Fajok - olyan mikroorganizmusok halmaza, amelyek közös evolúciós eredetűek, hasonló genotípussal (nagy fokú genetikai homológia, általában több mint 60%) és a lehető legközelebbi fenotípusos jellemzőkkel rendelkeznek. A törzs egy adott típusú baktérium izolált tenyészete („egy adott faj meghatározott mintája”) A telep egy szemmel látható, izolált struktúra, amely a mikroorganizmusok szaporodása és felhalmozódása eredményeként alakul ki egy bizonyos inkubációs időszak alatt, valamint egy szülősejtből vagy több azonos sejtből.

Laboratóriumi diagnosztika módszerei Ø Mikroszkópos - m/o kimutatása közvetlenül a klinikai anyagban Ø Bakteriológiai - m/o kimutatása az anyag táptalajra történő beoltásával Ø Biológiai - m/o izolálása korábban fertőzött laboratóriumi állatból Ø Szerológiai - m/o kimutatása specifikus immunantitestek a beteg vérszérumában Ø Allergiás – allergiás bőrvizsgálatot végző (nagyon specifikus – tuberkulózis, tularémia stb.)

Ø Kulturális - egy mikroorganizmus táptalajokon való növekedésének természete. Ø Biokémiai - a különféle szubsztrátok (szénhidrátok, fehérjék és aminosavak stb.) fermentálására való képesség, az életfolyamat során különféle biokémiai termékek képződése a különböző enzimrendszerek aktivitása és az anyagcsere jellemzői miatt. Ø Antigén - elsősorban a sejtfal kémiai összetételétől és szerkezetétől függ, a flagellák, kapszulák jelenléte, a makroorganizmus (gazdaszervezet) antitest-termelő képessége és az immunválasz egyéb formái alapján ismerhető fel, immunológiai reakciókban kimutatható.

Élettani - szénhidrát (autotrófok, heterotrófok), nitrogén (aminoautotrófok, aminoheterotrófok) és egyéb táplálkozási módszerek, a légzés típusa (aerobok, mikroaerofilek, fakultatív anaerobok, szigorú anaerobok). Ø Mobilitás és mozgástípusok. Ø Spóraképző képesség, spórák jellege. Ø Bakteriofágokra, fág tipizálásra való érzékenység. Ø A sejtfalak kémiai összetétele - bázikus cukrok és aminosavak, lipid és zsírsav összetétel. Ø Fehérje spektrum (polipeptid profil). Ø Ø Antibiotikumokra és egyéb gyógyszerekre való érzékenység. Ø Genotipikus (genoszisztematikus módszerek alkalmazása).

A bakteriológiai módszer magában foglalja a klinikai anyag mesterséges táptalajra történő beoltását, a mikrobák tiszta tenyészeteinek izolálását és az azt követő azonosítást.

Bakteriológiai módszereket alkalmaznak: fertőző betegségek diagnosztizálásában; Ш Bélbaktériumok, diftéria bacillusok stb. hordozójának megelőző vizsgálatok során; Ш a környezeti objektumok (víz, levegő, talaj, élelmiszerek stb.) egészségügyi és higiéniai állapotának vizsgálatakor, valamint járványügyi indikációk szerinti vizsgálatakor a kórokozó mikroorganizmusokkal való szennyeződés szempontjából. SH

Élettani jellemzők A hőmérséklethez való viszony Légzés Táplálkozás Enzimek Fehérjék és aminosavak metabolizmusa (zselatináz, kollagenáz, dekarboxiláz, ureáz) Egyéb enzimek (hemolizinok, lipázok, lecitináz, DNáz) Az anyagcsere végtermékei (kromatográfia) AMP-rezisztencia/érzékenység

A mikroorganizmusok szaporodásához elsődlegesen szükséges, a tápközegbe kerülő elemeket a mikrobasejtek kémiai összetételéből határozzák meg, amely elvileg minden élő szervezetben azonos. A teljes sejttömeg zömét a víz (80-90%) teszi ki, és csak 10-20%-a szárazanyag. Szárazanyag-tartalmuk alapján makro- és mikroelemeket különböztetünk meg. Az előbbiek közé tartozik: szén, oxigén, nitrogén, hidrogén, kén, foszfor, kálium, nátrium, magnézium, kalcium, vas. A mikroelemek közé tartozik a mangán, molibdén, cink, réz, kobalt stb., amelyek többsége nyomokban szükséges. Emiatt sok tápközeg összetételéhez nem adnak hozzá mikroelemeket, mivel ezek iránti igény kielégíthető a makrotápanyag-sók szennyeződései miatt. Ráadásul nem minden mikroorganizmus igényel mikroelemeket. 14

Az állati és növényi szervezetektől eltérően a mikroorganizmusokat sokféle táplálkozási típus jellemzi, amelyeket három fő kritérium szerint különböztetnek meg – szénforrás, energiaforrás és elektron (hidrogén) donor. A szénforrás jellegétől függően minden mikroorganizmust 2 nagy csoportra osztanak – autotrófokra, amelyek szén-dioxidot használnak, és heterotrófokra, amelyek növekedéséhez és szaporodásához kész szerves anyagokra van szükség. Figyelembe véve az energiaforrások és az elektrondonorok sokféleségét, ezeket a csoportokat alcsoportokra osztják, így a mikroorganizmusok 8 féle táplálkozást eredményeznek. Minden táplálkozási típus bizonyos mikroorganizmusokra jellemző, és tükrözi azok fiziológiai és biokémiai tulajdonságait. A legtöbb mikroorganizmus, beleértve a patogén mikroorganizmusokat is, olyan táplálkozással rendelkezik, amelyben a szerves anyagok szén-, energia- és elektrondonorok forrásai. 16

A mikroorganizmusok szerves szénforrásigénye igen sokrétű. Egyes fajok „mindenevők” és különféle kémiai természetű anyagokat fogyaszthatnak, mások szelektívebbek, és csak néhányat használnak fel. Az egyes mikroorganizmus-típusokra jellemző szerves vegyületek készletének sajátosságait figyelembe veszik a szelektív és differenciáldiagnosztikai közegek létrehozásakor, amelyeket széles körben használnak az egészségügyi és klinikai mikrobiológiában bizonyos mikroorganizmuscsoportok gyors azonosítására. A széntartalmú szubsztrátum kiválasztásakor figyelembe kell venni, hogy a szerves anyagok emészthetősége nagymértékben függ tulajdonságaiktól - oldhatóságuktól, a szénatomok oxidációs fokától, molekuláik térbeli konfigurációjától és polimerizációjától. A mikroorganizmusok általában bizonyos optikai izomereket – a D-sorozatba tartozó cukrokat, aminosavakat – asszimilálnak az L-sorozatba. Nagyon kevés mikroorganizmus rendelkezik olyan enzimekkel, amelyek az egyik optikai izomert egy másikká alakítják át. Csak azok a mikroorganizmusok használhatnak biopolimereket, mint a keményítő, poliszacharidok, fehérjék, zsírok, amelyek bizonyos hidrolitikus enzimeket - amilázokat, proteázokat, lipázokat exoenzimek formájában, azaz a sejt által a környezetbe szekretált enzimek formájában szintetizálnak. 17

A heterotróf mikroorganizmusok túlnyomó többsége számára a fő, könnyen elérhető szén- és energiaforrások a szénhidrátok, aminosavak, fehérjék és szerves savak. Jellemezve a mikroorganizmusok szerves szénforrások iránti igényét, meg kell jegyezni, hogy a heterotrófia legnagyobb foka azokban a patogén mikroorganizmusokban rejlik, amelyek alkalmazkodtak az emberek és állatok testében az élethez. A termesztésükhöz szükséges táptalaj összetétele különösen összetett. Fehérjéket vagy sekély hidrolízisük termékeit (peptideket), vitaminokat, nukleinsav-fragmenseket stb. tartalmaznak. Az ilyen tápközegek előállításához különféle típusú hidrolizátumokat és húskivonatokat, vért vagy szérumot, élesztő- és növényi kivonatokat és még sok mást használnak. Ezek a táptalajok sokféle faj tenyésztésére alkalmasak, és különösen hasznosak olyan esetekben, amikor a mikroba növekedési faktorigénye ismeretlen, vagy ahol sok növekedési faktor szükséges egyidejűleg. Az ilyen közegek hátránya a szabványosításuk bonyolultsága vagy lehetetlensége az alapanyag összetételének és tulajdonságainak nem szabványos jellege és korlátozott szabályozhatósága miatt. 18

