Oligonukleotid je kratak fragment nukleinske kiseline dužine kraće od 50 nukleotida. U proteklih 20 godina, značenje se proširilo na sve hemijski sintetizirane nukleinske kiseline, bez obzira na dužinu. Prva publikacija o ciljanoj hemijskoj sintezi oligonukleotida pojavila se 1955. godine.

Od tada se svake godine sintetiziraju milioni oligonukleotida za upotrebu u laboratorijama širom svijeta. Većina studija zahtijeva samo male količine DNK. Za upotrebu u biofizičkim studijama (NMR i rendgenska kristalografija) potrebne su mnogo veće količine DNK (10 µmol ili više), pa su za sintezu tako velikih količina razvijene metode sinteze na čvrstoj fazi koje omogućavaju upotrebu oligonukleotidi kao molekuli lijeka (npr. antisense oligonukleotidi).

Sinteza DNK ili RNK oligonukleotida odnosi se na hemijsku sintezu fragmenata nukleinske kiseline sa specifičnim hemijskim strukturama ili sekvencama u različitim veličinama.

Fig.1. Strukture oligonukleotida.

Princip sinteze u čvrstoj fazi prvi je razvio i primijenio na sintezu polipeptida Robert Bruce Merrifield, američki biohemičar koji je 1984. godine dobio Nobelovu nagradu za hemiju za pronalazak sinteze peptida u čvrstoj fazi. Shvatio je da je ključ uspješne sinteze u sidrenju prvog monomera za nerastvorljivu polimernu čvrstu fazu. Drugi monomeri se tada mogu spojiti, jedan za drugim, na stacionarni krajnji kraj polimera koji raste. Na kraju sinteze, završeni polimerni lanac se može odvojiti od nerastvorljivog polimera i pročistiti. Ovaj proces je optimizovan tokom godina kako bi postao visoko efikasan i sada je postao osnovna metoda koja se koristi u automatizovanim sintetizatorima oligonukleotida.

Da bi se osigurala uspješna sinteza oligonukleotida, neophodni su sljedeći uvjeti:

• Svi reagensi moraju biti rastvorljivi u nevodenim rastvaračima.
• Amino i hidroksilne grupe nukleotidnih baza i ostataka ugljikohidrata moraju biti na odgovarajući način blokirane.
• Zaštitne grupe uvedene tokom sinteze moraju biti stabilne u uslovima izduženja lanca tokom formiranja internukleotidne fosfodiestarske veze.
• Zaštitne grupe moraju biti dovoljno labilne da se mogu ukloniti na kraju sinteze bez oštećenja produkta reakcije.

Funkcije oligonukleotida i izgledi za njihovu upotrebu

Trenutno se oligonukleotidi i njihovi analozi široko koriste u različitim oblastima, kao što su medicina i molekularna biološka istraživanja, a smatraju se i obećavajućim terapeutskim agensima i sondama za molekularnu dijagnostiku.

U proteklih 20 godina, samo su dvije vrste analoga nukleinskih kiselina sa formalno električno neutralnom okosnicom relativno dobro proučavane: peptidne nukleinske kiseline i fosfodijamid morfolino oligonukleotidi. Analogi oba tipa su sposobni da se komplementarno vežu za prirodne DNK i RNK molekule, pa su zbog toga našli primenu i u molekularnoj biologiji, a posebno u medicini kao potencijalni lekovi.

Osim toga, razvojem DNK tehnologija postalo je moguće proučavati ekspresiju poznatih gena, odrediti mutacije u genomima različitih organizama i dijagnosticirati niz zaraznih bolesti. U rješavanju ovih problema najviše obećava korištenje DNK čipova, koji su male ploče s fragmentima DNK položenim na njihovoj površini.

Metoda za stvaranje DNK čipova kombinuje metode zasnovane na ciljanoj sintezi oligonukleotida direktno na površini čipa. Sinteza se vrši postupnim dodavanjem rastućem oligonukleotidnom lancu nukleotida koji na 5' kraju sadrži labilnu zaštitnu grupu, čije je uklanjanje moguće pod uticajem svetlosnog zračenja, električnog napona ili tokom kisele hidrolize.

Također je pokazano da se oligonukleotidi usmjereni na gen, ovisno o odabranom ciljnom genu, razlikuju po značajnoj raznolikosti modulirajućih efekata na tumorska tkiva, u rasponu od usporavanja i zaustavljanja proliferacije tumorskih ćelija do supresije njihovih invazivnih svojstava.

Lijekovi protiv raka na bazi nukleinske kiseline predstavljaju visoko specifično sredstvo za modulaciju ekspresije gena. Supresija brojnih gena čija se abnormalno visoka ekspresija javlja tokom neoplastične transformacije može se postići upotrebom lijekova na bazi nukleinskih kiselina, kao što su antisens oligonukleotidi (asON). Općenito, mehanizam za suzbijanje ekspresije gena je njihovo komplementarno vezivanje za ciljnu mRNA, nakon čega se ciljna mRNA ili cijepa ili se njen proces translacije blokira.

asON su sintetičke jednolančane DNK duge 15-20 nukleotida. Nedavno su dobijeni asON-ovi koji mogu ometati transport spojene mRNA iz jezgra u citoplazmu, kao i asON-i, koji blokiranjem mjesta spajanja u pre-mRNA mogu dovesti do ekspresije alternativnog proteina varijanta.

Zbog činjenice da su prirodni oligodezoksiribonukleotidi u ćelijskoj kulturi i in vivo podložni brzoj degradaciji pod dejstvom nukleaza, u asON strukturu se uvode različite hemijske modifikacije kako bi se povećala njihova stabilnost.

Hemijska sinteza oligonukleotida

Sinteza na čvrstoj fazi se široko koristi u sintezi peptida, sintezi oligonukleotida, sintezi oligosaharida i kombinatornoj hemiji. Hemijsku sintezu u čvrstoj fazi izumio je 1960-ih Bruce Merrifield, a dobio je Nobelovu nagradu za hemiju 1984.

Sinteza u čvrstoj fazi se izvodi na čvrstoj podlozi, između filtera, u kolonama koje omogućavaju prolaz svih reagensa i rastvarača. Sinteza na čvrstoj fazi ima niz prednosti u odnosu na sintezu u rastvoru:

 obezbeđuje veliku brzinu reakcije

 nečistoće i višak reagensa se ispiru, tako da čišćenje nakon svakog koraka nije potrebno

 proces se može automatizovati korišćenjem kompjuterski kontrolisanih sintisajzera čvrste faze.

Čvrsti nosači (takođe zvani smole) su čestice nerastvorljive u vodi, tipično prečnika 50-200 mikrona, na koje je oligonukleotid vezan tokom sinteze.

Postoje dokazi da je jedan od najefikasnijih materijala koji se može koristiti kao čvrsti nosač porozno staklo. Prilično je krut i ne može nabubriti. U njegovim dubokim porama dolazi do sinteze oligonukleotida. Staklo sadrži pore od 500 Å (50 nm) koje su pogodne za sintezu kratkih oligonukleotida. Međutim, nije pogodan za sintezu oligonukleotida dužih od 40 baza. To je zbog činjenice da rastući oligonukleotid blokira pore i smanjuje difuziju reagensa kroz matriks.

Čvrsti nosači za konvencionalnu sintezu oligonukleotida se tipično formulišu sa opterećenjem od 20-30 μmol nukleozida po gramu smole. Sinteza oligonukleotida pri većim opterećenjima postaje manje efikasna zbog steričke smetnje između susjednih DNK lanaca vezanih za smolu.

Faze hemijske sinteze oligonukleotida

Fosforamidatna oligosinteza se odvija u smjeru 3′ do 5′ (suprotno smjeru biosinteze DNK od 5′ do 3′ u replikaciji DNK). Jedan nukleotid se dodaje po ciklusu sinteze.

Rice. 2. Sinteza fosforamidatnog oligonukleotidnog ciklusa

Na početku sinteze oligonukleotida, prvi nukleozid je prethodno vezan za smolu (nosač) i kolone za sintezu A, G, C ili T se biraju ovisno o nukleozidu na 3′ kraju željenog oligonukleotida. Usidren nukleozid ima 5′-DMT zaštitnu grupu (DMT = 4,4′-dimetoksitritil) čija je uloga da spriječi polimerizaciju, a ova zaštitna grupa mora biti uklonjena (detritilacija). Mehanizam detrilacije prikazan je na slici 3.

Fig.3. Mehanizam za uklanjanje zaštitne grupe.

Nakon detritilacije, usidren nukleozid je spreman za reakciju sa sljedećom bazom, koja se dodaje kao nukleozid fosforamidatni monomer. Veliki višak odgovarajućeg nukleozida pomiješan je s aktivatorom (tetrazolom ili njegovim derivatima). Diizopropilamino grupa nukleozida je protonirana od strane aktivatora i tako postaje grupa koja se može odvojiti. Brzo se zamenjuje 5′-hidroksilnom grupom vezanog nukleozida, stvarajući fosfitni triestar (slika 4).

Fig.4. Mehanizam protonacije aktivatorom.

Nukleozidni fosforamiditi su prilično stabilni u inertnoj atmosferi i mogu se proizvoditi u velikim količinama, slati širom svijeta i čuvati kao suha krutina nekoliko mjeseci prije upotrebe.

Međutim, čak i uz visokoprecizan rad na sintezi oligonukleotida, ostaje mogućnost da će postojati nekoliko neizreagiranih 5′-hidroksilnih grupa koje će biti dostupne za sudjelovanje u sljedećem koraku. Ako se takav poremećaj ne zaustavi, oni će se akumulirati sa svakim sljedećim ciklusom, a konačni proizvod će biti složena mješavina oligonukleotida, od kojih će većina nositi netačne genetske informacije.

Stoga ih metoda acetilacije 5′-hidroksilnih grupa čini inertnima u odnosu na naknadnu reakciju. Ovo je takođe neophodno kako bi se minimizirale nečistoće.

Fosfitni triestar (P(III)) koji nastaje tokom koraka dodavanja je nestabilan na kiseline i mora se prevesti u stabilan oblik (P(V)). To se postiže oksidacijom joda u prisustvu vode i piridina (slika 5). Rezultirajući fosfotriester je zapravo os DNK zaštićena 2-cijanoetil grupom. Cijanoetil grupa sprečava neželjene reakcije sa fosforom tokom narednih ciklusa sinteze.

Sl.5. Mehanizam oksidativne faze.

Nakon toga, DMT zaštitna grupa na 5′ kraju DNK lanca mora biti uklonjena kako bi primarna hidroksilna grupa mogla reagirati sa sljedećim nukleotidnim fosforamidatom. Reakcija uklanjanja zaštite s triklorosirćetnom kiselinom u dihlorometanu je brza. Ciklus se ponavlja, jednom za svaku bazu, sve dok se ne dobije željeni oligonukleotid.

Zatim je potrebno odvojiti sintetizirani oligonukleotid od čvrstog nosača. U ovom slučaju se koristi sukcinil. Odvajanje je moguće tretiranjem koncentrovanom vodenom otopinom amonijaka na sobnoj temperaturi u trajanju od jednog sata (slika 6).

Fig.6. Mehanizam odvajanja oligonukleotida od čvrstog nosača u koncentrovanom vodenom rastvoru amonijaka.

Reakcija cijepanja se odvija automatski na nekim sintisajzerima, a otopina amonijaka koja sadrži oligonukleotid se pušta u staklenu bočicu. Alternativno, digestija se može obaviti ručno uzimanjem kolone iz sintisajzera i ispiranjem u špricevama koje sadrže amonijum hidroksid.

Oligonukleotid se rastvara u koncentrovanoj vodenoj otopini amonijaka, a naknadnim zagrijavanjem uklanjaju se zaštitne grupe iz heterocikličkih baza i fosfata. Vodeni rastvor se zatim ukloni isparavanjem i oligonukleotid je spreman za prečišćavanje.

Pored DMT zaštitne grupe, potrebne su i dodatne zaštitne grupe za adenin, citozin i gvanin (slika 7). Međutim, to nije neophodno za timin.

Fig.7. Strukture zaštitnih grupa koje se obično koriste za zaštitu baza adenina, citozina i gvanina tokom fosforamidatne sinteze DNK oligonukleotida.

zaključci

1. Umjetno sintetizirani oligonukleotidi se sve više koriste u različitim oblastima nauke, a metode za njihovu proizvodnju se sve više unapređuju, što omogućava sintezu dovoljnog broja oligonukleotida za laboratorijske eksperimente i za stvaranje terapijskih lijekova.

2. Danas najčešća metoda sinteze oligonukleotida ostaje metoda sinteze na čvrstoj fazi, koja može značajno ubrzati proces dobijanja oligonukleotida, kao i smanjiti zapreminu utrošenih reagensa.

Kupryushkin, M. S. Phosphorylguanidines. Nova klasa analoga nukleinskih kiselina / M.S. Kupryushkin, D.V. Pyshny, D.A. Stetsenko // Acta Naturae (ruska verzija). – 2014. – br. 4 (23). – P.123-125.

Garafutdinov, R.R. Hemijski aspekti stvaranja DNK čipova / R.R. Garafutdinov, I.S. Shepelevich, A.V. Chemeris, R.F. Talipov // Vestnik Bashkirsk. un-ta. – 2005. – br. 1. – P.49-54.

Patutina, O.A. Novi pristupi u liječenju onkoloških bolesti: antitumorski lijekovi na bazi genski ciljanih nukleinskih kiselina/ O.A. Patutina, N.L. Mironova, V.V. Vlasov, M.A. Zenkova // Acta Naturae (ruska verzija). – 2009. – br. 2. – P.47-66.

Rodriguez, A.A. Konverzija adenina u 5-amino-4-pirimidinilimidazol uzrokovana acetilnim kapiranjem tokom sinteze oligonukleotida u čvrstoj fazi/ A.A. Rodriguez, I. Cedillo, A.K. McPherson // Bioorg Med Chem Lett. – 2016. – P. 30653-9.

Broj pregleda publikacije: Molimo pričekajte

Sažetak

Pregled ispituje farmakokinetičke karakteristike različitih antisens oligonukleotidnih lijekova. Uspoređivana je farmakokinetika lijekova prve i druge generacije. Takođe se razmatra uticaj hemijske modifikacije molekula na farmakokinetiku.

Ključne riječi: antisense oligonukleotidi, fosforotioatni oligodeoksinukleotidi, farmakokinetika

Uvod

Farmakokinetička svojstva antisens oligonukleotida (ASO) najbolje se razumiju kada se razmatraju njihova fizička i hemijska svojstva. Parametri kao što su naboj, molekularna težina i amfipatska priroda fosforotioatnih ASO imaju značajan uticaj na njihovu farmakokinetiku. Hemijska struktura, posebno fosforotioatna grupa i 2'-metoksietil (MOE), ima posebno značajan uticaj na farmakokinetička svojstva ASO.

Apsorpcija, distribucija, metabolizam i izlučivanje fosforotioatnih oligodeoksinukleotida (ODN) prve generacije su opsežno proučavani na laboratorijskim životinjama i kliničkim studijama. Karakteristike farmakokinetike fosfotioatnih ASO lijekova su sljedeće: parenteralno primijenjeni fosfotioatni ODN brzo završavaju u krvnoj plazmi, gdje se vezuju za hidrofilne regije proteina plazme i tako izbjegavaju glomerularnu filtraciju. Ova hidrofilna mesta se razlikuju od drugih hidrofilnih mesta za koja se vežu lipofilni lekovi, i stoga postoji mala konkurencija za vezivanje proteina plazme za ASO. Kinetiku plazme karakterizira kratka faza distribucije (reda nekoliko sati), nakon čega slijedi faza eliminacije lijeka s poluživotom od nekoliko dana ili sedmica. Početna faza distribucije nužno uključuje vezivanje ASO za proteine ​​i distribuciju ovih kompleksa kroz tkiva jetre, bubrega, limfnih čvorova, koštane srži i slezene, koji su mjesta najaktivnijeg vezivanja i akumulacije ASO. Sasvim je očigledno da je faza eliminacije ASO zbog početnog vezivanja za proteine ​​određena početnom fazom njegove distribucije. Zbog moguće zasićenosti proteinima , Površina ispod farmakokinetičke krivulje (AUC) raste s povećanjem doze, budući da se ASO više ne vezuju za proteine ​​nakon njihovog zasićenja, već slobodno ulaze u krvotok. Nakon vezivanja, ASO ulaze u ćelije duž gradijenta koncentracije od ekstracelularnog prostora kroz ćelijsku membranu do intracelularnog prostora, verovatno uz pomoć proteina nosača. ASO u ćelijama se vezuju za dostupne mete, ali prvenstveno ASO u ćelijama se najverovatnije vezuju za intracelularne proteine. U ćeliji, sveprisutne nukleaze, ali ne i enzimi citokroma P450, metaboliziraju ASO lijekove. Budući da enzimi citokroma P450 tipično metaboliziraju lijekove malih molekula, ASO se ne natječu za metabolizam s konvencionalnim spojevima malih molekula, smanjujući rizik od interakcija lijekova. Izlučivanje ASO u urinu je u konačnici rezultat metabolizma u tkivima i uspostavljanja ravnoteže metabolita i nativne supstance izvan tkiva iu sistemskoj cirkulaciji. Ovi procesi kod laboratorijskih životinja i ljudi su vrlo slični, zbog čega nije moguće identificirati međuvrstsku korelaciju između laboratorijskih životinja i čovjeka.

Trenutno, konfiguracija ASO „druge generacije“, čija je karakteristika MOE grupa na poziciji 2" nukleotida na 3" i 5" krajevima, najviše se koristi u kliničkim studijama. Ova konfiguracija je naprednija struktura u poređenju sa nemodifikovanim fosforotioatni ODN, koji su antisens lijekovi prve generacije. To je zbog njegove povećane efikasnosti, smanjene toksičnosti i produženog poluživota. Mnogi faktori povezani s prijelazom s prve na drugu generaciju ASO su direktno povezani s poboljšanjima njihove farmakokinetike.

Karakteristike hemijske strukture ASO

Fosfotioatni skelet

Najraniji pokušaji stvaranja lijekova sa antisens aktivnošću uključivali su korištenje nemodificirane DNK, koja je, nažalost, bila vrlo osjetljiva na uništavanje nukleazama. Ispostavilo se da sveprisutne nukleaze cijepaju fosfodiesterazne veze nativne DNK, što rezultira poluživotom nemodificiranih ASO od minuta. Ova brza degradacija bila je glavna karakteristika farmakokinetičkog profila nemodifikovane antisens DNK. Promjena fosfodiestarske okosnice DNK u fosforotioatnu dramatično je promijenila farmakokinetički profil ASO. U ovim preparatima, fosforotioatna struktura zamjenjuje jedan atom sumpora u fosfodiesterskim vezama s jednim nepremosnim atomom kisika. Ova struktura povećava otpornost ASO na nukleaze i, kao rezultat, poboljšava njihova kinetička svojstva.

Fosfotioatna kiralnost

Kao što su studije pokazale, tiacija diesterskog skeleta ASO ne samo da povećava njegovu otpornost na nukleaze, već doprinosi i nastanku kiralnosti, odnosno mogućnosti postojanja stereoizomera na svakoj fosforotioatnoj vezi, što dovodi do činjenice da da u bilo kojem 20-mernom ASO postoji 219 Sp ili Rp stereoizomera. Kombinacija otpornosti na nukleaze i pojačanog vezivanja za proteine ​​snažno utječe na farmakokinetiku ASO. Povećanje stabilnosti fosforotioatnih ASO dovodi do činjenice da se poluvrijeme eliminacije lijeka iz plazme povećava na 30-60 minuta u usporedbi s poluživotom fosfodiesterskih ASO, koje iznosi 1-2 minute.

Nukleazna otpornost i kiralnost zbog zamjene fosfodiestera za fosforotioatne veze su vrijedni rasprave jer su fizička svojstva povezana s ovom strukturnom karakteristikom važna i za prvu i za drugu generaciju ASO. Otpornost na nukleaze u fosforotioatnim ASO proizilazi iz blizine sumpora na kisiku koji ne premošćuje u aktivnom mjestu egzonukleaze ionu metala. Ova blizina može uzrokovati pomicanje jona metala sa aktivnog mjesta. Ovaj efekat je demonstriran u modelu DNK polimeraze egzonukleaze 3"–5". Kristalografski podaci X-zraka podržavaju ovu hipotezu o pomicanju metalnih jona. Očigledne razlike u osjetljivosti stereoizomera na aktivnost egzonukleaze DNK polimeraze su u skladu s predloženom konformacijom fosforotioatnih stereoizomera ODN u aktivnom mjestu. Vjerovatno je da kiralnost fosforotioatnih veza može interferirati s drugim nukleazama na isti način, to jest, pomicanje metalnih jona, iako različite egzonukleaze mogu pokazati različite preferencije za Rp i Sp veze ovisno o prirodi aktivnog mjesta enzima.

Alternativno, sumpor može jednostavno zauzeti mjesto kisika u diesterskim vezama. Razlike u sposobnosti sumpora da preuzme negativan naboj u odnosu na kisik omogućavaju predviđanje promjena na aktivnom mjestu. Ova promjena najvjerovatnije nastaje zbog hidrolize fosfodiestarskih veza, a može nastati stvaranjem prolaznog petovalentnog fosfora s dva negativno nabijena atoma kisika. Zamjena jednog od ekvatorijalnih atoma kisika sumporom imat će negativne efekte na aktivnost enzima: (1) vezivanje vode, koje stabilizira lokalni negativni naboj na atomima, je smanjeno, što otežava dobivanje drugog negativnog naboja sumpora ; i (2) smanjeno vezivanje Mg 2+ za sumpor. Postoje dokazi za potonji efekat u studijama nivoa cijepanja ribozima dijastereomernih fosforotioatnih inkluzija, gdje dodatak Mg 2+ inhibira efekte cijepanja fosforotioatnih ribozima. Osim toga, pokazalo se da postoji blagi pad aktivnosti nukleaze na mjestima skeleta udaljenim od fosforotioatnih veza, što sugerira da se prenosi efekat kiralnosti. Ovaj fenomen se najbolje objašnjava promjenama u rasporedu molekula vode oko fosforotioatnog skeleta u odnosu na fosfodiestarski.

Stereospecifični efekti na aktivnost nukleaze značajno utiču na farmakokinetiku fosforotioatnih ASO, a to se najjasnije manifestuje u brzini metabolizma prve generacije fosforotioatnih ASO u krvnoj plazmi. Brzina potpunog uklanjanja ASO iz plazme se smanjuje, što ukazuje na sporiji metabolizam. Ove promjene u brzini ne mogu se objasniti samo na osnovu kinetike prvog reda, ali se mogu objasniti razlikama u osjetljivosti Rp i Sp veza.

Stereospecifične razlike u aktivnosti egzonukleaze manje su važne za ASO druge generacije. To je zbog činjenice da ASO druge generacije imaju 2" modifikacije na krajevima 3" i 5" koje sprječavaju njihovo cijepanje egzonukleazom. Korištenjem endonukleaze izolovane iz patogena Serratia marcescens, proučavani su efekti kiralnosti fosforotioatnih veza. Mjesto djelovanja endonukleaze je isto kao i egzonukleaze - ovo je jedan od nepremosnih kiseonika za hidrolizu fosfodiestarskih veza.U dijastereomeru, sumpor je lokalizovan u neposrednoj blizini Mg 2+, kao rezultat kod kojih se aktivnost enzima smanjuje, dok u Rp dijastereomeru ne. Pošto endonukleaza Serratia ima značajne sličnosti sa nekim endonukleazama sisara, treba pretpostaviti da bi ovaj mehanizam mogao biti široko primjenjiv. Kako stereohemijske karakteristike fosforotioatnih veza utiču na djelovanje drugih endonukleaza nije poznato.Međutim, ako pretpostavimo da se reakcija odvija po shemi sličnoj endonukleazi Serratia, može se misliti da će aktivno mjesto sadržavati metalni ion (vjerovatno Mg 2+) i da će sumpor interferirati sa djelovanje nukleaza , kada je orijentisan prema ionu metala. Ako su endonukleaze osjetljive na kiralnost, to bi moglo imati važne implikacije za razvoj problema stvaranja efikasnih lijekova druge generacije. Baš kao što je učinak kiralnosti na lijekove prve generacije, kiralni učinak na metabolizam lijekova druge generacije može dovesti do usporavanja njihovog metabolizma. Tako, na primjer, može se pretpostaviti da će stereoizomeri koji se brzo metaboliziraju će biti selektivno uništeni, ostavljajući samo izomeri koji se sporo metaboliziraju.

Vezivanje ASO za proteine

Utvrđeno je da, u poređenju sa ASO sa fosfodiestarskim skeletom, na farmakokinetiku fosfotioatnih struktura značajno utiče njihovo vezivanje za proteine. Hemijska osnova za povećano vezivanje proteina je povećana lipofilnost fosforotioatnih veza u poređenju sa fosfodiestarskim vezama. Budući da su molekularne interakcije s vodom određene oblikom i funkcijom makromolekula u vodenoj otopini, čak i male promjene u lipofilnosti kičme duž cijele dužine ASO mogu imati posljedice na interakciju oligomera s vodom i makromolekula kao što su proteini .

U prvoj aproksimaciji, fosforotioatni ODN se vezuju za ćelijske proteine ​​više nasumično nego fosfodiesterski ODN. Zašto fosforotioatni ASO bolje vezuju proteine ​​nije u potpunosti razjašnjeno. Moguća objašnjenja uključuju povećanu lipofilnost i kompleksiranje s ionima metala.

Važnost vezivanja za proteine ​​plazme za farmakologiju, farmakokinetiku i toksikologiju fosfotioatnih ASO (i prve i druge generacije) teško je precijeniti. Na nivoima mikromolarne koncentracije, više od 90% fosforotioatnih ODN vezano je u plazmi. Postoje specifične razlike u procentu i snazi ​​vezivanja za proteine, kao i kvalitativne razlike u vezivanju ASO za specifične proteine ​​među različitim vrstama. Vezivanje fosforotioatnih ASO za cirkulirajuće proteine ​​sprečava da ova jedinjenja budu filtrirana u glomerulu i izlučena urinom. U slučajevima zasićenja, na primjer uz primjenu velike doze ASO, povećava se izlučivanje ASO pune dužine urinom. Zbog razlika u vrstama, zasićenost u različitim vrstama određena je različitim koncentracijama ASO. Na primjer, proteini mišje plazme imaju manji afinitet za ASO u odnosu na one kod pacova ili ljudi. Zbog toga se efekat zasićenja vezivanja ASO za proteine ​​plazme kod miševa javlja u nižim koncentracijama u poređenju sa drugim vrstama. Vrste razlike u vezivanju za proteine ​​plazme su značajan faktor u razlikama u farmakokinetici među vrstama.

Nukleazna rezistencija i vezivanje za proteine, koji su karakteristični za fosforotioatno povezane ASO, također mijenjaju farmakokinetiku ASO terapije. Dodatne hemijske strukture karakteristične za drugu generaciju lijekova koji se razvijaju uvode druge promjene u njihovu farmakokinetiku.

