Имунофлуоресцентна реакция, директни и индиректни методи. Приложение. Комплексна диагностика по метода на рифа Какво е риф в медицината

Открита през 1942 г. от Кунс, реакцията на имунофлуоресценция не е нов изследователски метод. Въпреки това, появата на хибридомни технологии, които направиха възможно получаването на моноклонални антитела, даде „втори живот“ на тази реакция, тъй като тяхното използване позволи да се увеличи чувствителността на тази реакция и нейната специфичност няколко пъти.

И днес ще ви разкажем подробно за реакцията на директна и непряка имунофлуоресценция (RIF) като диагностичен метод на Кунс за възрастни мъже и жени по време на бременност.

Какво е имунофлуоресцентна реакция?

Представлявайки отлична възможност за бързо получаване на точна диагноза, имунофлуоресцентната реакция позволява да се определи наличието на причинителя на заболяването в патологичния материал. За целта се използва натривка от материал, който е специално обработен с FITC (флуоресцеин изотиоцианат) белязан и се изследва като хетерогенен анализ.

За да се получи резултатът, се използва флуоресцентен микроскоп, чиято оптична система съдържа набор от светлинни филтри, които осигуряват на лекарството синьо-виолетова или ултравиолетова светлина с определена дължина на вълната. Това условие позволява на флуорохрома да отразява в даден диапазон. Изследователят оценява свойствата на сиянието, неговия характер, размера на обектите и тяхното взаимно разположение.

На кого се предписва?

Имунофлуоресцентна реакция може да бъде предписана за диагностициране на много вирусни заболявания. По-специално, по време на цялостен преглед се предписва да се идентифицират следните фактори:

• наличието на вирус в тялото;
• инфекция със салмонела;
• наличието на определени антигени в тялото;
• идентифицира се вероятността от инфекция на тялото с хламидия, микоплазма и други микроорганизми, които имат способността да причиняват вирусни заболявания при хората;
• диагностика на вирусни заболявания при животните.

Изброените показания позволяват използването на реакцията на имунофлуоресценция за откриване на вирусни заболявания от различно естество в човешкото и животинското тяло.

Цели

Тъй като този диагностичен метод има много предимства, които включват неговата висока ефективност, скорост на изпълнение и получаване на резултати, както и липсата на голям брой противопоказания, той се използва за определяне на наличието на вирусни инфекции в организма. Следователно този анализ може да бъде предписан както за установяване, така и за изясняване на диагнозата, въз основа на която се предписва режим на лечение.

Процедурата не причинява дискомфорт, изисква получаване на материал за анализ, който се взема от всяка телесна течност: слюнка, храчки, изстъргвания от повърхността на лигавиците. Може да се вземе и кръв за изследване. Честотата на реакцията на имунофлуоресценция се предписва от лекуващия лекар, който трябва да получи данни за динамиката на процесите, протичащи в тялото.

Тъй като този тест не причинява вреда нито на тялото, нито на общото благосъстояние на човек, той може да бъде предписан при необходимост.

Видове такава процедура

Днес се използват няколко разновидности на този анализ, всеки от които има редица специфични характеристики и ви позволява да получите най-подробната картина на процесите, протичащи в тялото.

Видовете имунофлуоресцентна реакция включват:

1. - един от най-бързо развиващите се видове диагностика, този анализ дава възможност за получаване на количествени данни без използването на серийни разреждания. Използвайки получените измервания на оптичната плътност на течността, е възможно точно да се определи нивото на концентрация на желания компонент. Широките възможности на този вид анализ се използват при използване на моноклонални антитела за неговото прилагане, което позволява да се определи фазата на инфекциозния процес и неговата тежест;
2. ДНК диагностика- този метод се основава на комплементарното свързване на нуклеотиди, за което могат да се използват течности като слюнка, кръв, цереброспинална течност, урина, храчки, проби от биопсия и кръв. Този метод най-ефективно открива наличието на папилома вируси в тялото, но много съвременни тестови системи могат понякога да дават фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати. Те могат да бъдат причинени от замърсяване на течни проби за анализ на специфична ДНК, чието присъствие може да бъде от вложен или тотален характер;
3. имунохроматография— спецификата на този метод за определяне на наличието на патологична среда и вируси в тялото е използването на белязани антитела по време на реакцията. Този диагностичен метод се използва за идентифициране и степента на активност на инфекциозния процес със стрептококи от група А, както и хламидии от следните видове: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia от Oxoid. Притежаващи възможно най-висока чувствителност, тестови системи, които се основават на този метод на изследване. обикновено се използват като показателен тест.

