бактериологичния метод на изследване

Културен (бактериологичен) метод на изследване - набор от методи, насочени към изолиране и идентифициране на чисти култури от микроорганизми (бактерии) чрез култивиране върху хранителни среди.

Чистата култура е съвкупност от микроорганизми от един и същи вид. Най-често чиста култура се получава чрез селекция и култивиране на изолирана колония (потомството на единична микробна клетка).

Стъпки на метода:

1. Събиране на материал за изследване.

2. Изолиране на чиста култура и нейната идентификация.

3. Заключение.

Събиране на материал за изследване.Видът на изследвания материал зависи от целта на изследването (диагноза - от пациента; епидемиологичен анализ - от околната среда, храната, пациента и (или) бактериологичния носител).

Изолиране на чиста култура. Включва 3 или 4 етапа:

1. Засяване на материала (след предварителна микроскопия) върху чаша с плътна хранителна среда (за предпочитане диференциално диагностична или селективна), за да се получат изолирани колонии. Произвежда се най-често по метода на механичното разделяне. В някои случаи (например кръв), материалът се посява предварително в течна среда за обогатяване, последвано от субкултивиране върху плака с агарна среда. Понякога се извършва селективна обработка на материала преди инокулацията (като се вземат предвид свойствата на изолирания микроорганизъм; например обработка с киселина или основа за изолиране на резистентни бактерии). Култивира се при температура 37°C за 18-24 часа. Времето за култивиране на различните видове бактерии може да варира.

2(3): а) изследване на колонии върху агарово блюдо (културни признаци), селекция на най-типичните; б) изготвяне на намазки от тези колонии с оцветяване (по Грам или други методи); а) пресяване на останалата част от изследваната колония върху средата за натрупване и отглеждане в термостат при оптимална температура.

3(4). Изследване на чистотата на културата, получена върху средата за натрупване. С тази

целта е да се подготви цитонамазка, оцветяване (обикновено по Грам), микроскопско изследване

морфологична и тинкториална хомогенност (в различни зрителни полета).

4(5). Идентификация на чиста култура.

Заключение.Според съвкупността от характеристики в сравнение със свойствата на референтните (типични) щамове се посочва видът на микроорганизма, изолиран от материала.

Оценка на метода:

предимства:относително висока чувствителност и точност, възможност за определяне на броя на микробите в тестовия материал, както и чувствителност към антибиотици; недостатъци:относителна продължителност, методът е скъп.

21. Хранителни среди за аероби и анаероби. Изисквания към хранителните среди, класификация.

Изисквания:

медиите трябва да са питателни

трябва да има определено ph

трябва да е изотоничен, т.е. осмотичното налягане в средата трябва да бъде същото като в клетката.

трябва да е влажна и не прекалено течна

трябва да има определен редокс потенциал

трябва да е стерилен

трябва да бъдат унифицирани, т.е. съдържат постоянни количества от отделни съставки.

Хранителните среди могат да бъдат разделени:

А) Произход

1) естествена - естествена храна (месо, мляко, картофи);

2) изкуствени - специално подготвени за отглеждане на микроби: - среди от естествени продукти (месна вода, месо-пептонен бульон (MPB), месо-пептонен агар (MPA), - без постоянен състав; - синтетични хранителни среди - разтвори на строго определени количества соли, аминокиселини, азотни основи, витамини в дестилирана вода - имат постоянен състав, използват се за отглеждане на микроорганизми и клетъчни култури при производството на ваксини, имунни серуми и антибиотици;

Б) С предварително записване:

1) общо предназначение (MPB, MPA) - върху тях растат повечето микроби;

2) избираеми - селективно насърчаване на растежа на един вид микроби от смес (например жълтъчно-солев агар за стафилококи);

3) диференциална диагностика - позволяват един вид микроби да бъдат диференцирани по външния вид на околната среда от други (например Endo, Levin media за чревната група микроби).

Освен това в зависимост от цели на използванеВ схемата за изолиране на чисти култури по предназначение могат да се разграничат следните среди:

1) обогатяване - инхибират растежа на микроби, свързани с патогена;

2) да се получат изолирани колонии;

3) натрупване на чиста култура;

B) Консистенция:

1) течност;

2) полутечен (с добавяне на агар-агар в концентрация 0,5-0,7%);

3) плътен - над 1%.

Основен метод за микробиологична диагностика и "златен стандарт" на микробиологията е бактериологичният метод.

Целта на бактериологичния методсе състои в изолиране на чиста култура на патогена от тестовия материал, натрупване на чиста култура и идентифициране на тази култура чрез набор от свойства: морфологични, тинкториални, културни, биохимични, антигенни, чрез наличие на фактори на патогенност, токсигенност и определяне на нейната чувствителност. към антимикробни лекарства и бактериофаги.