Metoksietil derivati ​​ASO

Druga generacija ASO-a je razvijena da poboljša neke od karakteristika prve generacije ODN-a. Dakle, fosforotioatne strukture dodane MOE grupama na poziciji 2" povećavaju njihovu otpornost na nukleaze i mijenjaju efikasnost vezivanja za proteine.

Otpornost MOE na nukleaze

Pokazalo se da struktura MOE utiče na otpornost ASO na nukleaze. Dok fosforotioatne strukture smanjuju aktivnost egzonukleaze, struktura na poziciji 2" praktično eliminiše aktivnost egzonukleaze. Nukleazna rezistencija može biti rezultat (1) supstitucije vodonika na poziciji 2" MOE, (2) steričnih efekata MOE ili (3) formiranja krute vodene školjke oko ASO skeleta. Bez obzira na razloge rezistencije na nukleaze, prisustvo MOE grupe čini ASO modifikovane na poziciji 2" praktično imunim na efekte cirkulišućih i većine ćelijskih nukleaza. Centralna regija ASO skeleta, koja se sastoji od deoksifosfotioata, nije ni približno toliko otporna Razlike u ASO prve i druge generacije u područjima podložnim metabolizmu su također određene razlikama u metaboličkim modelima.

Kada su metabolički obrasci procijenjeni kapilarnom gel elektroforezom (CGE) ili tečnom hromatografijom/masenom spektrometrijom (LC/MS), nisu pronađeni metaboliti koji su bili kraći za jedan nukleotid. Najviše je otkriveno metabolita koji su se cijepali na deoksi mjestu (vjerovatno endonukleazama); daljnji put metabolizma je smanjenje veličine proizvoda cijepanja. Otpornost na egzonukleaze i usporen metabolizam pod utjecajem aktivnih endonukleaza dovode do stvaranja spojeva koje karakterizira dugi poluvijek .

Vezivanje MOE za proteine

Eksperimentalne studije su dokazale da fosforotioatni ASO sa 2"-MOE strukturama imaju manji afinitet za proteine ​​plazme u poređenju sa nemodifikovanim fosforotioatnim ASOs. Na primer, kada se pet MOE struktura doda na 3" krajeve prve generacije fosforotioatnih disociracionih konstanti za ODN, albumini se povećavaju sa oko 18 na oko 40 µM. Istovremeno, u ASO strukturi koja je potpuno zamijenjena MOE, afinitet za proteine ​​plazme samo se neznatno smanjuje. Zašto povećanje broja MOE struktura u oligonukleotidu ne utiče na dalje smanjenje afiniteta za proteine ​​plazme nije jasno, ali to može biti zbog posebnosti sekundarne strukture ASO.

Smanjenje afiniteta proteina povezanog sa MOE strukturama može se objasniti određenim fizičkim svojstvima. Možda najznačajniji fizički faktor koji razlikuje MOE-modificirane ASO od nemodificiranih je prisustvo molekularne ljuske vode, koja proizlazi iz MOE bočnog lanca. MOE supstituenti u ugljikovodičnom skeletu "keliraju" molekule vode (i eventualno metalne ione), formirajući vodenu ljusku i smanjujući potencijalni kontakt između "ljepljivih" molekula sumpora i plazme ili ćelijskih proteina. Stepen vezivanja ASO za proteine ​​u obrnutoj je korelaciji sa njihovim izlučivanjem urinom. Uvođenje fosforotioatnih veza i 2"-MOE supstituenata mijenja vezivanje proteina i, kao rezultat, mijenja svojstva ASO.

Apsorpcija, distribucija, metabolizam i izlučivanje ASO

Usisavanje

Parenteralni put primjene ASO

Istraživanja su utvrdila da je zbog molekularne težine (oko 7000 D) i negativnih naboja ASO, apsorpcija ovih lijekova iz gastrointestinalnog trakta ograničena. Zbog toga se obično koristi parenteralni način primjene. Za davanje lijekova prve generacije koriste se potkožna, intravenozna infuzija ili intravitrealne injekcije. Niža proinflamatorna aktivnost ASO druge generacije čini ih pogodnijim za supkutanu primjenu. Farmakokinetika ovih lijekova u plazmi nakon supkutane injekcije i intravenske infuzije je uporediva. Studije na laboratorijskim životinjama pokazuju da je, u konačnici, distribucija ASO također uporediva u različitim organima, s izuzetkom mjesta ubrizgavanja i limfnih čvorova.

Nakon supkutane primjene, i prva i druga generacija ASO se brzo apsorbiraju sa mjesta injekcije u sistemsku cirkulaciju. U kliničkim studijama nakon subkutane primjene ASO druge generacije, vrijeme do postizanja maksimalne koncentracije (Tmax) kretalo se od 1,5 do 4,7 sati u rasponu doza od 25 do 200 mg pri konstantnoj zapremini od 1 ml. Bioraspoloživost subkutane doze kreće se od 36 do 82% primijenjene doze. Pretkliničke i kliničke studije ukazuju na to da se bioraspoloživost ASO povećava na način koji ovisi o koncentraciji.

Kinetika ASO na mestu injekcije može uticati na lokalni odgovor, kao i na njihovu sistemsku kinetiku i distribuciju. Smanjenje koncentracije ASO na mjestu injekcije hipotetički smanjuje lokalni odgovor na injekciju. Jedan pristup smanjenju koncentracije ASO na mjestu injekcije je razrjeđivanje otopine i, kao rezultat, povećanje površine apsorpcije iz potkožnog depoa. Teoretski, razrijeđene otopine i veća površina apsorpcije trebali bi smanjiti lokalne koncentracije i smanjiti lokalne reakcije. Isti efekti bi se očekivali povećanjem sistemske apsorpcije. Stoga se promjene u dozi i volumenu mogu smatrati potencijalnim varijablama. Međutim, čak i danas, potkožne injekcije s malim volumenom i relativno visokim koncentracijama pokazuju visoku bioraspoloživost korištenog materijala.

Lokalna uprava ASO

Studija različitih metoda primjene ASO pokazuje da se aerosolni oblici, rektalna primjena i intravitrealne injekcije koriste kao sredstva za lokalnu primjenu. Za liječenje plućnih bolesti, pomoću aerosola moguće je stvoriti relativno visoke koncentracije ASO u plućima.

Kinetika prve generacije ODN je proučavana na miševima. Utvrđeno je da kinetika takvih lijekova ovisi o dozi, klirens je plućni s poluživotom od oko 2 sata. Nasuprot tome, studije druge generacije MOE-modificiranih ASO-a pokazuju da je njihov poluživot više od 4 dana. Kao i kod drugih lokalnih tretmana, prednost inhalacije je sposobnost stvaranja visokih lokalnih koncentracija u tkivima koja inače ne akumuliraju korištene tvari. ASO se obično ne akumuliraju u plućima nakon parenteralne primjene. Lokalna primjena također rijetko uzrokuje sistemske efekte. Na primjer, kada je ASO primijenjen majmunima u dozi od 0,1 mg/kg putem inhalacije (tri doze tokom 1 sedmice), koncentracija lijeka u plućima bila je približno 1 μg/g. Ali kod ovih istih majmuna, koncentracije u jetri i bubrezima bile su približno 5% koncentracija u plućima, što ukazuje na značajno manji sistemski učinak.

Podaci iz literature pokazuju da se rektalna primjena ASO uspješno koristi za liječenje ulceroznog kolitisa. Za razliku od inhalacija, gdje se mogu koristiti male količine primijenjene supstance, klistir koji se koristi za liječenje može sadržavati do 240 mg supstance prve generacije (alikaforsen). U ovom slučaju, epitel rektuma je izložen primijenjenoj supstanci, međutim, zbog slabe permeabilnosti visoko nabijenog ODN-a, primjećuje se minimalna apsorpcija lijeka, kao i ukupni sistemski učinak. Proračuni pokazuju da je koncentracija ASO u crijevnom epitelu 12 sati nakon primjene 20 μg/g. Bioraspoloživost kod ljudi kreće se od 0,03 do 2,14%, a maksimalna koncentracija ASO koja se može detektirati u plazmi je samo 0,126 μg/ml. Odsustvo značajne sistemske apsorpcije i visoka lokalna koncentracija lijeka imaju pozitivan učinak na liječenje.

Provedena je studija intravitrealnih injekcija ASO lijekova prve i druge generacije. U tom slučaju, tvari se ubrizgavaju u oko u vrlo malim količinama. Zbog izolacije mjesta ubrizgavanja, sistemski efekti lijeka su smanjeni u još većoj mjeri. U oko, staklasto tijelo i retinu, ASO ulazi različitom brzinom: staklasto tijelo ulazi brže u odnosu na retinu. I lokalni metabolizam i difuzija iz oka doprinose eliminaciji lijeka. Kao što je već napomenuto, zbog malih količina, sistemski efekat primenjenog leka je minimalan. Međutim, mehanizam sistemske distribucije sličan je većini drugih lijekova.

Enteralna primjena ASO

Zapažena stabilnost ASO druge generacije na nukleaze osigurava stabilnost lijeka u crijevima, što omogućava njegovu dalju apsorpciju. Međutim, molekularna veličina i naboji ASO ograničavaju apsorpciju lijeka. Nakon apsorpcije iz crijeva, kinetika ASO je slična onoj nakon parenteralne primjene. Iako je jetra jedno od glavnih mjesta akumulacije ASO, efekat prvog prolaska kroz jetru nije važan faktor koji utječe na kinetiku lijeka ASO.

Distribucija ASO u tijelu

Uloga perfuzije i afiniteta tkiva

Distribucija ASO i drugih lijekova ovisi o permeabilnosti, intenzitetu opskrbe krvlju, vezivanju za proteine ​​plazme, tkiva i stanice. Pokazalo se da distribucija u tkivu fosforotioatnih ASO prve i druge generacije sa višestrukim negativnim nabojem i njihovim vezivanjem za proteine ​​najmanje ovisi o opskrbi krvlju, a mnogo više o faktorima koji utiču na njihov transport u ćeliju.

Unutrašnja distribucija iz plazme u tkivo je relativno brza, sa poluživotom eliminacije od 30-90 minuta nakon intravenske primjene. Poluživot ASO nakon supkutane primjene je duži nego nakon i.v. Ova razlika je zbog vremena potrebnog za apsorpciju, a ne zbog drugih farmakokinetičkih razlika.

Studija kinetike lijekova prve i druge generacije primijetila je male razlike. Veća stabilnost na ASO nukleaze druge generacije kompenzira se njihovim slabijim vezivanjem za proteine. Uz to, farmakokinetički profili lijekova 1. i 2. generacije su slični ili se gotovo ne razlikuju kada se zbir nativnog ASO i njegovih metabolita (ukupni ASO) prve generacije uporedi s intaktnim lijekom druge generacije (ISIS 13650 ). Inače, brže uništavanje ASO egzonukleazama bi skratilo poluživot lijekova prve generacije u odnosu na lijekove druge generacije. Distribucija lijekova obje generacije ovisi o dozi.

Kao što je gore navedeno, nakon apsorpcije s mjesta injekcije ili crijeva, ASO se vezuju za proteine ​​plazme. Dva proteina plazme koja specifično vezuju fosforotioatne ASO su albumin i alfa-2-makroglobulin. Još jedan uobičajeni protein, kiseli glikoprotein ne vezuje ASO. Vezivanje za proteine ​​je veoma važno za distribuciju ASO u ciljno tkivo. Hemijske strukture koje smanjuju vezivanje dovode do primjetnog smanjenja koncentracije lijeka u tkivima, povećavaju stupanj njegove filtracije kroz bubrežne glomerule i izlučivanje u urinu. Ovaj fenomen se može uočiti kada se koriste ASO sa diesterskim vezama u skeletu lijeka ili u prisustvu MOE strukture. Smanjenje afiniteta diestera i MOE struktura (ili oboje) za proteine ​​omogućava ASO da slobodnije cirkuliše u krvotoku, što dovodi do intenziviranja njegovog izlučivanja u urinu.

U svim studijama sa parenteralno davanim ASO prve i druge generacije, nismo primetili linearni klirens ASO iz plazme. Klirens se smanjivao sa povećanjem doze lijeka, te je stoga njegova bioraspoloživost bila veća nego što bi se očekivalo na osnovu primijenjene doze. Budući da je početni klirens posljedica distribucije ASO u tkivima i da je uočena apsorpcija lijeka u tkiva, može se pretpostaviti da su ona zasićena ASO. Proučavanje procesa zasićenja kao rezultat primjene ASO može se provesti korištenjem jetrenih fagocita. Kada vezivanje ASO za Kupfferove ćelije dostigne zasićenje, počet će smanjenje afiniteta. Naknadno davanje ASO miševima poboljšava distribuciju ASO u nefagocitnim ćelijama jetre, što rezultira poboljšanom farmakološkom aktivnošću u hepatocitima u poređenju sa kontrolama. Suprotno tome, pri koncentracijama u plazmi ispod 1 μg/ml, ASO se aktivnije vezuju za Kupfferove ćelije i manje se akumuliraju u hepatocitima.

Studija procesa vezivanja ASO za proteine ​​plazme pokazala je da je ovaj efekat praćen brzom distribucijom kompleksa u tkivima preko površine ćelije. Iako tačni mehanizmi ćelijskog vezivanja nisu utvrđeni, može se pretpostaviti da se ASO vežu za proteine ​​plazme ili za ćelijske proteine ​​sve dok postoje slobodna mjesta vezivanja. Vezani ASO se zatim distribuiraju duž gradijenta koncentracije preko ćelijske membrane razmjenom ekstracelularnog proteina za intracelularni protein.

Dakle, pokretačka sila za ulazak ASO u ćelije je koncentracijski gradijent. Opisano je kretanje ASO između citoplazme i jezgra. Sve u svemu, jasno je da vezivanje proteina olakšava kretanje ASO-a kroz barijere koje bi normalno inhibirali kretanje hidrofilnih, visoko nabijenih molekula. Ovaj šatl mehanizam za kretanje kroz membrane ostaje hipoteza za ASO, ali je prethodno opisan za organometalna jedinjenja. Transport ASO iz ekstracelularnog matriksa u intracelularni prostor vizualizovan je u jetri miša primenom imunohistohemijskih metoda i u bubrezima pacova pomoću vitalne mikroskopije sa fluorescentnom oznakom za drugu generaciju ASO (S. Henry, B. Molitoris).

Identitet proteina koji kontrolišu transport ASO iz ekstracelularnog u intracelularni prostor nije poznat, ali se veruje da se vezivanje kompleksa protein-ASO za ćeliju vrši pomoću fagocitnog receptora. Budući da fagociti, kao što su Kupfferove ćelije, tkivni makrofagi i ćelije proksimalnih tubula, imaju visok afinitet za ASO, može se razmišljati o mogućnosti pronalaženja takvih receptora na njihovoj ćelijskoj površini.

Međutim, ćelijska distribucija i farmakodinamika ASO kod transgenih miševa kojima nedostaje fagocitni receptor SR-A I/II nisu se razlikovali od onih kod kontrolnih singenih životinja. Stoga se čini da ovaj receptor, poznat kao Scavenger receptor, nije odgovoran za unos kompleksa u jetru i bubrege. Uloga drugih akceptorskih struktura uključenih u procese endocitoze kompleksa ASO-protein nije proučavana.

Membranski proteini koji funkcionišu kao transporteri , prisutan u svim organizmima. Glavni transporteri droge su: ABC ( ATP-vezujući transporteri kaseta) i SLC (porodica nosača rastvorenih materija). Poznato je da je brzina prijenosa tvari kroz biološke membrane pomoću procesa posredovanih transporterima karakterizirana zasićenjem. Opisano je nekoliko članova porodice SLC sa poznatim funkcijama , uglavnom za transport nukleozida, nukleozidnih šećera i fosfatnih šećera. Vjeruje se da će se buduća istraživanja najvjerovatnije baviti procesima intermembranskog transporta ASO.

Jasno je da pored gore navedenih razlika u akumulaciji stvorenih struktura od strane različitih organa i tkiva i zavisnosti klirensa i distribucije takvih jedinjenja od njihove doze, na raspodelu ASO u tkivima utiču transportni sistemi, karakteristike krvotoka pojedinaca, moguće vrijeme boravka lijeka u tijelu i, konačno, zasićenost ASO tkiva. Uprkos značajnoj ulozi ovih faktora u procesima tkivne distribucije ASO, smatra se da je početno vezivanje ASO za površinu ćelije jedan od odlučujućih faktora u analiziranim mehanizmima. Ovaj zaključak se zasniva na činjenici da su jetra i bubrezi početna mjesta vezivanja ASO, uz nešto dodatnog nakupljanja u prva 24 sata nakon primjene ASO. Prilikom proučavanja parametara distribucije ASO u jetri i bubrezima, pokazano je frakciono povećanje koncentracije lijeka u organima tijekom prva 24 sata. Ovo se dešava tokom perioda ćelijske i subćelijske redistribucije ASO, ali bi se pretpostavljalo da bi organi primarne distribucije trebali akumulirati više supstance tokom vremena zbog većeg afiniteta ovih organa za ASO. Proteini odgovorni za ovaj afinitet mogu sadržavati mjesta vezanja slična heparinu za laminin i fibrinogen, te faktor rasta fibroblasta (FGF). Rana interakcija ASO sa ćelijom može biti posljedica vezivanja ovih proteina, ali priroda ovih proteina, kao što je gore navedeno, slabo je proučavana.

Uzimajući u obzir značaj kombinacije specifičnih mjesta vezivanja ASO za ćelije u distribuciji lijeka u tijelu, treba napomenuti tako važan faktor kao što je različita opskrba krvlju u različitim organima, čija sposobnost da utiče na različitu distribuciju fosforotioat ASO je očigledan. Prema različitim autorima, rad sa desetinama serija supstanci i prve i druge generacije ukazuje na njihovu sličnu distribuciju, i primetno sličnu distribuciju kod jedinki različitih vrsta. Bubrezi, jetra, limfni čvorovi, slezena i koštana srž su organi koji akumuliraju najveće količine ASO i njihovih metabolita. Činjenica da pluća i srce ne akumuliraju ASO ukazuje na to da za objašnjenje izražene akumulacije ASO u jetri i bubrezima nije dovoljno samo jedno objašnjenje njihove dobre prokrvljenosti. Na primjer, područja s najboljom cirkulacijom krvi u bubrezima su glomeruli, a to nisu područja koja sadrže najviše ASO. Naprotiv, u proksimalnim tubulima cirkulacija krvi je manje aktivna. Međutim, stanice proksimalnih tubula karakteriziraju se velikim brojem aktivno fagocitnih stanica i akumuliraju slobodne ASO, kao i ASO vezane za proteine ​​koji se obično reapsorbiraju u proksimalnim tubulima. Kao rezultat toga, korteks bubrega i proksimalni tubularni epitel sadrže najveću koncentraciju fosforotioatnih ASO, kako prve tako i druge generacije.

Također treba napomenuti da je opskrba krvlju (ml/g tkiva) jetre približno 20% od one u bubrezima. 4-5 puta razlike u perfuziji između bubrega i jetre ne dovode do 4-5 puta razlike u koncentracijama ASO u ovim organima. Fenestrirane kapilare povećavaju površinu kontakta ASO s krvotokom i stoga to može nadoknaditi nedovoljnu perfuziju jetre u odnosu na bubrege.

Vezivanje ASO za proteine ​​plazme tokom distribucije

Iako ćelijska zasićenost ASO na kraju utječe na njihovu distribuciju organa, vezivanje ASO za proteine ​​plazme može promijeniti distribuciju bubrega i jetre u različitim serijama. Postoje serijske razlike u vezivanju proteina. Sa smanjenjem vezivanja ASO za proteine ​​plazme, smanjuje se njihova akumulacija u jetri, a povećava se u bubrezima. I obrnuto, s većim vezanjem, koncentracija slobodnog ASO u krvotoku bit će u manjim količinama, manje će se akumulirati u bubrezima, a više u drugim organima. Postoji inverzna veza između stepena vezivanja ASO za proteine ​​i njihove akumulacije u bubrezima pacova i majmuna nakon ponovljene intravenske i supkutane primjene.

Vezivanje za proteine ​​može se koristiti kao kriterij za odabir ASO-a za klinička ispitivanja. Do danas, određivanje vezivanja za proteine ​​je empirijski proces bez načina da se predvidi koja će se serija više ili manje vezati za proteine.

Distribucija ASO-a između ostalih tijela

Bez obzira na redoslijed distribucije fosforotioatnih ASO prve i druge generacije, uočen je karakterističan obrazac lokalizacije ovih lijekova u bubrezima i jetri, kao iu slezeni i limfnim čvorovima, kostima i u citoplazmi adipocita. Akumulacija ASO u limfoidnom tkivu može se dijelom objasniti fagocitnom aktivnošću histiocita i drugih mononuklearnih ćelija. Moguće je vizualizirati ASO u fagolizosomima histiocita i tkiva makrofaga pomoću bojenja hematoksilinom. Pokazalo se da ASO podliježu endocitozi, da su lokalizirani u endosomima i pohranjeni unutar ovih struktura. Koncentracija ASO u fagolizosomima je često takva da se može odrediti bojenjem hematoksilinom (slično kao nuklearna DNK). ASO u fagolizosomima vjerovatno čini većinu ASO akumuliranog u slezeni i limfoidnim organima. Pored toga, fagocitno aktivne ćelije kostiju i koštane srži akumuliraju ASO u tim tkivima, što je dokazano prisustvom bazofilnih granula u njihovim ćelijama.

Mišići (i skeletni i srčani) ne sadrže značajne količine ASO. Međutim, pažljivo ispitivanje mišića imunohistohemijskim ili autoradiografskim metodama otkriva sadržaj ASO u fagolizosomima makrofaga u mišićnoj stromi, a ta akumulacija se može djelomično odraziti na mjerenje koncentracije ASO u mišićima i srcu.

Akumulacija ASO u citoplazmi adipocita je značajna sa terapeutske tačke gledišta. Posebno zato što su, za razliku od većine supstanci akumuliranih u adipocitima, ASO hidrofilni. Imunohistohemijske metode jasno pokazuju da se ASO nalaze u citoplazmatskoj frakciji adipocita, dok ASO gotovo da nema u masnoj vakuoli. Intenzitet bojenja ukazuje na značajno nakupljanje supstance u citoplazmi. Na primjer, kod majmuna nakon 13 sedmica tretmana ISIS 113715 u dozi od 10 mg/kg sedmično, koncentracija u jetri bila je 301 ± 88,1 μg/g, ali samo 37,3 ± 14,4 μg/g u masnom tkivu u iste životinje.

S obzirom da nemasna komponenta čini 10% ukupne mase masti, korekcija koncentracije ASO uzimajući u obzir ovaj pokazatelj ukazuje na uporedivost njegove koncentracije sa onom u jetri. Značajne koncentracije ASO u adipocitima ukazuju na to da se mogu koristiti za liječenje genetskih bolesti ove vrste stanica: izvora hormona i citokina. Tako je utvrđeno da se farmakološki aktivne koncentracije ASO bilježe u adipocitima miševa kada se lijek ISIS 113715 primjenjuje u dozi od 25 mg/kg dva puta sedmično i smanjuje ekspresiju ciljnog gena PTP-1B kako u jetri i u adipocitima. Slična zapažanja su obavljena kod majmuna tretiranih ASO ISIS 113715. Budući da se biopsije potkožne masti mogu izvoditi u kliničkom okruženju i budući da se aktivni ASO akumuliraju u masti, moguće je koristiti mast za biopsiju i direktno mjeriti farmakološke efekte (smanjenje mRNA ) i tkivnu koncentraciju lijeka u ljudskim tkivima.

Fosfotioatni ASO se takođe distribuiraju u druga tkiva. Imunohistohemijske studije pokazuju da endotelne ćelije akumuliraju ASO u koncentracijama koje su značajne za smanjenje nivoa mRNA, što ih čini potencijalnom metom za farmakološku intervenciju. U nekim tkivima njihove koncentracije nisu dovoljno visoke da bi proizvele farmakološki učinak. Na primjer, zreli limfociti ne akumuliraju ASO, a antisens aktivnost je ograničena T stanicama.

Koštane ćelije, posebno fagocitno aktivni osteoblasti, mogu akumulirati ASO i ovaj efekat se može koristiti u terapeutske svrhe. Osim toga, ćelije otočića pankreasa također akumuliraju ASO. I prva i druga generacija ASO su visoko nabijene hidrofilne molekule koje ne prodiru u krvno-moždanu ili krvno-testisnu barijeru. Međutim, kao iu mišićima, makrofagi koji sadrže ASO koji se mogu detektirati lokalizirani su u intersticijumu testisa. Jajnici nisu odvojeni barijerom, tako da se ASO može kvantitativno izmjeriti u jajnicima i vizualizirati imunohistohemijom u stromi.

Ograničena distribucija ASO iz plazme u moždane stanice i kardiomiocite čini ova tkiva malo vjerojatnim metama antisens intervencije, iako selektivna inhibicija ili ekspresija određenih proteina ionskih kanala u mozgu i mišićima može biti terapeutski korisna. Međutim, ograničena distribucija ASO u ovim tkivima može se smatrati prednošću. Odsustvo značajnih koncentracija ASO u mozgu i srcu smanjuje rizik od oštećenja centralnog nervnog sistema (CNS) i smanjuje pojavu štetnih srčanih efekata. Kao što je ranije navedeno, direktna primjena u CNS strukture, posebno mozak, putem intratekalne, intraventrikularne infuzije ili injekcije uzrokuje distribuciju ASO kroz centralni nervni sistem i može biti terapeutski korisna.

Tokom trudnoće, fetus je prilično dobro zaštićen od djelovanja antisens lijekova. Studija transplacentalne kinetike ASO nije otkrila njegovu akumulaciju u fetusu; uočen je nizak nivo ASO u posteljici kod glodara. Ovi rezultati su dosledno replicirani u studijama teratogenosti različitih ASO druge generacije kod miševa, pacova i zečeva. Posteljica, uprkos visokoj perfuziji, nije organ sa velikom akumulacijom ASO.

Općenito, prikazane činjenice pokazuju da je distribucija ASO jedan od ključnih faktora koji određuje ozbiljnost aktivnosti ASO. Čini se da su razlike u distribuciji ASO uglavnom povezane s tropizmom tkiva za ove lijekove i, u manjoj mjeri, s perfuzijom.

Metabolizam

Antisens lijekovi prve i druge generacije metaboliziraju se nukleazama, a ne oksidaznim sistemima kao što je citokrom P450, koji metabolizira konvencionalne lipofilne lijekove malih molekula. ASO nisu ni supstrat izoenzima citokroma P450, niti induciraju ili inhibiraju njegovu aktivnost u klinički relevantnim koncentracijama. Cijepanje ASO-a posredovano egzonukleazom, što je glavni put za metabolizam i klirens prve generacije fosforotioatnih ODN-a, sekundarno je u odnosu na ASO druge generacije. Aktivnost egzonukleaze ograničena je sa dva fragmenta: jednim MOE na kraju od 3" i drugim MOE na kraju od 5".