Изброените разновидности имат особености на тяхното прилагане и специфични характеристики на резултатите, но всички те са насочени към получаване на данни за наличието на патологични микроорганизми и вируси в организма, както и за степента на тяхното размножаване и активност.

Показания за употреба

Реакцията на имунофлуоресценция може да бъде предписана за идентифициране на всякакъв вид патологична среда в тялото.

По време на този тип диагностика се определят Chlamydia, Trichomonas, gonococci и, както и Giardia от всички видове. и други заболявания също изискват RIF. За провеждането му е необходима среща с лекар.

Противопоказания за

Тъй като тази реакция изисква всякакъв вид телесна течност като тестов материал, вземането им обикновено не е трудно и няма противопоказания за провеждане на имунофлуоресцентна реакция. Въпреки това, по време на бременност и при деца под 6 месеца, събирането на материал за изследване се извършва с максимални предпазни мерки.

Липсата на противопоказания позволява този вид диагностика да се извършва, когато е предписана от лекар на всички пациенти. Безопасността му се гарантира от използването на дезинфекцирани инструменти и спринцовки за еднократна употреба.

Подготовка за процедурата

Няма особености относно събирането на материал за този анализ. Кръвта за това се взема на празен стомах, така че в нея да няма повишено съдържание на вещества, които могат да променят истинските показания и да дадат фалшива картина.

Как се взема тестът?

Тъй като не се изисква специална подготовка за анализа, само хранене 12 часа преди изследването и липсата на употреба на лекарства е изключено, материалът за изследване се приема като нормален процес на вземане на телесна течност за анализ.

Субективните усещания по време на процедурата могат да варират в зависимост от чувствителността.

Декодиране на резултатите

Използването на съвременни тестови системи ви позволява да получите най-точните резултати от анализа. За дешифриране на резултата се използват следните данни:

• степен на интензитет на флуоресценция;
• флуоресцентен нюанс;
• периферния характер на процеса на луминесценция на обекта;
• характеристики на морфологията, местоположението на патогена в намазка от тестовия материал и неговия размер.

При изследване на големи обекти (например Gardenerella, Trichomonas, клетки, които вече са заразени с вируси), горните критерии позволяват да се получат най-надеждните резултати. Елементарните тела на микоплазмата и хламидиите обаче имат размери, които са на границата на разделителната способност на флуоресцентния микроскоп, което затруднява

Това затруднява получаването на точен резултат, тъй като периферното сияние губи част от своя интензитет. Останалите критерии вече не са достатъчни за точна идентификация на изследваните микроорганизми. Поради тази причина към специалистите, които провеждат този тип изследвания, се поставят специални изисквания: тяхното ниво на квалификация трябва да е достатъчно, за да работят с наличните данни.

Поради тази причина само лекар с подходящо ниво на квалификация може да тълкува получения анализ. Прочетете по-долу за цената на изследването по метода RIF.

средна цена

Цената на имунофлуоресцентна реакция зависи от местоположението и нивото на лечебното заведение, както и от квалификацията на специалиста, извършващ анализа. Днес цената варира от 1280 до 2160 рубли.

Видеото по-долу ще ви разкаже повече за имунологичните реакции:

Понастоящем широко се използват серологични реакции, включващи белязани антигени или антигени. Те включват имунофлуоресцентни реакции, радиоимунни и ензимни имуноанализни методи.

Те се прилагат:

1) за серодиагностика на инфекциозни заболявания, т.е. за откриване на AT с помощта на набор от известни конюгирани (химически комбинирани) антигени с различни етикети (ензими, флуорохромни багрила);

2) за определяне на микроорганизъм или неговия серовар с помощта на стандартни маркирани диагностични антитела (бърза диагностика).

Серумите се приготвят чрез имунизиране на животни с подходящи антигени, след което имуноглобулините се изолират и конюгират със светещи багрила (флуорохроми), ензими и радиоизотопи.

Маркираните СР не отстъпват по специфичност на другите СР, а по своята чувствителност превъзхождат всички СР.

Няма подобни материали

Като етикети се използват светещи флуорохромни багрила (флуоресцеин изотиоцианат и др.).

Има различни модификации на RIF. За експресна диагностика на инфекциозни заболявания Koons RIF се използва за идентифициране на микроби или техните антигени в тестовия материал.

Има два метода на RIF според Кунс: директен и индиректен.

Директни RIF компоненти:

1) изследваният материал (изпражнения, изхвърляни от назофаринкса и др.);

2) белязан специфичен имунен серум, съдържащ AT-la към желания антиген;

3) изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Намазка от тестовия материал се третира с белязан антисерум.

