Реакция связывания комплемента является одной из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных заболеваний, а также составляет основу некоторых других методов выявления противовирусных антител. Хотя реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации, непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ превосходят реакцию связывания комплемента по чувствительности, однако простота методики, раннее обнаружение антител, а также выявление вирусных антигенов, не обладающих гемагглютинирующими свойствами, объясняют ее широкое применение в вирусологических исследованиях.

Для ее постановки не требуется такая высокая степень концентрации и чистоты антигенных препаратов, которые необходимы для ряда других иммунологических реакций. Кроме того, групповая специфичность комплементсвязывающих антигенов многих вирусов позволяет использовать реакцию связывания комплемента при массовой диагностике: эта реакция не выявляет штаммовых различий, приобретает особую ценность при изучении антигенных взаимосвязей между вирусами.

Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных реакций. На первом этапе в реакции участвуют антигены и антитела (один из этих компонентов заранее известен), а также комплемент в оттитрованном количестве. При соответствии антигена и антител их комплекс связывает комплемент, что выявляется на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антител, то лизис бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция связывания комплемента). При отрицательной реакция связывания комплемента несвязанный комплемент способствует гемолизу, по которому судят о результатах реакции.

Основными компонентами реакции связывания комплемента служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2-7,4) или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать антикомплементарностью, т.е. способностью адсорбировать комплемент, что задерживает гемолиз и искажает результат реакции.

Антигены для РСК готовят из органов зараженных животных, аллантоисной или амниотической жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также культуральной жидкости после культивирования вирусов в тканевых культурах клеток. В антигенных препаратах всегда содержится много балластных веществ из клеток животных или культур ткани, что может также исказить результаты реакции.

Полученные вирусные антигены инактивируют, определяют рабочую дозу, а также антикомплементарные и гемолитические свойства. После этого антиген титруют в присутствии комплемента.

Вторым основным компонентом при постановке реакции является комплемент. Этим термином обозначают сложную систему белков и факторов, присутствующих в крови животных и человека. Обычно в реакции связывания комплемента применяют сыворотку крови морских свинок. Активность (титр) комплемента - это его наименьшее количество, в присутствии которого гемолизин вызывает полный гемолиз используемой гемолитической системы.

Для выявления комплемент-связывающих антител к вирусам проводят обязательную инактивацию сыворотки для устранения комплемента при 560С в течение 30 мин. В качестве референс-сывороток обычно используют сыворотки иммунизированных животных. Причем для иммунизации применяют вирусные антигены, тщательно очищенные от тканевых примесей, так как к противном случае возникает выраженная неспецифическая реакция.

Обязательным компонентом реакции связывания комплемента является гемолитическая система, в которую входят эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, полученная гипериммунизацией кроликов эритроцитами барана.

Для постановки реакции связывания комплемента используют следующие модификации: микрометод реакции связывания комплемента в микротитраторе системы Такачи, реакцию длительного связывания комплемента, реакцию непрямого связывания комплемента, реакцию связывания комплемента в геле, реакцию связывания комплемента микрокапельным методом, реакцию связывания комплемента на твердой основе.

Хотя чувствительность реакции связывания комплемента невысокая, однако она имеет высокую специфичность. В этой связи она широко применяется для диагностики вирусных пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или растворимый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc-фрагментом любого антитела, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свойства комплемента:

1) способность связываться с комплексом "антиген + антитело";

2) лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.

РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы - опытная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56 °С в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена.

К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37 °С в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образующиеся комплексы "антиген + антитело" свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса "антиген + антитело" не произойдет, и комплемент останется свободным.

Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37 °С в течение 30-60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Используя смартфон (например, такой), можно рассчитать точное время реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом "антитело + антиген", лизиса эритроцитов не будет - РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов.

Если же в сыворотке специфические антитела отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом "эритроциты + антитела" индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и контроль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию.

Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10% раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °С.

Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаружения специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.

Не нашли подходящую информацию? Не беда! Воспользуйтесь поиском на сайте в верхнем правом углу.

61. Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая - взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая - выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают - сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген - антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген - антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.

Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24-48 ч) или сухой комплемент в ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра - наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20-30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену - отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу в 1901. Которые установили, что при образовании комплекса антиген – антитело происходит связывание им комплемента.

Образовавшееся соединение мелкодисперсно и не определяется визуально. Для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы применили индикаторную гемолитическую систему: эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется, комплемент остаётся свободным. Комплемент адсорбируется только на комплексе антиген - антитело, отдельно на антигене или антителе он не адсорбируется. Поэтому при добавлении к испытуемой системе гемолитической системы, состоящей из уже готового комплекса антиген - антитело (эритроциты барана и антитела к ним), комплемент присоединяется к этому комплексу, вызывая гемолиз эритроцитов барана - видимый результат.

Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РСК применяется в серодиагностике гонореи, сифилиса, коклюша, всех риккетсиозов, многих вирусных заболеваний. Как и другие серологические реакции, РСК можно применить и для серотипирования.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют две системы антиген - антитело и комплемент.