Enzimi odgovorni za metabolizam ASO

Nisu poznati specifični enzimi koji metaboliziraju ASO druge generacije. Nukleaze su sveprisutno raspoređene i moguće je otkriti degradirane ASO metabolite u većini tkiva. Homogenati jetre i bubrega su sposobni za metabolizam druge generacije ASO in vitro bez dodavanja egzogenih izvora energije kao što su nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) ili adenozin 5-trifosfat (ATP). Početno cijepanje rezultira dva proizvoda, svaki karakteriziran 5" i 3" MOE zaštićenim krajem. Ovi metaboliti se ne vezuju za proteine ​​i tako se izlučuju iz tkiva. Budući da se metaboliti uklanjaju brže nego što se formiraju, gotovo da nema nakupljanja metabolita u tkivima. Dakle, nije moguće koristiti određivanje količine metabolita u tkivu kao indeks ASO metabolizma u tkivima.

Budući da brzina eliminacije ASO iz tkiva zavisi od njihovog metabolizma, razlike u metabolizmu ASO u različitim tkivima mogu se procijeniti na osnovu poluživota ovih lijekova iz okarakteriziranih tkiva. Na osnovu podataka za četiri ASO druge generacije, zaključuje se da je ponašanje pripadnika ove klase slično, ali postoje male razlike u njihovom poluživotu u jetri i bubrezima majmuna tretiranih 4-13 sedmica. Pokazalo se da je poluživot ASO lijekova ISIS 104838 i 112989 iz jetre i bubrega vrlo sličan. Ovi podaci sugeriraju da za neke serije ASO ne postoje značajne razlike u metaboličkim stopama u različitim organima. Međutim, pronađene su razlike u poluživotu tkiva za ISIS 107248, 113715 i 301012. Uočene razlike u brzini metabolizma ASO lijekova u jetri i bubrezima ukazuju na to da mogu postojati razlike u brzini metabolizma u različitim tkivima, ili složeniju kinetiku za neku seriju lijeka, ili dobijeni rezultati jednostavno odražavaju mali broj uzoraka uzetih u ograničenom vremenu.

Detaljna studija procesa eliminacije ASO druge generacije pokazuje prisustvo različitih brzina njihove eliminacije iz različitih tipova ćelija jetre. Budući da neki tipovi ćelija, kao što su bubrežne kortikalne proksimalne tubularne ćelije, imaju tendenciju da sadrže ASO u fagolizosomima, ovaj tip preuzimanja je vjerovatno odgovoran za razlike u brzinama metabolizma lijekova u tkivima. Osim toga, vjerovatno je da se specifične sekvence u strukturi ASO skeleta mogu karakterizirati različitom osjetljivošću na cijepanje endonukleazama.

Bakterijske egzonukleaze pokazuju visok stepen specifičnosti nukleotidne sekvence u ASO kičmi, vjerovatno za zaštitu od virusa. Većina aktivnosti nukleaze u stanicama sisara povezana je s transkripcijom i mehanizmima popravke DNK, pa se specifičnost vrste sisara može razlikovati od bakterijskih endonukleaza. Nije poznato da li su procesi replikacije i djelovanje enzima povezanih s fenomenom reparacije jednako odgovorni za katabolizam ovih sintetičkih ASO. Pri visokim koncentracijama ssDNK, ASO se mogu efikasno takmičiti sa prirodnim supstratom. Mnogi enzimi iz porodice nukleaza su sposobni da kataboliziraju ASO. Identifikacija specifičnih enzima uključenih u metabolizam ASO nije kritična za razvoj antisens lijekova, ali će bolje razumijevanje metaboličkih puteva biti korisno za razvoj novih tehnologija.

ASO metaboliti

Razlike u metabolizmu prve i druge generacije ASO su vrlo očigledne kada se uporedi metabolički profil sa CGE. Kada se uzorci tkiva ili urina analiziraju u LC/MS detektoru, priroda metaboličkih procesa postaje jasnija. Obično se fosforotioatni ODN prve generacije metaboliziraju u kaskadu ASO metabolita, od kojih se svaki razlikuje za jedan nukleotid kao rezultat cijepanja egzonukleaze od jednog nukleotida. Dakle, nakon uvođenja 20-mer, odnosno koji se sastoji od 20 nukleotida, prva generacija ODN-a, plazme i tkiva sadrže porodice sekvencijalno skraćenih ASO-a, počevši od 19-mera pa sve do kratkog ASO-a.

Početno cijepanje u drugoj generaciji ASO metabolizma posredovano
endonukleaze, dovodi do formiranja dva ASO-a, jedan sa 3" krajem MOE i drugi sa 5" krajem MOE. Cepanje proizvoda sa otvorenim krajevima može se izvesti ili 5" egzonukleazom ili 3" egzonukleazom. Rezultati kombinovane aktivnosti endo- i egzonukleaze su kaskada produkata cijepanja skraćenog lanca, od kojih se mnogi, ako ne i svi, mogu otkriti u urinu prikupljenom od test životinja ili ljudi. Urin životinja liječenih lijekom ili pacijenata liječenih ASO druge generacije može sadržavati metabolite koji se kreću od dva moguća 15-mera do dva moguća MOE 5-mera i višestruke kombinacije svakog intermedijarnog metabolita.

Metaboliti kraći od dužine MOE krajeva biće prisutni u tkivima ako su MOE krajevi sami supstrati za nukleaze. Ovi metaboliti se tipično ne otkrivaju analizom masenog spektra, što sugerira da obično nema MOE mononukleotida koji se oslobađaju tokom metabolizma. Međutim, postoje neki izuzeci od ove generalizacije. Za ograničen broj nukleotidnih sekvenci , u tkivima i plazmi uočeno je jednonukleotidno obrezivanje ASO druge generacije – ili CGE ili LC/MS: činilo se da su metaboliti rezultat digestije egzonukleaze. Ovi metaboliti se mogu uočiti u početnoj distribuciji. Očekuje se da će se brzo pojaviti u krvnoj plazmi. MOE mononukleotidi koji nastaju tokom metabolizma nisu supstrati za fosforilaciju, pa je malo vjerovatno da će biti ugrađeni u nukleotidne trifosfate i, konačno, u endogene nukleotide. MOE mononukleotidi ne inhibiraju enzime odgovorne za sintezu DNK. Stoga, MOE mononukleotidi, ako se formiraju, ne bi trebali biti ugrađeni u endogene nukleotide.

Centralni dio ASO deoksinukleotida druge generacije je podložan cijepanju egzonukleaze, što rezultira oslobađanjem jednog nukleotida. Monodeoksinukleotidi, koji nastaju digestijom egzonukleaze, identični su endogenim nukleotidima, sa izuzetkom tiofosfatne grupe koja bi teoretski mogla biti prisutna. Međutim, tiofosfatna grupa je labilna na oksidaciju i gubitak sumpora, čineći terminalnu fosfatnu grupu identičnom endogenim nukleotidima. Stoga, za razliku od MOE mononukleotida, svaki oslobođeni deoksinukleotid će prirodno biti uključen u intracelularno skladište endogenih nukleotida. Nukleotidi koji zadržavaju tiofosfatne grupe bit će supstrati za dodavanje jedne ili dvije fosfatne grupe, što rezultira miješanim nukleotidnim tiofosfatnim di- ili trifosfatom. Fosforilacija je moguća, ali prisustvo alfa tiofosfata čini reakcije termodinamički nepovoljnim.

Zaključak

Očigledna je relevantnost proučavanja farmakokinetike podataka i lijekova sličnih opisanim, kao i kreiranja modela na različitim životinjskim vrstama za potpuno razumijevanje procesa koji se dešavaju u tijelu nakon uzimanja lijekova. Istraživanja o sličnim lijekovima također su u toku u Rusiji.

Književnost

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. Ispitivanje faze I ISIS 2503, antisens inhibitora H-ras, u kombinaciji sa gemcitabinom kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom. // Clin. Cancer Res. 2003. Vol. 9, br. 1. P. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) je protein koji se vezuje za ODN. //Nat. Med. 1997. Vol. 3, br. 4. P. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Vezivanje fosforotioatnih ODN-a za osnovni faktor rasta fibroblasta, rekombinantni rastvorljivi CD4, laminin i fibronektin nezavisno od P-kiralnosti. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol. 23, br. 21. P. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. In vitro sudbina fosforotioatnih antisens ODN-a: dominantno preuzimanje od strane receptora hvatača na endotelnim ćelijama. // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25, br. 16. P. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Modulacija vezivanja za proteine ​​plazme i in vitro apsorpcija fosforotioatnih ODN ćelijama jetre konjugacijom holesterola. // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28, br. 14. P. 2717.

6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Učinak fosforotioatne modifikacije ODN-a na specifično vezivanje proteina. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, br. 43. R. 26801.

7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. Fosforotioatni ODN se slično distribuiraju kod nokautiranih receptora za hvatanje receptora A i kod miševa divljeg tipa. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. Vol. 292, br. P. 489.

8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Spinalna distribucija i metabolizam 2_-O-(2-metoksietil)-modificiranih ASO nakon intratekalne primjene kod pacova. // Neuroscience. 2005. Vol. 131, br. P. 705.

9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Ćelijska distribucija fosforotioatnih ODN-a u normalnim tkivima glodara. //Lab. Invest. 1997. Vol. 77, br. P. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Dispozicija 14C-obilježenog fosforotioata ASO ISIS 2105 nakon intravenske primjene pacovima. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. Vol. 267, broj 3. P. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Farmakokinetika 14C-obilježenog fosforotioata ASO, ISIS 2105, nakon intradermalne primjene pacovima. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. Vol. 269, br. P. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Farmakokinetička svojstva nekoliko novih analoga ASO kod miševa. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. Vol. 277, br. P. 923.

13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Inhibicija ekspresije embrionalnih gena zasnovana na ASO. //Nat. Biotechnol. 1999. Vol. 17. P. 1184.

14. Eckstein F. Fosforotioatni ODN-ovi: kakvo je njihovo porijeklo i šta je jedinstveno kod njih? //Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol. 10, br. 2. R. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. On-line HPLC elektrosprej masena spektrometrija fosforotioatnih ASO metabolita. //Anal. Chem. 1997. Vol. 69, br. P. 313.

16. Geary R.S. Trenutna procjena odnosa PK/PD za antisens terapije. // Svjetski kongres farmacije i farmaceutskih nauka, Nica, Francuska, 2002.

17. Geary R. S., Bradley J. D., Watanabe T. et al. Nedostatak farmakokinetičke interakcije za ISIS 113715, 2_-O-metoksietil modificirani antisens oligonukleotid koji cilja protein tirozin fosfatazu 1B glasničku RNA, sa oralnim antidijabetičkim jedinjenjima metforminom, glipizidom ili rosiglitazonom. // Clin. Pharmacokinet. 2006. Vol. 45, br. 8. P. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Farmakokinetika i metabolizam kod miševa fosforotioatnog ASO antisens inhibitora ekspresije C-raf-1 kinaze.// Drug Metab. Dispos. 1997. Vol. 25, br. 11. R. 1272.

19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Antisens oligonukleotidni inhibitori za liječenje raka: 1. Farmakokinetička svojstva fosforotioatnih ODN-a. // Anticancer Drug Des. 1997. Vol. 12, br. 5. R. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Nezavisna farmakokinetika plazme i tkiva za 3 antisens fosforotioatna ASOs: miš prema čovjeku. // u Američkom udruženju farmaceutskih znanstvenika, Pharm. Research, Plenum Press, Seattle, Washington. 1996. R. S.

21. Geary R. S., Teng C. L., Truong L. et al. Prvi prolaz jetrene ekstrakcije djelomično modificiranih himernih antisense oligonukleotida kod pasa Bigl. // na godišnjem sastanku Američkog udruženja farmaceutskih znanstvenika, Indianapolis, IN, 2000. str. 216.

22. Geary RS, Ushiro-Watanabe T, Truong L et al. Farmakokinetička svojstva 2_-O-(2-metoksietil)-modificiranih ASO analoga kod pacova. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 296, broj 3. R. 890.

23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Farmakokinetika fosforotioatnih antisens ODN-a. //Curr. Opin. Invest. Droge. 2001. Vol. 2, br. 4. R. 562.

24. Geary R. S., Yu R. Z., Watanabe T. et al. Farmakokinetika faktora nekroze tumora-alfa fosforotioat 2_-O-(2-metoksietil) modificiranih antisens oligonukleotida: poređenje među vrstama. // Drug Metab. Dispos. 2003. Vol. 31, br. 11. P. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y., Membranski transporteri i odgovor na lijekove, u Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11. izdanje, Brunton, L.L., ur., McGraw-Hill, New York, 2006. P. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Uništavanje citoprotektivnog gena, klasterina, radi povećanja hormonske i hemosenzitivnosti kod raka prostate i drugih karcinoma. //Ann. NY Acad. Sci. 2005. Vol.1058. P. 1.

27. Gleave M., Miyake H. Upotreba antisens oligonukleotida koji ciljaju citoprotektivni gen, klaster, za povećanje androgen- i kemo-senzitivnosti kod raka prostate. // Svijet J. Urol. 23. 2005. br. 1. P. 38.

28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Faza I bezbjednost i farmakokinetički profil antisens ODN molekula intercelularne adhezije-1 (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. Vol. 282, br. R. 1173.

29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. In vitro distribucija i metabolizam fosforotioata ASO u jetri štakora nakon intravenske primjene. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. Vol. 286, br. P. 447.

30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Fosforotioatni ODN se vezuju za osnovni faktor rasta fibroblasta, inhibiraju njegovo vezivanje za receptore na ćelijskoj površini i uklanjaju ga sa vezivnih mesta niskog afiniteta na ekstracelularnom matriksu. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P.2620.

31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Efekti humanih i mišjih antisens oligonukleotidnih inhibitora ICAM-1 na reproduktivne performanse, razvoj fetusa i postnatalni razvoj kod miševa. // Urođene mane Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2004. Vol. 71, broj 6. P. 359.

32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. et al. Inhibicija ekspresije spinalne protein kinaze C alfa antisens oligonukleotidom smanjuje toleranciju izazvanu infuzijom morfina. // Neuroscience. 2002. Vol. 113, br. 1. P. 99.

33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Inhibicija angiogeneze antisens oligonukleotida za klasterin. // Angiogeneza. 2005. Vol. 8, br. 3. P. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Snažno smanjenje apolipoproteina B i kolesterola lipoproteina niske gustine kratkotrajnom primjenom antisens inhibitora apolipoproteina B. // Circulation. 2006. Vol. 114, br. 16. P. 1729.

35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodiferencijacija – učinak P kiralnosti oligo(nukleozid fosforotioata) na aktivnost bakterijske RNKaze H. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol.23, No.24. R. 5000.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Farmakokinetička svojstva fosforotioatnih ASO kod ljudi, u Antisense Research and Applications, 1. izdanje, Crooke, S. T., ur., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Usporedba farmakokinetike subkutane i intravenske primjene fosforotioatnog oligodeoksinukleotida kod majmuna Cynomolgus. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, No.6. R. 435.

38. Levin A.A. Pregled pitanja farmakokinetike i toksikologije fosforotioatnih antisens oligonukleotida. //Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol.1489, br. 1. R. 69.

39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Farmakokinetika i toksičnost fosforotioatnih ASO, u Biotechnology and Safety Assessment, 2. izdanje, Thomas, J. A., ur., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. P. 151.

40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Pretklinički razvoj antisens terapije, u Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, 1. ed., Oxender D.L. i Post L.E., ur., Springer-Verlag, Heidelberg, Njemačka, 1998., str. 131.

41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toksičnost antisens oligonukleotida. // u Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., ur., Marcel Dekker, New York, 2001. P. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Karakterizacija ASO transporta u žive ćelije. //Proc. Natl. Akad. Sci. SAD. 1989. Vol. 86. P. 3474.

43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Nukleocitoplazmatsko prebacivanje: novo in vitro svojstvo antisens fosforotioatnih ODN-a. // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28, br. 2. P. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Bioraspoloživost i terapijska aktivnost alikaforsena (ISIS 2302) koji se daje kao rektalni retencijski klistir subjektima s aktivnim ulceroznim kolitisom. // Ailment Pharmacol. Ther. 2006. Vol. 23, broj 10. R. 1427.

45. Mou T.C., Grey D.M. Visok afinitet vezivanja oligomera modifikovanih fosforotioatom za protein Ff gena 5 je umeren dodatkom C-5 propina ili 2_-O-metil modifikacija. // Nucl. Acids Res. 2002. Vol. 30, br. R. 749.

46. ​​Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Farmakokinetička svojstva fosforotioata kod životinja – apsorpcija, distribucija, metabolizam i eliminacija, u Antisense Research and Applications, 1. izdanje, Crooke, S. T., ur., Springer, Berlin, 1998. str. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Distribucija tkiva i fiziološki zasnovana farmakokinetika antisens fosforotioata ASO ISIS 1082 kod pacova. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2001. Vol. 11, br. 1. P. 15.

48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. et al. Farmakokinetika, metabolizam i eliminacija 20-mernog fosforotioata ODN (CGP 69846A) nakon intravenske i potkožne primjene. // Biochem. Pharmacol. 1997. Vol. 54, br. 6. R. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Dispozicija ASO u izolovanom perfuziranom bubregu štakora: uključenost receptora za čišćenje u njihovu bubrežnu apsorpciju. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. Vol. 279, br. P. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Faza I ispitivanja ISIS 104838, 2_-metoksietil modifikovanih antisens oligonukleotida koji ciljaju faktor tumorske nekroze-alfa. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. Vol. 303, br. 3. R. 1334.

51. Slim G., Gait M.J. Konfiguracijski definirani oligoribonukleotidi koji sadrže fosforotioat u proučavanju mehanizma cijepanja ribozima glave čekića. // Nucl. Acids Res. 1991. Vol. 19, br. 6. R. 1183.

52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Ćelijska asocijacija, unutarćelijska distribucija i efluks auranofina putem sekvencijalnih reakcija izmjene liganda. // Biochem. Pharmacol. 1986. Vol. 35, br. 6. P. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Distribucija fosforotioata ASO po majci i fetusu kod pacova nakon intravenske infuzije. // Urođene mane Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2006. Vol. 77, br. P. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Inhibicija deoksiribonukleaza pomoću fosforotioatnih grupa u oligodeoksiribonukleotidima. // Nucl. Acids Res. 1988. Vol. 16, br. 24. R. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Farmakokinetika i efekat prvog prolaza kroz jetru antisens oligonukleotida (ISIS 2302) kod pacova. // na godišnjem sastanku Američkog udruženja farmaceutskih znanstvenika, Indianapolis, IN, 2000. str. 216.

56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. Farmakokinetički i toksični profil fosforotioatnog ASO nakon inhalacijske isporuke u pluća kod miševa. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol. 10, br. 5. R. 359.

57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. Kristalna struktura i poboljšana antisens svojstva 2_-O-(2-metoksietil)-RNA. //Nat. Struktura. Biol. 1999. Vol.6, No.6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. Faza I/II studija LY900003, antisens inhibitora protein kinaze C-alfa, u kombinaciji sa cisplatinom i gemcitabinom kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom pluća ne-malih ćelija. // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10, br. 18 Pt 1. P. 6086.

59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Vezivanje antisens oligonukleotida za proteine ​​plazme koji cilja ljudski ICAM-1 (ISIS 2302). // ASOs. 2006. Vol. 16, br. P. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hidratacija jednolančanih fosfodiestarskih i fosforotioatnih oligodezoksiribonukleotida. // Nucl. Acids Res. 1996. Vol. 24, br. 16. R. 3261.

61. Wilson D.M. Treće, aktivnost abazične endonukleaze Ape1 regulirana je koncentracijama magnezija i kalija i otporna je na alternativne strukture DNK. // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 345, br. 5. P. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E. R., Roskey A. et al. Stereo-obogaćeni fosforotioati ODN: sinteza, biofizička i biološka svojstva. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Vol.8, No.1. R. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Razvoj ultraosjetljivog nekompetitivnog hibridizacijsko-ligacijskog enzimskog imunosorbentnog testa za određivanje fosforotioatnog ODN u plazmi. //Anal. Biochem. 2002. Vol. 304, br. 1. P. 19.

64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Poređenje farmakokinetike i dispozicije tkiva antisens fosforotioata ASO koji cilja humanu Ha-ras mRNA kod miša i majmuna. // J. Pharm. Sci. 2001. Vol. 90, br. 2. P. 182.

65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Primjena novih kvantitativnih bioanalitičkih metoda za farmakokinetičke i farmakokinetičke/farmakodinamičke procjene antisens oligonukleotida. //Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2004. Vol. 7, br. 2. R. 195.

66. Yu R. Z., Kim T. W., Hong A. et al. Farmakokinetičko poređenje unakrsnih vrsta od miša do čovjeka druge generacije antisens oligonukleotida ISIS 301012, usmjerenog na ljudski apolipoprotein B-100. // Drug Metab. Dispos. 2007. Vol. 35. P. 460.

67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. Farmakokinetika i farmakodinamika antisens fosforotioata ASO koji cilja Fas mRNA kod miševa. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 296, br. P. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillian J.M. et al. PTP1B antisens oligonukleotid snižava PTP1B protein, normalizira glukozu u krvi i poboljšava osjetljivost na inzulin kod dijabetičkih miševa. //Proc. Natl. Akad. Sci. SAD. 2002. Vol. 99, br. 17. P. 1137.

Lek za gene

Dugogodišnji san ljekara je da imaju na raspolaganju supstance koje bi djelovale na specifične gene, tj. uzroku mnogih bolesti. Zaista, na bazi takvih supstanci moguće je stvoriti lijekove - prave "čarobne metke" koji mogu napasti nasljedni materijal različitih infektivnih agenasa bez nanošenja štete ljudskom tijelu, kao i suzbiti aktivnost onkogena odgovornih za maligne bolesti. rast ćelija. Stvaranje takvih supstanci koje specifično utječu na genetski materijal jedan je od glavnih zadataka molekularne biologije, jer je uz njihovu pomoć moguće proučavati funkcije gena i, u konačnici, kontrolirati rad potonjih.

Ali kako možete promijeniti željeni genetski program? Uostalom, svi geni imaju sličan hemijski sastav i strukturu: razlike među njima se svode samo na redosled izmjenjivanja četiri monomerna bloka - nukleotida A, T, G, C. Da bi se utjecalo na određeni gen, molekula tvar mora nekako prepoznati ovu nukleotidnu sekvencu - zadatak je, na prvi pogled, nerješiv.

Ali grupa sibirskih hemičara koja je došla u Novosibirski akademski grad u prvim godinama njegovog nastanka mislila je drugačije. Zaposlenici Instituta za organsku hemiju Sibirskog ogranka Akademije nauka SSSR-a (Novosibirsk) N.I. Grineva i D.G. Knorre, na osnovu principa molekularnog prepoznavanja koji koristi sama priroda, formulirali su ideju ​usmjerenog utjecaja na gene koristeći oligonukleotide - fragmente nukleinskih kiselina, "naoružane" posebnom hemikalijom u grupama. Sibirski hemičari objavili su svoj prvi rad o oligonukleotidima 1967. godine - ovaj datum se danas smatra službenim datumom nastanka novog pravca u molekularnoj biologiji i farmakologiji.

Oni su bili prvi

Implementaciju ovog neobično hrabrog projekta (u to vrijeme nije bilo planova za sprovođenje ovakvog istraživanja nigdje u svijetu) u početnoj fazi izvela je mala grupa mladih zaposlenih, diplomiranih studenata i studenata NSU. Morali smo početi praktično od nule, jer u to vrijeme još nisu znali kako sintetizirati oligonukleotide u primjetnim količinama; Nije bilo tehničkih instrumenata potrebnih za rad sa malim količinama nukleinskih kiselina niti efikasnih metoda za određivanje njihove sekvence. Naši hemičari su uspeli da reše ove probleme zahvaljujući interdisciplinarnosti - jednom od principa koji su činili osnovu delovanja Sibirskog ogranka.

U NIOH je organizovana proizvodnja nukleinskih kiselina i razvijene metode za njihovu hemijsku modifikaciju; zajedno sa zaposlenima Instituta za nuklearnu fiziku, bilo je moguće napraviti instrumente za analizu nukleinskih kiselina i manipulaciju malim količinama istih, a zajedno sa hemičarima Moskovskog državnog univerziteta započeli su rad na stvaranju automatskih sintisajzera oligonukleotida. Kao rezultat toga, naučnici su imali na raspolaganju gotovo sve potrebne analitičke metode i instrumente - biološka istraživanja su mogla početi.

Eksperimenti izvedeni prvo na jednostavnim modelima, a zatim i na prirodnim nukleinskim kiselinama pokazali su da oligonukleotidi zaista stupaju u interakciju s ciljnim nukleinskim kiselinama s visokim stupnjem selektivnosti. U slučaju kada su reaktivne grupe vezane za oligonukleotide, dolazi do usmerene hemijske modifikacije meta – nukleinskih kiselina. Osim toga, po prvi put je pokazano da je uz pomoć ovih reagenasa moguće suzbiti virusne infekcije kod životinja, a dokazana je i mogućnost njihovog unošenja u organizam preko kože i sluzokože itd.

Rane publikacije o biološkim efektima oligonukleotida izazvale su veliko interesovanje stručnjaka širom svijeta. Godine 1988. u Akademgorodoku je održan prvi svjetski simpozijum o gensko ciljanim supstancama na bazi fragmenata nukleinske kiseline. U rad na stvaranju takvih lijekova uključili su se naučnici iz SAD-a, Francuske, a potom i drugih zemalja; Desetine kompanija su se pojavile sa ciljem stvaranja terapijskih lijekova na bazi oligonukleotida.

Komplementarna medicina

Prvi od lijekova ciljanih na gene bili su takozvani antisens oligonukleotidi, dizajnirani da selektivno inaktiviraju virusne RNK i neke ćelijske RNK. U početku se pretpostavljalo da će ovi oligonukleotidi imati reaktivne grupe vezane za njih, koje će kemijski modificirati ili uništiti ciljne nukleinske kiseline. Međutim, pokazalo se da vezanje oligonukleotida za samu ciljnu RNK ima tako veliki učinak na nju da može izazvati njeno uništenje od strane ćelijskih enzima.