Възниква реакцията AG-AT. По време на луминесцентно микроскопско изследване се открива флуоресценция в областта, където са локализирани комплексите AG-AT.

Компоненти на непряк RIF:

1) изучавания материал;

2) специфичен антисерум;

3) антиглобулинов серум (AT-la срещу имуноглобулин), маркиран с флуорихром;

4) Изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Намазка от тестовия материал първо се третира с имунен серум към желания антиген и след това с маркиран антиглобулинов серум.

Луминесцентни AG-AT комплекси - белязани AT се откриват с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Предимството на индиректния метод е, че не е необходимо да се приготвя широка гама от флуоресцентни специфични серуми, а се използва само един флуоресцентен антиглобулинов серум.

Има и 4-компонентен тип индиректен RIF, когато допълнително се въвежда комплемент (серум от морско свинче). При положителна реакция се образува комплекс от AG-AT - белязан - AT-комплемент.

RIF се основава на комбинацията от антигени на бактерии, рикетсии и вируси със специфични антитела, маркирани с флуоресцентни багрила (флуоресцеин изотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лисатин родамин В-200, сулфохлорид и др.), които имат реактивни групи (сулфохлорид, изотиоцианит и т.н.). Тези групи се комбинират със свободни аминогрупи на молекули на антитела, които не губят своя специфичен афинитет към съответния антиген, когато се третират с флуорохром. Получените AG-AT комплекси стават ясно видими, ярко светещи структури под флуоресцентен микроскоп (фиг. 7). RIF може да открие малки количества бактериални и вирусни антигени. Методът RIF се използва в два варианта: директен и индиректен метод.

Директният метод се основава на директната комбинация от антиген с белязано антитяло. Индиректният метод се основава на поетапно откриване на комплекса AG-AT с помощта на флуоресцентни багрила. Първият етап е образуването на имунни комплекси от специфичен антиген със специфични антитела. Вторият етап е да се идентифицира този комплекс чрез третиране с белязан антигамаглобулин.

Предимството на RIF е простотата, високата чувствителност и скоростта на получаване на резултатите. RIF се използва като метод за ранна експресна диагностика на грип, дизентерия, малария, чума, туларемия, сифилис и др. За провеждане на такова изследване се използва флуоресцентен микроскоп.

Радиоимуноанализ (RIA)

РИА е един от най-чувствителните имунодиагностични методи. Използва се за откриване на антиген на вируса на хепатит В при пациенти с вирусен хепатит. За да направите това, към тестовия серум се добавя референтен серум (серум, съдържащ антитела срещу вируса на хепатит B). Сместа се инкубира в продължение на 1-2 дни при температура 40 °C, след което се добавя референтен антиген (антиген, белязан с изотопа 125 J) и инкубацията продължава още 24 часа. Към получения комплекс антиген-антитяло се добавят преципитиращи антиимуноглобулини срещу референтни серумни протеини, което води до образуването на преципитат (фиг. 8). Резултатът се отчита от наличието и броя на импулсите в утайката, записани от брояча. Ако в тестовия серум има антиген, който се е свързал със специфични антитела, последните не взаимодействат с белязания антиген и следователно не се открива в утайката. По този начин RIA се основава на принципа на конкурентно взаимодействие на определяния антиген и известно количество белязан антиген с активните центрове на антителата.Като етикети се използват радиоактивни изотопи.

В зависимост от техниката на стадиране има два метода на РИА.

1) Техника на “течна фаза” (класически RIA). Недостатъкът на тази постановъчна техника е необходимостта

специално разделяне на свободни и свързани белязани антигени (или антитела).

2) Техника "твърда фаза".

AG или AT с известна специфичност се свързват със сорбенти (твърда фаза) - стените на полистиролова ямка или пластмасова тръба. Останалите IC компоненти се сорбират последователно върху имобилизирания AG (AT).

В зависимост от естеството на реакцията се разграничават следните методи:

1) Състезателен метод - метод, основан на AG състезание.

Компоненти на реакцията:

а) установена хипертония (материал за изследване - кръв, храчка и др.);

б) антиген, идентичен на тестовия Ag, белязан с радиоизотоп;

в) специфични АТ с известна концентрация, свързани със сорбента;

г) стандартна хипертония (контрола);

д) буферен разтвор.

Първо, тестът AG се въвежда в реакцията. Образуването на AG-AT комплекс се случва на повърхността на сорбента. Сорбентът се измива, след което се въвежда маркиран AG.Колкото по-високо е съдържанието на изследвания AG, толкова по-малко белязан AG се свързва с AT-m на повърхността на сорбента. Концентрацията на белязания AG се определя чрез измерване на радиоактивността на реакцията с помощта на броячи. Количеството радиоактивност в реакцията ще бъде обратно пропорционално на количеството AG в тестовата проба.