A mikroorganizmusok konstruktív metabolizmusa általában négy fő típusú biopolimer – fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok és lipidek – szintézisére irányul. A fehérjék és nukleinsavak bioszintézisében a szén mellett a legfontosabb elem a nitrogén. A legtöbb mikroorganizmus számára a leginkább hozzáférhető nitrogénforrás az ammóniumion, amelyet szerves és szervetlen savak sóiból, aminosavakból, fehérjékből és egyéb nitrogéntartalmú anyagokból nyerhetnek. A baktériumok nagy csoportja, főként patogén, nitrogénforrásként nitrogéntartalmú szerves anyagokat igényel. Ha az aminosavak ilyen nitrogénforrások, akkor a mikroorganizmusok közvetlenül felhasználhatják azokat fehérjeszintézishez, vagy először dezaminálhatják, és a folyamat során felszabaduló aminocsoportokat felhasználhatják saját aminosavak és fehérjék szintézisére. 19

Egyes mikroorganizmusok növekedéséhez azonban bizonyos aminosavak szükségesek, amelyeket maguk nem tudnak szintetizálni. Az ilyen „esszenciális” aminosavakat igénylő mikroorganizmusok közé tartozik a Staphylococcus aureus, a hemolitikus streptococcus, a tejsavbaktériumok és mások. A mikrobák élettani jellemzőitől függően az „esszenciális” aminosavak száma eltérő – a Staphylococcus aureus esetében csak triptofán és cisztin szükséges a tápközegben, a hemolitikus streptococcus esetében pedig 17 aminosav. A fehérjék, mint nitrogénforrások csak azon mikroorganizmusok számára állnak rendelkezésre, amelyek a tápközegbe (azaz exo formában) felszabaduló proteolitikus enzimeket képeznek. Ezen enzimek hatására a fehérjék kisebb molekulatömegű anyagokra - peptonokra és aminosavakra - bomlanak le. 20

A mikroorganizmusok energiaanyagcseréjét a konstruktív anyagcseréhez hasonlóan sokféle biokémiai mechanizmus jellemzi. Ennek az anyagcserének három fő típusa van: aerob légzés, anaerob légzés és fermentáció, amelyek közül a leggyakoribb az aerob légzés. Ebben a folyamatban a szerves anyagok szén-dioxiddá és vízzé oxidálódnak az anyagban található maximális energiafelszabadulás mellett. Sok aerob légzéssel rendelkező mikroorganizmus szigorú aerob, de néhányuk fakultatív aerob, mivel anaerob körülmények között - fermentációval - ATP-t képezhetnek. Egyes mikroorganizmusok, főként baktériumok, anaerob légzéssel, azaz az anyagok oxidációjával jutnak energiához, ahol az oxigén helyett szervetlen vegyületek működnek elektronakceptorként. Így a Bacillus és az E. coli nemzetség bizonyos fajai anaerob légzést végeznek, melynek során a nitrát (NO 3) ammóniává redukálódik; A Clostridium aceticum oxidálja a molekuláris hidrogént szén-dioxiddal elektronakceptorként. 21

Az energia-anyagcsere legegyszerűbb fajtája a fermentáció. A fermentációs folyamatok anaerob körülmények között mennek végbe, és energia felszabadulásával járnak. A fő fermentációs szubsztrát a szénhidrátok, de a baktériumok szerves savakat, köztük aminosavakat, valamint purinokat és pirimidineket is fermentálhatnak. Az erjesztésnek számos fajtája létezik, amelyek mindegyikét a mikroorganizmusok egy-egy speciális csoportja okozza, és a mechanizmusnak megfelelően meghatározott végtermékek képződésével jár. Az erjedés végtermékei általában különféle szerves savak - tejsav, ecetsav, borostyánkősav, citromsav stb., valamint alkoholok (etil, butil, propil), szén-dioxid és hidrogén. A fő végtermék hozama alapján megkülönböztetik a megfelelő fermentációs típusokat. Tekintettel arra, hogy az erjesztés során nem megy végbe a szubsztrát teljes oxidációja, és részben oxidált, még energiát tartalmazó anyagok kerülnek a környezetbe - szerves savak, alkoholok stb. szubsztrát szignifikáns (~ 30-szor) alacsonyabb, mint ugyanazon szubsztrát metabolizmusa során a légzési folyamatokban. 22

Különleges szerep hárul Robert Kochra. Miután feltételezte a mikroba tiszta tenyészetének izolálásának szükségességét, ezzel meghatározta a probléma megoldásához szükséges feltételek megteremtését. Ezek közül a legfontosabb az a táptalaj volt, amelyen a mikroorganizmus növekedhetett. Koch nevéhez fűződik a szilárd táptalaj 1881-ben történő bevezetése a mikrobiológiai gyakorlatba. Használatuk ötlete korábban felmerült, és Bredfeld német kutatóé. Sőt, Schröter még 1877-ben baktériumokat tenyésztett burgonyaszeleteken, ami egyben táptalaj használataként is értelmezhető. Koch érdeme a probléma mélyreható tudományos megközelítésében és a tápközegek széleskörű használatában rejlik saját kutatásaiban. Az első keményítőt – a zselatint – is javasolta sűrű közeg alkotórészeként. 25

A modern mikrobiológusok számára ismert agar-agart Frost jóval később, 1919-ben vezette be a mindennapi gyakorlatba, bár nem szabad elfelejteni, hogy Hesse német kutató még 1881-ben javasolta az agar-agart. Ezenkívül 1913-ban V. L. Omeljanszkij orosz mikrobiológus, a zselatint tartalmazó tápközegek előtt tisztelegve, megjegyezte, hogy az agar tápközeg előnyösebb olyan esetekben, amikor a mikroba cseppfolyósítja a zselatint. Koch ötletei és gyakorlati tevékenységei a 19. század végén és a 20. század első negyedében intenzív fejlődésen mentek keresztül. Ebben az időszakban számos ország kutatói javasoltak különféle célokra táptalajokat, amelyek gyakorlati mikrobiológiai szerepe igen jelentős volt és marad. Egy modern mikrobiológus munkája során nap mint nap megjegyzi a nevüket. Ebben a néhány évben a japán származású Sh. Endo az enterobaktériumok differenciálására javasolta agart, az osztrák E. Lowenstein a mikobaktériumok táptalajt, az angol A. Mack pedig. Konki - szelektív és differenciáldiagnosztikai táptalaj bélmikroorganizmusokhoz, német T. Kitt és olasz D. Tarozzi - obligát anaerob baktériumok táptalaj, francia R. Sabouraud, cseh F. Chapek és amerikai A. Dox - gombák táptalaj , brazil R. Hottinger – húsemésztésen alapuló általános célú táptalajok stb. 26

Általános követelmények A mikrobasejt felépítéséhez szükséges összes elem tartalma Elegendő páratartalom Izotónia biztosítása A hidrogénionok bizonyos koncentrációja Oxidációs-redukciós potenciál Sterilitás

Egy periodikus kultúra növekedésének fő fázisai: kezdeti (lag) - 1, exponenciális (vagy logaritmikus) - 2, stacionárius - 3, haldoklás - 4 (12. ábra) Fig. 12. A mikrobiális populáció növekedésének fő fázisai folyékony táptalajokon.

A mikroorganizmusok szaporodásának jellege folyékony táptalajokon Ø Ø Ø Olyan baktériumok szaporodása, amelyeknek a táptalaj egyenletes zavarossága van, és amelynek színe nem, vagy a mikrobatenyészetben képződött vízoldható pigment színének megfelelően változik; Baktériumok fenéknövekedése – üledékképződés (szegény vagy bőséges, omlós, homogén, rostos stb.); Parietális növekedés a tápközeg átlátszóságának megőrzése mellett; A baktériumok felületes növekedése - film a táptalaj felületén (vékony, finom, színtelen vagy nedves, vastag, szabad szemmel jól látható, sűrű, száraz, ráncos és néha szemölcsös felülettel); A film színe a tápközeghez hasonlóan a növekvő mikrobakultúra által termelt pigmenttől függ.