D. G. KNORRE - akademik Ruske akademije nauka, specijalista u oblasti hemijske kinetike, molekularne biologije i bioorganske hemije. Šef Laboratorije za hemiju prirodnih polimera (1960-1984), Odeljenja za biohemiju i Laboratorije za hemiju nukleinskih kiselina (1970-1984) Instituta za organsku hemiju Sibirskog ogranka Akademije nauka SSSR, direktor Instituta za Bioorganska hemija Sibirskog ogranka Akademije nauka SSSR-a i Sibirskog ogranka Ruske akademije nauka (1984-1996). ) Antisens pristupi zasnovani na upotrebi nukleotida i nukleinskih kiselina za suzbijanje biološke aktivnosti nukleinskih kiselina obećavaju zanimljive izglede u slučajevima kada je potrebno suzbiti implementaciju neželjenih informacija u živim organizmima. Prije svega, otvara se perspektiva stvaranja nove generacije antivirusnih i antitumorskih lijekova. Takvi lijekovi imaju jednu neospornu prednost u odnosu na druge... Svi oligonukleotidi, bez obzira na cilj na koji su usmjereni, mogu se stvoriti pomoću jedne tehnologije. Potrebno je mijenjati samo sekvencu nukleotida. Konkretno, u virologiji i onkologiji se često mora suočiti s fenomenom rezistencije na lijekove. To se najčešće dešava zato što jedna virusna čestica ili jedna ćelija raka prolazi kroz mutaciju koja dovodi do takve rezistencije. U svakom drugom slučaju, morate započeti empirijsku potragu za novim lijekom. U slučaju antisens efekta, potrebno je samo utvrditi koja je promjena u strukturi virusnog genoma ili onkogena dovela do pojave rezistencije. Nakon toga odmah postaje jasno kako stvoriti novi lijek koristeći istu objedinjenu tehnologiju*.

* Soros obrazovni magazin. - 1998. - 12. - str. 25-31.

Pokazalo se da su najmoćnije sredstvo za "isključivanje" gena interferirajuće RNA - kratki dvolančani kompleksi RNA oligonukleotida. Kada se takav kompleks unese u ćeliju, jedan od lanaca se vezuje za njegovu komplementarnu sekvencu u ćelijskoj glasničkoj RNK. Ovo služi kao signal za početak grupe enzima koji režu RNK povezanu sa oligonukleotidima. Kao rezultat toga, program za sintezu određenog proteina nestaje.

Dva američka istraživača su 2006. godine dobila Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu za objašnjenje mehanizma interferencije RNK. Stvaranje regulatora ekspresije gena zasnovanih na interferirajućoj RNK otvorilo je velike mogućnosti za dobijanje širokog spektra visoko efikasnih netoksičnih lekova koji potiskuju ekspresiju gotovo svih gena, uključujući tumorske i virusne gene.

Ispravite mutacije

Pažnju stručnjaka već dugo privlače metode mutagenog djelovanja na DNK korištenjem oligonukleotida ili njihovih derivata. Ako bude uspješan, ono što danas izgleda kao naučna fantastika može postati stvarno: ispravljanje neispravnih genetskih programa.

Već je eksperimentalno dokazano da je korištenjem kratkih oligonukleotida moguće uvesti točkaste mutacije u genetske programe. Kako to učiniti? Mutageni oligonukleotidi koji sadrže "pogrešne" nukleotidne blokove unose se u ćeliju, gdje se spajaju sa DNK. Kao rezultat toga, u pojedinim dijelovima nukleotidnih sekvenci pojavljuju se “netačni”, odnosno nekomplementarni parovi baza, što sistem popravke (“popravke”) ćelijske DNK percipira kao oštećenje. Nukleotidi u takvom paru su zamijenjeni enzimima za popravku tako da on postaje "ispravan", komplementaran. U ovom slučaju može doći do zamjene kako u oligonukleotidnoj sekvenci tako iu samoj ćelijskoj DNK.

U potonjem slučaju radi se o promjeni genetskog programa, odnosno mutaciji. I iako je efikasnost takvog procesa mutacije općenito niska, može se koristiti u odnosu na nove ćelijske tehnologije. Na primjer, matične stanice pacijenta s nekim nasljednim poremećajem mogu se liječiti selektivnim mutagenom, a zatim se mogu odabrati, umnožiti i uvesti one u kojima je došlo do željene mutacije (tj. ćelije s “ispravljenim” genetskim programom). u telo.

1967. Objavljen je prvi rad o oligonukleotidima - genski ciljanim biološki aktivnim supstancama.

Dakle, oligonukleotidi koji postoje danas su sposobni regulisati "rad" gena na različitim nivoima. Dakle, gore pomenuti antisens oligonukleotidi i interferirajuće RNK rade u fazi sinteze proteina, utičući na mesindžer RNK - informacione molekule u kojima se sklapaju polipeptidni lanci. Antigeni oligonukleotidi koji formiraju komplekse sa DNK potiskuju ekspresiju gena – formiranje samih glasničkih RNK, a oligonukleotidni aptameri mogu, poput antitijela, formirati veze s određenim proteinima, blokirajući ih. Osim toga, neki oligonukleotidi su sposobni stimulirati imunološki sistem, a danas se koriste kao komponente vakcina.

Trenutno, razvoj i sintezu oligonukleotida i njihovih analoga obavljaju veliki istraživački i industrijski sektori. Tako je prošle godine obim tržišta oligonukleotida namijenjenih samo u istraživačke svrhe premašio 800 miliona dolara! Deseci novih tipova hemijski modifikovanih oligonukleotida su sada razvijeni i sintetizovani, a testiraju se i brojni antivirusni i antiinflamatorni lekovi dobijeni od njih. Istraživanja ove vrste u Rusiji se danas uglavnom sprovode na Institutu za hemijsku biologiju i fundamentalnu medicinu SB RAN, gde rade studenti i sledbenici akademika D. G. Knorrea.

Tako je plodnost ideje koja je nastala u Sibirskom ogranku prije četrdesetak godina dokazao sam život. Koristeći kratke fragmente nukleinskih kiselina kao osnovne strukture za stvaranje genski ciljanih biološki aktivnih supstanci, moguće je brzo razviti i uvesti u proizvodnju specifične lijekove protiv gotovo svih virusa. Da biste to učinili, trebate samo dešifrirati nukleotidnu sekvencu virusnih gena, što je lako učiniti uz pomoć modernih tehnologija. Ovaj univerzalni pristup ima veliku budućnost: rezultati istraživanja posljednjih godina, posebno ciljane mutageneze, omogućavaju nam da očekujemo da će se uskoro pojaviti učinkoviti lijekovi za borbu protiv bolesti koje se još uvijek smatraju neizlječivim.

Uvod

Razvoj ciljanih lijekova prioritetni je zadatak moderne molekularne biologije, bioorganske hemije i medicine. Trenutno postoji veliki broj radova koji odražavaju različite pristupe rješavanju ovog problema. Iz više razloga, pristup koji najviše obećava zasniva se na odabiru mRNA patogenog proteina kao mete i korištenju svojstva komplementarnosti u međusobnoj interakciji nukleinskih kiselina. Trenutno se radovi odvijaju u tri pravca:

Antisens oligonukleotidi;

Ribozimi i DNKzimi;

SiRNA i miRNA.

Ove metode se zasnivaju na upotrebi kratkih molekula nukleinske kiseline (17 - 70 nt) sa sekvencom koja je djelimično ili potpuno komplementarna ciljnoj mRNA regiji. Opći principi djelovanja ovakvih agenasa također ih ujedinjuju u području nastalih problema, među kojima su najhitniji dostava u ćeliju, otpornost na nukleaze i efikasnost interakcije s ciljnom mRNA. Hemijske modifikacije NC agenasa pomažu djelimično ili potpuno u rješavanju mnogih od ovih problema i povećavaju učinkovitost agenasa.

Proučavanje mehanizama supresije genske ekspresije primjenom komplementarnih interakcija zahtijeva korištenje analitičkih metoda koje omogućavaju nedvosmisleno određivanje antisens efekta oligonukleotida.

Cilj ovog rada je razvoj metode za suzbijanje ekspresije EGFP gena u ćelijama korišćenjem oligonukleotidnih konjugata sa pirenom.

Modifikacije antisens oligonukleotida (pregled literature)

Razvoj lijekova koji na nivou gena omogućavaju sprječavanje razvoja bolesti uzrokovanih ekspresijom patogenih proteina (virusnih, onkogenih produkata) ili proteina koji sprječavaju njegovo izlječenje (MDR), doveo je do pojave i razvoja antisens tehnologije. . Princip antisens tehnologije je jednostavan: antisens oligoribonukleotidi izazivaju supresiju ekspresije ciljnog gena na način specifičan za sekvencu, koristeći sposobnost oligonukleotida da se hibridizuju sa ciljnom mRNA kroz Watson-Crick interakcije. Oligonukleotid, vezivanjem za ciljnu RNK, sprečava njenu dalju obradu. Eksperimenti na ćelijskim kulturama su pokazali da upotreba oligodezoksiribonukleotida (u daljem tekstu ODN) dužine 20 - 30 nt, komplementarnih regionu mRNA, značajno smanjuje nivo ekspresije proteina koji on kodira. Razvoj metode pokazao je niz razloga koji dovode do smanjenja efikasnosti ODN-a: kratak životni vek ODN-a u serumu, niska efikasnost penetracije (transporta) u ćeliju i nedovoljna efikasnost vezivanja za strukturirane RNA fragmente.

Razvoj organske hemije, posebno hemije nukleinskih kiselina, omogućava nam da tražimo načine za rešavanje nastalih problema uvođenjem različitih hemijskih modifikacija ODN. I dušične baze i šećerno-fosfatni okosnici mogu biti podvrgnuti hemijskoj modifikaciji, što dovodi do povećanja njegove nukleazne otpornosti ODN-a i efikasnosti njegovog vezivanja za komplementarnu sekvencu. Oni pokušavaju povećati efikasnost isporuke ODN-a u ćeliju uvođenjem različitih grupa u njen sastav na jednom kraju, olakšavajući prolaz kroz membranu.

Postoje uglavnom dva mehanizma djelovanja antisens oligonukleotida: zaustavljanje translacije zbog vezivanja regulatornog regiona i cijepanje RNK kao dijela heterodupleksa RNA-DNK. Provođenje modifikacija može imati različite efekte kroz jedan ili drugi mehanizam, što treba uzeti u obzir pri odabiru opcije modifikacije.

1.1 Mehanizam djelovanja antisens oligonukleotida

Kada antisens oligonukleotid stupi u interakciju s mRNA, javljaju se dva događaja: sterično blokiranje i cijepanje ciljne mRNA od strane RNase H. Za neke oligonukleotide, oba događaja se javljaju (RNase H-kompetentni oligonukleotidi), za druge - samo sterično blokiranje (RNase H-nezavisno ). Ove dvije opcije su zasnovane na različitim ćelijskim mehanizmima. Najširi raspon molekularnih mehanizama pokriven je korištenjem druge opcije. Ovo se postiže ciljanjem oligonukleotida na specifične regulatorne sekvence, kako u pre-mRNA tako iu mRNA. U slučaju pre-mRNA, ciljanje ODN-a na granični region između introna i egzona ometa spajanje, što dovodi ili do njegovog zaustavljanja ili do formiranja mRNA koja kodira nefunkcionalni protein (vidi sliku 1). Još jedno obećavajuće mesto vezivanja ODN u pre-mRNK je 5"-terminalni region. Interakcija ODN sa ovim regionom dovodi do blokiranja zatvaranja.

Kada ODN stupi u interakciju s mRNA, njegova translacija i, posljedično, sinteza proteina su poremećeni blokiranjem kretanja ribozoma duž mRNA ili čak njegovog sklapanja, ovisno o položaju mjesta vezivanja.

Fig.1.

ODN-ovi kompetentni za RNazu H mogu se adresirati na bilo koju regiju pre-mRNA i mRNA, jer se njihovo djelovanje zasniva na aktivaciji RNaze H, čiji je supstrat RNK kao dio RNA-DNK dupleksa. Međutim, mnogi hemijski modifikovani antisens oligonukleotidi nisu u stanju da aktiviraju ovaj mehanizam zbog visoke sterične specifičnosti RNaze H. To je zbog činjenice da većina modifikacija dovodi do promena parametara spirale ODN - RNA dupleksa, i one prestaju da se biti supstrati za RNazu H.

Antisens oligonukleotidi druge generacije - modificirani na poziciji 2" ostatka šećera - nisu supstrati RNaze H, tako da morate potražiti druge agense za cijepanje (vještačke RNaze). Brojni mali molekuli (interkalatori, polikationi) su sposobni za cijepanje ciljna RNK.Vezivanje reaktivnih grupa na oligonukleotide dovodi do cijepanja željenih regija ciljne RNK.Takve grupe su metalni kompleksi, amini, oligopeptidi i molekularni konstrukti sa grupama aktivnog mjesta nukleaza (imidazolni prsten, COO - -, NH 2 grupe, gvanidin).

1.2 Modifikacije antisens oligonukleotida

1.2.1 Strategije za razvoj hemijskih modifikacija oligonukleotida

Na osnovu akumuliranih podataka o upotrebi antisens oligonukleotida, formulisan je niz kriterijuma koje ODN mora da zadovolji da bi bio efikasan terapeutski agens:

Nukleazna rezistencija

visok afinitet prema meti

formiranje RNaze H supstrata

· različiti mehanizmi djelovanja (utjecaj alternativnog spajanja, zaustavljanje translacije)

netoksični i specifični

Mogućnost nespecifičnog vezivanja za proteine ​​za transport

· jednostavnost sinteze, patentabilnost, prednosti

Izvorni ODN-ovi nisu u mogućnosti da u potpunosti zadovolje sve gore navedene kriterije. Glavna ograničenja su slaba rezistencija na nukleaze i nedovoljno stabilni ODN - RNA kompleksi. Uvođenje hemijskih modifikacija u ODN za sve ili pojedinačne nukleotide može u velikoj meri eliminisati postojeće nedostatke. ODN modifikacije se provode na fosfatnoj grupi, ostatku saharoze, dušičnoj bazi ili terminalnim fosfatnim ostacima. Da bi se povećala otpornost na nukleaze, modifikacija se najčešće provodi na fosfatnoj grupi i ostatku deoksiriboze. Povećanje efikasnosti vezivanja postiže se modifikacijom azotnih baza, kao i ostatka deoksiriboze. Da bi se povećala efikasnost vezivanja za proteine ​​i poboljšao transport, vrši se konjugacija sa ligandima različite prirode. U nekim slučajevima, vezane hemijske strukture deluju kao katalizatori za fosfodiestarske veze u RNK.

1.2.2 Modifikacije fosfatne grupe

Cepanje fosfodiestarskih veza u DNK nukleazama se dešava efikasnim vezivanjem na aktivnom mestu i korišćenjem kiselinsko-baznih svojstava fosfatne grupe. Jedan od načina da se poveća otpornost ODN veza na nukleaze je promjena elektronske konfiguracije fosfatne grupe. Da bi se to postiglo, jedan od nevezanih atoma kisika zamjenjuje se atomom drugog elementa. Sumpor je bio jedan od prvih koji je korišćen kao takav element, što je rezultiralo proizvodnjom fosforotioata (modifikovanih antisens oligonukleotida prve generacije; videti sl. 2, II).

Rice. 2.

Fosforotioati su pokazali visoku otpornost na nukleaze, ali je ova modifikacija značajno povećala toksičnost ODN.

Zamjenom nevezanog atoma kisika fosfatne grupe metilnom grupom dobijaju se metilfosfonati (vidi sliku 3, III), koji pokazuju visoku otpornost na djelovanje nukleaza. Modifikacija se često provodi samo na terminalnim nukleotidima, što dovodi do smanjene toksičnosti.

Ako zamijenite atom kisika fosfata sa BH 3 - ostatkom, dobićete boranfosfate. Ostatak -BH 3 - je izoelektronski prema atomu kiseonika u fosfodiesterskim vezama, zbog čega boranfosfati zadržavaju svoj negativni naboj, visoko su rastvorljivi u vodi i formiraju komplekse sa ciljnom RNK. Takođe, ovaj ostatak je izoelektronski i izosteričan prema metilnoj grupi, zbog čega se mogu očekivati ​​svojstva slična onima metilfosfonata, kao što je otpornost na nukleaze.

Rice. 3.

1.2.3 Modifikacije ostatka šećera

Modifikacije fosfodiestarskih veza nemaju značajan uticaj na stabilnost heterodupleksa DNK-RNA. Stoga su, pored modifikovanih oligodeoksinukleotida, interesantni tzv. druga generacija modifikovanih antisens oligonukleotida - to su oligoribonukleotidi supstituisani na 2"-hidroksilnoj grupi ostatka riboze. Ova modifikacija takođe povećava otpornost na delovanje nukleaza. Iako RNK je mnogo manje otporan na uticaje okoline u odnosu na DNK. Zbog prisustva 2"-OH grupe, modifikacije ove grupe omogućavaju dobijanje stabilnih proizvoda koji pokazuju manju toksičnost u odnosu na fosfonate. Također, druga generacija modificiranih antisens oligonukleotida često uključuje oligonukleotide s modificiranom okosnicom ne-šećer-fosfatne prirode, na primjer, peptidne nukleinske kiseline, koje također pokazuju otpornost na nukleazu i formiranje termodinamički stabilnih hibrida sa ciljnim mRNA molekulama.

Fig.4. Modifikacije druge generacije: V - 2"-O-alkil-RNA, VI - LNA, VII - Morfolino, VIII - PNA.

Analiza podataka o upotrebi većeg broja derivata 2"-O-alkil RNK koji sadrže od jedne do pet metilenskih jedinica u alkil radikalu pokazala je da s povećanjem broja metilenskih jedinica raste otpornost modificiranog oligonukleotida na djelovanje nukleaza se povećava (pentoksi > propoksi > metoksi > deoksi).Ova zavisnost se može objasniti steričnom nedostupnošću nukleotida pri vezivanju većeg supstituenta. komplementarni kompleksi sa ciljnom mRNA, stoga je najveći afinitet prema meti postignut pri korištenju malih supstituenata. Upoređivanjem fizičko-hemijskih parametara 2"-O-metiliranih fosforotioata (Me-S-ODN), S-DNK i nemodificirane DNK, utvrđeno je da temperatura topljenja (T m) heterodupleksa DNK-RNA raste sljedećim redoslijedom: Me-S-ODN - RNA > normalna DNK - RNA > S-ODN - RNA . Nedostatak ove modifikacije je u tome što RNaza H ne može razdvojiti ciljnu mRNA u RNA-RNA kompleksu. Kao posljedica ovog nedostatka, takvi oligonukleotidi su manje moćni inhibitori ekspresije gena u odnosu na nemodificirane.

2"-katjonske modifikacije dovode do stvaranja cwitterionskih oligonukleotida. Takvi oligonukleotidi, osim stvaranja stabilnijih heterodupleksa u odnosu na nemodificirane, imaju veću sposobnost prodiranja kroz biološke membrane i visoku stabilnost na djelovanje nukleaza zbog svog naboja. 2?-O-etil ]oligonukleotidi (2"-O-DMAEOE, vidi sliku 5), zbog efekta naelektrisanja, formiraju heteroduplekse sa ciljnom RNK sa temperaturom topljenja 2 °C višom u poređenju sa nemodifikovanim oligonukleotidima. Zwitterionski oligonukleotidi zadržavaju kompetenciju RNaze H ako su modifikacije raštrkane po cijeloj dužini oligonukleotida.

Rice. 5.2 "-O-DMAEOE

Konformaciono ograničene „zaključane“ nukleinske kiseline (Locked Nucleic Acids, LNA) su modifikovane nukleinske kiseline koje imaju najmanje jedan monomer sa bicikličnom furanozom kao ostatkom šećera (vidi sliku 4, VI). Imaju visok afinitet za komplementarnu sekvencu (temperatura topljenja dupleksa se povećava za 6 °C kada je jedan nukleotid modifikovan), što je i prednost (efikasno vezivanje cilja) i nedostatak (formiranje ukosnica). Takav afinitet se mora uzeti u obzir pri dizajniranju LNA. Studije na miševima su pokazale nisku toksičnost LNA.

Peptidne nukleinske kiseline (PNA) su analozi nukleinskih kiselina u kojima je šećerna fosfatna kičma zamijenjena pseudopeptidnim N-(2-aminoetil)-glicin polimerom. N-kraj imitira kraj od 3" oligonukleotida, a C-kraj imitira njegov kraj od 5" (vidi sliku 3, VII). PNA-RNA kompleksi su stabilniji od DNK-DNK i RNA-RNA kompleksa. Uprkos činjenici da PNA mogu vezati cilj iu antiparalelnoj (Watson-Crick) i paralelnoj (Hoogsteen) orijentaciji, stabilniji kompleksi se formiraju s antiparalelnom orijentacijom PNA. Studije su pokazale nisku toksičnost PNA.

Morfolini (vidi sliku 3, VIII) su reagensi koji kombinuju stabilnost, otpornost na nukleaze, efikasnost, aktivnost tokom dužeg perioda, rastvorljivost u vodi, visoku specifičnost i nisku toksičnost. Molekuli imaju neutralan naboj. Proizvodnju morfolina vrši Gene Tools, LLC ( http://www.gene-tools.com).

Da bi se održala kompetentnost RNaze H, potrebno je da u sredini oligonukleotida postoji dio od najmanje 7 deoksinukleotida, stoga se koriste „mješoviti“ antisens oligonukleotidi, tj. imaju različite modifikacije u različitim jedinicama (LNA/DNK, LNA/RNA, itd.). Također, u reakcionu smjesu se dodaju spojevi koji sadrže grupe koje uzrokuju cijepanje ciljne mRNA zbog njihove sličnosti sa aktivnim centrom RNaze H, ili se ne modificiraju sve nukleotidne jedinice (na primjer, samo krajevi od 3" i 5") . .

Dakle, glavna svojstva antisens oligonukleotida modificiranih šećerno-fosfatnom kičmom mogu se sažeti u sljedećoj tabeli:

Tabela 1. Poređenje modifikacija šećerne fosfatne kičme.

Modifikacija	Stabilnost nukleaze	Ciljni afinitet	Aktivacija RNaze H	Netoksičan

1.2.4 Modifikacije azotnih baza

Djelotvornu antisens aktivnost može biti teško postići samo modifikacijama šećerno-fosfatne kičme. Modifikovane azotne baze povećavaju efikasnost antisens ODN-a povećanjem afiniteta za ciljnu RNK (aminoadenozin, G-stezaljka) i brzinu prodiranja kroz plazma membranu (katjonske i cviterionske grupe).

Kada se fenoksazin doda ostatku citozina, dobija se takozvana G-stezaljka (vidi sliku 6, X), koja stvara dodatnu vodikovu vezu sa ostatkom gvanina, zbog čega se temperatura topljenja hibrida ODN - RNK povećava. povećava za 6 - 18 °C. Ova modifikacija se obično vrši na kraju od 3", što ne narušava kompetenciju RNaze H.

Kada se amino grupa unese u adeninski ostatak (vidi sliku 6, XI), afinitet prema meti se takođe povećava zbog stvaranja dodatne vodonične veze sa timinskim ostatkom.

Rice. 6. Dodatne vodikove veze između C i G stezaljke (X), između T i A NH2 (XI)

Zbog svog pozitivnog naboja, ODN sa kationskim i cviterionskim grupama vezanim za ostatke dušične baze (na primjer, spermidin, slika 7) ne samo da imaju veći afinitet prema meti, već i poboljšanu sposobnost prodiranja u ćelije i stabilnost na djelovanje nukleaze.

Rice. 7.

Veliki fluorescentni ligandi kao što je fluorescein su konjugirani na terminalne azotne baze kako bi se vizualizirala lokacija ODN-a u ćeliji.

Fig.8.

1.2.5 Dodatak glomaznih supstituenata

Sposobnost prodiranja u ćeliju, zaobilazeći ćelijsku membranu, jedna je od osobina koja mora biti prisutna u efikasnom antisens oligonukleotidu. Većina nukleotidnih modifikacija opisanih gore u ODN-u nemaju značajan uticaj na transport ODN-a kroz ćelijsku membranu. Postoji nekoliko puteva za molekule da prođu kroz plazmalemu, ali dva su važna za ODN: difuzni ili ne-receptorski posredovani i receptorski posredovani. Transport prema prvoj opciji otežan je ukupnim negativnim nabojem ODN-a i njihovom hidrofilnošću. Upotreba drugog puta ograničena je nedovoljnim podacima o površinskim proteinima stanične membrane odgovornim za transport nukleinskih kiselina u ćeliju. Stvaranje konjugata ODN sa različitim hemijskim grupama pomaže da se poveća efikasnost transporta duž jedne ili druge rute, u zavisnosti od vrste hemijske grupe i mesta njenog vezivanja na ODN. Slika 9 prikazuje opcije za linkere koji se koriste za dobijanje konjugata. Ligandi se mogu vezati za azotne baze, terminalne fosfate, fosfodiestarske (ili slične) veze i ostatke šećera. Neke vrste hemijskih grupa takođe omogućavaju vizualizaciju razdvajanja pomoću detekcije fluorescencije. modifikacija oligonukleotidne antisense reakcije

Fig.9.

Djelomična ili čak potpuna neutralizacija negativnog naboja ODN-a nema značajan utjecaj na sposobnost ODN-a da se spontano transportuje u ćeliju. Vezanje različitih glomaznih hidrofobnih liganada, posebno onih prikazanih na slici 9, olakšava transport ODN-a preko membrane.

Slika 10.

Konjugati sa holesterolom su dobro proučavani. Mehanizam koji poboljšava prodiranje u ćeliju zbog dodavanja kolesterola još nije potpuno jasan, iako se pretpostavlja receptorski posredovano uključivanje lipoproteina. Konjugati holesterola formiraju micele, što olakšava njihov transport u ćeliju. Ostatak holesterola je obično vezan za terminalne 5" i 3" fosfate, a 3"-monoholesteril oligonukleotidi su efikasniji u odnosu na 5"-monoholesteril oligonukleotide, a najefikasniji su 5", 3"-bisholesteril oligonukleotidi. Na primjer, 6 minuta nakon injekcije u krv miša, nivo u tkivima 3"-monomodificiranih fosforotioata bio je 4 puta veći, a 5"-mono- i 3,5"-bismodificiranih fosforotioata 7 puta veći u odnosu na nemodificirane fosforotioati.

Koriste se monomeri sa 5"- i/ili 3"-holesteril-supstituiranim fosfatom, oligonukleotidi sa ligandom konjugiranim na fosfodiestarsku vezu ispred 3"-terminalnog nukleozida, kao i dendrimeri holesterola sa lizinskim ostatkom ( vidi sliku 11).

Slika 11.

Sintetizirani su oligonukleotidi konjugirani sa drugim hidrofobnim molekulima (adamantan, piren, eikozanoična kiselina itd.) koji su upoređeni sa oligonukleotidima. Konjugati holesterola pokazali su optimalnu lipofilnost, kao i dobru sposobnost akumulacije u jetri.

Konjugacija sa derivatima pirena, pored poboljšanja transportne sposobnosti, zanimljiva je zbog njihove sposobnosti fluorescencije. Derivati ​​bis-pirenila su sposobni da formiraju ekscimere - bimolekularne komplekse u kojima je jedan molekul u osnovnom, a drugi u pobuđenom stanju. Takvi kompleksi su vrlo osjetljivi na prostorno okruženje; nivo fluorescencije se može koristiti za procjenu da li je ODN u stanju vezanom za ciljnu RNK ili ne:

Slika 12.

Da bi se poboljšala efikasnost transporta u ćeliju, koriste se i peptidni konjuganti. Na oligonukleotide, uklj. PNA, vezuje peptid sposoban da prenosi velike polarne nabijene molekule kroz membranu. Dakle, Antennapedia peptid ima mjesta za vezivanje DNK. PNA sa pričvršćenim peptidom Antennapedia ne samo da efikasno prodire u ćeliju, već i migrira u jezgro.