2) Несъстезателен метод.

Компоненти на реакцията:

а) откриваема хипертония;

б) специфични AT-a с известна концентрация, свързани

върху сорбент;

в) антитела, идентични на свързаното антитяло, маркирани

радиоизотоп;

г) стандарт AG;

д) буферен разтвор.

Тестът AG се добавя към свързаните антитела. По време на инкубационния процес върху сорбента се образуват комплекси AG-AT. Сорбентът се измива от свободните компоненти и се добавят белязани АТ, които се свързват със свободните валенции на АГ в комплекса. Степента на радиоактивност е пропорционална на концентрацията на изследвания антиген.

3) „Метод на сандвич“ (индиректен метод) - най-често срещаният метод.

Компоненти:

а) тест серум (или тест антиген);

b) AG-s, свързани към сорбента (или AT-la, свързани към сорбента при определяне на AG-a);

в) диагностични антитела срещу имуноглобулини, маркирани с радиоизотопи;

d) контролни серуми (или AG);

д) буферни разтвори.

Тестваните ATs (или AGs) реагират с твърдофазни AGs (ATs), след което инкубата се отстранява и в реакцията се въвеждат белязани антиглобулинови Abs, които се свързват със специфични AG-AT комплекси на повърхността на сорбента. Степента на радиоактивност на реакцията е право пропорционална на количеството на тестваното антитяло (или AG).

Предимства на RIA:

1) висока специфичност и чувствителност;

2) простота на постановъчната техника;

3) точност на количествената оценка на резултатите;

4) лесен за автоматизиране.

Недостатък: използване на радиоактивни изотопи.

Няма подобни материали (

Ензимно-свързан имуносорбентен метод (ELISA)

Методът се използва за откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани към ензим-маркер (пероксидаза от хрян, b-галактоза или алкална фосфатаза). След комбиниране на антигена с белязания с ензим имунен серум, към сместа се добавят субстрат и хромоген. Субстратът се разцепва от ензима и неговите продукти на разграждане причиняват химическа модификация на хромогена. В същото време хромогенът променя цвета си - интензитетът на цвета е правопропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло (фиг. 9).

Най-разпространеният е твърдофазният ELISA, при който един от компонентите на имунната реакция (антиген или антитяло) се адсорбира върху твърд носител. Като твърд носител се използват микропанели от полистирен. При определяне на антитела, кръвен серум на пациента, антиглобулинов серум, маркиран с ензим, и смес от ензимни и хромогенни субстратни разтвори се добавят последователно към ямките със сорбиран антиген. Всеки път след добавяне на друг компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. Ако резултатът е положителен, цветът на хромогенния разтвор се променя. Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитяло. След това желаният антиген се добавя към ямките със сорбирани антитела, добавя се имунен серум срещу антигена, маркиран с ензим, и след това се добавя смес от субстратни разтвори за ензима и хромогена.

ELISA се използва за диагностициране на заболявания, причинени от вирусни и бактериални патогени.Ензимите се използват като етикети: пероксидаза, алкална фосфатаза и др.

Индикатор за реакция е способността на ензимите да предизвикват цветни реакции при въздействие върху съответния субстрат. Например, субстратът за пероксидазата е разтвор на ортофенилдиамин.

Най-широко използваният е твърдофазният ELISA. Същността на ELISA е подобна на RIA.

Резултатите от ELISA могат да бъдат оценени визуално и чрез измерване на оптичната плътност на спектрофотометър.

Предимствата на ELISA включват:

Няма контакт с радиоактивни вещества;

Простота на методите за оценка на реакцията;

Стабилност на конюгатите;

Лесно се поддава на автоматизация.

Въпреки това, в сравнение с RIA, се отбелязва по-ниска чувствителност на метода, но в някои случаи чувствителността е по-добра от RIF и RIM.

Като примери са дадени следните видове ELISA:

Състезателен тип.

Предназначение.

Предназначен за откриване на повърхностния антиген на вируса на хепатит B (HB3Ad) в серум и кръвна плазма при диагностицирането на вирусен хепатит B и определяне на носителството на HB5Ad.