Бактериологичният метод на изследване включва:

1. инокулация на тестовия материал в хранителни среди

2. изолация на чиста култура

3. идентификация на микроорганизми (определяне на принадлежност към вид).

Изолирането и идентифицирането на чисти култури от аеробни и анаеробни бактерии включва следните изследвания:

I етап (работа с роден материал)

Цел: получаване на изолирани колонии

1. Предварителната микроскопия дава приблизителна представа за микрофлората

2. Подготовка на материала за изследване (разреждане с изотоничен разтвор на NaCl и др.)

3. Засяване върху плътни хранителни среди за получаване на изолирани колонии

4. Инкубация при оптимална температура, най-често 37°C, за 18-24 часа

II етап

Цел: получаване на чиста култура

1. Макроскопско изследване колониив пропусната и отразена светлина (характеристика на размера, формата, цвета, прозрачността, консистенцията, структурата, контура, повърхността на колониите).

2. Микроскопско изследване на изолирани колонии

3. Тестване за аеротолерантност (за потвърждаване наличието на строги анаероби в тестовия материал).

4. Засяване на колонии, характерни за даден вид, върху чиста среда за натрупване на култура или елективна среда и инкубиране при оптимални условия.

Етап III

Цел: Идентифициране на изолирана чиста култура

1. За идентифициране на изолираната култура чрез комплекс от биологични свойства се изследва следното:

морфология и тинкториални свойства

културни свойства (характер на растеж върху хранителни среди)

биохимични свойства (ензимна активност на микроорганизми, гликолитична, протеолитична и друга активност)

Серологични свойства (антигенни)

Вирулентни свойства (способност да произвежда фактори на патогенност: токсини, ензими, защитни и агресивни фактори)

патогенност за животните

фаголизируемост (чувствителност към диагностични бактериофаги)

чувствителност към антибиотици

Други самостоятелни имоти

Етап IV (Заключение)

По изследваните свойства се прави заключение за изолираната култура

Първият етап от изследването.Изследването на патологичния материал започва с микроскопия. Микроскопията на оцветен нативен материал позволява да се установи приблизително съставът на микробния пейзаж на изследвания обект, някои морфологични характеристики на микроорганизмите. Резултатите от микроскопията на нативния материал до голяма степен определят хода на по-нататъшните изследвания и впоследствие се сравняват с данните, получени по време на инокулацията върху хранителни среди.

При достатъчно съдържание на патогенни микроорганизми в пробата, инокулацията се извършва върху плътна хранителна среда (за получаване на изолирани колонии). Ако има малко бактерии в тестовия материал, тогава инокулацията се извършва върху течна хранителна среда за обогатяване. Хранителните среди се подбират според изискванията на микроорганизмите.

Култивирането на микроорганизми е възможно само при създаване на оптимални условия за тяхната жизнена дейност и спазване на правилата, които изключват замърсяване (случайно замърсяване от чужди микроби) на тестовия материал. В епруветка, колба или петриево блюдо могат да се създадат изкуствени условия, които изключват заразяване на културата от други видове. Всички прибори и хранителни среди трябва да бъдат стерилни и след инокулация на микробен материал, защитени от външно замърсяване, което се постига с помощта на запушалки или метални капачки и капаци. Манипулациите с изпитвания материал трябва да се извършват в зоната на пламъка на спиртна лампа, за да се изключи замърсяването на материала от външната среда, както и за да се спазват правилата за безопасност.

Посяването на материала върху хранителни среди трябва да се извърши не по-късно от 2 часа от момента на събирането им.

Вторият етап на изследването.Изследване на колонии и изолиране на чисти култури. След един ден инкубация колониите растат върху плочите, като при първия удар растежът е непрекъснат, а при следващия - изолирани колонии. Колонията е колекция от микроби от един и същи вид, които са израснали от една клетка. Тъй като материалът най-често е смес от микроби, растат няколко вида колонии. Различните колонии се маркират с молив, като се очертават с кръг от страната на дъното и се изследват (Таблица 12). Първо, проучете колониите с просто око: макроскопични признаци. Съдът се гледа (без да се отваря) от дъното на пропускаща светлина, отбелязва се прозрачността на колониите (прозрачен, ако не улавя светлина; полупрозрачен, ако частично улавя светлина; непрозрачен, ако светлината не преминава през колония), измерете (в mm) размера на колониите. След това изучават колониите от страната на капака, отбелязват формата (правилна кръгла, неправилна, плоска, изпъкнала), естеството на повърхността (гладка, лъскава, матова, грапава, набръчкана, мокра, суха, лигавица), цвят (безцветен, оцветен).