Slika 13.

Vezanje velikih planarnih interkalirajućih molekula, kao što je akridin (vidi sliku 14), na krajeve antisense ODN molekula je od interesa za povećanje efikasnosti cijepanja ciljnog RNA molekula. Zbog interkalacije, interakcija ODN - RNA je lokalno labavljena. Kao rezultat povećanja udaljenosti između DNK i RNK zbog veličine molekule interkalatora, formira se "petlja" molekule RNK iz dvostruke spirale heterodupleksa. Kationi teških metala, na primjer Lu 3+, koordinirani sa atomima dušika akridinskog ostatka, kataliziraju hidrolizu RNK bez sudjelovanja RNKaze H, a “petlja” kao destabilizirajuća struktura ubrzava ovaj proces.

Rice. 14.

1.3 Fizičko-hemijski aspekti interakcije između oligonukleotida i ciljne RNK

Efikasnost antisens oligonukleotida je kvantitativno okarakterisana afinitetom ODN za ciljnu mRNA i efektivnom konstantom cijepanja potonje.

Afinitet ODN-a za RNK koja mu je adresirana (ili slobodna energija formiranja heterodupleksa) opisuje stabilnost DNK-RNA hibrida. r G može se mjeriti kalorimetrijski ili izračunati teoretski. Prilikom izračunavanja Gibbsove slobodne energije formiranja heterodupleksa koristi se Hessov zakon (Gibbsova slobodna energija kompleksne reakcije ne ovisi o njenom putu) i proračuni energija formiranja sekundarnih i tercijalnih struktura prema „pravilu najbližeg susjeda“ koristeći mfold program koji su razvili Zucker et al. Reakcija se može predstaviti na sljedeći način:

U ovoj shemi, M, O, H su, redom, ciljna mRNA, antisense ODN i ODN - RNA heterodupleks, uzimajući u obzir njihovu sekundarnu i tercijarnu strukturu, M u, O u, H u - ciljna mRNA, antisense ODN i ODN - heterodupleks RNK bez uzimanja u obzir njihove sekundarne i tercijarne strukture, un G (M) , un G (O) , un G (H)- Gibbsove slobodne energije polaganja u sekundarnu i tercijarnu strukturu, r G, r G (rasklopljeno)- slobodne energije hibridizacije ODN i mRNA u presavijenom i potpuno denaturiranom stanju, respektivno.

un G (M) , un G (O) , un G (H) I r G (rasklopljeno) može se teoretski izračunati. Tada se slobodna energija hibridizacije nalazi prema Hessovom zakonu:

Konstanta ravnoteže procesa heterodupleksne asocijacije K 1 može se naći na osnovu izračunate Gibbsove slobodne energije procesa hibridizacije:

Da bi procijenili temperaturu topljenja heterodupleksa, oni također koriste pravilo „najbližeg susjeda“ i izračunavaju ga pomoću odgovarajućih programa.

Konstanta efektivne brzine može se pronaći eksperimentalno k eff gruba reakcija transformacije mRNA M u uslovni proizvod X (ova konvencija ne utječe na rezultat kinetičkih proračuna, ali ih značajno pojednostavljuje):

Efektivna bruto konstanta brzine reakcije ukazuje na uočenu brzinu cijepanja ciljne mRNA.

Mehanizam reakcije može se predstaviti sljedećim dijagramom:

U ovoj shemi, E je enzim RNKaza H, HE je njegov intermedijarni kompleks sa supstratom H, K 1 - heterodupleksna asocijacijska konstanta, izračunata po formuli (3).

Za datu kinetičku šemu možemo kreirati sistem kinetičkih jednačina:

Gdje WITH A- koncentracija supstance A, k i - konstanta brzine i-te elementarne reakcije.

Uobičajeni parametar je koncentracija mRNA u otopini (početna C M0 i struja C M), Zbog toga k eff izračunato u odnosu na matricu:

Korištenje kvazistacionarne aproksimacije za međuproizvod HE i pojednostavljivanje izraza za brzinu reakcije w koristeći Michaelis-Mentenovu jednačinu:

gdje je Michaelisova konstanta, možemo transformirati izraz za brzinu promjene koncentracije heterodupleksa H:

Nađimo izraz za efektivnu konstantu brzine cijepanja ciljne mRNA u dva slučaja: kada je proces ograničen vezivanjem mRNA antisens ODN-om i kada je ograničen katalitičkim cijepanjem ciljne mRNA kao dijela heterodupleksa .

Slučaj 1. Ograničenje hibridizacijom.

U ovom slučaju, proces cijepanja je mnogo brži od hibridizacije. Stoga možemo pretpostaviti da je uspostavljena stacionarna koncentracija heterodupleksa H, tj.

S druge strane, lako je vidjeti (6) da:

To jest, u ovom slučaju, izraz za brzinu cijepanja mRNA poklapa se u apsolutnoj vrijednosti sa izrazom za brzinu reakcije (brzina formiranja uslovnog proizvoda X). Koristeći ovo, transformiramo izraz za brzinu promjene koncentracije oligonukleotida; vidjet ćemo da se njegova koncentracija može smatrati praktički nepromijenjenom:

Korištenje izraza (14) i, kao posljedica toga, zanemarivanje doprinosa pojma k -1 WITH H c nalazimo brzinu cijepanja mRNA u novom obliku i izražavamo k eff .

Slučaj 2. Ograničenje katalitičkim cijepanjem supstrata.

U slučaju kada je cijepanje mnogo sporije od formiranja heterodupleksa, možemo pretpostaviti da ravnoteža ima vremena da se uspostavi.

Ravnotežna koncentracija heterodupleksa može se zanemariti u poređenju sa Michaelisovom konstantom u izrazu brzine:

Pisanjem izraza za konstantu ravnoteže K 1 i jednačine materijalnog bilansa za M i O, dobijamo dovoljne uslove za rešavanje jednačine:

Gdje [ A] - ravnotežna koncentracija, WITH A 0 je početna koncentracija supstance.

Uzimajući u obzir (17) i (18), dobijamo izraze za ravnotežne koncentracije H i O:

Zamjenom (21) u Michaelis-Mentenovu jednačinu (16) dobijamo modificiranu jednačinu brzine reakcije:

Zamjenom izraza (20), (21) i (22) u (12) i izostavljanjem glomaznih srednjih proračuna, dobivamo izraz za brzinu katalitičkog cijepanja mRNA:

odakle je lako pronaći formulu za efektivnu konstantu stope bruto procesa:

Postoje mnoge prepreke za stvaranje lijekova zasnovanih na antisens ODN-ovima: slaba sposobnost internalizacije, nestabilnost na nukleaze, toksičnost i druge. Kemijske modifikacije mogu eliminirati mnoge od ovih problema, ali samo djelomično, i teško je pronaći kompromis između prednosti i mana bilo koje modifikacije. Uprkos tome, mnogi lijekovi zasnovani na ODN-u su testirani. Prvi lijek baziran na ODN-u je Vitravene, usmjeren na suzbijanje infekcije citomegalovirusom kod pacijenata sa AIDS-om.

UVOD

POGLAVLJE 1. PREGLED LITERATURE.

1.1. Osnovne ideje i načini stvaranja ciljanih antitumorskih lijekova 15 1.1.1. Ciljani lijekovi u onkologiji: lijekovi na bazi monoklonskih antitijela i antisens oligonukleotida.

1.2. Endocitoza posredovana receptorima i njena uloga u isporuci biološki aktivnih jedinjenja do ciljnih ćelija

1.3. Alternativni sistemi za ciljanu isporuku lijekova protiv raka za poboljšanje efikasnosti terapije raka.

1.4. Tumorsko-specifični antigeni kao mete za ciljanu isporuku antitumorskih lijekova

1.5. Ciljana isporuka lijekova u konjugatima s proteinskim i peptidnim vektorskim molekulima.

1.6. Himerni proteini

1.7. Alfa-fetoprotein i njegovi receptori kao meta za selektivnu dostavu biološki aktivnih supstanci u tumorske ćelije.

1.7.1. Struktura i funkcija alfa-fetoproteina

1.7.2. Alfa-fetoproteinski receptori.

1.7.3. Biološki aktivni fragmenti alfa-fetoproteina

1.8. Ciljana isporuka lijekova protiv raka kao glavni pristup prevladavanju rezistencije na više lijekova (MDR)

1.8.1. Fenomen višestruke rezistencije tumorskih ćelija.

1.8.2. Savremeni pristupi prevladavanju rezistencije na više lijekova.

POGLAVLJE 2. MATERIJALI I METODE.

2.1. Izolacija prirodnog humanog alfa-fetoproteina i proizvodnja rekombinantnih proteinskih fragmenata AFP-a.

2.1.1. Izolacija ljudskog AFP-a

2.1.2. Priprema rekombinantnog C-terminalnog fragmenta AFP-a (rAFP27)

2.1.3. Priprema rekombinantnog PGA proteina

2.1.4. Dobivanje rekombinantnog AFP fragmenta AFP-3BC

2.2. Sinteza proteinskih i peptidnih konjugata sa FITC, citostaticima i oligonukleotidima.

2.2.1. Sinteza FITC-obilježenih AFP, MAb i C-terminalnih fragmenata AFP gAFP27 i AFP-3BC.

2.2.2. Sinteza FITC-obilježenog AFP oktapeptida GIP8.

EMTPVNPG (GIP8) sa doksorubicinom.

2.2.4. Sinteza konjugata AFP sa vinblastinom.

2.2.5. Sinteza konjugata AFP sa ftalocijaninima

2.2.6. Sinteza konjugata AFP i GIP8 sa esperamicinom Aib (EsA).

2.2.9. Sinteza konjugata AFP sa oligonukleotidima.

2.2.10. Priprema ON kompleksa sa proteinima.

2.3. Ćelijske kulture i uslovi kulture.

2.4. Procjena vezivanja receptora i endocitoze fluorescentno obilježenih proteina, peptida i konjugata korištenjem protočne citometrije.

2.4.1. Procjena vezivanja AFP i MAb za AFP receptor.

2.4.2. Procjena endocitoze fluorescentno označenog AFP-a, C-terminalnog fragmenta AFP-a i AFP oktapeptida GIP8.

2.5. Procjena endocitoze proteinskih i peptidnih konjugata sa DOX pomoću protočne citometrije.

2.6. Imunocitokemijske i imunohistohemijske studije.

2.6.1. Proučavanje ekspresije AFP receptora na površini ćelije.

2.6.2. Proučavanje ekspresije c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 proteina.

2.6.3. Imunohemijsko bojenje histoloških rezova.

2.7. Proučavanje ekspresije c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 u tumorskim ćelijama.

2.7.1. Studija ekspresije c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 pomoću Western blota.

2.7.2. Studija ekspresije c-Myc, Bc1-2 i Pgpl70 u tumorskim ćelijama pomoću protočne citometrije.

2.8. Fluorescentna mikroskopija.

2.9. Određivanje citostatske aktivnosti lijekova in vitro.

2.9.1. Određivanje preživljavanja ćelija.

2.9.2. Određivanje inhibicije proliferativne aktivnosti ćelija.

2.9.3. Analiza nivoa apoptoze pomoću fluorescentne mikroskopije.

2.8.4. Određivanje fotocitostatske i hemiocitostatske aktivnosti AFP konjugata sa aluminijum ftalocijaninima (A1Pc) i kobalt ftalocijaninima (CoPc).

2.9. Proučavanje proliferativne aktivnosti ćelija.

2.10. Analiza ćelijskog ciklusa protočnom citometrijom.

2.11. Proučavanje antitumorske aktivnosti lijekova in vivo.

2.12. Statistička obrada rezultata.

POGLAVLJE 3. REZULTATI I NJIHOVA DISKUSIJA.

3.1. Proučavanje ekspresije receptora alfa-fetoproteina na ćelijskim linijama humanog tumora.

3.1.1. Proučavanje specifičnosti klonova MAb za APPR

3.1.2. Procjena količine APPR-a na ljudskim tumorskim stanicama uzgojenim in vitro.

3.2. Imunohemijska detekcija APPR-a na ćelijama i presecima tkiva

3.2.1. Ispitivanje ekspresije AFP receptora na površini tumorskih ćelija primenom imunocitohemije.

3.2.2. Imunohistohemijsko bojenje preseka tumorskog tkiva

3.3. Proučavanje vezivanja i endocitoze fluorescentno obilježenog AFP-a tumorskim stanicama in vitro.

3.3.1. Proučavanje vezivanja AFP-a za receptor na površini tumorskih stanica i normalnih limfocita periferne krvi čovjeka korištenjem protočne citometrije.

3.3.2. In vitro studija endocitoze AFP uz pomoć protočne citometrije i fluorescentne mikroskopije.

3.4. Upotreba receptorom posredovane endocitoze za ciljanu isporuku antitumorskih lijekova - doksorubicina, vinblastina, esperamicina, ftalocijanina.

3.4.1. Analiza in vitro internalizacije konjugata tumorskim ćelijama

AFP sa antibioticima/citostaticima na primjeru doksorubicina.

3.4.2. Proučavanje citostatske aktivnosti proteinskih konjugata s doksorubicinom in vitro.

3.4.3. Proučavanje antitumorske aktivnosti AFP-DOX konjugata in vivo.

3.4.4. Proučavanje fotocitostatske i hemiocitostatske aktivnosti AFP konjugata s aluminijskim i kobalt ftalocijaninima (A1Pc)

3.4.5. Proučavanje citostatičke aktivnosti konjugata AFP sa nekim drugim antitumorskim antibioticima (citostaticima).

3.4.6. Proučavanje citostatske aktivnosti AFP konjugata sa esperamicinom Ajb (EsA) in vitro.

3.4.7. Proučavanje antitumorske aktivnosti AFP konjugata sa esperamicinom Aib (EsA) in vivo.

3.5. Prevazilaženje rezistencije na više lijekova uzrokovanu ekspresijom gena MDR 1 korištenjem konjugata AFP s antitumornim lijekovima in vitro.

3.5.1. Karakteristike rezistentnih ćelijskih linija.

3.5.2. Analiza internalizacije DOX-a i njegovih konjugata sa proteinima u rezistentnim ćelijskim linijama.

3.5.3. Proučavanje citostatske aktivnosti DOX-AFP konjugata protiv rezistentnih ćelijskih linija.

3.6. Biološki aktivni fragmenti AFP-a.

3.6.1. Rekombinantni C-terminalni fragment AFP-a (rAFP27).

3.6.2. Rekombinantni C-terminalni fragment AFP AFP-ZVS.

3.6.3. Biološki aktivni oktapeptid - fragment AFP-a

3.7. Ciljana isporuka antisens oligonukleotida u tumorske ćelije.

3.7.1. Ciljana isporuka antisens oligonukleotida u tumorske ćelije u obliku njihovih konjugata sa AFP.

3.7.2. Studija efikasnosti ASON isporuke korišćenjem nekovalentnih kompleksa sa AFP.

Preporučena lista disertacija

• Stvaranje i proučavanje svojstava rekombinantnih humanih proteina sa potencijalnim antitumorskim dejstvom 2007, Kandidat hemijskih nauka Savvateeva, Ljudmila Vladimirovna

• Razvoj ciljanih antitumorskih lijekova na bazi peptidnih vektora i antiangiogenih sredstava 2007, doktor bioloških nauka Feldman, Natalia Borisovna

• Upotreba C-terminalnog domena alfa-fetoproteina za ciljanu isporuku lijekova protiv raka 2012, Kandidat bioloških nauka Godovani, Artem Vitalijević

• Priprema i proučavanje biološke aktivnosti konjugata epidermalnog faktora rasta s antitumorskim kemoterapijskim lijekovima 2000, kandidat bioloških nauka Gumanov, Sergej Georgijevič

• Sinteza konjugata humanog α-fetoproteina s antitumorskim lijekovima za ciljanu dostavu u tumorske stanice 2001, kandidat hemijskih nauka Zabolotnjev, Dmitrij Viktorovič

Uvod u disertaciju (dio apstrakta) na temu “Upotreba proteinskih i peptidnih vektora za selektivnu dostavu antitumorskih lijekova i terapijskih oligonukleotida u tumorske stanice”

Relevantnost problema. Glavni razlozi neefikasnosti kemoterapijskog liječenja karcinoma su niska bioraspoloživost antitumorskih sredstava za tumor, potreba za korištenjem visokih doza lijekova i neselektivna priroda ovih lijekova. Ograničeni prodor lijekova u biološki heterogene tumore dovodi do preživljavanja nekih tumorskih stanica, čak i nakon dugotrajnog liječenja citotoksičnim agensima. Liječenje visokim dozama, neophodnim za potpunu remisiju, uzrokuje teške sistemske nuspojave, koje često prisiljavaju pacijente da prekinu liječenje. Osim toga, dugotrajna primjena kemoterapeutskih sredstava prepuna je razvoja rezistencije na više lijekova, što čini primijenjene lijekove neučinkovitima. Fenomen rezistencije na lijekove zasniva se na unutarćelijskim mehanizmima različite prirode, kao što je smanjenje transporta lijekova kroz plazma membranu, poremećaj nivoa ekspresije onkogena, oštećenje sistema za transdukciju signala, itd. Povećati efikasnost tumora. terapije, potrebno je povećati selektivnost djelovanja lijekova. Ovdje se mogu razlikovati dva pravca: razvoj novih visoko selektivnih lijekova i stvaranje novih sistema za regulirani transport dobro poznatih antitumorskih spojeva u ciljne stanice.

Selektivnost djelovanja lijeka može se povećati upotrebom ciljanih agenasa u sistemima isporuke - molekula koji se mogu vezati za specifične determinante na površini stanica. Dakle, upotreba ciljane komponente određuje interakciju sistema selektivne isporuke sa strogo određenim ćelijama i tkivima, posebno tumorskim ćelijama. Fiziološki ligandi receptora faktora rasta ili onkofetalnih proteina mogu djelovati kao ciljani agensi ili vektori, tj. sami faktori rasta i onkofetalni proteini. Antitumorski lijek se može kombinovati sa vektorom kovalentno da bi se formirao konjugat ili nekovalentno da bi se formirao stabilan kompleks. Vezivanje ciljanog molekula za specifični receptor na površini ćelije inducira proces endocitoze posredovane receptorima, koji osigurava akumulaciju lijeka u ćelijama tumora čija se molekularna meta nalazi unutar ćelije.

Treba napomenuti da je u nekim slučajevima upotreba sistema selektivne isporuke jedini način da se iskoristi terapijski potencijal nekih visoko toksičnih antitumorskih antibiotika, na primjer, endijne antibiotika. Primjer je lijek Mylotarg, koji je konjugat kalihemicina Xi sa humaniziranim antitijelima na CD33. Osim toga, primjena visoko efikasnih sistema za isporuku može značajno povećati terapijski učinak antisens oligonukleotida, koji, nažalost, još nisu našli primjenu u kliničkoj praksi.

Uspješno rješenje problema ciljanog transporta lijeka zasnovano na endocitozi posredovanoj receptorima određuje se, prije svega, izborom vektorske molekule. Proteinski vektori moraju zadovoljiti niz osnovnih zahtjeva, koji uključuju visok afinitet vektora za odgovarajuće receptore na površini ciljnih tumorskih ćelija, visoku stabilnost, mogućnost njihove kemijske modifikacije konjugacijom s kemoterapijom bez gubitka bioloških svojstava i dostupnost proteina u preparativnim količinama. Onkofetalni protein alfa-fetoprotein najviše ispunjava ove zahtjeve. Važni faktori pri dizajniranju sistema selektivne isporuke su i izbor leka (citostatik, fotosenzibilizator, antisens oligonukleotid) i linkera koji povezuje ciljanu i citostatičku komponentu. Skrining stvorenih konstrukta u in vitro sistemu i proučavanje njihovog intracelularnog ponašanja omogućava nam da identifikujemo najoptimalnije opcije za sisteme isporuke.

Cilj ovog rada bio je da se razviju principi za kreiranje sistema selektivne isporuke antitumorskih lekova i terapijskih oligonukleotida u tumorske ćelije na bazi prirodnih i rekombinantnih proteina i peptida i da se identifikuju obrasci koji određuju njihovu efikasnost. Ciljevi istraživanja:

Odabir proteinskih i peptidnih vektorskih molekula za selektivnu isporuku antitumorskih lijekova i antisens oligonukleotida;

Izrada konstrukta za selektivnu dostavu antitumorskih lijekova ciljnim stanicama na bazi alfa-fetoproteina i njegovih peptidnih fragmenata,

Studija internalizacije i intracelularne distribucije lijekova u zavisnosti od tipa dizajna za optimizaciju sistema isporuke;

Razvoj pristupa za prevazilaženje višestruke rezistencije na lekove korišćenjem sistema ciljane isporuke; Razvoj konstrukta na bazi alfa-fetoproteina i epidermalnog faktora rasta za selektivnu isporuku antisens oligonukleotida i evaluacija njihove efikasnosti.

Naučna novina i praktični značaj.

Dokazano je prisustvo AFP receptora kako na površini ćelijskih linija humanih tumora tako i na histološkim presecima humanih malignih tumora (jajnika, dojke, jetre, želuca, crijeva). AFP receptor nije detektovan na delovima benignih tumora i normalnih tkiva, kao ni na površini limfocita u mirovanju izolovanim iz krvi zdravih dobrovoljaca. Dakle, AFP receptor se može koristiti kao tumorski marker za širok spektar malignih tumora, a antitijela na receptor mogu se koristiti za dijagnozu tumora.

Formulisan je i razvijen koncept sistema za ciljanu isporuku biološki aktivnih jedinjenja u ciljne ćelije koristeći AFP i njegove peptidne fragmente kao ciljni motiv.

Razvijene su metode koje omogućavaju predviđanje djelotvornosti selektivnih lijekova u in vitro eksperimentima u ćelijskim kulturama.

Po prvi put je otkriveno da se rekombinantni C-terminalni fragment AFP-a (od aa 357 do 590) specifično vezuje za AFP receptor, endocitozira tumorskim ćelijama poput AFP-a i, poput AFP-a, inhibira rast hormona izazvan estradiolom. zavisne tumorske ćelije. Stoga se ovaj rekombinantni protein može koristiti kao vektorski molekul u sistemima ciljane isporuke.

Stvoreni su genski konstrukti za indukovanu biosintezu C-terminalnih fragmenata AFP-a u E. coli. Razvijene su visokoefikasne metode za izolaciju rekombinantnih AFP fragmenata.

Po prvi put je dokazana sposobnost biološki aktivnog fragmenta AFP-oktapeptida GIP8 (aa 472-479) da se selektivno veže za površinu tumorskih ćelija i da ih s visokom efikasnošću internalizuje, što otvara mogućnost upotrebe GIP8 kao vektora u sistemima ciljane isporuke.

Dokazana je efikasnost i selektivnost antitumorskog djelovanja konjugata AFP, AFP-ZVS i GIP8 in vitro protiv ćelijskih linija širokog spektra humanih tumora. Proučavani su obrasci njihove intracelularne translokacije i pokazana je zavisnost efikasnosti konjugata od labilnosti hemijske veze između proteina i citostatika.

Koristeći sisteme ciljane isporuke zasnovane na AFP-u, otkriveno je da je moguće prevladati rezistenciju tumorskih stanica na više lijekova uzrokovanu djelovanjem Pgpl70.

Po prvi put je dokazana visoka antitumorska efikasnost konjugata AFP sa esperamicinom Aib in vivo.

Razvijeni su sistemi za selektivnu isporuku terapijskih oligonukleotida i pokazano je fundamentalna mogućnost i obećanje upotrebe proteinskih vektora (AFP i epidermalni faktor rasta) za njihovu ciljanu dostavu u tumorske ćelije.

Glavne odredbe dostavljene na odbranu:

1. Alfa-fetoproteinski receptor je jedinstveni tumor-specifičan antigen koji je prisutan na površini tumorskih ćelija i odsutan je u većini normalnih ćelija.

2. Alfa-fetoproteinski receptor može poslužiti kao meta selektivne antitumorske terapije. Specifičnim vezivanjem za svoj receptor, alfa-fetoprotein se internalizuje od strane tumorskih ćelija zajedno sa molekulima jedinjenja lekova koji su kovalentno vezani za njega, čime se obezbeđuje selektivna isporuka lekova tumorskim ćelijama.

3. Upotreba sistema ciljane isporuke baziranih na alfa-fetoproteinu omogućava savladavanje rezistencije tumorskih ćelija na više lijekova uzrokovanu ABC transporterima plazma membrane.

4. Rekombinantni fragmenti alfa-fetoproteina koji sadrže motiv za vezivanje receptora mogu se koristiti u sistemima selektivne isporuke umjesto prirodnog proteina pune dužine.

5. Upotreba proteinskih vektora (AFP i epidermalni faktor rasta) može značajno povećati efikasnost intracelularne isporuke antisens oligonukleotida.

Lični doprinos autora sastoji se u razvijanju ideje, organizovanju i izvođenju eksperimentalnih studija, analizi, sumiranju i interpretaciji dobijenih rezultata. Sve eksperimente sa ćelijskim kulturama izvodio je direktno autor. Apromacija rada.

Glavni rezultati rada objavljeni su na V međunarodnom simpozijumu o biologiji i kliničkoj korisnosti tumorskih markera (1995, Barselona, ​​Španija), XVI. intern.

Kongres kliničke hemije, (1996, London), Međuzavisnost biologije tumora i kliničke onkologije (1996, Coronado, SAD), str. 121.Sastanak Međunarodnog društva za onkorazvojnu biologiju i medicinu (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), Evropska konferencija o raku ECCO (1997, Francuska), Ruski nacionalni kongres "Man i Medicine" (2000, 2005, Moskva), 37. godišnji naučni skup Evropskog društva za klinička istraživanja (2003, Verona, Italija), 1. EUFEPS konferencija o optimizaciji isporuke i formulacije lijekova: novi izazovi u isporuci lijekova (2003, Francuska, Versailles), 5. ISTC/Korejska radionica o biotehnologiji (2004, Chungbuk, Koreja), Svjetska konferencija o magičnim mecima (2004, Nirnberg, Njemačka), međunarodna konferencija Molekularna medicina i biološka sigurnost (2005, Moskva), III moskovski međunarodni kongres „Biotehnologija: stanje i perspektive razvoja" (2005, Moskva), moskovska međunarodna konferencija "Biotehnologija i medicina" (2006, Moskva), 19. sastanak Evropskog udruženja za istraživanje raka (EACR), Budimpešta, Mađarska, 1-4. jula 2006, konferencija "Novo tehnološka platforma za biomedicinska istraživanja (biologija, zdravstvo, farmacija)" (2006, Rostov na Donu), I međunarodna naučno-praktična konferencija "Postgenomske metode analize u biologiji, laboratorijskoj i kliničkoj medicini" (2010, Moskva).

Struktura i obim disertacije. Rad je predstavljen na 256 stranica kucanog teksta i sastoji se od uvoda, pregleda literature, opisa istraživačkih metoda, prezentacije i diskusije rezultata, zaključka, zaključaka i liste literature koja uključuje 406 izvora. Disertacija sadrži 94 slike i 14 tabela.