Компоненти:

1) материалът за изследване е серум или кръвна плазма;

2) антитела срещу HB3 Ad, адсорбирани върху повърхността на ямката на полистиролова микроплака;

3) конюгат - миши моноклонални антитела към HB3 Ad, белязани с пероксидаза,

4) ортофенилендиамин (OPD) - субстрат;

5) фосфатно буфериран физиологичен разтвор;

6) контролни серуми:

Положителен (серум с HBeAd);

Отрицателен (серум без HB3 Ad). Напредък

1) Добавяне на контролни и тестови серуми.

2) Инкубация 1 час при 37°C.

3) Измиване на дупките.

4) Добавяне на конюгата.

5) Инкубация 1 час при 37°C.

6) Измиване на дупките.

7) Влизане в OFD. В присъствието на HB3 разтворът в ямките става жълт.

Отчитането на ELISA се извършва чрез оптична плътност с помощта на фотометър. Степента на оптичната плътност ще бъде обратно пропорционална на концентрацията на изследваните NVs Ad.

Механизъм

Реакцията протича в три фази:

1) HB3 Ad от тестовия серум (плазма) се свързва с хомоложни Abs, адсорбирани на повърхността на ямката. Образува се ИР АГ-АТ. (NVz Ad - agl\NVz AT).

2) HB3Ad антитела, белязани с пероксидаза, се свързват с останалите свободни детерминанти на HB3Ad комплекса на AG-AT. Образува се комплекс AT-AG-белязан AT (ap!1 HB3 AT-HB3 Ad-ap(1 HB3 AT, белязан с пероксидаза).

3) OPD взаимодействат (с пероксидаза) на комплекса AT-AG-AT и се появява жълто оцветяване.

Индиректен тип

Това е основната тестова реакция за диагностициране на HIV инфекция.

Цел: серологична диагностика на HIV инфекция - откриване на антитела срещу HIV антигени, Компоненти:

1) материал за изследване - кръвен серум;

2) синтетичен

Понастоящем широко се използват серологични реакции (SR), в които участват белязани антигени или антитела. Те включват имунофлуоресцентна реакция, радиоимунни и ензимни имуноанализни методи, имуноблотинг реакция, поточна цитометрия и електронна микроскопия.

Те се прилагат:

1) за серодиагностика на инфекциозни заболявания, т.е. за откриване на антитела с помощта на набор от известни конюгирани (химически комбинирани) антигени с различни етикети (ензими, флуорохромни багрила);

2) за определяне на микроорганизъм или неговия серовар с помощта на стандартни маркирани диагностични антитела (бърза диагностика).

Диагностичните серуми се приготвят чрез имунизиране на животни с подходящ антиген, след което имуноглобулините се изолират и конюгират със светещи багрила (флуорохроми), ензими и радиоизотопи.

Диагностичните моноклонални антитела се произвеждат с помощта на хибридни клетки, образувани чрез сливане на имунен В лимфоцит с миеломна клетка. Хибридомите са способни бързо да се размножават in vitro в клетъчна култура и да произвеждат имуноглобулин, характерен за взетия В-лимфоцит.

Маркираните СР не отстъпват по специфичност на другите СР, а по своята чувствителност превъзхождат всички СР.

Имунофлуоресцентна реакция (RIF)

Като етикети се използват светещи флуорохромни багрила (флуоресцеин изотиоцианат и др.).

Има различни модификации на RIF. За експресна диагностика на инфекциозни заболявания Koons RIF се използва за идентифициране на микроби или техните антигени в изследвания материал.

Има два метода на RIF според Кунс: директен и индиректен.

Директни RIF компоненти:

1) материал за изследване (изпражнения, назофарингеален секрет и др.);

2) белязан специфичен имунен серум, съдържащ антитела към желания антиген;

3) изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Намазка от тестовия материал се третира с белязан антисерум.

Възниква реакцията AG-AT. По време на луминесцентно микроскопско изследване се открива флуоресценция на етикета в областта, където са локализирани комплексите AG-AT (фиг. 34).

Компоненти индиректен RIF, предназначен за бърза диагностика на грип А:

1) материалът за изследване се измива от назофаринкса на пациент със съмнение за грип;

2) специфичен антисерум с антитела срещу вируса на грип А;

3) антиглобулинов серум (AT срещу имуноглобулин), маркиран с флуорохром;

4) изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Намазка от тестовия материал първо се третира с имунен серум към желания антиген и след това с маркиран антиглобулинов серум.

Имунните комплекси AG-AT - белязани с AT се откриват с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Предимството на индиректния метод е, че не е необходимо да се приготвя широка гама от флуоресцентни специфични серуми, а се използва само един флуоресцентен антиглобулинов серум.