A mikroorganizmusok szaporodása félfolyékony tápközegen A teszttenyészetet 0,2-0,5%-os félfolyékony agart tartalmazó oszlopba vetjük. Egy mikroorganizmus mozgási képességét határozzák meg - az oltás (injektálás) helyéről a környezetbe való terjedését a kémcső falának közvetlen közelében végzett injekcióval.

Endo Differenciál diagnosztikai táptalaj Összetétel: Bázis – tápagar Differenciál. faktor - laktóz indikátor - bázikus fukszin, nátrium-szulfittal színtelenítve Laktóz növekedése + fémes fényű vörös színű telepek

Ploskirev táptalaj Szelektív, differenciáldiagnosztikai Összetétel: Bázis – tápanyag agar Szelektív faktor – epesók, briliáns zöld, jód Differenciál. faktor – laktóz Indikátor – semleges vörös Laktóz növekedése + vörösáfonya színű telepek

Sós agar Szelektív táptalaj Összetétel: Bázis – tápagar Szelektív faktor – só 10% Indikátor – nincs Sónak ellenálló telepek növekedése

Sárgás-sós agar (Chistovich) Választható, diagnosztikai Összetétel: Bázis – tápagar Elektív faktor – só 10% Diff. faktor – tojássárgája Indikátor – nem Sónak ellenálló telepek növekedése + a telepek körüli zavarosság a lecitovitelláz aktivitás miatt

Mueller-Kaufmann tetrationát táptalaj A táptalaj szelektív dúsításra szolgál a Salmonella nemzetségbe tartozó baktériumok kimutatására Összetétel: Bázis - tápleves Szelektív faktor - szelénsav só Indikátor - nincs Nátrium-szelénsavval szemben rezisztens baktériumok növekedése

Sóleves Választható táptalaj Összetétel: Alap – tápleves Elektív faktor – 6,5% Na. Cl indikátor – nincs Sónak ellenálló mikroorganizmusok növekedése

A mikroorganizmusok növekedésének természete szilárd táptalajokon. Főbb jellemzők: ü Méret – tűhegy (≤ 1 mm) – nagy (4 – 6 mm vagy több); ü Forma - szabályos (kerek); szabálytalan (amőba alakú), rhizoid; ü Szélkontúrok - sima vagy egyenetlen (kopott, hullámos stb.) ü Kolónia dombormű (kupola alakú, laposan domború, süllyesztett középpontú telepek stb. ü Kolónia felülete (matt vagy fényes (S-R- formák); ü Telep) szín (pigmentképződés); ü a telep szerkezete (finom vagy durva szemcsés); ü konzisztencia (viszkózus, nyálkás, pasztaszerű stb.).

Baktériumok pigmentációja Vörös-barna (prodigiosin) Serratia marcessens Sárga-narancs, (karotinoidok) Staphylococcus, Sarcina, M. tuberculosis nemzetségek Fekete, barna (melanin) B. cubtilis, Candida Blue (pyocyanin) P. aeruginosa Flowluorescentosa nemzetség gombái -zöld (pyoverdine) Vibrio nemzetség

Tiszta kultúrák izolálása: beoltás szelektív táptalajra Bade-Parker szelektív táptalaj staphylococcusokra. A kálium-tellurittal szemben ellenálló mikroorganizmusok növekedése. Fémtelluriummá alakítják, és a kolónia feketévé válik

Tiszta kultúrák izolálása: szűrés membránszűrőn keresztül Mikroorganizmusok a szűrőn Fém ketrecek nukleáris szűrőkhöz

A kóros anyag tanulmányozásának bakteriológiai módszere a mikobaktériumok izolálására és azonosítására 3 módszert tartalmaz: bakterioszkópos, kulturális és biológiai / R.V. Tkzova, 1983; I. I. Rumachik, 1987, 1993; MINT. Doncsenko, 1989; Yu.Ya. Kassica, 1990; A.Kh.Naimanov, 1993; L.P.Khodun, 1997/. A bakteriológiai vizsgálat időtartama nem haladhatja meg a 3 hónapot.

Tekintettel arra, hogy a szarvasmarhák szerveiben és szöveteiben a makroszkópos tuberkulózis-elváltozásokat a szarvasmarha-tuberkulózis kórokozója okozza, nincs értelme az ilyen anyagok bakteriológiai vizsgálatának. Ha ilyen anyagot kutatás céljából a laboratóriumba szállítanak, akkor bizottsági vizsgálatot végeznek, és jegyzőkönyvet készítenek. Az anyag ártalmatlanná válik.

Az anyag bakterioszkópos (mikroszkópos) vizsgálata abból áll, hogy minden szervről (vagy tuberkulózisra gyanús elváltozású szervdarabokról) és nyirokcsomóból 2 db ujjlenyomat kenetet készítünk, amelyet vizsgálatra szállítunk, levegőn szárítunk, alkohollámpa lángja fölé rögzítjük. , a Zil- Nielsen szerinti festés és a megfestett kenetek mikroszkóp alatti megtekintése, minden kenetben legalább 50 látómező. Egy tintából legalább 20 ujjlenyomat-kenetet kell készíteni anyagból. Ezenkívül a mikroszkópos keneteket táptalajra vetett anyag szuszpenziójából is készítik.

A kenetek Ziehl-Neelsen festése szelektív a mikobaktériumok azonosítására: a festett szövetek vagy idegen mikroflóra kék hátterében a mikobaktériumok vörös, rózsaszín vagy rubinvörös pálcikákként láthatók. A legjobb, ha binokuláris mikroszkóp alatt nézi a keneteket 1,5 (melléklet) x 7 (okulár) x 90 vagy 100 (lencse) nagyítással.

A módszert szignálmódszerként alkalmazzuk, hiszen a kenetekben a mikobaktériumok jelenléte vagy hiánya abszolút nincs hatással a további kutatások menetére, sőt a pozitív bakterioszkópiai következtetésnek sincs jogi jelentősége (madarak kivételével). Az anyagot tovább kell vizsgálni.

A madarak tuberkulózisának laboratóriumi diagnózisát megállapítottnak tekintik, ha a vizsgálati anyagból madárfaj (papagájokból - emberi vagy madárfajokból származó) mikobaktériumok tenyészetét izolálják, a biológiai vizsgálat pozitív eredményt kap, és akkor is, ha mikobaktériumokat mutatnak ki. kóros anyagból származó kenetekben a mikroszkópos vizsgálat során (7.3 .2. pont).

Arra is figyelni kell, hogy az ujjlenyomat-kenetek elkészítése, rögzítése, megtekintése sok időt vesz igénybe, és nagyon ritkán lehet bennük mikobaktériumot kimutatni, még az elvetett anyagszuszpenzióból származó kenetekben is. Ezért, hogy munkaidőt és pénzt takarítsunk meg olyan állatokból származó anyagok vizsgálatakor, amelyekben a vágás során nem történt változás, célszerű a kenet készítésére és megtekintésére korlátozódni, csak táptalajra vetett anyagszuszpenzióból. Ez nem okoz kárt a tuberkulózis diagnózisában, mert az anyag vizsgálata tovább folytatódik.

A hagyományos fénymikroszkópián kívül fluoreszcens mikroszkópia is használható. A keneteket hasonló módon készítik, rögzítik és fluorokrómok keverékével megfestik. A megfestett keneteket fluoreszcens mikroszkóp alatt nézzük. A módszer érzékenyebb, de kevésbé specifikus, ezért kevésbé elfogadható, különösen a gyakorlati laboratóriumokban.