Таблица 12. Схема на изследване на колонии

№	знак	Възможни характеристики на колонията
1.	форма	Плосък, изпъкнал, куполообразен, вдлъбнат, кръгъл, розетков, звездообразен
2.	Размер, мм	Голям (4-5 mm), среден (2-4 mm), малък (1-2 mm), джудже (< 1 мм)
3.	Повърхностна природа	Гладка (S-форма), грапава (R-форма), мазна (M-форма), набраздена, неравна, матова, лъскава
4.	Цвят	Безцветен, боядисан в ... цвят
5.	Прозрачност	Прозрачни, непрозрачни, полупрозрачни
6.	Естеството на ръбовете	Гладка, назъбена, с ресни, влакнеста, назъбена
7.	Вътрешна структура	Хомогенна, гранулирана, разнородна
8.	Последователност	Вискозен, лигав, ронлив
9.	Емулгиране в капка вода	Добро Лошо

Забележка: Точки 5-7 се изследват с микроскоп с малко увеличение или под лупа.

Можете да видите разликата между колониите още по-добре, когато ги увеличите. За да направите това, затворена чиния се поставя с главата надолу върху предметна маса, кондензаторът се спуска леко надолу, използва се малко увеличение на обектива (x8), като се движи чинията, микроскопичните признаци се изследват в колониите: естеството на ръб (гладък, вълнообразен, назъбен, назъбен), структура (хомогенна, зърнеста, влакнеста, хомогенна или различна в центъра и по периферията).

След това се изследва морфологията на микробните клетки от колониите. За целта се правят петна от част от всяка от маркираните колонии, оцветени по Грам. Когато вземате колонии, обърнете внимание на консистенцията (суха, ако колонията се рони и е трудна за вземане; мека, ако се хваща лесно на примката; лигава, ако колонията достига до примката; твърда, ако е част от колонията не се взема от цикъла, само цялата колония може да бъде премахната) .

При преглед на петна се установява, че колонията е представена от един вид микроб, следователно могат да се изолират чисти култури от бактерии. За да направите това, от изследваните колонии се извършва повторно засяване върху наклонен агар. При повторно засяване от колонии трябва да се внимава да се вземат точно предвидените колонии, без да се докосва примката на близките колонии. Епруветките се подписват и се инкубират в термостат при 37°C за 24 часа.

Третият етап на изследване.Идентифициране на изолираната култура. Идентификация на микробите - определяне на системното положение на изолираната от материала култура спрямо вида и варианта. Първото условие за надеждността на идентификацията е безусловната чистота на културата. За идентифициране на микробите се използва набор от признаци: морфологични (форма, размер, наличие на флагели, капсули, спори, взаимно разположение в намазка), тинкториални (връзка с оцветяване по Грам или други методи), химични (съотношение гуанин + цитозин в ДНК молекула), културни (хранителни изисквания, условия на култивиране, скорост и естество на растеж върху различни хранителни среди), ензимни (разцепване на различни вещества с образуването на междинни и крайни продукти), серологични (антигенна структура, специфичност), биологични ( вирулентност за животни, токсичност, алергенност, ефект на антибиотици и др.).

За биохимична диференциация те изучават способността на бактериите да ферментират въглехидрати с образуването на междинни крайни продукти, способността да разграждат протеини и пептони и изучават редокс ензими.

За изследване на захаролитичните ензимиизолираните култури се инокулират в епруветки с полутечна среда, съдържаща лактоза, глюкоза и други въглехидрати и многовалентни алкохоли. При полутечни среди инокулацията се извършва чрез инжектиране в дълбочината на средата. При засяване чрез инжектиране епруветката със средата се държи под ъгъл, запушалката се отстранява и ръбът на епруветката се изгаря. Материалът се взема със стерилна примка и с него почти до дъното се набожда колонка с хранителна среда.

За определяне на протеолитични ензимиизолираната култура се инокулира в пептонна вода или BCH. За да направят това, те вземат епруветка с инокулация по-близо до себе си и епруветка със средата - по-далеч от себе си. И двете епруветки се отварят едновременно, като се захващат запушалките им с малкия пръст и ръба на дланта, краищата на епруветките се изгарят, малко култура се улавя с калцинирана охладена примка и се прехвърля във втората епруветка , стрива се в течна среда върху стената на епруветката и се измива със средата.

При сеитба и повторно засяване трябва да се обърне внимание на спазването на правилата за стерилност, за да не се замърсят техните култури с чужда микрофлора, а също и да не се замърсява околната среда. Епруветките се етикетират и се поставят в термостат за инкубиране при температура 37°C за един ден.

Заключение

Отчитане на резултатите. Заключение от изследването. Резултатите от идентификацията се вземат предвид и въз основа на съвкупността от получените данни, въз основа на класификацията и характеристиките на типовите щамове, описани в ръководството (ръководство на Bergy, 1994-1996), се определя типът на изолираните култури.