За серологична диагностика на грип А,т.е. за определяне на антитела срещу грипен вирус А в кръвния серум с помощта на косвен RIFизползвайте инфлуенца диагностикум (антиген на вируса на грип А). Серодиагностиката на вирусните инфекции има предимно ретроспективен характер и се използва за потвърждаване на диагнозата и епидемиологичен анализ.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA): конкурентен метод (определяне на HBs-AG на вируса на хепатит B) и индиректен метод (серологична диагностика на HIV инфекция)

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Като етикети се използват ензими: пероксидаза, алкална фосфатаза и др.

Индикатор за реакция е способността на ензимите да предизвикват цветни реакции при въздействие върху съответния субстрат. Например, субстратът за пероксидаза е разтвор на ортофенилдиамин (OPD) или тетраметилбензидин (TMB).

Най-широко използвани са твърдофазният ELISA (фиг. 35), индиректните и конкурентните методи (фиг. 36).

Резултатите от ELISA могат да бъдат оценени визуално и чрез измерване на оптичната плътност на спектрофотометър (ELISA анализатор).

Предимствата на ELISA включват:

Простота на методите за оценка на реакцията;

Стабилност на конюгатите;

Лесно се поддава на автоматизация.

Като примери са дадени следните видове ELISA:

А) състезателен тип

Предназначен за откриване на повърхностен антиген на вируса на хепатит В (HBs Ag) в серум и кръвна плазма за диагностика на вирусен хепатит В и определяне на носителството на HBs Ag.

Компоненти:

1) материал за изследване - серум или кръвна плазма;

2) антитела срещу HBs Ag, адсорбирани върху повърхността на ямката на полистиролова микроплака;

3) конюгат – миши моноклонални антитела към HBs Ag, белязани с пероксидаза;

4) ортофенилендиамин (OPD) – субстрат;

5) фосфатно-солен буфер;

6) контролни серуми:

Положителен (серум с HBs Ag);

Отрицателен (серум без HBs Ag).

Напредък:

2. Инкубация 1 час при 37°C.

3. Измиване на дупките.

4. Добавяне на конюгата.

5. Инкубиране 1 час при 37°C.

6. Измиване на дупките.

7. Влизане в OFD. В присъствието на HBs Ag разтворът в ямките става жълт.

8. ELISA броенето се извършва чрез оптична плътност с помощта на фотометър. Степента на оптичната плътност ще бъде обратно пропорционална на концентрацията на изследваните Ag HBs.

Реакцията протича в три фази:

1. HBs Ag от тестовия серум (плазма) се свързва с хомоложни антитела, адсорбирани на повърхността на ямката. Образува се ИР АГ-АТ. (HBs Ag – анти HBs AT).

2. Антителата срещу HBs Ag, белязани с пероксидаза, се свързват с останалите свободни детерминанти на HBs Ag в комплекса AG-AT. Образува се комплекс от AT-AG-белязан AT (анти HBs AT - HBs Ag - анти HBs AT, белязан с пероксидаза).

3. OPD взаимодейства с пероксидазата на комплекса AT-AG-AT и се получава жълто оцветяване.

Б) индиректен тип

Това е основната тестова реакция за диагностициране на HIV инфекция.

Цел: Серологична диагностика на HIV инфекция - откриване на антитела срещу HIV антигени.

Компоненти:

1) материал за изследване - кръвен серум (AT до HIV Ags);

2) синтетични пептиди, имитиращи 2 антигена на HIV: gp 120 и gp 41, адсорбирани върху повърхността на полистиролова ямка;

3) антиглобулинов серум, белязан с пероксидаза, получен чрез имунизиране на зайци с човешки глобулини (AT до AT);

5) фосфатно буфериран физиологичен разтвор;

6) контролни серуми:

Положителен;

Отрицателна.

Напредък:

1. Добавяне на контролни и тестови серуми.

2. Инкубиране за 30 минути при 37°C.

3. Пране.

4. Добавяне на антиглобулинов серум, белязан с ензим.

5. Инкубиране за 30 минути при 37°C.

6. Пране.

7. Влизане в OFD.

Реакцията протича в 3 фази:

1. Антителата срещу HIV на тестовия серум се свързват с хомоложни антигени (gp 120 и gp 41) и IR AG-AT се образува на повърхността на сорбента (HIV Ag - AT към HIV).

2. Образуване на IR AG-AT-AT, белязан с пероксидаза, т.к Антителата на тест-серума са антигени за антиглобулинов серум.

3. OPD взаимодейства с пероксидазата на комплекса AG-AT-AT и се получава жълто оцветяване на разтвора на ямката. Степента на ензимната активност е правопропорционална на концентрацията на изследваните антитела.