A mikobaktériumok kulturált izolálása táptalajokon a jelenlegi szakaszban a tuberkulózis laboratóriumi diagnózisának egyik fontos láncszeme. Azonban a táptalaj, amelyre az anyagot vetettük (5-10 kémcsőhöz az utasításoknak megfelelően), az első 2-3 hétben általában részleges vagy teljes csírázással rendelkezik, a vetéskor a sterilitás megsértése miatt. anyag. A növényeket pontosan akkor dobják ki, amikor a legvalószínűbb az atipikus mikobaktériumok kezdeti növekedése (nem beszélve a tuberkulózis kórokozójának kezdeti növekedéséről, amely még később is növekedést mutat). Ilyen esetekben a mikobaktériumok táptalajokon történő izolálásának kultúrmódszerét mechanikusan kiküszöbölik. Ez az egyik fő oka annak, hogy az anyag bakteriológiai vizsgálata során negatív eredményeket kapunk. Ennek eredményeként, miután az anyag beoltása után nem kapták meg a mikobaktérium telepek növekedését tápközegen, és a laboratóriumi állatok 3 hónapig életben maradtak, a laboratóriumok standard válasza a következő: „A tuberkulózis kórokozóját nem izolálták” vagy „ Az anyag tuberkulózisra vonatkozó vizsgálata negatív.” A vizsgálatok eredményei alapján a szarvasmarhák tuberkulinra adott reakciójának oka nem állapítható meg, és ez a szarvasmarha-tuberkulózistól mentes telepeken jelentős számú tuberkulinre reagáló állat további indokolatlan levágásához vezet, ami nagy gazdasági károkat okoz. , megzavarja az állomány forgalmát és szaporodását.

A fentiek figyelembevételével kiemelt figyelmet kell fordítani a mikobaktériumok táptalajról történő izolálásának kulturált módszerére, amely a regionális állatorvosi laboratóriumokban a tuberkulózis bakteriológiai diagnózisának leggyengébb láncszeme.

A mikobaktériumok izolálására szolgáló tenyésztési módszer pozitív eredményei főként két körülménytől függenek: a mikobaktériumok anyagból történő kioltásának megbízhatóságának növelésétől és a sterilitási feltételek megőrzésétől a dobozban végzett munka során.

A kutatásra vett anyagból a mikobaktériumok beoltásának megbízhatóságának növelése mindenekelőtt annak minőségi kiválasztásától, a vetés előtti kezeléstől és az oltást szolgáló táptalaj kémcsövek számának növelésétől függ.

Az alapfeltételek, amelyek betartása táptalajra vetve garantálja a mikobakteriális telepek növekedését:

a) az elejtett állatokból, amelyek a vágás során nem változtak, a bakteriológiai kutatáshoz anyagot minden egyes tetemtől elkülönítve kell kiválasztani, és minden egyes mintát (az egyes állatokból származó anyagot) 10-20 táptalaj kémcsőbe oltani az alábbi séma szerint:

A fej nyirokcsomói (submandibularis, retropharyngealis);

Bronchialis és mediastinalis nyirokcsomók;

Mesenterialis (mesenterialis) nyirokcsomók;

Egyéb nyirokcsomók (ha vannak gyanús területek);

Szervek (szükség esetén is).

Az eredmény egy állatból származó anyag beoltása 30-50 cső táptalajba. Ez 3-5-szörösére növeli a mikobaktériumok vetésének megbízhatóságát, mivel a minta elválasztása nélkül (az utasításoknak megfelelően) egy gazdaság két fejéből csak 5-10 cső táptalajra ajánlott beültetni az anyagot.

b) Közvetlenül az anyag bakteriológiai oltása során vágja ki a nyirokcsomó vagy szerv zavart morfológiai szerkezetű (hiperplázia, tömörödés, tűpontos és csíkos vérzések stb.) darabjait. Ezenkívül minden megváltozott területet ki kell vágni. Ha egy habarcsban sok anyag van, akkor két részre osztható.

c) Szigorúan kövesse a munkához elfogadott módszertant, az anyag feldolgozási és vetési módjának megsértése nélkül.

d) Az anyagok, különösen a nyirokcsomók homogenizálásánál steril homokot vagy finomra törött steril üveget kell használni. A lehető legjobban őrölje meg az anyagot (krémes állagúra), hogy a mikobaktériumokat jobban kivonja a vizsgált anyagból

e) Adjunk a homogenizált anyaghoz mozsárban annyi sóoldatot, amennyi az anyag szuszpenziójának tápközegre vetéséhez és a biológiai vizsgálathoz szükséges (egy kémcsőben átlagosan 0,5 cm3, egy guinea szubkután fertőzése esetén 1-2 cm3). malac). Ez a sóoldat mennyisége előre kiszámítható.

f) Tekintse meg az anyag termését 3, 5, 7, 10, 15 nap után, majd hetente egyszer.

g) A táptalajon tenyésztett (tipikus vagy atipikus, pigmentált vagy nem pigmentált, nyálkás vagy száraz, stb.) mikroorganizmus telepeket mikroszkóppal át kell vetni szelektív Ziehl-Neelsen festéssel.

Figyelmet kell fordítani az anyag savtól (vagy lúgtól) való mosásának mértékére, amelyet az anyag idegen mikroflórával való szennyeződéstől való kezelésére használnak. Maradék savmennyiség mindig jelen lesz a vetendő anyag szuszpenziójában, de ennek minimálisnak kell lennie. Ennek mutatója a táptalaj eredeti színének visszaállítása az anyag elvetése utáni 2-4. napon. Ha a táptalaj színe nem áll helyre, ez a maradék sav megnövekedett mennyiségét jelzi. A közeg színe változó intenzitású kékes árnyalatot kap. A (feltételezett) mikobaktériumok szaporodása ebben az esetben lelassul, vagy egyáltalán nem fog létezni, különösen a tuberkulózis kórokozója, mivel ez nagyobb igénybevételt jelent a tenyésztési rendszerrel szemben. A visszamaradó savmennyiség bizonyos mértékig bakteriosztatikusan hat a mikobaktériumokra.

A csövek lezárásához az anyag beoltása után pamut- és pamut-gézdugókat használhat, majd meg kell tölteni paraffinnal, gumival és gumival vágott ferde horonnyal, parafa- és fémdugók (záróelemek).

Egy izolált mikobaktérium tenyészet fajidentitásának meghatározásakor számos (kb. 300) különböző vizsgálat ismert: kulturális-morfológiai, biológiai, biokémiai, szerológiai, gyógyszerrezisztencia meghatározása stb. Az állatorvosi gyakorlatban azonban ezek közül minimálisat használnak (lásd a kézikönyvet). Laboratóriumok számára elegendő meghatározni a következő típusú mikobaktériumok izolált tenyészetét: szarvasmarha, ember és madár, amelyet biológiai vizsgálattal határoznak meg, valamint atípusos mikobaktériumok - Runyon (1959) szerint csoportokra osztva: I - fotokromogén (képző pigment fény hatására), II - scotochromogen (pigmentet képez, függetlenül a fény hatásától - mind sötétben, mind világosban), III - nem kromogén (nem képződik pigment) vagy pigmentmentesnek is nevezik (a kórokozó a madártuberkulózis kórokozója is ide tartozik), IV - gyorsan növekvő mikobaktériumok és saválló szaprofiták.

Ebből a célból meglehetősen hatékony és gazdaságilag indokolt az izolált tenyészet tulajdonságainak vizsgálata egy rövidített séma szerint, amelyben a fő figyelmet a telepek elsődleges növekedésének, a pigmentképződésnek, a kulturális-morfológiai megjelenésének időpontjára fordítják. és színezési tulajdonságok Ziehl-Neelsen szerint festve. Különösen fontos a köldökzsinór kialakulásának vizsgálata egy primer vagy akár szubkultúrában a biológiai teszt eredményeivel kombinálva. Felnőtt telepekről kenet készítéséhez célszerű egyidejűleg készíteni mind a telepekből, mind a szuszpenzió- és kondenzátummaradványokból, pl. a kémcső alján lévő folyékony részből.

Emellett a laboratóriumi dolgozóknak lehetőségük van nem csak a tuberkulinra reagáló állatok ellenőrző levágására és kutatási anyagminta vételére, hanem arra is, hogy az állatokat életben (hörgő- vagy orrnyálka, tej, ürülék, vizelet, váladék, vér stb.) stb.), valamint takarmány-, víz- és környezeti tárgyak mintái a mikobaktériumok izolálására, és így közvetve bizonyítják az állatállomány tuberkulinra adott reakciójának okát. További anyagok és környezeti tárgyakból származó minták beoltásakor a mikobaktériumok koncentrálásának jól ismert módszereit alkalmazzák: ülepítés, flotáció, flotáció-ülepítés és mások.