Slične disertacije na specijalnosti "Biohemija", 01/03/04 šifra VAK

• Razvoj ciljanih antitumorskih lijekova na bazi peptidnih vektora i lijekova za kemoterapiju 2004, kandidat bioloških nauka Al-Nazwani Nasser Salem

• Rekombinantni fragmenti humanog alfa-fetoproteina za stvaranje ciljanih lijekova 2012, kandidat bioloških nauka Sharapova, Olga Andreevna

• Izgradnja kompleksa protein-nukleinska kiselina za ciljani transport strane DNK u ćelije 2010, kandidat bioloških nauka Tatarinova, Olga Nikolajevna

• Sinteza i proučavanje transportnih oblika antitumorskih lijekova na bazi alfa-fetoproteina i polimernih nanočestica 2000, kandidat bioloških nauka Bobruskin, Aleksej Igorevič

• Dobivanje i proučavanje antitumorskog potencijala antiangiogenih polipeptida i ciljanih kemoterapijskih lijekova 2006, kandidat bioloških nauka Digtyar, Anton Vasiljevič

Zaključak disertacije na temu "Biohemija", Posypanova, Galina Aronovna

1. Razvijen je koncept sistema za ciljanu dostavu biološki aktivnih jedinjenja u tumorske ćelije, u kojem se alfa-fetoprotein (AFP) i njegovi fragmenti koriste kao ciljni motiv.

2. Utvrđeno je prisustvo AFP receptora kako na površini ćelija humanih tumorskih linija tako i na ćelijama humanih malignih tumora (jajnika, dojke, jetre, želuca, crijeva). Na dijelovima benignih tumora i normalnih tkiva, kao i na površini limfocita zdravih dobrovoljaca, AFP receptor nije detektovan.

3. Pokazalo se da se ne samo AFP, već i njegovi rekombinantni C-terminalni fragmenti specifično vezuju za AFP receptor i endocitozuju tumorske ćelije.

4. Otkriveno je da se biološki aktivni fragment AFP-a, oktapeptid GIP8, selektivno vezuje za nepoznati receptor na površini tumorskih ćelija, sa visokom efikasnošću se internalizuje i može se koristiti kao vektor u sistemima ciljane isporuke.

5. Utvrđeno je da se konjugati antitumorskih lijekova sa AFP selektivno akumuliraju u ciljnim stanicama, imaju izražen citostatski učinak na tumorske ćelije i nisku toksičnost za normalne ljudske ćelije; Štaviše, efikasnost konjugata je određena labilnosti hemijske veze između proteina i citotoksičnog agensa.

6. Upotreba sistema ciljane isporuke baziranih na AFP-u omogućava prevazilaženje rezistencije na više lijekova tumorskih ćelija uzrokovanih aktivnošću Pgpl70.

7. Efikasnost transporta doksorubicina u tumorske ćelije u sastavu konjugata sa AFP značajno nadmašuje efikasnost njegovog transporta u sastavu konjugata sa transferinom i serumskim albuminom.

8. Visoka antitumorska aktivnost AFP konjugata sa esperamicinom Aib in vivo je demonstrirana korištenjem mišjeg modela tumora koji se može presađivati ​​(liječenje -30%, povećanje životnog vijeka - 163%).

9. Konjugat AFP fragmenta GIP8 sa doksorubicinom se selektivno akumulira u osjetljivim i rezistentnim tumorskim ćelijskim linijama, ima izražen citostatski učinak na tumorske ćelije i nisko je toksičan za humane mononuklearne leukocite.

Pokazano je obećanje upotrebe proteinskih vektora zasnovanih na AFP-u i epidermalnog faktora rasta za ciljanu isporuku antisens oligonukleotida u ciljne ćelije.

Zaključak.

Ovaj rad je posvećen proučavanju obrazaca u dizajnu ciljanih sistema za isporuku lijekova na bazi proteinskih vektora. Proučavanje karakteristika intracelularne translokacije ispitivanih lekova i njihovo poređenje sa biološkom aktivnošću protiv tumorskih i normalnih ćelija in vitro pomaže da se predvidi uspeh određene strategije i na taj način optimizuje proces stvaranja efikasnih antitumorskih lekova selektivnog delovanja.

Upotreba ciljane komponente određuje interakciju SAD sa strogo definisanim ćelijama i tkivima, čime se obezbeđuje selektivnost delovanja lekova. Mehanizam endocitoze posredovane receptorima potiče akumulaciju lijeka čija se molekularna meta nalazi unutar ćelije.

Poređenje SAD-ova, koji su konjugati (vektorski protein)-linker-(lijek), gdje su serumski albumin, transferin i alfa-fetoprotein korišćeni kao vektorski proteini, pokazalo je prednost potonjih kako u sposobnosti akumulacije u tumorskim ćelijama tako iu u citotoksičnoj aktivnosti za ove stanice. Ovi konjugati su koristili hidrazid 3-maleimidobenzojeve kiseline kao povezivač i doksorubicin kao lijek. Ovaj linker je kiselinski labilan i može se hidrolizirati u ćelijskim odjeljcima kao što su endosomi i lizozomi, oslobađajući lijek iz SAD-a. Doksorubicin, antraciklinski antibiotik, je efikasan terapijski agens koji se široko koristi. Postoje dva glavna mehanizma pomoću kojih lijek uzrokuje ćelijsku smrt: interkalacija DNK, zbog koje se DOX ubacuje između dva susjedna nukleotida, osiguravajući snažnu interakciju sa DNK i ometajući replikaciju i transkripciju; vezivanje i inhibicija topoizomeraze II. Zbog prisustva kinonske grupe u strukturi, DOX učestvuje u redoks procesima, što dovodi do stvaranja slobodnih radikala koji izazivaju oštećenje DNK i peroksidaciju lipida. Efikasnost DOX terapije zavisi od njegove intracelularne akumulacije.

Slobodni DOX, zbog svoje hidrofobnosti, brzo prodire u ćelije i ćelijska jezgra. Brzina preuzimanja DOX-a u konjugatu od strane ćelija određena je brojem specifičnih receptora na površini ciljnih ćelija i intenzitetom endocitoze posredovane receptorima.

Kao vektorske proteine ​​(ciljne komponente), pored AFP-a, koristili smo dobro poznate transportne proteine ​​HSA i Trf, koje tumorske ćelije aktivno endocitozuju i koriste se sa različitim stepenom uspeha za intratumoralnu isporuku lekova (videti Pregled literature, odeljak 1.5). Međutim, konjugat AFP sa DOX je bio značajno superiorniji od sličnih konjugata DOX sa HSA i Trf kako u pogledu efikasnosti akumulacije u tumorskim ćelijama tako i u pogledu citotoksične aktivnosti prema ovim ćelijama.

Studija ekspresije AFP receptora na površini ćelijskih linija humanog tumora i normalnih limfocita periferne krvi, kao i na histološkim presjecima kancerogenih, benignih i normalnih tkiva korištenjem monoklonskih antitijela na AFP, otkrila je dominantno prisustvo ovog receptora u ćelije malignih tumora. Naši rezultati su kasnije potvrđeni istraživanjem R. Moroa. Dakle, AFP može poslužiti kao jedinstvena meta na površini tumorskih ćelija, a sistemi isporuke zasnovani na njegovom prirodnom ligandu, AFP, mogu obezbijediti selektivnu isporuku lijekova tim stanicama. Analiza vezivanja i endocitoze fluorescentno obeleženog AFP-a ukazuje na visoku efikasnost i specifičnost akumulacije AFP-a u aktivno proliferirajućim tumorskim ćelijama, kao i na odsustvo akumulacije ovog proteina u neproliferirajućim limfocitima.

In vitro studija antitumorske efikasnosti brojnih konjugata baziranih na AFP-u, u kojima različiti citostatici, antitumorski antibiotici, antimetaboliti, fotosenzibilizatori (doksorubicin, daunomicin, kaliheamicin, bleomicin, esperamicin, cisplatin-boksiflatin, cisplatin-fotosfatoksimetoksin, ) bili koriste se kao citotoksične komponente.visoka selektivna antitumorska aktivnost. Konjugat AFP sa esperamicinom Aib pokazao je značajnu efikasnost u eksperimentima in vivo modela u liječenju miševa s eksperimentalnim tumorima, sprečavajući razvoj tumora i višestruko povećavajući životni vijek životinja. Treba napomenuti da je ovaj antibiotik, srodan enediinima, izuzetno toksično jedinjenje. Hemijska struktura enediinskih antibiotika ima zajednički element, koji se često naziva "bojna glava", a to je 10-člani enediinski prsten koji sadrži dvije acetilenske veze na a-pozicijama dvostruke veze ili oksiranskog prstena. U fiziološkim uslovima i uz određenu aktivaciju, takva "bojna glava" se preuređuje u reaktivni diradikal. Citotoksični učinak esperamicina nastaje zbog indukcije jedno- i dvolančanih prekida DNK. Klinička ispitivanja ovog lijeka nisu uspjela zbog njegove visoke sistemske toksičnosti. Možda je jedini način da se iskoristi potencijal ovog antibiotika da se poveća njegova selektivnost hemijskim vezivanjem za vektorske molekule, osiguravajući ciljanu dostavu do tumora, što smo i učinili.

Treba napomenuti da je pri konstruisanju SAD-a od posebne važnosti izbor linkera koji veže vektorski protein za citotoksični agens. Citostatik se može uspješno isporučiti u ciljnu ćeliju, ali ako se ne obezbijedi njegovo pravovremeno odvajanje od vektora, biološki efekat ili neće biti ostvaren ili će biti slabo izražen. Analiza efikasnosti konjugata AFP-a sa DOX-om, u kojima su korišteni linkeri koji se razlikuju po svojoj labilnosti, pokazala je da su najaktivniji konjugati sintetizirani glutaraldehidom i hidrazidom 3-maleimidobenzojeve kiseline. Citotoksična aktivnost AFP konjugata sa DOX-om je u korelaciji sa akumulacijom DOX-a u ćelijskim jezgrama: što se to brže dešavalo, to je konjugat bio aktivniji. Kada je N-hidroksisukcinimid ester 3-(2-ditiopiridil)propionske kiseline korišćen kao linker, lokalizacija DOX-a u ćelijama bila je pretežno citoplazmatska, čak i 24 sata nakon primene konjugata. Međutim, ovaj konjugat je pokazao vrlo nisku aktivnost (25 puta nižu od slobodnog DOX-a). Očigledno, jaka disulfidna veza sprječava brzo cijepanje DOX-a u endosomima. U ćelijama su enzimi sposobni da redukuju disulfidne veze (tiol-protein disulfid reduktaza, tioredoksin, glutaredoksin, gama interferon inducibilna lizozomalna tiol reduktaza - GILT) lokalizovani u šupljini mikrosoma, u strukturama Golgijevog kompleksa; Tioredoksin i glutaredoksin katalizuju redukciju disulfidnih veza u jezgru i citoplazmi; GILT - u kasnim endosomima/lizozomima (optimalni pH 4-5). Do smanjenja disulfidnih veza u proteinima dolazi u kasnim endosomima/lizosomima nakon ograničene proteolize katepsinima. Smanjenje disulfidne veze tiol-protein disulfid reduktazom značajno se usporava kako se pH smanjuje. Čini se da se oslobađanje DOX-a iz konjugata u kojima je antibiotik vezan za protein preko disulfidne veze odvija prilično sporo, što objašnjava nisku citotoksičnu aktivnost takvih konjugata. Drugi faktor koji bi mogao uticati na efikasnost razmatranog konjugata je modifikacija amino grupe ostatka šećera DOX-a uvođenjem tiolne grupe pomoću SPDP-a. Iako je niz studija pokazao pripremu aktivnih konjugata DOX-a s antitijelima korištenjem ove strategije sinteze, druge studije su pokazale da modifikacija DOX-a na amino šećeru smanjuje citotoksičnu aktivnost ovog antibiotika i dovodi do gubitka citotoksične aktivnosti antraciklin u konjugatu.

Ipak, upotreba SPDP-a u sintezi AFP-EsA konjugata pokazala se vrlo efikasnom. Zaista, citotoksičnost konjugata kada je testirana in vitro bila je najvećim dijelom niža od toksičnosti slobodne EsA. Međutim, kao rezultat povećanja selektivnosti djelovanja EsA u konjugatu, postignut je značajan uspjeh pri testiranju konjugata in vivo.

Dobijeni rezultati omogućavaju da se predvidi nivo efikasnosti ciljanih lekova na bazi proteinskih vektorskih molekula. Efikasnost takvih lijekova ne zavisi samo od proteina vektora, već u velikoj mjeri i od vrste hemijske veze između proteina i antitumorskog antibiotika. Ova veza ne bi trebala biti prejaka, jer se gube prednosti ciljane isporuke: uprkos visokoj unutarćelijskoj koncentraciji antibiotika, potonji možda neće imati farmakološki učinak ako ne postigne cilj. Ali veza ne bi trebala biti previše labilna, jer lijek mora održati svoj integritet prije interakcije s ciljnim stanicama. Istovremeno, prilikom kreiranja ciljanog konstrukta potrebno je uzeti u obzir da će do cijepanja lijeka (antibiotika, citostatika, itd.) od proteinske molekule najvjerovatnije doći u endosomima pri pH vrijednostima od 5,5- 6, odnosno linker koji povezuje molekulu AFP-a sa lijekom u idealnom slučaju mora biti hidroliziran na naznačenim pH vrijednostima ili biti supstrat endosomalnih enzima.

Najvažnije svojstvo sintetiziranih konjugata baziranih na AFP-u bila je njihova sposobnost da preokrenu rezistenciju na više lijekova uzrokovanu aktivnošću ABC transportera.

Dobijeni rezultati nam omogućavaju da zaključimo da se AFP može efikasno koristiti kao ciljano sredstvo za isporuku antitumorskih lijekova u tumorske ćelije različitog porijekla.

Možda je jedini značajan nedostatak prirodnog ljudskog AFP-a izvor njegove izolacije: AFP u preparativnim količinama može se izolovati samo iz abortivnog materijala. U krvi iz pupčane vrpce, biomaterijalu koji smo koristili, sadržaj AFP je znatno manji, a striktno govoreći, ni ovo nije najbolji biološki izvor. Stoga smo postavili zadatak dobijanja rekombinantnog proteinskog vektora - AFP fragmenta koji sadrži mjesto za vezanje receptora identično onom u prirodnom molekulu. Rezultirajući rekombinantni C-terminalni fragment AFP-a (rAFP27) specifično se vezuje za AFP receptor na tumorskim ćelijama i endocitozira ih slično kao i ljudski AFP pune dužine. gAFP27 je takođe zadržao neka druga biološka svojstva proteina pune dužine. Upotreba gAFP27 kao vektora u SAD otvara mogućnost praktične upotrebe potencijala proteina kao liganda za AFP.

Transformirane ćelije karakteriziraju promjene u genima povezanim s regulacijom ćelijske proliferacije i apoptoze. Među brojnim studijama posvećenim razvoju novih selektivnih agenasa za tumorske ćelije, posebno mjesto pripada antisens oligonukleotidima. ASON su jedna od klase novih agenasa koji mogu inhibirati sintezu specifičnih proteina povezanih s tumorom vezivanjem za mRNA koja kodira ove proteine, čime blokira sintezu proteina. Mnogi modificirani (posebno tiofosfatni) ASON-i su pokazali uvjerljivo smanjenje ekspresije ciljnih gena in vitro i sugerirano je da su uspješni protiv širokog spektra tumora. Prepreka koja smanjuje selektivnost ASON-a je trenutni nedostatak adekvatnog i efikasnog SAD-a ovih jedinjenja u ciljnim ćelijama, neophodnih za realizaciju terapeutskog potencijala ASON-a.

Transformirane ćelije karakteriziraju promjene u genima povezanim s regulacijom ćelijske proliferacije i apoptoze. Među brojnim studijama posvećenim razvoju novih selektivnih agenasa za tumorske ćelije, posebno mjesto pripada antisens oligonukleotidima. Antisens oligonukleotidi su jedna takva klasa novih agenasa koji mogu inhibirati sintezu specifičnih proteina povezanih s tumorom vezivanjem za mRNA koja kodira ove proteine, čime blokiraju sintezu proteina. Posljednjih desetljeća razvijeno je i testirano nekoliko antisensova u pretkliničkim i kliničkim studijama. Mnogi od njih su pokazali uvjerljivo smanjenje ekspresije ciljnih gena u in vitro sistemima i sugerirano je da su uspješni protiv širokog spektra tumora. Međutim, zbog genetske heterogenosti tumora, čini se da upotreba antisensova kao jednog lijeka nije učinkovita u liječenju bolesti. Antisens terapije usmjerene na ometanje signalnih puteva uključenih u ćelijsku proliferaciju i apoptozu su posebno obećavajuće kada se kombiniraju s konvencionalnim antitumorskim tretmanima.

Isporuka tiofosfata A8(G) tumorskim ćelijama u obliku konjugata sa AFP pokazala se izuzetno efikasnom, jer je omogućila savladavanje barijere citoplazmatske membrane koja ograničava prodiranje ABOI u ćelije.Ta efikasnost se očitovala bilo u obliku direktnog citostatskog efekta ili u vidu senzibilizacije ciljnih stanica na djelovanje drugih antitumorskih lijekova.Utvrđeno je da je nespecifična toksičnost nekih sekvenci (G nije bila prepreka za primjenu ovih (G), budući da je upotreba vektorske molekule u SAD ograničila njihovu toksičnost na tumorske ćelije.Međutim, ispostavilo se da je sinteza konjugata vrlo radno intenzivan proces, praćen značajnim gubicima proteina i ABOM-a.Alternativni dizajni, koji su nekovalentni kompleksi proteina sa ABOM, mogu biti tehnološki napredniji. AO, posebno njihovi tiofosfatni analozi, imaju visok negativni naboj i sposobni su da formiraju jake komplekse sa polikationskim molekulima. Da bi se povećala efikasnost formiranja ovakvih kompleksa, pozitivno nabijena sekvenca je uvedena u molekule rekombinantnih proteina (gAFP27 i EvP), osiguravajući njihovu snažnu interakciju sa LBOM. Dobijeni konstrukti su se pokazali kao uspješni SAD-ovi, ne samo što su značajno povećali efikasnost akumulacije ABOA u ćelijama koje karakteriše povećan sadržaj receptora za pomenute proteine, već i zaštitile prirodne fosfodiestarske OA od degradacije. Međutim, upotreba mitogena, koji je EOP, kao ciljane komponente SAD-a ograničava opseg korišćenih ABO-a, sprečavajući u nekim slučajevima implementaciju biološkog efekta. Moguće je da modifikacija regije vezivanja receptora molekule EUR može pomoći u rješavanju ovog problema, zbog čega će se izgubiti sposobnost receptora da se aktivira (sposobnost autofosforilacije), ali neće utjecati na sposobnost receptora koji se internalizuje nakon vezivanja za njegov ligand.

Rezultati eksperimentalnih studija predstavljeni u ovom radu ukazuju na visoku efikasnost i selektivnost sistema ciljane isporuke na bazi alfa-fetoproteina, njegovih fragmenata i modifikovanog epidermalnog faktora rasta.

Napredak u proučavanju molekularnih mehanizama patogeneze bolesti i pojava novih metoda u području molekularne biologije i biotehnologije otvaraju mogućnosti za razvoj novih lijekova koji selektivno djeluju na različite signalne puteve karakteristične za tumorske stanice, a time i mogućnost ciljanog individualnog tretmana zasnovanog na jedinstvenom kompleksu molekularnih ciljeva koje proizvodi tumor pacijenta. Lijekovi mogu doći do ciljeva sami (na primjer, terapijska antitijela), ili kao dio sistema za isporuku ciljanih na specifične organe zahvaćene tumorom, ili direktno na površinu ili unutar ćelija raka. Razumijevanje ćelijske biologije tumora i proučavanje mikrookruženja tumorskih ćelija omogućit će nam da razvijemo učinkovite opcije za ciljane lijekove.

Spisak referenci za istraživanje disertacije Doktor bioloških nauka Posypanova, Galina Aronovna, 2013

1. Jain R.K. Dostava molekularne i celularne medicine solidnim tumorima. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. br. 1-3. P. 149-168.

2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Dostava i transport lijekova do solidnih tumora. //Pharm Res. 2003. V. 20. br. 9. P. 1337-1350.

3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. Pregled kliničkog razvoja rituksimaba: prvo monoklonsko antitijelo odobreno za liječenje limfoma. // Semin Oncol. 1999. V. 26. br. 5 Suppl 14. P. 66-73.

4. Huhn D., von Schilling C„ Wilhelm M„ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W„ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab terapija bolesnika s B-ćelijskom kroničnom limfocitnom leukemijom. // Blood. 2001. V. 98. br. 5. P. 1326-1331.

5. Gribben J.G., Hallek M. Ponovno otkrivanje alemtuzumaba: trenutne i nove terapeutske uloge. //Br J Haematol. 2009. V. 144. br. 6. P. 818-831.

6. Ravandi F., O"Brien S. Alemtuzumab u CLL i drugim limfoidnim neoplazmama. // Cancer Invest. 2006. V. 24. No. 7. P. 718-725.

7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-IH) u liječenju kronične limfocitne leukemije. //Oncogene. 2007. V. 26. br. 25. P. 3644-3653.

8. Baselga J. Pregled EGFR ciljane terapije. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. br. 4. P. 218-219.

9. Fischgrabe J., Wulfing P. Ciljane terapije raka dojke: utvrđeni lijekovi i nedavni razvoj. // Curr Clin Pharmacol. 2008. V. 3. br. 2. P. 85-98.

10. Goldenberg M.M. Trastuzumab, humanizirano monoklonsko antitijelo izvedeno iz rekombinantne DNK, novo sredstvo za liječenje metastatskog raka dojke. // Clin Ther. 1999. V. 21. br. 2. P. 309-318.

11. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Rak dojke kod ljudi: korelacija relapsa i preživljavanja sa amplifikacijom HER-2/neu onkogena. // Science. 1987. V. 235. br. 4785. P. 177-182.

12. Azim H., Azim H.A., Jr. Ciljanje Her-2/neu kod raka dojke: ovako jednostavno! // Oncology. 2008. V. 74. br. 3-4. P. 150-157.

13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado V., Gascon P. Mehanizam djelovanja anti-HER2 monoklonskih antitijela: naučno ažuriranje trastuzumaba i 2C4. // Adv Exp Med Biol. 2003. V. 532. P.253-268.

14. Stern M., Herrmann R. Pregled monoklonskih antitela u terapiji raka: sadašnjost i obećanje. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. br. 1. P. 11-29.

15. Gutheil J. Obećanje monoklonskih antitijela za terapiju raka. // Crit Rev Oncol Hematol. 2001. V. 38. br. 1. P. 1-2.

16. Moiseenko B.M. Monoklonska antitijela u liječenju malignih tumora. // Praktična onkologija. 2003. V. 4. br. 3. R. 148-156.

17. Guillemard V., Uri Saragovi N. Hemoterapeutici predlijekova zaobilaze rezistenciju na p-glikoprotein i ubijaju tumore in vivo uz visoku efikasnost i selektivnost zavisnu od cilja. //Oncogene. 2004. V. 23. br. 20. P. 3613-3621.

18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Tehnološki uvid: imunokonjugati citotoksičnih lijekova za terapiju raka. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. br. 4. P. 245-255.

19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) za relapse CD30-pozitivnih limfoma. // New England Journal of Medicine. V. 363. br. 19. P. 1812-1821.

20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. Faza I studije trastuzumaba

21. DM1, konjugat HER2 antitijela i lijeka, koji se daje svake 3 sedmice pacijentima s HER2-pozitivnim metastatskim karcinomom dojke. // Journal of Clinical Oncology. V. 28. br. 16. P. 2698-2704.

22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: anti-CD33 imunokonjugat za liječenje akutne mijeloične leukemije. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. br. 4. P. 527-540.

23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O"Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. Uloga gemtuzumab ozogamicina u terapiji akutne leukemije. // Br J Haematol. 2006. V. 142. P. 142. 398-409.

24. Gao Z., McAlister V.C., Williams G.M. Repopulacija endotela jetre ćelijama izvedenim iz koštane srži. // Lancet. 2001. V. 357. br. 9260. P. 932-933.

25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Kaliheamicin gama II: antitumorski antibiotik koji posebno cijepa dvolančanu DNK mjesto. // Science. 1988. V. 240. br. 4856. P. 1198-1201.

26. Reiter Y. Rekombinantni imunotoksini u ciljanoj terapiji ćelija raka. // Adv Cancer Res. 2001. V. 81. P. 93-124.

27. Goyal A., Batra J.K. Uključivanje razmaknice osjetljivog na furin povećava citotoksičnost ribotoksina restriktocina koji sadrži rekombinantne jednolančane imunotoksine. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.

28. Kreitman R.J. Rekombinantni imunotoksini koji sadrže skraćene bakterijske toksine za liječenje hematoloških maligniteta. // BioDrugs. 2009. V. 23. br. 1. P. 1-13.

29. Jain R.K., Baxter L.T. Mehanizmi heterogene distribucije monoklonskih antitela i drugih makromolekula u tumorima: značaj povišenog intersticijalnog pritiska. // Cancer Res. 1988. V. 48. br. 24 Pt 1. P. 7022-7032.

30. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Terapija monoklonskim antitijelima za solidne tumore. // Cancer Treat Rev. 2000. V. 26. br. 4. P. 269-286.

31. Brada M. BCL2 gen: trenutni značaj za kliničku onkologiju. // Eur J Cancer. 1992. V. 28. br. 1. P. 270-272.

32. Yip K.W., Reed J.C. Proteini iz porodice Bcl-2 i rak. //Oncogene. 2008. V. 27. br. 50. P. 6398-6406.

33. Reed J.C. Proteini porodice Bcl-2: strategije za prevazilaženje hemoterapije kod raka. // Adv Pharmacol. 1997. V. 41. P. 501-532.

34. Reed J.C. Bel-2 familija proteina: regulatori hemorezistencije kod raka. // Toxicol Lett. 1995. V. 82-83. P. 155-158.

35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen u liječenju metastatskog melanoma. // Future Oncol. 2007. V. 3. br. 3. P. 263-271.

36. Oblimersen: Augmerosen, BCL-2 antisens oligonukleotid Genta, G 3139, GC 3139, oblimersen natrijum. // Drugs R D. 2007. V. 8. br. 5. P. 321-334.

37. Manoharan M. Oligonukleotidni konjugati kao potencijalni antisens lijekovi sa poboljšanim unosom, biodistribucijom, ciljanom isporukom i mehanizmom djelovanja. //"/ Antisense Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. No. 2. P. 103-128.

38. Abels C. Ciljanje vaskularnog sistema solidnih tumora fotodinamičkom terapijom (PDT). // Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. br. 8. P. 765-771.

39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. Mehanizmi direktnog oštećenja tumora fotodinamičke terapije. // Acta Biochim Pol. 2005. V. 52. br. 2. P. 339-352.