Реакцията се основава на факта, че имунните серуми се третират с флуорохроми (FITC), които се комбинират с антитела. Серумите не губят своята имунна специфичност. Когато полученият луминесцентен серум взаимодейства със съответния антиген, се образува специфичен луминесцентен комплекс, който лесно се вижда в луминисцентен микроскоп.

Различни имунофлуоресцентни серуми могат да се използват за методи на директна и индиректна имунофлуоресценция. При директния метод се приготвят специфични флуоресцентни имунни серуми за всеки микроб чрез имунизиране на заек с убита култура на патогена, след което заешкият имунен серум се комбинира с флуорохром (флуоресцеин изоцианат или изотиоцианат). Методът се използва за бърза диагностика за откриване на бактериални или вирусни антигени.

Индиректният метод включва използването на диагностичен имунен нефлуоресцентен серум (от имунизиран заек или болен човек) и флуоресцентен серум, който има антитела срещу специфичните глобулини на диагностичния серум.

Работа №3

Ензимен имуноанализ (ELISA)

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) е широко използван. Тя се основава на факта, че протеините са здраво адсорбирани върху плочи, например от поливинилхлорид. Един от най-разпространените в практиката варианти на ELISA се основава на използването на ензимно маркирани специфични антитела със същата специфичност. Разтвор, съдържащ анализирания антиген, се добавя към носителя с имобилизирани антитела. По време на инкубацията върху твърдата фаза се образуват специфични комплекси антиген-антитяло. След това носителят се измива от несвързаните компоненти и се добавят хомоложни антитела, белязани с ензим, които се свързват със свободните валенции на антигена в комплексите. След вторична инкубация и отстраняване на излишъка от тези ензимно белязани антитела се определя ензимната активност върху носителя, чиято стойност ще бъде пропорционална на първоначалната концентрация на изследвания антиген.

В друга версия на ELISA тестовият серум се добавя към имобилизирания антиген. След инкубиране и отстраняване на несвързаните компоненти се откриват специфични имунокомплекси с помощта на ензимно белязани антиглобулинови антитела. Тази схема е една от най-често срещаните при извършване на ELISA.

Специфичен тестов материал - специфични антитела субстрат

антитела патоген с пероксидаза за пероксидаза

Проучете AGS, етикетиран

Серум пероксидаза Субстрат за

Специфична пероксидаза

Контрол:

положителен - белязан с пероксидаза имунен серум + субстрат - 2 ямки;

отрицателен - нормален серум + субстрат - 2 ямки.

Реакция на имобилизация на Treponema pallidum(RIBT). Задължително условие е преди изследването пациентът да не е приемал антибиотици, които оказват токсично действие върху Treponema pallidum, причинявайки неспецифичното им обездвижване.

Положителните резултати от RIBT се откриват приблизително от средата на вторичния пресен период на сифилис и могат да продължат дълго време след лечението. Ако е необходимо, методът се използва за откриване на AT в CSF, това изследване се характеризира с висока специфичност, но ниска чувствителност (около 40%).

RIBT е малко полезен за диагностициране на ранни форми на сифилис поради късното (не по-рано от 8-9 седмици от момента на инфекцията) появата на AT-иммобилизини; методът може да даде фалшиво положителни резултати, особено при пациенти с автоимунна патология, злокачествени заболявания и диабет. Освен това RIBT е доста сложен, трудоемък и скъп анализ, който изисква висококвалифициран персонал и наличие на вивариум, поради което през последните години се използва само в определени лаборатории. В диагностиката RIBT се използва като реакционен арбитър, когато има несъответствия в резултатите от други серологични изследвания, за разграничаване на фалшиво положителни резултати и при установяване на диагноза на късни форми на сифилис.

Реакция на фиксиране на комплемента с трепонемален антиген (RSC с TA)Чувствителността на метода е около 80%, специфичността е 98%. Методът е част от набор от стандартни серологични реакции за сифилис, регламентиран със Заповед на Министерството на здравеопазването на СССР № 1161 от 2 септември 1985 г. „За подобряване на серологичната диагностика на сифилис“. Понастоящем използването на тази реакция, подобно на CSC с кардиолипин антиген, е ограничено до отделни лаборатории.

Имунофлуоресцентна реакция (RIF). За диагностициране на сифилис се използват няколко модификации на RIF: RIF-c - за откриване на AT в CSF, RIF-200 (тестовият серум се разрежда 200 пъти преди реакцията); RIF-abs (RIF с абсорбция), IgM-RIF-abs (за определяне на IgM AT). По отношение на чувствителността и специфичността RIF-abs не отстъпва на RIBT, но прилагането на този метод е много по-просто. Резултатите от RIF-abs стават положителни от 3-та седмица след инфекцията (преди появата на шанкроида или едновременно с него), това е метод за ранна диагностика на сифилис. Положителните резултати от изследването често се откриват много години след пълно лечение на ранен сифилис, а при пациенти с късен сифилис - в продължение на десетилетия.