Rövidített séma a mikobaktériumok differenciálására bioassay segítségével

A mikrobiológiai diagnosztika fő módszere és a mikrobiológia „arany standardja” a bakteriológiai módszer.

A bakteriológiai módszer célja a kórokozó tiszta tenyészetének izolálása a vizsgált anyagból, a tiszta tenyészet felhalmozása és a tenyészet azonosítása a következő tulajdonságok alapján: morfológiai, színezési, kulturális, biokémiai, antigén, patogenitási tényezők jelenléte, toxicitása és érzékenységének meghatározása antimikrobiális gyógyszerekre és bakteriofágokra.

A bakteriológiai kutatási módszer a következőket tartalmazza:

1. a vizsgálati anyag beoltása táptalajba

2. a tiszta kultúra izolálása

3. mikroorganizmusok azonosítása (fajok meghatározása).

Az aerob és anaerob baktériumok tiszta kultúráinak izolálása és azonosítása a következő tanulmányokat foglalja magában:

I. szakasz (natív anyagokkal való munka)

Cél: izolált telepek beszerzése

1. Az előzetes mikroszkópos vizsgálat hozzávetőleges képet ad a mikroflóráról

2. Kutatási anyag elkészítése

3. Vetés szilárd táptalajra, hogy izolált telepeket kapjunk

4. Inkubálás optimális hőmérsékleten, leggyakrabban 37°C-on, 18-24 óráig

szakasz II

Cél: tiszta kultúra megszerzése

1. Kolóniák makroszkópos vizsgálata áteresztett és visszavert fényben (a telepek méretének, alakjának, színének, átlátszóságának, konzisztenciájának, szerkezetének, kontúrjának, felületének jellemzői).

2. Izolált telepek mikroszkópos vizsgálata

3. Aerotolerancia vizsgálata (a vizsgált anyagban a szigorú anaerobok jelenlétének megerősítésére).

4. Egy adott fajra jellemző telepek vetése tiszta táptalajra vagy szelektív táptalajra és optimális körülmények között történő inkubálása.

szakasz III

Cél: izolált tiszta kultúra azonosítása

1. A kiválasztott kultúra biológiai tulajdonságok összessége alapján történő azonosításához a következőket tanulmányozzuk:

· morfológia és színárnyalati tulajdonságok

· kulturális tulajdonságok (táptalajokon való növekedés karaktere)

· biokémiai tulajdonságok (mikroorganizmusok enzimaktivitása)

Szerológiai tulajdonságok (antigén)

· virulens tulajdonságok (patogenitási faktorok termelésének képessége: toxinok, enzimek, védekezési és agressziós faktorok)

patogenitás állatokra

· fagolizabilitás (érzékenység a diagnosztikai bakteriofágokra)

antibiotikumokra való érzékenység

· egyéb egyedi ingatlanok

IV. szakasz (Következtetés)

A vizsgált tulajdonságok alapján következtetést vonunk le a kiválasztott kultúráról.

A kutatás első szakasza. A kóros anyag vizsgálata mikroszkóppal kezdődik. A megfestett natív anyag mikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vizsgált objektum mikrobiális tájképének megközelítőleg összetételének és a mikroorganizmusok egyes morfológiai jellemzőinek megállapítását. A natív anyag mikroszkópos vizsgálati eredményei nagymértékben meghatározzák a további kutatások menetét, ezeket ezt követően összevetjük a táptalajra oltással kapott adatokkal.

Ha elegendő kórokozó mikroorganizmus-tartalom van a mintában, a beoltást szilárd táptalajra kell végezni (izolált telepek létrehozása érdekében). Ha kevés baktérium van a vizsgált anyagban, akkor az oltást folyékony dúsító táptalajokon végezzük. A tápközeget a mikroorganizmusok igényei szerint választják ki.

A mikroorganizmusok tenyésztése csak akkor lehetséges, ha optimális feltételeket teremtenek életükhöz, és betartják azokat a szabályokat, amelyek kizárják a vizsgált anyag szennyeződését (véletlen szennyeződés idegen mikrobákkal). Kémcsőben, lombikban vagy Petri-csészében olyan mesterséges körülményeket lehet létrehozni, amelyek megakadályozzák a tenyészet más fajokkal való szennyeződését. Minden üvegedénynek és tápközegnek sterilnek kell lennie, és a mikrobiális anyag beoltása után védve kell lennie a külső szennyeződéstől, ami dugókkal vagy fémkupakokkal és fedőkkel történik. A vizsgálati anyaggal végzett manipulációkat alkohollámpa lángzónájában kell elvégezni az anyag külső környezetből történő szennyeződésének megelőzése, valamint a biztonsági előírások betartása érdekében.

Az anyag táptalajra történő beoltását legkésőbb a begyűjtéstől számított 2 órán belül meg kell tenni.

A kutatás második szakasza. Kolóniák vizsgálata és tiszta kultúrák izolálása. Egy napos inkubáció után telepek nőnek az edényeken, és az első löketnél a növekedés folyamatos, a következő ütéseknél pedig izolált telepek. A kolónia egy sejtből származó, azonos fajba tartozó mikrobák gyűjteménye. Mivel az anyag legtöbbször mikrobák keveréke, többféle kolónia nő. A különböző telepeket ceruzával megjelöljük, alulról körben körvonalazva, és tanulmányozzuk őket (11. táblázat). Mindenekelőtt a kolóniákat szabad szemmel vizsgálják: makroszkópos jelek. A csészét áteresztő fényben alulról nézzük (nyitás nélkül), a telepek átlátszóságát feljegyezzük (átlátszó, ha nem takarja el a fényt; áttetsző, ha részben elzárja a fényt; átlátszatlan, ha a fény nem halad át a fényen telep), és megmérjük a telepek méretét (mm-ben). Ezután a fedél oldaláról tanulmányozzák a telepeket, megjegyzik a formát (szabályos kerek, szabálytalan, lapos, domború), a felület jellegét (sima, fényes, fénytelen, érdes, ráncos, nedves, száraz, nyálkás), színét. (színtelen, színes).

11. táblázat. A kolóniák vizsgálatának sémája

№	Jel	A telepek lehetséges jellemzői
1.	Forma	Lapos, domború, kupolás, nyomott, kerek, rozetta, csillag
2.	Méret, mm	Nagy (4-5 mm), közepes (2-4 mm), kicsi (1-2 mm), törpe (< 1 мм)
3.	Felületi karakter	Sima (S-alakú), érdes (R-alakú),nyálkás (M-alakú), csíkos, csomós, matt, fényes
4.	Szín	Színtelen, színes
5.	Átláthatóság	Átlátszó, átlátszatlan, áttetsző
6.	Az élek karaktere	Sima, szaggatott, rojtos, rostos, csipkés
7.	Belső szerkezet	Homogén, szemcsés, heterogén
8.	Következetesség	Viszkózus, nyálkás, omlós
9.	Emulgeálás egy csepp vízben	Jó Rossz

Megjegyzés: az 5-7. pontokat alacsony mikroszkópos nagyítással vizsgáljuk.

A kolóniák közötti különbségek még jobban láthatók, ha nagyítással nézzük őket. Ehhez helyezzen egy zárt csészét aljával felfelé a színpadra, enyhén engedje le a kondenzátort, használja a lencsét enyhe nagyítással (x8), mozgassa a csészét, tanulmányozza a telepek mikroszkopikus jellemzőit: a perem jellegét ( sima, hullámos, szaggatott, csipkés), szerkezete (homogén, szemcsés, rostos, homogén, vagy középen és perifériáján eltérő).

Ezután a kolóniákból származó mikrobiális sejtek morfológiáját tanulmányozzuk. Ehhez a megjelölt telepek egy részéből kenetet készítenek, és Grammal megfestik. Kolóniák felvételénél ügyeljünk az állagra (száraz, ha a telep morzsolódik és nehezen felvehető; puha, ha hurokkal könnyen szedhető; nyálkás, ha hurokkal húzza a telepet; kemény, ha a telep része a telepet nem hurokkal veszik, csak a teljes telepet távolíthatja el) .