40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Fotodinamička terapija (PDT): kratak pregled o ćelijskim mehanizmima i primjenama istraživanja raka za PDT. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. br. 1. P. 1-8.

41. Aveline B.M., Redmond R.W. Ekskluzivni slobodni radikalni mehanizmi ćelijske fotosenzibilizacije. // Fotohemija i fotobiologija. 1998. V. 68. br. 3. P. 266-275.

42. Henderson B.W., Dougherty T.J. Kako funkcionira fotodinamička terapija? // Photochem Photobiol. 1992. V. 55. br. 1. P. 145-157.

43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Neželjena reakcija koju karakterizira bol u grudima, kratak dah i sinkopa povezana s verteporfinom (visudyne). // Am J Ophthalmol. 2002. V. 134. br. 2. P. 281-282.

44. Cheng Y., A C.S., Meyers J.D., Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Visoko efikasna isporuka lijekova s ​​vektorima zlatnih nanočestica za in vivo fotodinamičku terapiju raka. // J Am Chem Soc. 2008. V. 130. br. 32. P. 10643-10647.

45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Ciljana fotodinamička terapija putem sistema isporuke posredovanih receptorima. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. br. 1. P. 53-76.

46. ​​Oleinick N.L., Evans H.H. Fotobiologija fotodinamičke terapije: ćelijski ciljevi i mehanizmi. //Radiat Res. 1998. V. 150. br. 5 Suppl. P. S146-156.

47. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Ciljana intracelularna isporuka fotosenzibilizatora za poboljšanje fotodinamičke efikasnosti. // Immunol Cell Biol. 2000. V. 78. br. 4. P. 452-464.

48. Rozanova Torshina N., Zhang J.Z., Heck D.E. Katalitička terapija raka porfirinima i askorbatom. // Cancer Lett. 2007. V. 252. br. 2. P. 216-224.

49. Khorosheva E.V., Gerasimova G.K., Kalia O.J1. Proučavanje mehanizma transporta teraftala u tumorske ćelije

50. Ruski bioterapeutski časopis 2007. V. 6. br. 1. R. 8.

51. Kulbachevskaya N.Yu., Manzyuk L.V., Mikhailova JI.M. Klinička i eksperimentalna studija toksičnosti antitumorskog katalitičkog sistema “teraftal + askorbinska kiselina” (“TF + AK”). // Ruski bioterapeutski časopis. 2004. V. 3. br. 2. R. 70.

52. Ravi Kumar M.N. Nano i mikročestice kao uređaji za kontroliranu isporuku lijekova. // J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. br. 2. P. 234-258.

53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanočestice i ciljani sistemi za terapiju raka. // Adv Drug Deliv Rev. 2012. V.P.

54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Tehnologija vezana za nanočestice albumina (nab) je obećavajuća metoda za isporuku lijekova protiv raka. // Recent Pat Anticancer Drim Dkrnv 9PP9 V P

55. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Ciljanje nanočestica paklitaksela ugrađenih u albumin na tumore. //Nanomedicina. 2009. V, 5. br. 1. P. 73-82.

56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paklitaksel za rak dojke: nova formulacija s poboljšanim sigurnosnim profilom i većom djelotvornošću. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. br. 7. P. 919-943.

57. Moreno-Aspitia A., Perez E.A. Nanočestice paklitaksel vezan za albumin (ABI-007): novija alternativa taksanu kod raka dojke. // Future Oncol. 2005. V. 1. br. 6. P. 755-762.

58. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocitni mehanizmi za ciljanu isporuku lijekova. // Napredni pregledi isporuke lijekova. 2007. V. 59. br. 8. P. 748-758.

59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Endocitoza zavisna od klatrina. // Biochem J. 2004. V. 377. br. Pt l.P. 1-16.

60. Rodemer C., Haucke V. Clathrin/AP-2-zavisna endocitoza: novo igralište za farmakološki alat? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. br. 186. P. 105-122.

61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Endocitoza zavisna od klatrina. // Biohemijski časopis. 2004. V. 377. br. t. 1. str. 1-16.

62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Dodatni faktori u endocitozi sinaptičkih vezikula zavisnih od klatrina. //Nat Rev Neurosci. 2000. V. 1. br. 3. P. 161-172.

63. Marsh M., McMahon H.T. Strukturna era endocitoze. // Science. 1999. V. 285. br. 5425. P. 215-220.

64. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocitni mehanizmi za ciljanu isporuku lijekova. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. br. 8. P. 748-758.

65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. Dynamin se sam sastavlja u prstenove sugerirajući mehanizam za pupanje obloženih vezikula. //Priroda. 1995. V. 374. br. 6518. P. 190-192.

66. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, GTPase za remodeliranje membrane. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. br. 2. P. 75-88.

67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Citoplazmatski dinein-ovisni vezikularni transport od ranih do kasnih endosoma. // The Journal of cell biology. 1993. V. 123. br. 6 Pt 1. P. 1373-1387.

68. Stahl P.D., Barbieri M.A. Multivezikularna tijela i multivezikularni endosomi: "unutrašnji i izlasci" endosomalnog prometa. // Science's STKE: okruženje znanja o transdukciji signala 2002. V. 2002. br. 141. P. pe32.

69. Piper R.C., Luzio J.P. Kasni endosomi: sortiranje i podjela u multivezikularna tijela. // Saobraćaj. 2001. V. 2. br. 9. P. 612-621.

70. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Endolizozomalna proteoliza i njena regulacija. // Biohemijski časopis. 2002. V. 363. br. Pt 3. P. 417-429.

71. Eskelinen E.-L. Uloge LAMP-1 i LAMP-2 u biogenezi lizosoma i autofagiji. // Molekularni aspekti medicine. 2006. V. 27. br. 5-6. P. 495-502.

72. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Kaveolini, tečno uređeni domeni i transdukcija signala. // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. br. 11. P. 7289-7304.

73. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. ​​Putevi preuzimanja i naknadna intracelularna trgovina u nevirusnoj isporuci gena. // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. br. 1. P. 32-45.

74. Lajoie P., Nabi I.R. Poglavlje 3 Lipidni splavovi, kaveole i njihova endocitoza. U: Kwang WJ, urednik. International Review of Cell and Molecular Biology: Academic Press; 2010. str. 135163.

75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Endocitoza nezavisna od klatrina i kaveolina-1: ulazak virusa majmuna 40 u ćelije lišene kaveola. // J Cell Biol. 2005. V. 168. br. 3. P. 477-488.

76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. Ciljana intracelularna isporuka terapeutika: pregled. // Die Pharmazie. 2007. V. 62. br. 9. P. 643-658.

77. Fenton C., Perry C.M. Gemtuzumab ozogamicin: pregled njegove upotrebe u akutnoj mijeloidnoj leukemiji. // Drugs. 2005. V. 65. br. 16. P. 2405-2427.

78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Nova CD20 monoklonska antitijela za terapiju limfoma. // Časopis za hematologiju i onkologiju. 2012. V. 5. br. 1. P. 64.

79. Chari R.V.J. Ciljana terapija raka: davanje specifičnosti citotoksičnim lijekovima. // Računi kemijskih istraživanja. 2007. V. 41. br. 1. P. 98-107.

80. Casi G., Neri D. Konjugati antitijelo-lijek: osnovni koncepti, primjeri i buduće perspektive. // Journal of controlled release: službeni časopis Društva za kontrolirano oslobađanje. 2012. V. 161. br. 2. P. 422-428.

81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren T., Venkatachalam T., Waddick K.G., Rosostev A., Myers D.E. Citotoksična aktivnost epidermalnog faktora rasta-genisteina protiv ćelija raka dojke. // Clin Cancer Res. 1998. V. 4. br. 4. P. 901-912.

82. Rihova B. Ciljanje lijekova na receptore ćelijske površine. // Kritički osvrti u biotehnologiji. 1997. V. 17. br. 2. P. 149-169.

83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Nedavni napredak u konjugatima lijekova protiv raka koji ciljaju tumor. // Bioorganska i medicinska hemija. 2005. V. 13. br. 17. P. 50435054.

84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Intracelularna isporuka sredstava protiv raka na bazi prolijekova. // Napredni pregledi isporuke lijekova. 2011. V. 63. br. 1-2. P. 3-23.

85. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J. Najnoviji trendovi u dizajnu ciljanih lijekova protiv raka i konjugata. // Aktuelna medicinska hemija. 2008. V. 15. br. 18. P. 1802-1826.

86. Sanderson R.J., Hering M.A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. In vivo stabilnost lijeka-linkera imunokonjugata auristatina vezanog anti-CD30 dipeptidom. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. br. 2 Pt 1. P. 843-852.

87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Nelinearna farmakokinetika terapeutskih proteina koja je rezultat endocitoze posredovane receptorima. // J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2009. V. 36. br. 3. P. 239-260.

88. Malyankar U.M. Antigeni i biomarkeri povezani sa tumorom u terapiji raka i imunosti. // Int Rev Immunol. 2007. V. 26. br. 3-4. P. 223-247.

89. Tyuryaeva I.I. Tumorski antigeni. // Cytology. 2008. V. 50. br. 3. R. 189-209.

90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon T., van der Bruggen P. Citolitički T limfociti prepoznaju peptid MAGE-A4 predstavljen HLA-A2. // Eur J Immunol. 1999. V. 29. br. 10. P. 3329-3337.

91. Houghton A.N. Antigeni raka: imunološko prepoznavanje sebe i izmijenjenog sebe. // J Exp Med. 1994. V. 180. br. 1. P. 1-4.

92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Gangliozidi normalnih i neoplastičnih ljudskih melanocita. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 120. br. 2. P. 500-504.

93. Tang C.K., Katsara M., Apostolopoulos V. Strategije korištene za MUC1 imunoterapiju: kliničke studije na ljudima. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. br. 7. P. 963-975.

94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Uloga porodice HER receptora u razvoju i diferencijaciji. //J Cell Physiol. 2004. V. 200. br. 3. P. 343-350.

95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. ErbB signalna mreža: heterodimerizacija receptora u razvoju i rak. // EMBO J. 2000. V. 19. br. 13. P. 3159-3167.

96. Baryshnikov A.Yu. Odnos između tumora i imunološkog sistema organizma. // Praktična onkologija. 2003. V. 4. br. 3. R. 127-130.

97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Karcinoembrionalni antigen kao meta vakcine. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. br. 7. P. 987-993.

98. Singer J.W., De Vries P., Bhatt R., Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis R.A., Wallace S. Konjugacija kamptotecina na poli-(L-glutaminsku kiselinu). // Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 922. P.136-150.

99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Detekcija citofluorescencije interakcija adriamicin-mitohondrija u izolovanom, perfuziranom srcu pacova. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. br. 1. P. 35-41.

100. Evdokimova V.N., Butterfield L.H. Alfa-fetoprotein i drugi tumorski povezani antigeni za imunoterapiju hepatocelularnog karcinoma. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. br. 3. P. 325336.

101. Abelev G.I., Eraiser T.L. Ćelijski aspekti reekspresije alfa-fetoproteina u tumorima. // Semin Cancer Biol. 1999. V. 9. br. 2. P. 95-107.

102. Mizejewski G.J. Struktura i funkcija alfa-fetoproteina: relevantnost za izoforme, epitope i konformacijske varijante. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. br. 5. P. 377-408.

103. Castelli C., Rivoltini L., Andreola G., Carrabba M., Renkvist N., Parmiani G. T-ćelijsko prepoznavanje antigena povezanih s melanomom. // J Cell Physiol. 2000. V. 182. br. 3. P. 323-331.

104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. Nova porodica kodirajućih gena za antigen prepoznat od strane autolognih citolitičkih T limfocita na ljudskom melanomu. // J Exp Med. 1995. V. 182. br. 3. P. 689-698.

105. Lewis J.J., Houghton A.N. Definicija tumorskih antigena pogodnih za izradu vakcine. // Semin Cancer Biol. 1995. V. 6. br. 6. P. 321-327.

106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Ciljanje lijekova u liječenju raka: aktivni daunorubicin-proteinski konjugati. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pt A. P. 291-298.

107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Tumorska vaskularna permeabilnost i EPR efekat u makromolekularnoj terapiji: pregled. // J Control Release. 2000. V. 65. br. 1-2. P. 271-284.

108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Akumulacija makromolekula tumora u ranoj fazi: velika razlika u brzini klirensa između tumora i normalnog tkiva. // Jpn J Cancer Res. 1998. V. 89. br. 3. P. 307-314.

109. Kratz F., Beyer U. Serumski proteini kao nosači lijekova protiv karcinoma: pregled. // Drug Deliv. 1998. V. 5. br. 4. P. 281-299.

110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Priprema, karakterizacija i in vitro efikasnost albuminskih konjugata doksorubicina. // Biol Pharm Bull. 1998. V. 21. br. 1. P. 56-61.

111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Konjugati albumina lijeka protiv raka klorambucil: sinteza, karakterizacija i in vitro efikasnost. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. V. 331. br. 2. P. 47-53.

112. Udruženje za medicinsku onkologiju Njemačkog društva za rak. // Clin Cancer Res. 1999. V. 5. br. 4. P. 753-759.

113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. Sinteza, profil cijepanja i antitumorska efikasnost prolijeka metotreksata koji se vezuje za albumin koji se cijepa plazminom i katepsinom B. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. V. 340. br. 8. P. 389-395.

114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Razvoj i in vitro efikasnost novih MMP2 i MMP9 specifičnih doksorubicin albuminskih konjugata. // Bioorg Med Chem Lett. 2001. V. 11. br. 15. P. 2001-2006.

115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Konjugati lijek-polimer koji sadrže veze koje se razdvajaju kiselinama. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. V. 16. br. 3. P. 245-288.

116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung D.E., Gitzel M. Prolijekovi antraciklina u hemoterapiji raka. // Curr Med Chem. 2006. V. 13. br. 5. P. 477-523.

117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. Faza I i farmakokinetička studija derivata (6-maleimidokaproil)hidrazona doksorubicina. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. br. 16. P. 4858-4866.

118. Kratz F., Mansour A., ​​Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Razvoj prolijekova doksorubicina koji vezuju albumin koji se cijepaju antigenom specifičnim za prostatu. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. V. 338. br. 10. P. 462-472.

119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. In vitro i in vivo studija o lijeku doksorubicina koji veže albumin koji se cijepa katepsinom B. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. V. 64. br. 2. P. 413-418.

120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Razvoj bifunkcionalnih linkera koji se vezuju za proteine ​​za novu generaciju lijekova s ​​dvostrukim djelovanjem. // Bioconjug Chem. 2009. V. 20. br. 2. P. 390-396.

121. Abu Ajaj K., Kratz F. Razvoj prolijekova dvostrukog djelovanja za zaobilaženje rezistencije na više lijekova. // Bioorg Med Chem Lett. 2009. V. 19. br. 3. P. 995-1000.

122. Dautry-Varsat A. Endocitoza posredovana receptorima: intracelularno putovanje transferina i njegovog receptora. // Biochimie. 1986. V. 68. br. 3. P. 375-381.

123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez J.A., Helguera G., Penichet M.L. Receptor transferina, dio I: Biologija i ciljanje citotoksičnih antitijela za liječenje raka. // Clin Immunol. 2006. V. 121. br. 2. P. 144-158.

124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: struktura, funkcija i potencijalna terapijska djelovanja. // Drug Discov Today. 2005. V. 10. br. 4. P. 267-273.

125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Transferin je usmjerio isporuku adriamicina u ljudske ćelije. // Anticancer Res. 1998. V. 18. br. 3A. P. 1423-1427.

126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. Adriamicin konjugati humanog transferina vezuju transferinske receptore i ubijaju ćelije K562 i HL60. // Arch Biochem Biophys. 1993. V. 300. br. 1. P. 356-363.

127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. Inhibicija transporta elektrona transplazmatske membrane konjugatima transferin-adriamicin. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1105. br. 1. P. 84-88.

128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Utjecaj konjugacije doksorubicina na transferin na apsorpciju željeza od strane K562 ćelija putem endocitoze posredovane receptorima. // Eur J Biochem. 1993. V. 213. br. 1. P. 427-436.

129. Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Mehanizam djelovanja i spektar ćelijskih linija osjetljivih na konjugat doksorubicin-transferin. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. V. 41. br. 2. P. 155160.

130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. Receptor transferina, dio II: ciljana isporuka terapeutskih agenasa u ćelije raka. // Clin Immunol. 2006. V. 121. br. 2. P. 159-176.

131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. In vitro citotoksičnosti i in vivo distribucija transferin-platina(II) kompleksa. // J Pharm Sci. 1995. V. 84. br. 2. P. 216-221.

132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. Preliminarna procjena transferina platine (MPTC-63) kao potencijalnog netoksičnog liječenja raka dojke. // Otkrivanje raka Prev. 1988. V. 12. br. 1-6. P. 469-480.

133. Head J.F., Wang F., Elliott R.L. Antineoplastični lijekovi koji ometaju metabolizam željeza u stanicama raka. //Adv Enzyme Regul. 1997. V. 37. P. 147-169.

134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Sinteza i in vitro efikasnost konjugata transferina lijeka protiv raka klorambucila. //J Med Chem. 1998. V. 41. br. 15. P. 2701-2708.

135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Ciljanje tumora na osnovu efekta poboljšane permeabilnosti i retencije (EPR) i mehanizma endocitoze posredovane receptorima (RME). // Int J Pharm. 2004. V. 277. br. 1-2. P. 39-61.

136. Frankel A.E. Povećana sofisticiranost imunotoksina. // Clin Cancer Res. 2002. V. 8. br. 4. P. 942-944.

137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Imunotoksinska terapija hematoloških maligniteta. // Semin Oncol. 2003. V. 30. br. 4. P. 545-557.

138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. Efikasnost imunotoksina ciljanih na receptor transferina u ćelijskim linijama tumora mozga i pedijatrijskih tumora mozga. // Cancer Res. 1993. V. 53. br. 6. P. 1348-1353.

139. Weaver M., Laske D.W. Konjugat toksina ciljanog na transferin receptor ligandom (Tf-CRM107) za terapiju malignih glioma. // J Neurooncol. 2003. V. 65. br. 1. P. 3-13.

140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. Smanjenje regulacije c-FLIP-a senzibilizira ćelije raka prostate DU145 na Fas posredovanu apoptozu. // Cancer Biol Ther. 2002. V. 1. br. 4. P. 401-406.

141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. Ciljanje hlorina e6 posredovano epidermalnim faktorom rasta selektivno potencira njegovu fotodinamičku aktivnost. // Cancer Res. 2000. V. 60. br. 8. P. 2197-2202.

142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. EGF-ricin A konjugati: kinetički profili citotoksičnih efekata i rezistentne varijante ćelija. // Funkcija strukture ćelije. 1984. V. 9. br. 3. P. 203-212.

143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. Fizičko-hemijski zahtjevi za ćelijski unos pAntp peptida. Uloga afiniteta za vezivanje lipida. // Eur J Biochem. 2001. V. 268. br. 5. P. 1304-1314.

144. Vives E., Richard J.P., Rispal C., Lebleu B. internalizacija TAT peptida: traženje mehanizma ulaska. // Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. br. 2. P. 125-132.

145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Novi konjugati daunorubicin-nosač peptida izvedeni iz ljudskih segmenata kalcitonina. // J Mol Recognit. 2003. V. 16. br. 5. P. 280-287.

146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. Inhibicija telomera i poremećaj telomera kao procesi za ciljanje lijekova. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. V. 43. P. 359-379.

147. Chomczynski P., Sacchi N. Metoda izolacije RNK u jednom koraku ekstrakcijom kiselog gvanidinijum tiocijanat-fenol-hloroform. // Analytical Biochemistry. 1987. V. 162. br. 1. P. 156159.

148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Ćelije adenokarcinoma su ciljane od strane novog himernog toksina GnRH-PE66 preko specifičnih mjesta vezanja hormona koji oslobađa gonadotropin. // J Biol Chem. 1997. V. 272. br. 17. P. 11597-11603.

149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. Fuzija proteina difterijskog toksina i epidermalnog faktora rasta je citotoksična za multiformne ćelije humanog glioblastoma. // Cancer Res. 2003. V. 63. br. 8. P. 1834-1837.

150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. Ciljanje receptora epidermalnog faktora rasta u ćelijskim linijama raka dojke sa rekombinantnim toksinom fuzije liganda (DAB389EGF). // Cancer J Sci Am. 1996. V. 2. br. 3. P. 175-180.

151. Turturro F. Denileukin diftitox: promjena bioterapeutske paradigme u liječenju poremećaja uzrokovanih limfom. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. br. 1. P. 11-17.

152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox kao nova ciljana terapija za limfoidne maligne bolesti. // Cancer Invest. 2007. V. 25. br. 6. P. 495-501.

153. Duvic M., Talpur R. Optimiziranje denileukin diftitox (Ontak) terapije. // Future Oncol. 2008. V. 4. br. 4. P. 457-469.

154. Foss F. Kliničko iskustvo sa denileukin diftitoxom (ONTAK). // Semin Oncol. 2006. V. 33. br. 1 Suppl 3. P. SI 1-16.

155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. Nove terapije za hroničnu limfocitnu leukemiju. // Blood Rev. 2004. V. 18. br. 2. P. 137-148.

156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox kao nova ciljana terapija ne-Hodgkinovog limfoma // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. No. 2. P. 169-174.

157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: sažet klinički pregled. // Expert Rev Anticancer Ther. 2005. V. 5. br. 1. P. 33-38.

158. Black J.H., McCubrey J.A., Willingham M.C., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. Difterijski toksin-interleukin-3 fuzioni protein (DT(388)IL3) produžava preživljavanje bez bolesti leukemičnih imunokompromitovanih miševa. // Leukemija. 2003. V. 17. br. 1. P. 155-159.

159. Frankel A., Liu J.S., Rizzieri D., Hogge D. Klinička studija faze I fuzijskog proteina difterijskog toksina-interleukina 3 kod pacijenata sa akutnom mijeloidnom leukemijom i mijelodisplazijom. // Leuk limfom. 2008. V. 49. br. 3. P. 543-553.

160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. IL-4 i IL-13 pseudomonas egzotoksini: nova nada za terapiju tumora mozga. // Neurosurg Focus. 2006. V. 20. br. 4. P. El 1.

161. Terapija sa i bez Temozolomida kod novodijagnostikovanih malignih glioma: Faza 1 Studija konačnih rezultata sigurnosti. //Neurosurgery. 2008. V.P.

162. Jarboe J.S., Johnson K.R., Choi Y., Lonser R.R., Park J.K. Ekspresija interleukina-13 receptora alfa2 u multiformnom glioblastomu: implikacije za ciljane terapije. // Cancer Res. 2007. V. 67. br. 17. P. 7983-7986.

163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: novi prototip humanih himernih proteina za ciljanu terapiju. // FEBS Lett. 1999. V. 457. br. 2. P. 271-276.

164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Mehanizam djelovanja interleukina-2 (IL-2)-Bax, himernog proteina koji indukuje apoptozu i cilja na ćelije koje eksprimiraju IL-2 receptor // Biochem J. 2003. V. 370. No. Pt 1. P. 129-140.

165. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstracija nove proteinske frakcije u serumu iz ljudskog fetusa. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. br. 2. P. 174.

166. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., S.I.I. Fetalni serum a-globulin i njegova sinteza transplantabilnim mišjim hepatomima. // Biochemistry. 1963. V. 28. br. 4. R. 625-634.

167. Tatarinov Yu.S. Detekcija embriospecifičnog a-globulina u krvnom serumu bolesnika s primarnim karcinomom jetre. // Pitanje med. hemija. 1964. V. 10. R. 90-91.

168. Abelev G.I., Elgort D.A. Alfa-fetoprotein kao imunološki marker hepatocelularnog karcinoma i teratokarcinoma testisa i jajnika. // Oncology. 1978. V. 10. R. 3-17.

169. Brock D.J., Bolton A.E., Monaghan J.M. Prenatalna dijagnoza anencefalije putem mjerenja alfafetoproteina u serumu majke. // Lancet. 1973. V. 2. br. 7835. P. 923-924.

170. Aitken D.A., Crossley J.A. Defekti neuralne cijevi/alfa-fetoprotein/Downov sindrom // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. No. 2. P. 113-120.

171. Deutsch H.F. Hemija i biologija alfa-fetoproteina. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.t» t i ng. zjj-j1z.

172. Luft A.J., Lorscheider F.L. Strukturna analiza ljudskog i goveđeg alfa-fetoproteina elektronskom mikroskopijom, obradom slike i kružnim dihroizmom. // Biochemistry. 1983. V. 22. br. 25. P. 5978-5981.

173. Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake S., Ho S.K. Strukture izoforma alfa-fetoproteina u serumu specifičnih za bolest. // Br J Rak. 2000. V. 83. br. 10. P. 1330-1337.

174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. Prisustvo masnih kiselina u ljudskom alfa-fetoproteinu. // J Biol Chem. 1978. V. 253. br. 7. P. 2114-2119.

175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Tandem raspored gena albumina i alfa-fetoproteina u ljudskom genomu. // Gene. 1984. V. 32. br. 3. P. 255-261.

176. Lazarević N.L. Molekularni mehanizmi regulacije ekspresije alfa-fetoproteinskih gena. // Biochemistry. 2000. V. 65. br. 1. R. 139-158.

177. Jose-Estanyol M., Danan J.L. Faktor specifičan za jetru i nuklearni faktor I vezuju se za promotor alfa-fetoproteina štakora. // J Biol Chem. 1988. V. 263. br. 22. P. 10865-10871.

178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Nuklearni faktor 3 hepatocita ublažava represiju alfa-fetoproteinskog gena posredovanu hromatinom. // J Biol Chem. 1999. V. 274. br. 35. P. 25113-25120.

179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. Lokus alfa 1-fetoproteina aktivira nuklearni receptor Drosophila FTZ- F1 porodica. // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. br. 7. P. 3853-3865.

180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 je represor ekspresije a-fetoproteina u ćelijskim linijama humanog hepatoma. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. br. 6b. P. 2772-2780.

181. Van Reeth T., Gabant P., Szpirer C., Szpirer J. Stimulacija promotora alfa-feioproteina nevezanim receptorom tiroidnih hormona u vezi sa deacetilacijom proteina. // Molekularna i ćelijska endokrinologija. 2002. V. 188. br. 1-2. P. 99-109.

182. Lienard P., De Mees C., Drnze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Regulacija promotora alfa-fetoproteina: Ku vezanje i prostorna konformacija DNK. // Biochimie. 2006. V. 88. br. 10. P. 1409-1417.

183. Mizejewski G.J. Biološke uloge alfa-fetoproteina tokom trudnoće i perinatalnog razvoja. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. V. 229. br. 6. P. 439-463.

184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. Vezivno mjesto za masne kiseline humanog alfa-fetoproteina. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. V. 196. br. 3. P. 1049-1057.

185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Efekat alfa-fetoproteina i albumina na unos polinezasićenih masnih kiselina ćelijama hepatoma štakora i hepatocitima fetusa pacova. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. br. 1. P. 81-88.