Для постановки РСК необходимы:

Сложность реакции обуславливается количеством участвующих ингредиентов и, главным образом, необходимостью определять точные количественные соотношения их. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование её ингредиентов.

Гемолитическая сыворотка готовится в производственных условиях путем 3-4 кратной внутривенной иммунизации кролика 50 % взвесью бараньих эритроцитов и инактивируется при 56 °С в течение 30 мин. Для её титрования берутся последовательно уменьшающиеся дозы (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% взвесь эритроцитов, комплемент 1:10 в равных объёмах (но 0,5 мл). На этикетке ампул с гемолитической сывороткой обозначен её титр - максимальное разведение, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента в течение часа при 37°С. Для РСК используют разведение сыворотки, увеличенное против титра в 3 раза.

Взвесь эритроцитов барана 3% получают из дефибринированной крови барана путем отмывания изотоническим раствором NaCl.

Комплемент - свежая сыворотка крови морской свинки или высушенная - титруется перед опытом: последовательно уменьшающиеся дозы (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + гемолитическая система (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате при 37°С определяют титр комплемента - наибольшее разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%, т.к. активность комплемента в опыте может оказаться несколько подавленной другими комплементами реакции (антиген, сыворотка).

Антиген - взвесь убитых микроорганизмов, их лизаты, полные антигены, гаптены, экстракты тканевых липидов -иногда связывает комплемент даже в отсутствии иммунной сыворотки, поэтому его также необходимо оттитровать. Берутся последовательно уменьшающиеся дозы антигена + рабочая доза комплемента + гемолитическая система. Титром антигена является его наименьшая доза, при которой наступает отчётливый гемолиз. Для РСК берут дозу антигена, вдвое уменьшенную против титра во избежание связывания комплемента.

Исследуемая сыворотка перед опытом подвергается инактивированию при 56°С в течение 30 мин. Для инактивирования её собственного комплемента.

Все компоненты реакции связывания комплемента берутся в равных объёмах.

Постановка основного опыта.

После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК. В реакции участвует также титрованные сыворотки: заведомо здорового и заведомо больного (отрицательно и положительная сыворотки соответственно). Как и испытуемую сыворотку, контрольные - тоже инактивируют при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в две фазы:

I фаза - специфическая - инкубация смеси антигена, антитела и комплемента в термостате при 37°С в течение 30 мин.

II фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (предварительно помешенной на 30 мин. в термостат) и инкубации в термостате при 37°С в течение 20 -30 мин.

Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл.). Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной, когда жидкость интенсивно окрашивается ("лаковая кровь"). Степень интенсивности гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величине осадка эритроцитов на дне (+ + + +, + + +, + +, +).

Учёт результатов РСК.

Учитывать результаты опыта (испытуемой сывороткой) можно лишь в том случае, если все контроля прошли правильно.

В пробирке №2 с положительной сывороткой (содержащей антитела к данному антигену) гемолиза не должно быть, т.к. комплемент связан в первой специфической системе, а гемолитическая система осталась без комплемента - эритроциты оседают на дно, надосадочная жидкость прозрачна.

В пробирке №3 с отрицательной сывороткой, сывороткой здорового человека, не содержащей антитела к данному антигену, гемолиз должен быть, поскольку в первой фазе реакции не произошло образование комплекса антиген -антитело (из - за отсутствия антител к данному антигену) и комплемент остался свободным. При добавлении гемосистемы во II фазе реакции комплемент адсорбировался на готовом иммунном комплексе эритроциты барана плюс антитела к ним; произошел лизис эритроцитов барана (гемолиз).

Наличие гемолиза в контроле сыворотки и антигена (пробирки №4 и 5) указывает, что их дозы были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемента не связывают. Оставшийся свободным в специфической системе комплемент адсорбируется иммунным комплексом гемолитической системы, происходит гемолиз.

Гемолиз в контроле комплемента (пробирка №6) свидетельствует об активности комплемента и правильности выбора его рабочей дозы.

В контроле гемолитической системы (пробирка №7) при правильной работе этой системы не должно быть даже следов гемолиза, т.к. в ней отсутствует комплемент.

При безупречных контрольных результатах можно учитывать опыт (пробирка №1). Отсутствие гемолиза расценивают как положительный результат. Он свидетельствует о том, что в испытуемой сыворотке обнаружены антитела к данному антигену (человек болен). При соответствии антигена антителу образуется комплекс антиген - антитело, который связывает комплемент (I фаза). При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов во II фазе не будет. Наличие гемолиза является отрицательным результатом, свидетельствующим об отсутствии антител к данному антигену (человек здоров). Комплемент остается свободным и при добавлении гемолитической системы присоединяется к комплексу эритроцит - гемолизины, вызывая гемолиз.

Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело - сыворотка больного

3. Комплемент - сыворотка морских свинок

4. Антиген - эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

Подготовка ингредиентов

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.