A kenetek megtekintésekor megállapítható, hogy a telepet egyfajta mikroba képviseli, ezért tiszta baktériumkultúrák izolálhatók. Ehhez a vizsgált telepeket ferde agarra ültetjük újra. Kolóniákból történő újravetéskor ügyelni kell arra, hogy pontosan a tervezett telepeket vegyük ki, anélkül, hogy a hurokkal a közeli telepeket érintsük. A csöveket felcímkézzük, és termosztátban 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk.

A kutatás harmadik szakasza. Az izolált kultúra azonosítása. Mikrobák azonosítása - egy anyagból izolált tenyészet szisztematikus helyzetének meghatározása fajra és változatra. A megbízható azonosítás első feltétele a tenyészet feltétlen tisztasága. A mikrobák azonosítására a következő jellemzőket használjuk: morfológiai (alak, méret, flagellák, kapszulák, spórák jelenléte, relatív helyzet a kenetben), tinctoriális (Gram-festéssel vagy más módszerekkel kapcsolatos), kémiai (guanin + citozin aránya) ban ben DNS-molekula), kulturális (táplálkozási szükségletek, termesztési körülmények, növekedés sebessége és jellege különböző táptalajokon), enzimatikus (különböző anyagok hasítása közbenső és végtermékek képződésével), szerológiai (antigén szerkezet, specifitás), biológiai (virulencia) állatokra, toxicitás, allergenitás, antibiotikumok hatása stb.).

A biokémiai differenciálódáshoz a baktériumok szénhidrát fermentációs képessége közbenső és végtermékek, a fehérjék és peptonok lebontásának képessége, valamint a redox enzimek tanulmányozása.

A szacharolitikus enzimek tanulmányozása érdekében az izolált tenyészeteket kémcsövekbe oltják be félig folyékony tápközeggel, amely laktózt, glükózt és más szénhidrátokat és többértékű alkoholokat tartalmaz. A félig folyékony táptalajok esetében az oltást a táptalaj mélyére történő injektálással végezzük. Injekciós vetésnél a kémcsövet a tápközeggel ferdén tartják, a dugót eltávolítják, a kémcső szélét megégetik. Steril hurokkal felvesszük az anyagot, és szinte az aljáig átszúrjuk vele a táptalaj oszlopot.

A proteolitikus enzimek meghatározásához az izolált tenyészetet peptonvízzel vagy MPB-vel oltjuk be. Ehhez vegyük a kezünkbe a kémcsövet az oltással közelebb magunkhoz, a kémcsövet a táptalajjal távolabb magunktól. Mindkét kémcsövet egyszerre nyitjuk ki, a kisujjával és a tenyér szélével megragadva a dugójukat, a kémcsövek széleit megégetjük, kalcinált hűtött hurokkal megragadunk egy kis tenyészetet és áttesszük a második kémcsőbe, folyékony közegben őröljük a kémcső falán és mossuk le a közeggel.

A vetésnél és az újravetésnél ügyelni kell a sterilitás szabályainak betartására, nehogy idegen mikroflórával szennyezzék be a terményeiket, és ne szennyezzék a környezetet. A csöveket felcímkézzük, és termosztátba helyezzük, hogy 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk.

Következtetés

Eredmények elszámolása. A tanulmány következtetése. Az azonosítási eredményeket figyelembe veszik, és a kapott adatok összessége alapján, a kézikönyvben (Burgee's key, 1994-1996) leírt tipikus törzsek osztályozása és jellemzői alapján meghatározzák az izolált növények típusát.

3. A mikroszkópos készítmények fajtái. A rögzített kenet elkészítésének szakaszai. Egyszerű festési módszerek.

4. Differenciáldiagnosztikai módszerek mikrobák festésére. Gram-festés, mechanizmus és festési technika.

5. A baktériumok morfológiája. A prokarióták és az eukarióták közötti különbségek. A baktériumok alapvető formái.

6. Bakteriális sejt felszíni képződményeinek felépítése és funkciói. Kapszula. Észlelési módszerek.

7. Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok sejtfalának felépítése és funkciói. A baktériumok sejtfalhibás formái.

8. Baktériumok cytoppasmatikus szerkezete, funkciói, kimutatási módszerek. Saválló mikrobák. Színezési módszer.

9. A mikrobák pihenő formái. Sporuláció baktériumokban, stádiumok, spórák azonosításának módszerei.

10. Baktériumok mozgékonysága, mobilitás kimutatásának módszerei.

11. A mikrobiális taxonómia elvei. A mikrobák szisztematikus helyzete. Taxonómiai kategóriák. A típus fogalma és kritériumai.

12-16. A spirocheták, aktinomikéták, mikoplazmák, rickettsia, chlamydia szisztematikus elhelyezkedése és morfológiája. Tanulmányi módszerek.

18. A baktériumok légzőkészüléke. A biológiai oxidáció útjai. A mikrobák osztályozása e kritérium szerint

19 Mikrobaszaporítási módszerek. A sejtosztódás mechanizmusa és fázisai.

20. A bakteriológiai kutatási módszer jellemzői

21. Tápláló táptalajok aerobok és anaerobok számára. A táptalajokra vonatkozó követelmények, osztályozás.

22. Módszerek aerobok tiszta kultúráinak izolálására.

23. Módszerek anaerobok tiszta kultúráinak izolálására.

24. Mikroorganizmusok azonosítása morfológiai, kultúrszerológiai, biológiai, genetikai.

26. Baktériumok genetikai apparátusa (kromoszómák, plazmidok) A bakteriális transzpozonok jellemzői. A plazmidok biológiai szerepe.

27. A baktériumok variabilitásának típusai. Fenotípusos és genotípusos variabilitás. A népesség változékonyságának fogalma.

28. Mutációs változékonyság. Genetikai rekombinációk. A mikroorganizmusok változékonyságának gyakorlati jelentősége. A géntechnológia és biotechnológia fogalma.

29. Molekuláris diagnosztika. Cél. Feladatok. Mód.

30. Molekuláris hibridizáció. Polimeráz láncreakció.

31. A fertőzés tana. Fertőző folyamat előfordulásának feltételei. A fertőző betegségek megkülönböztető jelei. A fertőzések típusai.

32. Mikroorganizmusok szerepe a fertőzési folyamatban. Patogenitás és virulencia Patogenitási tényezők.

33. A makroorganizmus, a fizikai és társadalmi környezet szerepe a fertőzési folyamatban.

34. A probléma kutatásának biológiai módszere, értékelési szakaszai.

35. Kemoterápia és kemoprofilaxis. Az antibiotikumok meghatározásának osztályozása.

36. Az antibiotikumok hatásmechanizmusa.

37. Az antibiotikumok mellékhatásai.

38. Mikroorganizmusok rezisztenciája antibiotikumokkal szemben.

39 Módszerek a mikrobák antibiotikumokkal szembeni érzékenységének vizsgálatára.

40. Mikroorganizmusok ökológiája. A környezeti kapcsolatok típusai.

41. A normál emberi mikroflóra jellemzői és biológiai szerepe. Tanulmányi módszerek. Gnotobiológia. Diszbakteriózis. A fejlődés okai, a korrekció elvei.

42 Sterilizálás, fertőtlenítés. Fogalmak meghatározása, megvalósítási módok.

43. Aszepszis, antiszeptikumok. Fogalmak meghatározása. Végrehajtási módszerek.

20. A bakteriológiai kutatási módszer jellemzői

A kulturális (bakteriológiai) kutatási módszer olyan módszerek összessége, amelyek célja a mikroorganizmusok (baktériumok) tiszta tenyészeteinek izolálása és azonosítása táptalajon történő tenyésztés segítségével.

A tiszta kultúra ugyanazon fajhoz tartozó mikroorganizmusok gyűjteménye. Leggyakrabban egy izolált telep (egyetlen mikrobasejt utóda) kiválasztásával és tenyésztésével nyernek tiszta tenyészetet.