Показания за извършване на RIF-abs:

• положителни резултати от НТТ при бременни жени при липса на клинични и анамнестични данни, показващи сифилис;
• преглед на лица с различни соматични и инфекциозни заболявания, при които се отбелязват положителни резултати от НТТ;
• изследване на лица с клинични прояви, характерни за сифилис, но с отрицателни резултати от НТТ;
• ранна диагностика на сифилис;
• в някои случаи - като критерий за успех на антисифилитичното лечение: преминаването на положителен RIF-abs към отрицателен след лечението е 100% критерий за излекуване на сифилис.

IgM-RIF-abs се използва за отделно откриване на ATs от клас Ig, което е от особен интерес при диагностицирането на вроден сифилис, когато ATs на Treponema, синтезирани в тялото на детето, са представени от IgM, а ATs IgG са от майчин произход. Показания за това изследване са: диагностика на вроден сифилис; оценка на резултатите от лечението на ранен сифилис.

RIF има висока чувствителност (98,5%) и специфичност (99,6%) за почти всички форми на сифилис. Недостатъците на РИФ са: невъзможност за автоматизиране на изследването и записване на резултатите; трудности при приготвянето на висококачествен антиген от суспензия на Treponema pallidum, получена от тестис на заразен заек; субективизъм при оценката на резултатите.

Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA). Сравнението на резултатите, получени с помощта на RPGA и RIBT, RIF-abs, CSR, MRP показа висока чувствителност и специфичност на RPGA при диагностицирането на сифилис, съвпадащи с резултатите от RIF-abs.

RPGA може да се изпълнява в качествена и количествена версия; има техните макро- и микромодификации. Количественият метод RPGA позволява да се оцени концентрацията на специфични трепонемни антитела в кръвта. Титри от 1:640 и по-ниски са типични за пациенти, лекувани в миналото за сифилис. По-високите титри са обичайни за активна, нелекувана инфекция.

Положителните резултати от RPGA обикновено се отбелязват 3 седмици след появата на шанкра и след това при пациенти, които са имали сифилис в продължение на много години, често за цял живот.

Чувствителността на RPGA е 76% за първичен сифилис; 100% за вторичен сифилис; 97% за латентен сифилис; 94% за късен сифилис. Специфичността на RPGA е по-висока от специфичността на RIF–abs, като е 99%.

Поради съотношението на висока специфичност, чувствителност, лекота на изпълнение и стандартизация на реагентите сред трепонемните тестове за серодиагностика на сифилис, RPGA постоянно заема водещо място в клиничната практика в света.

Специални предимства на ELISAса: висока чувствителност и специфичност на метода; автоматизация на настройката на реакцията; висока степен на стандартизация; възможност за изследване на голям брой серумни проби; в количествено отчитане и обективно документиране на получените резултати; възможността за едновременно определяне на титъра на антитрепонемни антитела от различни класове (IgG и IgM) в една проба; пригодност за ранна диагностика на сифилис и диагностика на вроден сифилис; в лесна употреба за изследване на кръв в службата за кръвопреливане; приложимост като потвърдителен специфичен трепонемален тест. Чувствителността на ELISA е 98–100%, специфичността е 96–100%.

Недостатъците на ELISA включват: непригодност за изследване на единични проби; по-дълъг период преди получаване на резултата и по-кратък срок на годност на комплектите ELISA, например, в сравнение с RPGA.

Имунен блот (IB).Един от съвременните методи за диагностициране на сифилис е IB за определяне на IgG или IgM антитела към определени антитела на Treponema pallidum.

Методът има висока чувствителност (до 100%), специфичност (98%) и възпроизводимост (100%). Изследването дава възможност да се изследва спектърът от антитела към няколко антигена на T. pallidum наведнъж, като се използват високо пречистени рекомбинантни и пептидни антигени, които намаляват до минимум неспецифичната серумна реактивност.

Всичко това определя възможността за предпочитане на използването на метода IB пред други трепонемни тестове за проверка на диагнозата сифилис в трудни случаи, по-специално за диагностициране на сифилис през втората половина на инкубационния период, латентен вроден сифилис в първите дни на живота на детето, за идентифициране на латентен сифилис при лица със слаб хуморален отговор, както и за разграничаване на фалшиво положителни резултати от други тестове.