186. Mizejewski G.J., Pass K.A. Masne kiseline, alfa-fetoprotein i cistična fibroza. // Pedijatrija. 2001. V. 108. br. 6. P. 1370-1373.

187. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Utjecaj teških metala na alfa-fetoprotein u serumu majke i amnionskoj tekućini trudnih miševa. // Toxicology. 1990. V. 64. br. 1. P. 19-32.

188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. Pročišćeni humani alfa-fetoprotein inhibira proizvodnju estradiola stimuliranog folikula stimulirajućeg hormona u ćelijama svinjske granuloze u kulturi. // Mol Cell Endocrinol. 1993. V. 94. br. 1. P. 21-25.

189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Alfa-fetoprotein aktiviran estradiolom potiskuje uterotropni odgovor na estrogene. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. br. 9. P. 2733-2737.

190. Jacobson H.I., Bennett J.A., Mizejewski G.J. Inhibicija rasta raka dojke ovisnog o estrogenu produktom reakcije alfa-fetoproteina i estradiola. // Cancer Res. 1990. V. 50. br. 2. P. 415-420.

191. Mizejewski G.J., Warner A.S. Alfa-fetoprotein može regulirati rast u maternici kod nezrelih i odraslih miševa sa ovarijektomijom. // J Reprod Fertil. 1989. V. 85. br. 1. P. 177-185.

192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Studije intrinzične antiuterotropne aktivnosti mišjeg alfa-fetoproteina. // Biologija tumora. 1986. V. 7. br. 1. P. 19-36.

193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Hormoni trudnoće, alfa-feto protein i smanjenje rizika od raka dojke. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. P. 477-484.

194. Mizejewski G.J. Biološka uloga alfa-fetoproteina u raku: izgledi za terapiju protiv raka. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. br. 6. P. 709-735.

195. Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. Promovirajući molekularni mehanizam alfa-fetoproteina na rast ćelijske linije humanog hepatoma Bel7402. // World J Gastroenterol. 2002. V. 8. br. 3. P. 469-475.

196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. Intracelularni mehanizam alfa-fetoproteina koji potiče proliferaciju NIH 3T3 ćelija. // Cell Res. 2002. V. 12. br. 2. P. 151156.

197. Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Povećanje proliferacije HeLa ćelija alfa-fetoproteinom. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Šangaj). 2002. V. 34. br. 6. P. 769-774.

198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alfa-fetoprotein: novi član intracelularnog signala molekule u regulaciji PI3K/AKT signalizacije u ćelijskim linijama humanog hepatoma. // Int J Cancer. V.P.

199. Chakraborty M., Mandal C. Imuno-supresivni efekat humanog alfafetoproteina: studija unakrsnih vrsta. // Immunol Invest. 1993. V. 22. br. 5. P. 329-339.

200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. (alfa)-fetoprotein narušava funkciju APC i inducira njihovu apoptozu. // J Immunol. 2004. V. 173. br. 3. P. 1772-1778.

201. Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Poboljšanje autoimune neuroinflamacije rekombinantnim humanim alfa-fetoproteinom. // Exp Neurol. 2006. V. 198. br. 1. P. 136-144.

202. Chereshnev B.A., Rodionov S.Yu. Čerkasov V.A., Malyutina N.N., Orlov O.A. Alfa fetoprotein. Ekaterinburg: Uralski ogranak Ruske akademije nauka; 2004.

203. Dudich E. MM-093, rekombinantni humani alfa-fetoprotein za potencijalno liječenje reumatoidnog artritisa i drugih autoimunih bolesti. // Curr Opin Mol Ther. 2007. V. 9. br. 6. P. 603-610.

204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. Inhibicija apoptoze alfa-fetoproteinom (AFP) i uloga AFP receptora u antićelijskom starenju. // Anticancer Res. 1994. V. 14. br. 6B. P. 2429-2438.

205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. Hemoterapeutska efikasnost konjugata protein-doksorubicin na ćelijskoj liniji hepatoma pacova otpornih na više lijekova in vitro. // Br J Rak. 1993. V. 67. br. 2. P. 274-278.

206. Lubgan D., Jozwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. Konjugat doksorubicin-transferin selektivno prevladava rezistenciju na više lijekova u stanicama leukemije. // Cell Mol Biol Lett. 2009. V. 14. br. 1. P. 113-127.

207. Sarti D.A., Crandall B.F., Winter J., Robertson R.D., Kaback N.M., Karp L.E. Korelacija biparietalnog i fetalnog prečnika tela: 12-26 nedelja gestacije. // A.J.R. Američki časopis za rendgenologiju. 1981. V. 137. br. 1. P. 87-91.

208. Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus P.E., Giaccone G. Topoisomerase Ilalpha i drugi markeri rezistencije na lijekove u uznapredovalom karcinomu ne-malih stanica pluća. // Rak pluća. 2001. V. 32. br. 2. P. 117-128.

209. Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Kongenitalna kontrakturna arahnodaktilija, keratokonus i vjerojatni Marfanov sindrom u istom pedigreu. // The Journal of pediatrics. 1981. V. 98. br. 4. P. 591-593.

210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Studije kasne replikacije u humanoj translokaciji X/13: korelacija sa ekspresijom autosomnog gena. // Citogenetika i stanična genetika. 1981. V. 29. br. 4. P. 215-220.

211. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Preuzimanje radioaktivno obilježenog alfa-fetoproteina kod karcinoma dojke miša i njegova korisnost u scintigrafiji tumora. // Cancer Res. 1984. V. 44. br. 11. P. 5314-5319.

212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Uloga dinamina u formiranju vezikula obloženih klatrinom. // Cold Spring Harbor simpozijum o kvantitativnoj biologiji. 1995. V. 60. P. 235-242.

213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Upijanje alfafoetoproteina od strane kloniranih ćelijskih linija izvedenih iz niklom izazvanog rabdomiosarkoma štakora. // Br J Rak. 1983. V. 48. br. 2. P. 261-269.

214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. Upijanje alfa-fetoproteina od strane C-1300 ćelija neuroblastoma miša. // Br J Rak. 1985. V. 51. br. 6. P. 791-797.

215. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alfa-fetoproteinski receptori u ćelijskoj liniji raka dojke kod ljudi. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. br. 3. P. 1322-1327.

216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Specifični receptori za tip ćelije za alfa-fetoprotein u ćelijskoj liniji T-limfoma miša. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. br. 10. P. 3301-3305.

217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Izolacija i djelomična karakterizacija specifičnog alfa-fetoproteinskog receptora na ljudskim monocitima. // J Clin Invest. 1992. V. 90. br. 4. P. 1530-1536.

218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Aktivacija autokrine petlje alfa-fetoproteina (AFP)/receptora u HT-29 ćelijama humanog karcinoma debelog crijeva. // Int J Cancer. 1991. V. 49. br. 3. P. 425430.

219. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Ekspresija alfa-fetoproteinskih receptora ljudskim T-limfocitima tokom blastične transformacije. // Mol Immunol. 1989. V. 26. br. 9. P. 851-857.

220. Biddle W., Sarcione E.J. Specifični citoplazmatski alfa-fetoprotein vezujući protein u MCF-7 ljudskim ćelijama raka dojke i primarnom tkivu raka dojke. // Breast Cancer Res Treat. 1987. V. 10. br. 3. P. 279-286.

221. Mizejewski G.J. Proteini koji vežu alfa-fetoprotein: implikacije na transmembranski prolaz i subcelularnu lokalizaciju. // Life Sci. 1995. V. 56. br. 1. P. 1-9.

222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoklonska usmjerena antitijela protiv široko rasprostranjenog onkofetalnog antigena: alfa-fetoproteinskog receptora. // Tumor Biol. 1993. V. 14. br. 2. P. 116-130.

223. Kanevsky V., Pozdnyakova L.P., Aksenova O.A., Severin S.E., Katukov V., Severin E.S. Izolacija i karakterizacija AFP-vezujućih proteina iz tumorskih i fetalnih ljudskih tkiva. // Biochem Mol Biol Int. 1997. V. 41. br. 6. P. 1143-1151.

224. Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Specifični unos alfa-fetoproteina i albumina od strane ćelija hepatoma pacova Morris 7777. // Tumor Biol. 1999. V. 20. br. 1. P. 52-64.

225. Mizejewski G.J., MacColl R. Inhibicijski peptidi rasta alfa-fetoproteina: potencijalni vodiči za terapiju raka. // Mol Cancer Ther. 2003. V. 2. br. 11. P. 1243-1255.

226. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Sintetički peptidi izvedeni iz alfa-fetoproteina: analiza regulatornog segmenta koji modificira estrogen. // Mol Cell Endocrinol. 1996. V. 118. br. 1-2. P. 15-23.

227. Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Alfa-fetoprotein inhibira metamorfozu žaba: implikacije za očuvanje proteinskog motiva. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. V. 124. br. 1. P. 39-45.

228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Učinak alfa-fetoproteina i izvedenih peptida na fetotoksičnost uzrokovanu inzulinom i estrogenom. // Fetalna dijagnoza Ther. 2003. V. 18. br. 5. P. 360-369.

229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Studije o peptidu koji inhibira rast izveden iz alfa-fetoproteina i nekih analoga. // J Pept Res. 2001. V. 57. br. 1. P. 29-38.

230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Studije o analozima peptida izvedenih iz alfa-fetoproteina koji imaju svojstva protiv rasta. // J Pept Res. 2001. V. 57. br. 6. P. 539-546.

231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Pregled funkcionalnih aktivnosti alfa-fetoprotein izvedenih inhibitornih peptida rasta: pregled i izgledi. // Curr Protein Pept Sci. 2006. V. 7. br. 1. P. 73-100.

232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. Pregled peptida koji inhibira rast kao bioterapeutskog agensa za rast tumora, adheziju i metastaze. // Metastaze raka Rev. 2005. V. 24. br. 3. P. 441-467.

233. Vakharia D., Mizejewski G.J. Ljudski alfa-fetoproteinski peptidi vezuju receptore estrogena i estradiol i potiskuju rak dojke. // Breast Cancer Res Treat. 2000. V. 63. br. 1. P. 41-52.

234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Studije o 99mTc-obilježavanju modificiranog fragmenta humanog alfa-fetoproteina (P149-QY). // Časopis za radioanalitičku i nuklearnu hemiju. 2008. V. 275. br. 1. P. 101-107.

235. Linton K.J., Higgins C.F. Proteini Escherichia coli ATP-vezujuća kaseta (ABC). // Mol Microbiol. 1998. V. 28. br. 1. P. 5-13.

236. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. Superfamilija transportera humane ATP-binding cassette (ABC). // Genome Res. 2001. V. 11. br. 7. P. 1156-1166.

237. Dean M., Annilo T. Evolucija superfamilije transportera ATP-binding cassette (ABC) kod kičmenjaka. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. V. 6. P. 123-142.

238. Riordan J.R., Ling V. Pročišćavanje P-glikoproteina iz vezikula plazma membrane mutanata ćelija jajnika kineskog hrčka sa smanjenom propusnošću kolhicina. // J Biol Chem. 1979. V. 254. br. 24. P. 12701-12705.

239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC transporteri: moć promjene. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10. br. 3. P. 218-227.

240. Choi C.H. ABC transporteri kao mehanizmi rezistencije na više lijekova i razvoj hemosenzibilizatora za njihovo poništavanje. // Cancer Cell Int. 2005. V. 5. P. 30.

241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Transmembranski transport endo- i ksenobiotika pomoću proteina multirezistentne kasete sisara koji vežu ATP. // Physiol Rev. 2006. V. 86. br. 3. P. 849-899.

242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, kemoterapija i remodeliranje hromatina. // Cancer Biol Ther. 2004. V. 3. br. 9. P. 819-824.

243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. Transkripcijski regulatori humanog gena otpornosti na više lijekova 1: noviji pogledi. // Biochem Pharmacol. 2002. V. 64. br. 5-6. P. 943-948.

244. Breier A., ​​Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-glikoprotein-implikacije metabolizma neoplastičnih ćelija i terapija raka. // Curr Ciljevi lijekova protiv raka. 2005. V. 5. br. 6. P. 457-468.

245. Doz F., Roosen N., Rosenblum M.L. Metalotionein i agensi protiv raka: uloga metalotioneina u kemoterapiji raka. // J Neurooncol. 1993. V. 17. br. 2. P. 123-129.

246. Lazo J.S., Basu A. Ekspresija metalotioneina i prolazna rezistencija na elektrofilne antineoplastične lijekove. // Semin Cancer Biol. 1991. V. 2. br. 4. P. 267-271.

247. Chen A.Y., Liu L.F. DNK topoizomeraze: esencijalni enzimi i smrtonosne mete. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. V. 34. P. 191-218.

248. Makin G. Ciljanje apoptoze u kemoterapiji raka. // Expert Opin Ther Targets. 2002. V. 6. br. 1. P. 73-84.

249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2., Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,

250. P "RAPPAG \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct lomlag nolle +A Lionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/YCH/I VI 1U11VUU11 JVllJiU^UJ l/l WJJ l/l WJ. W1 X*A\/1 / WHO IU WlOUlUlill ŠŠpentoxifylline // Cancer Res. 1995. V. 55. No. 8. P. 1649-1654.

251. Sarkar R., Jain R.K., Puri P. Melasma kod indijskih muškaraca. // Dermatol Surg. 2003. V. 29. br. 2. P. 204.

252. Smith D.J., Ng H., Kluck R.M., Nagley P. Mitohondrijska kapija do ćelijske smrti. // IUBMB Life. 2008. V. 60. br. 6. P. 383-389.

253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Mitohondrijski nosači i pore: ključni regulatori mitohondrijalnog apoptotičkog programa? // Apoptoza. 2007. V. 12. br. 5. P. 869-876.

254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. Pregled literature o molekularnim markerima koji predviđaju klinički odgovor na citotoksičnu hemoterapiju kod pacijenata sa rakom dojke. // Int J Clin Oncol. 2009. V. 14. br. 2. P. 112-119.

255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. Uloga članova porodice Bcl-2 u tumorigenezi. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. br. 2-3. P. 229-249.

256. Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. Kliničke studije Bcl-2 i koristi liječenja kod pacijenata s rakom dojke. // Endocr Relat Cancer. 1999. V. 6. br. 1. P. 61-68.

257. Adams J.M., Cory S. Bcl-2-regulisana apoptoza: mehanizam i terapeutski potencijal. // Curr Opin Immunol. 2007. V. 19. br. 5. P. 488-496.

258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Direktno opažanje analoga citozina koji formira pet vodoničnih veza za gvanozin: gvanidino G-stezaljka. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. V. 41. br. 1. P. 115-117.

259. Cowling V.H., Cole M.D. Mehanizam aktivacije transkripcije pomoću onkoproteina Myc. // Semin Cancer Biol. 2006. V. 16. br. 4. P. 242-252.

260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Terapeutika protiv raka: ciljanje na tamnu stranu Myc. // Eur J Cancer. 2005. V. 41. br. 16. P. 2485-2501.

261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. Netranskripcijska kontrola replikacije DNK od c-Myc. //Priroda. 2007. V. 448. br. 7152. P. 445-451.

262. Spencer C.A., Groudine M. Kontrola regulacije c-myc u normalnim i neoplastičnim ćelijama. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. P. 1-48.

263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. MYC onkogeni i ljudska neoplastična bolest. //Oncogene. 1999. V. 18. br. 19. P. 3004-3016.

264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Parakrinska regulacija angiogeneze i diferencijacije adipocita tokom in vivo adipogeneze. // Circ Res. 2003. V. 93. br. 9. P. e88-97.

265. Sears R.C. Životni ciklus C-myc: od sinteze do razgradnje. // Cell Cycle. 2004. V. 3. br. 9. P. 1133-1137.

266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., ​​Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. Odgovori na antiangiogenezno liječenje spontanih autohtonih tumora i njihovih izotransplantata. // Cancer Res. 2003. V. 63. br. 4. P. 747-751.

267. Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc je metastazni gen za ne-small-cell Cancer pluća. // PLoS One. 2009. V. 4. br. 6. P. e6029.

268. Ahmed F.E. Molekularni markeri koji predviđaju odgovor na terapiju raka debelog crijeva. // Expert Rev Mol Diagn. 2005. V. 5. br. 3. P. 353-375.

269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. Nizvodni ciljevi faktora rasta i estrogenske signalizacije i endokrine rezistencije: potencijalne uloge c-Myc, ciklina Dl i ciklina E. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12 Suppl 1. P. S47-59.

270. Blackburn E.H. Telomere: struktura i sinteza. // J Biol Chem. 1990. V. 265. br. 11. P. 5919-5921.

271. Olovnikov A.M. Teorija marginotomije. Nepotpuno kopiranje margine šablona u enzimskoj sintezi polinukleotida i biološki značaj fenomena. // J Theor Biol. 1973. V. 41. br. 1. P. 181-190.

272. Wright W.E., Shay J.W. Dvostepeni mehanizam koji kontroliše ćelijsko starenje i besmrtnost. // Exp Gerontol. 1992. V. 27. br. 4. P. 383-389.

273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Arhitektura Telomere. // EMBO Rep. 2002. V. 3. br. 12. P. 1139-1145.

274. Liu J.P. Proučavanje molekularnih mehanizama u regulaciji aktivnosti telomeraze. // FASEB J. 1999. V. 13. br. 15. P. 2091-2104.

275. Wu K.J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Direktna aktivacija TERT transkripcije pomoću c-MYC. // Nat Genet. 1999. V. 21. br. 2. P. 220224.

276. Tian X., Chen B., Liu X. Telomera i telomeraza kao mete za terapiju raka. // Appl Biochem Biotechnol. V. 160. br. 5. P. 1460-1472.

277. Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Sastav liposoma je važan za zadržavanje liposomskog rodamina u ćelijama raka koje prekomjerno eksprimiraju P-glikoprotein. // Drug Deliv. 2009. V. 16. br. 5. P. 261-267.

278. Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Lipozom-inkapsulirani daunorubicin za PGP-povezanu rezistenciju na više lijekova. // Br J Haematol. 1999. V. 106. br. 1. P. 92-99.

279. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tamaoki T. Primarne strukture humanog alfa-fetoproteina i njegove mRNA. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. br. 15. P. 4604-4608.

280. Bogush T., Robert J. Komparativna procjena intracelularne akumulacije i DNK vezivanja idarubicina i daunorubicina u osjetljivim i multirezistentnim ljudskim ćelijama leukemije K562. // Anticancer Res. 1996. V. 16. br. 1. P. 365-368.

281. Cartier R., Reszka R. Upotreba sintetičkih peptida koji sadrže signale nuklearne lokalizacije za nevirusne sisteme prijenosa gena. // Gene Ther. 2002. V. 9. br. 3. P. 157-167.

282. Collas P., Alestrom P. Signali nuklearne lokalizacije: pokretačka snaga za nuklearni transport plazmidne DNK u zebri. // Biochem Cell Biol. 1997. V. 75. br. 5. P. 633-640.

283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Faktori koji utječu na sposobnost peptida sekvence nuklearne lokalizacije da poboljšaju isporuku nevirusnih gena. // Bioconjugate Chemistry. 2003. V. 15. br. 1. P. 152-161.

284. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Sinteza 2"-0-2-[(N,N-dimetilamino)oksi.etil] modificiranih nukleozida i oligonukleotida. // J Org Chem. 2002. V. 67. br. 2. P. 357-369.

285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Citotoksični efekti konjugata doksorubicin-transferin u KB ćelijama otpornim na više lijekova. // Biochem Pharmacol. 1996. V. 51. br. 4. P. 489-493.

286. Lemieux P., Page M. Osjetljivost MCF-7 ćelija otpornih na više lijekova na konjugat transferin-doksorubicin. // Anticancer Res. 1994. V. 14. br. 2A. P. 397-403.

287. Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Ćelijska akumulacija i citotoksičnost makromolekularnih kompleksa platine u tumorskim ćelijama otpornim na cisplatin. // J Control Release. 2008. V. 131. br. 2. P. 100-106.

288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Osjetljivost KB-C1 ćelija otpornih na više lijekova na konjugat antitijela-dekstran-adriamicin. // Anticancer Res. 1989. V. 9. br. 3. P. 637-641.

289. Chitambar C.R. Jedinjenja galija kao antineoplastična sredstva. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. br. 6. P. 547-552.

290. Ehrlich P. Djelomična funkcija ćelija. (Adresa Nobelove nagrade data 11. decembra 1908. u Stokholmu).. // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. V. 5. br. 2. P. 67-86.

291. Butcher E.C., Weissman I.L. Direktno fluorescentno označavanje ćelija fluoresceinom ili rodamin izotiocijanatom. I. Tehnički aspekti. // J Immunol Methods. 1980. V. 37. br. 2. P. 97108.

292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. Kvantifikacija protočnom citofluorimetrijom molekula HLA klase I na površini mišjih ćelija transformisanih kloniranim HLA genima. // J Immunol Methods. 1983. V. 61. br. 3. P. 301-315.

293. Fenton C., Perry C.M. U centru pažnje gemtuzumab ozogamicin u akutnoj mijeloidnoj leukemiji. // BioDrugs: klinička imunoterapeutika, biofarmaceutika i genska terapija. 2006. V. 20. br. 2. P. 137-139.

294. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Endocitoza posredovana receptorima i reciklaža alfa-fetoproteina u ćelijama humanog B-limfoma i T-leukemije. // Int J Cancer. 1991. V. 47. br. 1. P. 110-117.

295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Aktivacija puta alfa-fetoproteina/receptora u humanim normalnim i malignim mononuklearnim ćelijama periferne krvi. // Leukemija. 1993. V. 7. br. 11. P. 1807-1816.

296. Biaglow J.E., Miller R.A. Tioredoksin reduktaza/tioredoksin sistem: nove redoks mete za terapiju raka. // Cancer Biol Ther. 2005. V. 4. br. 1. P. 6-13.

297. Arunachalam V., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Enzimska redukcija disulfidnih veza u lizozomima: karakterizacija gama-interferonom inducibilne lizozomalne tiol reduktaze (GILT). // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. br. 2. P. 745-750.

298. Kooistra T., Millard P.C., Lloyd J.B. Uloga tiola u razgradnji proteina katepsinima. // Biochem J. 1982. V. 204. br. 2. P. 471-477.

299. Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Cepanje disulfidnih veza u endocitoziranim makromolekulama. Obrada koja nije povezana s lizosomima ili endosomima. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx y y V/ . t^■v<-л. л. » x w I vy v x v f w

300. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Sličnost između prirodnog i rekombinantnog humanog alfa-fetoproteina kao inhibitora rasta raka dojke ovisnog o estrogenu. // Breast Cancer Res Treat. 1997. V. 45. br. 2. P. 169-179.

301. DiMarco A. Adriamycin (NSC-123127): način i mehanizam djelovanja. // Cancer Chemother. Rep. 1975. V. 6. P. 91-106.

302. Hamza A., Sarma M.H., Sarma R.H. Vjerojatna interakcija alfa-fetoproteinskog ciklopeptida s modelom GPR30 receptora vezanog za G-protein: studija spajanja molekularnom dinamikom simuliranom žarenju. // J Biomol Struct Dyn. 2003. V. 20. br. 6. P. 751-758.

303. Tan W., Loke Y.H., Stein C.A., Miller P., Colombini M. Fosforotioatni oligonukleotidi blokiraju VDAC kanal. // Biophys J. 2007. V. 93. br. 4. P. 1184-1191.

304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. Farmakološka meta G3139 u ćelijama melanoma može biti mitohondrijski VDAC. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. No. 19. P. 7494-7499.

305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein C.A., Colombini M. Fosforotioatni oligonukleotidi smanjuju permeabilnost vanjske membrane mitohondrija na ADP. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. V. 292. br. 4. P. C1388-1397.

306. Carpenter G., Cohen S. Epidermalni faktor rasta. // Annu Rev Biochem. 1979. V. 48. P. 193-216.

307. Saeki T., Takashima S., Tachibana M., Koga M., Hiyama E., Salomon D.S., Holland J.F., Ohnuma T. Inhibicijski učinak fosforotioatnih oligodeoksi nukleotida koji oponašaju telomere (S-ODNS) na humane tumorske linije . // Oncology. 1999. V. 57 Suppl 2. P. 27-36.

308. Page T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. Citotoksični efekti jednolančanih telomera oponašaju OMA-BL1 ćelije. // Exp Cell Res. 1999. V. 252. br. 1. P. 41-49.

309. Berkers J.A., van Bergen en Henegouwen P.M., Boonstra J. Tri klase receptora epidermalnog faktora rasta na HeLa ćelijama. // J Biol Chem. 1991. V. 266. br. 2. P. 922-927.

310. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Povećanje osjetljivosti na lijekove humanih maligniteta epidermalnim faktorom rasta. // Br J Rak. 1995. V. 72. br. 3. P. 615-619.

311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molekularne manifestacije i molekularne determinante pokrivanja telomera. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. P. 253-263.

312. Collas P., Alestrom P. Signali nuklearne lokalizacije povećavaju prijenos transgena u zametnoj liniji kod zebrice. // Transgenic Res. 1998. V. 7. br. 4. P. 303-309.

313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Novi peptidni vektor za efikasnu isporuku oligonukleotida u ćelije sisara. // Nukleinske kiseline Res. 1997. V. 25. br. 14. P. 2730-2736.

314. Sinha B.K., Politi P.M. Antraciklini. // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1990. V. 11. P. 45-57.

315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamicini, klasa moćnih antitumorskih antibiotika: mehanizam djelovanja. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. br. 1. P. 2-6.

316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Selektivna citotoksičnost adriamicin imunokonjugata monoklonskog antitijela MSN-1 na adenokarcinom endometrija in vitro i in vivo. // Oncol Rep. 2000. V. 7. br. 5. P. 1099-1106.

317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. Efikasnost adriamicin imunokonjugata koji prepoznaje C-erbB-2 proizvod na ćelijskim linijama raka dojke. // Surg Today. 1996. V. 26. br. 7. P. 501-507.

318. Yamamoto K., Acton E.M., Henry D.W. Antitumorska aktivnost nekih derivata daunorubicina na funkcijama amino i metil ketona. // Časopis za medicinsku hemiju. 2002. V. 15. br. 8. P. 872-875.

319. Arnon R., Sela M. In vitro i in vivo efikasnost konjugata daunomicina sa antitumornim antitelima. // Immunol Rev. 1982. V. 62. P. 5-27.

320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. Kovalentno vezivanje daunomicina i adriamicina za antitijela, uz zadržavanje i lijekova i aktivnosti antitijela. // Cancer Res. 1975. V. 35. br. 5. P. 1175-1181.

321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. Budućnost antisens terapije: kombinacija sa tretmanima protiv raka. //Oncogene. 2003. V. 22. br. 42. P. 6579-6588.

Napominjemo da su gore predstavljeni naučni tekstovi objavljeni samo u informativne svrhe i da su dobijeni putem originalnog prepoznavanja teksta disertacije (OCR). Stoga mogu sadržavati greške povezane s nesavršenim algoritmima za prepoznavanje. Nema takvih grešaka u PDF datotekama disertacija i sažetaka koje dostavljamo.