A módszer szakaszai:

1. Anyaggyűjtés a kutatáshoz.

2. A tiszta kultúra izolálása és azonosítása.

3. Következtetés.

Anyaggyűjtés kutatáshoz. A vizsgált anyag típusa a vizsgálat céljától függ (diagnózis - a betegtől; epidemiológiai elemzés - a külső környezet, az élelmiszer, a beteg és (vagy) baktériumhordozó alapján.

A tiszta kultúra elszigeteltsége. 3 vagy 4 szakaszt tartalmaz:

1. Az anyag beoltása (előzetes mikroszkópos vizsgálat után) szilárd tápközeggel (lehetőleg differenciáldiagnosztikai vagy szelektív) egy edényen, hogy izolált telepeket kapjunk. Leggyakrabban mechanikai leválasztással állítják elő. Egyes esetekben (például vér) az anyagot előzetesen folyékony dúsító táptalajba oltják, majd agar táptalajt tartalmazó lemezre viszik át. Néha a vetés előtt az anyag szelektív kezelését végzik (figyelembe véve az izolált mikroorganizmus tulajdonságait; például savval vagy lúggal történő kezelés a rezisztens baktériumok izolálására). 37°C-os hőmérsékleten tenyésztjük 18-24 órán keresztül. A tenyésztési idők eltérőek lehetnek a különböző baktériumtípusok esetében.

2(3):a) telepek vizsgálata agarlemezen (tenyésztési jellemzők), a legjellemzőbbek kiválasztása; b) kenet készítése ezekről a telepekről festéssel (Gram vagy más módszerekkel); a) a vizsgált telep fennmaradó részét akkumulációs táptalajra szűrjük, és termosztátban az optimális hőmérsékleten neveljük.

3. (4) bekezdése alapján. Az akkumulációs táptalajon nyert tenyészet tisztaságának vizsgálata. Ezzel

kenetet készítenek, megfestik (általában Gram-festéssel), és mikroszkóposan megvizsgálják

morfológiai és színárnyalati homogenitás (különböző látószögekben).

4. (5) bekezdése alapján. A tiszta kultúra azonosítása.

Következtetés. A jellemzők halmaza alapján a referencia (típusú) törzsek tulajdonságaival összehasonlítva az anyagból izolált mikroorganizmus típusát jelzik.

A módszer értékelése:

előnyei: viszonylag nagy érzékenység és pontosság, a vizsgált anyagban lévő mikrobák számának meghatározására való képesség, valamint az antibiotikumokkal szembeni érzékenység; hibák: relatív időtartam, a módszer drága.

21. Tápláló táptalajok aerobok és anaerobok számára. A táptalajokra vonatkozó követelmények, osztályozás.

Követelmények:

tápanyagnak táplálónak kell lennie

bizonyos pH-értékkel kell rendelkeznie

izotóniásnak kell lennie, pl. A környezetben az ozmotikus nyomásnak meg kell egyeznie a sejtben lévővel.

nedvesnek és nem túl folyósnak kell lennie

rendelkeznie kell bizonyos redox potenciállal

sterilnek kell lennie

egységesnek kell lennie, i.e. állandó mennyiségben tartalmazzák az egyes összetevőket.

A tápközeg felosztható:

A) Származása szerint:

1) természetes - természetes élelmiszerek (hús, tej, burgonya);

2) mesterséges - kifejezetten mikrobák tenyésztésére készült: - természetes termékekből készült táptalajok (húsvíz, húsleves (MPB), húskivonat-agar (MPA), - nem állandó összetételű; - szintetikus tápközeg - szigorúan összeállított oldatok meghatározott mennyiségű sók, aminosavak, nitrogéntartalmú bázisok, vitaminok desztillált vízben - állandó összetételűek, mikroorganizmusok és sejtkultúrák tenyésztésére használják vakcinák, immunszérumok és antibiotikumok előállításához;

B) Cél szerint:

1) általános célú (MPB, MPA) - a legtöbb mikroba nő rajtuk;

2) szelektív - szelektíven elősegítik egyfajta mikroba növekedését keverékből (például sárgája-só agar staphylococcusokhoz);

3) differenciáldiagnosztika - lehetővé teszik, hogy egyfajta mikrobát megkülönböztessünk a többitől a táptalaj megjelenése alapján (például Endo, Levin környezete a mikrobák bélrendszeri csoportjához).

Ráadásul attól függően felhasználási célokra A tiszta kultúrák izolálásának sémájában a következő táptalajokat lehet megkülönböztetni a cél szerint:

1) dúsítás - elnyomja a kórokozót kísérő mikrobák növekedését;

2) izolált telepek előállítása;

3) a tiszta kultúra felhalmozódása;

B) Következetesség szerint:

1) folyékony;

2) félig folyékony (agar-agar hozzáadásával 0,5-0,7% koncentrációban);

3) sűrű - 1% felett.

A mikrobiológiai diagnosztika fő módszere és a mikrobiológia „arany standardja” a bakteriológiai módszer.

A bakteriológiai módszer célja a kórokozó tiszta tenyészetének izolálása a vizsgált anyagból, a tiszta tenyészet felhalmozása és a tenyészet azonosítása a következő tulajdonságok alapján: morfológiai, színezési, kulturális, biokémiai, antigén, patogenitási tényezők jelenléte, toxicitása és érzékenységének meghatározása antimikrobiális gyógyszerekre és bakteriofágokra.

A bakteriológiai kutatási módszer a következőket tartalmazza:

1. a vizsgálati anyag beoltása táptalajba

2. a tiszta kultúra izolálása

3. mikroorganizmusok azonosítása (fajok meghatározása).

Az aerob és anaerob baktériumok tiszta kultúráinak izolálása és azonosítása a következő tanulmányokat foglalja magában:

I. szakasz (natív anyagokkal való munka)

Cél: izolált telepek beszerzése

1. Az előzetes mikroszkópos vizsgálat hozzávetőleges képet ad a mikroflóráról

2. Kutatási anyag előkészítése (hígítás izotóniás NaCl oldattal stb.)

3. Vetés szilárd táptalajra, hogy izolált telepeket kapjunk

4. Inkubálás optimális hőmérsékleten, leggyakrabban 37°C-on, 18-24 óráig

szakasz II

Cél: tiszta kultúra megszerzése

1. Makroszkópos vizsgálat kolóniákáteresztett és visszavert fényben (a telepek méretének, alakjának, színének, átlátszóságának, konzisztenciájának, szerkezetének, kontúrjának, felületének jellemzői).

2. Izolált telepek mikroszkópos vizsgálata

3. Aerotolerancia vizsgálata (a vizsgált anyagban a szigorú anaerobok jelenlétének megerősítésére).

4. Egy adott fajra jellemző telepek vetése tiszta táptalajra vagy szelektív táptalajra és optimális körülmények között történő inkubálása.

szakasz III

Cél: izolált tiszta kultúra azonosítása

1. A kiválasztott kultúra biológiai tulajdonságok összessége alapján történő azonosításához a következőket tanulmányozzuk:

· morfológia és színárnyalati tulajdonságok

· kulturális tulajdonságok (táptalajokon való növekedés karaktere)

· biokémiai tulajdonságok (mikroorganizmusok enzimaktivitása, glikolitikus, proteolitikus és egyéb aktivitások)

Szerológiai tulajdonságok (antigén)

· virulens tulajdonságok (patogenitási faktorok termelésének képessége: toxinok, enzimek, védekezési és agressziós faktorok)

patogenitás állatokra

· fagolizabilitás (érzékenység a diagnosztikai bakteriofágokra)

antibiotikumokra való érzékenység

· egyéb egyedi ingatlanok

IV. szakasz (Következtetés)

A vizsgált tulajdonságok alapján következtetést vonunk le a kiválasztott kultúráról.

A kutatás első szakasza. A kóros anyag vizsgálata mikroszkóppal kezdődik. A megfestett natív anyag mikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vizsgált objektum mikrobiális tájképének megközelítőleg összetételének és a mikroorganizmusok egyes morfológiai jellemzőinek megállapítását. A natív anyag mikroszkópos vizsgálati eredményei nagymértékben meghatározzák a további kutatások menetét, ezeket ezt követően összevetjük a táptalajra oltással kapott adatokkal.

Ha elegendő kórokozó mikroorganizmus-tartalom van a mintában, a beoltást szilárd táptalajra kell végezni (izolált telepek létrehozása érdekében). Ha kevés baktérium van a vizsgált anyagban, akkor az oltást folyékony dúsító táptalajokon végezzük. A tápközeget a mikroorganizmusok igényei szerint választják ki.

A mikroorganizmusok tenyésztése csak akkor lehetséges, ha optimális feltételeket teremtenek életükhöz, és betartják azokat a szabályokat, amelyek kizárják a vizsgált anyag szennyeződését (véletlen szennyeződés idegen mikrobákkal). Kémcsőben, lombikban vagy Petri-csészében olyan mesterséges körülményeket lehet létrehozni, amelyek megakadályozzák a tenyészet más fajokkal való szennyeződését. Minden üvegedénynek és tápközegnek sterilnek kell lennie, és a mikrobiális anyag beoltása után védve kell lennie a külső szennyeződéstől, ami dugókkal vagy fémkupakokkal és fedőkkel történik. A vizsgálati anyaggal végzett manipulációkat alkohollámpa lángzónájában kell elvégezni az anyag külső környezetből történő szennyeződésének megelőzése, valamint a biztonsági előírások betartása érdekében.

Az anyag táptalajra történő beoltását legkésőbb a begyűjtéstől számított 2 órán belül meg kell tenni.

A kutatás második szakasza. Kolóniák vizsgálata és tiszta kultúrák izolálása. Egy napos inkubáció után telepek nőnek az edényeken, és az első löketnél a növekedés folyamatos, a következő ütéseknél pedig izolált telepek. A kolónia egy sejtből származó, azonos fajba tartozó mikrobák gyűjteménye. Mivel az anyag legtöbbször mikrobák keveréke, többféle kolónia nő. Jelölje meg ceruzával a különböző kolóniákat, alulról körvonalazva, és tanulmányozza őket (12. táblázat). Mindenekelőtt a kolóniákat szabad szemmel vizsgálják: makroszkópos jelek. A csészét áteresztő fényben alulról nézzük (nyitás nélkül), a telepek átlátszóságát feljegyezzük (átlátszó, ha nem takarja el a fényt; áttetsző, ha részben elzárja a fényt; átlátszatlan, ha a fény nem halad át a fényen telep), és megmérjük a telepek méretét (mm-ben). Ezután a fedél oldaláról tanulmányozzák a telepeket, megjegyzik a formát (szabályos kerek, szabálytalan, lapos, domború), a felület jellegét (sima, fényes, fénytelen, érdes, ráncos, nedves, száraz, nyálkás), színét. (színtelen, színes).

12. táblázat. A kolóniák vizsgálatának sémája

№	Jel	A telepek lehetséges jellemzői
1.	Forma	Lapos, domború, kupolás, nyomott, kerek, rozetta, csillag
2.	Méret, mm	Nagy (4-5 mm), közepes (2-4 mm), kicsi (1-2 mm), törpe (< 1 мм)
3.	Felületi karakter	Sima (S-alakú), érdes (R-alakú),nyálkás (M-alakú), csíkos, csomós, matt, fényes
4.	Szín	Színtelen, színes... színes
5.	Átláthatóság	Átlátszó, átlátszatlan, áttetsző
6.	Az élek karaktere	Sima, szaggatott, rojtos, rostos, csipkés
7.	Belső szerkezet	Homogén, szemcsés, heterogén
8.	Következetesség	Viszkózus, nyálkás, omlós
9.	Emulgeálás egy csepp vízben	Jó Rossz

Megjegyzés: az 5-7. pontokat mikroszkóp kis nagyításán vagy nagyító alatt vizsgáljuk.

A kolóniák közötti különbségek még jobban láthatók, ha nagyítással nézzük őket. Ehhez helyezzen egy zárt csészét aljával felfelé a színpadra, enyhén engedje le a kondenzátort, használja a lencsét enyhe nagyítással (x8), mozgassa a csészét, tanulmányozza a telepek mikroszkopikus jellemzőit: a perem jellegét ( sima, hullámos, szaggatott, csipkés), szerkezete (homogén, szemcsés, rostos, homogén, vagy középen és perifériáján eltérő).

Ezután a kolóniákból származó mikrobiális sejtek morfológiáját tanulmányozzuk. Ehhez a megjelölt telepek egy részéből kenetet készítenek, és Grammal megfestik. Kolóniák felvételénél ügyeljünk az állagra (száraz, ha a telep morzsolódik és nehezen felvehető; puha, ha hurokkal könnyen szedhető; nyálkás, ha hurokkal húzza a telepet; kemény, ha a telep része a telepet nem hurokkal veszik, csak a teljes telepet távolíthatja el) .

A kenetek megtekintésekor megállapítható, hogy a telepet egyfajta mikroba képviseli, ezért tiszta baktériumkultúrák izolálhatók. Ehhez a vizsgált telepeket ferde agarra ültetjük újra. Kolóniákból történő újravetéskor ügyelni kell arra, hogy pontosan a tervezett telepeket vegyük ki, anélkül, hogy a hurokkal a közeli telepeket érintsük. A csöveket felcímkézzük, és termosztátban 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk.

A kutatás harmadik szakasza. Az izolált kultúra azonosítása. Mikrobák azonosítása - egy anyagból izolált tenyészet szisztematikus helyzetének meghatározása fajra és változatra. A megbízható azonosítás első feltétele a tenyészet feltétlen tisztasága. A mikrobák azonosítására a következő jellemzőket használjuk: morfológiai (alak, méret, flagellák, kapszulák, spórák jelenléte, relatív helyzet a kenetben), tinctoriális (Gram-festéssel vagy más módszerekkel kapcsolatos), kémiai (guanin + citozin aránya) DNS-molekulában), kulturális (táplálkozási szükségletek, termesztési körülmények, a növekedés sebessége és jellege különböző táptalajokon), enzimatikus (különféle anyagok lebontása közbenső és végtermékek képződésével), szerológiai (antigén szerkezet, specificitás), biológiai (virulencia állatokra, toxicitás, allergenitás, antibiotikumok hatása stb.).

A biokémiai differenciálódás érdekében vizsgálják a baktériumok szénhidrát fermentációs képességét köztes végtermékek képződésével, fehérjék és peptonok lebontásának képességét, valamint a redox enzimeket.

Szacharolitikus enzimek tanulmányozására az izolált tenyészeteket kémcsövekbe oltják be félfolyékony tápközeggel, amely laktózt, glükózt és más szénhidrátokat és többértékű alkoholokat tartalmaz. A félig folyékony táptalajok esetében az oltást a táptalaj mélyére történő injektálással végezzük. Injekciós vetésnél a kémcsövet a tápközeggel ferdén tartják, a dugót eltávolítják, a kémcső szélét megégetik. Steril hurokkal felvesszük az anyagot, és szinte az aljáig átszúrjuk vele a táptalaj oszlopot.

Proteolitikus enzimek meghatározására az izolált tenyészetet peptonvízre vagy MPB-re vetjük. Ehhez vegyük a kezünkbe a kémcsövet az oltással közelebb magunkhoz, a kémcsövet a táptalajjal távolabb magunktól. Mindkét kémcsövet egyszerre nyitjuk ki, a kisujjával és a tenyér szélével megragadva a dugójukat, a kémcsövek széleit megégetjük, kalcinált hűtött hurokkal megragadunk egy kis tenyészetet és áttesszük a második kémcsőbe, folyékony közegben őröljük a kémcső falán és mossuk le a közeggel.

A vetésnél és az újravetésnél ügyelni kell a sterilitás szabályainak betartására, nehogy idegen mikroflórával szennyezzék be a terményeiket, és ne szennyezzék a környezetet. A csöveket felcímkézzük, és termosztátba helyezzük, hogy 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk.

Következtetés

Eredmények elszámolása. A tanulmány következtetése. Az azonosítási eredményeket figyelembe veszik, és a kapott adatok összessége alapján, a kézikönyvben (Burgee's key, 1994-1996) leírt tipikus törzsek osztályozása és jellemzői alapján meghatározzák az izolált növények típusát.